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特開2024-9994ペプチド、細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地、該ペプチドを用いた細胞増殖方法、及び、該ペプチドを用いたタンパク質産生方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024009994
(43)【公開日】2024-01-23
(54)【発明の名称】ペプチド、細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地、該ペプチドを用いた細胞増殖方法、及び、該ペプチドを用いたタンパク質産生方法
(51)【国際特許分類】
C07K 5/083 20060101AFI20240116BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240116BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20240116BHJP
C07K 5/093 20060101ALI20240116BHJP
【ＦＩ】
C07K5/083
C12N5/071
C12P21/00 A
C07K5/093
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023178978
(22)【出願日】2023-10-17
(62)【分割の表示】P 2022166686の分割
【原出願日】2020-12-22
(71)【出願人】
【識別番号】591040513
【氏名又は名称】株式会社マルハチ村松
(74)【代理人】
【識別番号】110000626
【氏名又は名称】弁理士法人英知国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】保苅 義則
(72)【発明者】
【氏名】奈良輪 名津子
(72)【発明者】
【氏名】青島 啓太
(72)【発明者】
【氏名】杉谷 晴美
(72)【発明者】
【氏名】関根 亜矢
(57)【要約】 （修正有）
【課題】動物由来の成分を含まない、合成培地であり、特に動物由来の成分が含まれなくとも、細胞増殖の促進し、又、タンパク質産生促進に寄与するペプチドを含む培地を提供する。
【解決手段】Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、ペプチドを含む培地を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、ペプチドを含む培地を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、ペプチド。
【請求項2】
請求項１記載のペプチドを１種以上含む、細胞増殖促進剤。
【請求項3】
請求項１記載のペプチドを１種以上含む、タンパク質産生促進剤。
【請求項4】
請求項２記載の細胞増殖促進剤、又は、請求項３記載のタンパク質産生促進剤を含む、培地。
【請求項5】
請求項１記載のペプチド１種以上を用いた、細胞増殖方法。
【請求項6】
請求項１記載のペプチド１種以上を用いた、タンパク質産生方法。
【請求項7】
バッチ培養又はフェドバッチ培養を含む、請求項６に記載のタンパク質産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチドに関する。特に、動物細胞培養用に適した新規なトリペプチド、該ペプチドを含む細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地、該ペプチドを用いた細胞増殖方法、及び、該ペプチドを用いたタンパク質産生方法に関する。
【背景技術】
【0002】
動物細胞を培養して該動物細胞の産生する天然型タンパク質を得ようとする場合、あるいは所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞を培養して所望のタンパク質等を製造する場合、ビタミン類、アミノ酸類、塩類、糖類等の栄養成分の他に、動物細胞の増殖の目的で、牛胎児血清等の哺乳動物由来の抽出物や、魚肉関連成分が添加される（特許文献１、２）。
【0003】
しかしながら、牛胎児血清等の哺乳動物由来の抽出物は、培地に対し５％～２０％程度で添加され、培地のコストの７５％～９５％を占めることや、動物由来のために品質にロット差があるという問題があった。さらに、狂牛病、ウシ海綿状脳症、感染性海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病等との相関が懸念されるため、牛胎児血清等の哺乳動物由来の抽出物を含有しない培地も試みられたが、培養の早期に細胞生存率の著しい低下を生じ、長期培養や大量培養を行うことが困難であるという別の課題が発生した。
【0004】
また、魚肉抽出物や魚肉の酵素分解物である魚肉関連成分が添加されることにより、コスト面や、培養早期での細胞生存率低下の面の課題は解決された。しかしながら、動物由来に伴う品質にロット差があることには変わりはないという問題が残った。さらには、該魚肉関連成分の成分詳細が不明であり、また対象となる魚の種類、部位、酵素分解条件によって成分が変動するため、培地として使用する際にさまざまな未知のリスクを伴い、安全に使用しづらいという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開ＷＯ９９／６３０５８号公報
【特許文献2】特開２００３－３３４０６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、動物由来の成分を含まない、合成培地を提供することを課題とする。特に、動物由来の成分が含まれなくとも、細胞増殖を促進し、又、タンパク質産生の促進に寄与するペプチドを含む培地を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意検討した結果、細胞増殖を促進し、又、タンパク質産生の促進に寄与するペプチドを見出し、該ペプチドを含む細胞増殖促進剤、該ペプチドを含むタンパク質産生促進剤、該ペプチドを含む培地を見出した。
【0008】
すなわち、本発明のペプチドは、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択されることを特徴とする。
【0009】
本発明の細胞増殖促進剤は、上記ペプチドを１種以上含むことを特徴とする。
【0010】
本発明のタンパク質産生促進剤は、上記ペプチドを１種以上含むことを特徴とする。
【0011】
本発明の培地は、上記細胞増殖促進剤、又は、上記タンパク質産生促進剤を含むことを特徴とする。
【0012】
本発明の細胞増殖方法は、上記ペプチドを１種以上用いることを特徴とする。
【0013】
本発明のタンパク質産生方法は、上記ペプチドを１種以上用いることを特徴とする。
【発明の効果】
【0014】
本発明のペプチドにより、動物由来成分を含まず、化学的に合成した物質を配合した、細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地、細胞増殖方法、及び、タンパク質産生方法を提供することができる。すなわち、狂牛病等との相関の懸念もなく、コストも抑えられ、かつ、成分詳細が明確となることにより品質の安定した細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】細胞増殖試験における、ＧＥＫの濃度と生細胞数（吸光度）との関係を示す。
【図2】細胞増殖試験における、ＤＧＰの濃度と生細胞数（吸光度）との関係を示す。
【図3】細胞増殖試験における、ＡＧＫの濃度と生細胞数（吸光度）との関係を示す。
【図4】細胞増殖試験における、ＧＰＰの濃度と生細胞数（吸光度）との関係を示す。
【図5】細胞増殖試験における、ＧＧＰの濃度と生細胞数（吸光度）との関係を示す。
【図6】細胞増殖試験における、ＡＥＫの濃度と生細胞数（吸光度）との関係を示す。
【図7】細胞増殖試験における、ＡＧＧの濃度と生細胞数（吸光度）との関係を示す。
【図8】細胞増殖試験における、ＡＳＮの濃度と生細胞数（吸光度）との関係を示す。
【図9】細胞増殖試験における、ＥＧＫの濃度と生細胞数（吸光度）との関係を示す。
【図10】細胞増殖試験における、ＧＧＧの濃度と生細胞数（吸光度）との関係を示す。
【図11】細胞増殖試験における、各トリペプチドの生細胞数（吸光度）を示す。
【図12】細胞増殖試験における、各トリペプチドの生細胞数（吸光度）の経時変化を示す。
【図13】３日間の細胞増殖試験における、各トリペプチドの生細胞数を示す。
【図14】３日間の細胞増殖試験における、各トリペプチドの細胞生存率を示す。
【図15】５日間の細胞増殖試験における、各トリペプチドの生細胞数を示す。
【図16】５日間の細胞増殖試験における、各トリペプチドの細胞生存率を示す。
【図17】トリペプチド１種の細胞増殖試験における、各トリペプチドの生細胞数を示す。
【図18】トリペプチド１種の細胞増殖試験における、各トリペプチドの細胞生存率を示す。
【図19】トリペプチド１種の細胞増殖試験における、各トリペプチドの産生タンパク質量を示す。
【図20】トリペプチド２種の細胞増殖試験における、各トリペプチドの組み合わせの生細胞数を示す。
【図21】トリペプチド２種の細胞増殖試験における、各トリペプチドの組み合わせの細胞生存率を示す。
【図22】トリペプチド２種の細胞増殖試験における、各トリペプチドの組み合わせの産生タンパク質量を示す。
【図23】トリペプチド３種の細胞増殖試験における、各トリペプチドの組み合わせの生細胞数を示す。
【図24】トリペプチド３種の細胞増殖試験における、各トリペプチドの組み合わせの細胞生存率を示す。
【図25】トリペプチド３種の細胞増殖試験における、各トリペプチドの組み合わせの産生タンパク質量を示す。
【図26】ビタミン及び核酸を添加した細胞増殖試験における、ＡＧＫの生細胞数、及び、産生タンパク質量を示す。
【図27】完全合成培地を用いた細胞増殖試験における、ＧＥＫの濃度と生細胞数との関係を示す。
【図28】完全合成培地を用いた細胞増殖試験における、ＧＥＫの濃度と細胞生存率との関係を示す。
【図29】完全合成培地を用いた細胞増殖試験における、ＧＥＫの濃度と産生タンパク質量との関係を示す。
【図30】ビタミン等補強培地を用いた細胞増殖試験における、各トリペプチドの生細胞数を示す。
【図31】ビタミン等補強培地を用いた細胞増殖試験における、各トリペプチドの細胞生存率を示す。
【図32】ビタミン等補強培地を用いたタンパク質産生試験における、各トリペプチドの産生タンパク質量を示す。
【図33】ビタミン等補強培地を用いたタンパク質産生試験における、各トリペプチドの産生タンパク質量を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の実施形態について、以下に具体的に説明する。
【0017】
（ペプチド）
本発明のペプチドは、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される。また、上記ペプチドは薬学上許容される塩とすることができ、さらにはペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾することができる。なかでも、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）が好ましい。
「薬学上許容される塩」としては、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基塩、スルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩等の有機酸塩、アルキルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が例示される。
「ペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾する」とは、アミノ酸が化学修飾されても大きくペプチドの活性が変わらないもので化学修飾することであり、アミド、エステル、アシル基等によるＣ－末端の修飾、アセチル基によるＮ－末端の修飾等が例示される。
なお、上記プロリン（Ｐｒｏ（Ｐ））は、ヒドロキシル基が導入されたヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）となっていてもよい。
本発明のペプチドは、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される。また、上記ペプチドは薬学上許容される塩とすることができ、さらにはペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾することができる。なかでも、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）が好ましい。
「薬学上許容される塩」としては、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基塩、スルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩等の有機酸塩、アルキルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が例示される。
「ペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾する」とは、アミノ酸が化学修飾されても大きくペプチドの活性が変わらないもので化学修飾することであり、アミド、エステル、アシル基等によるＣ－末端の修飾、アセチル基によるＮ－末端の修飾等が例示される。
なお、上記プロリン（Ｐｒｏ（Ｐ））は、ヒドロキシル基が導入されたヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）となっていてもよい。
【0018】
上記トリペプチドは、主に魚肉の抽出物やその酵素分解物に含まれる数百種類のさまざまな長さのペプチドを中心に、動物細胞増殖を促進するもの及びタンパク質産生を促進するものをさまざまな条件で分画して同定し、その効果をペプチドごとに確認することにより、鋭意探索されたものである。
【0019】
上記ペプチドは、魚肉の抽出物やその酵素分解物から分画する方法や、ペプチド合成法を含む化学合成法、あるいは、組換えＤＮＡ法による発現のような手段によって、得ることができる。
魚肉の抽出物やその酵素分解物等から分画する方法では、ゲルろ過クロマトグラフィー、順相／逆相ＨＰＬＣの各種条件を調整して分画、単離する。化学合成法では、合成されたアミノ酸もしくは化学修飾されたアミノ酸を化学反応により合成し、特定の配列を有するペプチドを得ることができる。組換えＤＮＡ法では、ペプチド配列を複数含む組換えタンパク質を組換え体により生成させ、それらのタンパク質を精製後、酵素処理、あるいは化学処理等により分解することにより、目的とするペプチドを得ることができる。
魚肉の抽出物やその酵素分解物等から分画する方法では、ゲルろ過クロマトグラフィー、順相／逆相ＨＰＬＣの各種条件を調整して分画、単離する。化学合成法では、合成されたアミノ酸もしくは化学修飾されたアミノ酸を化学反応により合成し、特定の配列を有するペプチドを得ることができる。組換えＤＮＡ法では、ペプチド配列を複数含む組換えタンパク質を組換え体により生成させ、それらのタンパク質を精製後、酵素処理、あるいは化学処理等により分解することにより、目的とするペプチドを得ることができる。
【0020】
（細胞増殖促進剤）
本発明の細胞増殖促進剤は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを含む。また、該１種以上のペプチドを含まない場合に比べ、細胞増殖を促進するものである。
本発明の細胞増殖促進剤は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを含む。また、該１種以上のペプチドを含まない場合に比べ、細胞増殖を促進するものである。
【0021】
上記ペプチドは薬学上許容される塩とすることができ、さらにはペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾することができる。上記プロリン（Ｐｒｏ（Ｐ））は、ヒドロキシル基が導入されたヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）となっていてもよい。
【0022】
ペプチドの選択は、上記ペプチドから１種以上から適宜組み合わせることにより行われる。
なかでも、１種の場合は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）がより好ましい。
２種の場合は、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）等が好ましい組み合わせとして例示される。
３種の場合は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ等が、好ましい組み合わせとして例示される。
なかでも、１種の場合は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）がより好ましい。
２種の場合は、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）等が好ましい組み合わせとして例示される。
３種の場合は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ等が、好ましい組み合わせとして例示される。
【0023】
（タンパク質産生促進剤）
本発明のタンパク質産生促進剤は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを含む。また、該１種以上のペプチドを含まない場合に比べ、タンパク質産生を促進するものである。
本発明のタンパク質産生促進剤は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを含む。また、該１種以上のペプチドを含まない場合に比べ、タンパク質産生を促進するものである。
【0024】
上記ペプチドは薬学上許容される塩とすることができ、さらにはペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾することができる。上記プロリン（Ｐｒｏ（Ｐ））は、ヒドロキシル基が導入されたヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）となっていてもよい。
【0025】
ペプチドの選択は、上記ペプチドから１種以上から適宜組み合わせることにより行われる。
なかでも、１種の場合は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）が好ましいペプチドとして例示される。
２種の場合は、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）等が好ましい組み合わせとして例示される。
３種の場合は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ等が、好ましい組み合わせとして例示される。
なかでも、１種の場合は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）が好ましいペプチドとして例示される。
２種の場合は、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）等が好ましい組み合わせとして例示される。
３種の場合は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ等が、好ましい組み合わせとして例示される。
【0026】
（培地）
本発明の培地は、上記ペプチドを含む上記細胞増殖促進剤、又は、上記ペプチドを含む上記タンパク質産生促進剤を含む。
本発明の培地は、上記ペプチドを含む上記細胞増殖促進剤、又は、上記ペプチドを含む上記タンパク質産生促進剤を含む。
【0027】
培地中のペプチドの濃度は、細胞や培養条件により適宜設定される。すなわち、培地中のペプチドの量は、細胞が生存維持できる濃度が下限濃度であり、細胞増殖促進剤やタンパク質産生促進剤が添加されていない培地に比べて細胞増殖の量やタンパク質産生量が最大となる濃度が好適濃度であり、培地の組成として有害とならない最大濃度が上限濃度である。ペプチド１種あたりの濃度の一例は、培地に対し０．１ｍＭ～５０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ～１０ｍＭ、より好ましくは０．５ｍＭ～５ｍＭである。
【0028】
培地には、動物細胞培養用培地で使用される他の成分を適宜配合することができる。ビタミン類、核酸、アミノ酸、無機塩、糖、ポリアミン、炭水化物、タンパク質、脂肪酸、脂質、ｐＨ調整剤、亜鉛、銅、セレン等が例示される。
ビタミン類としては、塩化コリン、ナイアシンアミド、Ｄ－パントテン酸ヘミカルシウム塩、葉酸、シアノコバラミン、ピリドキサール塩酸塩、リボフラビン、ビオチン、ミオ－イノシトール、アスコルビン酸、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２等が例示される。
核酸としては、キサンチン、ヒポキサンチン、ウリジン、グアニン塩酸塩、イノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、アデニン等が例示される。
アミノ酸としては、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン塩酸塩、Ｌ－アスパラギン－一水和物、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン酸塩酸塩－一水和物、Ｌ－シスチン二塩酸塩、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩－一水和物、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リシン塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩、Ｌ－バリン、アルギニン等が例示される。
無機塩としては、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム－一水和物等が例示される。
その他の成分として、Ｄ－グルコース、α－リポ酸、フェノールスルホンフタレイン（フェノールレッド）、ピルビン酸ナトリウム、ＡｌｂｕＭａｘ（登録商標）ＩＩ、ヒトトランスフェリン（ホロ）、メタバナジン酸アンモニウム、硫酸銅、塩化マンガン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、グルタチオン、メトトレキサート、インスリン等があげられる。さらには、目的に応じ、ウシ胎児血清等の血清成分が含まれてもよいが、培地から動物由来の成分を除く意図がある場合は含有させない。
ビタミン類としては、塩化コリン、ナイアシンアミド、Ｄ－パントテン酸ヘミカルシウム塩、葉酸、シアノコバラミン、ピリドキサール塩酸塩、リボフラビン、ビオチン、ミオ－イノシトール、アスコルビン酸、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２等が例示される。
核酸としては、キサンチン、ヒポキサンチン、ウリジン、グアニン塩酸塩、イノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、アデニン等が例示される。
アミノ酸としては、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン塩酸塩、Ｌ－アスパラギン－一水和物、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン酸塩酸塩－一水和物、Ｌ－シスチン二塩酸塩、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩－一水和物、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リシン塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩、Ｌ－バリン、アルギニン等が例示される。
無機塩としては、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム－一水和物等が例示される。
その他の成分として、Ｄ－グルコース、α－リポ酸、フェノールスルホンフタレイン（フェノールレッド）、ピルビン酸ナトリウム、ＡｌｂｕＭａｘ（登録商標）ＩＩ、ヒトトランスフェリン（ホロ）、メタバナジン酸アンモニウム、硫酸銅、塩化マンガン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、グルタチオン、メトトレキサート、インスリン等があげられる。さらには、目的に応じ、ウシ胎児血清等の血清成分が含まれてもよいが、培地から動物由来の成分を除く意図がある場合は含有させない。
【0029】
（細胞増殖方法及びタンパク質産生方法）
本発明の細胞増殖方法及びタンパク質産生方法は、上記培地に本発明のペプチドを配合し、様々な動物細胞を培養することによって行うものである。
細胞増殖方法及びタンパク質産生方法は、以下に例示するが、これに限定されるものではない。
本発明の細胞増殖方法及びタンパク質産生方法は、上記培地に本発明のペプチドを配合し、様々な動物細胞を培養することによって行うものである。
細胞増殖方法及びタンパク質産生方法は、以下に例示するが、これに限定されるものではない。
【0030】
基礎培地を用いて、動物細胞を無血清浮遊化に馴化させる。
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを基礎培地に添加する。このとき、基礎培地を補強する成分である、ビタミン、核酸、糖、ポリアミン、アミノ酸を添加してもよい。
バイオリアクターを用いて、ペプチドが添加された基礎培地に、基礎培地で馴化した動物細胞を播種し、細胞増殖及びタンパク質産生を行う。
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを基礎培地に添加する。このとき、基礎培地を補強する成分である、ビタミン、核酸、糖、ポリアミン、アミノ酸を添加してもよい。
バイオリアクターを用いて、ペプチドが添加された基礎培地に、基礎培地で馴化した動物細胞を播種し、細胞増殖及びタンパク質産生を行う。
【実施例0031】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【0032】
（各ペプチド溶液の濃度と生細胞数の関係の測定）
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）の配列を有するペプチドを合成し、表１～表１０に記載の１０倍濃度となるように、ペプチド溶液をそれぞれ調製した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌプレートへ１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（１００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を９０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（１０μＬ）をそれぞれ添加して（合計１００μＬ／ｗｅｌｌ）、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内の表１～表１０に記載の終濃度とし、５日間培養した。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。５日間の培養後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２時間呈色反応させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長は６３０ｎｍとした。なお、４５０ｎｍの吸光度は細胞数と相関することが確認されている。
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）の配列を有するペプチドを合成し、表１～表１０に記載の１０倍濃度となるように、ペプチド溶液をそれぞれ調製した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌプレートへ１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（１００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を９０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（１０μＬ）をそれぞれ添加して（合計１００μＬ／ｗｅｌｌ）、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内の表１～表１０に記載の終濃度とし、５日間培養した。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。５日間の培養後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２時間呈色反応させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長は６３０ｎｍとした。なお、４５０ｎｍの吸光度は細胞数と相関することが確認されている。
【0033】
【0034】
【表1】
【0035】
【表2】
【0036】
【表3】
【0037】
【表4】
【0038】
【表5】
【0039】
【表6】
【0040】
【表7】
【0041】
【表8】
【0042】
【表9】
【0043】
【表10】
【0044】
表１～表１０、図１～図１０より、試験したペプチドにおいては、ＧＧＧを除き、ペプチド溶液を添加することにより、添加しない場合に比べ、細胞数が増えることが分かった。また、ペプチドの種類により、細胞数が最も増えるペプチド溶液の濃度は異なることが分かった。
【0045】
さらに、ペプチド溶液の濃度を最適化した場合の細胞増殖促進の程度を比較して示すため、試験した各ペプチドについて、細胞数が最も増えるペプチド溶液の濃度における吸光度について、表１１及び図１１にまとめた。
【0046】
【表11】
【0047】
上記試験条件においては、ペプチドの配列が、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）の順に細胞増殖が促進されることが分かった。
【0048】
（各ペプチドの細胞増殖日数と細胞数の関係の測定）
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）は１１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を１．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．０ｍＭとした。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌプレートへ１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（１００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を９０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（１０μＬ）をそれぞれ添加して（合計１００μＬ／ｗｅｌｌ）、０～５日間培養した。１日毎に、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２時間呈色反応させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長は６３０ｎｍとした。なお、４５０ｎｍの吸光度は細胞数と相関することが確認されている。比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）は１１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を１．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．０ｍＭとした。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌプレートへ１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（１００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を９０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（１０μＬ）をそれぞれ添加して（合計１００μＬ／ｗｅｌｌ）、０～５日間培養した。１日毎に、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２時間呈色反応させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長は６３０ｎｍとした。なお、４５０ｎｍの吸光度は細胞数と相関することが確認されている。比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
【0049】
以上の調製、培養、測定をｎ＝３で行い、１日毎の各ペプチド溶液の吸光度及び標準偏差を表１２、図１２に示した。
【0050】
【表12】
【0051】
表１２及び図１２より、上記試験条件においては、ペプチド溶液を添加することにより、添加しない系に比べ、日数が経過するに従い細胞数が増えることが分かった。
【0052】
（各ペプチドのコート剤上での細胞増殖試験－３日間－）
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を２．１ｍＭ、２．２ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、４ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートへ５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、３日間培養した。細胞を回収し細胞数をカウントした。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を２．１ｍＭ、２．２ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、４ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートへ５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、３日間培養した。細胞を回収し細胞数をカウントした。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
【0053】
各ｗｅｌｌ中の培地を１．５ｍＬチューブに回収し、ＭＥＭα２００μＬでリンスし、リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。その後、トリプシン１００μＬを添加して３分間インキュベートを行った。１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα３００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。再度、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα２００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。
【0054】
１．５ｍＬチューブに回収した細胞に対し、遠心操作を行った。遠心条件は、１０００ｒｐｍ、１０分間、４℃とした。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び生存率を測定した。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び生存率を測定した。
【0055】
【0056】
【表13】
【0057】
【表14】
【0058】
【0059】
（各ペプチドのコート剤上での細胞増殖試験－５日間－）
Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）は２５ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を２．２ｍＭ、２．０ｍＭ、２．１ｍＭ、２．５ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、４ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌへ５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。細胞を回収し細胞数をカウントした。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）は２５ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を２．２ｍＭ、２．０ｍＭ、２．１ｍＭ、２．５ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、４ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌへ５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。細胞を回収し細胞数をカウントした。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
【0060】
各ｗｅｌｌ中の培地を１．５ｍＬチューブに回収し、ＭＥＭα２００μＬでリンスし、リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。その後、トリプシン１００μＬを添加して３分間インキュベートを行った。１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα３００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。再度、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα２００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。
【0061】
１．５ｍＬチューブに回収した細胞に対し、遠心操作を行った。遠心条件は、１０００ｒｐｍ、１０分間、４℃とした。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び細胞生存率を測定した。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び細胞生存率を測定した。
【0062】
【0063】
【表15】
【0064】
【表16】
【0065】
【0066】
（各ペプチド及びペプチドを組み合わせた、コート剤上での細胞増殖試験及びタンパク質産生試験）
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）は１１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を１．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．０ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を、２ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・５００μＬとなるように調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させたＤＭＥＭ培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＤＭＥＭ基礎培地を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去、ＤＭＥＭ基礎培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＤＭＥＭ基礎培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。
ペプチドはＧＰＰ、ＤＧＰ、ＧＥＫ、ＡＧＫの単体の他、ＧＰＰ＋ＧＥＫ、ＧＰＰ＋ＡＧＫ、ＤＧＰ＋ＧＥＫ、ＧＥＫ＋ＡＧＫ、ＤＧＰ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＧＥＫ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＤＧＰ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＤＧＰ＋ＧＥＫの組み合わせを用いた。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）は１１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を１．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．０ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を、２ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・５００μＬとなるように調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させたＤＭＥＭ培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＤＭＥＭ基礎培地を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去、ＤＭＥＭ基礎培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＤＭＥＭ基礎培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。
ペプチドはＧＰＰ、ＤＧＰ、ＧＥＫ、ＡＧＫの単体の他、ＧＰＰ＋ＧＥＫ、ＧＰＰ＋ＡＧＫ、ＤＧＰ＋ＧＥＫ、ＧＥＫ＋ＡＧＫ、ＤＧＰ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＧＥＫ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＤＧＰ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＤＧＰ＋ＧＥＫの組み合わせを用いた。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
【0067】
産生タンパク質量を測定するために、培地上清１００μＬを１．５ｍＬチューブに回収し、希釈し、ＥＬＩＳＡ法により産生タンパク質量を定量した。
【0068】
細胞を回収するため、各ｗｅｌｌ中の培地を１．５ｍＬチューブに回収し、ＤＭＥＭ基礎培地２００μＬでリンスし、リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。その後、トリプシン１００μＬを添加して３分間インキュベートを行った。１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ基礎培地３００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。再度、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ基礎培地２００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。
【0069】
１．５ｍＬチューブに回収した細胞に対し、遠心操作を行った。遠心条件は、１０００ｒｐｍ、１０分間、４℃とした。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び細胞生存率を測定した。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び細胞生存率を測定した。
【0070】
以上の調製、培養、測定をｎ＝３で行い、各ペプチド溶液における生細胞数を表１７、図１７、表２０、図２０、表２３、図２３に示し、各ペプチド溶液における細胞生存率を表１８、図１８、表２１、図２１、表２４、図２４に示し、各ペプチド溶液における産生タンパク質量を表１９、図１９、表２２、図２２、表２５、図２５に示した。
【0071】
【表17】
【0072】
【表18】
【0073】
【表19】
【0074】
【表20】
【0075】
【表21】
【0076】
【表22】
【0077】
【表23】
【0078】
【表24】
【0079】
【表25】
【0080】
【0081】
（各ペプチドの細胞増殖試験及びタンパク質産生試験－ビタミン及び核酸の添加効果－）
Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、１．０ｍＭ及び２．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。
ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を、２ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を、１ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（５００μＬ）となるように２４ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させたＤＭＥＭ培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＤＭＥＭ基礎培地を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＤＭＥＭ基礎培地（５００μＬ）で洗い出した後、各ペプチド溶液（５００μＬ）をそれぞれのｗｅｌｌに分注して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。
Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、１．０ｍＭ及び２．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。
ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を、２ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を、１ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（５００μＬ）となるように２４ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させたＤＭＥＭ培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＤＭＥＭ基礎培地を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＤＭＥＭ基礎培地（５００μＬ）で洗い出した後、各ペプチド溶液（５００μＬ）をそれぞれのｗｅｌｌに分注して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。
【0082】
以下の試験区の評価培地にそれぞれ培地交換した後、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで５日間培養した。
＜評価培地＞
・ＤＭＥＭ基礎培地
・ＡＧＫ（１ｍＭ）＋ＤＭＥＭ基礎培地
・ＡＧＫ（２ｍＭ）＋ＤＭＥＭ基礎培地
・ビタミン及び核酸補強培地（ＤＭＥＭ基礎培地＋ビタミン＋核酸）
・ＡＧＫ（１ｍＭ）＋ビタミン及び核酸補強培地
・ＡＧＫ（２ｍＭ）＋ビタミン及び核酸補強培地
＜評価培地＞
・ＤＭＥＭ基礎培地
・ＡＧＫ（１ｍＭ）＋ＤＭＥＭ基礎培地
・ＡＧＫ（２ｍＭ）＋ＤＭＥＭ基礎培地
・ビタミン及び核酸補強培地（ＤＭＥＭ基礎培地＋ビタミン＋核酸）
・ＡＧＫ（１ｍＭ）＋ビタミン及び核酸補強培地
・ＡＧＫ（２ｍＭ）＋ビタミン及び核酸補強培地
【0083】
培養５日後、２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌの培地を全量回収し、遠心操作（５０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を別途回収して産生タンパク質量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【0084】
上記ビタミン及び核酸の組成は、表２６に示した。
【0085】
【表26】
【0086】
培地回収後のｗｅｌｌに接着している細胞は、トリプシン処理により剥離し、再度１０％ＦＢＳを含有したＤＭＥＭ基礎培地に懸濁させ、セルカウンターにてトリパンブルー染色法により生細胞数及び生存率を測定した。
【0087】
以上の調製、培養、測定をｎ＝３で行い、各評価培地における生細胞数、細胞生存率、産生タンパク質量を表２７に示し、生細胞数と産生タンパク質量を図２６に示した。
【0088】
【表27】
【0089】
表２７、図２６より、上記試験条件においては、基礎培地に対し、ペプチドを添加すると、生細胞数、産生タンパク質量ともに多くなるが、さらにビタミンと核酸を添加すると細胞増殖もタンパク質産生もより促進されることが分かった。
【0090】
（完全合成培地にペプチドを添加した場合の細胞増殖試験及びタンパク質産生試験）
【0091】
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ、２．６ｍＭ、５．１ｍＭ、１０ｍＭ、２０．５ｍＭ、４１ｍＭの濃度のペプチド溶液を調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加して、それぞれ終濃度を０ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．５１ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０５ｍＭ、４．１ｍＭとした。本試験には、ＣＨＯ用の完全合成培地であるＡＳＦ１０４培地（味の素）に、２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＡＳＦ１０４基礎培地に馴化させたＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を使用した。細胞濃度が４ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートへ４５０μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、ＣＨＯ用の完全合成培地であるＡＳＦ１０４培地（味の素）に、２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＡＳＦ１０４基礎培地を用いた。
【0092】
２４時間後、調製したペプチド溶液を５０μＬずつ添加し、５日間培養した。培養後に細胞を回収して生細胞数をカウントした。
＜評価培地＞
・ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（０．２６ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（０．５１ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（１．０ｍＭ） ＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（２．０５ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（４．１ｍＭ） ＋ＡＳＦ１０４基礎培地
＜評価培地＞
・ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（０．２６ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（０．５１ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（１．０ｍＭ） ＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（２．０５ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（４．１ｍＭ） ＋ＡＳＦ１０４基礎培地
【0093】
産生タンパク質量を定量するために、培地上清１００μＬを１．５ｍＬチューブに採取した。該上清を希釈し、ＥＬＩＳＡ法により産生タンパク質量を測定した。
【0094】
細胞を解析するために、各ｗｅｌｌ中の培地を１．５ｍＬチューブに回収し、ＰＢＳ２００μＬでリンスし、リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。その後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ１００μＬを添加して１分間インキュベートを行った。トリプシンインヒビター１００μＬを添加して同じ１．５ｍＬチューブに回収した。
ＰＢＳ２００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した後、遠心操作を行った。ＰＢＳ１００μＬで懸濁させ、セルカウンターにてトリパンブルー染色法により生細胞数及び細胞生存率を測定した。
ＰＢＳ２００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した後、遠心操作を行った。ＰＢＳ１００μＬで懸濁させ、セルカウンターにてトリパンブルー染色法により生細胞数及び細胞生存率を測定した。
【0095】
【0096】
【表28】
【0097】
【表29】
【0098】
【表30】
【0099】
表２８～表３０、図２７～図２９より、上記試験条件において、市販の完全合成培地を用いた基礎培地に比べ、ＧＥＫのペプチドを添加した場合、生細胞数は増加し、細胞生存率は同等に高く、産生タンパク質量も増加傾向がみられ、細胞増殖を促進し、タンパク質産生を促進することが分かった。
【0100】
（浮遊細胞系におけるＧＥＫ及びＤＧＰの細胞増殖試験及びタンパク質産生試験）
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）の配列を有するペプチドを合成し、２．８７ｍＭのＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、１．５５ｍＭのＡｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）のペプチド溶液を調製した。
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）の配列を有するペプチドを合成し、２．８７ｍＭのＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、１．５５ｍＭのＡｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）のペプチド溶液を調製した。
【0101】
Ｍｉｃｒｏ－２４バイオリアクターシステム（日本ポール社製）の２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌにＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地やビタミン等補強培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地＋ビタミン等補強成分）、各ペプチド溶液を５ｍＬずつ加え、３７℃、ｐＨ７、撹拌速度６５０ｒｐｍの条件で一晩培養した。翌日にｐＨキャリブレーションを行い、その後、３．５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌに２ｍＬずつ加え、浮遊細胞の細胞密度が１ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（７ｍＬ／ｗｅｌｌ）となるように播種し、３７℃、ｐＨ７、撹拌速度６５０ｒｐｍ、溶存酸素３０％の培養条件、以下の評価培地で培養した。
＜評価培地＞
・ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地
・ビタミン等補強培地（基礎培地＋ビタミン等補強成分）
・ＧＥＫ（２．０５ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
・ＤＧＰ（１．１１ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
なお、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、１０μＬ／ｍＬのＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、１０μＬ／ｍＬの１０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を配合したＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地を用いた。
＜評価培地＞
・ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地
・ビタミン等補強培地（基礎培地＋ビタミン等補強成分）
・ＧＥＫ（２．０５ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
・ＤＧＰ（１．１１ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
なお、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、１０μＬ／ｍＬのＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、１０μＬ／ｍＬの１０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を配合したＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地を用いた。
【0102】
使用する浮遊細胞には、ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を無血清浮遊化に馴化し、振とう型培養装置（Ｃｕｓｔｏｍ Ｂｉｏ Ｓｈａｋｅｒ ＣＯ２－ＢＲ－４３ＦＬ、タイテック社）で、１００ｍＬ容三角フラスコを用いて、３７℃、ＣＯ2５％、撹拌速度１２５ｒｐｍの培養条件で継代培養をしている無血清浮遊化ＣＨＯ ＤＰ－１２を用いた。
【0103】
上記ビタミン等補強成分を、表３１に示す。
【0104】
【表31】
【0105】
培養３日目以降、２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌから培地２００μＬを１．５ｍＬのチューブに回収した。うち、５０μＬを別の１．５ｍＬのチューブに取り、トリパンブルー５０μＬを加えて十分に懸濁させた後、セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により生細胞数及び生存率を測定した。
【0106】
【0107】
【表32】
【0108】
【表33】
【0109】
【0110】
培養３日目以降、２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌから回収した培地２００μＬのうち、１５０μＬを１．５ｍＬのチューブで遠心操作（５０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を別途回収して産生タンパク質量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
表３４、図３２に、測定された産生タンパク質量を示した。
表３４、図３２に、測定された産生タンパク質量を示した。
【0111】
【表34】
【0112】
表３４、図３２より、基礎培地、あるいは、ビタミン等強化培地に対し、ペプチドを添加すると、産生タンパク質量は多くなることが分かった。
【0113】
（浮遊細胞系におけるＡＧＫ及びＧＰＰのタンパク質産生試験）
Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）及びＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）の配列を有するペプチドを合成し、５．５３ｍＭのＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、及び、６．１６ｍＭのＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）のペプチド溶液を調製した。
Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）及びＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）の配列を有するペプチドを合成し、５．５３ｍＭのＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、及び、６．１６ｍＭのＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）のペプチド溶液を調製した。
【0114】
Ｍｉｃｒｏ－２４バイオリアクターシステム（日本ポール社製）の２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌに基礎培地やビタミン等補強培地（基礎培地＋ビタミン等補強成分）、各ペプチド溶液を５ｍＬずつ加え、３７℃、ｐＨ７、６５０ｒｐｍの条件で一晩培養した。翌日にｐＨキャリブレーションを行い、その後、３．５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌに２ｍＬずつ加え、浮遊細胞の細胞密度が１ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（７ｍＬ／ｗｅｌｌ）となるように播種し、３７℃、ｐＨ７、６５０ｒｐｍ、溶存酸素３０％の培養条件、以下の評価培地で培養した。
＜評価培地＞
・基礎培地
・ビタミン等補強培地（基礎培地＋ビタミン等補強成分）
・ＡＧＫ（３．９５ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
・ＧＰＰ（４．４０ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
なお、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、１０μＬ／ｍＬのＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、１０μＬ／ｍＬの１０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を配合した基礎培地を用いた。
＜評価培地＞
・基礎培地
・ビタミン等補強培地（基礎培地＋ビタミン等補強成分）
・ＡＧＫ（３．９５ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
・ＧＰＰ（４．４０ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
なお、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、１０μＬ／ｍＬのＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、１０μＬ／ｍＬの１０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を配合した基礎培地を用いた。
【0115】
使用する浮遊細胞には、ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を無血清浮遊化に馴化し、振とう型培養装置（Ｃｕｓｔｏｍ Ｂｉｏ Ｓｈａｋｅｒ ＣＯ２－ＢＲ－４３ＦＬ、タイテック社）で、１００ｍＬ容三角フラスコを用いて、３７℃、ＣＯ2５％、撹拌速度１２５ｒｐｍの培養条件で継代培養をしている無血清浮遊化ＣＨＯ ＤＰ－１２を用いた。
【0116】
上記ビタミン等補強成分は表３１に示したものである。
【0117】
培養３日目以降、２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌから培地１５０μＬを１．５ｍＬのチューブに回収し、遠心操作（５０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を回収して産生タンパク質量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
表３５、図３３に、測定された産生タンパク質量を示した。
表３５、図３３に、測定された産生タンパク質量を示した。
【0118】
【表35】
【0119】
表３５、図３３より、上記試験条件において、基礎培地、あるいは、ビタミン等補強培地に対し、ペプチドを添加すると、産生タンパク質量は多くなることが分かった。
【0120】
なお、上記浮遊細胞系でのタンパク質産生において、ＣＨＯ細胞を無血清浮遊化したが、まず血清培地のみを用いて細胞培養を行い、その後、血清培地と無血清培地を半々にして細胞培養を行い、最後に無血清培地のみを用いて細胞培養を行うことにより、馴化させてもよい。
【0121】
また、上記浮遊細胞系におけるタンパク質産生試験において、ＣＨＯ細胞を用いたが、本発明のペプチドを含む培地は、その他の物質産生に利用されるハイブリドーマ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ｓｆ９等の細胞株にも適用可能である。
【0122】
本発明のペプチドによるタンパク質産生方法は、上記バッチ培養の他、産生中に培地を継ぎ足すフェドバッチ培養の工程を含んでもよい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）からなるペプチド。
【請求項2】
請求項１記載のペプチドを含む、細胞増殖促進剤。
【請求項3】
請求項１記載のペプチドを含む、タンパク質産生促進剤。
【請求項4】
請求項２記載の細胞増殖促進剤、又は、請求項３記載のタンパク質産生促進剤を含む、培地。
【請求項5】
請求項１記載のペプチドを用いた、細胞増殖促進方法。
【請求項6】
請求項１記載のペプチドを用いた、タンパク質産生促進方法。
【請求項7】
バッチ培養又はフェドバッチ培養を含む、請求項６に記載のタンパク質産生促進方法。