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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025010203
(43)【公開日】2025-01-20
(54)【発明の名称】ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦ－Βを標的とする二機能性分子
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20250109BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250109BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250109BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250109BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250109BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250109BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250109BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20250109BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250109BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250109BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20250109BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20250109BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20250109BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20250109BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K16/00 ZNA
C12N15/62 P
C12N15/13
C12N15/12
C07K14/705
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/00 C
C12P21/00 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61P37/04
A61K39/395 N
A61K39/395 U
A61K47/55
A61K47/62
A61K47/68
A61K38/17
C07K16/00
C07K19/00 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】36
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024187749
(22)【出願日】2024-10-24
(62)【分割の表示】P 2023505901の分割
【原出願日】2021-07-27
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/105286
(32)【優先日】2020-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/098476
(32)【優先日】2021-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】521543336
【氏名又は名称】レプ バイオファーマ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ゴン ウェンツ
(72)【発明者】
【氏名】トウ イーウェイ
(57)【要約】
【課題】ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦ－Βを標的とする二機能性分子の提供。
【解決手段】ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキングにおいて優れた活性を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。ヒトＴＧＦ－β受容体２型の細胞外ドメインに融合した抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片を含む多機能性分子も提供される。本開示は、いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１タンパク質およびＴＧＦ－βの両方を標的とする二機能性分子を提供する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体から構成される開示されたＰＤ－Ｌ１標的化ユニットは、ＴＧＦ－βのトラップとして機能するヒト形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）受容体ＩＩの細胞外ドメインに融合される。実験データは、これらの新しい二機能性分子が、臨床開発における現在のリード候補であるＭ７８２４よりも有効であることを示している。
【選択図】なし
【解決手段】ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキングにおいて優れた活性を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。ヒトＴＧＦ－β受容体２型の細胞外ドメインに融合した抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片を含む多機能性分子も提供される。本開示は、いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１タンパク質およびＴＧＦ－βの両方を標的とする二機能性分子を提供する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体から構成される開示されたＰＤ－Ｌ１標的化ユニットは、ＴＧＦ－βのトラップとして機能するヒト形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）受容体ＩＩの細胞外ドメインに融合される。実験データは、これらの新しい二機能性分子が、臨床開発における現在のリード候補であるＭ７８２４よりも有効であることを示している。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）抗体またはその抗原結合断片およびヒトＴＧＦ－βＲＩＩ（ＴＧＦ－β受容体２型）の細胞外ドメインを含む多機能性分子であって、
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片が、前記ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する特異性を有し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含み、
前記ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片に融合されている、多機能性分子。
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片が、前記ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する特異性を有し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含み、
前記ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片に融合されている、多機能性分子。
【請求項2】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片が、前記ＶＨを含む重鎖と、前記ＶＬを含む別個の軽鎖とを含む、請求項１に記載の多機能性分子。
【請求項3】
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片の前記重鎖に融合されている、請求項２に記載の多機能性分子。
【請求項4】
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片の前記重鎖のＣ末端に融合されている、請求項３に記載の多機能性分子。
【請求項5】
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、ペプチドリンカーを介して前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片の前記重鎖に融合されている、請求項３または４に記載の多機能性分子。
【請求項6】
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号７２を含み、配列番号７１のアミノ酸残基２４～４８の少なくとも部分的な欠失を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
【請求項7】
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号６１および７３～７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号７４について、Ｘが、Ｋ、ＳまたはＮを除く任意のアミノ酸である、請求項１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
【請求項8】
配列番号７２と前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片との間に少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
【請求項9】
配列番号７２と前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片との間にアルファヘリックスモチーフを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
【請求項10】
前記ＶＨが、配列番号３１～３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３８～４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の多機能性分子。
【請求項11】
前記ＶＨが配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の多機能性分子。
【請求項12】
前記ＶＬおよび軽鎖定常領域を含む軽鎖、ならびに前記ＶＨ、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、および前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインを含む重鎖を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の多機能性分子。
【請求項13】
前記重鎖定常領域が、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の多機能性分子。
【請求項14】
ヒトＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）タンパク質に対する特異性を有し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項15】
前記ＶＨが、配列番号３１～３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３８～４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項16】
前記ＶＨが配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項17】
ペプチドリンカーを介して配列番号７２のアミノ酸配列のＮ末端に融合した抗体またはその抗原結合断片を含む、多機能性分子。
【請求項18】
前記ペプチドリンカーは、柔軟性リンカーおよび／またはＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰ（配列番号８９）の置換ペプチドを含み、前記置換ペプチドは配列番号８９とは異なる、請求項１７に記載の多機能性分子。
【請求項19】
前記置換ペプチドが、ＩＰＰＨＶＱＸＸＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＸＧＡＶＫＦＰ（配列番号８８）のアミノ酸配列を含み、Ｘが、Ｋ、Ｓ、またはＮを除く任意のアミノ酸である、請求項１８に記載の多機能性分子。
【請求項20】
前記置換ペプチドが、配列番号８８と少なくとも５０％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の多機能性分子。
【請求項21】
前記置換ペプチドが、ＴＡＧＨＴＱＴＳＴＧＧＧＡＩＴＴＧＴＳＧＡＧＨＧＰ（配列番号８７）のアミノ酸配列、または配列番号８７と少なくとも７５％の配列同一性を有するバリアントを含み、前記バリアントが、少なくとも４つのＧを含み、ＰＰジペプチドを含まず、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、ＹおよびＰからなる群から選択される３個以下の疎水性アミノ酸残基を含む、請求項１８に記載の多機能性分子。
【請求項22】
前記バリアントが、少なくとも５つのＧと、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、ＹおよびＰからなる群から選択される１個以下の疎水性アミノ酸残基とを含む、請求項２１に記載の多機能性分子。
【請求項23】
前記柔軟性リンカーが、Ｓおよび少なくとも５０％のＧを含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の多機能性分子。
【請求項24】
前記柔軟性リンカーが、１またはそれを超えるＧＧＧＧＳ（配列番号８６）単位を含む、請求項２３に記載の多機能性分子。
【請求項25】
前記抗体またはその抗原結合断片のＣ末端が、配列番号７２のアミノ酸配列のＮ末端から少なくとも２０個のアミノ酸残基である、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の多機能性分子。
【請求項26】
ＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号９０）の配列全体を少なくとも含まない、請求項１７～２５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
【請求項27】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４－１ＢＢ、ＴＩＭ ３、ＯＸ－４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ４７およびＣＤ７３からなる群より選択される抗原に特異的である、請求項１７～２６のいずれか一項に記載の多機能性分子。
【請求項28】
前記抗体またはその抗原結合断片がＦｃ断片を含む、請求項１７～２７のいずれか一項に記載の多機能性分子。
【請求項29】
前記ペプチドリンカーが、前記Ｆｃ断片のＣ末端に融合されている、請求項２８に記載の多機能性分子。
【請求項30】
請求項１～１３および１７～２９のいずれか一項に記載の多機能性分子または請求項１４～１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片をコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項31】
請求項１～１３および１７～２９のいずれか一項に記載の多機能性分子または請求項１４～１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片をコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチド。
【請求項32】
請求項１～１３および１７～２９のいずれか一項に記載の多機能性分子または請求項１４～１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片と、薬学的に適切な担体とを含む組成物。
【請求項33】
がんを処置するための医薬品を製造するための、請求項１～１３および１７～２９のいずれか一項に記載の多機能性分子または請求項１４～１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片の使用。
【請求項34】
がんの処置を必要とする患者においてがんを処置するための組成物であって、有効量の請求項１～１３および１７～２９のいずれか一項に記載の多機能性分子または請求項１４～１６のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片を含む、組成物。
【請求項35】
前記がんが固形腫瘍である、請求項３３に記載の使用または請求項３４に記載の組成物。
【請求項36】
前記がんが、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、胃腸がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がん、黒色腫、前立腺がんおよび甲状腺がんからなる群から選択される、請求項３３もしくは３５に記載の使用または請求項３４もしくは３５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
背景
近年のがん免疫療法におけるエキサイティングな進歩は、腫瘍学におけるパラダイムの転換をもたらした。最も注目すべき結果は、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）、遺伝子操作されたＴ細胞および二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を含むＴ細胞ベースの治療であった。Ｔ細胞は、優れた特異性および長期記憶を有する免疫監視および腫瘍根絶の主要なクラスを表す。しかしながら、腫瘍微小環境では、Ｔ細胞は疲弊するかまたは腫瘍細胞に寛容になり得る。Ｔ細胞疲弊は、プログラム死受容体－１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン－３（ＴＩＭ－３）、ＩＬ－１０受容体、およびキラー免疫グロブリン受容体を含む阻害性受容体の過剰発現に一般的に関連する。
近年のがん免疫療法におけるエキサイティングな進歩は、腫瘍学におけるパラダイムの転換をもたらした。最も注目すべき結果は、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）、遺伝子操作されたＴ細胞および二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を含むＴ細胞ベースの治療であった。Ｔ細胞は、優れた特異性および長期記憶を有する免疫監視および腫瘍根絶の主要なクラスを表す。しかしながら、腫瘍微小環境では、Ｔ細胞は疲弊するかまたは腫瘍細胞に寛容になり得る。Ｔ細胞疲弊は、プログラム死受容体－１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン－３（ＴＩＭ－３）、ＩＬ－１０受容体、およびキラー免疫グロブリン受容体を含む阻害性受容体の過剰発現に一般的に関連する。
【背景技術】
【0002】
これらのチェックポイント分子に対抗するためのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に基づく治療は、腫瘍浸潤Ｔ細胞を抑制するブレーキを取り除くことができ、それによって異なる悪性腫瘍において有意な臨床的利益を達成する。例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングすることにより、免疫正常化を強化し、抗がん応答を強化することができる。しかしながら、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断の顕著な欠乏は、同様の腫瘍特性を有する均一な試験集団にわたって一貫性がない。また、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断処置はまた、一部の患者において特定の炎症性副作用を引き起こし得る。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断による単独療法の限界および有望な代替物の欠如により、抗腫瘍免疫を活性化し、処置有効性を高めることができる併用処置方法を探求することが必要となっている。
【0003】
Ｍ７８２４（ビントラフスプ アルファ（ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｆａ））は、ヒト形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）受容体ＩＩの細胞外ドメインに融合したプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に対するモノクローナル抗体で構成される二機能性タンパク質であり、３つすべてのＴＧＦ－βアイソフォームに対する「トラップ」として機能する。ＰＤ－Ｌ１部分は、メルケル細胞癌および尿路上皮がんの処置に承認されているアベルマブに基づく。しかしながら、現在の臨床データは、Ｍ７８２４の使用が望ましくない皮膚成長に関連し、ＨＰＶ陽性悪性腫瘍を有する患者に対する第ＩＩ相試験において全奏効率がわずか約３５％～４０％であったことを示している。したがって、改善された治療が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
概要
本開示は、いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１タンパク質およびＴＧＦ－βの両方を標的とする二機能性分子を提供する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体から構成される開示されたＰＤ－Ｌ１標的化ユニットは、ＴＧＦ－βのトラップとして機能するヒト形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）受容体ＩＩの細胞外ドメインに融合される。実験データは、これらの新しい二機能性分子が、臨床開発における現在のリード候補であるＭ７８２４よりも有効であることを示している。
本開示は、いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１タンパク質およびＴＧＦ－βの両方を標的とする二機能性分子を提供する。抗ＰＤ－Ｌ１抗体から構成される開示されたＰＤ－Ｌ１標的化ユニットは、ＴＧＦ－βのトラップとして機能するヒト形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）受容体ＩＩの細胞外ドメインに融合される。実験データは、これらの新しい二機能性分子が、臨床開発における現在のリード候補であるＭ７８２４よりも有効であることを示している。
【0005】
したがって、本開示の一実施形態によれば、提供されるのは、抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）抗体またはその断片およびヒトＴＧＦ－βＲＩＩ（ＴＧＦ－β受容体２型）の細胞外ドメインを含む多機能性分子であって、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片が、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する特異性を有し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号７～１２または配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む、またはＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１９を含み、ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２０、９１または９２を含み、ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２１を含み、ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２４または９３を含み、ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号７２のアミノ酸配列を含み、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片に融合されている、多機能性分子である。
【0006】
一実施形態では、提供されるのは、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する特異性を有し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）抗体またはその断片であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号７～１２または配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含むか、またはＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１９を含み、ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２０、９１または９２を含み、ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２１、ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２４または９３を含む、抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）抗体またはその断片である。
【0007】
配列番号７２のアミノ酸配列のＮ末端にペプチドリンカーを介して融合された抗体またはその抗原結合断片を含む多機能性分子も提供され、ペプチドリンカーは、（ａ）少なくとも３０個のアミノ酸残基長であるか、または（ｂ）少なくとも２５個のアミノ酸残基長であり、アルファヘリックスモチーフを含む。
【0008】
本開示の分子のいずれかでがんを処置するための使用および方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
定義
「ａ（１つの、ある）」または「ａｎ（１つの、ある）」実体という用語は、１またはそれを超えるその実体を指すことに留意されたい。例えば、「１つの抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１またはそれを超える抗体を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１またはそれを超える」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。
「ａ（１つの、ある）」または「ａｎ（１つの、ある）」実体という用語は、１またはそれを超えるその実体を指すことに留意されたい。例えば、「１つの抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１またはそれを超える抗体を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１またはそれを超える」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。
【0033】
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体および任意の抗原結合断片またはその単鎖であり得る。したがって、「抗体」という用語は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。そのようなものの例としては、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域もしくはその任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも１つの部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【0034】
本明細書で使用される「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部である。構造にかかわらず、抗体断片は、インタクトな抗体によって認識される同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語は、アプタマー、シュピーゲルマー（spiegelmer）、およびダイアボディを含む。「抗体断片」という用語はまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する任意の合成または遺伝子操作されたタンパク質を含む。
【0035】
抗体という用語は、生化学的に区別することができる様々な広範なクラスのポリペプチドを包含する。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、その中にいくつかのサブクラスがあることを十分に理解する（例えば、γ１～γ４）。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５などは、十分に特徴付けられており、機能的特殊化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修飾バージョンは、本開示を考慮して当業者に容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスが明らかに本開示の範囲内であり、以下の議論は一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。４つの鎖は、典型的には、「Ｙ」配置でジスルフィド結合によって結合され、ここで、軽鎖が「Ｙ」の口から始まり可変領域を通って続く重鎖を支える。
【0036】
「特異的に結合する」または「特異性を有する」とは、一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間の何らかの相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、抗体は、その抗原結合ドメインを介して、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、そのエピトープに結合する場合、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、本明細書では、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対親和性を限定するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに対して高い特異性を有すると見なされ得るか、または抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対してそれが有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。
【0037】
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置および予防的または予防的手段の両方を指し、目的は、がんの進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であろうと検出不能であろうと、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状況、疾患進行の遅延または遅延、病状の改善または緩和、および寛解（部分的であろうと全体的であろうと）が含まれるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを意味し得る。処置を必要とする者には、既に状態もしくは障害を有する者、ならびに状態もしくは障害を有する傾向がある者、または状態もしくは障害を予防すべき者が含まれる。
【0038】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、飼育動物、農場動物および動物園動物、スポーツ動物またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛などが含まれる。
【0039】
本明細書で使用される場合、「処置を必要とする患者に」または「処置を必要とする対象」などの語句は、例えば検出のため、診断手順および／または処置のために使用される本開示の抗体または組成物の投与から利益を得るであろう対象、例えば哺乳動物対象を含む。
多機能性分子
多機能性分子
【0040】
添付の実験例において明らかにされるように、本発明者らは、抗ＰＤ－Ｌ１単位およびＴＧＦ－β標的化単位を含むいくつかの二機能性融合タンパク質を同定することができた。実施例１４に示されるように、例えば、試験された二機能性タンパク質、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳの両方が、ＭＣ３８マウスモデルにおいてＭ７８２４よりも大きい有効性を示した。Ｍ７８２４は、ＨＰＶ陽性悪性腫瘍を有する患者について現在第ＩＩ相臨床試験中のＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－β二重標的化融合タンパク質である。Ｍ７８２４の抗ＰＤ－Ｌ１単位は、主要なＰＤ－Ｌ１抗体であり、メルケル細胞癌および尿路上皮がんの処置に承認されているアベルマブに基づく。したがって、Ｍ７８２４と比較して、新たに開示された二機能性タンパク質の優れた性能は驚くべきことである。
【0041】
さらに、実施例１２に示すように、即座に開示される二機能性タンパク質は、より良好な種特異性を有する。同様にマウスおよびラットＰＤ－Ｌ１と反応するＭ７８２４とは異なり、新しい二機能性タンパク質は、その優れたＰＤ－Ｌ１結合活性に加えて、ヒトおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１のみに結合する。
【0042】
したがって、一実施形態では、本開示は、少なくとも抗ＰＤ－Ｌ１単位（unit）およびＴＧＦ－β標的化単位を有する多機能性分子を提供する。抗ＰＤ－Ｌ１単位（unite）は
、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体または断片を含むことができる。ＴＧＦ－β標的化ユニットは、好ましくは、ヒト形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩまたはＴＧＦＢＲ２）の細胞外ドメインである。
、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体または断片を含むことができる。ＴＧＦ－β標的化ユニットは、好ましくは、ヒト形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）受容体ＩＩ（ＴＧＦ－βＲＩＩまたはＴＧＦＢＲ２）の細胞外ドメインである。
【0043】
ＴＧＦ－βＲＩＩは、２つのアイソフォームを有する。アイソフォームＡ（ＮＰ＿００１０２００１８．１；配列番号７０）は、アイソフォームＢ（ＮＰ＿００３２３３．４；配列番号７１）よりも長い細胞外断片を有するが、それらは同じコア外部ドメイン（配列番号７２）を共有する。それらの配列を以下の表Ａに示す。
表Ａ ＴＧＦ－βＲＩＩに関連する配列（下線および太字：コア外部ドメイン、下線および斜体：アイソフォーム間の異なる残基、下線のみ：変異）
表Ａ ＴＧＦ－βＲＩＩに関連する配列（下線および太字：コア外部ドメイン、下線および斜体：アイソフォーム間の異なる残基、下線のみ：変異）
【表A-1】
【表A-2】
【0044】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインは、コア外部ドメイン（配列番号７２）ならびにいくつかの隣接残基を含む。例えば、実施例８～１６で試験したバリアント１（配列番号６１）は、Ｎ末端側にさらに２５個の残基を含み、Ｃ末端側に９個の残基を含む。別のバリアント、バリアント２（配列番号７３）は、９個のＣ末端隣接残基のみを含む。バリアント４～７（配列番号７５～７８）などの他のバリアントは、配列番号６１のＮ末端配列の一部を置き換える代替リンカーを含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインは、配列番号６１の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸を含まない。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインは、配列番号６１の最後の１、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸を含まない。
【0046】
さらに別のバリアントであるバリアント３は、バリアント１に基づくが、Ｎ末端部分内のＸ位置に少なくともアミノ酸置換を含む（配列番号８８）。これらのＸ位置は、潜在的なグリコシル化部位である。したがって、置換は、Ｋ、ＳおよびＮ以外のアミノ酸によるものである。置換の例は、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｉ、Ｌ、ＤまたはＥであるが、これらに限定されない。
【0047】
いくつかの実施形態では、ａｎｉ－ＰＤ－Ｌ１単位は、下記にさらに記載されるような抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片（an anti-PD-L1 antibodyof fragment thereof）から構成される。抗体または断片は、限定するものではないが、従来の完全なＩｇＧ形式、Ｆａｂ断片、単鎖断片、または単一ドメイン抗体などの任意の抗体形式をとることができる。抗体またはその断片が軽鎖および別個の重鎖を有する場合、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインは、軽鎖または重鎖のいずれかに融合され得る。抗体又はその断片が１本のタンパク質鎖（例えば、ｓｃＦｖ）上に軽鎖及び重鎖を有する場合、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインは、軽鎖又は重鎖のいずれかにより近接して融合され得る。
【0048】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインは、抗ＰＤ－Ｌ１単位の鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインは、抗ＰＤ－Ｌ１単位の鎖のＣ末端に融合される。好ましい実施形態では、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインは、必要に応じてペプチドリンカー（例えば、配列番号６０、または１つ、２つ、もしくは３つのＧＧＧＧＳ（配列番号８６）リピート）を介して、抗ＰＤ－Ｌ１単位の重鎖のＣ末端に融合される。
【0049】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１単位は、ＶＨ（重鎖可変領域）およびＶＬ（軽鎖可変領域）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域には、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ
ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３が含まれ、例えば、表１Ａ～表１Ｃに示されるものが含まれる。
ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３が含まれ、例えば、表１Ａ～表１Ｃに示されるものが含まれる。
【0050】
一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＳＤＹＡＷＮ（配列番号７）、ＹＩＩＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号８）、ＳＴＭＩＡＴＮＷＦＡＹ（配列番号９）、ＫＡＳＱＤＶＳＬＡＶＡ（配列番号１０）、ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１１）およびＱＱＨＹＩＴＰＷＴ（配列番号１２）の配列を含む。そのようなＶＨ配列の例は、配列番号２５（マウス）および２６～２８（ヒト化）に提供されている。そのようなＶＬ配列の例は、配列番号２９（マウス）および３０（ヒト化）に提供されている。例示的なヒト化抗体には、配列番号２６または２７または２８のＶＨおよび配列番号３０のＶＬを有するものが含まれる。
【0051】
一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれＤＦＷＶＳ（配列番号１３）、ＥＩＹＰＮＳＧＶＳＲＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１４）、ＹＦＧＹＴＹＷＦＧＹ（配列番号１５）、ＲＡＳＫＳＶＳＴＹＭＨ（配列番号１６）、ＳＡＳＨＬＥＳ（配列番号１７）およびＱＱＳＮＥＬＰＶＴ（配列番号１８）の配列を含む。そのようなＶＨ配列の例は、配列番号３１（マウス）および３２～３７（ヒト化）に提供されている。そのようなＶＬ配列の例は、配列番号３８（マウス）および３９～４３（ヒト化）に提供されている。例示的なヒト化抗体には、配列番号３４のＶＨおよび配列番号３９、４０もしくは４３のＶＬを有するもの、配列番号３５のＶＨおよび配列番号３９のＶＬを有するもの、または配列番号３７のＶＨおよび配列番号３９のＶＬを有するものが含まれる。一実施形態では、ヒト化抗体が、配列番号３４のＶＨおよび配列番号４３のＶＬを含む。
【0052】
一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２０）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＮＳＧＮＴ（配列番号２４）の配列を含む。あるいは、ＶＨ ＣＤＲ２は、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＡＶＫＧ（配列番号９１）またはＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＥＳＶＫＧ（配列番号９２）を含み得る。あるいは、ＶＬ ＣＤＲ３はＳＱＹＱＳＧＮＴ（配列番号９３）であり得る。
【0053】
一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２０）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＮＳＧＮＴ（配列番号２４）の配列を含む。一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＡＶＫＧ（配列番号９１）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＮＳＧＮＴ（配列番号２４）の配列を含む。一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＥＳＶＫＧ（配列番号９２）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＮＳＧＮＴ（配列番号２４）の配列を含む。
【0054】
一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２０）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＱＳＧＮＴ（配列番号９３）の配列を含む。一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＡＶＫＧ（配列番号９１）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＱＳＧＮＴ（配列番号９３）の配列を含む。一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＥＳＶＫＧ（配列番号９２）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＱＳＧＮＴ（配列番号９３）の配列を含む。
【0055】
そのようなＶＨ配列の例は、配列番号４４（マウス）および４５～４９（ヒト化）および５７～５８（ヒト化）に提供されている。そのようなＶＬ配列の例は、配列番号５０（マウス）および５１～５５（ヒト化）および５６（ヒト化）に提供されている。
【0056】
例示的なヒト化抗体には、配列番号４９のＶＨおよび配列番号５２もしくは５４のＶＬを有するもの、または配列番号４８のＶＨおよび配列番号５３もしくは５４のＶＬを有するものが含まれる。一実施形態では、ヒト化抗体が、配列番号４８のＶＨおよび配列番号５３のＶＬを含む。一実施形態では、ヒト化抗体が、配列番号４８のＶＨおよび配列番号５６のＶＬを含む。一実施形態では、ヒト化抗体が、配列番号５７のＶＨおよび配列番号５６のＶＬを含む。一実施形態では、ヒト化抗体が、配列番号５８のＶＨおよび配列番号５６のＶＬを含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）および／または軽鎖定常領域（例えば、ＣＬ）をさらに含む。例示的な重鎖定常領域が配列番号５９に提供され、例示的な軽鎖定常領域が配列番号６７に提供される（残基１０８～２１４）。
ＴＧＦ－βＲＩＩ ｘ抗体融合物
ＴＧＦ－βＲＩＩ ｘ抗体融合物
【0058】
異なる融合タンパク質設計（例えば、表１５）による試験は、ＴＧＦ－βＲＩＩのコア外部ドメイン（配列番号７２）のみが活性に必要であることを実証した。さらに、ＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインは、抗体に直接融合されるべきではない。ペプチドリンカーによって提供される十分な距離があるべきである。
【0059】
外部ドメインに関して、ペプチドリンカー（これは完全に人工リンカーであり得るか、または外部ドメインに対してＮ末端の細胞外断片の一部を含み得る、配列番号８９）は、最小長を有するべきである。距離が短すぎると、融合タンパク質の安定性または活性が低下する。最小長は、いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｅｎｔｓ）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０または２００個以下のアミノ酸残基である。
【0060】
柔軟性リンカー、例えば１またはそれを超えるＧ４Ｓ（配列番号８６）単位を含むことは、いくつかの実施形態では、多機能性分子の安定性および／または活性に有用であり得る。いくつかの実施形態では、柔軟性リンカーは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％または８０％のグリシンを含む。いくつかの実施形態では、柔軟性リンカーは、１またはそれを超えるセリンを含む。いくつかの実施形態では、柔軟性リンカーは、１、２、３、４、５または６つのＧ４Ｓ（配列番号８６）リピートを含む。
【0061】
（例えば、実施例１７）、いくつかの実施形態では、天然のＮ末端断片（ＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰ；配列番号８９）を置換ペプチドで置き換えて、屠殺することなく、または活性を改善しても安定性を高めることができることが示されている。いくつかの実施形態では、置換ペプチドは、配列番号８９とは異なるが、配列番号８９と少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する。
【0062】
例示的な置換ペプチドは、ＩＰＰＨＶＱＸＸＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＸＧＡＶＫＦＰ（配列番号８８）であり、Ｘは、Ｋ、Ｓ、またはＮを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、剛性ジペプチドＰＰを除去する、潜在的切断部位ＱＫ、Ｎおよび／またはＫを除去する、柔軟性を高めるための複数のグリシン残基を含む、および／または疎水性残基を減少させるための置換を行うことができる。そのような一例は、ＴＡＧＨＴＱＴＳＴＧＧＧＡＩＴＴＧＴＳＧＡＧＨＧＰ（配列番号８７）または配列番号８７と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも４つのＧを含み、ＰＰジペプチドを含まず、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、ＹおよびＰからなる群から選択される３個以下の疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも５つのＧおよび、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、ＹおよびＰからなる群より選択される１個以下の疎水性アミノ酸残基を含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片とＴＧＦ－βＲＩＩの外部ドメイン（配列番号７２）との間のペプチドリンカーは、柔軟性リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号８９の置換ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、柔軟性リンカーと置換ペプチドとの両方を含む。いくつかの実施形態では、柔軟性リンカーは、置換ペプチドのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、柔軟性リンカーは、置換ペプチドのＣ末端である。
【0064】
いくつかの実施形態では、多機能性分子は、少なくとも、ＥＥＹＮＴＳＮＰＤの配列全体（配列番号９０）を含まない。多機能性分子は、ＴＧＦ－βＲＩＩの細胞外ドメインから配列番号９０全体が除去されていてもよい。いくつかの実施形態では、多機能性分子は、ＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号９０）の１、２、３、４、５、６、７または８個を超えるアミノ酸残基を含まない。
【0065】
多機能性分子の抗体またはその抗原結合断片は、任意の抗原を標的とし得る。非限定的な例は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４－１ＢＢ、ＴＩＭ３、ＯＸ－４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ４７およびＣＤ７３である。それらはまた、本明細書中に開示されるような任意の抗体または断片であり得る。
【0066】
ＴＧＦ－βＲＩＩの外部ドメインは、抗体または断片の任意の部分に融合され得る。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、抗体または断片の重鎖または軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、外部ドメインは抗体または断片のＦｃ断片のＣ末端に融合される。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体および断片
抗ＰＤ－Ｌ１抗体および断片
【0067】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体および断片も提供され、多機能性分子、二重特異性抗体または多重特異性抗体における抗ＰＤ－Ｌ１単位として、または単一特異性抗体において単独で使用することができる。
【0068】
例示的なマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体ならびにそれらのヒト化抗体および改良抗体を調製し、添付の実験例で試験した。全てのマウス抗体（４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７、８９Ｃ１０Ｈ８）およびそれらの対応するヒト化バージョンは、優れた結合親和性、交差反応性およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合の阻害における有効性を示した。
【0069】
重要なことに、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）と比較した場合、ヒト化６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用の遮断においてＭＰＤＬ３２８０Ａよりも高い活性を示した（例えば、実施例１８を参照のこと）。また、興味深いことに、本開示の試験された抗体のすべてが、ＭＰＤＬ３２８０Ａよりも低い疎水性および低い粘度を示した。より高い疎水性は、タンパク質の溶解度を低下させることが知られている。同様に、高粘度はまた、高濃度タンパク質製剤開発の障害でもある。したがって、そのようなデータは、本発明の抗体が高濃度抗体製剤の調製により適していることを実証している。
【0070】
さらに、即時に開示される抗体の抗原結合断片を、ＴＧＦ－β標的化単位も含む二機能性融合タンパク質中の単位として含めた。得られた二機能性融合タンパク質は、ＭＣ３８マウスモデルにおいてＭ７８２４よりも高い有効性を示した。Ｍ７８２４は、ＨＰＶ陽性悪性腫瘍を有する患者について現在第ＩＩ相臨床試験中のＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－β二重標的化融合タンパク質である。Ｍ７８２４の抗ＰＤ－Ｌ１単位は、主要なＰＤ－Ｌ１抗体であり、メルケル細胞癌および尿路上皮がんの処置に承認されているアベルマブに基づく。したがって、これらのデータは、二機能性分子または多機能性分子を調製する際の即時に開示される抗体の独特の利点を実証する。
【0071】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または断片は、ＶＨ（重鎖可変領域）およびＶＬ（軽鎖可変領域）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域には、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３が含まれ、例えば、表１Ａ～表１Ｃに示されるものが含まれる。
【0072】
一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＳＤＹＡＷＮ（配列番号７）、ＹＩＩＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号８）、ＳＴＭＩＡＴＮＷＦＡＹ（配列番号９）、ＫＡＳＱＤＶＳＬＡＶＡ（配列番号１０）、ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号１１）およびＱＱＨＹＩＴＰＷＴ（配列番号１２）の配列を含む。そのようなＶＨ配列の例は、配列番号２５（マウス）および２６～２８（ヒト化）に提供されている。そのようなＶＬ配列の例は、配列番号２９（マウス）および３０（ヒト化）に提供されている。例示的なヒト化抗体には、配列番号２６または２７または２８のＶＨおよび配列番号３０のＶＬを有するものが含まれる。
【0073】
一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれＤＦＷＶＳ（配列番号１３）、ＥＩＹＰＮＳＧＶＳＲＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１４）、ＹＦＧＹＴＹＷＦＧＹ（配列番号１５）、ＲＡＳＫＳＶＳＴＹＭＨ（配列番号１６）、ＳＡＳＨＬＥＳ（配列番号１７）およびＱＱＳＮＥＬＰＶＴ（配列番号１８）の配列を含む。そのようなＶＨ配列の例は、配列番号３１（マウス）および３２～３７（ヒト化）に提供されている。そのようなＶＬ配列の例は、配列番号３８（マウス）および３９～４３（ヒト化）に提供されている。例示的なヒト化抗体には、配列番号３４のＶＨおよび配列番号３９、４０もしくは４３のＶＬを有するもの、配列番号３５のＶＨおよび配列番号３９のＶＬを有するもの、または配列番号３７のＶＨおよび配列番号３９のＶＬを有するものが含まれる。一実施形態では、ヒト化抗体が、配列番号３４のＶＨおよび配列番号４３のＶＬを含む。
【0074】
一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２０）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＮＳＧＮＴ（配列番号２４）の配列を含む。あるいは、ＶＨ ＣＤＲ２は、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＡＶＫＧ（配列番号９１）またはＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＥＳＶＫＧ（配列番号９２）を含むことができる。あるいは、ＶＬ ＣＤＲ３はＳＱＹＱＳＧＮＴ（配列番号９３）であり得る。
【0075】
一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２０）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＮＳＧＮＴ（配列番号２４）の配列を含む。一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＡＶＫＧ（配列番号９１）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＮＳＧＮＴ（配列番号２４）の配列を含む。一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＥＳＶＫＧ（配列番号９２）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＮＳＧＮＴ（配列番号２４）の配列を含む。
【0076】
一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２０）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＱＳＧＮＴ（配列番号９３）の配列を含む。一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＤＡＶＫＧ（配列番号９１）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＱＳＧＮＴ（配列番号９３）の配列を含む。一実施形態では、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、ＮＹＷＭＴ（配列番号１９）、ＳＩＴＮＴＧＳＳＴＦＹＰＥＳＶＫＧ（配列番号９２）、ＤＴＴＩＡＰＦＤＹ（配列番号２１）、ＫＡＳＱＮＬＮＥＹＬＮ（配列番号２２）、ＫＴＮＴＬＱＡ（配列番号２３）およびＳＱＹＱＳＧＮＴ（配列番号９３）の配列を含む。
【0077】
そのようなＶＨ配列の例は、配列番号４４（マウス）および４５～４９（ヒト化）および５７～５８（ヒト化）に提供されている。そのようなＶＬ配列の例は、配列番号５０（マウス）および５１～５５（ヒト化）および５６（ヒト化）に提供されている。
【0078】
例示的なヒト化抗体には、配列番号４９のＶＨおよび配列番号５２もしくは５４のＶＬを有するもの、または配列番号４８のＶＨおよび配列番号５３もしくは５４のＶＬを有するものが含まれる。一実施形態では、ヒト化抗体が、配列番号４８のＶＨおよび配列番号５３のＶＬを含む。一実施形態では、ヒト化抗体が、配列番号４８のＶＨおよび配列番号５６のＶＬを含む。一実施形態では、ヒト化抗体が、配列番号５７のＶＨおよび配列番号５６のＶＬを含む。一実施形態では、ヒト化抗体が、配列番号５８のＶＨおよび配列番号５６のＶＬを含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）および／または軽鎖定常領域（例えば、ＣＬ）をさらに含む。例示的な重鎖定常領域が配列番号５９に提供され、例示的な軽鎖定常領域が配列番号６７に提供される（残基１０８～２１４）。
【0080】
抗体の活性を保持することができ、またはそれらを改善することさえできるこれらのＣＤＲ配列の間で小さな変化（例えば、１つのアミノ酸の付加、欠失または置換）を設計することができると想定される。そのような修飾ＣＤＲ配列は、ＣＤＲバリアントと呼ばれる。本明細書に開示される抗体は、それらが由来する天然に存在する結合ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることも当業者によって理解される。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、類似していてもよく、例えば、出発配列と一定のパーセント同一性を有していてもよく、例えば、出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であってもよい。いくつかの実施形態では、修飾された抗体または断片は、指定されたＣＤＲ配列を保持する。
【0081】
一定の実施形態では、抗体は、抗体と通常関連しないアミノ酸配列または１もしくはそれを超える部分を含む。例示的な変形形態を以下により詳細に記載する。例えば、本開示の抗体は、柔軟性リンカー配列を含み得るか、または機能性部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または標識）を付加するように修飾され得る。
タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびタンパク質の調製方法
タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびタンパク質の調製方法
【0082】
本開示はまた、本開示の多機能性タンパク質、抗体、そのバリアントまたは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子上または別個のポリヌクレオチド分子上の抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域全体をコードし得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子上または別個のポリヌクレオチド分子上の抗原結合ポリペプチド、そのバリアントまたは誘導体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の一部をコードし得る。
【0083】
抗体を作製する方法は当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。一定の実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域と定常領域の両方が完全にヒトである。完全ヒト抗体は、当分野で記載され、本明細書に記載される技術を使用して作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。そのような抗体を作製するために使用され得る例示的な技術は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第６，１５０，５８４号、第６，４５８，５９２号、第６，４２０，１４０号に記載されている。
がん処置
がん処置
【0084】
本明細書に記載されるように、本開示の抗体、バリアントまたは誘導体は、特定の処置および診断方法において使用され得る。
【0085】
本開示はさらに、本明細書中に記載される１またはそれを超える障害または症状を処置するために本開示の多機能性分子または抗体を患者（例えば、動物、哺乳動物およびヒト）に投与することを伴う多機能性分子または抗体に基づく治療を対象とする。本開示の治療用化合物には、本開示の抗体（本明細書に記載のそのバリアントおよび誘導体を含む）および本開示の抗体をコードする核酸またはポリヌクレオチド（本明細書に記載のそのバリアントおよび誘導体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【0086】
本開示の抗体はまた、がんを処置または阻害するために使用され得る。ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍細胞において過剰発現され得る。腫瘍由来ＰＤ－Ｌ１は、免疫細胞上のＰＤ－１に結合することができ、それによって抗腫瘍Ｔ細胞免疫を制限する。マウス腫瘍モデルにおけるＰＤ－Ｌ１を標的化する小分子阻害剤またはモノクローナル抗体による結果は、標的化ＰＤ－Ｌ１治療が腫瘍成長の効果的な制御に対する重要な代替的かつ現実的なアプローチであることを示している。実験例で実証されているように、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は適応免疫応答機構を活性化し、これはがん患者の生存率の改善をもたらし得る。
【0087】
したがって、いくつかの実施形態では、それを必要とする患者のがんを処置する方法が提供される。この方法は、一実施形態では、有効量の本開示の多機能性分子または抗体を患者に投与することを伴う。いくつかの実施形態では、患者の少なくとも１つのがん細胞（例えば、間質細胞）は、ＰＤ－Ｌ１を発現するか、過剰発現するか、または発現するように誘導される。ＰＤ－Ｌ１発現の誘導は、例えば、腫瘍ワクチンの投与または放射線治療によって行うことができる。
【0088】
ＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する腫瘍には、膀胱がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、乳がん、尿道がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、扁平上皮がん、メルケル細胞癌、胃腸がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がん、および小細胞肺がんの腫瘍が含まれる。したがって、本開示の抗体は、任意の１またはそれを超えるそのようながんを処置するために使用することができる。
【0089】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療などの細胞治療も本開示で提供される。本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と接触させる（または本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を発現するように代替的に操作する）適切な細胞を使用することができる。そのような接触または操作を行うと、次いで、細胞を、処置を必要とするがん患者に導入することができる。がん患者は、本明細書に開示される種類のいずれかのがんを有し得る。細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例えば、腫瘍浸潤Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。
【0090】
いくつかの実施形態では、細胞は、がん患者自身から単離された。いくつかの実施形態では、細胞は、ドナーによって、または細胞バンクから提供された。細胞ががん患者から単離されると、望ましくない免疫反応を最小限に抑えることができる。
【0091】
本開示の抗体もしくはバリアント、またはそれらの誘導体を用いて処置、予防、診断および／または予後判定され得る、細胞生存の増加に関連するさらなる疾患または状態には、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病を含む）および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む））、真性多血症、リンパ腫（例：ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、および、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫などの肉腫および癌を含むがこれらに限定されない固形腫瘍などの悪性腫瘍および関連障害の進行および／または転移が含まれるが、これらに限定されない。
組成物
組成物
【0092】
本開示はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、有効量の抗体および許容され得る担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、第２の抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含む。
【0093】
特定の実施形態では、「薬学的に許容され得る」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されていること、または動物、より具体的にはヒトでの使用のために米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。さらに、「薬学的に許容され得る担体」は、一般に、任意の種類の非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料または製剤補助剤である。
【0094】
「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、滅菌液体、例えば水および油、例えば石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。医薬組成物を静脈内投与する場合、水が好ましい担体である。食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射液剤用の液体担体として使用することができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、または酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩などのｐＨ緩衝剤も含有することができる。ベンジルアルコール、メチルパラベン等の抗菌剤、アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウム等の酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤、および、塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張度を調整するための剤も想定される。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤・散剤（powder）、持続放出製剤などの形態をとることができる。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体と共に坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、治療有効量の抗原結合ポリペプチド、好ましくは精製形態の抗原結合ポリペプチドを適切な量の担体と共に含有する。製剤は投与様式に適するべきである。親製剤（parentalpreparation
）は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与バイアルに封入することができる。
）は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与バイアルに封入することができる。
【0095】
一実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として日常的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、注射部位の痛みを和らげるために可溶化剤およびリグノカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々に、または一緒に混合されて単位剤形で供給される。組成物が輸注によって投与される場合、組成物は、無菌医薬品グレードの水または食塩水を含有する輸液ボトルで投薬することができる。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。
【実施例0096】
実施例１：ヒトＰＤ－Ｌ１に対するマウスモノクローナル抗体の作製
この実施例は、ハイブリドーマ技術を用いた抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体の作製を記載する。
この実施例は、ハイブリドーマ技術を用いた抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体の作製を記載する。
【0097】
抗原：ＣＨＯＫ１細胞株（ＰＤＬ１－ＣＨＯＫ１細胞株）上に高発現したヒトＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質およびヒトＰＤ－Ｌ１。
【0098】
免疫：ヒトＰＤ－Ｌ１を標的とするマウスモノクローナル抗体を作製するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＷｉｓｔａｒラットを最初にＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質で免疫した。その後、免疫したマウスおよびラットを、それぞれＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質およびＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤ－Ｌ１安定細胞でブーストした。ＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合する抗体を産生するマウスまたはラットを選択するために、免疫したマウスまたはラットの血清をＥＬＩＳＡによる抗体価評価に供した。簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＥＬＩＳＡ被覆緩衝液中０．５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質、１００μｌ／ウェルで４℃にて一晩被覆し、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡでブロックした。免疫マウス由来の血清の希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体またはＨＲＰとコンジュゲートした抗ラットＩｇＧ抗体と３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。３回の免疫の後、ｒｈＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する血清ＥＬＩＳＡおよびＣＨＯ－Ｋ１親細胞株を陰性対照として用いたＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤＬ－１安定細胞株に対するＦＡＣＳによっても免疫応答を試験した。十分な力価の抗ＰＤＬ１ ＩｇＧを示したマウスを、３回の免疫後に２５μｇのヒトＰＤＬ１－Ｆｃタンパク質で追加免疫した。得られたマウスを融合に使用した。ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによって抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧについて試験した。
【0099】
細胞融合：電気融合によって融合を行った。融合した細胞を、各融合について５０個の９６ウェルプレートにプレーティングした。
【0100】
スクリーニング：上清を、組換えヒト（ｒｈ）ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質およびカウンタースクリーニング抗原に対してＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。次いで、陽性上清を、ＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤ－Ｌ１安定細胞株およびｒｈＰＤ－１－Ｆｃタンパク質に対する受容体ブロッキングＦＡＣＳによる一次スクリーニングから確認スクリーニングに供した。
【0101】
サブクローニングおよびスクリーニング：各融合からの陽性一次クローンを限界希釈によってサブクローニングして、サブクローンが単一の親細胞に由来することを確実にした。サブクローニングを一次クローンと同じアプローチでスクリーニングし、陽性クローンの培養上清を親和性順位付けによるさらなる確認スクリーニングにかけた。
【0102】
ハイブリドーマクローン４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８をさらなる分析のために選択した。４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８の可変領域のアミノ酸配列を以下の表１に列挙する。
表１ ４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８の可変領域の配列
表１Ａ ４７Ｃ６Ａ３のＣＤＲ配列
表１Ｂ ６７Ｆ３Ｇ７のＣＤＲ配列
表１Ｃ ８９Ｃ１０Ｈ８のＣＤＲ配列
実施例２：ＰＤ－Ｌ１抗原への結合活性
ＥＬＩＳＡ試験
表１ ４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８の可変領域の配列
【表1】
【表1A】
表１Ｂ ６７Ｆ３Ｇ７のＣＤＲ配列
【表1B】
表１Ｃ ８９Ｃ１０Ｈ８のＣＤＲ配列
【表1C】
実施例２：ＰＤ－Ｌ１抗原への結合活性
ＥＬＩＳＡ試験
【0103】
ハイブリドーマクローン４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８の結合活性を評価するために、これらのクローン由来のキメラｍＡｂをＥＬＩＳＡ試験に供した。
【0104】
簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質、１００μｌ／ウェルで４℃、一晩、コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡでブロッキングした。１０μｇ／ｍｌから開始する４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたマウス抗ヒトＩｇＧ
Ｆａｂ抗体と３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。図１に示すように、４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８は、ヒトＰＤ－Ｌ１に高親和性で結合した（４７Ｃ６Ａ３についてＥＣ５０＝１０．２４ｎｇ／ｍｌ、６７Ｆ３Ｇ７についてＥＣ５０＝１０．７６ｎｇ／ｍｌ、８９Ｃ１０Ｈ８についてＥＣ５０＝８．１１２ｎｇ／ｍｌ）。
Ｆａｂ抗体と３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。図１に示すように、４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８は、ヒトＰＤ－Ｌ１に高親和性で結合した（４７Ｃ６Ａ３についてＥＣ５０＝１０．２４ｎｇ／ｍｌ、６７Ｆ３Ｇ７についてＥＣ５０＝１０．７６ｎｇ／ｍｌ、８９Ｃ１０Ｈ８についてＥＣ５０＝８．１１２ｎｇ／ｍｌ）。
【0105】
細胞に基づく結合：ＦＡＣＳを使用して、ヒトＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯＫ１細胞に対する４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８キメラｍＡｂの結合活性を評価した。
【0106】
手短に言えば、ＰＤＬ１－ＣＨＯＫ１細胞を最初に、３倍段階希釈した４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８キメラｍＡｂと共に、１００ｎＭで開始して４℃で４０分間インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳＣａｎｔｏで評価した。図２に示すように、４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８は、ＰＤＬ１－ＣＨＯＫ１細胞に高親和性で結合した（４７Ｃ６Ａ３についてＥＣ５０＝０．１４７６ｎＭ、６７Ｆ３Ｇ７についてＥＣ５０＝０．１０３５ｎＭ、８９Ｃ１０Ｈ８についてＥＣ５０＝０．１６９６ｎＭ）。
種間活性
種間活性
【0107】
ＥＬＩＳＡ試験を行って、ヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１に対するキメラ抗体の結合をそれぞれ評価した。
【0108】
簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌのヒト、マウス、ラットおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１タンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃、一晩コーティングし、次いで１５０μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡでブロッキングした。１０μｇ／ｍｌから開始するキメラ抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体と３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ
４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７及び８９Ｃ１０Ｈ８抗体は、ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１に結合したが、ラット及びマウスＰＤ－Ｌ１には結合しなかった（図３および表２）。
表２ ４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８の種間活性
実施例３：抗体によるＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合の遮断
４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７及び８９Ｃ１０Ｈ８抗体は、ヒト及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１に結合したが、ラット及びマウスＰＤ－Ｌ１には結合しなかった（図３および表２）。
表２ ４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８の種間活性
【表2】
【0109】
組換えヒトＰＤ－Ｌ１のその受容体ＰＤ－１への結合に対する４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８キメラｍＡｂのブロッキング効果を評価するために、ＥＬＩＳＡに基づく受容体ブロッキングアッセイを使用した。
【0110】
簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃、一晩コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡでブロッキングした。５０μｌのビオチン標識ヒトＰＤ－１－Ｆｃタンパク質、ならびに１０μｇ／ｍｌから出発して５０μｌで３倍希釈した４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８抗体を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いでストレプトアビジン－ＨＲＰと共に３７℃で１０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。図４に示すように、４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８は、それぞれ９１．１８ｎｇ／ｍｌ、１３９．８ｎｇ／ｍｌ、１２９．８ｎｇ／ｍｌで検出されるＩＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１のヒトＰＤ１への結合を効率的に阻害した。
実施例４：ｍＡｂの結合親和性
実施例４：ｍＡｂの結合親和性
【0111】
組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質（ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタグ）に対する４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８抗体の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８ ｍＡｂを、プロテインＡチップを使用して捕捉した。ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉抗体上に３０μｌ／分の流速で２分間注入した。抗原を４８０～１５００秒間解離させた。全ての実験はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して行った。結果を図５及び下記表３に示す。
表３ Ｂｉａｃｏｒｅで測定した親和性
実施例５．マウス抗体のヒト化
表３ Ｂｉａｃｏｒｅで測定した親和性
【表3】
【0112】
４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７および８９Ｃ１０Ｈ８可変領域遺伝子を使用して、ヒト化ｍＡｂを作製した。このプロセスの第１のステップでは、４７Ｃ６Ａ３、６７Ｆ３Ｇ７、および８９Ｃ１０Ｈ８のＶＨおよびＶＬまたはＶＫのアミノ酸配列をヒトＩｇ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較して、全体的に最も適合するヒト生殖細胞系Ｉｇ遺伝子配列を見つけた。４７Ｃ６Ａ３の軽鎖の場合、ヒトＶｋ１－４が最良適合生殖細胞系であり、重鎖の場合、ヒトＶＨ１－２を主鎖として選択した。６７Ｆ３Ｇ７の軽鎖の場合、最も近いヒトマッチはＶｋ１－３９／ＪＫ４遺伝子であり、重鎖の場合、最も近いヒトマッチはＶＨ１－２／ＪＨ４－ＦＷ４遺伝子である。８９Ｃ１０Ｈ８の軽鎖の場合、最も近いヒトマッチはＶｋ１－１７／ＪＫ２遺伝子であり、重鎖の場合、最も近いヒトマッチはＶＨ３－２１／ＪＨ３遺伝子である。
【0113】
４７Ｃ６Ａ３のＶＬについては、ヒトＶｋ１－４が最良適合生殖細胞系であり、４７Ｃ６Ａ３のＶＨについては、ヒトＶＨ１－２を主鎖として選択した。次いで、４７Ｃ６Ａ３のヒト化可変ドメイン配列を設計し、ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３をＶｋ１－４遺伝子のフレームワーク配列に移植し、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３をＶＨ１－２遺伝子のフレームワーク配列に移植した。次いで、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸で置き換えることが結合および／またはＣＤＲ立体配座に影響を及ぼし得るフレームワーク位置があるかどうかを決定した。重鎖の場合、フレームワーク中のＲ、ＭおよびＩは、復帰変異に関与していた。
【0114】
次いで、６７Ｆ３Ｇ７のヒト化可変ドメイン配列を設計し、ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３をＶｋ１－３９／ＪＫ４遺伝子のフレームワーク配列に移植し、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３をＶＨ１－２／ＪＨ４－ＦＷ４遺伝子のフレームワーク配列に移植した。次いで、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸で置き換えることが結合および／またはＣＤＲ立体配座に影響を及ぼし得るフレームワーク位置があるかどうかを決定した。重鎖の場合、フレームワーク中のＶ、Ｋ、ＴおよびＩは、復帰変異に関与していた。軽鎖の場合、フレームワーク中のＴ、Ｖ、ＬおよびＱが復帰変異に関与していた。
【0115】
次いで、８９Ｃ１０Ｈ８のヒト化可変ドメイン配列を設計し、ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３をＶｋ１－１７／ＪＫ２遺伝子のフレームワーク配列に移植し、ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３をＶＨ３－２１／ＪＨ３遺伝子のフレームワーク配列に移植した。次いで、３Ｄモデルを生成して、マウスアミノ酸をヒトアミノ酸に置き換えることが結合および／またはＣＤＲ立体配座に影響を及ぼし得るフレームワーク位置があるかどうかを決定した。重鎖の場合、フレームワーク中のＡ、Ｔ、ＩおよびＳは、復帰変異に関与していた。軽鎖の場合、フレームワーク中のＹ、Ｉ、ＥおよびＦが復帰変異に関与していた。
【0116】
いくつかのヒト化抗体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を以下の表４に列挙する。
表４ ヒト化抗体配列（下線はＣＤＲを示し、太字／斜体は復帰変異を示す）
表４ ヒト化抗体配列（下線はＣＤＲを示し、太字／斜体は復帰変異を示す）
【表4-1】
【表4-2】
【0117】
遺伝子をｐｃＤＮＡ ３．４ベクターにクローニングし、２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。抗体は以下の表に従って作製した。
【0118】
ヒト化ＶＨおよびＶＬ遺伝子を合成的に作製し、次いで、それぞれヒトガンマ１およびヒトカッパ定常ドメインを含有するベクターにクローニングした。ヒトＶＨとヒトＶＬのペアリングは、４１個のヒト化抗体を作り出した（表５参照）。
表５ ＶＨおよびＶＬ領域を有するヒト化抗体
実施例６：ヒト化抗体の抗原結合特性
組換えヒトＰＤ－Ｌ１への結合
表５ ＶＨおよびＶＬ領域を有するヒト化抗体
【表5】
組換えヒトＰＤ－Ｌ１への結合
【0119】
抗原結合活性を評価するために、ヒト化抗体をＥＬＩＳＡ試験に供した。簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃、一晩コーティングし、次いで、２００μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡでブロッキングした。１０μｇ／ｍｌから始まるヒト化抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ抗体と３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。図６に示すように、全てのヒト化抗体は、キメラ抗体としてヒトＰＤ－Ｌ１と同等の結合効率を示した。
【0120】
ヒト化抗体の結合動態を調べるために、この実施例では、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて親和性ランキングを行った。表６に示されるように、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－３、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－５、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－７、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－４、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－７、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－１１及びＨｕ８９Ｃ１０Ｈ８－１２は、キメラ抗体と同等の高親和性を示した。
表６ ヒト化抗体の親和性ランキング
哺乳動物細胞上に過剰発現されたヒトＰＤ－Ｌ１への結合
表６ ヒト化抗体の親和性ランキング
【表6】
【0121】
抗原結合特性を評価するために、ヒト化抗体を、ＦＡＣＳによって哺乳動物細胞上に過剰発現されたＰＤ－Ｌ１へのそれらの結合について分析した。手短に言えば、ＰＤＬ１－ＣＨＯＫ１細胞を、最初に、１５μｇ／ｍｌで開始する３倍段階希釈（3-foldserious diluted）ヒト化抗体と共に４℃で４０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７のＭＦＩをＦＡＣＳＣａｎｔｏで評価した。図７に示すように、全てのヒト化抗体は、哺乳動物細胞上に発現されたＰＤ－Ｌ１に高効率で結合することができる。
Ｂｉａｃｏｒｅによるヒト化抗体の完全速度論的親和性
Ｂｉａｃｏｒｅによるヒト化抗体の完全速度論的親和性
【0122】
組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質（ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタグ）に対するヒト化抗体の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅによって試験した。Ｈｕ４７Ｃ６Ａ３－１、Ｈｕ４７Ｃ６Ａ３－２、Ｈｕ４７Ｃ６Ａ３－３、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－３、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－５、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－７、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－４、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－７、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－１１およびＨｕ８９Ｃ１０Ｈ８－１２ ｍＡｂを、プロテインＡチップを使用して捕捉した。ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉抗体上に３０μｌ／分の流速で２分間注入した。抗原を１５００秒間解離させた。全ての実験はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いてデータ解析を行い、結果を以下の表７に示す。
表７ Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性
実施例７：ヒト化抗体によるＰＤ１へのＰＤＬ１の結合の遮断
組換えヒトＰＤ－Ｌ１を用いることによる受容体ブロッキングアッセイ
表７ Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性
【表7】
組換えヒトＰＤ－Ｌ１を用いることによる受容体ブロッキングアッセイ
【0123】
ヒトＰＤ－Ｌ１には２つの受容体、ＰＤ－１およびＣＤ８０がある。これらの２つのタンパク質に対するヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体のブロッキング特性を調べるために、タンパク質ベースの受容体ブロッキングアッセイをここで使用した。
【0124】
簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質、１００μｌ／ウェルで４℃、一晩コーティングし、次いで１５０μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡで３７℃、２時間ブロッキングした。５０μｌのビオチン標識ヒトＰＤ－１－ＦｃまたはＣＤ８０－Ｆｃタンパク質および１０μｇ／ｍｌから出発して５０μｌで３倍希釈したＰＤ－Ｌ１抗体を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いでストレプトアビジン－ＨＲＰと共に３７℃で１０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。図８に示すように、Ｈｕ４７Ｃ６Ａ３－１、Ｈｕ４７Ｃ６Ａ３－２、Ｈｕ４７Ｃ６Ａ３－３、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－３、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－５、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－７、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－４、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－７、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－１１及びＨｕ８９Ｃ１０Ｈ８－１２は、ヒトＰＤ１へのヒトＰＤ－Ｌ１の結合を効率的に阻害した。さらに、Ｈｕ４７Ｃ６Ａ３－１、Ｈｕ４７Ｃ６Ａ３－２、Ｈｕ４７Ｃ６Ａ３－３、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－３、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－５、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－７、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－４、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－７、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－１１及びＨｕ８９Ｃ１０Ｈ８－１２は、ヒトＣＤ８０へのヒトＰＤ－Ｌ１の結合を用量依存的に効率的に阻害した（図９）。
実施例８．ＰＤ－Ｌ１経路およびＴＧＦ－β経路の両方における二機能性タンパク質標的化
実施例８．ＰＤ－Ｌ１経路およびＴＧＦ－β経路の両方における二機能性タンパク質標的化
【0125】
この実施例では、二機能性組換え抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびＴＧＦ－βＲＩＩ融合タンパク質を調製し、試験した。
【0126】
上記分子の軽鎖は、抗ＰＤＬ１ ｍＡｂの軽鎖である。重鎖は、柔軟性（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｇｌｙリンカーを介した抗ＰＤＬ１ ｍＡｂの重鎖と、ＴＧＦ－βＲＩＩの可溶性細胞外ドメインのＮ末端との融合物である。融合接合部で、抗体重鎖のＣ末端リジン残基をアラニンに変異させて、潜在的なタンパク質分解切断を減少させた。
【0127】
いくつかの例では、ＣＤＲの潜在的な修飾部位を類似のアミノ酸に変異させた。抗ＰＤ－Ｌ１部分の配列を以下の表８に示す。
表８ 二機能性分子中の抗体部分の可変領域の配列
表９ 二機能性分子のＶＨ／ＶＬ
表８ 二機能性分子中の抗体部分の可変領域の配列
【表8-1】
【表8-2】
【表9】
【0128】
ＶＨに加えて、二機能性分子の重鎖は、定常領域（Ｃ末端ＫがＡに変異している）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｇｌｙリンカー、およびＴＧＦ－βＲＩＩの可溶性細胞外ドメインのＮ末端をさらに含む。それらの配列を表１０に示す。
表１０ 重鎖および重鎖／軽鎖全体のさらなる配列
実施例９：二機能性分子の結合親和性
表１０ 重鎖および重鎖／軽鎖全体のさらなる配列
【表10-1】
【表10-2】
【表10-3】
【0129】
組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質（ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタグ）に対するＬＰ００８－０６、ＬＰ００８－０６ａ、ＬＰ００８－０６ａ－ＤＡおよびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳ二機能性分子の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。
【0130】
プロテインＡチップを用いて二機能性分子を捕捉した。ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタグタンパク質の段階希釈物を、捕捉抗体上に３０μｌ／分の流速で２分間注入した。抗原を１５００秒間解離させた。全ての実験はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して行った。結果を図１０および以下の表１１に示す。
表１１ Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性試験
表１１ Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性試験
【表11】
【0131】
組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質およびヒトＴＧＦ－β１へのＬＰ００８－０２の結合を、捕捉法を使用してＢｉａｃｏｒｅで試験した。
【0132】
プロテインＡチップを用いてＬＰ００８－０２を捕捉した。ヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓタグタンパク質およびヒトＴＧＦ－β１の段階希釈物を、捕捉抗体上に３０μｌ／分の流速で２分間注入した。ＰＤ－Ｌ１を６８０秒間解離させ、ＴＧＦ－β１を１０００秒間解離させた。全ての実験はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。データ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して行った。結果を図１１および以下の表１２に示す。
表１２ Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性試験
実施例１０：ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断のための機能アッセイ
表１２ Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性試験
【表12】
【0133】
ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキングにおける二機能性分子の活性を、この実施例では生物発光細胞ベースのアッセイによって測定した。
【0134】
このアッセイでは、ＰＤ１エフェクター細胞をＰＤ－Ｌ１標的細胞と共培養すると、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用がＴＣＲシグナル伝達およびＮＦＡＴ－ＲＥ媒介性発光を阻害する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロックする抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかを添加すると、阻害シグナルが放出され、ＴＣＲ活性化とＮＦＡＴ－ＲＥ媒介発光が生じるであろう。
【0135】
図１２に示すように、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳは、Ｍ７８２４よりもかなり高い活性でＰＤ１およびＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断した（Ｍ７８２４ ＥＣ５０＝０．８５０４ｎＭ、ＬＰ００８－０２ ＥＣ５０＝０．３６３０ｎＭ、ＬＰ００８－０６ａ－ＥＳ ＥＣ５０＝０．４５５３ｎＭ）。
実施例１１：ＴＧＦ－βについての機能アッセイ
実施例１１：ＴＧＦ－βについての機能アッセイ
【0136】
この実施例は、ルシフェラーゼアッセイを使用して、標準的なＴＧＦ－βシグナル伝達に対するＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳの効果を評価した。
【0137】
Ｍ７８２４の段階希釈物（二機能性抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβトラップ融合タンパク質、例えば、Ｋｎｕｄｓｏｎら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１８；７（５）：ｅ１４２６５１９を参照のこと）、ＬＰ００８－０２またはＬＰ００８－０６ａ－ＥＳを、組換えヒトＴＧＦ－βの存在下で約２０時間、ＳＢＥルシフェラーゼレポーター－トランスフェクト２９３細胞と共にインキュベートした。
【0138】
図１３に示されるように、Ｍ７８２４、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳは、２９３細胞において構築されたＴＧＦ－βＳＢＥルシフェラーゼレポーターアッセイ系において、ＴＧＦ－βカノニカルシグナル伝達をブロックした（ＩＣ５０＝０．０６６８７ｎＭ、ＩＣ５０＝０．０７３５２ｎＭ、ＩＣ５０＝０．０７１６７ｎＭ）。
実施例１２：ヒトＰＤ－Ｌ１に対する結合活性
組換えヒトＰＤ－Ｌ１を用いたＥＬＩＳＡ
実施例１２：ヒトＰＤ－Ｌ１に対する結合活性
組換えヒトＰＤ－Ｌ１を用いたＥＬＩＳＡ
【0139】
Ｍ７８２４、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳの結合活性を評価するために、二機能性分子をＥＬＩＳＡ試験に供した。
【0140】
簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質、１００μｌ／ウェルで４℃、一晩コーティングし、次いで１５０μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡでブロッキングした。１μｇ／ｍｌから開始したＭ７８２４、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳの３倍希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。
【0141】
図１４に示すように、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳは、Ｍ７８２４よりもかなり高い活性でヒトＰＤ－Ｌ１に結合した（ＥＣ５０＝１１．８２ｎｇ／ｍｌおよびＥＣ５０＝１４．３６ｎｇ／ｍｌ対ＥＣ５０＝２３．６８ｎｇ／ｍｌ）。
種間活性
種間活性
【0142】
マウスＰＤ－Ｌ１、ラットＰＤ－Ｌ１、カニクイザルＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体の結合を評価するために、抗体をＥＬＩＳＡで試験した。
【0143】
簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌのマウス、ラットおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１タンパク質、１００μｌ／ウェルで４℃、一晩コーティングし、次いで１５０μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡでブロッキングした。１μｇ／ｍｌから出発する二重特異性抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。
【0144】
ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳは、カニクイザルＰＤ－Ｌ１にＭ７８２４よりも高親和性で結合することができたが、Ｍ７８２４のみがラットおよびマウスＰＤ－Ｌ１に結合することができる（図１５および表１３）。
表１３ Ｍ７８２４、ＣＺ０１０－０２およびＣＺ０１０－０６ａ－ＥＳの種間活性
実施例１３：ヒトＴＧＦ－βに対する結合活性
組換えヒトＴＧＦ－βを使用することによるＥＬＩＳＡ
表１３ Ｍ７８２４、ＣＺ０１０－０２およびＣＺ０１０－０６ａ－ＥＳの種間活性
【表13】
組換えヒトＴＧＦ－βを使用することによるＥＬＩＳＡ
【0145】
ヒトＴＧＦ－βに対するＭ７８２４、ＬＰ００８－０２及びＬＰ００８－０６ａ－ＥＳの結合活性を評価するために、これらの二機能性分子をＥＬＩＳＡ試験に供した。
【0146】
簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦ－βタンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃、一晩コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡでブロッキングした。１０μｇ／ｍｌから始まるＭ７８２４、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳ二機能性分子の３倍希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。
【0147】
図１６に示すように、Ｍ７８２４、ＬＰ００８－０２及びＬＰ００８－０６ａ－ＥＳは、いずれもヒトＴＧＦ－βに高い活性（ＥＣ５０＝４３．４３ｎｇ／ｍｌ、ＥＣ５０＝２８．５８ｎｇ／ｍｌ、ＥＣ５０＝３９．３８ｎｇ／ｍｌ）で結合した。
種間活性
種間活性
【0148】
マウス、ラットおよびカニクイザルＴＧＦ－βに対する二重特異性抗体の結合を評価するために、二機能性分子をＥＬＩＳＡ試験に供した。
【0149】
簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのマウス、ラットおよびカニクイザルＴＧＦ－βタンパク質、１００μｌ／ウェルで、４℃、一晩コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ ＢＳＡでブロッキングした。１０μｇ／ｍｌから出発する二重特異性抗体の３倍希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。
【0150】
試験した二機能性分子はすべて、カニクイザル、ラットおよびマウスのＴＧＦ－βに高い活性で結合した（図１７および表１４）。
表１４ Ｍ７８２４、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳの種間活性
実施例１４：ＭＣ３８腫瘍マウスモデルにおける有効性
表１４ Ｍ７８２４、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳの種間活性
【表14】
【0151】
この実施例は、二機能性分子のインビボ有効性を試験するために腫瘍マウスモデルを使用した。
【0152】
ＰＢＳに再懸濁したヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８細胞を、Ｂ－ｈＰＤ－Ｌ１ヒト化マウスの右皮膚に、５×１０５細胞の濃度で０．２ｍＬの容量で皮下播種した。平均腫瘍体積が約５５ｍｍ３に達したとき、適切な個々の腫瘍体積を有する２４匹のマウスを群のために選択し、動物を腫瘍体積に従って４つの実験群に無作為に割り当て、各群に６匹の動物を割り当てた。抗ｍＣＤ２０ｍＡｂ注射後、総ヒトＩｇＧ、Ｍ７８２４、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳを腹腔内注射によって週に３回投与した。用量は、１０μｇ／ｇでの実験動物の体重に基づいて計算した。マウスの体重および腫瘍サイズを週に２回試験した。
【0153】
結果を図１８に示す。二機能性分子ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳは、腫瘍成長阻害に関してこれらの動物モデルにおいてＭ７８２４よりも良好な有効性を示した。さらに、動物の死亡がＩｇＧおよびＭ７８２４群の両方で観察されたが、ＬＰ００８－０２およびＬＰ００８－０６ａ－ＥＳ群では観察されず、新しい二機能性分子のより良好な安全性プロファイルを実証した。
実施例１５．二機能性分子の修飾
実施例１５．二機能性分子の修飾
【0154】
この実施例では、特定の修飾二機能性分子（表１５）を、ＴＧＦ－βについての機能的アッセイのそれらのインビトロ有効性について試験した。それらのいくつかは、ＴＡＧＨＴＱＴＳＴＧＧＧＡＩＴＴＧＴＳＧＡＧＨＧＰ（配列番号８７）、ＨＹＰおよび／またはＧ４Ｓ（配列番号８６）リピートのリンカー配列を含んでいた。これらの分子をそれぞれＬＰ００８－０２－１～ＬＰ００８－０２－７と呼ぶ。
表１５ リンカーおよびＴＧＦ－βＲＩＩの修飾配列設計
組換えヒトＴＧＦ－β１を用いたＥＬＩＳＡ
表１５ リンカーおよびＴＧＦ－βＲＩＩの修飾配列設計
【表15】
【0155】
修飾ＬＰ００８－０２二機能性分子の結合活性を評価するために、これらの二機能性分子をＥＬＩＳＡで試験した。
【0156】
簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦ－β１タンパク質（Ａｃｒｏ、ＴＧ１－Ｈ４２１２）、１００μｌ／ウェルで４℃、一晩コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロッキングした。３０ｎＭから出発する修飾ＬＰ００８－０２二機能性分子の３倍希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体と共に３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、ＯＤ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。
【0157】
図１９に示すように、修飾されたＬＰ００８－０２の二機能性分子は、いずれもＬＰ００８－０２－１に匹敵する高い活性でヒトＴＧＦ－β１に結合した。
ＴＧＦ－β機能アッセイ
ＴＧＦ－β機能アッセイ
【0158】
修飾ＬＰ００８－０２二機能性分子の段階希釈物を、組換えヒトＴＧＦ－β１の存在下で約２２時間、ＳＢＥルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトした２９３細胞とインキュベートした。
【0159】
図２０に示されるように、ＬＰ００８－０２－２、ＬＰ００８－０２－３およびＬＰ００８－０２－４は、２９３細胞において構築されたＴＧＦ－βＳＢＥルシフェラーゼレポーターアッセイ系において、ＴＧＦ－βカノニカルシグナル伝達を効果的にブロックし（ＩＣ５０＝０．１４３５ｎＭ、ＩＣ５０＝０．１６３９ｎＭ、ＩＣ５０＝０．１８８２ｎＭ）、これをＬＰ００８－０２－１と比較した。
実施例１６．二機能性分子の比較
実施例１６．二機能性分子の比較
【0160】
表１５の分子１～７は、外部ドメインのＮ末端およびＣ末端に異なる配列を含んでいた（配列番号７２）。それらを安定性および活性について試験して、これらの配列の影響を評価した。
【0161】
分子１（ＬＰ００８－０２－１）は、細胞外ドメインのＮ末端から２５個のアミノ酸（ＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰ、配列番号８９、またはアイソフォームＢのアミノ酸２４～４８、配列番号７１）およびＣ末端断片（ＥＥＹＮＴＳＮＰＤ、配列番号９０）を含むタンパク質（配列番号６１）の細胞外部分全体（entireexcellular portion）を含んでいた。さらに、この分子は、いくつかのＧ４Ｓ（配列番号８６）
リピートをリンカーに付加した。
リピートをリンカーに付加した。
【0162】
分子２（ＬＰ００８－０２－２）は、分子１と比較して、細胞外ドメインのＮ末端部分（アイソフォームＢのアミノ酸２４～４８、配列番号８９）を人工リンカーＴＡＧＨＴＱＴＳＴＧＧＧＡＩＴＴＧＴＳＧＡＧＨＧＰ（配列番号８７）で置き換えた。このリンカーを配列番号８９に基づいてモデル化した。変化には、（ｉ）剛性ジペプチドＰＰの除去、（ｉｉ）潜在的切断部位ＱＫ、ＮおよびＫの除去、（ｉｉｉ）柔軟性を高めるための複数のグリシン残基の包含、（ｉｖ）疎水性残基の部分的除去（例えば、１つのＩのみを保持する）が含まれた。これらの変化を以下の表１６に示す。分子２はまた、Ｎ末端に単一のＧ４Ｓユニットを含んでいた。
表１６ 人工リンカー
表１６ 人工リンカー
【表16】
【0163】
分子３（ＬＰ００８－０２－３）は、分子２よりも長いＧ４Ｓリンカーを含んでいた。分子３の上に、分子４（ＬＰ００８－０２－４）は、Ｃ末端断片ＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号９０）の欠失を有していた。分子５（ＬＰ００８－０２－５）は、人工リンカー、配列番号８７を短いリンカーＨＹＰで置き換えた。分子６（ＬＰ００８－０２－６）および７（ＬＰ００８－０２－７）は、ＨＹＰリンカーのＮ末端側に異なる長さのＧ４Ｓリンカーを含んでいた。
実施例１７．二機能性分子の結合活性および安定性
実施例１７．二機能性分子の結合活性および安定性
【0164】
この実施例では、ＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＣＥ－ＳＤＳを使用して、ＬＰ００８－０２－１、および４つのさらなる修飾分子、ＬＰ００８－０２－２、ＬＰ００８－０２－３、ＬＰ００８－０２－６およびＬＰ００８－０２－７を含む修飾二機能性分子のいくつかの安定性を評価した。
【0165】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介一過性トランスフェクションによって５つの配列をＣＨＯ－Ｋ１細胞で発現させ、１０日後に上清を回収した。二機能性分子をプロテインＡによって培養上清から精製し、その後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって検出される９９％を超える純度レベルでＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇによって精製した（表１７）。
表１７ ０日目の試験品のＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＣＥ－ＳＤＳの結果
表１７ ０日目の試験品のＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＣＥ－ＳＤＳの結果
【表17】
【0166】
修飾ＬＰ００８－０２二機能性分子の結合活性を評価するために、これらの二機能性分子をＥＬＩＳＡによって試験した。
【0167】
簡潔には、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦ－β１タンパク質（Ａｃｒｏ、ＴＧ１－Ｈ４２１２）、１００μｌ／ウェルで４℃、一晩コーティングし、次いで、１５０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡでブロッキングした。３０ｎＭから出発する修飾ＬＰ００８－０２二機能性分子の４倍段階希釈物を各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体と３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートを発色のためにＴＭＢ基質とインキュベートし、ＯＤ ４５０ｎｍで分光光度計によって分析した。
【0168】
図２１に示されるように、他の修飾されたＬＰ００８－０２二機能性分子は全て、ＬＰ００８－０２－１に匹敵する高い活性でヒトＴＧＦ－β１に結合した。
【0169】
標準的なＴＧＦ－βシグナル伝達に対する修飾されたＬＰ００８－０２二機能性分子の効果を評価するために、修飾二機能性分子をルシフェラーゼアッセイで試験した。二機能性分子の段階希釈物を、ＳＢＥルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトした２９３細胞と共に、組換えヒトＴＧＦ－β１の存在下で２４時間インキュベートした。図２２に示されるように、ＬＰ００８－０２－１、ＬＰ００８－０２－２、ＬＰ００８－０２－３、ＬＰ００８－０２－６およびＬＰ００８－０２－７のように、２９３細胞において構築されたＴＧＦ－βＳＢＥルシフェラーゼレポーターアッセイ系において、ＴＧＦ－βカノニカルシグナル伝達を効率的にブロックした（ＩＣ５０＝０．０４２３１ｎＭ、ＩＣ５０＝０．０５２７ｎＭ、ＩＣ５０＝０．０９６１６ｎｍおよびＩＣ５０＝０．１９６２ｎＭ）。
【0170】
二機能性分子を抗体安定性検出のために２つの緩衝液に別々に溶解した。緩衝液情報は以下のように列挙される：緩衝液Ａ：２０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、２５０ｍＭソルビトール、０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ４．９；緩衝液Ｂ：２０ｍＭ Ｈｉｓ／Ｈｉｓ－ＨＣｌ、２５０ｍＭトレハロース、ｐＨ５．４。
【0171】
調製した３．０ｍｇ／ｍｌの試料を４０℃でインキュベートし、次いで０日目および１４日目にそれぞれＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＣＥ－ＳＤＳによって検出した。表１８に示すように、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂの両方で調合したＬＰ００８－０２－２、ＬＰ００８－０２－３、ＬＰ００８－０２－６およびＬＰ００８－０２－７は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにおいてＬＰ００８－０２－１よりも高い安定性を有する。
表１８ １４日目の試験品のＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＣＥ－ＳＤＳの結果
表１８ １４日目の試験品のＳＥＣ－ＨＰＬＣおよびＣＥ－ＳＤＳの結果
【表18】
【0172】
したがって、この実施例は、修飾二機能性分子ＬＰ００８－０２－２、ＬＰ００８－０２－３、ＬＰ００８－０２－６およびＬＰ００８－０２－７が、ＬＰ００８－０２－１と同様の活性を示したが、ＬＰ００８－０２－１よりも有意により高い安定性を示したことを示す。ＬＰ００８－０２－１中のＴＧＦ－βＲＩＩのＮ末端部分（ＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰ、配列番号８９）を人工リンカー（例えば、ＴＡＧＨＴＱＴＳＴＧＧＧＡＩＴＴＧＴＳＧＡＧＨＧＰ（配列番号８７）またはＨＹＰ）で置き換えると、安定性が有意に改善された。
実施例１８．抗ＰＤ－Ｌ１抗体の高濃度製剤
実施例１８．抗ＰＤ－Ｌ１抗体の高濃度製剤
【0173】
この実施例は、ＨＩＣ－ＨＰＬＣおよび粘度試験を使用して、高濃度抗ＰＤ－Ｌ１分子製剤の開発の潜在性およびリスクを評価した。
【0174】
４つの抗ＰＤ－Ｌ１分子を、一過性トランスフェクションによってＣＨＯ－Ｋ１細胞または２９３Ｆ細胞において発現させた。重鎖の定常領域はヒトＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）－Ｆｃである。精製されたＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、４７Ｃ６Ａ３、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２およびＨｕ８９Ｃ１０Ｈ８－７抗体をＨＩＣ－ＨＰＬＣによって試験し、疎水性溶出時間に対応する硫酸アンモニウムの濃度を得て、これを使用してこれらの分子の溶解度範囲を予測した。表１９に示すように、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、４７Ｃ６Ａ３、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－７の疎水性溶出時間に相当する硫酸アンモニウム濃度は、それぞれ０．４１Ｍ、０．７８Ｍ、０．９７Ｍ、１．１０Ｍである。新しく開発された抗体はすべて、参照抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａよりも疎水性が低い。
表１９ ＨＩＣ－ＨＰＬＣ試験からの抗体疎水性
表１９ ＨＩＣ－ＨＰＬＣ試験からの抗体疎水性
【表19】
【0175】
次いで、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキングにおける抗ＰＤ－Ｌ１抗体の活性を生物発光細胞ベースのアッセイで測定した。このアッセイでは、ＰＤ１エフェクター細胞をＰＤ－Ｌ１標的細胞と共培養すると、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用がＴＣＲシグナル伝達およびＮＦＡＴ－ＲＥ媒介性発光を阻害する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロックする抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかを添加すると、阻害シグナルが放出され、ＴＣＲ活性化とＮＦＡＴ－ＲＥ媒介発光が生じるであろう。図２３に示すように、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、４７Ｃ６Ａ３、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２及びＨｕ８９Ｃ１０Ｈ８－７は、ＰＤ１及びＰＤ－Ｌ１相互作用をかなり高い活性で遮断した（ＭＰＤＬ３２８０Ａ ＥＣ５０＝０．１３２７ｎＭ、４７Ｃ６Ａ３ ＥＣ５０＝０．１５０１ｎＭ、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２ ＥＣ５０＝０．１０３４ｎＭ、Ｈｕ８９Ｃ１０Ｈ８－７ ＥＣ５０＝０．２１３８ｎＭ）。
【0176】
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有するＭＰＤＬ３２８０ＡおよびＨｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２を、一過性トランスフェクションによってＣＨＯ－Ｋ１細胞において発現させた。精製されたＭＰＤＬ３２８０Ａ－ｈＩｇＧ１ ＦｃおよびＨｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２－ｈＩｇＧ１ Ｆｃ抗体をＨＩＣ－ＨＰＬＣによって試験し、疎水性溶出時間に対応する硫酸アンモニウムの濃度を得て、これを使用して２つの分子の溶解度範囲を予測した。表２０に示すように、ＭＰＤＬ３２８０Ａ－ｈＩｇＧ１ Ｆｃ及びＨｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２－ｈＩｇＧ１ Ｆｃの疎水性溶出時間に相当する硫酸アンモニウム濃度は、それぞれ０．４２ Ｍ及び０．９９ Ｍである。ここでも、同じＦｃ断片では、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２は、ＭＰＤＬ３２８０Ａよりも低い疎水性を示した。
表２０ ＨＩＣ－ＨＰＬＣ試験の結果
表２０ ＨＩＣ－ＨＰＬＣ試験の結果
【表20】
【0177】
抗体の溶解度および粘度特性をさらに確認するために、２つの精製候補物を、限外濾過によってリン酸緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣｌを含む）中で直接濃縮した。限外濾過プロセス中に、濃度、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、および粘度特性を異なる段階で測定した。表２１に示すように、ＭＰＤＬ３２８０Ａ－ｈＩｇＧ１ Ｆｃの粘度は、同様の濃度のＨｕ ６７Ｆ３Ｇ７－２２－ｈＩｇＧ１ Ｆｃの粘度よりもはるかに高い。また、高濃度製剤の場合、一般に、より低い粘度を有する抗体が、より高い粘度を有する抗体よりも好ましい。したがって、治療用タンパク質として、Ｈｕ６７Ｆ３Ｇ７－２２抗体は、ＭＰＤＬ３２８０Ａよりも高い潜在性を有する。
表２１ 溶解度試験の結果
表２１ 溶解度試験の結果
【表21】
【0178】
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図される記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に等価な任意の組成物または方法が本開示の範囲内にある。本開示の精神または範囲から逸脱することなく、本開示の方法および組成物に様々な修正および変形を加えることができることは当業者には明らかである。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内に入る限り、本開示の修正および変形を包含することが意図されている。
【0179】
本明細書で言及されるすべての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）抗体またはその断片およびヒトＴＧＦ－βＲＩＩ（ＴＧＦ－β受容体２型）の細胞外ドメインを含む多機能性分子であって、
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片が、前記ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する特異性を有し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号７～１２または配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む、または前記ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２０、９１または９２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、
前記ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２４または９３を含み、
前記ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片に融合されている、多機能性分子。
(項目２)
抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片が、前記ＶＨを含む重鎖と、前記ＶＬを含む別個の軽鎖とを含む、項目１に記載の多機能性分子。
(項目３)
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片の前記重鎖に融合されている、項目２に記載の多機能性分子。
(項目４)
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片の前記重鎖のＣ末端に融合されている、項目３に記載の多機能性分子。
(項目５)
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、ペプチドリンカーを介して前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片の前記重鎖に融合されている、項目３または４に記載の多機能性分子。
(項目６)
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号７２を含み、配列番号７１のアミノ酸残基２４～４８の少なくとも部分的な欠失を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目７)
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号６１および７３～７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号７４について、Ｘが、Ｋ、ＳまたはＮを除く任意のアミノ酸である、項目１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目８)
配列番号７２と前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片との間に少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目９)
配列番号７２と前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片との間にアルファヘリックスモチーフを含む、項目１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目１０)
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目１１)
前記ＶＨが、配列番号３１～３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３８～４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の多機能性分子。
(項目１２)
前記ＶＨが配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号４３のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の多機能性分子。
(項目１３)
前記ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２０、９１または９２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２４または９３を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目１４)
前記ＶＨが、配列番号４４～４９および５７～５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５０～５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１３に記載の多機能性分子。
(項目１５)
前記ＶＨが配列番号４８、５７または５８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号５３または５６のアミノ酸配列を含む、項目１３に記載の多機能性分子。
(項目１６)
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１９、９２、２１、２２、２３および９３のアミノ酸配列を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目１７)
前記ＶＨが配列番号５８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号５６のアミノ酸配列を含む、項目１６に記載の多機能性分子。
(項目１８)
前記ＶＬおよび軽鎖定常領域を含む軽鎖、ならびに前記ＶＨ、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、および前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインを含む重鎖を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目１９)
前記重鎖定常領域が、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、項目１８に記載の多機能性分子。
(項目２０)
前記ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する特異性を有し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）抗体またはその断片であって、前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号７～１２または配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含むか、または前記ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２０、９１または９２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２４または９３を含む、抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）抗体またはその断片。
(項目２１)
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む、項目２０に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２２)
前記ＶＨが、配列番号３１～３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３８～４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２３)
前記ＶＨが配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号４３のアミノ酸配列を含む、項目２１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２４)
前記ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２０、９１または９２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２４または９３を含む、項目２０に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２５)
前記ＶＨが、配列番号４４～４９および５７～５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５０～５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２６)
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤ
Ｒ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１９、９２、２１、２２、２３および９３のアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２７)
前記ＶＨが配列番号５８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号５６のアミノ酸配列を含む、項目２６に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２８)
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号７～１２のアミノ酸配列を含む、項目２０に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２９)
前記ＶＨが、配列番号２５～２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号２９～３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目３０)
前記ＶＨが配列番号２６、２７または２８のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号３０のアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目３１)
ペプチドリンカーを介して配列番号７２のアミノ酸配列のＮ末端に融合した抗体またはその抗原結合断片を含む、多機能性分子。
(項目３２)
前記ペプチドリンカーは、柔軟性リンカーおよび／またはＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰ（配列番号８９）の置換ペプチドを含み、前記置換ペプチドは配列番号８９とは異なる、項目３１に記載の多機能性分子。
(項目３３)
前記置換ペプチドが、ＩＰＰＨＶＱＸＸＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＸＧＡＶＫＦＰ（配列番号８８）のアミノ酸配列を含み、Ｘが、Ｋ、Ｓ、またはＮを除く任意のアミノ酸である、項目３２に記載の多機能性分子。
(項目３４)
前記置換ペプチドが、配列番号８８と少なくとも５０％の配列同一性を有する、項目３３に記載の多機能性分子。
(項目３５)
前記置換ペプチドが、ＴＡＧＨＴＱＴＳＴＧＧＧＡＩＴＴＧＴＳＧＡＧＨＧＰ（配列番号８７）のアミノ酸配列、または配列番号８７と少なくとも７５％の配列同一性を有するバリアントを含み、前記バリアントが、少なくとも４つのＧを含み、ＰＰジペプチドを含まず、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、ＹおよびＰからなる群から選択される３個以下の疎水性アミノ酸残基を含む、項目３２に記載の多機能性分子。
(項目３６)
前記バリアントが、少なくとも５つのＧと、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、ＹおよびＰからなる群から選択される１個以下の疎水性アミノ酸残基とを含む、項目３５に記載の多機能性分子。
(項目３７)
前記柔軟性リンカーが、Ｓおよび少なくとも５０％のＧを含む、項目３２～３６のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目３８)
前記柔軟性リンカーが、１またはそれを超えるＧＧＧＧＳ（配列番号８６）単位を含む、項目３７に記載の多機能性分子。
(項目３９)
前記抗体またはその抗原結合断片のＣ末端が、配列番号７２のアミノ酸配列のＮ末端から少なくとも２０個のアミノ酸残基である、項目３１～３８のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目４０)
ＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号９０）の配列全体を少なくとも含まない、項目３１～３９のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目４１)
前記抗体またはその断片が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４－１ＢＢ、ＴＩＭ ３、ＯＸ－４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ４７およびＣＤ７３からなる群より選択される抗原に特異的である、項目３１～４０のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目４２)
前記抗体またはその断片がＦｃ断片を含む、項目３１～４１のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目４３)
前記ペプチドリンカーが、前記Ｆｃ断片のＣ末端に融合されている、項目４２に記載の多機能性分子。
(項目４４)
項目１～１９および３１～４３のいずれか一項に記載の多機能性分子または項目２０～３０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその断片をコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチドを含む細胞。
(項目４５)
項目１～１９および３１～４３のいずれか一項に記載の多機能性分子または項目２０～３０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその断片をコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチド。
(項目４６)
項目１～１９および３１～４３のいずれか一項に記載の多機能性分子または項目２０～３０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその断片と、薬学的に適切な担体とを含む組成物。
(項目４７)
がんを処置するための医薬品を製造するための、項目１～１９および３１～４３のいずれか一項に記載の多機能性分子または項目２０～３０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその断片の使用。
(項目４８)
がんの処置を必要とする患者においてがんを処置するための方法であって、有効量の項目１～１９および３１～４３のいずれか一項に記載の多機能性分子または項目２０～３０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその断片を前記患者に投与することを含む方法。
(項目４９)
前記がんが固形腫瘍である、項目４７に記載の使用または項目４８に記載の方法。
(項目５０)
前記がんが、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、胃腸がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がん、黒色腫、前立腺がんおよび甲状腺がんからなる群から選択される、項目４７もしくは４９に記載の使用または項目４８もしくは４９に記載の方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）抗体またはその断片およびヒトＴＧＦ－βＲＩＩ（ＴＧＦ－β受容体２型）の細胞外ドメインを含む多機能性分子であって、
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片が、前記ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する特異性を有し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号７～１２または配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む、または前記ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２０、９１または９２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、
前記ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２４または９３を含み、
前記ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号７２のアミノ酸配列を含み、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片に融合されている、多機能性分子。
(項目２)
抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片が、前記ＶＨを含む重鎖と、前記ＶＬを含む別個の軽鎖とを含む、項目１に記載の多機能性分子。
(項目３)
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片の前記重鎖に融合されている、項目２に記載の多機能性分子。
(項目４)
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片の前記重鎖のＣ末端に融合されている、項目３に記載の多機能性分子。
(項目５)
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、ペプチドリンカーを介して前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片の前記重鎖に融合されている、項目３または４に記載の多機能性分子。
(項目６)
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号７２を含み、配列番号７１のアミノ酸残基２４～４８の少なくとも部分的な欠失を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目７)
前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインが、配列番号６１および７３～７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号７４について、Ｘが、Ｋ、ＳまたはＮを除く任意のアミノ酸である、項目１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目８)
配列番号７２と前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片との間に少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目９)
配列番号７２と前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片との間にアルファヘリックスモチーフを含む、項目１～５のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目１０)
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目１１)
前記ＶＨが、配列番号３１～３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３８～４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の多機能性分子。
(項目１２)
前記ＶＨが配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号４３のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の多機能性分子。
(項目１３)
前記ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２０、９１または９２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２４または９３を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目１４)
前記ＶＨが、配列番号４４～４９および５７～５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５０～５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１３に記載の多機能性分子。
(項目１５)
前記ＶＨが配列番号４８、５７または５８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号５３または５６のアミノ酸配列を含む、項目１３に記載の多機能性分子。
(項目１６)
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１９、９２、２１、２２、２３および９３のアミノ酸配列を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目１７)
前記ＶＨが配列番号５８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号５６のアミノ酸配列を含む、項目１６に記載の多機能性分子。
(項目１８)
前記ＶＬおよび軽鎖定常領域を含む軽鎖、ならびに前記ＶＨ、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、および前記ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメインを含む重鎖を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目１９)
前記重鎖定常領域が、配列番号５９のアミノ酸配列を含む、項目１８に記載の多機能性分子。
(項目２０)
前記ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する特異性を有し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）抗体またはその断片であって、前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号７～１２または配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含むか、または前記ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２０、９１または９２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２４または９３を含む、抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）抗体またはその断片。
(項目２１)
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１３～１８のアミノ酸配列を含む、項目２０に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２２)
前記ＶＨが、配列番号３１～３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３８～４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２３)
前記ＶＨが配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号４３のアミノ酸配列を含む、項目２１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２４)
前記ＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１９を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２０、９１または９２を含み、前記ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２１を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、前記ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２４または９３を含む、項目２０に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２５)
前記ＶＨが、配列番号４４～４９および５７～５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５０～５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２６)
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤ
Ｒ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１９、９２、２１、２２、２３および９３のアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２７)
前記ＶＨが配列番号５８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号５６のアミノ酸配列を含む、項目２６に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２８)
前記ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号７～１２のアミノ酸配列を含む、項目２０に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目２９)
前記ＶＨが、配列番号２５～２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号２９～３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目３０)
前記ＶＨが配列番号２６、２７または２８のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが配列番号３０のアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片。
(項目３１)
ペプチドリンカーを介して配列番号７２のアミノ酸配列のＮ末端に融合した抗体またはその抗原結合断片を含む、多機能性分子。
(項目３２)
前記ペプチドリンカーは、柔軟性リンカーおよび／またはＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰ（配列番号８９）の置換ペプチドを含み、前記置換ペプチドは配列番号８９とは異なる、項目３１に記載の多機能性分子。
(項目３３)
前記置換ペプチドが、ＩＰＰＨＶＱＸＸＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＸＧＡＶＫＦＰ（配列番号８８）のアミノ酸配列を含み、Ｘが、Ｋ、Ｓ、またはＮを除く任意のアミノ酸である、項目３２に記載の多機能性分子。
(項目３４)
前記置換ペプチドが、配列番号８８と少なくとも５０％の配列同一性を有する、項目３３に記載の多機能性分子。
(項目３５)
前記置換ペプチドが、ＴＡＧＨＴＱＴＳＴＧＧＧＡＩＴＴＧＴＳＧＡＧＨＧＰ（配列番号８７）のアミノ酸配列、または配列番号８７と少なくとも７５％の配列同一性を有するバリアントを含み、前記バリアントが、少なくとも４つのＧを含み、ＰＰジペプチドを含まず、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、ＹおよびＰからなる群から選択される３個以下の疎水性アミノ酸残基を含む、項目３２に記載の多機能性分子。
(項目３６)
前記バリアントが、少なくとも５つのＧと、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、ＹおよびＰからなる群から選択される１個以下の疎水性アミノ酸残基とを含む、項目３５に記載の多機能性分子。
(項目３７)
前記柔軟性リンカーが、Ｓおよび少なくとも５０％のＧを含む、項目３２～３６のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目３８)
前記柔軟性リンカーが、１またはそれを超えるＧＧＧＧＳ（配列番号８６）単位を含む、項目３７に記載の多機能性分子。
(項目３９)
前記抗体またはその抗原結合断片のＣ末端が、配列番号７２のアミノ酸配列のＮ末端から少なくとも２０個のアミノ酸残基である、項目３１～３８のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目４０)
ＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号９０）の配列全体を少なくとも含まない、項目３１～３９のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目４１)
前記抗体またはその断片が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４－１ＢＢ、ＴＩＭ ３、ＯＸ－４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ８、ＣＤ４７およびＣＤ７３からなる群より選択される抗原に特異的である、項目３１～４０のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目４２)
前記抗体またはその断片がＦｃ断片を含む、項目３１～４１のいずれか一項に記載の多機能性分子。
(項目４３)
前記ペプチドリンカーが、前記Ｆｃ断片のＣ末端に融合されている、項目４２に記載の多機能性分子。
(項目４４)
項目１～１９および３１～４３のいずれか一項に記載の多機能性分子または項目２０～３０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその断片をコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチドを含む細胞。
(項目４５)
項目１～１９および３１～４３のいずれか一項に記載の多機能性分子または項目２０～３０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその断片をコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチド。
(項目４６)
項目１～１９および３１～４３のいずれか一項に記載の多機能性分子または項目２０～３０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその断片と、薬学的に適切な担体とを含む組成物。
(項目４７)
がんを処置するための医薬品を製造するための、項目１～１９および３１～４３のいずれか一項に記載の多機能性分子または項目２０～３０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその断片の使用。
(項目４８)
がんの処置を必要とする患者においてがんを処置するための方法であって、有効量の項目１～１９および３１～４３のいずれか一項に記載の多機能性分子または項目２０～３０のいずれか一項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその断片を前記患者に投与することを含む方法。
(項目４９)
前記がんが固形腫瘍である、項目４７に記載の使用または項目４８に記載の方法。
(項目５０)
前記がんが、膀胱がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、白血病、リンパ腫、膵臓がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、乳がん、尿道がん、頭頸部がん、胃腸がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、腎臓がん、黒色腫、前立腺がんおよび甲状腺がんからなる群から選択される、項目４７もしくは４９に記載の使用または項目４８もしくは４９に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】
【外国語明細書】