特開 2025-101688 ミトコンドリア機能向上剤、化粧品及びミトコンドリア機能向上方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025101688

(43)【公開日】2025-07-07

(54)【発明の名称】ミトコンドリア機能向上剤、化粧品及びミトコンドリア機能向上方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/57 20150101AFI20250630BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20250630BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20250630BHJP

   A61P 17/18 20060101ALI20250630BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20250630BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20250630BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20250630BHJP

   A61K 8/98 20060101ALI20250630BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20250630BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20250630BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20250630BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20250630BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20250630BHJP

【ＦＩ】

A61K35/57

A61K35/12

A61P17/00

A61P17/18

A61P17/16

A61P39/06

A61P21/00

A61K8/98

A61Q19/00

A61Q19/08

A23L33/10

C12N5/071

C12N5/077

【審査請求】未請求

【請求項の数】21

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023218705

(22)【出願日】2023-12-25

(71)【出願人】

【識別番号】511132786

【氏名又は名称】エムスタイルジャパン株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(74)【代理人】

【識別番号】100180921

【弁理士】

【氏名又は名称】峰 雅紀

(72)【発明者】

【氏名】稲冨 幹也

(72)【発明者】

【氏名】片倉 喜範

【テーマコード（参考）】

4B018

4B065

4C083

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B018MD69

4B018ME10

4B018MF01

4B065AA93X

4B065AC12

4B065BC12

4B065BD42

4B065CA41

4B065CA50

4C083AA071

4C083AA072

4C083CC03

4C083EE11

4C083EE12

4C083EE13

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB33

4C087MA52

4C087MA63

4C087NA14

4C087ZA89

4C087ZA94

4C087ZC52

4C087ZC61

(57)【要約】

【課題】 本願発明は、皮膚細胞におけるミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上剤等を提供することを目的とする。
【解決手段】 細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上剤であって、燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する、ミトコンドリア機能向上剤である。本願発明の各観点によれば、皮膚細胞におけるミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上剤等を提供することが可能となる。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上剤であって、
燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する、ミトコンドリア機能向上剤。

【請求項2】

前記有効成分は、PGC1-αを活性化させるものである、請求項１記載のミトコンドリア機能向上剤。

【請求項3】

前記有効成分は、細胞中のミトコンドリア数を増加させるものである、請求項２記載のミトコンドリア機能向上剤。

【請求項4】

前記有効成分は、ミトコンドリアの面積を増大させるものである、請求項３記載のミトコンドリア機能向上剤。

【請求項5】

請求項１から４のいずれかの前記有効成分を含有する、細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるための化粧品。

【請求項6】

請求項１から４のいずれかの前記有効成分を含有する、細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるためのシワ改善剤。

【請求項7】

請求項１から４のいずれかの前記有効成分を含有する、細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるための老化抑制剤。

【請求項8】

細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上剤生産方法であって、
燕窩に含まれる成分を有効成分として加えるステップを含む、ミトコンドリア機能向上剤生産方法。

【請求項9】

細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上方法であって、
燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する外用剤を対象に塗布するステップを含む、ミトコンドリア機能向上方法（ヒトに対する医療行為を除く）。

【請求項10】

腸管細胞から分泌されるエクソソームを制御するエクソソーム制御剤であって、
燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する、エクソソーム制御剤。

【請求項11】

燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する、腸管細胞から分泌されるエクソソームを制御するエクソソーム制御用食品組成物。

【請求項12】

腸管細胞から分泌される腸管由来エクソソームを含有する腸管由来エクソソーム含有組成物を製造する腸管由来エクソソーム含有組成物製造方法であって、
前記腸管細胞を含む培地に燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する溶液を加える工程を含む、腸管由来エクソソーム含有組成物製造方法。

【請求項13】

腸管細胞から分泌されるエクソソームを制御するエクソソーム制御方法であって、
前記腸管細胞を含む培地に燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する溶液を加える工程を含む、エクソソーム制御方法。

【請求項14】

燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する溶液を加えた腸管細胞から分泌された腸管由来エクソソームを含有する、腸管由来エクソソーム含有組成物。

【請求項15】

細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるためのミトコンドリア機能向上剤であって、
請求項１４記載の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、ミトコンドリア機能向上剤。

【請求項16】

表皮角化細胞、真皮線維芽細胞、又は、筋芽細胞におけるミトコンドリアの機能を向上させる、請求項１５記載のミトコンドリア機能向上剤。

【請求項17】

活性酸素を消去させる活性酸素消去剤であって、
請求項１４記載の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、活性酸素消去剤。

【請求項18】

皮膚のシワを改善させるシワ改善剤であって、
請求項１４記載の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、シワ改善剤。

【請求項19】

皮膚の保湿機能を向上させる皮膚保湿機能向上剤であって、
請求項１４記載の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、皮膚保湿機能向上剤。

【請求項20】

請求項１４記載の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、筋肉機能活性化剤。

【請求項21】

請求項１４記載の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、老化関連疾患予防用食品組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願発明は、ミトコンドリア機能向上剤、化粧品及びミトコンドリア機能向上方法に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚は人間の体の全表面を覆っており、周囲の環境に常に晒されている。皮膚の構造は表皮、真皮、皮下脂肪層の3層に分けられ、さらに表皮は角層、顆粒層、有棘層、基底層からなる。

【0003】

皮膚が紫外線や化学物質などの外部刺激にさらされると活性酸素が発生する。活性酸素は表皮のコラーゲン分解や、メラニン産生を促進し、シワやシミ、たるみなどの皮膚老化を引き起こす。

【0004】

また、外部刺激により皮膚のバリア機能が低下することで、痒みや湿疹、アトピー性皮膚炎などの皮膚トラブルを招く。

【0005】

これらを改善するために、近年では皮膚のアンチエイジングに関連する研究が数多く行われており、本願発明者らは特に皮膚改善に効果がある食品の探索を行なっている。

【0006】

SIRT1やSIRT3はその活性化によりさまざまな組織でアンチエイジング効果を示すことが明らかとなっている。

【0007】

SIRT1が活性化すると、生理活性フローの下流にあるミトコンドリアや外的バリア、内的バリアの活性が上がり、シワ抑制や皮膚バリア機能及び保水機能の向上につながる。

【0008】

また、SIRT3が活性化すると、活性酸素が消去され、美白促進につながる。

【0009】

近年、ミトコンドリア機能は老化と密接な関連があることが明らかにされつつある。特に皮膚細胞においてミトコンドリアの機能障害は、シワ形成、表皮肥厚等の皮膚老化、白髪や脱毛の増加につながるとされており、ミトコンドリア機能の向上によるシワの抑制及び改善、表皮肥厚の抑制、白髪や脱毛の抑制等の老化抑制が期待されている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】吉村ら「MITOL活性化薬による抗老化作用」実験医学Pp210-216 Vol.37 No.12 2019年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

そこで、本願発明は、皮膚細胞又は筋芽細胞におけるミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上剤等を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本願発明の第１の観点は、細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上剤であって、燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する、ミトコンドリア機能向上剤である。

【0013】

本願発明の第２の観点は、第１の観点のミトコンドリア機能向上剤であって、前記有効成分は、PGC1-αを活性化させるものである。

【0014】

本願発明の第３の観点は、第２の観点のミトコンドリア機能向上剤であって、前記有効成分は、細胞中のミトコンドリア数を増加させるものである。

【0015】

本願発明の第４の観点は、第３の観点のミトコンドリア機能向上剤であって、前記有効成分は、ミトコンドリアの面積を増大させるものである。

【0016】

本願発明の第５の観点は、第１から第４のいずれかの観点の前記有効成分を含有する、細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるための化粧品である。

【0017】

本願発明の第６の観点は、第１から第４のいずれかの観点の前記有効成分を含有する、細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるためのシワ改善剤である。

【0018】

本願発明の第７の観点は、第１から第４のいずれかの観点の前記有効成分を含有する、細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるための老化抑制剤である。

【0019】

本願発明の第８の観点は、細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上剤生産方法であって、燕窩に含まれる成分を有効成分として加えるステップを含む、ミトコンドリア機能向上剤生産方法である。

【0020】

本願発明の第９の観点は、細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上方法であって、燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する外用剤を対象に塗布するステップを含む、ミトコンドリア機能向上方法（ヒトに対する医療行為を除く）である。

【0021】

本願発明の第１０の観点は、腸管細胞から分泌されるエクソソームを制御するエクソソーム制御剤であって、燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する、エクソソーム制御剤である。

【0022】

本願発明の第１１の観点は、燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する、腸管細胞から分泌されるエクソソームを制御するエクソソーム制御用食品組成物である。

【0023】

本願発明の第１２の観点は、腸管細胞から分泌される腸管由来エクソソームを含有する腸管由来エクソソーム含有組成物を製造する腸管由来エクソソーム含有組成物製造方法であって、前記腸管細胞を含む培地に燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する溶液を加える工程を含む、腸管由来エクソソーム含有組成物製造方法である。

【0024】

本願発明の第１３の観点は、腸管細胞から分泌されるエクソソームを制御するエクソソーム制御方法であって、前記腸管細胞を含む培地に燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する溶液を加える工程を含む、エクソソーム制御方法である。

【0025】

本願発明の第１４の観点は、燕窩に含まれる成分を有効成分として含有する溶液を加えた腸管細胞から分泌された腸管由来エクソソームを含有する、腸管由来エクソソーム含有組成物である。

【0026】

本願発明の第１５の観点は、細胞中のミトコンドリアの機能を向上させるためのミトコンドリア機能向上剤であって、第１４の観点の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、ミトコンドリア機能向上剤である。

【0027】

本願発明の第１６の観点は、第１５の観点のミトコンドリア機能向上剤であって、表皮角化細胞、真皮線維芽細胞、又は、筋芽細胞におけるミトコンドリアの機能を向上させる。

【0028】

本願発明の第１７の観点は、活性酸素を消去させる活性酸素消去剤であって、第１４の観点の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、活性酸素消去剤である。

【0029】

本願発明の第１８の観点は、皮膚のシワを改善させるシワ改善剤であって、第１４の観点の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、シワ改善剤である。

【0030】

本願発明の第１９の観点は、皮膚の保湿機能を向上させる皮膚保湿機能向上剤であって、第１４の観点の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、皮膚保湿機能向上剤である。

【0031】

本願発明の第２０の観点は、第１４の観点の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、筋肉機能活性化剤である。

【0032】

本願発明の第２１の観点は、第１４の観点の前記腸管由来エクソソームを有効成分として含有する、老化関連疾患予防用食品組成物である。

【発明の効果】

【0033】

本願発明の各観点によれば、皮膚細胞又は筋芽細胞におけるミトコンドリアの機能を向上させるミトコンドリア機能向上剤等を提供することが可能となる。

【0034】

皮膚老化抑制食品の探索を行うにあたって本願発明者らは、長寿遺伝子であるSIRT1、SIRT3に着目した。

【0035】

本願発明の第２の観点によれば、SIRT1を活性化させてPGC1-αを活性化させることにより、ミトコンドリアの機能を向上させることが可能になる。

【0036】

特に、本願発明の第３及び第４の観点によれば、皮膚細胞中のミトコンドリア数及びミトコンドリア面積を増加させることにより、ミトコンドリアの機能及び活性を向上させることが可能になる。特に、従来、ミトコンドリアの数及び面積の両方を増大させるものがあまり報告されておらず、本願発明の優れた効果といえる。

【0037】

本願発明の第５から第７のいずれかの観点によれば、皮膚に塗布することによりミトコンドリア機能を向上させる、化粧品、シワ改善剤又は老化抑制剤を提供可能となる。

【0038】

本願発明の第１０から第２１の観点によれば、細胞のミトコンドリア増強に直接的な影響を及ぼす腸管細胞からのエクソソームの分泌を制御することが可能となる。

【0039】

第１０から第２１の観点は、本発明者らが、燕窩に含まれる成分が腸管細胞に吸収されることを契機として腸管細胞から分泌されるエクソソームが、細胞のミトコンドリア増強や活性化につながることを見出したことで想到し得たものである。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】SIRT1プロモーター活性によるEGFP蛍光強度を示す図である。

【図2】SIRT3プロモーター活性によるEGFP蛍光強度を示す図である。

【図3】HaCaT細胞におけるミトコンドリア数を示す図である。

【図4】HaCaT細胞におけるミトコンドリア面積を示す図である。

【図5】HaCaT細胞におけるミトコンドリア活性を示す図である。

【図6】SIRT1プロモーター活性化サンプルを選抜するために、EGFPの蛍光強度を測定した結果を示す図である。

【図7】長寿遺伝子活性化サンプルを選抜するために、SIRT1、SIRT3のmRNA発現量を測定した結果を示す図である。

【図8】エクソソームをHaCaT細胞に添加してRT-ｑPCRによりmRNA発現量を測定した結果を示す図である。

【図9】外的バリア関連遺伝子のmRNA発現量をRT-qPCRにより測定した結果を示す図である。

【図10】蛍光強度によりミトコンドリア活性を測定した結果を示す図である。

【図11】活性酸素種（ROS）消去能について、BES 蛍光強度の変化を測定した結果を示す図である。

【図12】Caco-2 細胞由来エクソソームをヒト皮膚線維芽細胞に添加した後のSIRT1、SIRT3の mRNA発現量を測定した結果を示す図である。

【図13】筋芽細胞におけるミトコンドリア活性化効果の検証のため、蛍光強度を測定した結果を示す図である。

【図14】ミトコンドリアの面積を測定して比較した結果を示す図である。

【図15】ツバメの巣エキスの腸管細胞を介したミトコンドリア活性化効果を検証のため、蛍光強度を測定した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0041】

以下、図面を参照して本願発明の実施形態を詳細に説明する。なお、本願発明の実施例は、以下に記載する内容に限定されるものではない。

【実施例0042】

第１章 実験材料および方法
第１節 細胞培養
第1項 ヒト表皮角化細胞HaCaT細胞
本研究では、ヒト表皮のモデル細胞として、ヒト表皮角化細胞HaCaT細胞を用いた。HaCaT細胞は56℃の恒温槽で30分間加熱することで非動化させたFetal Bovine Serum(FBS) を10%含有させたDMEM培地を用いて、細胞培養ディッシュ(Corning, New York, USA)にて、37℃、5% CO2存在下で継代培養した。DMEM培地は、470 mLのMilli-Q水に対してダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」(2) （Nissui pharmaceutical, Tokyo, Japan）4.75 gを溶解し、オートクレーブにより滅菌した後に、100 U/mL ペニシリン（Meiji seika pharma, Tokyo, Japan）1 mL、 0.1 mg/mL ストレプトマイシン （Meiji seika pharma, Tokyo, Japan）1 mL、10% NaHCO₃ （FUJIFILM Wako）6 mL、0.22 μmフィルターで濾過滅菌を行ったL-グルタミンを終濃度が4 mM（0.2 M L(+)-グルタミン （FUJIFILM Wako）10 mL）となるように添加して作成した。培地は4℃で保存した。

【0043】

第2項 ヒト表皮角化細胞HaCaT（SIRT1 p-EGFP）細胞
先行研究により樹立された、SIRT1プロモーターにより発現が制御されるEGFP発現ベクター（SIRT1 p-EGFP）をHaCaT細胞に導入したHaCaT細胞(SIRT1 p-EGFP)を用いた。HaCaT細胞と同様に、10% FBS添加DMEM培地、ペトリディッシュを用いて、37℃、5％CO₂存在下で継代培養した。

【0044】

第3項 ヒト表皮角化細胞HaCaT（SIRT3 p-EGFP）細胞
先行研究により樹立された、SIRT3プロモーターにより発現が制御されるEGFP発現ベクター（SIRT3 p-EGFP）をHaCaT細胞に導入したHaCaT細胞(SIRT3 p-EGFP)を用いた。HaCaT細胞と同様に、10% FBS添加DMEM培地、ペトリディッシュを用いて、37℃、5％CO₂存在下で継代培養した。

【0045】

第2節 サンプル及びその調整法
第1項 燕窩サンプル
燕窩サンプル溶液Ａ～Ｃを用意した。燕窩サンプル溶液の作製手順として、まず、乾燥粉砕を施したマレーシア産アナツバメ巣（含有水分10%以下）とプロテアーゼ調整液を1:９の比率で浸漬させたのち、温度45-55℃の範囲をキープしながら、48時間酵素処理加水分解を行った。その後、目びらき100メッシュの篩により未溶解残差を取り除き、篩過した液体を温度80-90℃・60分の条件下で酵素を失活させて燕窩由来抽出物とした。

【0046】

ここで、上記のプロテアーゼ調整液は、RO膜処理を施した純水にAspergillus oryzae由来のプロテアーゼ（力価：30000u/g（CFA法・pH6.0））を濃度1.5から2.5%の範囲で常温にて完全溶解させたものを用いた。

【0047】

続いて、燕窩由来抽出物を含む溶液（以下、「燕窩溶液」）を10,000 rpmで10分遠心し、その上清を1×PBSを溶媒として150 μg/mL、450 μg/mL、1500 μg/mL、4500 μg/mLの濃度で調整した。4℃で保存し、適宜懸濁して使用した。

【0048】

第2項 ポジティブコントロール
Resveratrol溶液
Resveratrol粉末（Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan）をジメチルスルホキシド（DMSO）（FUJIFILM Wako）を用いて10 mMに調製し、0.20 μm×13 mmのフィルター（Merck Millipore）にて濾過滅菌したものを－20℃で保存し、適宜解凍して懸濁し使用した。

【0049】

AICAR溶液
AICAR粉末（FUJIFILM Wako）を1×PBSを用いて100 mMに調製し、0.22 μm×13 mmのフィルター（Merck Millipore）にて濾過滅菌したものを-20℃で保存し、適宜解凍して使用した。

【0050】

第3節 IN Cell Analyzer 2200を用いた燕窩の機能性の探索
第1項 SIRT1、SIRT3活性化の検証
試薬の調整
（1）細胞固定液
必要量の1×PBSに対して、パラホルムアルデヒド（FUJIFILM Wako, Tokyo, Japan）0.08 g /mLと5 N NaOH 2 μL/mLを加えて、8%パラホルムアルデヒドの溶液を60℃のウォーターバスで溶かして作製し、4℃で保存した。
（2）核染色溶液
Hoechst33342を1×PBSで2 μg/mLとなるように希釈し、遮光状態で使用した。

【0051】

燕窩溶液を添加したHaCaT (SIRT1/3)細胞におけるSIRT1/3活性を評価した。HaCaT（SIRT1/3p-EGFP）細胞が終濃度6.0×104 cells/mLとなるように96-well black plate（Greiner Bio-one, Tokyo, Japan）に播種し、10％FBSを含むDMEM培地にて37℃、5％CO₂存在下で培養した。24時間後、ポジティブコントロールとしてResveratrol及び燕窩サンプルを各濃度0.1 μL/wellとなるよう添加した。またコントロールとして1×PBSをサンプル添加量と同量加え、37℃、5％CO₂存在下で培養した。48時間後、細胞固定液を100 μL/wellで添加し、遮光下室温で15分間静置した。細胞培養液と細胞固定液を合わせて除去し、1×PBSで2回洗浄した後、核染色溶液を100 μL/wellで添加した。遮光下室温で20分間静置した後、核染色溶液を除去し、1×PBSで2回洗浄した。1×PBSを100 μL/wellで添加し、IN Cell Analyzer 2200を用いて、EGFP蛍光強度を測定した。

【0052】

第2項 ミトコンドリアへの効果の検証
（1）ミトコンドリア染色溶液
10％FBSを含むDMEM培地を用いて、Mito TrackerRed CMXosを終濃度0.25 μMに、Mito TrackerGreen FMを終濃度0.2 μMに希釈した。
（2）核染色溶液
第３節第1項と同様の手順で核染色溶液を作成した。

【0053】

燕窩溶液を添加したHaCaT細胞におけるミトコンドリアへの効果を検証した。HaCaT細胞が終濃度6.0×10⁴ cells/mLとなるように96-well black plateに播種し、10％FBSを含むDMEM培地にて37℃、5％CO₂存在下で培養した。24時間後、AICARは終濃度250 mMになるよう、燕窩サンプルは各濃度0.1 μL/wellとなるよう添加した。またコントロールとして1×PBSをサンプル添加量と同量加え、37℃、5％CO₂存在下で培養した。24時間後、細胞培養液を除去し、ミトコンドリア染色溶液を100 μL/wellで添加し、37℃で15分間インキュベートした。ミトコンドリア染色溶液を除去した後、核染色溶液を100 μL/wellで添加し、遮光下室温にて30分間静置した。核染色溶液を除去し、1×PBSを150 μL/wellで添加し、IN Cell Analyzer 2200を用いて、ミトコンドリアの数・面積・活性を測定した。

【0054】

第6節 統計処理
統計処理はStudent’s t-test, Tukey-Krammer法 (Statcel 4) により行い、p<0.05をもって有意差ありとした。

【0055】

第２章 結果
第１節 IN Cell Analyzer 2200を用いた燕窩の機能性の探索
SIRT1 p-EGFPを導入したHaCaT細胞を用いて、燕窩サンプルを添加した時のSIRT1プロモーター活性を、EGFP蛍光強度を測定することで評価した。図１は、燕窩サンプルのSIRT1プロモーター活性によるEGFP蛍光強度を示す図である。HaCaT(SIRT1 p-EGFP)細胞にポジティブコントロールとしてResveratrolと燕窩サンプルを添加し、48時間培養後にIN Cell Analyzer 2200によりEGFPの蛍光強度を測定した。

【0056】

その結果、図１に示す通り、ツバメの巣のサンプルＡ～Ｃのいずれにおいてもコントロールよりも有意に高い蛍光強度が得られた。これは、燕窩サンプルがSIRT1を量的に活性化することを示唆している。SIRT1の量的活性はPGC1-αの活性化につながる。

【0057】

次に、SIRT3 p-EGFPを導入したHaCaT細胞を用いて、燕窩サンプルを添加した時のSIRT3プロモーター活性を、EGFP蛍光強度を測定することで評価した。図２は、燕窩サンプルのSIRT3プロモーター活性によるEGFP蛍光強度を示す図である。SIRT1と同様にHaCaT(SIRT3 p-EGFP)細胞にResveratrolと燕窩サンプルを添加し、48時間培養後にIN Cell Analyzer 2200によりEGFP蛍光強度を測定した。

【0058】

その結果、図２に示す通り、ツバメの巣Ａの4500μg/mLのサンプルがコントロールより有意に高い蛍光強度を示した。

【0059】

燕窩サンプルによるHaCaT細胞におけるミトコンドリアへの効果を用いて測定した。図３、図４、図５は、それぞれ、HaCaT細胞におけるミトコンドリア数、ミトコンドリア面積、ミトコンドリア活性を示す図である。HaCaT細胞にポジティブコントロールとしてAICARを終濃度100 mM、燕窩サンプルをそれぞれ0.1 μL/wellとなるように添加した。48時間培養後MitoTracker GreenとMitoTracker Redで染色し、IN Cell Analyzer 2200によりミトコンドリアの数と面積及び活性を測定した。

【0060】

その結果、図３及び図４に示す通り、コントロールと比較して燕窩A、B、C全てにおいて数と面積の有意な増強が確認できた。

【0061】

また、図５に示す通り、ミトコンドリア活性についてもコントロールと比較して強い蛍光強度を示す傾向が得られた。特に、450μg/mLのサンプルＡ、450μg/mLや4500μg/mLのサンプルＢ、4500μg/mLのサンプルＣで高い活性が認められた。

【0062】

なお、図５に示されるミトコンドリア活性とは、高い活性を示したミトコンドリア数を反映しているものであり、試料中の全部のミトコンドリアの活性の総量を示すものではない。

【0063】

本研究ではまず、燕窩による皮膚改善の分子基盤を明らかにすることを目的とし、長寿遺伝子に着目して研究を行なった。SIRT1、SIRT3活性化の検証において、燕窩サンプルが、コントロールと比較してSIRT1を量的に活性化すること、及び、SIRT3を有意に活性化することが確認できた。

【0064】

また、SIRT1の下流にあるミトコンドリアへの効果の検証では、ミトコンドリアの数と面積を有意に増強し、ミトコンドリアの活性も増強する燕窩サンプルが複数確認できた。このことから、燕窩が、SIRT1の下流で、ミトコンドリアの上流にあるPGC1-αを活性化させていると考えられる。

【0065】

HaKaT細胞は血管が通っていないヒト表皮の細胞モデルである。したがって、本実施例に係る燕窩サンプルは、少なくとも塗布する化粧品、シワ改善剤又は老化抑制剤の有効成分として、シワの抑制や改善、表皮肥厚の抑制、白髪や脱毛の抑制等の機能が期待される。

【実施例0066】

第2章 実験材料および方法
第1節 細胞培養
第1項 ヒト結腸癌由来細胞株Caco-2の培養
Caco-2 細胞は、10%非働化 Fetal Bovine Serum(FBS) (56℃の恒温槽で 30 分間加熱することで補体を不活性化したもの)含有 Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培地、細胞培養ディッシュを用いて 37℃、5% CO2存在下で継代培養した。DMEM 培地は、470 mL の Milli-Q 水に対して DMEM 培地「ニッスイ」(2)(日水製薬, Tokyo, Japan) 4.75 g を溶解し、オートクレーブにより滅菌した後に、100 U/mL ペニシリン (Meiji Seika ファルマ, Tokyo, Japan) 1 mL、0.1 mg/mL ストレプトマイシン(Meiji Seika ファルマ) 1 mL、10% NaHCO3 (富士フィルム和光純薬) 6 mL、0.22 μm フィルター（Toyo Roshi）で濾過滅菌を行った L-グルタミンを終濃度が 4 mM となるように添加して作成した。培地は 4℃で保存した。

【0067】

第2項 ヒト表皮角化細胞 HaCaT 細胞の培養
Caco-2 細胞と同様に、10% FBS 添加 DMEM 培地、細胞培養ディッシュを用いて、37 ℃、5％CO₂存在下で継代培養した。

【0068】

第3項 ヒト表皮角化細胞 HaCaT(SIRT1p-EGFP)細胞の培養
先行研究により樹立された、SIRT1-EGFP レポーターベクターが導入されたHaCaT 細胞(SIRT1p-EGFP)を用いた。HaCaT 細胞(SIRT1p-EGFP)は安定発現株であり、SIRT1 プロモーターの活性化に応じて EGFP 蛍光を発現する仕組みである。Caco-2 細胞と同様に、10% FBS 添加 DMEM 培地、細胞培養ディッシュを用いて、37℃、5％CO₂存在下で継代培養した。

【0069】

第4項 ヒト皮膚線維芽細胞株 Immortalized Human Skin Fibroblast - SV40 の培養
本研究には、皮膚真皮線維芽細胞モデルとして、ヒト皮膚線維芽細胞株Immortalized Human Skin Fibroblast - SV40(以下 Skin Fibroblast 細胞)(Applied biological materials, Richmond, BC, Canada)を用いた。Skin Fibroblast 細胞は、非働化を行っていない FBS を 10%含む DMEM 培地、細胞培養ディッシュを用いて、37℃、5%の CO2存在下で継代培養した。

【0070】

第2節 サンプルおよびその調製方法 ツバメの巣サンプル
実施例１と同様に調整した燕窩溶液を 10,000 rpm で 10 分遠心し、その上清を 1×PBSを溶媒として 150 μg/mL、450 μg/mL、1500 μg/mL、4500 μg/mL の濃度で調整した。-20℃で保存し、使用する際に適宜解凍した。

【0071】

第3節 腸管を介した皮膚長寿遺伝子の活性化の検証
第1項SIRT1 プロモーター活性の効果
試薬の調製
(1) 細胞固定液
1×PBS で 8％パラホルムアルデヒドになるように希釈し、2 N 水酸化ナトリウム溶液を 5 μg/mL 加え、60℃のウォーターバスで溶かして作製し、4℃で保存した。
(2)核染色溶液
Hoechst33342 を 1×PBS で 2 μg/mL となるように希釈し、遮光状態で使用した。また、使用時に調製した。

【0072】

Caco-2 上清添加実験
Caco-2 細胞を終濃度が 1.0×10⁵ cells/mL となるように 24-well plate (FALCON) に播種した。24 時間後、ツバメの巣サンプルを各濃度 1μL/well となるように添加した。なお、コントロールとして 1×PBS を使用した。HaCaT (SIRT1p-EGFP)細胞を終濃度が 6.0×10⁴ cells/mL となるように 96-well black plate に播種し、24 時間培養後、培地を 50 μL/well 除去した後にサンプルを添加した Caco-2 細胞培養液を 50 μL/well 添加し、37 ℃、5 ％CO₂存在下で 48 時間培養した。48 時間培養後、培養液に細胞固定液 100 μL/well で添加し、室温 15 分間インキュベートした。細胞培養液と細胞固定液を除去し、1×PBS で 2 回洗浄した後、核染色溶液を 100 μL/well で添加した。室温で 20 分間静置した後、核染色溶液を除去し、1×PBS で 2 回洗浄した。PBS を 100 μL/well で添加し、IN Cell Analyzer 2200 を用いて、EGFP 蛍光強度を測定することで、SIRT1 プロモーター活性を、またHoechst33342 蛍光を認識することで細胞数を調べた。画像は、IN Cell Investigator High-content image analysis software (GE Healthcare)で解析した。プロトコルは「HaCaT-eGFP 20190627」を使用した。

【0073】

第2項 RT-qPCR を用いた内在性長寿遺伝子に対する効果
スクリーニングの結果選出された SIRT1 活性増強を持つサンプルと新規に調製したサンプルを用いて、次に HaCaT 細胞の長寿遺伝子の解析を RT-qPCR で行った。

【0074】

(1)High Pure RNA Isolation Kit を使用した total RNA の調製
High Pure RNA Isolation Kit（Roche, Basel, Switzerland）を使用し、製品のプロトコルに従って total RNA の調製を行った。Caco-2 細胞を終濃度が 1.0×105 cells/mL となるように 24-well plate に播種した。24 時間後、ツバメの巣サンプルを各濃度 1μL/well となるように添加した。HaCaT 細胞を終濃度が 6.0×10⁴ cells/mL となるように 5mL ディッシュ に播種し、24 時間培養後、培地を 2.5ｍL/well 除去した後にサンプルを添加した。Caco-2 細胞培養液を 2.5mL/well 添加し、37℃、5％CO2存在下で 48 時間培養した。48 時間後、培地を完全に除去し、1×PBS を 2 mL 加えて洗浄した。その後、1×PBS 200 μL と High Pure RNA Isolation Kit の Lysis-binding Buffer 400 μL を添加し、粘性がなくなるまで、4 分間プレートを傾けながらディッシュ全体に行き渡らせた。チップの裏でディッシュの底を擦り、細胞溶解液を 1.5 mL チューブへ回収した。回収した細胞溶解液はボルテックスミキサーで 50 秒間よく懸濁した。Kit の High Pure フィルターチューブとコレクションチューブを組み立て、細胞溶解液全量をフィルターチューブに加えた。10,000 rpm で 15 秒間遠心分離し、回収用チューブに排出された溶液を捨て、フィルターチューブとコレクションチューブを再び組み立てた。1.5 mL チューブに、1 サンプル当たり 90 μL の DNase Incubation Buffer と DNase I 10 μL をサンプル数＋1 本分加えて混合し、この混合液を先ほどのフィルターチューブに 100 μL ずつ添加し、室温で 15 分間静置した。15 分後、Kit の Wash Buffer I 500 μL をフィルターチューブに添加し、10,000 rpm で 15 秒間遠心分離した。コレクションチューブの溶液を捨てて再度フィルターチューブとコレクションチューブを組み立て、Wash Buffer II 500 μL をフィルターチューブに添加し、10,000 rpm で 15 秒間遠心分離した。コレクションチューブの溶液を捨てフィルターチューブとコレクションチューブを組み立て、Wash Buffer II 200 μL をフィルターチューブに添加し、14,000 rpm で 2 分間遠心分離した。遠心後、フィルターチューブを新しい滅菌済み 1.5 mL チューブにセットし、Elusion Buffer 100 μL をフィルターチューブの中心に添加し、室温で 3 分間静置した。静置後 10,000 rpm で 1 分間遠心分離し totalRNA を溶出した。溶液中の total RNA 濃度を、Nano Drop 2000（Thermo Fisher SCIENTIFIC, Waltham, USA）を用いて測定した。

【0075】

(2) RT-qPCR
0.2 mL チューブに Nuclease-Free Water を用いて各 RNA を 6.25 ng/ μL になるよう希釈調製し、これをさらに 10 倍希釈したものをそれぞれ準備した。また、0.2 mL チューブに SIRT1、SIRT3のプライマーを 2 μM に希釈した。さらにサンプル数と遺伝子数を考慮し、Go Taq qPCR Master Mix と Go Script RT Mix と Nuclease-Free Water を 25：1：4 で 1.5 mL チューブに懸濁したものをプレミックスとした。PCR 用 96 well plate をアイスプレートにセットして、全 well にプレミックスを 12 μL、プライマーの F と R をそれぞれ 2 μL、希釈した RNA をそれぞれ 4 μL 入れ、シールを貼った。プレート用遠心機で 10 秒遠心し、PCR にセットし測定した。各プライマーの配列は Table 1 に示した。

【0076】

【表1】

【0077】

第4節 RT-qPCR を用いた腸管由来エクソソームを介した表皮角化細胞に対する効果
第1項 エクソソーム精製
（1）エクソソーム精製における細胞培養とツバメの巣サンプル処理
Caco-2 細胞を 10 mL dish に 1.4×106 cells/dish となるように播種した。播種後の培養は、Exosome-depleted FBS Media Supplement Heat Inactivated (System Biosciences, Mountain View, CA, USA)を 10%含有する DMEM 培地で行った。24 時間後に調製したツバメの巣サンプルを各濃度 10 μL /well となるように添加し、その 24 時間後に培養上清を回収し、以下の方法で Caco-2 細胞が分泌するエクソソームを精製した。

【0078】

（2）ホスファチジルセリンアフィニティ法によるエクソソームの精製
回収した培養上清 10 mL を 300× g で 5 分間遠心分離を行うことにより、培養上清中の細胞の除去を行った。上清を別のチューブに移し、次に 1,200 × g で 20 分間遠心分離し、細胞断片の除去を行った。上清を別のチューブに移し、 10,000 × g で 30 分間遠心分離を行うことで、エクソソームより大きい細胞外小胞の除去を行った。細胞や大きいサイズの細胞外小胞を取り除いた培養上清は、分画分子量 100,000 のフィルターの遠心式限外濾過ユニット（AmiconUltra15 100K, Merck Millipore によりおよそ 40 倍に濃縮した。濃縮した培養上清からのエクソソーム精製は、MagCapture Exosome Isolation PS Kit Ver.2（富士フィルム和光）を用いた。まず、バッファーを作製した。15 mL チューブに 0.55 mL の Exosome Immobilizing/Washing Buffer（10×）と4.95 mLの精製水を添加し、さらにExosome Binding Enhancer（500×）を 11 μL 添加して Exosome Immobilizing/Washing buffer （1×）を調製した。1.5 mL チューブに、15 μL の Exosome Elution Buffer（10×）と 135 μL の精製水を添加し、Exosome Elution Buffer（1×）を調製した。次に、Exosome Capture 固定化ビーズを作製した。ボルテックスミキサーでよく攪拌させた Biotin Capture Magnetic Beads 60 μL を 1.5 mL Reaction Tube にうつし、Exosome Immobilizing/Washing buffer（1×）500 μL を添加し、ボルテックスミキサーにより懸濁した。チューブをスピンダウンし、磁気スタンドにセットして 1 分間静置した。次に Exosome Immobilizing/Washing buffer（1×）500 μL と Biotin-labeled Exosome Capture 10 μL をチューブに添加し、磁気スタンドから取り外してボルテックスミキサーにより懸濁し、室温で、回転式攪拌機により転倒混和しながら 10 分間反応させた。チューブをスピンダウンし、再び磁気スタンドにセットして約 1 分間静置した。磁気ビーズが完全にチューブ壁に付着したら、上清をピペットで除いた。（ア）このチューブに Exosome Immobilizing/Washing buffer（1×）500 μL を添加し、磁気スタンドから取り外してボルテックスミキサーにより懸濁し、チューブをスピンダウンしたのち、再び磁気スタンドにセットして 1 分間静置した。磁気ビーズが完全にチューブ壁に付着したら、上清をピペットで除いた。（ア）の操作をあと 1 回繰り返した。以上の操作により、Exosome Capture 固定化ビーズを完成させた。次に、Exosome Capture 固定化ビーズと、上記のとおり濃縮させた培養上清とを反応させる処理を行った。40 倍に濃縮させた培養上清約 500 μL を滅菌済み 1.5 mL チューブに移し、細胞上清に対して 1/500 容量の Exosome Binding Enhancer（500×）を添加し、ボルテックスミキサーで混合した。このチューブをスピンダウンし、サンプルを Exosome Capture 固定化ビーズの入ったチューブ（Reaction Tube）に移し、ボルテックスミキサーにより混合させた。室温で回転式攪拌機により転倒混和しながら、1 時間以上反応させた。1.5 mL Reaction Tube をスピンダウンした後、磁気スタンドにセットし、約 1 分間静置した。磁気ビーズが完全にチューブ壁に付着したら、上清をピペットで除き、エクソソームが結合したビーズとした。次に、エクソソーム結合ビーズの洗浄を行った。（イ）エクソソーム結合ビーズの入った 1.5 mL Reaction Tube に Exosome Binding Enhancer の入ったWashing Buffer 1 mL を添加し、ボルテックスミキサーにより懸濁し、1.5 mL Reaction Tube をスピンダウンして磁気スタンドにセットし、約 1 分間静置して磁気ビーズが完全にチューブ壁に付着したら、上清を除いた。（イ）の操作をさらに 2 回繰り返した。この操作により、洗浄済みエクソソーム結合ビーズとした。エクソソームの溶出は以下のように行った。洗浄済みエクソソーム結合ビーズが入った 1.5 mL Reaction Tube に Exosome Elution Buffer（1×）50 μL を添加し、磁気スタンドから取り出してボルテックスミキサーにより懸濁した。チューブをスピンダウンし、磁気スタンドにセットし、1 分間静置後、磁気ビーズが完全にチューブ壁に付着したら、上清を新しい滅菌済み 1.5 mL チューブに回収した。1.5mL Reaction Tube に残っている磁気ビーズに Exosome Elution Buffer（1×）をさらに 50 μL 添加し、磁気スタンドから取り出してボルテックスミキサーにより懸濁した。スピンダウンし、磁気スタンドにセットし、1 分間静置した。磁気ビーズが完全にチューブ壁に付着したら、上清を新しい滅菌済み 1.5 mL チューブ（上記のもの）に回収し、計 100 μL のエクソソーム溶液とした。

【0079】

（3）エクソソーム量の定量（BCA 法）
BCA 法でタンパク質濃度を測定することによりエクソソーム量を定量した。BCA 法によるタンパク質濃度の測定には、Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) を使用した。エクソソーム溶液は、100 μL のうち 30 μL を用いて 10 倍希釈したものを測定に用いた。標準曲線のスタンダードには、BSAを 0～200 μg/mL になるように PBS で段階希釈した液を使用した。96-well プレート（Thermo Fisher Scientific）の 2 well を 1 検定分として、スタンダード、サンプルの順で各穴 150 μL ずつ添加した。次に、Micro BCA Protein Assay Kitに含まれる Micro Reagent A, Micro Reagent B, Micro Reagent C を 25 : 24 : 1 の割合で混合させたものを、全ての穴に 150 μL ずつ加えた。37℃で 2 時間、遮光反応させ、吸光光度計（Sunrise, TECAN）を用いて、595 nm の吸光度をもとに測定を行った。測定で得られた標準曲線を基に定量を行い、タンパク質濃度を決定した。

【0080】

第2項 長寿遺伝子に対する効果
（1）High Pure RNA Isolation Kit を使用した total RNA の調製
HaCaT 細胞を終濃度が 3.0×10⁴ cells/mL となるように 5mL ディッシュ に播種し、24 時間培養後、第 4 節で精製したエクソソームを 1 μg/well 添加し、37℃、5％CO2存在下で 48 時間培養した。48 時間後、培地を完全に除去し、1×PBS を2 mL 加えて洗浄した。1×PBS 200 μL と High Pure RNA Isolation Kit の Lysisbinding Buffer 400 μL を添加し、粘性がなくなるまで、4 分間プレートを傾けながらディッシュ全体に行き渡らせた。チップの裏でディッシュの底を擦り、細胞溶解液を 1.5 mL チューブへ回収した。回収した細胞溶解液はボルテックスミキサーで 50 秒間よく懸濁した。Kit の High Pure フィルターチューブとコレクションチューブを組み立て、細胞溶解液全量をフィルターチューブに加えた。10,000 rpm で 15 秒間遠心分離し、回収用チューブに排出された溶液を捨て、フィルターチューブとコレクションチューブを再び組み立てた。1.5 mL チューブに、1 サンプル当たり 90 μL の DNase Incubation Buffer と DNase I 10 μL をサンプル数＋1 本分加えて混合し、この混合液を先ほどのフィルターチューブに 100 μL ずつ添加し、室温で 15 分間静置した。15 分後、Kit の Wash Buffer I 500 μL をフィルターチューブに添加し、10,000 rpm で 15 秒間遠心分離した。コレクションチューブの溶液を捨てて再度フィルターチューブとコレクションチューブを組み立て、Wash Buffer II 500 μL をフィルターチューブに添加し、10,000 rpm で 15 秒間遠心分離した。コレクションチューブの溶液を捨てフィルターチューブとコレクションチューブを組み立て、Wash Buffer II 200 μL をフィルターチューブに添加し、14,000 rpm で 2 分間遠心分離した。遠心後、フィルターチューブを新しい滅菌済み 1.5 mL チューブにセットし、Elusion Buffer 100 μL をフィルターチューブの中心に添加し、室温で 3 分間静置した。静置後 10,000 rpm で 1 分間遠心分離し totalRNA を溶出した。溶液中の total RNA 濃度を、Nano Drop 2000（Thermo Fisher SCIENTIFIC）を用いて測定した。

【0081】

（2）RT-qPCR
第3節第1項（2）と同様の手順で行った。各プライマーの配列は Table 1に示した。

【0082】

第3項 外的バリア関連遺伝子に対する効果
（1）High Pure RNA Isolation Kit を使用した total RNA の調製
第4節第2項（1）と同様の手順で行った。
（2）RT-qPCR
第3節第1項（2）と同様の手順で行った。各プライマーの配列は Table 1 に示した。

【0083】

第5項 ミトコンドリアに対する効果
（1）ミトコンドリア染色溶液
10％FBS を含む DMEM 培地を用いて、Mito TrackerRed CMXos を終濃度 0.25 μM に、Mito TrackerGreen FM を終濃度 0.2 μM に調製した。
（2）核染色溶液
第3節第1項（2）と同様の手順で核染色溶液を作成した。

【0084】

エクソソーム添加実験
ツバメの巣溶液処理をした Caco-2 細胞由来のエクソソームの HaCaT 細胞におけるミトコンドリアへ及ぼす効果を検証した。HaCaT 細胞が終濃度 6.0×10⁴ cells/mL となるように 96-well black plate に播種し、10％FBS を含む DMEM 培地にて 37 ℃、5 ％CO₂存在下で培養した。24 時間後、エクソソームは 90 ng/wellとなるよう添加した。またコントロールとして 1 ×PBS を 0.1 μL/well 添加し、37 ℃、5 ％CO₂存在下で培養した。48 時間後、細胞培養液を除去し、ミトコンドリア染色溶液を 100 μL/well で添加し、37 ℃で 15 分 間インキュベートした。ミトコンドリア染色溶液を除去した後、核染色溶液を 100 μL/well で添加し、遮光下室温にて 30 分間静置した。核染色溶液を除去し、1×PBS を 150 μL/well で添加し、IN Cell Analyzer 2200 を用いて、ミトコンドリアの活性を測定した。

【0085】

第6項 ROS 消去能の効果試薬の調製
(1)HBSS
Hanks’ Balanced Salts(SIGMA) 9.7 g と NaHCO₃ (富士フィルム和光純薬) 0.35 g を 900 ｍL の超純水に入れ、スターラーで攪拌させた。粉末が完全に溶けたら、pH 7.0 (±0.1~0.3)に調整し、メスアップして 1 L にした。そして、0.22 μm フィルター滅菌（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）を行った後遮光をし、4 ℃で保存した。
(2)BES-H₂O₂-Ac
BES-H₂O₂-Ac 1 mg をエタノール 750 μL に溶かし、遮光した後 4℃で保存した。使用時には適宜、10 mM HEPES (pH 7.4)で 500 倍に希釈した。
(3)核染色溶液
第3節第1項と同様の手順で核染色溶液を作成した。

【0086】

エクソソーム添加実験
10 mL ディッシュにサブコンフルエント状態の HaCaT 細胞を UV クロスリンカー(CL-1000 Ultraviolet Crosslinker, UVP, Upland, CA,USA) 内でディッシュのフタを外した状態で UV-B10 mJ/cm² 照射した。1×PBS により洗浄した後、トリプシンで細胞を剥がし、96-well plate に 1.2×10⁵ cells/mL になるように播種した。細胞が接着し始めたことを確認し、4 時間培養後、ツバメの巣抽出液処理をしたCaco-2 細胞由来エクソソームを 90 ng/well となるように添加した。なお、コントロールは 1×PBS とした。37 ℃、5 ％CO₂存在下で 24 時間培養した。その後、IN Cell Analyzer 2200 で BES 染色により細胞内活性酸素消去能及び細胞数を測定した。培養後の上清をすべて取り除き、HBSS で 1 回洗浄した後、10 mM HEPESで 400 倍希釈した BES-H₂O₂-Ac と 500 倍希釈した Hoechst 33342 solution を 100 μL/well 添加し、37 ℃遮光下で 30 分間インキュベートした。30 分後、染色液を除き、HBSS で 1 回洗った後、100 μL/well HBSS を添加して IN Cell Analyzer 2200 にて測定した。画像は、IN Cell Investigator High-content image analysis software (GE Healthcare)で解析した。プロトコルは「HaCaT-eGFP 20190627」を使用し、GFP の蛍光量を測定することで細胞内の活性酸素消去能を調べた。

【0087】

第5節 真皮線維芽細胞に対する効果（エクソソーム実験）
第1項 エクソソーム精製
（1）エクソソーム精製における細胞培養とツバメの巣サンプル処理
第4節第1項（1）と同様の手順で行った。
（2）ホスファチジルセリンアフィニティ法によるエクソソームの精製
第4節第1項（2）と同様の手順で行った。
（3）エクソソーム量の定量（BCA 法）
第4節第1項（3）と同様の手順で行った。

【0088】

第2項 長寿遺伝子に対する効果
（1）High Pure RNA Isolation Kit を使用した total RNA の調製
第4節第2項（1）と同様の手順で行った。
（2）RT-qPCR
第3節第1項（2）と同様の手順で行った。各プライマーの配列は Table 1に示した。

【0089】

第3項 シワ関連遺伝子に対する効果
（1）High Pure RNA Isolation Kit を使用した total RNA の調製
第 4 節 第 2 項（1）と同様の手順で行った。
（2) RT-qPCR
第3節第1項（2）と同様の手順で行った。各プライマーの配列は Table 1に示した（図２１）。

【0090】

第6節 マイクロアレイ解析
第10節第1項にてホスファチジルセリンアフィニティ法により精製したエクソソーム溶液をマイクロアレイ解析に用いた。マイクロアレイ実験は鎌倉テクノサイエンス（Kanagawa, Japan）に委託した。得られたデータをもとに、コントロールと比較した際のratioが2.0 以上かつ、2 サンプルのシグナル値のいずれかが 100 を超えているものを転写量が変動していた miRNA として抽出した。以上の方法で選抜した miRNA についてTargetScan Human 8.0（http://www.targetscan.org/vert_80/）を用いて、ターゲット遺伝子の探索を行い、それぞれの遺伝子の機能はWEB上の解析ソフトDAVID（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）により推測した。

【0091】

第7節 統計処理
統計処理は Student’s t-test, Tukey-Krammer 法 (Statcel 4) により行い、p<0.05 をもって有意差ありとした。

【0092】

第3章 結果
第１節 腸管を介した皮膚長寿遺伝子活性化の検証
第1項 SIRT1 プロモーターへの効果
Caco-2細胞にサンプルを添加し、その上清を添加したHaCaT細胞を48時間培養後、IN Cell Analyzer 2200 で HaCaT(SIRT1p-EGFP)細胞における EGFP 蛍光強度の変化を測定した。その結果、G150、G450、G1500 において SIRT1 プロモーターEGFP の蛍光値に増加傾向が見られたため、これらを SIRT1 プロモーター活性化サンプルとして選抜した(図６)。

【0093】

第2項 RT-qPCRを用いた内在性長寿遺伝子に対する効果
Caco-2細胞に第1節第1項で選抜したサンプルと新規に調製したサンプルを添加し、その上清を添加した HaCaT 細胞を 48 時間培養後の SIRT1、SIRT3の mRNA 発現量を RT-qPCR により測定した。その結果、SIRT1 においては L1500、L4500、SIRT3 においては L4500が有意に発現増強した。これらの結果から、L1500、L4500 を長寿遺伝子活性化サンプルとして選抜した（図７）。

【0094】

第2節 RT-qPCRを用いた腸管由来エクソソームを介した表皮角化細胞に対する効果
第1項 長寿遺伝子に対する効果
第1節で選抜したツバメの巣抽出液で処理をした Caco-2 細胞由来エクソソームを HaCaT 細胞に添加し、48 時間培養後の SIRT1、SIRT3の mRNA 発現量を RT-qPCR により測定した。その結果、SIRT1、SIRT3 で発現増強傾向が確認された（図８）。

【0095】

第2項 外的バリア関連遺伝子に対する効果
第1節で選抜したツバメの巣抽出液で処理をした Caco-2 細胞由来エクソソームを HaCaT 細胞に添加し、48 時間培養後の外的バリア関連遺伝子の mRNA 発現量をRT-qPCRにより測定した。その結果、少なくともFilaggrin、Involucrin、TGM1ではL4500、LOR では L1500 の発現量が有意に増強された。（図９）。

【0096】

第4項 ミトコンドリアに対する効果
第1節で選抜したツバメの巣抽出液で処理をした Caco-2 細胞由来エクソソームを HaCaT 細胞に添加し、48 時間培養後 MitoTracker Green と MitoTracker Red で染色し、IN Cell Analyzer 2200 によりミトコンドリアの活性を測定した。その結果、L1500、L4500 ともに蛍光強度が増強されたことが確認された（図１０）。

【0097】

第5項 ROS消去能の効果
第1節で選抜したツバメの巣抽出液で処理をした Caco-2 細胞由来エクソソームを 10 mJ/cm²の UVB を照射した HaCaT 細胞に添加し、24 時間培養後、IN Cell Analyzer 2200 で HaCaT 細胞における BES 蛍光強度の変化を測定した。その結果、L4500 は UVB 照射をしたコントロールと比較し、有意に蛍光強度を低減させたことが確認された（図１１）。

【0098】

第3節 RT-qPCR を用いた腸管由来エクソソームを介した真皮線維芽細胞に対する効果
第1項 長寿遺伝子に対する効果
第1節で選抜したツバメの巣抽出液で処理をした Caco-2 細胞由来エクソソームをヒト皮膚線維芽細胞（Skin Fibroblast）に添加して48 時間後の SIRT1、SIRT3の mRNA 発現量を RT-qPCR により測定した。その結果、SIRT1、SIRT3において発現量が増加したことが確認された（図１２）。