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特開2025-10148タンパク質発現の増加および／またはハプロ不全障害の治療のための方法および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025010148
(43)【公開日】2025-01-20
(54)【発明の名称】タンパク質発現の増加および／またはハプロ不全障害の治療のための方法および組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20250109BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250109BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12N15/63 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024170988
(22)【出願日】2024-09-30
(62)【分割の表示】P 2021517022の分割
【原出願日】2019-09-26
(31)【優先権主張番号】62/736,847
(32)【優先日】2018-09-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】597138069
【氏名又は名称】ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ
(71)【出願人】
【識別番号】500482810
【氏名又は名称】ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100227329
【弁理士】
【氏名又は名称】延原 愛
(72)【発明者】
【氏名】コラー，ジェフリー エム．
(72)【発明者】
【氏名】スウィート，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】ロディッシュ，ハーベイ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】非最適コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物の哺乳動物細胞における発現を増加させるための方法を提供する。
【解決手段】方法は、（ｉ）第１の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第１の外因性ｔＲＮＡを哺乳動物細胞に導入することを含み、前記細胞への前記第１の外因性ｔＲＮＡの導入が、第１の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。
【選択図】図１
【解決手段】方法は、（ｉ）第１の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第１の外因性ｔＲＮＡを哺乳動物細胞に導入することを含み、前記細胞への前記第１の外因性ｔＲＮＡの導入が、第１の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の非最適コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物の哺乳動物細胞における発現を増加させる方法であって、（ｉ）前記第１の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第１の外因性ｔＲＮＡを前記細胞に導入することを含み、前記細胞への前記第１の外因性ｔＲＮＡの導入が、前記第１の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して前記遺伝子産物の前記発現を増加させる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２６日に出願された米国仮出願第６２／７３６，８４７号の優先権を主張し、その主題は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年９月２６日に出願された米国仮出願第６２／７３６，８４７号の優先権を主張し、その主題は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、概して、非最適コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を増加させるための、かつ／または対象におけるハプロ不全障害を治療するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
ハプロ不全は、１つの遺伝子の対立遺伝子が不活性化され、残りの活性対立遺伝子から発現される遺伝子産物の量が適切な遺伝子機能にとって不十分な場合に起こる。多くの障害は、ハプロ不全に関連しているか、またはハプロ不全によって引き起こされる。
【0004】
ハプロ不全障害の一例はドラベ（Ｄｒａｖｅｔ）症候群である。ドラベ症候群は、乳児期に始まる、まれで壊滅的な形態の難治性てんかんである。最初に、患者は長期の発作を経験する。２年目には、さらなる型の発作が発生し始め、これは通常、おそらく繰り返しの脳低酸素症が原因で、発達の低下と一致する。これは、言語および運動能力の発達不良につながる。ＳＣＮ１Ａ（電位依存性ナトリウムチャネルαサブユニットをコードする）、ＳＣＮ１Ｂ（電位依存性ナトリウムチャネルβ１サブユニットをコードする）、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ９Ａ、ＧＡＢＲＧ２（γ－アミノ酪酸受容体γ２サブユニットをコードする）、ＧＡＢＲＤ（γ－アミノ酪酸受容体Δサブユニットコードする）および／またはＰＣＤＨ１９遺伝子における変異は、ドラベ症候群に関連している。
【0005】
例えば、ドラベ症候群は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における変異によって引き起こされ、１つのＳＣＮ１Ａ遺伝子の対立遺伝子が不活性化され、機能的なＳＣＮ１Ａ遺伝子産物の量の不足または減少をもたらす。ＳＣＮ１Ａ遺伝子は通常、ニューロンの電位依存性ナトリウムチャネルαサブユニット、Ｎａ（Ｖ）１．１をコードする。マウスモデルにおいて、ＳＣＮ１Ａでの機能喪失型変異は、ナトリウム電流の減少をもたらし、海馬のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの興奮性を損なうことが観察されている。
【0006】
したがって、当技術分野において、タンパク質発現を増加させ、ドラベ症候群を含むハプロ不全によって媒介される疾患を治療するための改良された組成物および方法が必要とされる。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、概して、非最適コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を増加させるための、かつ／または対象におけるハプロ不全障害を治療するための方法および組成物に関する。目的の遺伝子における非最適コドンの存在は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの不安定化をもたらし、その遺伝子によってコードされる機能性タンパク質の産生に影響を与え得る。そのような状況では、ｍＲＮＡ転写産物の不安定化は、例えば、非最適コドンにハイブリダイズする特定のアミノアシル化ｔＲＮＡ分子の存在量が、同じアミノ酸でアミノアシル化された細胞内で利用可能な他の異なるｔＲＮＡよりも少ない場合に起こり得る。驚くべきことに、他の天然に豊富なｔＲＮＡと比較して細胞内のそのようなｔＲＮＡの存在量を増加させることは、細胞によって産生される機能性タンパク質の発現および／または量を促進させ得ることが発見されている。遺伝子産物、例えばタンパク質の発現は、遺伝子における非最適コドンをデコードする最小数（例えば、１、２、または３）のｔＲＮＡの細胞への導入によって、増加および／または選択的に増加され得る（すなわち、遺伝子産物の発現は、別の遺伝子産物よりもまたはいかなる他の遺伝子産物よりも増加され得る）。
【0008】
同様に、非最適コドンを含む遺伝子を有する対象について、非最適コドンをデコードする有効量のｔＲＮＡの対象への投与は、対象における遺伝子からの遺伝子産物の発現を増加させ得る。したがって、対象へのｔＲＮＡの投与は、対象における遺伝子産物の不十分な発現によって媒介される疾患、例えば、ハプロ不全障害を治療し得る。さらに、本明細書に記載の方法および組成物の特徴は、それらを、ヒト対象における障害、例えば、ハプロ不全障害の治療における使用に望ましいものにする。例えば、ｔＲＮＡはサイズが比較的小さく、組換え技術により産生し得、本明細書に記載の方法および組成物は、対立遺伝子が不活性化された変異またはメカニズムに関係なく、ハプロ不全障害を治療し得る。
【0009】
したがって、一態様において、本開示は、第１の非最適コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物の哺乳動物細胞における発現を増加させる方法を提供する。方法は、（ｉ）第１の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第１の外因性ｔＲＮＡを細胞に導入することを含み、細胞への第１の外因性ｔＲＮＡの導入は、第１の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。
【0010】
特定の実施形態において、遺伝子は、第２の非最適コドンを含み、方法は、（ｉ）第２の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第２の外因性ｔＲＮＡを細胞に導入することをさらに含み、細胞への第２の外因性ｔＲＮＡの導入は、第２の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。特定の実施形態において、遺伝子は、第３の非最適コドンを含み、方法は、（ｉ）第３の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第３の外因性ｔＲＮＡを細胞に導入することをさらに含み、細胞への第３の外因性ｔＲＮＡの導入は、第３の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。
【0011】
別の態様において、本開示は、第１の非最適コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物の哺乳動物細胞における発現を増加させる方法を提供する。方法は、（ｉ）第１の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、第１の外因性ｔＲＮＡを発現することができる有効量の第１の発現ベクターを細胞に導入することを含み、細胞における第１の外因性ｔＲＮＡの発現は、第１の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。
【0012】
特定の実施形態において、遺伝子は、第２の非最適コドンを含み、方法は、（ｉ）第２の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、第２の外因性ｔＲＮＡを発現することができる有効量の第２の発現ベクターを細胞に導入することをさらに含み、細胞における第２の外因性ｔＲＮＡの発現は、第２の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。特定の実施形態において、遺伝子は、第３の非最適コドンを含み、方法は、（ｉ）第３の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、第３の外因性ｔＲＮＡを発現することができる有効量の第３の発現ベクターを細胞に導入することをさらに含み、細胞における第３の外因性ｔＲＮＡの発現は、第３の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。
【0013】
特定の実施形態において、第１、第２、および／または第３の発現ベクターは同じである。特定の実施形態において、第１、第２、および／または第３の発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【0014】
発現を増加させる前述の方法のいずれかの特定の実施形態において、細胞はヒト細胞である。特定の実施形態において、細胞は、中枢神経系細胞、例えばニューロンである。
【0015】
特定の実施形態において、遺伝子は、ＡＧＧＦ１、ＡＲＨＧＡＰ３１、ＢＭＰＲ２、ＣＨＤ７、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＴＬＡ４、ＣＴＮＮＢ１、ＤＬＬ４、ＥＨＭＴ１、ＥＬＮ、ＥＮＧ、ＦＡＳ、ＦＢＮ１、ＦＯＸＧ１、ＧＡＴＡ３、ＧＬＩ３、ＧＲＮ、ＩＲＦ６、ＪＡＧ１、ＫＣＮＱ４、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＢＤ５、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＩＴＦ、ＭＮＸ１、ＭＹＣＮ、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＸ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＳＤ１、ＰＡＸ３、ＰＨＩＰ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＡＩ１、ＲＢＰＪ、ＲＰＳ１４、ＲＵＮＸ２、ＳＡＬＬ４、ＳＣＮ１Ａ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＨＡＮＫ３、ＳＨＨ、ＳＨＯＸ、ＳＬＣ２Ａ１／ＧＬＵＴ１、ＳＯＸ１０、ＳＹＮＧＡＰ１、ＴＢＸ１、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＣＦ４、ＴＣＯＦ１、ＴＧＩＦ１、ＴＮＸＢ、ＴＲＰＳ１、ＷＴ１、およびＺＩＣ２から選択される。特定の実施形態において、遺伝子は、ＳＣＮ１Ａである。
【0016】
別の態様において、本開示は、それを必要とする対象におけるハプロ不全障害を治療する方法を提供し、対象は第１の非最適コドンを含むハプロ不全遺伝子を有する。方法は、（ｉ）第１の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第１のｔＲＮＡを対象に投与することを含み、それによって対象におけるハプロ不全障害を治療する。
【0017】
特定の実施形態において、ハプロ不全遺伝子は、第２の非最適コドンを含み、方法は、（ｉ）第２の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第２のｔＲＮＡを対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態において、ハプロ不全遺伝子は、第３の非最適コドンを含み、方法は、（ｉ）第３の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第３のｔＲＮＡを対象に投与することをさらに含む。
【0018】
別の態様において、本開示は、それを必要とする対象におけるハプロ不全障害を治療する方法を提供し、対象は第１の非最適コドンを含むハプロ不全遺伝子を有する。方法は、（ｉ）第１の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、第１のｔＲＮＡを発現することができる有効量の第１の発現ベクターを対象に投与することを含み、それによって対象のハプロ不全障害を治療する。
【0019】
特定の実施形態において、ハプロ不全遺伝子は、第２の非最適コドンを含み、方法は、（ｉ）第２の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、第２のｔＲＮＡを発現することができる有効量の第２の発現ベクターを対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態において、ハプロ不全遺伝子は、第３の非最適コドンを含み、方法は、（ｉ）第３の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、第３のｔＲＮＡを発現することができる有効量の第３の発現ベクターを対象に投与することをさらに含む。
【0020】
特定の実施形態において、第１、第２、および／または第３の発現ベクターは同じである。特定の実施形態において、第１、第２、および／または第３の発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【0021】
前述の治療方法のいずれかの特定の実施形態において、対象はヒトである。
【0022】
特定の実施形態において、ハプロ不全障害は、５ｑ症候群、アダムス－オリバー（Ａｄａｍｓ－Ｏｌｉｖｅｒ）症候群１、アダムス－オリバー症候群３、アダムス－オリバー症候群５、アダムス－オリバー症候群６、アラジール（Ａｌａｇｉｌｌｅ）症候群１、自己免疫性リンパ増殖症候群ＩＡ型、自己免疫性リンパ増殖症候群Ｖ型、常染色体優性難聴－２Ａ、尿路欠損を伴うか、または伴わない脳奇形（ＢＲＭＵＴＤ）、カーニー複合（Ｃａｒｎｅｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）１型、ＣＨＡＲＧＥ症候群、鎖骨頭蓋異形成症（Ｃｌｅｉｄｏｃｒａｎｉａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、クラリーノ（Ｃｕｒｒａｒｉｎｏ）症候群、デニス－ドラッシュ（Ｄｅｎｙｓ－Ｄｒａｓｈ）症候群／フレイジャー（Ｆｒａｓｉｅｒ）症候群、発達遅延、知的障害、肥満、および異形性容貌（ＤＩＤＯＤ）、ディジョージ（ＤｉＧｅｏｒｇｅ）症候群（ＴＢＸ１関連）、ドラベ症候群、デュアン－橈側列（Ｄｕａｎｅ－ｒａｄｉａｌ ｒａｙ）症候群、エーラス－ダンロス（Ｅｈｌｅｒｓ－Ｄａｎｌｏｓ）症候群（古典的）、エーラス－ダンロス症候群（血管型）、ファインゴールド（Ｆｅｉｎｇｏｌｄ）症候群１、ＴＤＰ４３封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ＴＤＰ）、ＧＲＮ関連、ＧＬＵＴ１欠損症候群、グレイグ尖頭多合指（Ｇｒｅｉｇ ｃｅｐｈａｌｏｐｏｌｙｓｙｎｄａｃｔｙｌｙ）症候群、遺伝性出血性毛細血管拡張症１型、全前脳症３、全前脳症４、全前脳症５、ホルト－オラム（Ｈｏｌｔ－Ｏｒａｍ）症候群、副甲状腺機能低下症、感音性難聴、および腎疾患（ＨＤＲ）、クリーフストラ（Ｋｌｅｅｆｓｔｒａ）症候群１、クリッペル－トレノネー（Ｋｌｉｐｐｅｌ－Ｔｒｅｎａｕｎａｙ）症候群（ＡＡＧＦ関連）、レリ－ワイル（Ｌｅｒｉ－Ｗｅｉｌｌ）軟骨異形成症、マルファン（Ｍａｒｆａｎ）症候群、心臓欠陥を伴うか、または伴わない精神遅滞および特異顔貌（ＭＲＦＡＣＤ）、精神遅滞、常染色体優性１、精神遅滞、常染色体優性１９、精神遅滞、常染色体優性２９、ネイル－パテラ（Ｎａｉｌ－ｐａｔｅｌｌａ）症候群（ＮＰＳ）、フェラン－マクダーミッド（Ｐｈｅｌａｎ－ＭｃＤｅｒｍｉｄ）症候群、ピット－ホプキンス（Ｐｉｔｔ－Ｈｏｐｋｉｎｓ）症候群、原発性肺高血圧症１、レット（Ｒｅｔｔ）症候群（先天性変異）、スミス－マゲニス（Ｓｍｉｔｈ－Ｍａｇｅｎｉｓ）症候群（ＲＡＩ１関連）、ソトス（Ｓｏｔｏｓ）症候群１、ソトス症候群２、スティックラー（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ）症候群Ｉ型、大動脈弁上狭窄、ＳＹＮＧＡＰ１関連知的障害、トリーチャーコリンズ（Ｔｒｅａｃｈｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ）症候群、毛髪鼻指節骨症候群Ｉ型、尺骨－乳房症候群、ファンデルヴォウデ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅ）症候群１、ワールデンブルグ（Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ）症候群１型、ワールデンブルグ症候群２Ａ型、ならびにワールデンブルグ症候群４Ｃ型から選択される。特定の実施形態において、ハプロ不全障害はドラベ症候群である。
【0023】
特定の実施形態において、ハプロ不全遺伝子はＡＧＧＦ１、ＡＲＨＧＡＰ３１、ＢＭＰＲ２、ＣＨＤ７、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＴＬＡ４、ＣＴＮＮＢ１、ＤＬＬ４、ＥＨＭＴ１、ＥＬＮ、ＥＮＧ、ＦＡＳ、ＦＢＮ１、ＦＯＸＧ１、ＧＡＴＡ３、ＧＬＩ３、ＧＲＮ、ＩＲＦ６、ＪＡＧ１、ＫＣＮＱ４、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＢＤ５、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＩＴＦ、ＭＮＸ１、ＭＹＣＮ、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＸ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＳＤ１、ＰＡＸ３、ＰＨＩＰ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＡＩ１、ＲＢＰＪ、ＲＰＳ１４、ＲＵＮＸ２、ＳＡＬＬ４、ＳＣＮ１Ａ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＨＡＮＫ３、ＳＨＨ、ＳＨＯＸ、ＳＬＣ２Ａ１／ＧＬＵＴ１、ＳＯＸ１０、ＳＹＮＧＡＰ１、ＴＢＸ１、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＣＦ４、ＴＣＯＦ１、ＴＧＩＦ１、ＴＮＸＢ、ＴＲＰＳ１、ＷＴ１、およびＺＩＣ２から選択される。特定の実施形態において、ハプロ不全遺伝子は、ＳＣＮ１Ａである。
【0024】
特定の実施形態において、ハプロ不全障害は、以下の表１または表２に記載される障害であり、ハプロ不全遺伝子は、以下の表１または表２の対応する行に記載される遺伝子である。
【0025】
特定の実施形態において、方法はさらに、対象にＤＩＡＣＯＭＩＴ（登録商標）（スチリペントール）、ＥＰＩＯＤＯＬＥＸ（登録商標）（カンナビジオール）、ケトン食、ＯＮＦＩ（登録商標）（クロバザム）、ＴＯＰＡＭＡＸ（登録商標）（トピラメート）、またはバルプロ酸を投与することを含む。
【0026】
前述の方法のいずれかの特定の実施形態において、遺伝子は、以下の表１または表２に列挙される遺伝子であり、第１、第２、および／または第３の非最適コドンは、以下の表１または表２の対応する行に列挙されるコドンである。特定の実施形態において、ハプロ不全障害は、以下の表１または表２に列挙される障害であり、第１、第２、および／または第３の非最適コドンは、以下の表１または表２の対応する行に列挙されるコドンである。
【0027】
前述の方法のいずれかの特定の実施形態において、第１、第２、および／または第３の非最適コドンは、ＡＴＡ、ＧＴＡ、およびＡＧＡから選択される。
【0028】
前述の方法のいずれかの特定の実施形態において、第１、第２、および／または第３のｔＲＮＡは、配列番号１、配列番号２および配列番号３のヌクレオチド配列を含むｔＲＮＡから選択される。特定の実施形態において、第１、第２、および／または第３の発現ベクターは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0029】
別の態様において、本開示は、（ｉ）第３の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、第１、第２、および／または第３のｔＲＮＡをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および／または配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、ＤＮＡウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。別の態様において、本開示は、前述の発現ベクターのいずれかおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【0030】
本発明のこれらおよび他の態様および特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0031】
本発明は、以下の図面の参照でより完全に理解され得る。
【図1】ｍＲＮＡ転写産物を不安定化する非最適コドンを含むＳＣＮ１Ａ ｍＲＮＡ転写産物の概略図である。非最適コドンは、灰色の転写産物以外では暗い領域として示される。示されたｔＲＮＡの発現は、ｍＲＮＡ転写産物を安定化し、タンパク質の発現増加を促進する。
【図2A】コンセンサスｔＲＮＡの二次構造である。残基の番号付けは、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２１：３０１１－１５に記載されるｔＲＮＡ番号付けシステムに基づく。
【図2B】特定の真核生物のサイトゾルからのｔＲＮＡ配列の修飾プロファイルを示す表である。表中の比は、図２Ａに示される番号付けられた位置での列挙されたヌクレオチドの出現頻度を示す。修飾された残基の略語は、Ｍｏｔｏｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．において定義される。
【図3】ｔＲＮＡＡＴＡ、ｔＲＮＡＧＴＡ、およびｔＲＮＡＡＧＡの発現後のＨＥＫ２９３細胞におけるＳＣＮ１ＡおよびＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルの定量化を示すグラフである。示された値は、ΔΔＣｔ法により、ＳＣＮ１Ａを発現しているがｔＲＮＡを発現していない細胞と比較して計算された。＋は各ｔＲＮＡに対して１００ｎｇＤＮＡを示し、＋＋は各ｔＲＮＡに対して２００ｎｇのＤＮＡを示し、＋＋＋は、３００ｎｇＤＮＡ各ｔＲＮＡを示す。
【発明を実施するための形態】
【0032】
本開示は、概して、非最適コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を増加させるための、かつ／または対象におけるハプロ不全障害を治療するための方法および組成物に関する。目的の遺伝子における非最適コドンの存在は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡが不安定化をもたらし、それは遺伝子によってコードされる機能性タンパク質の産生に影響を与え得る。そのような状況下では、ｍＲＮＡ転写産物の不安定化は、例えば、非最適コドンにハイブリダイズする特定のアミノアシル化ｔＲＮＡ分子の存在量が、同じアミノ酸でアミノアシル化された細胞で利用可能な他の異なるｔＲＮＡよりも少ない場合に発生し得る。理論によって縛られることを望まないが、特定のｔＲＮＡの存在量が少ないことを考えると、タンパク質合成中にそれらの利用可能なｔＲＮＡがリボソームに到達して取り込まれるのに、他のより豊富なｔＲＮＡよりも時間がかかり得ると考えられ、それは次々に、その位置に必要なアミノ酸が組み込まれる間、タンパク質の合成に遅れを生じさせ得る。タンパク質合成速度における遅れは、ｍＲＮＡ転写産物によってコードされるタンパク質の産生の減少をもたらし得るｍＲＮＡ転写産物の対応する不安定化を誘発すると考えられる。目的の細胞におけるそのようなｔＲＮＡの存在量を他の細胞と比較して増加させると、当然、より豊富なｔＲＮＡは、細胞によって産生される機能性タンパク質の発現および／または量を促進し得ることが発見されている。
【0033】
遺伝子産物の発現、すなわち、遺伝子の発現の結果として生じる産物、例えば、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ転写産物、遺伝子によってコードされるタンパク質などの発現は、遺伝子における非最適コドンをデコードする最小数（例えば、１、２、または３）のｔＲＮＡの細胞への導入によって、増加および／または選択的に増加され得る（例えば、遺伝子産物の発現は、別の遺伝子産物よりも、またはいかなる他の遺伝子産物よりも増加され得る）。
【0034】
同様に、非最適コドンを含む遺伝子を有する対象について、非最適コドンをデコードする有効量のｔＲＮＡの対象への投与は、対象における遺伝子からの遺伝子産物の発現を増加させ得る。したがって、対象へのｔＲＮＡの投与は、対象における遺伝子産物の不十分な発現によって媒介される疾患、例えば、ハプロ不全障害を治療し得る。さらに、本明細書に記載の方法および組成物の特徴は、それらを、ヒト対象における障害、例えば、ハプロ不全障害の治療における使用に望ましいものにし得る。例えば、ｔＲＮＡはサイズが比較的小さく、組換え技術により産生され得、本明細書に記載の方法および組成物は、対立遺伝子が不活性化された変異またはメカニズムに関係なく、ハプロ不全障害を治療し得る。
【0035】
したがって、一態様において、本開示は、第１の非最適コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物の哺乳動物細胞における発現を増加させる方法を提供する。方法は、（ｉ）第１の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第１の外因性ｔＲＮＡを細胞に導入することを含み、細胞への第１の外因性ｔＲＮＡの導入は、第１の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。
【0036】
別の態様において、本開示は、第１の非最適コドンを含む遺伝子によってコードされる遺伝子産物の哺乳動物細胞における発現を増加させる方法を提供する。方法は、（ｉ）第１の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、第１の外因性ｔＲＮＡを発現することができる有効量の第１の発現ベクターを細胞に導入することを含み、細胞における第１の外因性ｔＲＮＡの発現は、第１の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。
【0037】
前述の方法のいずれかにおいて、遺伝子は、追加の非最適コドン（例えば、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０の非最適コドン）を含み得、方法はさらに、遺伝子産物の発現を増加させるために有効量の追加の外因性ｔＲＮＡまたは発現ベクター（例えば、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０の外因性ｔＲＮＡまたは発現ベクター）を細胞に導入することを含み得ることがさらに企図される。
【0038】
例えば、特定の実施形態において、遺伝子が第２および／または第３の非最適コドンを含む場合、方法は、（ｉ）第２および／または第３の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、有効量の第２および／または第３の外因性ｔＲＮＡを細胞に導入することをさらに含み、細胞への第２および／または第３の外因性ｔＲＮＡの導入は、第２および／または第３の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。特定の実施形態において、遺伝子が第２および／または第３の非最適コドンを含む場合、方法は、（ｉ）第２および／または第３の非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含み、かつ（ｉｉ）アミノ酸でアミノアシル化されることができる、第２および／または第３の外因性ｔＲＮＡを発現することができる有効量の第２および／または第３の発現ベクターを細胞に導入することをさらに含み、細胞における第２および／または第３の外因性ｔＲＮＡの発現は、第２および／または第３の外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞と比較して遺伝子産物の発現を増加させる。
【0039】
特定の実施形態において、方法は、外因性ｔＲＮＡを欠く細胞、組織、または対象と比較して、細胞、組織、または対象における遺伝子産物の発現を少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１０００％、またはそれ超増加させる。特定の実施形態において、方法は、外因性ｔＲＮＡを欠く細胞、組織、または対象と比較して、細胞、組織、または対象における遺伝子産物の発現を、約２０％～約２００％、約２０％～約１８０％、約２０％～約１６０％、約２０％～約１４０％、約２０％～約１２０％、約２０％～約１００％、約２０％～約８０％、約２０％～約６０％、約２０％～約４０％、約４０％～約２００％、約４０％～約１８０％、約４０％～約１６０％、約４０％～約１４０％、約４０％～約１２０％、約４０％～約１００％、約４０％～約８０％、約４０％～約６０％、約６０％～約２００％、約６０％～約１８０％、約６０％～約１６０％、約６０％～約１４０％、約６０％～約１２０％、約６０％～約１００％、約６０％～約８０％、約８０％～約２００％、約８０％～約１８０％、約８０％～約１６０％、約８０％～約１４０％、約８０％～約１２０％、約８０％～約１００％、約１００％～約２００％、約１００％～約１８０％、約１００％～約１６０％、約１００％～約１４０％、約１００％～約１２０％、約１２０％～約２００％、約１２０％～約１８０％、約１２０％～約１６０％、約１２０％～約１４０％、約１４０％～約２００％、約１４０％～約１８０％、約１４０％～約１６０％、約１６０％～約２００％、約１６０％～約１８０％、または約１８０％～約２００％増加させる。特定の実施形態において、方法は、外因性ｔＲＮＡを欠く細胞、組織、または対象と比較して、細胞、組織、または対象における遺伝子産物の発現を、約１００％～約１０００％、約１００％～約９００％、約１００％～約８００％、約１００％～約７００％、約１００％～約６００％、約１００％～約５００％、約１００％～約４００％、約１００％～約３００％、約１００％～約２００％、約２００％～約１０００％、約２００％～約９００％、約２００％～約８００％、約２００％～約７００％、約２００％～約６００％、約２００％～約５００％、約２００％～約４００％、約２００％～約３００％、約３００％～約１０００％、約３００％～約９００％、約３００％～約８００％、約３００％～約７００％、約３００％～約６００％、約３００％～約５００％、約３００％～約４００％、約４００％～約１０００％、約４００％～約９００％、約４００％～約８００％、約４００％～約７００％、約４００％～約６００％、約４００％～約５００％、約５００％～約１０００％、約５００％～約９００％、約５００％～約８００％、約５００％～約７００％、約５００％～約６００％、約６００％～約１０００％、約６００％～約９００％、約６００％～約８００％、約６００％～約７００％、約７００％～約１０００％、約７００％～約９００％、約７００％～約８００％、約８００％～約１０００％、約８００％～約９００％、または約９００％～約１０００％増加させる。遺伝子産物またはタンパク質の発現は、当技術分野で既知の任意の方法、例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって測定され得る。
【0040】
特定の実施形態において、方法は、外因性ｔＲＮＡを欠く同様の細胞、組織、または対象と比較して、細胞、組織、または対象において遺伝子によってコードされる遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）の安定性を増加させる。例えば、特定の実施形態において、方法は、外因性ｔＲＮＡを欠く細胞、組織、または対象と比較して、細胞、組織、または対象におけるｍＲＮＡの安定性を、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１０００％またはそれ超増加させる。特定の実施形態において、方法は、外因性ｔＲＮＡを欠く細胞、組織、または対象と比較して、細胞、組織、または対象におけるｍＲＮＡの安定性を、約２０％～約２００％、約２０％～約１８０％、約２０％～約１６０％、約２０％～約１４０％、約２０％～約１２０％、約２０％～約１００％、約２０％～約８０％、約２０％～約６０％、約２０％～約４０％、約４０％～約２００％、約４０％～約１８０％、約４０％～約１６０％、約４０％～約１４０％、約４０％～約１２０％、約４０％～約１００％、約４０％～約８０％、約４０％～約６０％、約６０％～約２００％、約６０％～約１８０％、約６０％～約１６０％、約６０％～約１４０％、約６０％～約１２０％、約６０％～約１００％、約６０％～約８０％、約８０％～約２００％、約８０％～約１８０％、約８０％～約１６０％、約８０％～約１４０％、約８０％～約１２０％、約８０％～約１００％、約１００％～約２００％、約１００％～約１８０％、約１００％～約１６０％、約１００％～約１４０％、約１００％～約１２０％、約１２０％～約２００％、約１２０％～約１８０％、約１２０％～約１６０％、約１２０％～約１４０％、約１４０％～約２００％、約１４０％～約１８０％、約１４０％～約１６０％、約１６０％～約２００％、約１６０％～約１８０％、または約１８０％～約２００％増加させる。特定の実施形態において、方法は、外因性ｔＲＮＡを欠く細胞、組織、または対象と比較して、細胞、組織、または対象におけるｍＲＮＡの安定性を、約１００％～約１０００％、約１００％～約９００％、約１００％～約８００％、約１００％～約７００％、約１００％～約６００％、約１００％～約５００％、約１００％～約４００％、約１００％～約３００％、約１００％～約２００％、約２００％～約１０００％、約２００％～約９００％、約２００％～約８００％、約２００％～約７００％、約２００％～約６００％、約２００％～約５００％、約２００％～約４００％、約２００％～約３００％、約３００％～約１０００％、約３００％～約９００％、約３００％～約８００％、約３００％～約７００％、約３００％～約６００％、約３００％～約５００％、約３００％～約４００％、約４００％～約１０００％、約４００％～約９００％、約４００％～約８００％、約４００％～約７００％、約４００％～約６００％、約４００％～約５００％、約５００％～約１０００％、約５００％～約９００％、約５００％～約８００％、約５００％～約７００％、約５００％～約６００％、約６００％～約１０００％、約６００％～約９００％、約６００％～約８００％、約６００％～約７００％、約７００％～約１０００％、約７００％～約９００％、約７００％～約８００％、約８００％～約１０００％、約８００％～約９００％、または約９００％～約１０００％増加させる。遺伝子転写産物またはｍＲＮＡの安定性は、当技術分野で既知の任意の方法、例えばノーザンブロットによって測定され得る。
【0041】
特定の実施形態において、細胞はヒト細胞である。特定の実施形態において、細胞は中枢神経系細胞、例えばニューロンである。
【0042】
特定の実施形態において、遺伝子は、ＡＧＧＦ１、ＡＲＨＧＡＰ３１、ＢＭＰＲ２、ＣＨＤ７、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＴＬＡ４、ＣＴＮＮＢ１、ＤＬＬ４、ＥＨＭＴ１、ＥＬＮ、ＥＮＧ、ＦＡＳ、ＦＢＮ１、ＦＯＸＧ１、ＧＡＴＡ３、ＧＬＩ３、ＧＲＮ、ＩＲＦ６、ＪＡＧ１、ＫＣＮＱ４、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＢＤ５、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＩＴＦ、ＭＮＸ１、ＭＹＣＮ、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＸ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＳＤ１、ＰＡＸ３、ＰＨＩＰ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＡＩ１、ＲＢＰＪ、ＲＰＳ１４、ＲＵＮＸ２、ＳＡＬＬ４、ＳＣＮ１Ａ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＨＡＮＫ３、ＳＨＨ、ＳＨＯＸ、ＳＬＣ２Ａ１／ＧＬＵＴ１、ＳＯＸ１０、ＳＹＮＧＡＰ１、ＴＢＸ１、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＣＦ４、ＴＣＯＦ１、ＴＧＩＦ１、ＴＮＸＢ、ＴＲＰＳ１、ＷＴ１、およびＺＩＣ２から選択される。特定の実施形態において、遺伝子は、ＳＣＮ１Ａである。
【0043】
特定の実施形態において、方法は、参照遺伝子からの遺伝子産物の発現を実質的に増加させない。例えば、特定の実施形態において、方法は、参照遺伝子からの遺伝子産物の発現を、約５％未満、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％増加させる。特定の実施形態において、参照遺伝子の発現における検出可能な増加はない。特定の実施形態において、参照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＤおよびＴＲＡＰＰＣ６Ａから選択される。特定の実施形態において、参照遺伝子はＧＡＰＤＨである。
【0044】
特定の実施形態において、遺伝子はＳＣＮ１Ａ遺伝子であり、方法は、外因性ｔＲＮＡを欠く細胞、組織、または対象と比較して、細胞、組織、または対象における電位依存性ナトリウムチャネル活性を少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１０００％、またはそれ超増加させる。特定の実施形態において、方法は、外因性ｔＲＮＡを欠く細胞、組織、または対象に対して、細胞、組織、または対象における電位依存性ナトリウムチャネル活性を、約２０％～約２００％、約２０％～約１８０％、約２０％～約１６０％、約２０％～約１４０％、約２０％～約１２０％、約２０％～約１００％、約２０％～約８０％、約２０％～約６０％、約２０％～約４０％、約４０％～約２００％、約４０％～約１８０％、約４０％～約１６０％、約４０％～約１４０％、約４０％～約１２０％、約４０％～約１００％、約４０％～約８０％、約４０％～約６０％、約６０％～約２００％、約６０％～約１８０％、約６０％～約１６０％、約６０％～約１４０％、約６０％～約１２０％、約６０％～約１００％、約６０％～約８０％、約８０％～約２００％、約８０％～約１８０％、約８０％～約１６０％、約８０％～約１４０％、約８０％～約１２０％、約８０％～約１００％、約１００％～約２００％、約１００％～約１８０％、約１００％～約１６０％、約１００％～約１４０％、約１００％～約１２０％、約１２０％～約２００％、約１２０％～約１８０％、約１２０％～約１６０％、約１２０％～約１４０％、約１４０％～約２００％、約１４０％～約１８０％、約１４０％～約１６０％、約１６０％～約２００％、約１６０％～約１８０％、または約１８０％～約２００％増加させる。電位依存性ナトリウムチャネル活性は、例えばＫａｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．ＮＥＵＲＯＳＣＩ．２７（４１）：１１０６５－７４，Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＮＡＴ．ＮＥＵＲＯＳＣＩ．９（９）：１１４２－９、およびＨａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＮＡＴＵＲＥ４８９（７４１６）：３８５－３９０に記載されるように、当技術分野で既知の任意の方法によって測定され得る。
【0045】
特定の実施形態において、ハプロ不全障害は、表１または表２に列挙される障害であり、ハプロ不全遺伝子は、表１または表２の対応する行に列挙される遺伝子である。特定の実施形態において、遺伝子は、表１または表２に列挙される遺伝子であり、第１、第２、および／または第３の非最適コドンは、表１または表２の対応する行に列挙されるコドンである。特定の実施形態において、ハプロ不全障害は、表１または表２に記載される障害であり、第１、第２、および／または第３の非最適コドンは、表１または表２の対応する行に記載されるコドンである。
【表1】
【表2】
【0046】
特定の実施形態において、ハプロ不全障害は、各障害に関連するハプロ不全遺伝子とともに、以下の表４、５、６または７のいずれか１つに列挙される障害である。特定の実施形態において、遺伝子は、表４、５、６または７に列挙される遺伝子であり、第１、第２、および／または第３の非最適コドンは、表４、５、６または７の対応する行に列挙されるコドンである。特定の実施形態において、ハプロ不全障害は、表４、５、６または７に列挙される障害であり、第１、第２、および／または第３の非最適コドンは、表４、５、６または７の対応する行に記載されるコドンである。表４および表５は、それぞれ、コドン使用率およびｔＲＮＡ適応指数（ｔＡＩ）に基づいて計算された、示された遺伝子の３つおよび１０個の最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンを示している。表６および表７は、それぞれ、ｔＲＮＡ遺伝子のコピー数に基づくｔＲＮＡレベルの推定値ではなく、ＨＥＫ２９３細胞におけるｔＲＮＡレベルの直接定量化に基づくコドン使用率および修正ｔＡＩに基づいて計算された、示された遺伝子の３つおよび１０個の最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンを示している。
【0047】
ＩＩ．非最適コドンをデコードする転移ＲＮＡ
Ａ．転移ＲＮＡ
タンパク質合成中、ｔＲＮＡは、成長中のタンパク質（ポリペプチド）鎖に挿入するためにアミノ酸をリボソームに送達する。ｔＲＮＡは通常約７０～１００ヌクレオチドの長さである。活性なｔＲＮＡは、合成中にｔＲＮＡに転写され得る、または転写後処理中に後から添加され得る、３’ＣＣＡ配列を含む。アミノアシル化中、所与のｔＲＮＡ分子に結合されるアミノ酸は、３’末端リボースの２’または３’ヒドロキシル基に共有結合され、アミノアシルｔＲＮＡ（ａａ－ｔＲＮＡ）を形成する。アミノ酸は、２’－ヒドロキシル基から３’－ヒドロキシル基におよびその逆に自発的に移動し得るが、３’－ＯＨ位置からリボソームで成長中のタンパク質鎖に組み込まれると考えられる。折りたたまれたａａ－ｔＲＮＡ分子の他の端にあるループは、アンチコドンとして知られる３つの塩基の配列を含む。このアンチコドン配列がリボソーム結合ｍＲＮＡ転写産物の相補的な３塩基コドン配列とハイブリダイズまたは塩基対形成すると、ａａ－ｔＲＮＡはリボソームに結合し、そのアミノ酸がリボソームによって合成されているポリペプチド鎖に組み込まれる。特定のコドンと塩基対を形成する全てのｔＲＮＡは、単一の特定のアミノ酸でアミノアシル化されているため、遺伝コードの翻訳はｔＲＮＡによって影響を受ける。ｍＲＮＡにおける６１の非終止コドンの各々は、その関連するａａ－ｔＲＮＡの結合と、リボソームによって合成されている成長中のタンパク質またはポリペプチド鎖への単一の特定のアミノ酸の付加を指示する。
Ａ．転移ＲＮＡ
タンパク質合成中、ｔＲＮＡは、成長中のタンパク質（ポリペプチド）鎖に挿入するためにアミノ酸をリボソームに送達する。ｔＲＮＡは通常約７０～１００ヌクレオチドの長さである。活性なｔＲＮＡは、合成中にｔＲＮＡに転写され得る、または転写後処理中に後から添加され得る、３’ＣＣＡ配列を含む。アミノアシル化中、所与のｔＲＮＡ分子に結合されるアミノ酸は、３’末端リボースの２’または３’ヒドロキシル基に共有結合され、アミノアシルｔＲＮＡ（ａａ－ｔＲＮＡ）を形成する。アミノ酸は、２’－ヒドロキシル基から３’－ヒドロキシル基におよびその逆に自発的に移動し得るが、３’－ＯＨ位置からリボソームで成長中のタンパク質鎖に組み込まれると考えられる。折りたたまれたａａ－ｔＲＮＡ分子の他の端にあるループは、アンチコドンとして知られる３つの塩基の配列を含む。このアンチコドン配列がリボソーム結合ｍＲＮＡ転写産物の相補的な３塩基コドン配列とハイブリダイズまたは塩基対形成すると、ａａ－ｔＲＮＡはリボソームに結合し、そのアミノ酸がリボソームによって合成されているポリペプチド鎖に組み込まれる。特定のコドンと塩基対を形成する全てのｔＲＮＡは、単一の特定のアミノ酸でアミノアシル化されているため、遺伝コードの翻訳はｔＲＮＡによって影響を受ける。ｍＲＮＡにおける６１の非終止コドンの各々は、その関連するａａ－ｔＲＮＡの結合と、リボソームによって合成されている成長中のタンパク質またはポリペプチド鎖への単一の特定のアミノ酸の付加を指示する。
【0048】
ｔＲＮＡは、概して高度に保存されており、多くの場合、種間で機能する。したがって、細菌のｔＲＮＡ、非哺乳動物の真核生物のｔＲＮＡ、または哺乳動物（例えば、ヒト）のｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡは、本明細書に記載の組成物および方法の実施において有用であり得る。天然に存在するヒトｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋなどの供給源を通じて当業者に既知であり、概して入手可能である。Ｓｐｒｉｎｚｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３３：Ｄ１３９－４０、Ｂｕｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＧＥＮＯＭＩＣＳ３５（１）：１６４－７１、Ｓｃｈｉｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．）（１９７９）“Ｔｒａｎｓｆｅｒ－ＲＮＡ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｇｒｉｓ（１９８３）“Ｔｈｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ，ＩＩ，”Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．ｔＲＮＡｓ ａｒｅ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ａｒｅ ｏｆｔｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｃｒｏｓｓ ｓｐｅｃｉｅｓも参照されたい。
【0049】
特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、任意の天然アミノ酸でアミノアシル化されているか、またはアミノアシル化されることができる。例えば、ｔＲＮＡは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンでアミノアシル化されることが可能であり得る。特定の実施形態において、アミノ酸は、セリンおよびアルギニンから選択される。
【0050】
特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、または配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド配列と８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0051】
配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内である様々な方式で決定され得る。プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって採用されたアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析（Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｊ．ＭＯＬ．ＥＶＯＬ．３６，２９０－３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２５：３３８９－３４０２、参照により組み込まれる）は、配列類似性検索用に調整される。配列データベースの検索における基本的な問題の考察については、参照により完全に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ６：１１９－１２９，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｆｕｌｌｙ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅを参照されたい。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。ヒストグラム、説明、アライメント、期待値（つまり、データベー配列に対する一致を報告するための統計的有意性の閾値）、カットオフ、マトリックス、およびフィルターの検索パラメーターは、既定値設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘで使用される既定値のスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９、参照により完全に組み込まれる）である。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは次のように調整し得る。Ｑ＝１０（ギャップ作成ペナルティ）、Ｒ＝１０（ギャップ拡張ペナルティ）、ｗｉｎｋ＝１（クエリに沿った全てのｗｉｎｋ．ｓｕｐ．ｔｈの位置でワードヒットを生成する）、およびｇａｐｗ＝１６（ギャップのあるアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）。同等のＢｌａｓｔｐパラメーター設定はＱ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１、およびｇａｐｗ＝３２であり得る。検索は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｐｔｉｏｎパラメーターを使用して実行もし得る（例：－Ｇ、ギャップを開くためのＣｏｓｔ［整数］：既定値＝ヌクレオチドの場合は５／タンパク質の場合は１１；－Ｅ、ギャップを拡張するためのＣｏｓｔ［整数］：既定値＝ヌクレオチドの場合は２／タンパク質の場合は１；－ｑ、ヌクレオチドの不一致に対するＰｅｎａｌｔｙ［整数］：既定値＝－３；－ｒ、ヌクレオチドの一致に対する利益［整数］：既定値＝１；－ｅ、期待値［実数］：既定値＝１０、－Ｗ、ワードサイズ［整数］：既定値＝ヌクレオチドの場合は１１／メガブラストの場合は２８／タンパク質の場合は３；－ｙ、切れ切れにブラスト拡張のドロップオフ（Ｘ）：既定値＝ｂｌａｓｔｎの場合は２０／その他の場合は７；－Ｘ、ギャップアラインメント（切れ切れ）についてのＸドロップオフ値：全てのプログラムで既定値＝１５、ｂｌａｓｔｎには適用されない；および－Ｚ、ギャップアラインメントの最終Ｘドロップオフ値（切れ切れ）：ｂｌａｓｔｎの場合は５０、他は２５）。一対のタンパク質アラインメントためのＣｌｕｓｔａｌＷも使用され得る（既定値のパラメーターには、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスおよびＧａｐ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１０およびＧａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１が含まれる場合がある）。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能なシーケンス間の最適な比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップ作成ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ拡張ペナルティ）を使用し、タンパク質比較の同等の設定はＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【0052】
ｔＲＮＡは、１つ以上の修飾を含み得ることが企図される。修飾ｔＲＮＡの例は、アシル化ｔＲＮＡ、アルキル化ｔＲＮＡ、アデニン、シトシン、グアニン、またはウラシル以外の１つ以上の塩基を含むｔＲＮＡ、特定のリガンドまたは抗原性、蛍光性、親和性、反応性、スペクトルの、または他のプローブ部分の結合によって共有結合的に修飾されたｔＲＮＡ、メチル化またはその他の方法で修飾された１つ以上のリボース部分を含むｔＲＮＡ、試薬、特定のリガンドの担体として、または抗原性、蛍光性、反応性、親和性、スペクトルの、または他のプローブとして機能する非天然アミノ酸を含む、２０種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸でアミノアシル化されたａａ－ｔＲＮＡ、またはこれらの組成物の任意の組み合わせを含む。修飾ｔＲＮＡ分子の例は、Ｓｏｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）“ｔＲＮＡ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｅｌ Ｙａｃｏｕｂｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＧＥＮＥＴ．４６：６９－９５、Ｇｒｏｓｊｅａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ．”ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．７３：１４７－１７６，２００４、Ｉｂｂａ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．６９：６１７－６５０、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ ＨＡＲＢＯＲ ＳＹＭＰＱＵＡＮＴ．ＢＩＯＬ．６０：７１－８２、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．１５６：１１３－１４０、Ｃｒｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＣＥＬＬ７８：６１－７１、Ｂｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２９：４７６７－４７８２、Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＴＲＥＮＤＳ ＭＯＬ．ＭＥＤ．２０：３０６－３１４、およびＢｊｏｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．５６：２６３－２８７に記載されている。
【0053】
特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチド修飾を含む。天然に存在するｔＲＮＡは、例えばＭａｃｈｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＲＮＡ ＢＩＯＬＯＧＹ１１（１２）：１６１９－１６２９に記載されている、転写後修飾された様々なヌクレオチドを含み、図２Ｂに示す残基のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、０位の２’－Ｏ－メチルグアノシンまたはＧ、１位のシュードウリジンまたはＵ、４位の２’－Ｏ－メチルアデノシン、Ａ、２’－Ｏ－メチルウリジン、Ｕ、２’－Ｏ－メチルシチジン、Ｃ、２’－Ｏ－メチルグアノシン、またはＧ、６位のＮ２－メチルグアノシンまたはＧ、７位のＮ２－メチルグアノシンまたはＧ、９位の１－メチルアデノシン、Ａ、１－メチルグアノシン、Ｇ、または修飾Ｇ、１０位のＮ２－メチルグアノシンまたはＧ、１２位のＮ４－アセチルシチジンまたはＣ、１３位のシュードウリジン、Ｕ、２’－Ｏ－メチルシチジン、またはＣ、１４位の１－メチルアデノシン、Ａ、または修飾Ａ、１６位のジヒドロウリジン（Ｄ）またはＵ、１７位のＤまたはＵ、１８位の２’－Ｏ－メチルグアノシンまたはＧ、２０位の３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、Ｄ、またはＵ、２０ａ位の３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、Ｄ、シュードウリジン、Ｕ、または修飾Ｕ、２０ｂ位のＤ、シュードウリジン、またはＵ、２５位のシュードウリジンまたはＵ、２６位のシュードウリジン、Ｕ、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｇ、または修飾Ｇ、２７位のシュードウリジン、Ｕ、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、またはＧ、２８位のシュードウリジンまたはＵ、３０位のシュードウリジンまたはＵ、３１位のシュードウリジンまたはＵ、３２位の２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、シュードウリジン、Ｕ、２’－Ｏ－メチルシチジン、３－メチルシチジン、Ｃ、または修飾Ｃ、３４位のイノシン、Ａ、２－チオウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５－カルバモイルメチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、シュードウリジン、Ｕ、修飾Ｕ、２’－Ｏ－メチルシチジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン、５－メチルシチジン、Ｃ、修飾Ｃ、キューオシン、マンノシル－キューオシン、ガラクトシル－キューオシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、またはＧ、３５位のシュードウリジンまたはＵ、３６位のシュードウリジン、Ｕ、または修飾Ｕ、３７位の１－メチルイノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ａ、修飾Ａ、１－メチルグアノシン、ペルオキシワイブトシン、ウィブトシン、Ｇ、または修飾Ｇ、３８位のシュードウリジン、Ｕ、５－メチルシチジン、Ｃ、または修飾Ｃ、３９位の１－メチルシュードウリジン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、シュードウリジン、Ｕ、２’－Ｏ－メチルグアノシン、またはＧ、４０位のシュードウリジン、Ｕ、５－メチルシチジン、またはＣ、４４位の２’－Ｏ－メチルウリジン、Ｕ、または修飾Ｕ、ｅ１１位のシュードウリジンまたはＵ、ｅ１２位のシュードウリジンまたはＵ、ｅ１４位のシュードウリジンまたはＵ、ｅ２位の３－メチルシチジンまたはＣ、４６位の７－メチルグアノシンまたはＧ、４７位のＤ、Ｕ、または修飾Ｕ、４８位のＤ、Ｕ、５－メチルシチジン、Ｃ、または修飾Ｃ、４９位のＡ、修飾Ａ、５－メチルシチジン、Ｃ、または修飾Ｃ、５０位のシュードウリジン、Ｕ、５－メチルシチジン、またはＣ、５４位の５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、５－メチルウリジン、シュードウリジン、またはＵ、５５位のシュードウリジンまたはＵ、５８位の１－メチルアデノシン、Ａ、または修飾Ａ、６４位の２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸）、Ａ、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）、Ｇ、または修飾Ｇ、６５位のシュードウリジンまたはＵ、６７位のシュードウリジン、Ｕ、Ｎ２－メチルグアノシン、またはＧ、６８位のシュードウリジンまたはＵ、および、７２位のシュードウリジン、Ｕ、５－メチルシチジン、またはＣからなる群から選択される残基のうちの１つ以上を含む。残基の番号付けは、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２１：３０１１－１５に記載されているｔＲＮＡ番号付けシステムに基づく。
【0054】
特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、５－メチルウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、および１－メチルアデノシンから選択される１つ以上のヌクレオチド修飾を含む。
【0055】
Ｂ．非最適コドン
本明細書に記載の組成物および方法において有用なｔＲＮＡは、非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含む。
本明細書に記載の組成物および方法において有用なｔＲＮＡは、非最適コドンにハイブリダイズするアンチコドンを含む。
【0056】
タンパク質合成は、合成されているタンパク質に組み込まれるアミノ酸をコードする６１個の３塩基対コドン、およびタンパク質の合成を終了させる３個の３塩基対コドン（ストップまたは終止コドンと呼ばれる）を含む遺伝コードによって指示される。遺伝コードの縮退は、２０個のアミノ酸をコードする６１個の３塩基対のコドンの組み合わせに基づく数学的結果である。同義のコドンは、同じアミノ酸をコードする３塩基対のコドンを指す。同義のコドン置換は沈黙しており、遺伝子発現または結果として生じる機能的遺伝子産物の量に影響を及ぼさないと概して考えられている。しかし、同義のコドンは翻訳装置によって異なって認識されるようである。この概念は、コドン最適性と呼ばれる。概念的には、コドンの最適性は、翻訳に関与するコドンの濃度によって課せられるアミノアシル化ｔＲＮＡ分子の供給およびそれらの需要間のバランスを反映する。したがって、リボソームは、同族のｔＲＮＡが比較的豊富であるため、一部のコドンをすばやくデコードするが、他のコドンは、ｔＲＮＡ濃度が比較的少ないため、読み取りが遅くなる（Ｔｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＣＥＬＬ１４１（２）：３４４－５４；Ｎｏｖｏａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＴＲＥＮＤＳ ＧＥＮＥＴ．２８（１１）：５７４－８１）。さらに、コドンの最適性は、ｔＲＮＡのアンチコドン／コドン相互作用の精度にある程度基づいており、デコード率に影響を与え得る（Ａｋａｓｈｉ（１９９４）ＧＥＮＥＴＩＣＳ１３６（３）：９２７－３５；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＣＥＬＬ１３４（２）：３４１－５２）。
【0057】
ｍＲＮＡ転写産物内のコドンの最適性は、ｍＲＮＡ転写産物の安定性、およびｍＲＮＡ転写産物がリボソームによって翻訳される速度に影響を与えることが示されている（Ｐｒｅｓｎｙａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＣＥＬＬ １６０（６）：１１１１－２４；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＣＥＬＬ１６７（１）：１２２－１３２）。したがって、本明細書で使用される場合、「非最適コドン」という用語は、同じアミノ酸の別のコドンを認識する異なるｔＲＮＡよりも細胞内に豊富ではないｔＲＮＡによって認識されるｍＲＮＡ転写産物中のコドンを指す。多くの場合、非最適コドンを、同じアミノ酸をコードする別のコドン（つまり、同義のコドン）に置き換えることで、細胞内により豊富なｔＲＮＡによって読み取られ、ｍＲＮＡ転写産物の安定性かつ／またはｍＲＮＡ転写産物がリボソームによって翻訳される速度を増加させる。結果として、非最適コドンは、その同族のｔＲＮＡの過剰発現がｍＲＮＡの安定性、存在量、または翻訳伸長を増強する任意のコドンである。
【0058】
コドン最適性は、ｔＲＮＡ適応指数（ｔＡＩ）、正規化された翻訳効率（ｎＴＥ）、種特異的ｔＲＮＡ適応指数（ｓＴＡＩ）、コドン適応指数（ＣＡＩ）、ｇＣＡＩおよびｍＲＮＡ安定性に対するコドン発生の相関係数（ＣＳＣ）を含む以下のアプローチのうちの１つ以上によって測定または定量化され得る。
【0059】
ｔＡＩは、ｔＲＮＡの細胞濃度（ｔＲＮＡ遺伝子のコピー数に基づく）およびデコードの効率の推定値を考慮に入れた、各コドンのコドン最適性の推定値である。ｔＡＩは、例えばｄｏｓ Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３２（１７）：５０３６－５０４４，ａｎｄ Ｍａｈｌａｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬＯＳ ＣＯＭＰＵＴ．ＢＩＯＬ．１０（１）：ｅ１００３２９４に記載されている。特定の実施形態において、非最適コドンは、所与の種、例えば、ヒトについての全てのコドンのｔＡＩ値の中央値よりも小さいｔＡＩ値を有する。
【0060】
特定の実施形態において、非最適コドンは、ｔＡＩによって決定されるように、０．４７以下の値を有する。例えば、特定の実施形態において、非最適コドンは、ＣＴＡ（Ｌｅｕ）、ＴＣＡ（Ｓｅｒ）、ＣＡＴ（Ｈｉｓ）、ＡＧＴ（Ｓｅｒ）、ＴＴＡ（Ｌｅｕ）、ＧＴＡ（Ｖａｌ）、ＡＴＡ（Ｉｌｅ）、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＴＣＧ（Ｓｅｒ）、ＴＴＴ（Ｐｈｅ）、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＣＧＡ（Ａｒｇ）、ＡＣＡ（Ｔｈｒ）、ＣＣＧ（Ｐｒｏ）、ＧＧＴ（Ｇｌｙ）、ＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＣＧＧ（Ａｒｇ）、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＣＧＴ（Ａｒｇ）、ＧＡＴ（Ａｓｐ）、ＴＡＴ（Ｔｙｒ）、ＡＣＣ（Ｔｈｒ）、ＴＣＣ（Ｓｅｒ）、ＡＣＧ（Ｔｈｒ）、ＣＣＣ（Ｐｒｏ）、ＣＴＣ（Ｌｅｕ）、ＧＴＣ（Ｖａｌ）、ＴＧＧ（Ｔｒｐ）、ＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＧＣＧ（Ａｌａ）、ＴＴＧ（Ｌｅｕ）、ＡＧＣ（Ｓｅｒ）、ＧＧＡ（Ｇｌｙ）、ＣＴＧ（Ｌｅｕ）、ＡＣＴ（Ｔｈｒ）、ＣＡＣ（Ｈｉｓ）、ＴＣＴ（Ｓｅｒ）、ＧＣＡ（Ａｌａ）、ＣＣＴ（Ｐｒｏ）、ＣＴＴ（Ｌｅｕ）、ＧＴＴ（Ｖａｌ）、ＧＧＧ（Ｇｌｙ）、ＧＡＡ（Ｇｌｕ）、ＴＴＣ（Ｐｈｅ）、ＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＴＧＴ（Ｃｙｓ）、ＴＡＣ（Ｔｙｒ）、ＧＧＣ（Ｇｌｙ）、ＡＡＴ（Ａｓｎ）、ＧＡＣ（Ａｓｐ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0061】
特定の実施形態において、非最適コドンは、ｔＡＩによって決定されるように、０．２５以下の値を有する。例えば、特定の実施形態において、非最適コドンは、ＣＴＡ（Ｌｅｕ）、ＴＣＡ（Ｓｅｒ）、ＣＡＴ（Ｈｉｓ）、ＡＧＴ（Ｓｅｒ）、ＴＴＡ（Ｌｅｕ）、ＧＴＡ（Ｖａｌ）、ＡＴＡ（Ｉｌｅ）、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＴＣＧ（Ｓｅｒ）、ＴＴＴ（Ｐｈｅ）、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＣＧＡ（Ａｒｇ）、ＡＣＡ（Ｔｈｒ）、ＣＣＧ（Ｐｒｏ）、ＧＧＴ（Ｇｌｙ）、ＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＣＧＧ（Ａｒｇ）、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＣＧＴ（Ａｒｇ）、ＧＡＴ（Ａｓｐ）、ＴＡＴ（Ｔｙｒ）、ＡＣＣ（Ｔｈｒ）、ＴＣＣ（Ｓｅｒ）、ＡＣＧ（Ｔｈｒ）、ＣＣＣ（Ｐｒｏ）、ＣＴＣ（Ｌｅｕ）、ＧＴＣ（Ｖａｌ）、ＴＧＧ（Ｔｒｐ）、ＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＧＣＧ（Ａｌａ）、ＴＴＧ（Ｌｅｕ）、ＡＧＣ（Ｓｅｒ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0062】
特定の実施形態において、非最適コドンは、ＣＴＡ（Ｌｅｕ）、ＴＣＡ（Ｓｅｒ）、ＣＡＴ（Ｈｉｓ）、ＡＧＴ（Ｓｅｒ）、ＴＴＡ（Ｌｅｕ）、ＧＴＡ（Ｖａｌ）、ＡＴＡ（Ｉｌｅ）、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＴＣＧ（Ｓｅｒ）、ＴＴＴ（Ｐｈｅ）、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＣＧＡ（Ａｒｇ）、ＡＣＡ（Ｔｈｒ）、ＣＣＧ（Ｐｒｏ）、ＧＧＴ（Ｇｌｙ）、ＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＣＧＧ（Ａｒｇ）、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＣＧＴ（Ａｒｇ）、ＧＡＴ（Ａｓｐ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＣＴＡ（Ｌｅｕ）、ＴＣＡ（Ｓｅｒ）、ＣＡＴ（Ｈｉｓ）、ＡＧＴ（Ｓｅｒ）、ＴＴＡ（Ｌｅｕ）、ＧＴＡ（Ｖａｌ）、ＡＴＡ（Ｉｌｅ）、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＴＣＧ（Ｓｅｒ）、ＴＴＴ（Ｐｈｅ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＣＴＡ（Ｌｅｕ）、ＴＣＡ（Ｓｅｒ）、ＣＡＴ（Ｈｉｓ）、ＡＧＴ（Ｓｅｒ）、ＴＴＡ（Ｌｅｕ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0063】
コドンの最適性は、ｔＲＮＡ遺伝子のコピー数に基づく推定値の代わりに、所与の細胞内のｔＲＮＡレベルの直接定量化に基づくｔＡＩの修正バージョンによって測定され得る。ｔＲＮＡレベルは、例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＮＡＴ．ＭＥＴＨＯＤＳ．１２（９）：８３５－８３７に記載されているような、当技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。例えば、特定の実施形態において、非最適コドンは、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＣＴＣ（Ｌｅｕ）、ＡＴＡ（Ｉｌｅ）、ＣＣＣ（Ｐｒｏ）、ＣＴＡ（Ｌｅｕ）、ＣＴＴ（Ｌｅｕ）、ＴＡＴ（Ｔｙｒ）、ＣＣＴ（Ｐｒｏ）、ＴＧＴ（Ｃｙｓ）、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＧＣＡ（Ａｌａ）、ＴＣＣ（Ｓｅｒ）、ＴＡＣ（Ｔｙｒ）、ＧＣＧ（Ａｌａ）、ＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＣＧＴ（Ａｒｇ）、ＣＣＧ（Ｐｒｏ）、ＧＧＡ（Ｇｌｙ）、ＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＴＧＣ（Ｃｙｓ）、ＴＣＴ（Ｓｅｒ）、ＴＣＧ（Ｓｅｒ）、ＴＴＧ（Ｌｅｕ）、ＡＧＴ（Ｓｅｒ）、ＴＴＴ（Ｐｈｅ）、ＡＣＧ（Ｔｈｒ）、ＡＡＴ（Ａｓｎ）、ＡＣＡ（Ｔｈｒ）、ＧＡＡ（Ｇｌｕ）、ＡＴＣ（Ｉｌｅ）、ＴＧＧ（Ｔｒｐ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＣＴＣ（Ｌｅｕ）、ＡＴＡ（Ｉｌｅ）、ＣＣＣ（Ｐｒｏ）、ＣＴＡ（Ｌｅｕ）、ＣＴＴ（Ｌｅｕ）、ＴＡＴ（Ｔｙｒ）、ＣＣＴ（Ｐｒｏ）、ＴＧＴ（Ｃｙｓ）、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＧＣＡ（Ａｌａ）、ＴＣＣ（Ｓｅｒ）、ＴＡＣ（Ｔｙｒ）、ＧＣＧ（Ａｌａ）、ＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＣＧＴ（Ａｒｇ）、ＣＣＧ（Ｐｒｏ）、ＧＧＡ（Ｇｌｙ）、ＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＴＧＣ（Ｃｙｓ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＣＴＣ（Ｌｅｕ）、ＡＴＡ（Ｉｌｅ）、ＣＣＣ（Ｐｒｏ）、ＣＴＡ（Ｌｅｕ）、ＣＴＴ（Ｌｅｕ）、ＴＡＴ（Ｔｙｒ）、ＣＣＴ（Ｐｒｏ）、ＴＧＴ（Ｃｙｓ）、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＣＴＣ（Ｌｅｕ）、ＡＴＡ（Ｉｌｅ）、ＣＣＣ（Ｐｒｏ）、ＣＴＡ（Ｌｅｕ）、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0064】
特定の実施形態において、遺伝子中のコドンの平均ｔＡＩ値は、約０．１５～約０．５、約０．１５～約０．４５、約０．１５～約０．４、約０．１５～約０．３５、約０．１５～約０．３、約０．１５～約０．２５、約０．１５～約０．２、約０．２～約０．５、約０．２～約０．４５、約０．２～約０．４、約０．２～約０．３５、約０．２～約０．３、約０．２～約０．２５、約０．２５～約０．５、約０．２５～約０．４５、約０．２５～約０．４、約０．２５～約０．３５、約０．２５～約０．３、約０．３～約０．５、約０．３～約０．４５、約０．３～約０．４、約０．３～約０．３５、約０．３５～約０．５、約０．３５～約０．４５、約０．３５～約０．４、約０．４～約０．５、約０．４～約０．４５、および約０．４５～約０．５の間である。特定の実施形態において、遺伝子におけるコドンの平均ｔＡＩ値は、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、または約０．５未満である。
【0065】
ｓｔＡＩは、ｔＲＮＡの細胞濃度およびデコードの効率の推定値を考慮に入れ、種固有の方法でデコード効率に重みを付した各コドンのコドン最適性の推定値である。ｓｔＡＩは、例えばＳａｂｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＤＮＡ ＲＥＳ．２１（５）：５１１－５２５に記載されている。特定の実施形態において、非最適コドンは、所与の種、例えば、ヒトについての全てのコドンのｓｔＡＩ値の中央値よりも小さいｓｔＡＩ値を有する。
【0066】
ｎＴＥは、ｔＲＮＡの細胞濃度、デコードの効率、および細胞ｍＲＮＡプール内のコドンの使用の推定値を考慮に入れた、各コドンのコドン最適性の推定値である。ｎＴＥは、例えば、Ｐｅｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＮＡＴ．ＳＴＲＵＣＴ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２０（２）：２３７－４３に記載されている。特定の実施形態において、非最適コドンは、所与の種、例えば、ヒトについての全てのコドンのｎＴＥ値の中央値よりも小さいｎＴＥ値を有する。
【0067】
ＣＡＩは、高度に発現する遺伝子のコドン頻度をスコアリングすることにより、コドンの最適性を推定する。したがって、ＣＡＩによって推定されるコドン最適性は、高発現として指定された遺伝子セットに応じて変化する可能性がある。ＣＡＩは、例えば、Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．１５（３）：１２８１－９５に記載されている。ｇＣＡＩはＣＡＩに似ているが、所与の細胞の発現トランスクリプトーム全体を使用する。特定の実施形態において、非最適コドンは、所与の種、例えば、ヒトについての全てのコドンのＣＡＩ値の中央値よりも小さいＣＡＩ値を有する。
【0068】
ＣＳＣは、コドンの発生をｍＲＮＡの半減期の測定値と相関させることによって、コドンの最適性を推定する。ＣＳＣは、例えばＰｒｅｓｎｙａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＣＥＬＬ１６０（６）：１１１１－２４に記載されている。特定の実施形態において、非最適コドンは、所与の種、例えば、ヒトについての全てのコドンのＣＳＣ値の中央値よりも小さいＣＳＣ値を有する。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＣＳＣによって決定されるように、０以下の値を有する。
【0069】
特定の実施形態において、非最適コドンは、ＡＴＡ、ＧＴＡ、およびＡＧＡ、ならびにそれの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＡＴＡである。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＧＴＡである。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＡＧＡである。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＡＴＡおよびＧＴＡである。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＡＴＡおよびＡＧＡである。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＧＴＡおよびＡＧＡである。特定の実施形態において、非最適コドンは、ＡＴＡ、ＧＴＡ、およびＡＧＡである。
【0070】
特定の実施形態において、遺伝子におけるコドンの約２０％～約７０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約２０％～約３０％、約３０％～約７０％、約３０％～約６０％、約３０％～約５０％、約３０％～約４０％、約４０％～約７０％、約４０％～約６０％、約４０％～約５０％、約５０％～約７０％、約５０％～約６０％、または約６０％～約７０％が非最適コドンである。特定の実施形態において、遺伝子におけるコドンの約２０％超、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７０％は、非最適コドンである。特定の実施形態において、遺伝子におけるコドンの約４０％超または約５０％は、非最適コドンである。
【0071】
ＩＩＩ．転移ＲＮＡの作製方法
本明細書に記載の組成物および方法の実施において有用なｔＲＮＡ分子は、合成化学的方法による細胞外産生、組換えＤＮＡ法による細胞内産生、または天然源からの精製を含む、当技術分野で既知の方法によって産生され得ると企図される。
本明細書に記載の組成物および方法の実施において有用なｔＲＮＡ分子は、合成化学的方法による細胞外産生、組換えＤＮＡ法による細胞内産生、または天然源からの精製を含む、当技術分野で既知の方法によって産生され得ると企図される。
【0072】
例えば、ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論によって合成され得る。例えば、ｔＲＮＡの配列は、適切な合成核酸プライマーを使用して、従来のハイブリダイゼーション技術またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によってライブラリーから合成またはクローン化され得る。得られたｔＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、例えば、ｔＲＮＡをコードする従来の遺伝子発現構築物（すなわち、発現ベクター）を産生するために、発現制御配列を含む他の適切なヌクレオチド配列にライゲーションされ得る。定義された遺伝子構築物の産生は、当技術分野の技術の範囲内である。所望のｔＲＮＡをコードする核酸は、次のセクションで説明する発現ベクターなどの発現ベクターに組み込まれ得（ライゲーションされ得）、従来の遺伝子導入または形質転換技術を介して宿主細胞に導入され得る。宿主細胞の例は、大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、および骨髄腫細胞である。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞がｔＲＮＡをコードする遺伝子を発現することを可能にする条件下で増殖させ得る。特定の発現および精製条件は、採用される発現システムによって異なる。
【0073】
あるいは、ｔＲＮＡは、当技術分野で知られている方法によって、化学的に合成または天然の供給源から精製され得る。細胞への導入または対象への投与の前にｔＲＮＡがアミノアシル化される場合、ｔＲＮＡは、化学的または酵素的アミノアシル化を含む当技術分野で既知の任意の方法によって、所望のアミノ酸でアミノアシル化され得る。
【0074】
ＩＶ．発現ベクター
目的のｔＲＮＡは、目的のｔＲＮＡをコードする遺伝子を発現ベクターに組み込むことによって、目的の細胞で発現させ得る。本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含む。発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはインビトロ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだ、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソーム中に含まれる）、レトロトランスポゾン（例えば、ピギーバック、眠れる森の美女（ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ））、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの当技術分野で既知の全てのものが含まれる。
目的のｔＲＮＡは、目的のｔＲＮＡをコードする遺伝子を発現ベクターに組み込むことによって、目的の細胞で発現させ得る。本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含む。発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはインビトロ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだ、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソーム中に含まれる）、レトロトランスポゾン（例えば、ピギーバック、眠れる森の美女（ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ））、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの当技術分野で既知の全てのものが含まれる。
【0075】
特定の実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターである。「ウイルス」という用語は、本明細書では、タンパク質合成またはエネルギー生成メカニズムを有さない偏性の細胞内寄生生物のいずれかを指すために使用される。ウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ポリオーマウイルスベクター（例えば、シミアン空胞形成ウイルス４０（ＳＶ４０）ベクター）、ポックスウイルスベクター、および偽型ウイルスベクターを含む。
【0076】
ウイルスは、ＲＮＡウイルス（ＲＮＡで構成されるゲノムを有する）またはＤＮＡウイルス（ＤＮＡで構成されるゲノムを有する）であり得る。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスベクターである。例示的なＤＮＡウイルスは、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、アデノウイルス、アスファルウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パピロモウイルス（例えば、ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、シミアン空胞形成ウイルス４０（ＳＶ４０））、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、カウポックスウイルス、スモールポックスウイルス、ファウルポックスウイルス、シープポックスウイルス、粘液腫ウイルス）を含む。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスベクターである。ＲＮＡウイルスの例は、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス）、コロナウイルス、エボラウイルス、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス）、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエンザウイルスＣ型）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ノロウイルス（例えば、ノーウォークウイルス）、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全）ウイルス－１（ＨＩＶ－１））およびトロウイルスが含まれる。
【0077】
特定の実施形態において、発現ベクターは、ｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列またはプロモーターを含む。「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素の連結を指す。核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが遺伝子の転写に影響を与える場合、遺伝子に作動可能に連結される。作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、通常、隣接する。しかし、エンハンサーは概してプロモーターから数キロベース離れたときに機能し、イントロン配列は可変長であり得るため、一部のポリヌクレオチド要素は操作可能にリンクされ得るが、直接隣接しておらず、異なる対立遺伝子または染色体から推移的に機能し得る。
【0078】
ｔＲＮＡ遺伝子は、好ましくは、様々な細胞型において活性である強力なプロモーターを有する。真核生物のｔＲＮＡ遺伝子のプロモーターは、通常、ｔＲＮＡ分子自体をコードする構造配列内に存在する。５’上流領域内の転写活性を調節する要素があるが、活性な転写ユニットの長さは、５００塩基対よりかなり短くてもよい。
【0079】
採用され得るプロモーターの追加の例は、これらに限定されないが、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、これらに限定されないがヒストン、ｐｏｌＩＩＩ、およびβ－アクチンプロモーターを含む真核生物細胞プロモーターなどの細胞プロモーター）を含む。採用され得る他のウイルスプロモーターは、これらに限定されないが、アデノウイルスプロモーター、ＴＫプロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含む。プロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者には明らかであろう。
【0080】
特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、または配列番号１、配列番号２、および／もしくは配列番号３のヌクレオチド配列と８０％、８５％、８６、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むｔＲＮＡコード配列を含む。
【0081】
特定の実施形態において、ｔＲＮＡコード配列に加えて、発現ベクターは、対応する野生型ｔＲＮＡ遺伝子に隣接するゲノムＤＮＡ配列に対応するヌクレオチド配列を含む。例えば、特定の実施形態において、発現ベクターは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、もしくは配列番号１１のヌクレオチド配列、または配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のヌクレオチド配列と８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0082】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
特定の実施形態において、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶは、ディペンドパルボウイルス属、パルボウイルス科の小さな、エンベロープを有さない二十面体ウイルスである。ＡＡＶは約４．７ｋｂの一本鎖線形ＤＮＡゲノムを有する。ＡＡＶは、いくつかの組織型の分裂および静止細胞の両方に感染することができ、異なるＡＡＶ血清型は異なる組織向性を示す。
特定の実施形態において、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶは、ディペンドパルボウイルス属、パルボウイルス科の小さな、エンベロープを有さない二十面体ウイルスである。ＡＡＶは約４．７ｋｂの一本鎖線形ＤＮＡゲノムを有する。ＡＡＶは、いくつかの組織型の分裂および静止細胞の両方に感染することができ、異なるＡＡＶ血清型は異なる組織向性を示す。
【0083】
ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ－１からＡＡＶ－１２だけでなく非ヒト霊長類からの１００超の血清型を含む多数の血清学的に識別可能な型を含む（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（２００８）Ｊ．ＣＥＬＬ ＢＩＯＣＨＥＭ．，１０５（１）：１７－２４，およびＧａｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，７８（１２），６３８１－６３８８参照）。本明細書に記載の組成物および方法で使用されるＡＡＶベクターの血清型は、送達の効率、組織向性、および免疫原性に基づいて当業者によって選択され得る。例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－８、およびＡＡＶ－９は、中枢神経系への送達に使用され得、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－８、およびＡＡＶ－９は、心臓への送達に使用され得、ＡＡＶ－２は腎臓への送達に使用され得、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、およびＡＡＶ－９は、肝臓への送達に使用され得、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－９は肺への送達に使用され得、ＡＡＶ－８は膵臓への送達に使用され得、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、およびＡＡＶ－８は光受容細胞への送達に使用され得、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、およびＡＡＶ－８は、網膜色素上皮への送達に使用され得、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、およびＡＡＶ－９は、骨格筋への送達に使用され得る。特定の実施形態において、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、これらに限定されないが、ＡＡＶ－９（米国特許第７，１９８，９５１号の配列番号１～３）、ＡＡＶ－２（米国特許第７，１９８，９５１号の配列番号４）、ＡＡＶ－１（米国特許第７，１９８，９５１号の配列番号５）、ＡＡＶ－３（米国特許第７，１９８，９５１号の配列番号６）、およびＡＡＶ－８（米国特許第７，１９８，９５１号の配列番号７）などの米国特許第７，１９８，９５１号に開示される配列を含む。アカゲザルから同定されたＡＡＶ血清型、例えば、ｒｈ．８、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３、およびｒｈ．７４もまた企図される。天然のＡＡＶ血清型に加えて、送達の効率、組織向性、および免疫原性を改善するために改変ＡＡＶキャプシドが開発されている。天然および改変ＡＡＶキャプシドの例は、米国特許第７，９０６，１１１号、同第９，４９３，７８８号、および同第７，１９８，９５１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１８９９６４Ａ２号に開示される。
【0084】
野生型ＡＡＶゲノムは、２つの１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、これらは、ＡＡＶ複製、ゲノムキャプシド形成、および統合を指示するシグナル配列を含む。ＩＴＲに加えて、３つのＡＡＶプロモーター、ｐ５、ｐ１９、およびｐ４０は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのオープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーターは、単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシングと相まって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）を生成する。Ｒｅｐタンパク質はゲノム複製に関与する。Ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、ｃａｐ遺伝子のスプライスバリアントである３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のキャプシドを形成する。
【0085】
複製、キャプシド形成、および統合のためのシス作用性シグナルはＩＴＲ内に含まれているため、４．３ｋｂの内部ゲノムの一部または全てを外来ＤＮＡ、例えば目的の外因性遺伝子のための発現カセットに置き換えることができる。したがって、特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接する外因性遺伝子の発現カセットを含むゲノムを含む。ＩＴＲは、そのキャプシドまたは誘導体と同じ血清型に由来し得る。あるいは、ＩＴＲは、キャプシドとは異なる血清型であり得、それによって偽型のＡＡＶが生成される。特定の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ－２に由来する。特定の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ－５に由来する。ＩＴＲの少なくとも１つは、末端分離部位を変異または削除するように改変され得、それにより、自己相補的ＡＡＶベクターの産生を可能にする。
【0086】
ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、ＡＡＶベクターを産生するために、例えばプラスミド上で推移的に提供することができる。ＡＡＶ複製を許容する宿主細胞株は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ＩＴＲ隣接発現カセット、ならびにヘルパーウイルスによって提供されるヘルパー機能、例えばアデノウイルス遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ５５Ｋ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、およびＶＡを発現する必要がある（Ｗｅｉｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１－２３，２０１１）。ＡＡＶベクターを生成および精製するための方法が詳細に記載されている（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，１４Ｄ．１．１－１４Ｄ．１．２１，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ参照）。ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞だけでなく昆虫細胞を含む多数の細胞型はＡＡＶベクターの産生に好適である（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号、同第５，３８７，４８４号、同第５，７４１，６８３号、同第５，６９１，１７６号、同第５，６８８，６７６号、および同第８，１６３，５４３号、米国特許公開第２００２／００８１７２１号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ００／４７７５７号、同第ＷＯ００／２４９１６号、および同第ＷＯ９６／１７９４７号参照）。ＡＡＶベクターは通常、これらの細胞型において、ＩＴＲ隣接発現カセットを含む１つのプラスミド、および追加のＡＡＶおよびヘルパーウイルス遺伝子を提供する１つ以上の追加のプラスミドによって産生される。
【0087】
任意の血清型のＡＡＶは、本明細書に記載の組成物および方法において使用され得る。同様に、任意のアデノウイルス型が使用され得、当業者は、それらの所望の組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）の産生に好適なＡＡＶおよびアデノウイルス型を同定することができると企図される。ＡＡＶ粒子は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオジキソナル勾配、またはＣｓＣｌ勾配によって精製され得る。
【0088】
ＡＡＶベクターは、サイズが４．７ｋｂである、または５．２ｋｂの大きさの、もしくは３．０ｋｂの小ささの特大ゲノムを含む、４．７ｋｂよりも大きいまたは小さい一本鎖ゲノムを有し得る。したがって、ＡＡＶベクターから発現される目的の外因性遺伝子が小さい場合、ＡＡＶゲノムはスタッファー配列を含み得る。さらに、ベクターゲノムは実質的に自己相補的であり得、それにより細胞における迅速な発現を可能にする。特定の実施形態において、自己相補的ＡＡＶベクターのゲノムは、５’から３’に、５’ＩＴＲと、目的の遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む第１の核酸配列と、機能的な端末分離部位を有しない改変ＩＴＲと、第１の核酸配列に相補的または実質的に相補的な第２の核酸配列と、３’ＩＴＲと、を含む。全ての型のゲノムを含むＡＡＶベクターは、本明細書に記載の方法においての使用に好適である。
【0089】
ＡＡＶベクターの非限定的な例には、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＡＡＶＫ－ＥＦ１α－ＭＣＳ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏカタログ番号ＡＡＶ５０２Ａ－１）、ｐＡＡＶＫ－ＥＦ１α－ＭＣＳ１－ＣＭＶ－ＭＣＳ２（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏカタログ番号ＡＡＶ５０３Ａ－１）、ｐＡＡＶ－ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６２３１）、ｐＡＡＶ－ＭＣＳ２（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号４６９５４）、ＡＡＶ－Ｓｔｕｆｆｅｒ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１０６２４８）、ｐＡＡＶｓｃＣＢＰＩＧｐｌｕｃ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号３５６４５）、ＡＡＶＳ１＿Ｐｕｒｏ＿ＰＧＫ１＿３ｘＦＬＡＧ＿Ｔｗｉｎ＿Ｓｔｒｅｐ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号６８３７５）ｐＡＡＶ－ＲＡＭ－ｄ２ＴＴＡ：：ＴＲＥ－ＭＣＳ－ＷＰＲＥ－ｐＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号６３９３１）、ｐＡＡＶ－ＵｂＣ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号６２８０６）、ｐＡＡＶＳ１－Ｐ－ＭＣＳ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号８０４８８）、ｐＡＡＶ－Ｇａｔｅｗａｙ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号３２６７１）、ｐＡＡＶ－Ｐｕｒｏ＿ｓｉＫＤ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号８６６９５）、ｐＡＡＶＳ１－Ｎｓｔ－ＭＣＳ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号８０４８７）、ｐＡＡＶＳ１－Ｎｓｔ－ＣＡＧ－ＤＥＳＴ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号８０４８９）、ｐＡＡＶＳ１－Ｐ－ＣＡＧ－ＤＥＳＴ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号８０４９０）、ｐＡＡＶｆ－ＥｎｈＣＢ－ｌａｃＺｎｌｓ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号３５６４２）、およびｐＡＡＶＳ１－ｓｈＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号８２６９７）が挙げられる。これらのベクターは、治療用途用に好適であるように改変され得る。例えば、目的の外因性遺伝子はマルチクローニング部位に挿入され得、選択マーカー（例えば、ｐｕｒｏまたは蛍光タンパク質をコードする遺伝子）は削除、または別の（同じまたは異なる）目的の外因性遺伝子で置き換えられ得る。ＡＡＶベクターのさらなる例は、米国特許第５，８７１，９８２号、同第６，２７０，９９６号、同第７，２３８，５２６号、同第６，９４３，０１９号、同第６，９５３，６９０号、同第９，１５０，８８２号、および同第８，２９８，８１８号、米国特許公開第２００９／００８７４１３号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０７５３３５Ａ１号、同第ＷＯ２０１７／０７５３３８Ａ２号、および同第ＷＯ２０１７／２０１２５８Ａ１号に開示されている。
【0090】
特定の実施形態において、発現ベクターは、対象、例えば、ヒト対象において、神経系、例えば、中枢神経系を標的とすることができるＡＡＶベクターである。神経系を標的とすることができる例示的なＡＡＶベクターには、ＡＡＶ９変異体ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ（例えば、Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．３４（２）：２０４－２０９参照）、ＡＡＶ－ＡＳ（例えば、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＭＯＬ．ＴＨＥＲ．２４：７２６－３５参照）、およびＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ（例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＮＡＴ．ＮＥＵＲＯＳＣＩ．２０：１１７２－７９参照）が挙げられる。神経系を標的とするための追加の例示的なＡＡＶベースの戦略は、Ｂｅｄｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＡＮＮＵ ＲＥＶ ＮＥＵＲＯＳＣＩ．４１：３２３－３４８に記載されている。
【0091】
レンチウイルスベクター
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、脾臓壊死ウイルスベクター、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターを含む。レトロウイルスベクターは、真核細胞へのレトロウイルス媒介遺伝子転移を媒介する薬剤として有用である。
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、脾臓壊死ウイルスベクター、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターを含む。レトロウイルスベクターは、真核細胞へのレトロウイルス媒介遺伝子転移を媒介する薬剤として有用である。
【0092】
特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターの例は、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス－２（ＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）に由来するベクターを含む。
【0093】
レトロウイルスベクターは通常、ウイルスの構造遺伝子についてコードする配列の大部分が削除され、目的の遺伝子に置き換えられるように構築される。多くの場合、構造遺伝子（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）は、当技術分野で既知の遺伝子工学技術を使用してレトロウイルス骨格から除去される。これには、適切な制限エンドヌクレアーゼ、または場合によってはＢａｌ３１エキソヌクレアーゼによる消化を含み、パッケージングシグナルの適切な部分を含む断片が生成される。したがって、最小のレトロウイルスベクターは、５’から３’に、５’長い末端反復（ＬＴＲ）と、パッケージングシグナルと、任意の外因性プロモーターおよび／またはエンハンサーと、目的の外因性遺伝子と、３’ＬＴＲと、を含む。外因性プロモーターが提供されない場合、遺伝子発現は５’ＬＴＲによって駆動され、これは弱いプロモーターであり、発現を活性化するためにＴａｔの存在を必要とする。構造遺伝子は、レンチウイルスの製造のための別個のベクターで提供され得、産生されたビリオンを複製欠陥にする。具体的には、レンチウイルスに関して、パッケージングシステムは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、およびＴａｔ遺伝子をコードする単一のパッケージングベクター、およびエンベロープタンパク質Ｅｎｖ（通常、その広い感染性のためにＶＳＶ－Ｇ）をコードする第３の別個のベクターを含み得る。パッケージングシステムの安全性を向上させるために、パッケージングベクターは分割し、あるベクターからＲｅｖを、別のベクターからＧａｇおよびＰｏｌを発現し得る。Ｔａｔはまた、キメラ５’ＬＴＲを含むレトロウイルスベクターを使用することによってパッケージングシステムから排除され得、５’ＬＴＲのＵ３領域は、異種調節要素で置き換えられる。
【0094】
これらの新しい遺伝子は、いくつかの一般的な方法でプロウイルス骨格に組み込まれ得る。最も単純な構造は、レトロウイルスの構造遺伝子が、ＬＴＲ内のウイルス調節配列の制御下で転写される単一の遺伝子に置き換えられる構造である。複数の遺伝子を標的細胞に導入することができるレトロウイルスベクターも構築されている。通常、そのようなベクターにおいては、１つの遺伝子がウイルスＬＴＲの制御下にあり、２番目の遺伝子はスプライシングされたメッセージから離れているか、それ自体の内部プロモーターの制御下で発現される。
【0095】
したがって、新しい遺伝子（複数可）は、それぞれビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するのに役立つ５’および３’ＬＴＲに隣接される。「長い末端反復」または「ＬＴＲ」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、それはそれらの自然な配列のコンテキストにおいて、直接反復であり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含む。ＬＴＲは、概して、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写産物の促進、開始、およびポリアデニル化）およびウイルス複製の基本的な機能を提供する。ＬＴＲは、転写制御要素、ポリアデニル化シグナル、およびウイルスゲノムの複製および統合に必要な配列を含む多数の調節シグナルを含む。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターの要素を含む。Ｕ５領域は、プライマー結合部位およびＲ領域間の配列であり、ポリアデニル化配列を含む。Ｒ（リピート）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域の両側にある。特定の実施形態において、Ｒ領域は、トランス活性化応答（ＴＡＲ）遺伝子要素を含み、それは、トランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝子要素と相互作用して、ウイルス複製を増強する。この要素は、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置き換えられる実施形態において必要とされない。
【0096】
特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、改変５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲの改変は、ウイルスを複製欠陥にすることにより、レンチウイルスまたはレトロウイルスシステムの安全性を向上させるために行われることがよくある。特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、自己不活化（ＳＩＮ）ベクターである。本明細書で使用される場合、ＳＩＮレトロウイルスベクターは、３’ＬＴＲ Ｕ３領域が（例えば、欠失または置換によって）改変され、ウイルス複製の第１ラウンドを超えるウイルス転写を防止する複製欠損レトロウイルスベクターを指す。これは、３’ＬＴＲ Ｕ３領域がウイルス複製中に５’ＬＴＲ Ｕ３領域のテンプレートとして使用され、Ｕ３エンハンサープロモーターなしではウイルス転写産物を作製し得ないためである。さらなる実施形態において、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、理想的なポリアデニル化配列で置き換えられるように改変される。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’および５’ＬＴＲの両方への改変などのＬＴＲへの改変も本明細書に記載されることに留意されたい。
【0097】
特定の実施形態において、５’ＬＴＲのＵ３領域は、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動するために異種プロモーターで置き換えられる。使用され得る異種プロモーターの例は、例えば、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、前初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターを含む。典型的なプロモーターは、Ｔａｔに依存しない方法で高レベルの転写を駆動することができる。ウイルス生産システムには完全なＵ３配列がないため、この置換により、組換えが複製能力のあるウイルスを生成する可能性が低くなる。
【0098】
５’ＬＴＲへの隣接は、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的なパッケージング（Ｐｓｉ部位）に必要な配列である。本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成に必要なレトロウイルスゲノム内に位置する配列を指す（例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５Ｊ．ＶＩＲＯＬＯＧＹ，６９（４）：２１０１－０９参照）。パッケージングシグナルは、ウイルスゲノムのキャプシド形成に必要な最小限のパッケージングシグナル（プサイ［Ψ］配列とも呼ばれる）であり得る。
【0099】
特定の実施形態において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、ＦＬＡＰをさらに含む。本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰ」という用語は、その配列が、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２の中央ポリプリン路および中央終止配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。ＦＬＡＰ要素の例は、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＣＥＬＬ１０１：１７３に記載されている。逆転写中、ｃＰＰＴでのプラス鎖ＤＮＡの中央開始、およびＣＴＳでの中央終止は、中央ＤＮＡフラップという３本鎖ＤＮＡ構造が形成を導く。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ＤＮＡフラップはレンチウイルスゲノムの核輸入のシス活性決定因子として作用し得、かつ／またはウイルスの力価を増加させ得る。特定の実施形態において、レトロウイルスベクター骨格は、ベクター中の目的の異種遺伝子の上流または下流の１つ以上のＦＬＡＰ要素を含む。例えば、特定の実施形態において、転移プラスミドは、ＦＬＡＰ要素を含む。一実施形態において、本明細書に記載のベクターは、ＨＩＶ－１から単離されたＦＬＡＰ要素を含む。
【0100】
特定の実施形態において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、輸出要素をさらに含む。一実施形態において、レトロウイルスベクターは、１つ以上の輸出要素を含む。「輸出要素」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写産物の輸送を調節するシス作用性転写後調節要素を指す。ＲＮＡ輸出要素の例には、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＲＥ、（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．ＶＩＲＯＬ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＣＥＬＬ５８：４２３参照）およびＢ型肝炎ウイルスの転写後調節要素（ＨＰＲＥ）が挙げられる。概して、ＲＮＡ輸出要素は遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは多数のコピーとして挿入され得る。
【0101】
特定の実施形態において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、転写後調節要素をさらに含む。様々な転写後調節要素は、異種核酸の発現を増加させ得、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節要素（ＷＰＲＥ、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，７３：２８８６参照）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節要素（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．，５：３８６４）、および同様のもの（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９５），ＧＥＮＥＳ ＤＥＶ．，９：１７６６）である。転写後調節要素は、概して、異種核酸配列の３’末端に配置される。この構成は、その５’部分が異種核酸コード配列を含み、その３’部分が転写後調節要素配列を含むｍＲＮＡ転写産物の合成をもたらす。特定の実施形態において、本明細書に記載のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節要素を欠くかまたは含まない。なぜなら、これらの要素は、場合によっては、細胞形質転換のリスクを増加させ、かつ／またはｍＲＮＡ転写産物の量を実質的または有意に増加させないまたはｍＲＮＡの安定性を高めないからである。したがって、特定の実施形態において、本明細書に記載のベクターは、追加の安全対策としてのＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠いているか、または含まない。
【0102】
異種核酸転写産物の効率的な終止およびポリアデニル化を指示する要素は、異種遺伝子発現を増加させる。転写終止シグナルは、概してポリアデニル化シグナルの下流に見られる。したがって、特定の実施形態において、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。本明細書で使用される「ポリアデニル化シグナル」または「ポリアデニル化配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＨによる新生ＲＮＡ転写産物の終止およびポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を意味する。ポリアデニル化シグナルを欠く転写産物は、不安定で、急速に分解するため、組換え転写産物の効率的なポリアデニル化が望ましい。本明細書に記載のベクターで使用され得るポリアデニル化シグナルの例示的な例は、理想的なポリアデニル化配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリアデニル化配列（ｒβｇｐＡ）、または当技術分野で既知の別の好適な異種または内因性ポリアデニル化配列を含む。
【0103】
特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、絶縁体要素をさらに含む。絶縁体要素は、レトロウイルス発現配列、例えば、ゲノムＤＮＡに存在するシス作用性要素によって媒介され、転移配列の無秩序な発現につながる可能性のある統合部位効果からの治療遺伝子を保護することに寄与する可能性がある（すなわち、位置効果、例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ－Ｂｅｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３、およびＺｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＨＵＭ．ＧＥＮＥＴ．，１０９：４７１を参照）。特定の実施形態において、レトロウイルスベクターは、細胞ゲノムに統合するベクターの領域における一方または両方のＬＴＲまたはそれ以外に絶縁体要素を含む。本明細書に記載の組成物および方法において使用するための絶縁体の例には、これに限定されないが、鶏のβ－グロビン絶縁体が挙げられる（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）．ＣＥＬＬ７４：５０５；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．，ＵＳＡ９４：５７５、およびＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９．ＣＥＬＬ９８：３８７参照）。絶縁体要素の例には、これに限定されないが、ニワトリＨＳ４などのβ－グロビン遺伝子座からの絶縁体が挙げられる。
【0104】
レンチウイルスベクターの非限定的な例には、ｐＬＶＸ－ＥＦ１ａｌｐｈａ－ＡｃＧＦＰ１－Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６３１９８４）、ｐＬＶＸ－ＥＦ１ａｌｐｈａ－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６３１９８７）、ｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６３２１５９）、ｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃａｔａｌｏｇ番号６３２１８６）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ｐＬＫＯ．１（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１０８７８）、ｐＬＫＯ．３Ｇ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１４７４８）、ｐＳｉｃｏ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１１５７８）、ｐＬＪＭ１－ＥＧＦＰ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１９３１９）、ＦＵＧＷ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１４８８３）、ｐＬＶＴＨＭ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１２２４７）、ｐＬＶＵＴ－ｔＴＲ－ＫＲＡＢ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１１６５１）、ｐＬＬ３．７（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１１７９５）、ｐＬＢ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１１６１９）、ｐＷＰＸＬ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１２２５７）、ｐＷＰＩ（Ｐｌａｓｍｉｄ番号１２２５４）、ＥＦ．ＣＭＶ．ＲＦＰ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１７６１９）、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号１７４５２）、ｐＬｅｎｔｉ－ｐｕｒｏ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号３９４８１）、ｐＵＬＴＲＡ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号２４１２９）、ｐＬＸ３０１（Ｐｌａｓｍｉｄ番号２５８９５）、ｐＨＩＶ－ＥＧＦＰ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号２１３７３）、ｐＬＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＡｄｄｇｅｎｅのＰｌａｓｍｉｄ番号３６０８４）、ｐＬｉｏｎＩＩ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号１７３０）、ｐＩｎｄｕｃｅｒ１０－ｍｉｒ－ＲＵＰ－ＰｈｅＳ（Ａｄｄｇｅｎｅのプラスミド番号４４０１１）が挙げられる。これらのベクターは、治療用途用に好適であるように改変され得る。例えば、選択マーカー（例えば、ｐｕｒｏ、ＥＧＦＰ、またはｍＣｈｅｒｒｙ）が削除される、または目的の２番目の外因性遺伝子に置き換えられ得る。レンチウイルスベクターのさらなる例は、米国特許第７，６２９，１５３号、同第７，１９８，９５０号、同第８，３２９，４６２号、同第６，８６３，８８４号、同第６，６８２，９０７号、同第７，７４５，１７９号、同第７，２５０，２９９号、同第５，９９４，１３６号、同第６，２８７，８１４号、同第６，０１３，５１６号、同第６，７９７，５１２号、同第６，５４４，７７１号、同第５，８３４，２５６号、同第６，９５８，２２６号、同第６，２０７，４５５号、同第６，５３１，１２３号、および同第６，３５２，６９４号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０９１７８６号において開示されている。
【0105】
アデノウイルスベクター
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルスは、中サイズ（９０～１００ｎｍ）、エンベロープを持たない（裸の）二十面体ウイルスであり、ヌクレオカプシドと二本鎖線状ＤＮＡゲノムで構成される。「アデノウイルス」という用語は、これらに限定されないがヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウス、およびサルのアデノウイルス亜属を含む、アデノウイルス属における任意のウイルスを指す。典型的には、アデノウイルスベクターは、例えば、遺伝子転移のためのアデノウイルスへの非天然核酸配列の挿入に対応するために、アデノウイルスのアデノウイルスゲノムに１つ以上の変異（例えば、欠失、挿入、または置換）を導入することによって生成される。
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルスは、中サイズ（９０～１００ｎｍ）、エンベロープを持たない（裸の）二十面体ウイルスであり、ヌクレオカプシドと二本鎖線状ＤＮＡゲノムで構成される。「アデノウイルス」という用語は、これらに限定されないがヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウス、およびサルのアデノウイルス亜属を含む、アデノウイルス属における任意のウイルスを指す。典型的には、アデノウイルスベクターは、例えば、遺伝子転移のためのアデノウイルスへの非天然核酸配列の挿入に対応するために、アデノウイルスのアデノウイルスゲノムに１つ以上の変異（例えば、欠失、挿入、または置換）を導入することによって生成される。
【0106】
ヒトアデノウイルスは、アデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムの供給源として使用され得る。例えば、アデノウイルスは、下位群Ａ（例えば、血清型１２、１８、および３１）、下位群Ｂ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、および５０）、下位群Ｃ（例えば、血清型１、２、５、および６）、下位群Ｄ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２～３０、３２、３３、３６～３９、および４２～４８）、下位群Ｅ（例えば、血清型４）、下位群Ｆ（例えば、血清型４０および４１）、または未分類の血清群（例えば、血清型４９および５１）、または任意の他のアデノウイルス血清群または血清型のうちのアデノウイルスであり得る。アデノウイルス血清型１～５１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）から入手可能である。非Ｃ群アデノウイルスベクター、非Ｃ群アデノウイルスベクターを製造する方法、および非Ｃ群アデノウイルスベクターを使用する方法は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号、同第５，８３７，５１１号、および同第５，８４９，５６１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ１９９７／０１２９８６号および同第ＷＯ１９９８／０５３０８７号に記載されている。
【0107】
非ヒトアデノウイルス（例えば、類人猿、サル、トリ、イヌ、ヒツジ、またはウシのアデノウイルス）は、アデノウイルスベクターを生成するために使用され得る（すなわち、アデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムの供給源として）。例えば、アデノウイルスベクターは、新世界および旧世界の両方のサルを含むサルアデノウイルスに基づき得る（例えば、Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ：ＶＨＩｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（２００５）参照）。霊長類に感染するアデノウイルスの系統発生分析は、例えば、Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬＯＳ ＰＡＴＨＯＧ．５（７）：ｅ１０００５０３に開示されている。ゴリラアデノウイルスは、アデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムの供給源として使用され得る。ゴリラアデノウイルスおよびアデノウイルスベクターは、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０５２７９９号、同第ＷＯ２０１３／０５２８１１号、および同第ＷＯ２０１３／０５２８３２号に記載されている。アデノウイルスベクターはまた、亜型の組み合わせを含み得、それにより「キメラ」アデノウイルスベクターであり得る。
【0108】
アデノウイルスベクターは、複製能力がある、条件付きで複製能力がある、または複製欠損であり得る。複製能力のあるアデノウイルスベクターは、典型的な宿主細胞、すなわち、典型的にアデノウイルスによって感染されることができる細胞において複製し得る。条件付きで複製するアデノウイルスベクターは、前もって決められた条件下で複製するように操作されているアデノウイルスベクターである。例えば、複製に必須の遺伝子機能、例えば、アデノウイルス初期領域によってコードされる遺伝子機能は、誘導性、抑制性、または組織特異的転写制御配列、例えば、プロモーターに作動可能に連結され得る。条件付きで複製するアデノウイルスベクターは、米国特許第５，９９８，２０５号にさらに記載されている。複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターが典型的な宿主細胞、特にアデノウイルスベクターによって感染されるヒトの宿主細胞において複製しないよう、例えば、１つ以上の複製必須遺伝子機能または領域における欠損の結果として、複製に必要なアデノウイルスゲノムの１つ以上の遺伝子機能または領域の補完を必要とするアデノウイルスベクターである。
【0109】
いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは複製欠損であり、その結果、複製欠損アデノウイルスベクターは、増殖のために（例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために）アデノウイルスゲノムの１つ以上の領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域（すなわち、Ｅ１－Ｅ４領域）のみ、アデノウイルスゲノムの後期領域（すなわち、Ｌ１－Ｌ５領域）のみ、アデノウイルスゲノムの初期領域および後期領域の両方、または全てのアデノウイルス遺伝子（すなわち、高容量アデノベクター（ＨＣ－Ａｄ））の１つ以上の複製必須遺伝子機能において欠損し得る。例えば、Ｍｏｒｓｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ９５：９６５－９７６，Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ９４：１６４５－１６５０，およびＫｏｃｈａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＨＵＭ．ＧＥＮＥ ＴＨＥＲ．１０（１５）：２４５１－９．を参照されたい。複製欠損アデノウイルスベクターの例は、米国特許第５，８３７，５１１号、同第５，８５１，８０６号、同第５，９９４，１０６号、同第６，１２７，１７５号、同第６，４８２，６１６号、および同第７，１９５，８９６号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ１９９４／０２８１５２号、同第ＷＯ１９９５／００２６９７号、同第ＷＯ１９９５／０１６７７２号、同第ＷＯ１９９５／０３４６７１号、同第ＷＯ１９９６／０２２３７８号、同第ＷＯ１９９７／０１２９８６号、同第ＷＯ１９９７／０２１８２６号、および同第ＷＯ２００３／０２２３１１号に記載されている。
【0110】
本明細書に記載の複製欠損アデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスベクターには存在しないが、高力価のウイルスベクターストックを生成するために適切なレベルでウイルス増殖に必要な遺伝子機能を提供する補完細胞株において産生され得る。そのような補完細胞株は既知であり、これらに限定されないが２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．ＧＥＮ．ＶＩＲＯＬ．３６：５９－７２に記載される）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９７／０００３２６号、および米国特許第５，９９４，１２８号および同第６，０３３，９０８号に記載される）、および２９３－ＯＲＦ６細胞（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９５／０３４６７１号およびＢｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．ＶＩＲＯＬ．７１：９２０６－９２１３に記載）が挙げられる。複製欠損アデノウイルスベクターを産生するための補完細胞の他の例は、その発現が宿主細胞におけるウイルス増殖を阻害する導入遺伝子をコードするアデノウイルスベクターを増殖させるために生成された補完細胞を含む（例えば、米国特許公開第２００８／０２３３６５０号参照）。補完細胞の追加の例は、米国特許第６，６７７，１５６号および同第６，６８２，９２９号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／０２０８７９号に記載されている。アデノウイルスベクター含有組成物の製剤は、例えば、米国特許第６，２２５，２８９号および同第６，５１４，９４３号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０００／０３４４４４号にさらに記載されている。
【0111】
アデノウイルスベクター、および／またはアデノウイルスベクターを作製または増殖させるための方法の追加の例は、米国特許第５，５５９，０９９号、同第５，８３７，５１１号、同第５，８４６，７８２号、同第５，８５１，８０６号、同第５，９９４，１０６号、同第５，９９４，１２８号、同第５，９６５，５４１号、同第５，９８１，２２５号、同第６，０４０，１７４号、同第６，０２０，１９１号、同第６，０８３，７１６号、同第６，１１３，９１３号、同第６，３０３，３６２号、同第７，０６７，３１０号および同第９，０７３，９８０号に記載されている。
【0112】
市販のアデノウイルスベクターシステムは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＡｄＥａｓｙ（商標）ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ、およびＴａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｉｎｃから入手可能なＡｄｅｎｏ－Ｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ３を含む。
【0113】
他のウイルスベクター
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスプラスミドベクターであり得る。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）は、遺伝子治療に役立つ可能性のある遺伝子送達ベクターシステムとして実証されている。ＨＳＶ－１ベクターは、筋肉への遺伝子の転移に使用されており、マウスの脳腫瘍の治療にも使用されている。ヘルパーウイルス依存性ミニウイルスベクターは、操作を容易にし、より大きな挿入（最大１４０ｋｂ）を可能にするために開発されている。複製能力のないＨＳＶアンプリコンは当技術分野で構築されている。これらのＨＳＶアンプリコンには、外因性ＤＮＡを挿入するためのスペースを提供するために、ＨＳＶゲノムの大きな欠失を含む。通常、これらは、ＨＳＶ－１パッケージング部位、ＨＳＶ－１「ｏｒｉＳ」複製部位、およびＩＥ４／５プロモーター配列を含む。これらのビリオンは、増殖のためにヘルパーウイルスに依存する。
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスプラスミドベクターであり得る。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）は、遺伝子治療に役立つ可能性のある遺伝子送達ベクターシステムとして実証されている。ＨＳＶ－１ベクターは、筋肉への遺伝子の転移に使用されており、マウスの脳腫瘍の治療にも使用されている。ヘルパーウイルス依存性ミニウイルスベクターは、操作を容易にし、より大きな挿入（最大１４０ｋｂ）を可能にするために開発されている。複製能力のないＨＳＶアンプリコンは当技術分野で構築されている。これらのＨＳＶアンプリコンには、外因性ＤＮＡを挿入するためのスペースを提供するために、ＨＳＶゲノムの大きな欠失を含む。通常、これらは、ＨＳＶ－１パッケージング部位、ＨＳＶ－１「ｏｒｉＳ」複製部位、およびＩＥ４／５プロモーター配列を含む。これらのビリオンは、増殖のためにヘルパーウイルスに依存する。
【0114】
ウイルスベクターの産生
ウイルスベクターを産生するための方法は当技術分野において既知である。典型的には、開示されたウイルスは、感染性ウイルス粒子の産生を可能にするために、好適な条件下で遺伝子導入された、または感染した宿主細胞を培養することを含む従来の技術を使用して好適な宿主細胞株において産生される。ウイルス遺伝子および／またはｔＲＮＡをコードする核酸は、プラスミドに組み込まれ、従来の遺伝子導入または形質転換技術を通じて宿主細胞に導入され得る。開示されたウイルスを産生するための宿主細胞の例は、ＨｅＬａ、Ｈｅｌａ－Ｓ３、ＨＥＫ２９３、９１１、Ａ５４９、ＨＥＲ９６、またはＰＥＲ－Ｃ６細胞などのヒト細胞株を含む。特定の産生および精製条件は、採用されるウイルスおよび産生システムによって異なる。
ウイルスベクターを産生するための方法は当技術分野において既知である。典型的には、開示されたウイルスは、感染性ウイルス粒子の産生を可能にするために、好適な条件下で遺伝子導入された、または感染した宿主細胞を培養することを含む従来の技術を使用して好適な宿主細胞株において産生される。ウイルス遺伝子および／またはｔＲＮＡをコードする核酸は、プラスミドに組み込まれ、従来の遺伝子導入または形質転換技術を通じて宿主細胞に導入され得る。開示されたウイルスを産生するための宿主細胞の例は、ＨｅＬａ、Ｈｅｌａ－Ｓ３、ＨＥＫ２９３、９１１、Ａ５４９、ＨＥＲ９６、またはＰＥＲ－Ｃ６細胞などのヒト細胞株を含む。特定の産生および精製条件は、採用されるウイルスおよび産生システムによって異なる。
【0115】
特定の実施形態において、プロデューサー細胞は、対象に直接投与され得るが、他の実施形態において、産生に続いて、感染性ウイルス粒子は、培養物から回収され、任意に精製される。典型的な精製工程は、プラーク精製、遠心分離、例えば、塩化セシウム勾配遠心分離、清澄化、酵素処理、例えば、ベンゾナーゼまたはプロテアーゼ処理、クロマトグラフィー工程、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは濾過工程を含み得る。
【0116】
ＩＶ．医薬組成物
治療的使用のために、ｔＲＮＡおよび／または発現ベクターは薬学的に許容される担体と組み合わせられ得る。本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
治療的使用のために、ｔＲＮＡおよび／または発現ベクターは薬学的に許容される担体と組み合わせられ得る。本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
【0117】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比に見合った、緩衝液、担体、および賦形剤を指す。薬学的に許容される担体には、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョンなど）、および様々な種類の湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれかが含まれる。組成物はまた、安定剤および防腐剤を含み得る。担体、安定剤およびアジュバントの例については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ［１９７５］を参照されたい。薬学的に許容される担体は、医薬品投与に準拠した緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で既知である。
【0118】
特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、組成物の吸着または浸透を改変、維持または保存するための製剤材料を含み得る。そのような実施形態において、製剤材料には、これらに限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなど）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝液（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸など）、増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）、充填材、単糖、二糖類およびその他の炭水化物（ブドウ糖、マンノース、デキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなど）、着色剤、香料および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩を形成する対イオン（ナトリウムなど）、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、過酸化水素など）、溶剤（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなど）、安定性向上剤（ショ糖またはソルビトールなど）、張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど）、輸送媒体、希釈剤、賦形剤および／または医薬品アジュバント（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０））が挙げられる。
【0119】
特定の実施形態において、医薬組成物は、ナノ粒子、例えば、ポリマーナノ粒子、リポソーム、またはミセルを含み得る（Ａｎｓｅｌｍｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＢＩＯＥＮＧ．ＴＲＡＮＳＬ．ＭＥＤ．１：１０－２９参照）。特定の実施形態において、組成物は、例えば、米国特許公開第２０１７／０３５４６７２号に記載されるように、ナノ粒子またはアミノ脂質送達化合物を含まない。特定の実施形態において、細胞に導入されるかまたは対象に投与されるｔＲＮＡまたは発現ベクターは、別の部分、例えば、担体粒子、例えば、アミノ脂質粒子にコンジュゲートしない、または結びつかない。本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、構造が使用される条件下、例えば生理学的条件下で部分が物理的に結びついたままであるように、十分に安定な構造を形成するために直接または連結剤として機能する１つ以上の追加の部分を介して、部分が、互いに物理的に結びつくまたは接続されることを意味する。通常、部分は、１つ以上の共有結合によって、または特異的結合を含むメカニズムによって取り付けられる。あるいは、十分な数のより弱い相互作用は、部分が物理的に結びついたままであるための十分な安定性を提供し得る。
【0120】
特定の実施形態において、医薬組成物は、持続送達または制御送達製剤を含み得る。リポソーム担体、生体分解性微粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射などの持続または制御送達手段を処方するための技術もまた、当業者に既知である。持続放出調製物には、例えば、多孔質ポリマー微粒子または成形品の形態の半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルが挙げられ得る。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ－グルタミン酸およびガンマエチル－Ｌ－グルタミン酸のコポリマー、ポリ（２－ヒドロキシエチル－イネトアクリレート）、エチレン酢酸ビニル、またはポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられ得る。持続放出組成物はまた、当技術分野で既知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得るリポソームを含み得る。
【0121】
本明細書に開示されるｔＲＮＡおよび／または発現ベクターを含む医薬組成物は、投薬単位形態で提示され得、任意の好適な方法によって調製され得る。医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように処方され得る。投与経路の例は、静脈内（ＩＶ）、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、髄腔内および直腸投与である。特定の実施形態において、ｔＲＮＡおよび／または発現ベクターは、髄腔内に投与される。特定の実施形態において、ｔＲＮＡおよび／または発現ベクターは、注射によって投与される。製剤は、製薬分野で既知の方法によって調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）を参照されたい。非経口投与用の製剤成分は、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝液、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調整するための薬剤、を含む。
【0122】
静脈内投与については、担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。担体は、製造および保管の条件下で安定であり得、微生物に対して保護される必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。
【0123】
概して、核酸分子を送達する任意の方法は、ｔＲＮＡでの使用に適合され得る（例えば、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＴＲＥＮＤＳ ＣＥＬＬ．）ＢＩＯＬ．２（５）：１３９－１４４およびＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０２５９５号参照）。ｔＲＮＡは、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるｔＲＮＡの急速な分解を防ぐために、修飾され得るか、または代わりに薬物送達システムを使用して送達され得る。ｔＲＮＡ分子は、コレステロールなどの親油性基への化学的コンジュゲートによって修飾され、細胞への取り込みを強化し、分解を防ぎ得る。ｔＲＮＡ分子はまた、アプタマーにコンジュゲートし得るか、そうでなければ結びつき得る。ｔＲＮＡはまた、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達システムなどの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性デリバリーシステムは、ｔＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を促進し、負に帯電した細胞膜での相互作用を強化して、細胞によるｔＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ＲＮＡ、例えばｔＲＮＡに結合し得るか、または誘導されてＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成し得る（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ ＲＥＬＥＡＳＥ１２９（２）：１０７－１１６参照）。カチオン性ＲＮＡ複合体を作製および投与するための方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＣＬＩＮ．ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．ＨＹＰＥＲＴＥＮＳ．２５：１９７－２０５参照）。ＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡの全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例には、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）上記、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）上記）、オリゴフェクタミン、固体核酸脂質粒子（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＮＡＴＵＲＥ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＣＡＮＣＥＲ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲ．１２：３２１－３２８、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＩＮＴ Ｊ．ＯＮＣＯＬ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＨＡＲＭ．ＲＥＳ．２５（１２）：２９７２－８２、Ａｉｇｎｅｒ （２００６）Ｊ．ＢＩＯＭＥＤ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．７１６５９），Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｌｉｕ（２００６）ＭＯＬ．ＰＨＡＲＭ．３：４７２－４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＢＩＯＣＨＥＭ．ＳＯＣ．ＴＲＡＮＳ．３５：６１－６７、Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＰＨＡＲＭ．ＲＥＳ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。特定の実施形態において、ｔＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。ＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、米国特許第７，４２７，６０５号に記載されている。
【0124】
医薬製剤は好ましくは無菌である。滅菌は、任意の好適な方法、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、フィルター滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行われ得る。
【0125】
本明細書に記載の組成物は、局所的または全身的に投与され得る。投与は概して非経口投与であり得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は皮下投与され、さらにより好ましい実施形態において静脈内投与される。非経口投与の製剤には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。
【0126】
概して、治療有効量の活性成分、例えば、ｔＲＮＡおよび／または発現ベクターは、０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば、１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態において、ウイルス発現ベクターの治療的有効量は、１０２～１０１５プラーク形成単位（ＰＦＵ）の範囲、例えば、１０２～１０１０、１０２～１０５、１０５～１０１５、１０５～１０１０または１０１０～１０１５プラーク形成単位である。投与される量は、治療される疾患または症状の種類および程度、患者の健康全般、抗体のインビボ効力、医薬製剤、および投与経路などの変数に依存するであろう。所望の血中レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、初期投与量は上限レベルを超えて増加され得る。あるいは、初期投与量は最適量よりも少なくあり得、治療の過程で毎日の投与量は徐々に増加され得る。ヒトの投与量は、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇまで実行するように設計された従来の第Ｉ相用量漸増試験において最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投与量、血清半減期、および治療される疾患などの要因に応じて変化し得る。投与頻度の例は、１日１回、１週間に１回、および２週間に１回である。投与経路の一例は、非経口、例えば、静脈内注入である。
【0127】
Ｖ．治療上の使用
本明細書に開示される組成物および方法は、対象におけるハプロ不全障害を治療するために使用され得る。本明細書で使用される場合、ハプロ不全障害という用語は、ハプロ不全によって、またはハプロ不全に関連して、媒介、強化、またはそうでなければ促進される障害、すなわち、二倍体対象が遺伝子の単一の機能的コピーのみを有し、遺伝子の単一の機能的コピーが、適切な遺伝子機能のために十分な遺伝子産物（例えば、タンパク質）を産生しない状態を指す。本明細書で使用される場合、ハプロ不全遺伝子は、適切な遺伝子機能のために両方の対立遺伝子を必要とする遺伝子を指す。ハプロ不全障害の例には、５ｑ症候群、アダムス－オリバー症候群１、アダムス－オリバー症候群３、アダムス－オリバー症候群５、アダムス－オリバー症候群６、アラジール症候群１、自己免疫性リンパ増殖症候群ＩＡ型、自己免疫性リンパ増殖症候群Ｖ型、常染色体優性難聴－２Ａ、尿路欠損を伴うか、または伴わない脳奇形（ＢＲＭＵＴＤ）、カーニー複合１型、ＣＨＡＲＧＥ症候群、鎖骨頭蓋異形成症、クラリーノ症候群、デニス－ドラッシュ症候群／フレイジャー症候群、発達遅延、知的障害、肥満、および異形性容貌（ＤＩＤＯＤ）、ディジョージ症候群（ＴＢＸ１関連）、ドラベ症候群、デュアン－橈側列症候群、エーラス－ダンロス症候群（古典的）、エーラス－ダンロス症候群（血管型）、ファインゴールド症候群１、ＴＤＰ４３封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ＴＤＰ）、ＧＲＮ関連、ＧＬＵＴ１欠損症候群、グレイグ尖頭多合指症候群、遺伝性出血性毛細血管拡張症１型、全前脳症３、全前脳症４、全前脳症５、ホルト－オラム症候群、副甲状腺機能低下症、感音性難聴、および腎疾患（ＨＤＲ）、クリーフストラ症候群１、クリッペル－トレノネー症候群（ＡＡＧＦ関連）、レリ－ワイル軟骨異形成症、マルファン症候群、心臓欠陥を伴うか、または伴わない精神遅滞および特異顔貌（ＭＲＦＡＣＤ）、精神遅滞、常染色体優性１、精神遅滞、常染色体優性１９、精神遅滞、常染色体優性２９、ネイル－パテラ症候群（ＮＰＳ）、フェラン－マクダーミッド症候群、ピット－ホプキンス症候群、原発性肺高血圧症１、レット症候群（先天性変異）、スミス－マゲニス症候群（ＲＡＩ１関連）、ソトス症候群１、ソトス症候群２、スティックラー症候群Ｉ型、大動脈弁上狭窄、ＳＹＮＧＡＰ１関連知的障害、トリーチャーコリンズ症候群、毛髪鼻指節骨症候群Ｉ型、尺骨－乳房症候群、ファンデルヴォウデ症候群１、ワールデンブルグ症候群１型、ワールデンブルグ症候群２Ａ型、ならびにワールデンブルグ症候群４Ｃ型が挙げられる。関連するハプロ不全遺伝子を含むハプロ不全障害の例を表１および表２に示す。
本明細書に開示される組成物および方法は、対象におけるハプロ不全障害を治療するために使用され得る。本明細書で使用される場合、ハプロ不全障害という用語は、ハプロ不全によって、またはハプロ不全に関連して、媒介、強化、またはそうでなければ促進される障害、すなわち、二倍体対象が遺伝子の単一の機能的コピーのみを有し、遺伝子の単一の機能的コピーが、適切な遺伝子機能のために十分な遺伝子産物（例えば、タンパク質）を産生しない状態を指す。本明細書で使用される場合、ハプロ不全遺伝子は、適切な遺伝子機能のために両方の対立遺伝子を必要とする遺伝子を指す。ハプロ不全障害の例には、５ｑ症候群、アダムス－オリバー症候群１、アダムス－オリバー症候群３、アダムス－オリバー症候群５、アダムス－オリバー症候群６、アラジール症候群１、自己免疫性リンパ増殖症候群ＩＡ型、自己免疫性リンパ増殖症候群Ｖ型、常染色体優性難聴－２Ａ、尿路欠損を伴うか、または伴わない脳奇形（ＢＲＭＵＴＤ）、カーニー複合１型、ＣＨＡＲＧＥ症候群、鎖骨頭蓋異形成症、クラリーノ症候群、デニス－ドラッシュ症候群／フレイジャー症候群、発達遅延、知的障害、肥満、および異形性容貌（ＤＩＤＯＤ）、ディジョージ症候群（ＴＢＸ１関連）、ドラベ症候群、デュアン－橈側列症候群、エーラス－ダンロス症候群（古典的）、エーラス－ダンロス症候群（血管型）、ファインゴールド症候群１、ＴＤＰ４３封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ＴＤＰ）、ＧＲＮ関連、ＧＬＵＴ１欠損症候群、グレイグ尖頭多合指症候群、遺伝性出血性毛細血管拡張症１型、全前脳症３、全前脳症４、全前脳症５、ホルト－オラム症候群、副甲状腺機能低下症、感音性難聴、および腎疾患（ＨＤＲ）、クリーフストラ症候群１、クリッペル－トレノネー症候群（ＡＡＧＦ関連）、レリ－ワイル軟骨異形成症、マルファン症候群、心臓欠陥を伴うか、または伴わない精神遅滞および特異顔貌（ＭＲＦＡＣＤ）、精神遅滞、常染色体優性１、精神遅滞、常染色体優性１９、精神遅滞、常染色体優性２９、ネイル－パテラ症候群（ＮＰＳ）、フェラン－マクダーミッド症候群、ピット－ホプキンス症候群、原発性肺高血圧症１、レット症候群（先天性変異）、スミス－マゲニス症候群（ＲＡＩ１関連）、ソトス症候群１、ソトス症候群２、スティックラー症候群Ｉ型、大動脈弁上狭窄、ＳＹＮＧＡＰ１関連知的障害、トリーチャーコリンズ症候群、毛髪鼻指節骨症候群Ｉ型、尺骨－乳房症候群、ファンデルヴォウデ症候群１、ワールデンブルグ症候群１型、ワールデンブルグ症候群２Ａ型、ならびにワールデンブルグ症候群４Ｃ型が挙げられる。関連するハプロ不全遺伝子を含むハプロ不全障害の例を表１および表２に示す。
【0128】
本開示は、ハプロ不全障害の治療を必要とする対象におけるハプロ不全障害を治療する方法を提供する。この方法は、有効量のｔＲＮＡおよび／または発現ベクター、例えば、本明細書に開示されるｔＲＮＡおよび／または発現ベクターを、単独で、または対象におけるハプロ不全障害を治療するための別の治療薬と組み合わせて投与することを含む。
【0129】
ハプロ不全障害がドラベ症候群である特定の実施形態において、方法は、対象における発作頻度、発作重症度、および／または認知障害を軽減する。例えば、特定の実施形態において、この方法は、対象における発作頻度を、例えば、１日、１週間、または１か月の期間にわたって少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減少させる。特定の実施形態において、この方法は、例えば、１日、１週間、または１か月の期間にわたって発作頻度を５０％減少させる。
【0130】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な活性剤（例えば、組換えポリペプチドおよび／または多量体タンパク質）の量を指す。有効量は、１回以上の投与、適用、または用量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図するものではない。
【0131】
本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象、例えばヒトにおける疾患の治療を意味する。これは（ａ）病気を阻害する、すなわちその発症を阻止すること、および（ｂ）病気を和らげる、すなわち、病状の退行を引き起こすこと、を含む。本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載の方法および組成物によって治療される生物を指す。そのような生物は、好ましくは、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）を含み、より好ましくは、ヒトを含む。
【0132】
本明細書に記載の方法および組成物は、単独で、または他の治療薬および／またはモダリティと組み合わせて使用され得る。本明細書で使用される「組み合わせて」投与されるという用語は、対象が障害に苦しんでいる過程で２つ（またはそれ超）の異なる治療が対象に送達され、ある時点で患者に対する治療の効果が重複することを意味すると理解される。特定の実施形態において、１つの治療の送達は、第２の治療の送達が開始されたときにまだ起こっているので、投与に関して重複がある。これは、本明細書では「同時に」または「同時送達」と呼ばれることもある。他の実施形態において、１つの治療の送達は、他の治療の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合の特定の実施形態において、治療は、併用投与のためより効果的である。例えば、第２の治療はより効果的であり、例えば、第２の治療の不在下で投与された場合、または最初の治療で同様の状況が見られた場合に見られるよりも、第２の治療がより少ない場合に同等の効果が見られるか、または第２の治療が、症状を大幅に軽減する。特定の実施形態において、送達は、症状の減少、または障害に関連する他のパラメーターが、他の不在下で送達された１つの治療で観察されるものよりも大きいようなものである。２つの処理の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的よりも大きくあり得る。送達は、送達された最初の治療の効果が、第２の治療が送達されたときに依然として検出可能であるようなものであり得る。
【0133】
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法または組成物は、１つ以上の追加の療法、例えば、ＤＩＡＣＯＭＩＴ（登録商標）（スチリペントール）、ＥＰＩＯＤＯＬＥＸ（登録商標）（カンナビジオール）、ケトン食、ＯＮＦＩ（登録商標）（クロバザム）、ＴＯＰＡＭＡＸ（登録商標）（トピラメート）、またはバルプロ酸、と組み合わせて投与される。例えば、ドラベ症候群の治療中に、方法または組成物は、本明細書に記載の１つ以上の追加の療法、例えば、ＤＩＡＣＯＭＩＴ（登録商標）（スチリペントール）、ＥＰＩＯＤＯＬＥＸ（登録商標）（カンナビジオール）、ケトン食、ＯＮＦＩ（登録商標）（クロバザム）と組み合わせて投与される、ＴＯＰＡＭＡＸ（登録商標）（トピラメート）、またはバルプロ酸、と組み合わせて投与される。
【0134】
説明全体を通して、組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、さらに、記載された成分から本質的になるか、またはそれからなる本発明の組成物が存在すること、および記載された処理ステップから本質的になるかまたはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが企図される。
【0135】
要素または成分が、記載された要素または成分のリストに含まれる、および／またはリストから選択されると言われる本出願において、要素または成分は、記載された要素または成分のうちのいずれか１つであり得るか、または要素または成分は、記載された要素または成分のうちの２つ以上からなる群から選択され得ることを理解されたい。
【0136】
さらに、本明細書に記載の組成物または方法の要素および／または特徴は、本明細書で明示的であろうと暗黙的であろうと、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な方式で組み合わされ得ることを理解されたい。例えば、特定の化合物に言及する場合、その化合物は、文脈から別段の理解がない限り、本発明の組成物および／または本発明の方法の様々な実施形態において使用され得る。言い換えれば、本出願内で、実施形態は、明確で簡潔な出願を記述および描画することを可能にする方式で説明および示されてきたが、実施形態は、本発明および本発明から逸脱することなく、様々に組み合わせまたは分離され得ることが意図され、理解されるであろう。例えば、本明細書に記載および描写される全ての特徴は、本明細書に記載および描写される本発明（複数可）の全ての態様に適用され得ることが理解されよう。
【0137】
「の少なくとも１つ」という表現は、文脈および使用から別段の理解がない限り、表現の後に記載されたオブジェクトの各々、および２つ以上の記載されたオブジェクトの様々な組み合わせを個別に含むことを理解されたい。３つ以上の記載されたオブジェクトに関連する「および／または」という表現は、文脈から別段の理解がない限り、同じ意味を有すると理解されたい。
【0138】
それらの文法的同等物を含む「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語の使用は、概して、制約がなく、制限がないものとして、例えば、文脈から特に明記または理解されない限り、追加の記載されない要素またはステップを除外しないと理解されたい。
【0139】
「約」という用語の使用が定量値の前にある場合、特に明記しない限り、本発明はまた、特定の定量値自体も含む。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、他に示されないかまたは推論されない限り、名目の値からの±１０％の変動を指す。
【0140】
さらに、本発明が実施可能である限り、ステップの順序または特定の動作を実行するための順序は重要ではないことを理解されたい。さらに、２つ以上のステップまたは動作が同時に実行され得る。
【0141】
任意かつ全ての実施例、または本明細書の例示的な言語、例えば「など」または「含む」の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特許請求されない限り、本発明の範囲に制限をもたらさない。本明細書におけるいかなる文言も、本発明の実施に不可欠であるとしていかなる特許請求されない要素を示すと解釈されるべきではない。
【実施例0142】
以下の実施例は、単に例示的なものであり、本発明の範囲または内容を決して制限することを意図するものではない。
【0143】
実施例１－野生型ＳＣＮ１Ａ転写産物の発現を増強するためのｔＲＮＡ発現
この実施例において、ＳＣＮ１Ａにおいて最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンが決定された。これらのコドンについての同族のｔＲＮＡの発現は、ＳＣＮ１Ａの発現を増強し、ドラベ症候群を治療する可能性がある。
この実施例において、ＳＣＮ１Ａにおいて最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンが決定された。これらのコドンについての同族のｔＲＮＡの発現は、ＳＣＮ１Ａの発現を増強し、ドラベ症候群を治療する可能性がある。
【0144】
最初に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の各コドンのコドン使用率を決定した。次に、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の各コドンの最適性がｔＲＮＡ適応指数（ｔＡＩ）を使用して決定された。ｔＡＩは、ｔＲＮＡの細胞濃度（ｔＲＮＡ遺伝子のコピー数に基づく）の推定値およびデコードの効率を考慮した各コドンの翻訳効率の推定値であり、ｔＡＩ値が高いほどより最適なコドンを示す。ｔＡＩは、例えば、ｄｏｓ Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３２（１７）：５０３６－５０４４、およびＭａｈｌａｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬＯＳ ＣＯＭＰＵＴＢＩＯＬ．１０（１）：ｅ１００３２９４に記載されているこの実施例における計算について、ｔＲＮＡ遺伝子のコピー数に基づく推定値の代わりに、ＨＥＫ２９３細胞のｔＲＮＡレベルの直接定量化に基づく修正ｔＡＩ値が使用された（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＮＡＴ．ＭＥＴＨＯＤＳ １２（９）：８３５－８３７に記載）。
【0145】
コドン使用率にｔＡＩ値の逆数を掛けて、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の各コドンのスコアを求めた。結果の要約を表３に示す。概して、最高スコアのコドンは、トランスクリプトームに関連して最小の最適で、ＳＣＮ１Ａにおいて最も豊富であり、これらのコドンの同族ｔＲＮＡは、ＳＣＮ１Ａ発現を増強するための最良の候補である。
【表3】
【0146】
実施例２－野生型ＳＣＮ１Ａ転写産物の発現を増強するためのｔＲＮＡ発現
この実施例において、培養細胞における野生型ＳＣＮ１Ａの発現を増強するための選択された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の異所性送達の能力が評価された。
この実施例において、培養細胞における野生型ＳＣＮ１Ａの発現を増強するための選択された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の異所性送達の能力が評価された。
【0147】
ＡＴＡ（Ｉｌｅ）、ＧＴＡ（Ｖａｌ）、およびＡＧＡ（Ａｒｇ）が、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の例示的な非最適コドンとして選択された。ＡＴＡ ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＡＴＡ）をコードするヌクレオチド配列は配列番号１に示され、ＧＴＡ ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＧＴＡ）をコードするヌクレオチド配列は配列番号２に示され、そしてＡＧＡ ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＡＧＡ）をコードするヌクレオチド配列は配列番号３に示される。
【0148】
ＳＣＮ１Ａオープンリーディングフレームは、フォワードプライマーにＫｐｎＩ部位およびリバースプライマーにＮｏｔＩ部位を含むプライマーを使用して、ヒト脳ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＲＴ－ＰＣＲによって増幅された。次に、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ部位を使用して、ｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロモーターおよびＳＶ４０ｐｏｌｙ（Ａ）部位の間にＳＣＮ１ＡＯＲＦがクローニングされた。
【0149】
ｔＲＮＡＡＴＡ、ｔＲＮＡＧＴＡ、およびｔＲＮＡＡＧＡ遺伝子配列（２００塩基対（ｂｐ）の隣接ゲノムＤＮＡ配列を伴うｔＲＮＡコード配列を含む）は、５’末端にＸｈｏＩ部位および３’末端にＰｃｉＩを有するｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）として順序付けられた。ｔＲＮＡＡＴＡ遺伝子配列（２００ｂｐの隣接ゲノムＤＮＡ配列を伴うｔＲＮＡコード配列を含む）は、配列番号６に示され、ｔＲＮＡＧＴＡ遺伝子配列（２００ｂｐの隣接ゲノムＤＮＡ配列を伴うｔＲＮＡコード配列を含む）は配列番号７に示され、ｔＲＮＡＡＧＡ遺伝子配列（２００塩基対（ｂｐ）の隣接ゲノムＤＮＡ配列を伴うｔＲＮＡコード配列を含む）は配列番号８に示される。
【0150】
アンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源のみがｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔから残されるように、全てのｔＲＮＡ遺伝子配列はＸｈｏＩおよびＰｃｉＩ部位を使用してｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に個別にクローン化された。ｔＲＮＡ遺伝子配列全体はシーケンシングによって確認された。
【0151】
ＨＥＫ２９３細胞は、６ウェルプレートのウェルあたり３００，０００細胞で、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで播種された。２４時間後、各ウェルはモック遺伝子導入（ＤＮＡなし）された、または１００ｎｇのＳＣＮ１Ａプラスミドおよび０、１００、２００、または３００ｎｇの各ｔＲＮＡのいずれかを１、４、７、または１０μＬのエンハンサーおよび１０μＬのＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）で遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞は２４時間インキュベートされた後、製造元のプロトコルに従ってトータルＲＮＡ調製のためにＴｒｉｚｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に直接回収された。次に、各条件からの２μｇのトータルＲＮＡを４ＵのＴｕｒｂｏＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で処理され、２．５Ｍ塩化リチウムでの沈殿によって精製された。製造元の指示に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘおよびランダムプライマー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、総反応量１０μＬのＤＮａｓｅ処理ＲＮＡ３００ｎｇからｃＤＮＡが調製された。ｑＰＣＲは、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、ＳＹＢＲ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｑＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）、ＳＣＮ１ＡおよびＧＡＰＤＨのプライマー、ならびに反応あたり２０分の１のｃＤＮＡを使用して、総反応量１０μＬで実施された。
【0152】
図３に示すとおり、様々な用量で、異所性ｔＲＮＡの発現は、内因性転写産物、ＧＡＰＤＨに対する影響は最小限であった。しかし、異所性ｔＲＮＡ発現は、ＳＣＮ１Ａ発現のほぼ直線的な増加をもたらし、テストされたｔＲＮＡの最高用量で最大７倍であった（図３）。最高濃度のｔＲＮＡを除いて、細胞に対する明白な毒性は観察されなかった。
【0153】
まとめると、これらの結果は、ｍＲＮＡ転写産物、例えば、ＳＣＮ１Ａ転写産物の発現が、その転写産物内の非最適コドンと同族のｔＲＮＡの異所性発現によって増加され得ることを示している。
【0154】
実施例３－ハプロ不全遺伝子の発現を増強するためのｔＲＮＡ発現
この実施例では、ハプロ不全障害に関連する遺伝子の範囲において、最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンが決定された。これらのコドンの同族のｔＲＮＡの発現は、遺伝子発現を増強し、ハプロ不全障害を治療する可能性がある。
この実施例では、ハプロ不全障害に関連する遺伝子の範囲において、最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンが決定された。これらのコドンの同族のｔＲＮＡの発現は、遺伝子発現を増強し、ハプロ不全障害を治療する可能性がある。
【0155】
実施例１に記載されているとおり、遺伝子における各コドンのコドン使用率が決定された。次に、遺伝子における各コドンの最適性が、ｔＲＮＡ適応指数（ｔＡＩ）を使用して決定された。ｔＡＩは、ｔＲＮＡの細胞濃度（ｔＲＮＡ遺伝子のコピー数に基づく）の推定値およびデコード効率を考慮した各コドンの翻訳効率の推定値であり、ｔＡＩ値が高いほど最適なコドンを示す。ｔＡＩは、例えば、ｄｏｓ Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．３２（１７）：５０３６－５０４４およびＭａｈｌａｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬＯＳ ＣＯＭＰＵＴ．ＢＩＯＬ．１０（１）：ｅ１００３２９４に記載されている。コドン使用率にｔＡＩ値の逆数を掛けて、遺伝子における各コドンのスコアを求めた。概して、最高スコアのコドンは、トランスクリプトームに関連して、遺伝子において最小の最適で、最も豊富であり、これらのコドンの同族のｔＲＮＡは、遺伝子発現を増強するための最良の候補である。
【0156】
示された遺伝子における３つの最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンを表４に示し、示された遺伝子における１０個の最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンを表５に示す。
【表4】
【表5】
【0157】
さらに、ｔＲＮＡ遺伝子のコピー数に基づくｔＲＮＡレベルの推定ではなく、ＨＥＫ２９３細胞におけるｔＲＮＡレベルの直接定量化に基づく修正ｔＡＩ値を使用することを除いて、示された遺伝子における最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンは上記のとおり計算された（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＮＡＴ．ＭＥＴＨＯＤＳ１２（９）：８３５－８３７に記載）。
【0158】
示された遺伝子の３つの最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンを表６に示し、示された遺伝子の１０個の最小の最適で最も大きな比率を占めるコドンを表７に示す。
【表6】
【表7】
【0159】
参照による組み込み
本明細書で参照される特許および科学文書の各々の開示全体は、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。
同等物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するものではなく、全ての点で例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および同等の範囲内に収まる全ての変更は、そこに包含されることが意図される。
本明細書で参照される特許および科学文書の各々の開示全体は、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。
同等物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するものではなく、全ての点で例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および同等の範囲内に収まる全ての変更は、そこに包含されることが意図される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【配列表】