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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025011242
(43)【公開日】2025-01-23
(54)【発明の名称】誘導平滑筋細胞を得るための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20250116BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20250116BHJP
A61K 35/34 20150101ALI20250116BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20250116BHJP
C07K 14/495 20060101ALN20250116BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
C12N1/00 G
A61K35/34
A61P21/00
C07K14/495
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024179303
(22)【出願日】2024-10-11
(62)【分割の表示】P 2021552231の分割
【原出願日】2020-03-23
(31)【優先権主張番号】19164574.6
(32)【優先日】2019-03-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521244282
【氏名又は名称】インノヴァセル ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】110003063
【氏名又は名称】弁理士法人牛木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】トーナー，マルコ
(72)【発明者】
【氏名】マークシュタイナー，ライナー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AC14
4B065BA25
4B065BB19
4B065BD39
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZA94
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA01
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA72
(57)【要約】 （修正有）
【課題】本発明は、誘導平滑筋細胞（ｉＳＭＣ）を得るための方法、得られたｉＳＭＣ、疾患や障害を治療する方法に使用するためまたは組織工学に使用するためのｉＳＭＣ、およびｉＳＭＣを得るための骨格筋由来の細胞の使用を提供する。
【解決手段】誘導平滑筋細胞（ｉＳＭＣ）を取得するためのインビトロまたはエクスビボの方法であって、
（ａ）対象から骨格筋由来細胞を取得するステップ、
（ｂ）ＴＧＦ-ベータ、特にＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ２および／またはＴＧＦｂ３、より好ましくはＴＧＦｂ１および／またはＴＧＦｂ３、最も好ましくはＴＧＦｂ１、およびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって骨格筋由来細胞を分化転換させてｉＳＭＣを得るステップを含む方法、とする。
【選択図】なし
【解決手段】誘導平滑筋細胞（ｉＳＭＣ）を取得するためのインビトロまたはエクスビボの方法であって、
（ａ）対象から骨格筋由来細胞を取得するステップ、
（ｂ）ＴＧＦ-ベータ、特にＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ２および／またはＴＧＦｂ３、より好ましくはＴＧＦｂ１および／またはＴＧＦｂ３、最も好ましくはＴＧＦｂ１、およびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって骨格筋由来細胞を分化転換させてｉＳＭＣを得るステップを含む方法、とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
誘導平滑筋細胞（iSMC）を取得するためのインビトロまたはエクスビボの方法であって、
（ａ）対象から骨格筋由来細胞を取得するステップ、
（ｂ）TGF-ベータ、特にTGFb1、TGFb2および／またはTGFb3、より好ましくはTGFb1および／またはTGFb3、最も好ましくはTGFb1、およびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって骨格筋由来細胞を分化転換させてiSMCを得るステップ
を含む方法。
（ａ）対象から骨格筋由来細胞を取得するステップ、
（ｂ）TGF-ベータ、特にTGFb1、TGFb2および／またはTGFb3、より好ましくはTGFb1および／またはTGFb3、最も好ましくはTGFb1、およびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって骨格筋由来細胞を分化転換させてiSMCを得るステップ
を含む方法。
【請求項2】
ステップ（ｂ）で得られたiSMCは、非融合コンピテントであり、および／またはaSMA、CD49a、およびCD146の陽性発現によって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
骨格筋由来細胞は、CD56およびデスミンの陽性発現、およびCD34の陰性発現によって特徴付けられる筋形成前駆細胞（MPC）であり、
あるいは、骨格筋由来細胞は、CD105、CD73の陽性発現、およびCD34およびCD56の陰性発現によって特徴付けられる間葉系間質細胞（MSC）である、請求項１または２に記載の方法。
あるいは、骨格筋由来細胞は、CD105、CD73の陽性発現、およびCD34およびCD56の陰性発現によって特徴付けられる間葉系間質細胞（MSC）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ステップ（ｂ）においてMPCから得られたiSMCは、aSMA、CD49a、デスミン、CD56、およびCD146の陽性発現、およびCD34の陰性発現によって特徴付けられ、
ステップ（ｂ）においてMSCから得られたiSMCは、aSMA、CD49aおよびCD146の陽性発現、およびCD56の陰性発現によって特徴付けられる、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
ステップ（ｂ）においてMSCから得られたiSMCは、aSMA、CD49aおよびCD146の陽性発現、およびCD56の陰性発現によって特徴付けられる、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
ステップ（ａ）の後に、骨格筋由来細胞を増殖させて、好ましくは20～40×106個の細胞を受け取ることを含むステップ（ａ１）が行われる、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
ステップ（ｂ）は、１日から６日間行われる、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
請求項１～６のいずれかに記載の方法によって得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）。
【請求項8】
aSMA、デスミン、CD56、CD49aおよびCD146の陽性発現、およびCD34の陰性発現によって特徴付けられるMPCから得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）。
【請求項9】
aSMA、CD49aおよびCD146の陽性発現、およびCD56の陰性発現によって特徴付けられるMSCから得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）。
【請求項10】
iSMCは、機能的なカルシウムおよび／またはカリウムチャネルを発現する請求項７～９のいずれかに記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）。
【請求項11】
対象の疾患または障害を治療する方法で使用するための請求項７～１０のいずれかに記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）。
【請求項12】
疾患または障害は、好ましくは、肛門失禁、尿失禁、逆流症、胃不全麻痺、過活動性および過活動性の膀胱からなる群から選択される平滑筋欠損症である、請求項１１に記載の誘導平滑筋細胞。
【請求項13】
平滑筋欠損症は、括約筋の欠損症である請求項１１または１２に記載の誘導平滑筋細胞。
【請求項14】
組織工学または細胞治療で使用するための請求項７～１０のいずれかに記載の誘導平滑筋細胞。
【請求項15】
誘導平滑筋細胞を得るための骨格筋由来細胞の使用。
【請求項16】
骨格筋由来細胞は、CD56、およびデスミンの陽性発現、およびCD34の陰性発現によって特徴付けられる筋形成前駆細胞（MPC）であり、あるいは、骨格筋由来細胞は、CD105、CD73、CD90の陽性発現、およびCD34およびCD56の陰性発現によって特徴付けられる間葉系間質細胞（MSC）である、請求項１５に記載の骨格筋由来細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、誘導平滑筋細胞（iSMC）を得るための方法、iSMC、疾患や障害を治療する方法に使用するためまたは組織工学に使用するためのiSMC、およびiSMCを得るための骨格筋由来の細胞の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
例えば、括約筋における平滑筋の変性は、便失禁などの衰弱性疾患を引き起こす可能性がある。骨格筋由来細胞（SMDC）は、外肛門括約筋や尿道括約筋などの骨格筋括約筋の再生のために診療所で効果的に使用されてきた。しかし、SMDC由来の平滑筋細胞のインビトロの平滑筋分化およびインビボの平滑筋再生能についてはほとんど知られていない。
【0003】
括約筋は、固体および／または液体の動きを制御する円形の筋肉であり、外肛門括約筋などの骨格筋、または内肛門括約筋や幽門括約筋などの平滑筋のいずれかからなる（Al-Ali et al., 2009; Ramkumar & Schulze, 2005）。肛門と幽門の括約筋の機能不全は、それぞれ大便失禁と胃不全麻痺に関連している（Abrahamsson, 2007; Rao, 2004）。内肛門括約筋の平滑筋の変性は、大便失禁の主なタイプである受動的便失禁の既知の原因であり（Vaizey et al., 1997）、すべての便失禁患者の78％に影響を及ぼしている（Mimura et al., 2004）。生命を脅かすものではないものの、便失禁は患者の生活の質に深刻な影響を及ぼし（Meyer & Richter, 2015）、男性と女性の有病率は最大12％である（Goode et al., 2005; Quander et al., 2005）。バルキング剤の適用などの保存的治療は、失禁の重症度が高い患者での成功は限られており、外科的アプローチは罹患率と合併症の発生率が高い（J. Y. Wang & Abbas, 2013）。
【0004】
平滑筋組織の機能は、平滑筋アクチンアルファ（aSMA）、デスミン、スムーセリン（SMTN）などの収縮性タンパク質を発現する高度に分化した平滑筋細胞の存在に依存し（Capetanaki et al., 1997; van Eys et al., 2007; J. Wang et al., 2006）、機能的電位依存性のカルシウムとカリウムのチャネルにも依存して、調節された細胞収縮の誘導を可能にする（Sanders, 2008）。平滑筋欠損症の治療のための同様の細胞の分離と使用は、有望な治療オプションかもしれない。しかし、現在、平滑筋細胞療法は市場に出回っていない。欠損した平滑筋組織を再生することができる平滑筋細胞の単離は、これらの細胞の臨床使用に取り組むための最初の前提条件である。平滑筋細胞を誘導するための最先端の方法は、供給源としての平滑筋組織の使用である。これらの一次平滑筋細胞は、受動的糞便失禁動物モデルの平滑筋再生に効果的に使用された（Bohl et al., 2017）が、一次平滑筋細胞は、生きているヒトでは自家移植治療にほとんど利用できず、本質的に不均一であり、増殖能力が制限される可能性があり（Sandison & McCarron, 2015）、したがって、ヒトの平滑筋再生の細胞治療候補としての資格はほとんどない。したがって、平滑筋細胞に分化する準備ができている高度に増殖性の幹／前駆細胞の使用にアプローチした。
【0005】
多能性間葉系幹細胞（MSC）や人工多能性幹細胞（iPSC）などの幹細胞／前駆細胞は、平滑筋系統への分化転換能（Bajpai et al., 2012; Park et al., 2013）と、インビボでの平滑筋再生能（Li et al., 2016）を秘めていることが示されている。iPSCは特にインビトロでの平滑筋分化能と機能性において有望であり（Bajpai et al., 2012）、iPSC由来の平滑筋前駆細胞は、インビボで尿道括約筋再生能を示しました（Li et al., 2016）が、遺伝的不安定性や奇形腫形成などの、安全性への懸念は、それらの有用性を制限している（Jung et al., 2012）。成人のMSC由来の細胞製品は、大多数の臨床試験で大きな健康上の懸念を引き起こさなかった（Y. Wang et al., 2012）。しかし、平滑筋の再生におけるそれらの臨床効果はとらえどころのないままである。
【0006】
骨格筋組織は、MSCや衛星細胞由来の筋形成前駆細胞などの幹細胞および前駆細胞の供給源であることが判明しており、どちらも高度に再生すると予想されている（(Yin et al., 2013）。CD56陽性細胞が豊富な骨格筋由来細胞（SMDC）は、診療所での便失禁に関連する外肛門括約筋の衰弱を改善することが示されている（A. Frudinger et al., 2010, 2015; Andrea Frudinger et al., 2018）。さらに、骨格筋由来の細胞が膀胱排尿筋に生着し、膀胱機能を改善することが見出された（Huard et al., 2002）。しかし、平滑筋細胞の分化と単離、またはインビボでのそれらの再生能力に関するSMDCに関する知識は限られており（Lu et al., 2011）、括約筋平滑筋の再生のためのSMDC由来の平滑筋細胞（誘導平滑筋細胞）の治療可能性を評価した研究はない。
【0007】
平滑筋組織の再生のための細胞治療アプローチは、非常に望ましく、平滑筋再生に有能な細胞の使用に依存している。従来技術の方法の欠点を考慮して、平滑筋細胞を提供するための新しい方法が必要とされている。
【0008】
Frudinger et al. (2018)は、Frudinger et al. (2018)の図６に示されているように、SMDCと呼ばれるCD56+骨格筋由来細胞の分離を教示している（Andrea Frudinger et al., 2018）。前記細胞は、とりわけ、本開示の図１５に示されるように、aSMA、CD49a、CD146ａの陰性発現によって特徴付けられる。さらに、Frudinger et al. (2018)に記載されているように、SMDCは、Pax-7の陽性発現によって特徴付けられる（Andrea Frudinger et al., 2018）。Frudinger et al. (2018)に記載されているSMDCは、骨格筋原生形成性であり、すなわち、それらは多核筋管に融合することができる。
【0009】
EP 2 206 774 A1は、筋肉組織、より具体的には骨格筋組織および／または心筋組織、好ましくは筋内膜および／または心臓組織からの単離によって得られる分化能力を有する細胞集団に関する（Marolleau et al., 2010）。EP 2 206 774 A1の細胞集団は、ALDH陽性細胞を含み、特に筋原性および／または脂肪生成性および／または骨形成性の分化能を有している。特に、EP 2 206 774 A1は、EP 2 206 774 A1の表１、表３、図８に示されているように、すべてCD146-である、ALDH+/CD34-セル、ALDH+/CD34+セル、およびSMALD/34+セルを開示している。さらに、EP 2 206 774A1は、SMALD/34-セルを開示している。上記の細胞は、EP 2 206 774 A1の図３に示されているように、CD146+であって融合コンピテントである。
【0010】
Lecourt S et al. (2010)は、ヒトの骨格筋が潜在的な治療の見通しを持つ様々な細胞前駆細胞の本質的な源であることを調ベている。一方では、CD49a-およびCD49e +であるCD56+セルが記載されている。他方、CD146-およびSMA-であるCD56-細胞が記載されている（Lecourt et al., 2010）。
【0011】
Thurner et al. (2018)は、ヒト骨格筋由来細胞のインビトロ効力アッセイの開発を開示している。特に、CD56+とCD56-の両方の骨格筋由来細胞（SMDC）の分離について説明されている。本開示の図１５に示されているように、Thurner et al. (2018)に記載されたCD56+とCD56-の両方のSMDCは、aSMA-、CD146-およびCD49a-である。さらに、Thurner et al. (2018)の図２ａに示されているように、CD56+細胞は>1000 mUrel/gのAChE活性を有している。
【発明の概要】
【0012】
本発明の根底にあるのは、対象の疾患または障害を治療する方法で使用するのに安全かつ効果的なiSMCを取得する方法を提供するための技術的問題である。本発明の根底にあるさらなる技術的問題は、平滑筋組織の再生に使用するのに安全かつ効果的な細胞の提供である。
【0013】
この技術的問題は、特許請求の範囲で定義された主題によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数を参照することによってよりよく理解される。
【図1】［図１は、骨格筋由来のMPCおよびMSCの分化能に応じた特性評価を示す。]MPCおよびMSCの分化能は、それぞれの分化培地で培養することにより脂肪生成、軟骨形成、骨形成および骨格筋形成系統へのインビトロでの分化後に評価され、オイルレッドｏ（脂肪細胞）、アルシアンブルー（軟骨細胞）、アリザリンレッドｓ（骨細胞）、抗デスミン／ヘキスト（核および筋細胞）染色によって、それぞれ検出された。少なくとも３つの個別の調製品のうちの代表的な画像（スケールバー＝100μm）が示されている（Ａ）。オイルレッドｏ、アルシアンブルーまたはアリザリンレッドｓ染色のフィールドごとの平均染色強度の計算による、または少なくとも３つの個別サンプルの融合指数計算による、MSCおよびMPCの脂肪生成、軟骨形成、骨形成、および骨格筋形成分化能の定量化が、それぞれ示されている（Ｂ）。データは、少なくとも３つの個別の筋生検からのMPCおよびMSCの平均±SDとして表されている。統計的比較は、対応のないｔ検定によって実行された（p<0.05が有意と見なされる）。
【図2】［図２は、骨格筋由来のMPCとMSC、およびそれらに由来するiSMCの細胞表面マーカー発現による特性評価を示す。］骨格筋由来のMPCとMSC、およびそれらに由来するiSMCにおける、間葉系（CD105、90、73）、筋原性（CD56）、造血（CD34）および平滑筋系統マーカー（CD146およびCD49a）の表面発現は、それぞれ少なくとも３つの個別のヒト骨格筋生検から、フローサイトメトリーによって評価された。対照として、平滑筋系統マーカーCD146およびCD49aの発現が、ヒト膀胱由来の平滑筋細胞（hBd-SMC）の集団で示されている。データは平均±SEMとして表されている。
【図3】［図３は、SMDC（MPCおよびMSC）およびiSMCにおける細胞内マーカーの発現を示す。］MPCとMSC、およびそれらに由来するiSMCにおける一般的な筋原性（デスミン）および平滑筋筋原性（aSMA、スムーセリン）マーカーの検出は、免疫細胞化学によって行われ、代表的な画像（スケールバー＝100μm）が示されている（Ａ）。MPC、MSC、およびそれらに由来するiSMC内の、aSMA、スムーセリン、またはデスミンに陽性の細胞の百分率は、少なくとも３つの個別のヒト筋生検から、培養物の免疫細胞化学画像上の対応するマーカー発現細胞の定量化によって評価された（Ｂ）。データは平均±SEMとして表されている。
【図4】［図4は、SMDC（MPCおよびMSC）からiSMCへの分化転換中の遺伝子発現の変化を示す。］遺伝子発現の変化は、成長培地（MSCとMPC）または平滑筋分化培地（MSC-iSMCとMPC-iSMC）でそれぞれ６日間培養され、２つの個別のヒト筋生検に由来する、MSCとMPCからMSC-iSMCとMPC-iSMCへのマイクロアレイ分析によって評価された。ｋ平均法によって得られた、iSMCの分化時のMSCとMPCの両方で同様にアップレギュレート（Ａ）またはダウンレギュレート（Ｂ）された遺伝子のクラスターがヒートマップに示されている。アスタリスク（*）は、両方の細胞タイプで、アップレギュレート（log2 FC≧1）またはダウンレギュレート（log2 FC≦-1）のいずれかがされた遺伝子に付している。統計的比較は、0.05未満のｐ値を有意と見なしたカイ２乗検定によって実行された。遺伝子発現の変化の結果を（C）に示す。
【図5】［図５は、MPCとiSMCの融合能力を示す。］筋管の形成（融合能力）は、核の可視化のためのHoechst33342染色に続く蛍光顕微鏡によって観察された。画像に基づいて、融合指数（FI）（Ａ）およびチューブあたりの核の数が決定された（Ｂ）。少なくとも３つの核を持つ細胞をチューブとして数えた。測定値は、MPCとそれに由来するiSMCの間で比較された。
【図6】［図６は、MPCからiSMCへの分化転換中の機能性イオンチャネルの形成を示す。］MPCおよびそれに由来するiSMC、ならびに膀胱由来の平滑筋細胞（hBd-SMC）における電位依存性の内向きカルシウム（Ａ）および外向きカリウム電流（Ｂ）の分析である。MPC、iSMC（MPCに由来）およびhBd-SMCの少なくとも３つの細胞のそれぞれのインピーダンス－電位（I-V）曲線は、iSMC（MPCに由来）およびhBd-SMCに機能的なCav（Ａ）およびKv（Ｂ）チャネルが存在し、MPCには存在しないことを示している。
【図7】［図７は、コラーゲンゲル格子におけるSMDCとiSMCの収縮性を示す。］SMDC（MSCおよびMPC）、それに由来するiSMC、および膀胱由来の平滑筋細胞（hBd-SMC）の収縮性は、コラーゲンゲル格子収縮によって定量化された。本発明のステップ（ａ）によって得られた細胞（MPCまたはMSC）および本発明のステップ（ｂ）によってiSMCへの分化転換によって得られた細胞、ならびに対照のヒト膀胱由来の平滑筋細胞（hBd-SMC）の、48時間以内の元のサイズからのゲル収縮率を棒グラフ（Ａ）として示す。少なくとも３つの個別のヒト筋生検またはhBd-SMC分析のそれぞれからの細胞調製物の平均±SEMとしてデータを示す。24ウェルプレートのウェル内における、埋め込まれたMSCとMSCおよびそれぞれそれらに由来するiSMC、ならびにhBd-SMCを含むコラーゲンゲルの代表的な立体顕微鏡画像（B）である。
【図8】［図８は、mMPC由来のiSMCの平滑筋細胞表現型とインビボでの平滑筋組織へのそれらの生着を示す。］マウスMPCに由来するiSMCにおけるデスミン陽性細胞およびaSMA陽性細胞の百分率を棒グラフとして示す（Ａ）。インビボイメージングによる蛍光ビーズおよび無傷の幽門括約筋における局在化を発現するTdTomato導入遺伝子の蛍光シグナル検出（Ｂ）を示す。移植されたiSMCの、アルファ平滑筋アクチン（aSMA）タンパク質発現、TdTomato発現、およびTdTomatoとaSMAタンパク質のオーバーレイ（MERGE）は、移植後12週間の幽門括約筋組織切片で免疫組織化学によって検出された。各画像の核の対比染色は、DAPIによって行われた。n＝8の注射されたマウスの代表的な画像を示す（Ｃ）。
【図9】［図９は、組織リングの光学および走査型電子顕微鏡画像を示す。］異なる倍率でのアガローステンプレートの中央ポストの周りに配置されたMPC由来のiSMCの３D培養によって得られた組織リングの光学顕微鏡画像である（ＡおよびＢ）。異なる倍率でのMPC由来のiSMCの3D培養によって得られた組織リングの走査型電子顕微鏡画像である（ＣおよびＤ）。
【図10】［図１０は、蛍光抗体法によるSMDCおよびiSMC由来の組織リングにおける収縮性タンパク質の発現を示す。］一般的な筋原性（デスミン）および平滑筋筋原性（aSMA）マーカーの免疫蛍光染色と、MPCおよびそれに由来するiSMCの３D培養から得られた組織リングの凍結切片で行われた核対比染色（Hoechst）である。
【図11】［図１１は、組織リングの透過型電子顕微鏡画像を示す。］iSMCの３D培養によって得られた超薄切片組織リングの透過型電子顕微鏡によって得られた画像は、2つの隣接する細胞の細胞膜上のカベオラ（矢印の先）（ＡおよびＢ）、細胞質内の豊富な糸状構造（Ｃ）およびフィラメントが蓄積された高密度体（矢印）（Ｄ）を示す。
【図12】［図１２は、SMDC（MPCとMSC）からiSMCへの分化転換中の遺伝子発現の変化の定量化を示す。］遺伝子発現の変化は、MSCとMPCからMSC-iSMCとMPC-iSMCへのマイクロアレイ分析によって評価されたが、それらは成長培地（MSCとMPC）または平滑筋分化培地（MSC-iSMCとMPC-iSMC）でそれぞれ６日間培養され、２つの個別のヒト筋生検に由来する。MSCとMPCの間の平滑筋の分化を比較するために、MSC対MSC-iSMC（MSC）およびMPC対MPC-iSMC（MPC）のサンプルにおける平滑筋関連遺伝子のLog2倍の変化を示す。アスタリスク（＊）は、アップレギュレート（Log2≧1）またはダウンレギュレート（Log2≦-1）されている遺伝子を示す。
【図13】［図１３は、実施例１５による、抗CD49e抗体染色およびアイソタイプ対照染色されたマウスMPC-iSMCのフローサイトメトリー分析を示す。］IgG1アイソタイプ対照（Ａ）および抗CD49e（Ｂ）の陽性MPC-iSMCのドットプロットは、それぞれ0.14％の対照陽性細胞および9.5％のCD49e陽性細胞を示している。
【図14】［図１４は、MPCおよびMPC-iSMCのAChEおよびCK活性分析を示し、これにより、骨格筋分化培地（SKDiff）での細胞培養の前後の酵素活性が測定された。］AChE活性（Ａ）とCK活性（Ｂ）を測定し、骨格筋分化培地（SKDiff）で６日間培養する前後に、MPCとMPC-iSMCでそれぞれ比較を行った。データは、少なくとも３つの個別のヒト筋生検に由来する細胞の平均±SEMとして表した。統計分析は、p<0.05を有意と見なして、対応のあるｔ検定によって行なわれた。
【図15】［図１５は、本明細書に記載されている異なる細胞型の特性およびマーカー発現の概要を示す。］CD56+のSMDCおよびCD56-のSMDC（Thurner et al 2018）およびSMDC（Frudinger et al. 2018）は、実施例１８に記載されているようにして取得した。ＭPCおよびMSCは、実施例１に記載されているようにして取得した。MPC-iSMCおよびMSC-iSMCは、実施例２に記載されているようにして取得した。試験した細胞集団の細胞の少なくとも50％がそれぞれの細胞マーカーを発現した場合、特定のマーカーの発現は「＋」として示されている。試験した細胞集団の細胞の50％未満がそれぞれの細胞マーカーを発現した場合、特定のマーカーの発現は「－」として示されている。特定の細胞集団のAChE酵素活性は、細胞集団が実施例１７に従って測定された少なくとも1000mUrel/mgタンパク質のAChE活性を有する場合、「＋」として示されている。特定の細胞集団のAChE酵素活性は、細胞集団が実施例１７に従って測定された1000mUrel/mgタンパク質未満のAChE活性を有する場合、「－」として示されている。特定の細胞集団のCK酵素活性は、細胞集団が実施例１７に従って測定された少なくとも100mUrel/mgタンパク質のCK活性を有する場合、「＋」として示されている。特定の細胞集団のCK酵素活性は、細胞集団が実施例１７に従って測定された100mUrel/mgタンパク質未満のCK活性を有する場合、「－」として示されている。
【発明を実施するための形態】
【0015】
特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語と併せて使用される場合の「１つの」という単語の使用は、「１つ」を意味する場合があるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つ以上」の意味とも一致する。
【0016】
「約」という用語は、記載された値、記載された値のプラスマイナス５％、または所与の値の測定値の標準誤差が考慮されることを意味する。
【0017】
本明細書で使用される「肛門失禁」という用語は、放屁、液体または固体の便など、肛門を介した腸内容物の望ましくない喪失を指す。この用語は、全部で３つの重大度グレード：グレード１＝気体のみ、グレード２＝液体および軟便、グレード３＝固体の形のある便：で構成される。
【0018】
本明細書で使用される「肛門括約筋」または「肛門括約筋組織」という用語は、特に、肛門挙筋の一部としての外肛門括約筋および恥骨直腸筋を指す。ただし、恥骨尾骨筋、尾骨筋、腸骨尾骨筋と陰部神経も含まれる。
【0019】
「骨格筋由来細胞」または「SMDC」という用語は、例えば、筋芽細胞のような融合コンピテントセル、または、例えば、多能性間葉系間質細胞のような非融合コンピテントセル、を含む骨格筋組織から得られた細胞を指し、これは、初代細胞および／またはインビトロの培養細胞、あるいは筋原性または多分化能を有する他の細胞（例えば、脂肪吸引組織または骨髄などの組織を含む他の幹細胞からの）である可能性がある。この用語はまた、単離され、平滑筋細胞への分化に使用され得る脂肪に由来する細胞を含む。「骨格筋由来細胞」または「SMDC」という用語は、筋肉組織から単離された細胞集団も指す。
【0020】
「ヒト膀胱由来平滑筋細胞（hBd-SMC）」という用語は、ヒト膀胱からの平滑筋細胞を含む細胞の集団を指す。hBd-SMCは、PromoCell（登録商標）（カタログ番号：C-12571）から市販されており、本発明において骨格筋由来細胞に由来するiSMCによって得られると予測される平滑筋細胞の表現型および機能的特徴を表す。
【0021】
本明細書で使用される「注射」という用語は、注射装置から人体内の特定の部位、特に肛門失禁を提供する筋肉組織へ、またはそれに隣接して、上記の細胞を含む注射溶液を排出することを指す。注射プロセスは、静的、すなわち注射装置が到達した位置に留まる、であり得るが、これに限定されない。あるいは、注射プロセスは動的である。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、注射は、注射部位からの注射装置の収縮と同時に起こる。
【0022】
本明細書で使用される「注射部位」という用語は、注射プロセスが開始される、肛門失禁を提供する筋肉組織の近くまたは筋肉組織であるなど、人体内の部位を指す。注射部位は、注射プロセスが終了する部位と同一である必要はない。
【0023】
本明細書で使用される「注射装置」という用語は、目的の注射部位に到達するためにヒト組織に突き刺さるのに適し、溶液、特に筋肉由来細胞を含む溶液を目的の注射部位に送達することができる任意の装置を指す。
【0024】
本明細書で使用される「便失禁」という用語は、肛門を介した液体または形のある便の望ましくない喪失のみを指す。
【0025】
本明細書で使用される「受動的失禁」という用語は、便の喪失の感覚的認識の欠如を指す。これは、内肛門括約筋平滑筋の欠陥、および／または、肛門および直腸粘膜の感覚能力の欠如による、低い肛門ベースライン圧力値を含む。
【0026】
本明細書で使用される「CD56+」または「CD56陽性」という用語は、細胞マーカーCD56を発現する細胞を指す。「CD56+」または「CD56陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーCD56を発現する。
【0027】
本明細書で使用される「CD56-」または「CD56陰性」という用語は、細胞マーカーCD56を発現しない細胞を指す。「CD56-」または「CD56陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーCD56を発現する。
【0028】
本明細書で使用される「多能性」という用語は、少なくとも脂肪生成、軟骨形成、および骨形成の系統に対するインビトロ分化能によって特徴付けられる間葉系細胞の分化能を指す。
【0029】
本明細書で使用される「オリゴポテント」という用語は、平滑筋、横紋筋、および心筋などの筋原性系統に限定されるインビトロ分化能によって特徴付けられる間葉系細胞の分化能を指す。
【0030】
本明細書で使用される「間葉系細胞」という用語は、CD105、CD90、およびCD73に対して陽性であり、CD14、CD19、CD34、CD45およびHLA-DR（MHCII）に対して陰性である細胞を指す。
【0031】
本明細書で使用される「CD34+」または「CD34陽性」という用語は、細胞マーカーCD34を発現する細胞を指す。「CD34+」または「CD34陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーCD56を発現する。
【0032】
本明細書で使用される「CD34-」または「CD34陰性」という用語は、細胞マーカーCD34を発現しない細胞を指す。「CD34-」または「CD34陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーCD34を発現する。特に好ましい実施形態では、「CD34-」または「CD34陰性」という用語は、異なる細胞を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の多くても19、10、５、４、３、２、１または０パーセントが細胞マーカーCD34を発現する。
【0033】
本明細書で使用される「CD146+」または「CD146陽性」という用語は、細胞マーカーCD146を発現する細胞を指す。「CD146+」または「CD146陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーCD146を発現する。
【0034】
本明細書で使用される「CD146-」または「CD146陰性」という用語は、細胞マーカーCD146を発現しない細胞を指す。「CD146-」または「CD146陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーCD146を発現する。
【0035】
本明細書で使用される「CD49a+」または「CD49a陽性」という用語は、細胞マーカーCD49aを発現する細胞を指す。「CD49a+」または「CD49a陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーCD146を発現する。
【0036】
本明細書で使用される「CD49a-」または「CD49a陰性」という用語は、細胞マーカーCD49aを発現しない細胞を指す。「CD49a-」または「CD49a陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーCD49aを発現する。
【0037】
本明細書で使用される「CD49a-」または「CD49a陰性」という用語は、細胞マーカーCD49aを発現しない細胞を指す。「CD49a-」または「CD49a陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーCD49aを発現する。
【0038】
本明細書で使用される「CD73+」または「CD73陽性」という用語は、細胞マーカーCD73を発現する細胞を指す。「CD73+」または「CD73陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーCD73を発現する。
【0039】
本明細書で使用される「CD73-」または「CD73陰性」という用語は、細胞マーカーCD73を発現しない細胞を指す。「CD73-」または「CD73陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーCD73を発現する。
【0040】
本明細書で使用される「CD90+」または「CD90陽性」という用語は、細胞マーカーCD90を発現する細胞を指す。「CD90+」または「CD90陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーCD90を発現する。
【0041】
本明細書で使用される「CD90-」または「CD90陰性」という用語は、細胞マーカーＣＤ90を発現しない細胞を指す。「CD90-」または「CD90陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーCD90を発現する。
【0042】
本明細書で使用される「CD105+」または「CD105陽性」という用語は、細胞マーカーCD105を発現する細胞を指す。「CD105+」または「CD105陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーCD105を発現する。
【0043】
本明細書で使用される「CD105-」または「CD105陰性」という用語は、細胞マーカーCD105を発現しない細胞を指す。「CD105-」または「CD105陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーCD105を発現する。
【0044】
本明細書で使用される「aSMA+」または「aSMA陽性」という用語は、細胞マーカーaSMAを発現する細胞を指す。「aSMA+」または「aSMA陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーaSMAを発現する。
【0045】
本明細書で使用される「aSMA-」または「aSMA陰性」という用語は、細胞マーカーaSMAを発現しない細胞を指す。「aSMA-」または「aSMA陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーaSMAを発現する。
【0046】
本明細書で使用される「デスミン陽性」または「デスミン＋」という用語は、細胞マーカーデスミンを発現する細胞を指す。「デスミン陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーデスミンを発現する。
【0047】
本明細書で使用される「デスミン陰性」または「デスミン-」という用語は、細胞マーカーであるデスミンを発現しない細胞を指す。「デスミン陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用することができ、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーデスミンを発現する。
【0048】
本明細書で使用される「スムーセリン陽性」または「スムーセリン+」という用語は、細胞マーカースムーセリンを発現する細胞を指す。「スムーセリン陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカースムーセリンを発現する。
【0049】
本明細書で使用される「スムーセリン陰性」または「スムーセリン-」という用語は、細胞マーカースムーセリンを発現しない細胞を指す。「スムーセリン陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用することができ、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカースムーセリンを発現する。
【0050】
本明細書で使用される「融合コンピテント」または「骨格筋形成」という用語は、骨格筋分化培地で5～7日間培養した後、多核筋管内の核の少なくとも50、60、70、80、90または100パーセントが多核筋管に融合することができる細胞を指す。
【0051】
本明細書で使用される「非融合コンピテント」または「非骨格筋形成」という用語は、骨格筋分化培地で5～7日間培養した後、多核筋管内の核の50％未満または多くても49、30、20、10または0パーセントが多核筋管に融合することができない細胞を指す。
【0052】
本明細書で使用される「骨格筋分化培地」という用語は、多核融合コンピテントセルまたは例えば筋芽細胞のような筋形成細胞において、融合を誘導する細胞培養培地を指す。しかしながら、前記用語は、多核融合コンピテントセルまたは筋形成細胞がそれぞれの誘導なしに融合することができる場合に、融合の誘導に必要な物質を含まない細胞培養培地も指す。
【0053】
本明細書で使用される「平滑筋分化培地」という用語は、細胞の平滑筋表現型への分化転換を誘導する細胞培養培地を指す。しかしながら、前記用語は、細胞がそれぞれの誘導なしに分化転換することができる場合に、分化転換の誘導に必要な物質を含まない細胞培養培地も指す。
【0054】
本明細書で使用される「細胞増殖培地」という用語は、SMDCなどの哺乳動物細胞のインキュベーションに適した任意の培地を指し、これにより、インキュベーション容器の表面への前記哺乳動物細胞の付着およびそれらの増殖が可能になる。
【0055】
本明細書で使用される「収縮性」という用語は、48時間以内の初期ゲルサイズからの少なくとも40％のコラーゲンゲル格子収縮を指す。
【0056】
本明細書で使用される「非収縮性」という用語は、48時間以内の初期ゲルサイズからの40％未満のコラーゲンゲル格子収縮を指す。
【0057】
「TGF-ベータ」という用語は、３つの異なるアイソフォーム（TGF-β1、2、および3）およびすべての白血球系統によって生成される他の多くのシグナル伝達タンパク質を含む、トランスフォーミング成長因子スーパーファミリーに属する多機能サイトカインである、トランスフォーミング成長因子ベータに使用される。「TGF-ベータ」という用語は、「TGF-β」、「TGF-b」、「TGFb」、および「TGFB」という用語と同義語として使用される。
【0058】
本明細書で使用される「AChE陽性」または「AChE+」という用語は、例えば、本明細書の実施例に記載されているように、平滑筋分化培地で培養された細胞で測定された細胞タンパク質の1mgあたり少なくとも1×103mUrelのアセチルコリンエステラーゼ酵素活性を指す。あるいは、アセチルコリンエステラーゼ酵素活性は、例えば、Thurner et al., 2018に記載されているような、当技術分野で知られている任意の試験によって試験することができる。
【0059】
本明細書で使用される「CK陽性」または「CK+」という用語は、例えば、本明細書の実施例に記載されているように、平滑筋分化培地で培養された細胞で測定された細胞タンパク質の1mgあたり少なくとも1×102mUrelのクレアチンキナーゼ活性を指す。あるいは、クレアチンキナーゼ活性は、例えば、Thurner et al., 2018に記載されているような、当技術分野で知られている任意の試験によって試験することができる。
【0060】
本明細書で使用される「CK陰性」または「CK-」という用語は、例えば、本明細書の実施例に記載されているように、平滑筋分化培地で培養された細胞で測定された細胞タンパク質の1mgあたり1×102mUrel未満のクレアチンキナーゼ酵素活性を指す。あるいは、クレアチンキナーゼ活性は、例えば、記載されているような、または当業者が分析を行うような、当技術分野で知られている任意の試験によって試験することができる（Thurner et al. 2018）。
【0061】
本明細書で使用される「CD49e+」または「CD49e陽性」という用語は、細胞マーカーＣD49eを発現する細胞を指す。「CD49e+」または「CD49e陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーCD49eを発現する。
【0062】
本明細書で使用される「CD49e-」または「CD49e陰性」という用語は、細胞マーカーCD49eを発現しない細胞を指す。「CD49e-」または「CD49e陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーCD49eを発現する。
【0063】
本明細書で使用される「Pax-7+」または「Pax-7陽性」という用語は、転写因子Pax-7を発現する細胞を指す。「Pax-7+」または「Pax-7陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーPax-7を発現する。
【0064】
本明細書で使用される「Pax-7-」または「Pax-7陰性」という用語は、細胞マーカーPax-7を発現しない細胞を指す。「Pax-7-」または「Pax-7陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の50％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントの細胞マーカーPax-7を発現する。
【0065】
本明細書で使用される「SSEA4+」または「SSEA4陽性」という用語は、細胞表面マーカーSSEA4を発現する細胞を指す。「SSEA4+」または「SSEA4陽性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の少なくとも50、60、70、80、90、95、98または99パーセントが細胞マーカーSSEA4を発現する。
【0066】
本明細書で使用される「SSEA4-」または「SSEA4陰性」という用語は、細胞表面マーカーSSEA4を発現しない細胞を指す。「SSEA4-」または「SSEA4陰性」という用語は、異なる細胞型を含む細胞集団にも使用でき、好ましくは、細胞集団の0％未満または多くても49、40、30、20、10、5、4、3、2、1または0パーセントが細胞マーカーSSEA4を発現すする。
【0067】
本明細書で使用される「MPC」という用語は、筋形成前駆細胞を指す。特に、「MPC」という用語は、aSMA、CD49a、およびCD146の陰性の発現によって特徴付けられる筋形成前駆細胞を指す。MPCは骨格筋原性であり、多能性ではない。MPCは、CD105、CD90、CD73、CD56、デスミン、ACHEおよび／またはCKの陽性の発現、および／または、CD34の陰性の発現によってさらに特徴付けられることがある。MPCの特性の例を図１５に示す。
【0068】
本明細書で使用される「MSC」という用語は、間葉系間質細胞を指す。特に、「MSC」という用語は、aSMA、CD49a、及びCD146の陰性の発現によって特徴付けられる間葉系間質細胞を指す。MSCは、非融合コンピテントであって、骨格筋原性ではないが、多能性である。MSCは、CD105、CD90、CD73および／またはデスミンの陽性の発現、および／または、CD56、CD34、デスミン、ACHE及び／又はCKの陰性の発現によってさらに特徴付けられることがある。MSCの特性の例を図１５に示す。
【0069】
本発明によれば、骨格筋由来細胞（SMDC）から誘導平滑筋細胞（iSMC）を取得するための方法が提供される。
【0070】
［骨格筋細胞由来の誘導平滑筋細胞］
本発明の第１の主題は、誘導平滑筋細胞（iSMC）を取得するための方法に関し、この方法は、（ａ）対象から骨格筋由来細胞を取得するステップ、（ｂ）TGF-ベータ、特にTGFb1、TGFb2および／またはTGFb3、およびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって骨格筋由来細胞を分化転換させてiSMCを得るステップを含む。特に好ましい実施形態では、iSMCを得るために、骨格筋由来細胞は、ステップ（ｂ）において、TGFb1および／またはTGFb3、より好ましくはTGFb1、およびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって分化転換される。本発明のステップ（ｂ）は、インビトロまたはエクスビボで実施される。したがって、本発明による方法は、インビトロまたはエクスビボである。
本発明の第１の主題は、誘導平滑筋細胞（iSMC）を取得するための方法に関し、この方法は、（ａ）対象から骨格筋由来細胞を取得するステップ、（ｂ）TGF-ベータ、特にTGFb1、TGFb2および／またはTGFb3、およびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって骨格筋由来細胞を分化転換させてiSMCを得るステップを含む。特に好ましい実施形態では、iSMCを得るために、骨格筋由来細胞は、ステップ（ｂ）において、TGFb1および／またはTGFb3、より好ましくはTGFb1、およびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって分化転換される。本発明のステップ（ｂ）は、インビトロまたはエクスビボで実施される。したがって、本発明による方法は、インビトロまたはエクスビボである。
【0071】
本発明の好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）は、1～10μg/mlのTGFb1および10～30μg/mlのヘパリンまたは1～6U/mlのヘパリンを含む細胞培養培地中で実施される。
【0072】
好ましい実施形態では、本発明の方法に従って、好ましくは本発明による方法のステップ（ｂ）で得られたiSMCは、aSMA、CD49a、およびCD146の陽性発現によって特徴付けられる。
【0073】
本発明の好ましい実施形態において、骨格筋由来細胞は、CD56およびデスミンの陽性発現、およびCD34の陰性発現によって特徴付けられる筋形成前駆細胞（MPC）であり、あるいは、骨格筋由来細胞は、CD105、CD73の陽性発現、およびCD34、およびCD56の陰性発現によって特徴付けられる間葉系間質細胞（MSC）である。
【0074】
本発明の好ましい実施形態では、骨格筋由来細胞はオリゴポテントMPCである。
【0075】
本発明のさらに好ましい実施形態において、骨格筋由来細胞は、デスミンの陰性発現および／またはCD90の陽性発現によって特徴付けられるMSCである。
【0076】
本発明のさらに好ましい実施形態では、骨格筋由来細胞は多能性MSCである。
【0077】
好ましくは、本発明による方法において、ステップ（ｂ）においてMPCから得られたiSMCは、aSMA、CD49a、デスミン、CD56、およびCD146の陽性発現、およびCD34の陰性発現によって特徴付けられることが予測され、そして、ステップ（ｂ）においてMSCから得られたiSMCは、aSMA、CD49a、およびCD146の陽性発現、およびCD56の負の発現によって特徴付けられることが予測される。
【0078】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）においてMPCから得られたiSMCは、スムーセリンの陽性発現によってさらに特徴付けられる。
【0079】
本発明のさらに好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）においてMSCから得られたiSMCは、デスミンおよび／またはCD34の陰性発現によってさらに特徴付けられる。
【0080】
CD73または5'-ヌクレオチダーゼ（5'-NT）は、エクト-5'-ヌクレオチダーゼとしても知られており、ヒトではNT5E遺伝子によってコードされる酵素である。CD73は通常、AMPをアデノシンに変換する働きをする。CD73は、リンパ球、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、筋芽細胞に発現している。CD73は、国際細胞治療学会（ISCT）によって提案されているMSCの最小基準に従った多能性間葉系間質細胞（MSC）マーカーである（Dominici et al., 2006）。
【0081】
CD105は、エンドグリンとしても知られている。それは、血管内皮細胞および胎盤の合胞体栄養膜に見られる90kDのサブユニットを持つI型内在性膜ホモ二量体タンパク質である。CD105は、間質線維芽細胞で弱く発現している。また、それは、活性化された単球や組織マクロファージにも発現している。CD105の発現は、腫瘍などの血管新生を受けている組織の活性化された内皮、または創傷治癒や皮膚の炎症の場合に増加する。CD105は、ヒト臍帯静脈内皮細胞のTGF-β受容体システムの構成要素であり、TGF-β1およびβ3に高い親和性で結合する。CD105は、国際細胞治療学会（ISCT）によって提案されているMSCの最小基準に従った多能性間葉系間質細胞（MSC）マーカーである（Dominici et al., 2006）。本発明は、MPCおよび／またはMSCからの、後者をTGFbとインキュベートすることによるiSMCの単離を予見するので、TGFb補助受容体としての役割によるCD105発現は、本明細書に記載の方法の成功に役立つ可能性がある。よって、本発明は、CD105陽性（図２）であり、したがって、iSMCの単離（実施例２）に有用である、MSCまたはMPCの単離（実施例１）を開示する。
【0082】
CD34の発現は、筋肉由来の幹細胞と静止衛星細胞で説明された（Qu-Petersen et al., 2002）。さらに、CD34陽性骨格筋由来細胞は、ジストロフィン骨格筋におけるジストロフィンの再生の増強を示した（Jankowski et al., 2002）。最先端技術は、インビトロで平滑筋細胞を生成するためのCD34+骨格筋由来細胞の使用、および平滑筋増強のためのCD34+骨格筋由来細胞の使用である（Capelli et al., 2002）。しかし、正常な内因性平滑筋は、一般にCD34陰性である（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000174059-CD34/tissue/primary+data）が、腫瘍形成状態の平滑筋はしばしばCD34+になる（van de Rijn et al., 1994）。したがって、CD34を欠く本発明の方法によって得られた細胞は、平滑筋の再生に有利であり、悪性形質転換を起こしにくい可能性がある。本発明の方法に従って、CD34陰性骨格筋由来細胞は、第１のステップで得られ、第２のステップでCD34陰性iSMCに分化する（実施例１および２）。
【0083】
CD146は、ラミニンアルファ4の表面タンパク質および受容体であり、それは、発達中の平滑筋組織の細胞外マトリックスに存在する（Iivanainen et al., 1995）。さらに、CD146は、平滑筋系統に関与する骨髄由来幹細胞で発現することが示された（Espagnolle et al., 2014）。図２に示されるように、膀胱由来の平滑筋細胞は、CD146に陽性である。CD146+細胞を要約すると、平滑筋再生や組織工学の使用に適した平滑筋拘束細胞の集団がマークされる。本発明の方法は、骨格筋由来細胞からのCD146+のiSMCの単離を可能にする。
【0084】
神経細胞接着分子（NCAM）としても知られるCD56は、インビトロで骨格筋筋芽細胞（Belles-Isles et al., 1993）およびインビボで平滑筋組織（Romanska et al., 1996）で発現する筋形成コミットメントマーカーである。CD56は、融合コンピテントのdesmin+のSMDC（ここではMPCと呼ぶ）および後者に由来するiSMCに存在する。CD56は、MPCと本明細書に記載の骨格筋由来のMSCとの間の主要な識別マーカーであり、それはMSCおよび後者に由来するiSMCの両方がCD56陰性であるためである。本発明によって得られたCD56+のiSMCは、平滑筋の再生に最も適している可能性がある。
【0085】
アルファ平滑筋アクチン（aSMA）は、発達中の平滑筋コミットメントの最初のマーカーの１つである（McHugh, 1995）。その存在は、平滑筋細胞におけるメカノトランスダクションによる機能と収縮性に不可欠である（J. Wang et al., 2006）。したがって、平滑筋機能の再生を目的としたiSMCのマーカーとしてのaSMAの使用は、不可欠である。本発明の方法（実施例２）は、骨格筋由来細胞からのaSMA+細胞の生成を可能にする（図３）。
【0086】
デスミンは、すべての筋肉タイプに存在する最も初期の既知の筋原性マーカーの１つである。デスミンの欠如は、筋肉の変性と機能不全を引き起こす可能性がある（Capetanaki et al., 1997）。したがって、筋肉再生のためにデスミン+細胞の使用が好ましい。図３に示されるように、MPCから由来するiSMCはデスミン陽性である。
【0087】
ITGA1遺伝子の発現と翻訳に起因するCD49aまたはインテグリンアルファタンパク質（VLA-1も）は、特に大動脈などの平滑筋組織に見られる平滑筋の発達中に存在する（Belkin et al., 1990）。本発明の方法は、CD49a陰性のMPCまたはMSCからのCD49a陽性iSMCの単離を可能にする。図２に示されるように、ヒト膀胱由来の平滑筋細胞（hBd-SMC）もCD49aに陽性である。
【0088】
平滑筋組織の機能は、スムーセリンなどの収縮性タンパク質を発現する高度に分化した平滑筋細胞の存在に依存している（Niessen et al., 2005）。さらに、スムーセリンは、完全に分化した平滑筋細胞のよく知られたマーカーであり、平滑筋が損なわれると消える最初のマーカーである（(van Eys et al., 2007）。したがって、平滑筋組織の再生におけるスムーセリン+細胞の使用は好ましいかもしれない。現在の方法（実施例２および５）では、スムーセリン-MPCからスムーセリン+iSMCを分離できる（図３）。
【0089】
上記のように、言及されたマーカーCD146、CD56、aSMA、CD34、デスミン、CD49a、スムーセリンは、平滑筋細胞の同定および／または機能にとって重要であり、マーカーの組み合わせは、平滑筋再生に適したiSMCを同定するのに有利である可能性がある。本明細書で実証された方法は、扱われたマーカーの組み合わせでiSMCの単離を可能にする（実施例２）。
【0090】
詳細には、本発明は、骨格筋由来のMPCからiSMCを取得するための方法を提供する。MPCから取得したiSMCは、CD56+、aSMA+、CD49a+、デスミン+、CD146+、およびCD34-である。上記の後者のマーカーは、例えば、hBd-SMCがCD146およびCD49aに対して陽性であり（図２）、したがって平滑筋再生細胞として使用される細胞に好ましいため、平滑筋細胞を同定するのに有利である。CD56+、aSMA+、CD49a+、デスミン+、CD146+、およびCD34-マーカーの発現の組み合わせは、ヒト骨格筋由来のMPCからインビトロで生成されたiSMCにとって有利で新規である。
【0091】
さらに、本発明は、骨格筋由来のMSCからiSMCを取得するための方法を提供する。骨格筋MSCに由来するiSMCは、aSMA+、CD146+、CD49a+、CD56-、および好ましくはデスミン-および／またはCD34-である。aSMA、CD49aおよびCD146の陽性発現およびCD56および好ましくはCD34の陰性発現は、これらの細胞をMSC由来の平滑筋細胞として同定するのに適しており、平滑筋再生細胞としてのiSMCの機能に関連している。骨格筋由来のMSCからのiSMC上でのaSMA+、CD146+、CD49a+およびCD56-マーカー発現の組み合わせは、当技術分野における以前の方法よりも有利であり新規である。
【0092】
本発明のさらに好ましい実施形態では、この方法は、ステップ（ａ）の後に、骨格筋由来細胞を増殖させて、好ましくは20～40×106個の細胞を受け取ることを含むステップ（ａ１）が行われる。
【0093】
本発明の特定の好ましい実施形態では、骨格筋由来細胞は、増殖されて50×106個の細胞を受け取る。
【0094】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）は、１日から６日間行われる。本発明の特定の好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）は、３日から６日間行われる。
【0095】
本発明のさらなる主題は、本発明による方法によって得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）に関する。
【0096】
本発明のさらに好ましい実施形態では、MPCから得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）は、aSMA、CD49a、デスミン、CD56、およびCD146の陽性発現、およびCD34の陰性発現によって特徴付けられる。
【0097】
上記ですでに明らかにされているように、MPCからのiSMCにおいて、aSMA、CD49a、デスミン、CD56およびCD146が存在し、またはCD34が存在しない、マーカーの組み合わせは、本明細書に記載の方法によって平滑筋細胞の自然な発現プロファイルを表現型模写するため、有利である。
【0098】
本発明のさらに好ましい実施形態において、MPCから得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）は、非融合コンピテントである。
【0099】
単核筋形成前駆細胞（MPC）または他の融合コンピテントの筋由来細胞（筋芽細胞など）の多核筋管への融合は、骨格筋の形成と再生の前提条件である（Rochlin et al., 2010）。しかしながら、インビボでの平滑筋組織は、多核筋管ではなく、むしろ分化した単核平滑筋細胞からなるので、平滑筋の再生には、非融合コンピテントの細胞が有利である。したがって、本発明は、MPCからのiSMC、ならびにMSCからのiSMCが非融合コンピテントであることを予見している。本発明の実施例１に示されるように得られたMPCは融合コンピテントであるが、本発明の実施例２に示されるように得られ、最終的に平滑筋組織への適用が意図されたiSMCは、非融合コンピテントである。これは、例えば、図１５に示されるように、本発明によるMPC-iSMCおよびMSC-iSMCの両方に当てはまる。
【0100】
本発明のさらに好ましい実施形態において、MSCから得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）は、aSMA、CD49a、およびCD146の陽性発現、およびCD56の陰性発現によって特徴付けられる。
【0101】
好ましくは、MSCから得られたiSMCは、デスミンおよび／またはCD34の陰性発現によってさらに特徴付けられる。
【0102】
骨格筋由来のMSCはCD56の点でMPCとは異なるため、MSC由来のiSMCもCD56陰性である。しかし、MSC由来のiSMCは、aSMA+、CD146+、およびCD34-であり、これは、MPC由来のiSMCと一致して、MSC由来のiSMCの平滑筋コミットメントを代表するものであり、したがって有利である。さらに、本発明によるMSCに由来するiSMCにおいて陽性の間葉マーカーCD90、CD105、CD73の発現は、必要としている平滑筋組織の間葉系の性質のために好ましい。
【0103】
上記のような様々なマーカーの発現は、好ましくはインビトロで試験される。さらに、上記で定義された様々なマーカーの発現は、インビトロでのそれぞれの細胞におけるそれらの発現を指す。好ましい実施形態において、上記で定義されたそれぞれの細胞におけるaSMAおよびデスミンのインビトロでの発現は、それらのそれぞれのインビボでの発現に対応する。
【0104】
好ましくは、誘導平滑筋細胞（iSMC）は、機能的なカルシウムおよび／またはカリウムチャネルを発現する。
【0105】
平滑筋組織の機能性は、機能的電位依存性のカルシウムチャネルおよびカリウムチャネルの存在に依存しており、それぞれ、調節された細胞収縮および調節された膜電位の誘導を可能にする（Sanders, 2008）。神経学的刺激により、平滑筋細胞膜が脱分極して電圧感知カルシウムチャネルを開いてカルシウムイオンが細胞間空間から細胞に入るのを可能にする（Sanders, 2008）。以下のこのイベントは、シグナル伝達カスケードをトリガーし、最終的には、例えば、収縮して直腸からの不随意の放出から液体、気体、および固体を保持するための内肛門括約筋の機能のために詳細に必要とされる、アクチン／ミオシンによって誘発される平滑筋細胞の収縮を引き起こす（Webb, 2003）。さらに、電位依存性カリウムチャネルは、平滑筋膜のニューロン誘発性脱分極後に開き、膜を再分極させて、ニューロン信号を追跡する場合のさらなる脱分極を可能にする。したがって、iSMC上のカルシウムチャネルおよびカリウムチャネルの存在は、インビトロでの機能的なiSMCの同定に適している。機能的なiSMCは、実際には、例えば、糞便失禁患者では十分に機能していない内肛門括約筋の機能不全を再生するために必要である。本発明は、機能的電位依存性のカリウムチャネルおよびカルシウムチャネルの両方を有する骨格筋由来細胞からのiSMCの生成を可能にし、これは、平滑筋再生におけるそれらの使用に有利である可能性がある。
【0106】
好ましくは、誘導平滑筋細胞（iSMC）は、インビトロで収縮性である。平滑筋組織の典型的な機能の１つは、収縮である（Webb, 2003）。インビトロで収縮性を試験するために、細胞をコラーゲンゲルに播種し、時間の経過に伴うコラーゲンゲルのサイズの減少を収縮性の尺度として定量化する。本発明者らは、MPCからのiSMCおよびMSCからのiSMCが、それを起源とするMPCおよびMSCと比較して収縮性であることを発見した。
【0107】
好ましくは、本発明の方法に従って、好ましくはステップ（ｂ）で得られる、誘導平滑筋細胞（iSMC）、特にMPC-iSMCは、CD49e-である。CD49eの発現は、インビトロで試験することが好ましい。インテグリンアルファ5としても知られるCD49eは、細胞接着分子であり、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、フィブリリン-1に結合するインテグリンベータ1とヘテロダイマー受容体を構築する。フィブロネクチン阻害剤は、平滑筋遺伝子発現を増加させるのに十分であったため、CD49eを介してサポートされるフィブロネクチンシグナル伝達は、平滑筋の発現を妨げる可能性がある。本発明者らは、マウスMPCからのiSMCがCD49eを欠損していることを発見した。CD49eの欠損は、フィブロネクチンシグナル伝達を低減するのに役立つ可能性があり、したがって、本発明に従って得られたCD49e-iSMCは、平滑筋再生のためのそれらの使用において当技術分野で知られている細胞よりも有利である可能性がある。
【0108】
代替の好ましい実施形態では、本発明の方法に従って、好ましくはステップ（ｂ）で得られる、誘導平滑筋細胞（iSMC）、特にMPC-iSMCは、CD49e+である。CD49eの発現は、インビトロで試験することが好ましい。
【0109】
好ましくは、本発明の方法に従って、好ましくはステップ（ｂ）で得られる、誘導平滑筋細胞（iSMC）、特にMPC-iSMCは、AChE-である。AChEの発現は、インビトロで試験することが好ましい。骨格筋形成細胞の典型的な機能の１つは、運動終板での神経信号の終結に必要であるような、インビトロ融合中の活性AChE酵素の発現である（Thurner et al., 2018）。しかし、平滑筋は運動ニューロンによって神経支配されていないため、その収縮は主にアセチルコリンによって調節されておらず、終了にはAChEが必要である。本発明者らは、実施例１７によるAChE活性について、実施例３に従って単離されたiSMCを分析し、iSMCがAChE-であることを発見した（図１４）。
【0110】
好ましくは、本発明の方法に従って、好ましくはステップ（ｂ）で得られる、誘導平滑筋細胞（iSMC）、特にMPC-iSMCは、CK-である。CKの発現は、インビトロで試験することが好ましい。骨格筋形成細胞の典型的な機能の１つは、骨格筋の収縮に必要であることから、インビトロでの融合中の活性CK酵素の発現である（Thurner et al., 2018）。しかし、平滑筋の収縮は、クレアチンキナーゼ（CK）によって制御されていないため、平滑筋細胞には必要ない。本発明者らは、CK活性（実施例１７）について分析されたiSMC（実施例３）がCK-であることを発見した（図１４）。
【0111】
好ましい実施形態では、本発明の方法に従って、好ましくはステップ（ｂ）で得られる、誘導平滑筋細胞（iSMC）、特にMPC-iSMCは、特にPax-7の発現をインビトロで試験した場合、Pax-7陰性である。さらに好ましい実施形態では、本発明の方法に従って、好ましくはステップ（ｂ）で得られる、誘導平滑筋細胞（iSMC）、特にMPC-iSMCは、特にPax-7の発現をインビトロで試験した場合、Pax-7陽性である。Pax-7は、骨格筋系統に関与する細胞に見られる転写因子である（Krauss et al., 2016）。マウスの筋層におけるPax-7の欠失は、骨格筋の減少と平滑筋量の増加につながる（Woerl et al., 2009）。
【0112】
好ましい実施形態では、本発明の方法に従って、好ましくはステップ（ｂ）で得られる、誘導平滑筋細胞（iSMC）、特にMPC-iSMCは、SSEA4陰性である。さらに好ましい実施形態では、本発明の方法に従って、好ましくはステップ（ｂ）で得られる、誘導平滑筋細胞（iSMC）、特にMPC-iSMCは、SSEA4陽性である。SSEA4の発現は、インビトロで試験することが好ましい。SSEA4は、多能性幹細胞に見られる細胞表面マーカーであり、広範な増殖能で知られているため、腫瘍形成のリスクがある。
【0113】
［誘導平滑筋細胞に基いた治療］
本発明のさらなる主題は、対象の疾患または障害を治療する方法で使用するための誘導平滑筋細胞（iSMC）に関する。好ましくは、対象は、ヒトまたは動物である。特に、本発明は、外科手術または治療による人体または動物の体の治療方法で使用するための誘導平滑筋細胞（iSMC）を提供する。より具体的には、本発明は、細胞治療、特に平滑筋細胞治療で使用するための誘導平滑筋細胞（iSMC）を提供する。
本発明のさらなる主題は、対象の疾患または障害を治療する方法で使用するための誘導平滑筋細胞（iSMC）に関する。好ましくは、対象は、ヒトまたは動物である。特に、本発明は、外科手術または治療による人体または動物の体の治療方法で使用するための誘導平滑筋細胞（iSMC）を提供する。より具体的には、本発明は、細胞治療、特に平滑筋細胞治療で使用するための誘導平滑筋細胞（iSMC）を提供する。
【0114】
本発明のさらに好ましい実施形態では、疾患または障害は、平滑筋欠損症である。好ましくは、平滑筋欠損症は、肛門失禁、尿失禁、逆流症、胃不全麻痺、過活動性および過小活動性の膀胱からなる群から選択される。
【0115】
本発明の特に好ましい実施形態では、疾患または障害は、便失禁、特に受動的便失禁である。したがって、本発明はまた、肛門失禁、尿失禁、逆流症、胃不全麻痺、過活動性および過小活動性の膀胱、特に便失禁、より具体的には受動性便失禁を治療する方法で使用するためのiSMCを指す。
【0116】
好ましくは、iSMCは、iSMCを必要とする対象の平滑筋組織に注射される。好ましくは、iSMCは、平滑筋欠損症を治療するのに有効な量で注射される。投与される化合物の有効量は、医師および臨床医によく知られている方法による前臨床試験および臨床試験中に当業者によって容易に決定することができる。
【0117】
細胞投与による、衰弱し、萎縮し、または損傷を受けた平滑筋、例えば、内部肛門、内部尿道、下部または上部食道括約筋などの括約筋など、必要な平滑筋組織の再生は、細胞を必要としている組織に局所的に投与する必要がある。iSMCの局所投与は、投与部位に注射されたiSMCの生着によって平滑筋を再生する可能性がある。従来技術（Chancellor et al., 2001）は、デスミン+、CD34+およびBlc-2+として特徴付けられる骨格筋由来細胞、ならびに膀胱または肛門括約筋などの軟組織（例えば、平滑筋）の増強におけるそれらの使用を開示している。対照的に、本発明は、第１のステップにおけるCD34-、CD56+、デスミン+のMPC、または多能性のCD34-、CD56-、CD73+およびCD105+のMSC骨格筋由来細胞の単離を開示する。骨格筋の前記細胞から、TGFb1およびヘパリンによる処理に続き、第２のステップでiSMCを単離することができる。それによって、これらのiSMCは、例えば、aSMAおよびCD146などの平滑筋マーカーの発現によって平滑筋表現型を獲得するため、平滑筋の再生に有利な場合がある。好ましくは、これらのiSMCは、必要としている対象を治療する方法において、前記対象へ注射することによって使用される。本発明者らは、本発明の方法によって得られたiSMCが、幽門括約筋の平滑筋組織に投与され、注射部位に生着し、平滑筋組織に組み込まれることを見出した。
【0118】
好ましくは、iSMCは、複数回の注射によって必要としている軟組織に投与される。
【0119】
骨格筋へのSMDCの複数回の注射は、筋肉への細胞の生着を改善することが示されている（Skuk et al., 2014）。本発明は、組織の同じ連続体の複数の部位における、例えば、平滑筋などの軟組織へのiSMCの注射を予見する。特に、細胞は、それぞれが規定された数の細胞を注入する複数の針を使用して投与されてもよい。
【0120】
本発明によるiSMCは、iSMCおよび薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体を含む医薬組成物の形態で投与することができる。したがって、本発明はまた、本発明によるiSMCおよび薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体を含む医薬組成物を指す。
【0121】
本発明の別の実施形態では、iSMCは、肛門失禁、尿失禁、逆流症、胃不全麻痺、過活動および過小活動の膀胱、特に便失禁、より具体的には受動性便失禁の治療のための薬剤の製造に使用される。
【0122】
［組織工学］
本発明のさらなる主題において、誘導平滑筋由来細胞は、組織工学で使用するためのものである。
本発明のさらなる主題において、誘導平滑筋由来細胞は、組織工学で使用するためのものである。
【0123】
平滑筋組織は、血管や内肛門括約筋など、人体の内部にリング／チューブ状の構造を形成することがよくある。リング／チューブ形状の構造を生成するための本明細書で得られたiSMCの使用は、血管または括約筋のインビトロ工学に使用することができる。インビトロで操作された平滑筋構造は、例えば、糞便失禁患者において、平滑筋括約筋などの機能不全の平滑筋構造を置き換えるために有用である可能性がある。本発明者らは、本発明によって得られたiSMCが、例えば、内肛門括約筋と同様のリング形状の三次元構造を再構築できることを見出した。これらの組織リング内の細胞は、aSMAやデスミンなどの平滑筋マーカータンパク質を発現することがわかった。本発明の細胞によって得られる組織リング内の収縮性タンパク質aSMAおよびデスミンの発現は、組織リングの機能性に必要であり、したがって、組織置換における前記組織リングの使用に有利である。
【0124】
さらに、インビトロで操作された括約筋に由来するiSMCは、メカノトランスダクション、したがって平滑筋構築物の機能性に必要な、非常に豊富なアクチン構造および濃密体などの天然平滑筋の超微細構造特性を有することが本明細書で見出された。さらに、本発明によって得られた組織工学による括約筋は、細胞内でのカベオラの形成を可能にする。カベオラは、例えば、興奮－収縮、興奮－転写および薬力学的な結合による、カルシウムの取り扱いに必要であることが知られている（Popescu et al., 2006）。したがって、本発明によって得られるiSMCは、組織工学における使用に有望である。
【0125】
［薬物スクリーニング］
本発明のさらなる主題において、iSMCは、薬物スクリーニングで使用するためのものである。
本発明のさらなる主題において、iSMCは、薬物スクリーニングで使用するためのものである。
【0126】
iSMCを使用してインビトロで平滑筋構造を生成することは、動物またはヒトの研究で潜在的に有害な薬剤候補を使用する前に、インビトロで新薬および平滑筋細胞に対するそれらの効果を試験するのに役立つ可能性がある。
【0127】
［誘導平滑筋細胞の生成のための骨格筋由来細胞］
本発明のさらなる主題は、誘導平滑筋細胞（iSMC）を得るための骨格筋由来細胞の使用に関する。
本発明のさらなる主題は、誘導平滑筋細胞（iSMC）を得るための骨格筋由来細胞の使用に関する。
【0128】
頻繁に使用される最先端の方法では、インビトロで平滑筋細胞を得るために、人工多能性幹細胞（(Dash et al., 2016）、脂肪由来の多能性間葉系幹細胞（G. Wang et al., 2015）、または骨髄由来の多能性間葉系幹細胞（Espagnolle et al., 2014）を用いるが、これは、本発明において誘導平滑筋細胞を得るための供給源として使用される骨格筋由来細胞とは起源が明らかに異なる。現在の最先端の細胞、例えば、平滑筋細胞を取得するために使用されるiPSCの不利な点は、iPSCを取得するために必要な遺伝子工学による悪性形質転換のリスクである。別の最先端の方法は、平滑筋細胞の供給源としてのCD34+骨格筋由来細胞を説明している。それにより、前記細胞は、分化培地で2～4週間培養される（Lu et al., 2011）。本発明において初めて、本発明の方法に従って単離されたCD34-骨格筋由来細胞を使用して、iSMCを取得する。本発明の方法は１週間未満しかかからないので、前記骨格筋由来細胞は、iSMCの単離に十分に適している。
【0129】
本発明による好ましい実施形態では、骨格筋由来細胞は、CD56、デスミンの陽性の発現、およびCD34の陰性の発現によって特徴付けられるオリゴポテント筋形成前駆細胞（MPC）であり、または、骨格筋由来細胞は、CD105、CD73の陽性の発現、およびCD34およびCD56の陰性の発現によって特徴付けられる多能性間葉系間質細胞（MSC）である。
【0130】
以下の実施例は、本発明を説明するが、限定的であるとは見なされない。
【実施例0131】
［実施例１－骨格筋由来細胞（SMDC）の単離］
以下の分離方法に応じて、SMDCは、ヒト筋原性前駆細胞（MPC）、マウス筋原性前駆細胞（mMPC）、またはヒト多能性間葉系幹細胞（MSC）のいずれかを濃縮した。
以下の分離方法に応じて、SMDCは、ヒト筋原性前駆細胞（MPC）、マウス筋原性前駆細胞（mMPC）、またはヒト多能性間葉系幹細胞（MSC）のいずれかを濃縮した。
【0132】
［ヒト骨格筋由来の筋形成前駆細胞（MPC）の単離］
詳細には、骨格筋生検を、失禁患者の大胸筋または上腕三頭筋から採取した。生検を行うために、最初に、大胸筋の筋膜に到達するまで、筋肉の上の約1cmの長さの切開によって皮膚を開いた。筋膜を開いた後、1cm3の筋肉組織（生検）を採取した。生検は、約4℃に予冷されゲンタマイシン（1～5μg/ml最終濃度）が添加されたハムのF10基本培地で構成される生検輸送培地に直接移した。生検を、生検輸送培地内で1～11℃で約26時間保存した。次に、生検を1×PBSで満たされたペトリ皿に移した。滅菌鉗子とメスを使用して、筋肉組織を結合組織から分離しました。次に、筋肉組織を1×PBSで満たされた別のペトリ皿に移し、メスを使用して2～3mm2のサイズに解剖した。上記のような追加の移動ステップの後、組織片をさらに1mmの断片に切断した。最後に、断片を1×PBSで満たされた遠心分離チューブに移し、1300rpmで10分間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、筋肉組織を8μg/mlゲンタマイシンを添加した1×PBSに再懸濁した。次に、筋肉組織懸濁液を2～8℃に48時間冷却した。冷却後、筋肉組織懸濁液を1300rpmで10分間遠心分離し、次に上清を除去し、ハムのF10に1～5mg/mlコラゲナーゼ、2～4％v/v Hepesバッファー、0.1～10％v/vウシ胎児血清および5～10μg/mlゲンタマイシンを含む2.5mlの消化溶液。次に筋肉組織懸濁液を37℃、5％CO2で6から20時間インキュベートした。次に、懸濁液を1300rpmで10分間遠心分離し、上清を除去し、ハムのF10に10～20％v/v FCS、1～3ng/ml bFGF、および3～10μg/mlゲンタマイシンを含む培地にペレットを再懸濁し、細胞培養フラスコに播種した。培養フラスコの底に付着したSMDCを、3～4日ごとに培地を交換し、コンフルエントに達した後に剥離して継代培養することによって、さらに維持した。1×107から5×107のSMDCに達するまで継代培養を行った。
詳細には、骨格筋生検を、失禁患者の大胸筋または上腕三頭筋から採取した。生検を行うために、最初に、大胸筋の筋膜に到達するまで、筋肉の上の約1cmの長さの切開によって皮膚を開いた。筋膜を開いた後、1cm3の筋肉組織（生検）を採取した。生検は、約4℃に予冷されゲンタマイシン（1～5μg/ml最終濃度）が添加されたハムのF10基本培地で構成される生検輸送培地に直接移した。生検を、生検輸送培地内で1～11℃で約26時間保存した。次に、生検を1×PBSで満たされたペトリ皿に移した。滅菌鉗子とメスを使用して、筋肉組織を結合組織から分離しました。次に、筋肉組織を1×PBSで満たされた別のペトリ皿に移し、メスを使用して2～3mm2のサイズに解剖した。上記のような追加の移動ステップの後、組織片をさらに1mmの断片に切断した。最後に、断片を1×PBSで満たされた遠心分離チューブに移し、1300rpmで10分間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、筋肉組織を8μg/mlゲンタマイシンを添加した1×PBSに再懸濁した。次に、筋肉組織懸濁液を2～8℃に48時間冷却した。冷却後、筋肉組織懸濁液を1300rpmで10分間遠心分離し、次に上清を除去し、ハムのF10に1～5mg/mlコラゲナーゼ、2～4％v/v Hepesバッファー、0.1～10％v/vウシ胎児血清および5～10μg/mlゲンタマイシンを含む2.5mlの消化溶液。次に筋肉組織懸濁液を37℃、5％CO2で6から20時間インキュベートした。次に、懸濁液を1300rpmで10分間遠心分離し、上清を除去し、ハムのF10に10～20％v/v FCS、1～3ng/ml bFGF、および3～10μg/mlゲンタマイシンを含む培地にペレットを再懸濁し、細胞培養フラスコに播種した。培養フラスコの底に付着したSMDCを、3～4日ごとに培地を交換し、コンフルエントに達した後に剥離して継代培養することによって、さらに維持した。1×107から5×107のSMDCに達するまで継代培養を行った。
【0133】
［マウス骨格筋由来の筋形成前駆細胞（mMPC）の単離］
マウスMPCを、Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB- tdTomato,-EGFP)Luo/J、要するにTdTomatoマウス（Jackson Laboratory, Maine, USA）の骨格筋生検から得た。成体マウスを頸椎脱臼により犠牲にし、続いて背中の皮膚をつまんで皮膚を剥がした。次に、はさみとメスを使用して、背最長筋、腓腹筋、前脛骨筋から骨格筋を取得した。筋肉を滅菌ペトリ皿に移し、1×PBSで覆った。次に、ピンセットとメスを使用して、残りの結合組織を骨格筋から取り除き、廃棄した。その後、骨格筋解離キット（MiltenyiBiotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany）を製造元の指示に従って使用して、筋肉組織を消化した。筋形成前駆細胞（mMPC）を非筋形成SMDCから分離するために、衛星細胞分離キット（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を製造元の指示に従って使用した。収集したmMPCと非筋原性SMDCを上記のように遠心分離し、20％FCSとbFGFを添加したDMEM／ハムのF12からなるマウス増殖培地に再懸濁した。37℃で1時間、1:10の1×PBSで希釈したラットの尾からのコラーゲンIで培養フラスコの表面を覆うことによって調製した、コラーゲン被覆培養フラスコでマウスSMDCを培養した。ヒトSMDCの場合と同様に継代培養を実施した。最後に、細胞を細胞培養容器の壁から剥がし、培地に再懸濁し、直ちに使用するか、さらに使用するまで液体窒素で凍結保存した。
マウスMPCを、Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB- tdTomato,-EGFP)Luo/J、要するにTdTomatoマウス（Jackson Laboratory, Maine, USA）の骨格筋生検から得た。成体マウスを頸椎脱臼により犠牲にし、続いて背中の皮膚をつまんで皮膚を剥がした。次に、はさみとメスを使用して、背最長筋、腓腹筋、前脛骨筋から骨格筋を取得した。筋肉を滅菌ペトリ皿に移し、1×PBSで覆った。次に、ピンセットとメスを使用して、残りの結合組織を骨格筋から取り除き、廃棄した。その後、骨格筋解離キット（MiltenyiBiotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany）を製造元の指示に従って使用して、筋肉組織を消化した。筋形成前駆細胞（mMPC）を非筋形成SMDCから分離するために、衛星細胞分離キット（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を製造元の指示に従って使用した。収集したmMPCと非筋原性SMDCを上記のように遠心分離し、20％FCSとbFGFを添加したDMEM／ハムのF12からなるマウス増殖培地に再懸濁した。37℃で1時間、1:10の1×PBSで希釈したラットの尾からのコラーゲンIで培養フラスコの表面を覆うことによって調製した、コラーゲン被覆培養フラスコでマウスSMDCを培養した。ヒトSMDCの場合と同様に継代培養を実施した。最後に、細胞を細胞培養容器の壁から剥がし、培地に再懸濁し、直ちに使用するか、さらに使用するまで液体窒素で凍結保存した。
【0134】
［ヒト骨格筋由来の多能性間葉系幹細胞（MSC）の分離］
MSCをThurner et al. 2018に従って分離した。最初に、SMDCを筋生検（大胸筋または広背筋）から分離し、cGMP環境下で増やした。細胞を標準的な細胞培養法によって維持した。簡単に説明すると、細胞を、10％FCS（57℃、40分で不活化）、bFGFおよびゲンタマイシンを添加したハムのF-10基本培地を含む増殖培地で培養し、37℃、5％CO2でインキュベートした。増殖培地を2から3日ごとに交換した。継代培養および採取のために、細胞を1×PBSで1回洗浄し、1×トリプシン溶液とともに37℃で5分間インキュベートした。細胞を増殖培地ですすぎ、400×gで10分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを増殖培地に再懸濁した。次に、MSCを磁気活性化セルソーティング（MACS）によって精製した。したがって、ヒトCD56 MicroBeadsキット（MiltenyiBiotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany）を使用した。要約すると、採取およびカウント後、細胞を400×gで10分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を10mLのMACSバッファーに再懸濁した。別の遠心分離ステップ（400×gで10分間）の後、ペレットを80μLのMACSバッファーに再懸濁した。続いて、1×107細胞あたり20μLの磁性CD56抗体を添加し、4℃で15分間インキュベートした。その後、Mini MACSセパレーターを使用して細胞の選別を行い、フロースルーでCD56-MSCを収集した。最後に、細胞を培地に再懸濁し、さらに使用するかすぐに使用するまで液体窒素で凍結保存した。
MSCをThurner et al. 2018に従って分離した。最初に、SMDCを筋生検（大胸筋または広背筋）から分離し、cGMP環境下で増やした。細胞を標準的な細胞培養法によって維持した。簡単に説明すると、細胞を、10％FCS（57℃、40分で不活化）、bFGFおよびゲンタマイシンを添加したハムのF-10基本培地を含む増殖培地で培養し、37℃、5％CO2でインキュベートした。増殖培地を2から3日ごとに交換した。継代培養および採取のために、細胞を1×PBSで1回洗浄し、1×トリプシン溶液とともに37℃で5分間インキュベートした。細胞を増殖培地ですすぎ、400×gで10分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを増殖培地に再懸濁した。次に、MSCを磁気活性化セルソーティング（MACS）によって精製した。したがって、ヒトCD56 MicroBeadsキット（MiltenyiBiotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany）を使用した。要約すると、採取およびカウント後、細胞を400×gで10分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を10mLのMACSバッファーに再懸濁した。別の遠心分離ステップ（400×gで10分間）の後、ペレットを80μLのMACSバッファーに再懸濁した。続いて、1×107細胞あたり20μLの磁性CD56抗体を添加し、4℃で15分間インキュベートした。その後、Mini MACSセパレーターを使用して細胞の選別を行い、フロースルーでCD56-MSCを収集した。最後に、細胞を培地に再懸濁し、さらに使用するかすぐに使用するまで液体窒素で凍結保存した。
【0135】
［実施例２－SMDCのiSMCへの分化転換とその単離］
実施例１で得られたMPC、マウスMPCまたはMSCを培養容器の壁に播種し、約70％のコンフルエントまで増殖培地で培養した。次に、細胞をDMEM／F12（Thermo Scientific, MA, USA）で1回洗浄した。次に、細胞を、組換えヒトTGFb1（Thermo Scientific, MA, USA）、ブタ腸粘膜由来のヘパリンナトリウム塩（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）、熱不活化（57℃、40分）ウシ胎児血清（Gibco, Thermo Scientific, MA, USA）およびゲンタマイシン（Sandoz GmbH, Tirol, Austria）を、それぞれ最終濃度10ng/ml、3.84μg/mlおよび5％(v/v)で添加したDMEM／F12からなる平滑筋分化培地で覆った。最後に、細胞を平滑筋分化培地で37℃、5％CO2で3～6日間培養した。培地を3～4日ごとに交換した。単離のために、細胞を培養容器の壁から剥がし、懸濁液に集めた。
実施例１で得られたMPC、マウスMPCまたはMSCを培養容器の壁に播種し、約70％のコンフルエントまで増殖培地で培養した。次に、細胞をDMEM／F12（Thermo Scientific, MA, USA）で1回洗浄した。次に、細胞を、組換えヒトTGFb1（Thermo Scientific, MA, USA）、ブタ腸粘膜由来のヘパリンナトリウム塩（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）、熱不活化（57℃、40分）ウシ胎児血清（Gibco, Thermo Scientific, MA, USA）およびゲンタマイシン（Sandoz GmbH, Tirol, Austria）を、それぞれ最終濃度10ng/ml、3.84μg/mlおよび5％(v/v)で添加したDMEM／F12からなる平滑筋分化培地で覆った。最後に、細胞を平滑筋分化培地で37℃、5％CO2で3～6日間培養した。培地を3～4日ごとに交換した。単離のために、細胞を培養容器の壁から剥がし、懸濁液に集めた。
【0136】
［実施例３－SMDCの分化の可能性］
インビトロでの脂肪生成、軟骨形成、および骨形成の分化のために、実施例１によって得られたそれぞれ500,000個の細胞を６ウェルプレート（NUNC, Thermo Scientific, MA, USA）に播種し、増殖培地中で37℃、5％CO2で24時間培養した。次に、細胞を5ml DMEM／ハムのF12で1回洗浄し、それぞれ5mlの脂肪生成、軟骨形成、または骨形成分化培地で覆った。StemXVivo（商標）骨形成／脂肪生成ベース培地（R&D Systems Inc., MN, USA）からなる脂肪生成、軟骨形成および骨形成分化培地に、StemXVivoヒト／マウス／ラット脂肪生成（R&D Systems Inc., MN, USA）、StemXVivoヒト骨生成サプリメント（R&D Systems Inc., MN, USA）、またはSTEMPro（登録商標）軟骨形成サプリメント（Gibco（登録商標）, Thermo Scientific, MA, USA）を、それぞれ製造元の指示に従って添加した。分化培地にゲンタマイシン（Sandoz GmbH, Austria）をさらに添加して、3.83μg/mlの最終濃度に到達させた。細胞をそれぞれの分化培地でそれぞれ14日間培養し、培地を2～3日ごとに交換した。14日間の培養後、オイルレッドo（脂肪細胞）、アルシアンブルー（軟骨細胞）およびアリザリンレッドs（骨細胞）の染色によってそれぞれ視覚化された脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞の存在によって、成功した分化を評価した。image jソフトウェアパッケージにより、複数の個別実験の顕微鏡画像において、オイルレッドo、アルシアンブルー、アリザリンレッドsの染色の定量化を行った。そのため、画像を読み込み、カラーチャンネルを分割した。オイルレッドoおよびアリザリンレッドsの染色には赤のチャンネルを使用し、アルシアンブルーの染色には青のチャンネルを使用した。共通のしきい値を設定することでバックグラウンドを除去し、image jによる定量化のためにフィールドあたりの平均ピクセル強度を取得した。統計的比較を、p<0.05を有意（*）と見なして、対応のないt検定によって実行した。p<0.01、p<0.001を、それぞれ*または**として視覚化した。24ウェルNunclon（商標）Delta Surfaceプラスチックプレート（Thermo Scientific, MA, USA）での細胞培養において、以前に説明したように（Thurner et al., 2018）、10mLの骨格筋細胞分化培地サプリメントパック（PromoCell GmbH, Germany）および240μLのゲンタマイシン（8mg/mL, Sandoz GmbH, Austria）を添加した骨格筋細胞分化培地（500mL, PromoCell GmbH, Germany）により、成長培地を置き換えることによって、骨格筋分化を開始させた。
インビトロでの脂肪生成、軟骨形成、および骨形成の分化のために、実施例１によって得られたそれぞれ500,000個の細胞を６ウェルプレート（NUNC, Thermo Scientific, MA, USA）に播種し、増殖培地中で37℃、5％CO2で24時間培養した。次に、細胞を5ml DMEM／ハムのF12で1回洗浄し、それぞれ5mlの脂肪生成、軟骨形成、または骨形成分化培地で覆った。StemXVivo（商標）骨形成／脂肪生成ベース培地（R&D Systems Inc., MN, USA）からなる脂肪生成、軟骨形成および骨形成分化培地に、StemXVivoヒト／マウス／ラット脂肪生成（R&D Systems Inc., MN, USA）、StemXVivoヒト骨生成サプリメント（R&D Systems Inc., MN, USA）、またはSTEMPro（登録商標）軟骨形成サプリメント（Gibco（登録商標）, Thermo Scientific, MA, USA）を、それぞれ製造元の指示に従って添加した。分化培地にゲンタマイシン（Sandoz GmbH, Austria）をさらに添加して、3.83μg/mlの最終濃度に到達させた。細胞をそれぞれの分化培地でそれぞれ14日間培養し、培地を2～3日ごとに交換した。14日間の培養後、オイルレッドo（脂肪細胞）、アルシアンブルー（軟骨細胞）およびアリザリンレッドs（骨細胞）の染色によってそれぞれ視覚化された脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞の存在によって、成功した分化を評価した。image jソフトウェアパッケージにより、複数の個別実験の顕微鏡画像において、オイルレッドo、アルシアンブルー、アリザリンレッドsの染色の定量化を行った。そのため、画像を読み込み、カラーチャンネルを分割した。オイルレッドoおよびアリザリンレッドsの染色には赤のチャンネルを使用し、アルシアンブルーの染色には青のチャンネルを使用した。共通のしきい値を設定することでバックグラウンドを除去し、image jによる定量化のためにフィールドあたりの平均ピクセル強度を取得した。統計的比較を、p<0.05を有意（*）と見なして、対応のないt検定によって実行した。p<0.01、p<0.001を、それぞれ*または**として視覚化した。24ウェルNunclon（商標）Delta Surfaceプラスチックプレート（Thermo Scientific, MA, USA）での細胞培養において、以前に説明したように（Thurner et al., 2018）、10mLの骨格筋細胞分化培地サプリメントパック（PromoCell GmbH, Germany）および240μLのゲンタマイシン（8mg/mL, Sandoz GmbH, Austria）を添加した骨格筋細胞分化培地（500mL, PromoCell GmbH, Germany）により、成長培地を置き換えることによって、骨格筋分化を開始させた。
【0137】
実施例１によって得られたMPCおよびMSCについて、適切な培養条件下で、脂肪生成、軟骨形成、骨形成および骨格筋形成系統へのインビトロ分化について試験した。脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞および筋管の染色を、上記のように実施した。オイルレッドoおよびアリザリンレッドsの陽性細胞は、MPC内に存在せず、低レベルのアルシアンブルー細胞しか検出できなかった。MSC内では、オイルレッドo、アルシアンブルー、アリザリンレッドsに陽性の細胞が、それぞれ脂肪生成、軟骨形成、骨形成の分化培地での培養後に見られ（図１Ａ、Ｂ）、国際細胞治療学会（Dominici et al., 2006）によって規定されているような、多能性細胞の濃縮と多能性間葉系幹細胞の状態が確認された。MPC内でのみ、デスミン陽性の多核筋管が検出された（図１Ａ）。それぞれインビトロでの脂肪生成、軟骨形成および骨形成の分化後のオイルレッドo、アルシアンブルーおよびアリザリンレッドsの染色強度の定量化、ならびにMSCおよびMPCの骨格筋形成分化後の融合指数計算によって、MSCと比較してMSCのオイルレッドo（p=0.0117）、アルシアンブルー（p=0.0020）およびアリザリンレッドs（p=0.0012）の染色において、有意に高い染色強度が明らかになり、一方、MSCと比較してMPC内では有意に高い融合指数（p=0.0007）が見られた（図１Ｂ）。したがって、MPCは間葉系オリゴポテント細胞であり、筋原性系統に関与する。さらに、MSCは多能性であり、インビトロで脂肪生成、軟骨形成、骨形成の分化が可能である。
【0138】
［実施例４－表面マーカーの発現］
表面マーカーの発現を測定するために、Guava easyCyte 6HT 2Lフローサイトメーター（Merck Millipore, Darmstadt, Germany）でフローサイトメトリーを実施した。簡単に説明すると、実施例１によって得られた細胞を、37℃で5分間、1×トリプシンで覆うことによって収集し、400×ｇで遠心分離し、1％FCSを添加した1×PBSに再懸濁した。40000個の細胞を195μlの1×PBSに再懸濁し、5μLのCD34-PE、CD56-PE、CD146-PE、IgG1-PE、IgG1-FITC、CD90-PE、CD105-PE（すべてBeckman Coulter, CA, USA製）、CD49a-FITC（Miltenyi Biotec, Germany）またはCD73-PE（Becton Dickinson, NJ, USA）を添加した後に、1.5mL Eppendorfチューブ内、4℃、暗所で30分間、インキュベートした。次に、細胞を1mL PBSで洗浄し、400×gで10分間遠心分離し、96ウェル丸底プレート内の195μLの1×PBSに再懸濁した。そして、各反応物に5μLの生存率色素7-アミノアクチノマイシンD（Beckman Coulter Inc., France）を加え、プレートを室温の暗所で10分間インキュベートした。最後に、Guava InCyte（商標）v.2.3ソフトウェアを使用してセルイベントを取得した。ヒストグラムとドットプロットを、1.8μL/mLのサンプル流量、最低5000イベントで生成した。陽性染色を、少なくとも95％陰性として設定されたアイソタイプ対照との比較、または対照（陰性）細胞との比較によって得た。
表面マーカーの発現を測定するために、Guava easyCyte 6HT 2Lフローサイトメーター（Merck Millipore, Darmstadt, Germany）でフローサイトメトリーを実施した。簡単に説明すると、実施例１によって得られた細胞を、37℃で5分間、1×トリプシンで覆うことによって収集し、400×ｇで遠心分離し、1％FCSを添加した1×PBSに再懸濁した。40000個の細胞を195μlの1×PBSに再懸濁し、5μLのCD34-PE、CD56-PE、CD146-PE、IgG1-PE、IgG1-FITC、CD90-PE、CD105-PE（すべてBeckman Coulter, CA, USA製）、CD49a-FITC（Miltenyi Biotec, Germany）またはCD73-PE（Becton Dickinson, NJ, USA）を添加した後に、1.5mL Eppendorfチューブ内、4℃、暗所で30分間、インキュベートした。次に、細胞を1mL PBSで洗浄し、400×gで10分間遠心分離し、96ウェル丸底プレート内の195μLの1×PBSに再懸濁した。そして、各反応物に5μLの生存率色素7-アミノアクチノマイシンD（Beckman Coulter Inc., France）を加え、プレートを室温の暗所で10分間インキュベートした。最後に、Guava InCyte（商標）v.2.3ソフトウェアを使用してセルイベントを取得した。ヒストグラムとドットプロットを、1.8μL/mLのサンプル流量、最低5000イベントで生成した。陽性染色を、少なくとも95％陰性として設定されたアイソタイプ対照との比較、または対照（陰性）細胞との比較によって得た。
【0139】
MPCおよびMSCを特徴付けるために、実施例１で使用した方法で得られた個々の患者からの少なくとも4つのサンプル、およびそれに由来する実施例２で使用した方法で得られたiSMCを、間葉系マーカー（CD105、CD90、およびCD73）、造血マーカー（CD34）、筋原性マーカー（CD56）および平滑筋系統マーカー（CD146）の存在について試験した。平均％陽性細胞が≧50以上を陽性と見なし、一方、平均％陽性細胞が＜50を陰性と見なした。それによって、すべての細胞タイプがCD105、CD90、およびCD73に対して陽性であることが分かったが、CD34に対しては陰性であった（図２）。さらに、MPCおよびそれに由来するiSMCはCD56+であったが、MSCおよびそれに由来するiSMCはCD56-であった。
【0140】
興味深いことに、MSCの血管平滑筋コミットメントに関連する表面マーカーCD146（Espagnolle et al., 2014）、および平滑筋発達中に発現するCD49a（Belkin et al., 1990）の発現は、MPCとMSCの両方において陰性であるが、それに由来するiSMCにおいては陽性であった（図２）。
【0141】
［実施例５－細胞内マーカー発現］
以前に説明したように（Thurner et al., 2018）、ゼラチンで覆われた24ウェルプレート、または6ウェルプレートに配置されたガラスカバースリップ上で、細胞内マーカーの発現を直接検出するために、免疫蛍光染色を行った。アルファ平滑筋アクチン（aSMA）、スムーセリン、またはデスミンの蛍光免疫標識のために、細胞をマウス抗アクチンアルファ平滑筋（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）、マウス抗平滑筋（Merck Millipore, MA, USA）、抗平滑筋ミオシン重鎖（Merck Millipore, MA, USA）またはウサギ抗デスミン（Thermo Scientific, MA, USA）の抗体とともにそれぞれインキュベートし、それぞれ、ブロッキング培地で1:100に希釈して使用した。ブロッキング培地で1:200に希釈した二次ヤギ抗マウスAlexa488またはロバ抗ウサギAlexa547コンジュゲート抗体（Thermo Scientific, MA, USA）を使用した。核の対比染色は、PBST（0.1％Triton X-100）で最終濃度2μg/mLに希釈したHoechst33342（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）と細胞をインキュベートすることによって行った。細胞をEntellan(登録商標）（Merck Millipore, MA, USA）でマウントし、ガラスカバースリップで密封しました。染色を、（1）一次抗体を使用しない手順および（2）試験した抗体が陰性の細胞と比較した。陽性細胞の数を定量化するために、ヘキスト染色と抗体染色のオーバーレイを実行し、少なくとも３つの独立した細胞調製物の複数の画像を分析した。抗体染色陽性の細胞の総数を、ヘキスト染色で評価した細胞（核）の総数で割った。実施例１および２によって得られた細胞を比較するために、平均および標準誤差値を計算した。
以前に説明したように（Thurner et al., 2018）、ゼラチンで覆われた24ウェルプレート、または6ウェルプレートに配置されたガラスカバースリップ上で、細胞内マーカーの発現を直接検出するために、免疫蛍光染色を行った。アルファ平滑筋アクチン（aSMA）、スムーセリン、またはデスミンの蛍光免疫標識のために、細胞をマウス抗アクチンアルファ平滑筋（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）、マウス抗平滑筋（Merck Millipore, MA, USA）、抗平滑筋ミオシン重鎖（Merck Millipore, MA, USA）またはウサギ抗デスミン（Thermo Scientific, MA, USA）の抗体とともにそれぞれインキュベートし、それぞれ、ブロッキング培地で1:100に希釈して使用した。ブロッキング培地で1:200に希釈した二次ヤギ抗マウスAlexa488またはロバ抗ウサギAlexa547コンジュゲート抗体（Thermo Scientific, MA, USA）を使用した。核の対比染色は、PBST（0.1％Triton X-100）で最終濃度2μg/mLに希釈したHoechst33342（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）と細胞をインキュベートすることによって行った。細胞をEntellan(登録商標）（Merck Millipore, MA, USA）でマウントし、ガラスカバースリップで密封しました。染色を、（1）一次抗体を使用しない手順および（2）試験した抗体が陰性の細胞と比較した。陽性細胞の数を定量化するために、ヘキスト染色と抗体染色のオーバーレイを実行し、少なくとも３つの独立した細胞調製物の複数の画像を分析した。抗体染色陽性の細胞の総数を、ヘキスト染色で評価した細胞（核）の総数で割った。実施例１および２によって得られた細胞を比較するために、平均および標準誤差値を計算した。
【0142】
実施例１によって得られたMPCおよびMSC、ならびに実施例２に記載のそれらに由来するiSMCを、蛍光免疫染色によって、細胞内収縮性平滑筋タンパク質（aSMA、スムーセリン）ならびに一般的な筋原性マーカーデスミンの発現について分析した。MPCとMSCはaSMA-とスムーセリン-であった。対照的に、MSCとMPCの両方から分離されたiSMCは、aSMA+であることが分かった（図３）。さらに、実施例２のMPCから単離されたiSMCは、スムーセリン+であることが分かった。細胞内デスミン発現の分析により、MSCおよびそれから単離されたiSMCがデスミン-であることが明らかになった。対照的に、MPCとそれから分離されたiSMCはどちらもデスミン+である（図３）。
【0143】
［実施例６－遺伝子発現］
実施例１に示すようにしてそれぞれ得られたMPCまたはMSCおよび実施例２に示すようなそれらに由来するiSMCの、1×106個の全RNAを、RNEasyキット（QIAGEN, Hilden, Germany）によって製造業者の指示に従って単離した。マイクロアレイハイブリダイゼーションのサンプル調製を、NuGEN Ovation PicoSL WTA System V2およびUGENEncore Biotin Moduleのマニュアル（NuGEN Technologies, Inc, San Carlos, CA, USA）に記載されているように実施した。ハイブリダイズしたアレイを洗浄し、Affymetrix Fluidics Station FS450で染色し、蛍光シグナルをAffymetrix GeneChip Scanner 3000 7Gで測定した。フルイディクスとスキャン機能を、Affymetrix GeneChip Command Consolev 4.1.3ソフトウェアによって制御した。サンプル処理を、Affymetrixサービスプロバイダーおよびコア施設「KFB - Center of Excellence for Fluorescent Bioanalytics」（Regensburg, Germany）で実施した。
実施例１に示すようにしてそれぞれ得られたMPCまたはMSCおよび実施例２に示すようなそれらに由来するiSMCの、1×106個の全RNAを、RNEasyキット（QIAGEN, Hilden, Germany）によって製造業者の指示に従って単離した。マイクロアレイハイブリダイゼーションのサンプル調製を、NuGEN Ovation PicoSL WTA System V2およびUGENEncore Biotin Moduleのマニュアル（NuGEN Technologies, Inc, San Carlos, CA, USA）に記載されているように実施した。ハイブリダイズしたアレイを洗浄し、Affymetrix Fluidics Station FS450で染色し、蛍光シグナルをAffymetrix GeneChip Scanner 3000 7Gで測定した。フルイディクスとスキャン機能を、Affymetrix GeneChip Command Consolev 4.1.3ソフトウェアによって制御した。サンプル処理を、Affymetrixサービスプロバイダーおよびコア施設「KFB - Center of Excellence for Fluorescent Bioanalytics」（Regensburg, Germany）で実施した。
【0144】
log2スケールで要約されたプローブセット信号を、Affymetrix GeneChip Expression Console v1.4でRMAアルゴリズムを使用して計算し、MPCとMPC-iSMCの間でlog2倍の変化が最も大きいプローブセットIDを、その後の分析とMSCとMSC-iSMCの間のlog2倍の変化との比較に使用した。分析されたすべての遺伝子の概要と、MSCとMSC-iSMCの間、およびMPCとMPC-iSMCの間のそれぞれのlog2倍の変化を（図１２）に示す。Log2倍の変化≧1を、アップレギュレーションを示すと見なしたので、アスタリスク（*）でマークする。log2倍の変化を視覚化し、階層的クラスタリングとユークリッド距離に応じたk-meansクラスタリングを実行するために、Multiple Expression Viewer（MeV 3.1.0）ソフトウェアを使用してヒートマップを生成した。
【0145】
本発明におけるiSMCの単離に関連する遺伝子発現の変化を研究するために、マイクロアレイ分析を実施した。スムーセリン（SMTN）、カルポニン1（CNN1）、トロポミオシン1（TPM1）、トランスゲリン（TGLN、SM22）、インテグリン-アルファ-3（ITGA3）、インテグリン-アルファ-1（ITGA1、CD49a）、ビンキュリン（VCL）およびメラノーマ細胞接着分子（MCAM、CD146）（Espagnolle et al., 2014; Miano, 2010; Xie et al., 2011）、ならびに筋原性コミットメント遺伝子デスミン（DES）（Capetanaki et al., 1997）、および血管平滑筋の収縮に必要なすべての遺伝子（「KEGG PATHWAY：血管平滑筋収縮-ホモサピエンス（ヒト）」、未検出）を詳細に分析した。MPCとそれに由来するiSMCとの間の遺伝子発現の変化を、MSCとそれに由来するiSMCとの間の変化と比較した。log2 FCが1以上およびlog2 FCが-1以下であることを、それぞれアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションと見なすと、MPCからMPC-iSMCへの分化中に、試験された123個の遺伝子の20.33パーセントがアップレギュレーションされ、わずか3.25パーセントがダウンレギュレーションされ、平滑筋細胞の表現型への分化が示唆された。MPCと比較してMPC-iSMCにおいて、KEGGクラスターまたは既知の平滑筋マーカー遺伝子のアップレギュレーションされた遺伝子は、PPP1R14A、KCNMB1、PLCB4、ACTG2、ITPR1、ADCY6、CALCRL、KCNMA1、GNA13、CNN1、ADCY2、KCNMB4、GUCY1A3、ARAF、ITGA1、PPP1R12A、MAPK1、CALD1、KCNMB2、PRKACB、ARHGEF11、PPP1R12C、ITPR2、PLCB1、およびSMTNであった（図１２）。
【0146】
log2 FCが1以上およびlog2 FCが-1以下であることを、それぞれアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションと見なすと、MSCからMSC-iSMCへの分化中に、試験された123個の遺伝子の12.20％がアップレギュレーションされ、わずか3.25％がダウンレギュレーションされ、平滑筋細胞の表現型への分化が示唆された。MSCと比較してMSC-iSMCにおいて、KEGGクラスターまたは既知の平滑筋マーカー遺伝子のアップレギュレーションされた遺伝子は、ACTA2、ACTG2、CALD1、GNAQ、ITPR1、MAPK1、MYL9、KCNMA1、PLCB4、PPP1R14A、PRKCE、CNN1、TPM1、TAGLN、およびITGA1であった（図１２）。CD49aをコードするITGA1およびスムーセリンタンパク質をコードするSMTNの遺伝子発現がMPC-iSMCでアップレギュレーションされていることがわかったという発見は、MPCと比較してMPC-iSMCにおいて、CD49a陽性細胞およびスムーセリン陽性細胞の割合が増加したという我々の発見を支持し、したがって、MPC-iSMCの平滑筋マーカー発現を確認するものである。CD49aをコードするITGA1の遺伝子発現がMSC-iSMCでアップレギュレーションされていることがわかったという発見は、MSCと比較してMSC-iSMCにおいて、CD49a陽性細胞の割合が増加したという我々の発見を支持し、したがって、MPCs-iSMCsの平滑筋マーカー発現を確認するものである。
【0147】
CD146（MCAM）表面タンパク質発現はMPC-iSMCでアップレギュレーションされたが、MCAM遺伝子発現はマイクロアレイ実験でアップレギュレーションされていないことがわかり、CD146発現の転写後調節が示唆された。さらに、MPC-iSMCおよびMSC-iSMCへの分化中にMPCおよびMSCの遺伝子発現が変化したlog2 FCのk-meansクラスター分析は、それらのiSMCがそれぞれ単離されたとき、MPCとMSCの間で同様にアップレギュレーション（図４Ａ）およびダウンレギュレーション（図４Ｂ）された遺伝子の同定につながった。PP1R14A、ACTG2、PLCB4、ITPR1、MAPK1、CNN1、ITGA1、およびKCNMA1は、MPCとMSCの両方でアップレギュレーションされたが、PLA2G2Aは両方の細胞型でダウンレギュレーションされた。全体として、試験された遺伝子の75.61パーセントは、iSMCへの分化時にMPCとMSCにおいて、同様にアップレギュレーションし、ダウンレギュレーションし、または両方ともしない。MSC（12.20％アップレギュレーションと5.69％ダウンレギュレーション）よりもMPC（20.33％アップレギュレーションと3.25％ダウンレギュレーション）において、より多くのアップレギュレーション遺伝子とより少ないダウンレギュレーション遺伝子が見つかったが、MPCとMSCの間にアップレギュレーション遺伝子とダウンレギュレーション遺伝子の割合に有意差は見られなかった（図４Ｃ）。
【0148】
［実施例７－融合能力］
実施例１および２それぞれによるMPCおよびiSMCの融合能力を、それらの融合指数（FI）に従って評価した。融合指数（FI）を決定するために、実施例３で骨格筋分化のために誘導された細胞をPBSで２回洗浄し、4％PFAで10分間固定した。次に、細胞をPBSで３回洗浄し、2μg/mL Hoechst33342溶液で20分間染色した。各サンプルについて、免疫蛍光イメージング中に少なくとも３つの視野を捕捉し、核と細胞の境界を簡単に検出できるように位相差画像を重ねた。分析されたすべての視野の平均を計算した後、チューブ内の核の数を視野あたりの核の総数で割ることにより、捕捉された視野ごとに融合指数を計算した。少なくとも3つの核を持つ細胞のみを筋管と見なした。統計分析のために、各グループについて、異なる患者に由来する少なくとも3つの集団を分析した。
実施例１および２それぞれによるMPCおよびiSMCの融合能力を、それらの融合指数（FI）に従って評価した。融合指数（FI）を決定するために、実施例３で骨格筋分化のために誘導された細胞をPBSで２回洗浄し、4％PFAで10分間固定した。次に、細胞をPBSで３回洗浄し、2μg/mL Hoechst33342溶液で20分間染色した。各サンプルについて、免疫蛍光イメージング中に少なくとも３つの視野を捕捉し、核と細胞の境界を簡単に検出できるように位相差画像を重ねた。分析されたすべての視野の平均を計算した後、チューブ内の核の数を視野あたりの核の総数で割ることにより、捕捉された視野ごとに融合指数を計算した。少なくとも3つの核を持つ細胞のみを筋管と見なした。統計分析のために、各グループについて、異なる患者に由来する少なくとも3つの集団を分析した。
【0149】
FIの定量化により、有意により多くのMPCが、実施例２でMPCから単離されたiSMCと比較して骨格筋形成を受けたことが示され、MPCからiSMCを単離するとMPCの骨格筋形成能が低下することが示唆される（図５Ａ）。さらに、iSMCによって形成されたチューブは、MPCによって形成されたチューブよりも有意に少ない核を含んでいた（図５Ｂ）。まとめると、MPCは融合コンピテントであるように見えるが、MPC由来のiSMCは非融合コンピテントであると考えられる。
【0150】
［実施例８－電気生理学］
以前に公開されたプロトコル（Park et al., 2013）に従って、実験固有のわずかな適応を加えて、それぞれ実施例１および２に従って取得されたMPCおよびiSMCにおいて、パッチクランプ分析を実施した。手順は以下のとおりである。Axopatch 200Aパッチクランプ増幅器（Axon Instruments, Foster City）を使用して、全細胞の構成で電気生理学的記録を実施した。抵抗が1から4MΩのパッチピペットを、ホウケイ酸ガラス（GC150F-7.5, Clark Electromedical Instruments, UK）から作成し、ピペット溶液で満たした。すべてのデータを、DIGIDATA 1200インターフェース（Axon Instruments, Foster City）を使用してデジタル化し、４極ベッセルフィルターによって平滑化し、ディスクに保存した。電流トレースを10kHzでサンプリングし、2kHzでフィルタリングした。データ取得にはpClampソフトウェアパッケージ（バージョン10.0 Axon Instruments, Inc.）を使用した。分析にはMicrocal Origin 7.0を使用した。特に明記しない限り、試薬はSigma-Aldrichから入手した。電位依存性Cavチャネルの内向き電流を、-50～50mVの保持電位から500msの脱分極パルスを印加することによって誘発した。Kvチャネルの重ね合わせ電流トレースを、MPC、MPC-iSMC、およびhBd-SMCにおける80mVの保持電位から20mVのステップで-80～60mVの間のステップ脱分極パルスによって誘発した。
以前に公開されたプロトコル（Park et al., 2013）に従って、実験固有のわずかな適応を加えて、それぞれ実施例１および２に従って取得されたMPCおよびiSMCにおいて、パッチクランプ分析を実施した。手順は以下のとおりである。Axopatch 200Aパッチクランプ増幅器（Axon Instruments, Foster City）を使用して、全細胞の構成で電気生理学的記録を実施した。抵抗が1から4MΩのパッチピペットを、ホウケイ酸ガラス（GC150F-7.5, Clark Electromedical Instruments, UK）から作成し、ピペット溶液で満たした。すべてのデータを、DIGIDATA 1200インターフェース（Axon Instruments, Foster City）を使用してデジタル化し、４極ベッセルフィルターによって平滑化し、ディスクに保存した。電流トレースを10kHzでサンプリングし、2kHzでフィルタリングした。データ取得にはpClampソフトウェアパッケージ（バージョン10.0 Axon Instruments, Inc.）を使用した。分析にはMicrocal Origin 7.0を使用した。特に明記しない限り、試薬はSigma-Aldrichから入手した。電位依存性Cavチャネルの内向き電流を、-50～50mVの保持電位から500msの脱分極パルスを印加することによって誘発した。Kvチャネルの重ね合わせ電流トレースを、MPC、MPC-iSMC、およびhBd-SMCにおける80mVの保持電位から20mVのステップで-80～60mVの間のステップ脱分極パルスによって誘発した。
【0151】
実施例２によって得られた細胞は、電位依存性カルシウムチャネルまたは電位依存性カリウムチャネルそれぞれの、電位感受性の内向きの電流も外向きの電流も示さないことが見出された。反対に、実施例２のMPC由来のiSMCは、hBd-SMCにも見られるように、電位感受性の内向き電流と外向き電流の両方を示した（図６）。要約すると、TGFb1およびヘパリンとのインキュベーションによるiSMCの単離は、機能的成熟をもたらす。
【0152】
［実施例９－コラーゲンゲル格子収縮］
実施例１に従って得たMSCおよびMPC、ならびに実施例２によってそれらから誘導したiSMCの収縮性を測定するために、コラーゲンゲル格子に播種し、パーセントゲルサイズの減少を定量化した。詳細には、標準的な細胞培養容器内のサブコンフルエントな細胞から培地を除去し、細胞を1×PBSで２回洗浄した。次に、細胞をトリプシンで覆い、37℃で5分間インキュベートした。その後、培養容器の壁を軽くたたくことによって細胞を剥離し、DMEM／ハムのF12基本培地の添加後に再懸濁した。次に、細胞を400×gで10分間遠心分離した。
実施例１に従って得たMSCおよびMPC、ならびに実施例２によってそれらから誘導したiSMCの収縮性を測定するために、コラーゲンゲル格子に播種し、パーセントゲルサイズの減少を定量化した。詳細には、標準的な細胞培養容器内のサブコンフルエントな細胞から培地を除去し、細胞を1×PBSで２回洗浄した。次に、細胞をトリプシンで覆い、37℃で5分間インキュベートした。その後、培養容器の壁を軽くたたくことによって細胞を剥離し、DMEM／ハムのF12基本培地の添加後に再懸濁した。次に、細胞を400×gで10分間遠心分離した。
【0153】
上清を除去し、細胞ペレットをDMEM／ハムのF12に再懸濁して、1mlあたり6×105個の細胞を得た。各ゲルについて、400μlの細胞懸濁液を200μlのウシ皮膚由来のコラーゲン溶液（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）と混合した。次に、3μlの0.1M NaOHを添加した後、直ちに再懸濁し、500μlの混合物を24ウェルプレート（NUNC, Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）のウェルに移した。次に、24ウェルプレートを37℃で30分間インキュベートして、ゲルを形成させた。その後、各ゲルを500μlのDMEM／ハムのF12で覆い、滅菌ピペットチップを使用して24ウェルプレートの底から解放させて表面に浮かせた。最後に、ゲルを37℃、5％CO2で24時間インキュベートして、含まれる細胞によるゲルの収縮を可能にした。ゲルの収縮を定量化するために、立体顕微鏡写真を撮影し、FIJI（image J）ソフトウェアを用いてゲルの面積を計算した。
【0154】
本発明のステップ（ａ）（実施例１）に従って単離されたMPCおよびMSCは、コラーゲンゲル格子収縮アッセイにおいて非収縮性であることが見出された。対照的に、本発明のステップ（ｂ）（実施例２）に従ってMPCおよびMSCから単離されたiSMCは、（MPC、MSC）に由来する細胞よりも有意に高い収縮性を示した。要約すると、iSMCに分化転換され、ステップ（ｂ）（実施例2）に従って分離されたSMDCは、ステップ（ａ）（実施例１；図７）で単離された細胞と比較して収縮性であることがわかった。
【0155】
［実施例１０－iSMCを使用した平滑筋の再生］
平滑筋の再生に関して実施例２に従って得られたiSMCの可能性を試験するために、マウスMPCに由来するiSMC（実施例１に従って得られた）を成体雌SHO-PrkdcscidHrhrマウスの幽門括約筋に注射した。このために、マウスは最初に腹腔内に100mg/kgのケタミン、10mg/kgのキシラジンと3mg/kgのアセプロマジンを適用することによって麻酔された。処置中に眼を保護するクリームを塗布した。凍結保存した細胞を新たに解凍し、1×PBSで１回洗浄し、400×gで10分間遠心分離した後、細胞を1×PBSに再懸濁して、最終濃度を40 000 000細胞/mlにした。一方、細胞を受け取ったマウスは、体温を37℃に維持するために加熱プレート上に置いた。次に、25μlの細胞懸濁液（1 000 000個の細胞を含む）を、5μlのFluoSpheres（登録商標）ポリスチレンビーズ、15μmのイエローグリーンまたはブルー（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）と混合したが、これは、手術後に注射の位置を追跡するために必要であった。幽門括約筋へのiSMC注射では、正中開腹術を実施した後、幽門括約筋領域の位置を特定し、1mlシリンジに取り付けられた28G針を使用して30μlの細胞－蛍光球混合物を適用した。腹膜および筋肉皮膚層を、6-0エチコンPDSおよび吸収性モノフィラメントを用いた連続的な縫合によって別々に閉じた。術後、体重１キログラムあたり200mgのノバルギン（Metamizol（登録商標））を３日間皮下投与した。細胞注射の12週間後、幽門括約筋を取得して画像化するために、頸椎脱臼によってマウスを犠牲にした。
平滑筋の再生に関して実施例２に従って得られたiSMCの可能性を試験するために、マウスMPCに由来するiSMC（実施例１に従って得られた）を成体雌SHO-PrkdcscidHrhrマウスの幽門括約筋に注射した。このために、マウスは最初に腹腔内に100mg/kgのケタミン、10mg/kgのキシラジンと3mg/kgのアセプロマジンを適用することによって麻酔された。処置中に眼を保護するクリームを塗布した。凍結保存した細胞を新たに解凍し、1×PBSで１回洗浄し、400×gで10分間遠心分離した後、細胞を1×PBSに再懸濁して、最終濃度を40 000 000細胞/mlにした。一方、細胞を受け取ったマウスは、体温を37℃に維持するために加熱プレート上に置いた。次に、25μlの細胞懸濁液（1 000 000個の細胞を含む）を、5μlのFluoSpheres（登録商標）ポリスチレンビーズ、15μmのイエローグリーンまたはブルー（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）と混合したが、これは、手術後に注射の位置を追跡するために必要であった。幽門括約筋へのiSMC注射では、正中開腹術を実施した後、幽門括約筋領域の位置を特定し、1mlシリンジに取り付けられた28G針を使用して30μlの細胞－蛍光球混合物を適用した。腹膜および筋肉皮膚層を、6-0エチコンPDSおよび吸収性モノフィラメントを用いた連続的な縫合によって別々に閉じた。術後、体重１キログラムあたり200mgのノバルギン（Metamizol（登録商標））を３日間皮下投与した。細胞注射の12週間後、幽門括約筋を取得して画像化するために、頸椎脱臼によってマウスを犠牲にした。
【0156】
新たに単離された幽門括約筋領域のイメージングを、IVIS Spectrum（PerkinElmer, MA, USA）を用いて、Living Image（登録商標）ソフトウェアバージョン4.5.2（PerkinElmer, MA, USA）を製造元の指示に従って使用することによって、実行した。要するに、注射されたSHOマウスと対照のSHOマウスの幽門括約筋を、ガラスペトリ皿上に置き、IVISシステム内に置いた。TdTomatoおよび黄色のFluosphereビーズの対応する吸収および発光波長の自動露光時間で、高さ2cmで蛍光写真を撮影した。バックグラウンド信号を取り除くために、対照マウスからの括約筋外植片と比較することによって、事後の信号強度を調整した。
【0157】
組織学的分析のために、動物をイソフルランで深く麻酔し、頸椎脱臼によって犠牲にした。関心のある組織を直ちに解剖し、液体窒素で冷却した2-メチルブタンに浸すことにより凍結固定した。Leica 1950クライオスタット上で組織を15μmに切断し、Superfrost plusスライド上に切片を集め、さらに処理するまで-20℃で保存した。免疫組織学的分析のために、切片を4％PFAで固定し、0.1％Tween-20（Sigma-Aldrich）を含むPBSで洗浄した。ブロッキングおよび抗体希釈を、1％ウシ血清アルブミン画分（Sigma-Aldrich）、0.2％魚皮ゼラチン（Sigma-Aldrich）および0.1％Tween-20（Sigma-Aldrich）を含むPBS溶液を使用して実施した。tdTomato（Sicgen）またはaSMA（Thermo Scientific, MA, USA）に対する一次抗体を、4℃で一晩インキュベートした後、ブロッキング培地で1:100に希釈した。二次抗体（Thermo Scientific）を1:500に希釈し、室温で4時間適用した。核を、0.5μg/mlの作業濃度に希釈したDAPI（Sigma-Aldrich）で染色した。その後、Prolong Gold Antifade（Life Technologies）を使用して切片をマウントした。LSM 710共焦点顕微鏡とZEN 2011 Black Software（Carl Zeiss）を使用して蛍光画像を取得した。
【0158】
本発明者らは、実施例１に従って得られたMPCを発現するTdTomatoレポータータンパク質から実施例２に従って単離されたiSMCが、検出可能であり、移植後12週間で幽門括約筋の部位に同時注入された蛍光ビーズと共局在することを発見し、これは、注射部位でiSMCが生着したことを示唆した。組織学的検査とそれに続くTdTomatoおよびaSMAの蛍光免疫染色により、TdTomato陽性のiSMC細胞が、幽門括約筋の円形筋および同時注入された蛍光ビーズの近くの粘膜筋板内に見られることが示唆された（図８）。幽門括約筋の平滑筋層内にあるTdTomato陽性iSMC細胞も、aSMAタンパク質を発現し、これは、平滑筋組織への生着だけでなく、平滑筋再生に必要な生着後の平滑筋細胞の表現型特性も保存されていることを示唆している（図８）。
【0159】
［実施例１１－組織工学平滑筋］
組織工学で使用するための本明細書の方法によって得られた細胞の適合性を試験するために、3D細胞培養を実施した。実施例１または２に従って得られた細胞を使用して、当技術分野で既に知られているリング状の括約筋様構造の生成を可能にする方法（Gwyther et al., 2011）を採用した。3D培養用の培養容器を製造するため、オートクレーブ可能なPDMSネガティブテンプレートを製造するためのリング状の彫刻を備えたテンプレート（内径4mm、外径10mm）をステンレス鋼で作成した。次に、ハムのF10基本培地を250mlまで満たしたSchott（登録商標）フラスコ中で、5gの低ゲル化アガロース（Sigma-Aldrich, MA, USA）を秤量することにより、2％（w/v）アガロース溶液を調製した。次に、PDMSテンプレートとアガロース溶液の両方を121℃で20分間オートクレーブ処理した。その後、PDMSテンプレートを滅菌条件下においてアガロース溶液で満たし、続いて室温で1時間インキュベートしてアガロースを固化させた。次のステップでは、固化したアガロースをPDMSテンプレートから取り離し、それぞれ１つのリング状のテンプレートを含む立方体をアガロースから切り出し、2mlのハムのF10基本培地を満たした6ウェルプレートに移し、さらに使用するまで37℃で保存した。3D培養のために、実施例１で得られた細胞を400×gで10分間遠心分離し、細胞ペレットを培養培地に再懸濁して、5×106細胞/mlの濃度に到達させた。次に、200μlの細胞懸濁液をアガローステンプレートに加え、さらに乱すことなく37℃で48時間インキュベートして、細胞のリングを形成させた。インキュベーション時間後、6ウェルプレート内のテンプレートの外側の培地を廃棄し、6ウェルプレートに実施例１で使用した5mlの培地を注意深く満たして、3D培養MPCまたはMSCを生成させ、または実施例２で使用した後者のいずれかで、iSMCの3D培養を生成させた。細胞を6日間培養し、分析まで37℃、5％CO2で成熟させた。培養の6日後、細胞を標準的な光学顕微鏡法、凍結切片化とそれに続く免疫染色（実施例１２）またはH&E染色、走査型電子顕微鏡法または半／超薄切片化とそれに続くトルイジンブルー染色または透過型電子顕微鏡法によって分析した。実施例２に記載のようにiSMCに向けて分化転換された実施例１に従って誘導されたMPCは、Gwyther et al., 2014に基づく上記の方法を使用することによってリング状括約筋を形成した（図９）。
組織工学で使用するための本明細書の方法によって得られた細胞の適合性を試験するために、3D細胞培養を実施した。実施例１または２に従って得られた細胞を使用して、当技術分野で既に知られているリング状の括約筋様構造の生成を可能にする方法（Gwyther et al., 2011）を採用した。3D培養用の培養容器を製造するため、オートクレーブ可能なPDMSネガティブテンプレートを製造するためのリング状の彫刻を備えたテンプレート（内径4mm、外径10mm）をステンレス鋼で作成した。次に、ハムのF10基本培地を250mlまで満たしたSchott（登録商標）フラスコ中で、5gの低ゲル化アガロース（Sigma-Aldrich, MA, USA）を秤量することにより、2％（w/v）アガロース溶液を調製した。次に、PDMSテンプレートとアガロース溶液の両方を121℃で20分間オートクレーブ処理した。その後、PDMSテンプレートを滅菌条件下においてアガロース溶液で満たし、続いて室温で1時間インキュベートしてアガロースを固化させた。次のステップでは、固化したアガロースをPDMSテンプレートから取り離し、それぞれ１つのリング状のテンプレートを含む立方体をアガロースから切り出し、2mlのハムのF10基本培地を満たした6ウェルプレートに移し、さらに使用するまで37℃で保存した。3D培養のために、実施例１で得られた細胞を400×gで10分間遠心分離し、細胞ペレットを培養培地に再懸濁して、5×106細胞/mlの濃度に到達させた。次に、200μlの細胞懸濁液をアガローステンプレートに加え、さらに乱すことなく37℃で48時間インキュベートして、細胞のリングを形成させた。インキュベーション時間後、6ウェルプレート内のテンプレートの外側の培地を廃棄し、6ウェルプレートに実施例１で使用した5mlの培地を注意深く満たして、3D培養MPCまたはMSCを生成させ、または実施例２で使用した後者のいずれかで、iSMCの3D培養を生成させた。細胞を6日間培養し、分析まで37℃、5％CO2で成熟させた。培養の6日後、細胞を標準的な光学顕微鏡法、凍結切片化とそれに続く免疫染色（実施例１２）またはH&E染色、走査型電子顕微鏡法または半／超薄切片化とそれに続くトルイジンブルー染色または透過型電子顕微鏡法によって分析した。実施例２に記載のようにiSMCに向けて分化転換された実施例１に従って誘導されたMPCは、Gwyther et al., 2014に基づく上記の方法を使用することによってリング状括約筋を形成した（図９）。
【0160】
［実施例１２－凍結切片化および免疫染色］
実施例１１に従って得られたリング形状の3D培養物（バイオエンジニアリング括約筋）の組織学的分析のために、滅菌スプーンを使用してリングをアガローステンプレートから注意深く取り出し、1×PBSで満たされたEppendorfチューブに移すことによって洗浄し、次に、-20℃に予冷したMetOHに5分間浸すことによって固定して透過処理した。次に、溶液の半分を除去した後、MetOHを1×PBSで３回希釈することによりリングを洗浄した。バイオエンジニアリングされた括約筋を、液体窒素で冷却した2-メチルブタンに浸すことによって凍結固定した。標本をCM1950クライオスタット（Leica, Germany）上で15μmに切断し、Superfrost plusスライド（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）上に切片を集め、さらに処理するまで-20℃で保存した。ブロッキングおよび抗体希釈を、1％ウシ血清アルブミン画分（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）、0.2％魚皮ゼラチン（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）および0.1％Tween-20（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）を含むPBS溶液を使用して実施した。一次抗体aSMA（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）を、4℃で一晩インキュベートした後、ブロッキング培地で1:100に希釈した。二次抗体（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）を1:500に希釈し、室温で4時間適用した。核を、0.5μg/mlの作業濃度に希釈したDAPI（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）で染色し、アクチンフィラメントをPBSで1:100に希釈したファロイジン（Thermo-Fisher Scientific, MA USA)）と室温で20分間インキュベートして染色した。その後、Prolong Gold Antifade（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）を使用して切片をマウントした。Nikon Eclipse TE2000-U倒立顕微鏡を使用して蛍光画像を取得した。
実施例１１に従って得られたリング形状の3D培養物（バイオエンジニアリング括約筋）の組織学的分析のために、滅菌スプーンを使用してリングをアガローステンプレートから注意深く取り出し、1×PBSで満たされたEppendorfチューブに移すことによって洗浄し、次に、-20℃に予冷したMetOHに5分間浸すことによって固定して透過処理した。次に、溶液の半分を除去した後、MetOHを1×PBSで３回希釈することによりリングを洗浄した。バイオエンジニアリングされた括約筋を、液体窒素で冷却した2-メチルブタンに浸すことによって凍結固定した。標本をCM1950クライオスタット（Leica, Germany）上で15μmに切断し、Superfrost plusスライド（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）上に切片を集め、さらに処理するまで-20℃で保存した。ブロッキングおよび抗体希釈を、1％ウシ血清アルブミン画分（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）、0.2％魚皮ゼラチン（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）および0.1％Tween-20（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）を含むPBS溶液を使用して実施した。一次抗体aSMA（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）を、4℃で一晩インキュベートした後、ブロッキング培地で1:100に希釈した。二次抗体（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）を1:500に希釈し、室温で4時間適用した。核を、0.5μg/mlの作業濃度に希釈したDAPI（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）で染色し、アクチンフィラメントをPBSで1:100に希釈したファロイジン（Thermo-Fisher Scientific, MA USA)）と室温で20分間インキュベートして染色した。その後、Prolong Gold Antifade（Thermo-Fisher Scientific, MA, USA）を使用して切片をマウントした。Nikon Eclipse TE2000-U倒立顕微鏡を使用して蛍光画像を取得した。
【0161】
実施例１０に従って得られた組織リング内の細胞は、アルファ平滑筋アクチンおよびデスミンについて陽性であることが見出された（図１０）。MPC由来の組織リング内では、aSMAは特にリングの外層の細胞によって発現されたが、iSMCを含む組織リング内では、aSMA発現細胞はリング全体に分布していた。詳細には、実施例２および１０の組み合わせによる3D培養中にiSMCに分化したMPCから形成されたリング内の細胞は、MPCから形成されたリング内の細胞よりも多くのaSMAを発現することが見出された（図１０）。対照的に、デスミンは、MPC由来とiSMC由来の両方の組織リングにおいて、組織リング全体に発現した（図１０）。
【0162】
［実施例１３－走査型電子顕微鏡検査］
走査型電子顕微鏡検査を、インスブルック医科大学の組織学および発生学の学部で、ありがたいことに、Angelika FloerlとKristian Pfallerの助けを借りて行った。走査型電子顕微鏡による実施例１および２（セクション3.2.26で説明）によって得られた3D培養細胞の分析のために、リングをアガローステンプレートから解放し、1×PBSを含む1.5ml Eppendorf（登録商標）チューブで１回洗浄し、次に予冷（-20°C）したMetOHで固定し、続いて1％四酸化オスミウムで1時間後固定し、EtOHで脱水し、Bal-Tec CPD 030臨界点乾燥機（Balzers, Lichtenstein）で臨界点乾燥した。15nm Au/Pdでスパッタコーティングされたアルミニウムスタブ（Balzers）上に導電性カーボンセメントLeit-C after Goecke（Plano GmbH, Wetzlar, Germany）で試料を取り付け、Gemini 982走査型電子顕微鏡（Carl Zeiss）で検査した。実施例１に従って得られ、実施例２に記載されるように3D培養中（実施例２）にiSMCに向かって分化転換したMPCは、細長く見え、実施例１０で形成された組織リングの表面上の組織リングの不可欠な部分として現れた（図９）。細胞はリングの表面に無傷で現れ、潜在的に生存可能であった（図９）。
走査型電子顕微鏡検査を、インスブルック医科大学の組織学および発生学の学部で、ありがたいことに、Angelika FloerlとKristian Pfallerの助けを借りて行った。走査型電子顕微鏡による実施例１および２（セクション3.2.26で説明）によって得られた3D培養細胞の分析のために、リングをアガローステンプレートから解放し、1×PBSを含む1.5ml Eppendorf（登録商標）チューブで１回洗浄し、次に予冷（-20°C）したMetOHで固定し、続いて1％四酸化オスミウムで1時間後固定し、EtOHで脱水し、Bal-Tec CPD 030臨界点乾燥機（Balzers, Lichtenstein）で臨界点乾燥した。15nm Au/Pdでスパッタコーティングされたアルミニウムスタブ（Balzers）上に導電性カーボンセメントLeit-C after Goecke（Plano GmbH, Wetzlar, Germany）で試料を取り付け、Gemini 982走査型電子顕微鏡（Carl Zeiss）で検査した。実施例１に従って得られ、実施例２に記載されるように3D培養中（実施例２）にiSMCに向かって分化転換したMPCは、細長く見え、実施例１０で形成された組織リングの表面上の組織リングの不可欠な部分として現れた（図９）。細胞はリングの表面に無傷で現れ、潜在的に生存可能であった（図９）。
【0163】
［実施例１４－透過型電子顕微鏡検査］
透過型電子顕微鏡検査を、実施例１０に従って得られた組織リングに対して実施した。したがって、リングをアガローステンプレートから解放し、洗浄のために、1×PBSで満たされた1.5ml Eppendorfチューブに移した。次に、サンプルを、固定および保存（4℃）のために、0.1Mリン酸緩衝液（pH 7.3）中の2.5％グルタルアルデヒドで満たされた新しいEppendorf（登録商標）チューブに移した。少なくとも24時間固定した後、リングをリン酸緩衝液で２回洗浄し、1％OsO4で45分間固定した。その後、リングを蒸留水で15分ごとに３回洗浄した。次に、リングを、EtOH濃度を上げながら（70、80、90、100％）、30分ごとに脱液し、そして、新しい100％アセトン中で20分ごとに２回インキュベートした。次に、標本を2:1アセトン-Epon混合物に150分間包埋し、続いて1:2アセトン-Epon混合物中で一晩インキュベートした。最後に、リングを、回転子上で回転する純粋なEponで、8時間後にEponを交換して24時間インキュベートした。Eponの重合のために、リングを60℃で24時間インキュベートした。Eponで包埋した標本を、Ultratrim（Reichert）を使用してトリミングし、Ultracut S（Reichert）を使用して超薄切片を取得した。超薄切片を、MORADA CCDカメラ（Olympus/SIS製）を備えたCM120 TEM（Philips/FEI製）を使用して80kVで観察した。
透過型電子顕微鏡検査を、実施例１０に従って得られた組織リングに対して実施した。したがって、リングをアガローステンプレートから解放し、洗浄のために、1×PBSで満たされた1.5ml Eppendorfチューブに移した。次に、サンプルを、固定および保存（4℃）のために、0.1Mリン酸緩衝液（pH 7.3）中の2.5％グルタルアルデヒドで満たされた新しいEppendorf（登録商標）チューブに移した。少なくとも24時間固定した後、リングをリン酸緩衝液で２回洗浄し、1％OsO4で45分間固定した。その後、リングを蒸留水で15分ごとに３回洗浄した。次に、リングを、EtOH濃度を上げながら（70、80、90、100％）、30分ごとに脱液し、そして、新しい100％アセトン中で20分ごとに２回インキュベートした。次に、標本を2:1アセトン-Epon混合物に150分間包埋し、続いて1:2アセトン-Epon混合物中で一晩インキュベートした。最後に、リングを、回転子上で回転する純粋なEponで、8時間後にEponを交換して24時間インキュベートした。Eponの重合のために、リングを60℃で24時間インキュベートした。Eponで包埋した標本を、Ultratrim（Reichert）を使用してトリミングし、Ultracut S（Reichert）を使用して超薄切片を取得した。超薄切片を、MORADA CCDカメラ（Olympus/SIS製）を備えたCM120 TEM（Philips/FEI製）を使用して80kVで観察した。
【0164】
実施例１０に従って得られた組織リングの透過型電子顕微鏡法により、細胞がそれらの原形質膜の近くにカベオラを形成したことが明らかになった（図１１ＡおよびＢ）。さらに、組織リング内の細胞は優勢なアクチン構造を有しており（図Ｃ）、細胞の一部で高密度体のような高密度のパッケージ構造を形成していることがわかった（図Ｄ）。
【0165】
［実施例１５－マウスMPC-iSMCの表面マーカー発現］
マウスMPC-iSMCの表面マーカー発現を測定するために、Guava easyCyte 6HT 2Lフローサイトメーター（Merck Millipore, Darmstadt, Germany）でフローサイトメトリーを実施した。簡単に説明すると、実施例１によって得られたマウスMPC-iSMCを、市販のマウス細胞表面マーカースクリーニングパネル（BD biosciences, NJ, USA）の抗体染色手順に使用した。したがって、細胞を増殖培地に1mlあたり1.25×106細胞の濃度で懸濁させ、100μlの一定分量の細胞懸濁液を、製造元の指示に従って96ウェルプレート中のすべての一次抗体と混合した。混合物を4℃で30分間インキュベートした後、100μlの増殖培地を各ウェルに添加し、プレートを300×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、200μlの増殖培地を各ウェルに添加し、さらなる遠心分離、上清の除去、および100μlのビオチン化二次抗体（製造元の指示に従って調製）への細胞の再懸濁を行った。再び細胞を4℃で30分間インキュベートした後、100μlの増殖培地を各ウェルに添加し、プレートを300×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、200μlの増殖培地を各ウェルに添加し、さらなる遠心分離、上清の除去、および100μlのAlexa647コンジュゲートストレプトアビジン（製造元の指示に従って調製）への細胞の再懸濁を行った。再び細胞を4℃で30分間インキュベートした後、100μlの増殖培地を各ウェルに添加し、プレートを300×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、200μlの増殖培地を各ウェルに添加し、さらなる遠心分離、上清の除去、および10％FCSを添加した200μlのハムのF10への細胞の再懸濁を行った。最後に、Guava InCyte（商標）v.2.3ソフトウェアを使用して細胞事象を取得した。ヒストグラムとドットプロットを、1.8μL/mLのサンプル流量において最低5000事象で生成した。陽性染色を、少なくとも95％陰性として設定されたアイソタイプ対照との比較、または対照（陰性）細胞との比較によって得た。実施例３のマウスiSMCは、CD49e-であることが見出された（図１３）。
マウスMPC-iSMCの表面マーカー発現を測定するために、Guava easyCyte 6HT 2Lフローサイトメーター（Merck Millipore, Darmstadt, Germany）でフローサイトメトリーを実施した。簡単に説明すると、実施例１によって得られたマウスMPC-iSMCを、市販のマウス細胞表面マーカースクリーニングパネル（BD biosciences, NJ, USA）の抗体染色手順に使用した。したがって、細胞を増殖培地に1mlあたり1.25×106細胞の濃度で懸濁させ、100μlの一定分量の細胞懸濁液を、製造元の指示に従って96ウェルプレート中のすべての一次抗体と混合した。混合物を4℃で30分間インキュベートした後、100μlの増殖培地を各ウェルに添加し、プレートを300×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、200μlの増殖培地を各ウェルに添加し、さらなる遠心分離、上清の除去、および100μlのビオチン化二次抗体（製造元の指示に従って調製）への細胞の再懸濁を行った。再び細胞を4℃で30分間インキュベートした後、100μlの増殖培地を各ウェルに添加し、プレートを300×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、200μlの増殖培地を各ウェルに添加し、さらなる遠心分離、上清の除去、および100μlのAlexa647コンジュゲートストレプトアビジン（製造元の指示に従って調製）への細胞の再懸濁を行った。再び細胞を4℃で30分間インキュベートした後、100μlの増殖培地を各ウェルに添加し、プレートを300×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、200μlの増殖培地を各ウェルに添加し、さらなる遠心分離、上清の除去、および10％FCSを添加した200μlのハムのF10への細胞の再懸濁を行った。最後に、Guava InCyte（商標）v.2.3ソフトウェアを使用して細胞事象を取得した。ヒストグラムとドットプロットを、1.8μL/mLのサンプル流量において最低5000事象で生成した。陽性染色を、少なくとも95％陰性として設定されたアイソタイプ対照との比較、または対照（陰性）細胞との比較によって得た。実施例３のマウスiSMCは、CD49e-であることが見出された（図１３）。
【0166】
［実施例１６－フローサイトメトリーによる細胞内マーカーの分析］
簡単に説明すると、実施例１によって得られたMPCおよびMPC-iSMCを、付着細胞を37℃で５分間1×トリプシンで覆うことによって収集し、その後、剥離した細胞を400×ｇで遠心分離した。細胞を計数および分取して50,000細胞/反応を達成し、次に400×gで遠心分離した後、BD Cytofix/Cytoperm固定・透過処理溶液（BD Biosciences, Pharmingen（商標））に再懸濁し、4℃で20分間インキュベートした。その後、細胞をBD Perm/Wash緩衝液（aqua destで1:10に希釈）（BD Biosciences, Pharmingen（商標））で洗浄し、遠心分離した。次に、細胞を1×PBSに再懸濁し、IgGアイソタイプコントロール-Alexa488（Bioss Antibodies Inc., MA, USA）または抗Pax-7-Alexa488（Bioss Antibodies Inc., MA, USA）と暗所にて4℃で1時間インキュベートした。続いて、細胞を遠心分離し、BD Perm/Wash緩衝液（aqua destで1:10に希釈）で洗浄し、最後の遠心分離ステップの後、1×PBSに再懸濁した。Guava InCyte（商標）v.2.3ソフトウェアを使用して細胞事象を取得しました。ヒストグラムを、1.8μl/mlのサンプル流量において最低3000事象で生成した。陽性細胞のパーセンテージを、99％陰性として設定されたアイソタイプ対照との比較によって得た。
簡単に説明すると、実施例１によって得られたMPCおよびMPC-iSMCを、付着細胞を37℃で５分間1×トリプシンで覆うことによって収集し、その後、剥離した細胞を400×ｇで遠心分離した。細胞を計数および分取して50,000細胞/反応を達成し、次に400×gで遠心分離した後、BD Cytofix/Cytoperm固定・透過処理溶液（BD Biosciences, Pharmingen（商標））に再懸濁し、4℃で20分間インキュベートした。その後、細胞をBD Perm/Wash緩衝液（aqua destで1:10に希釈）（BD Biosciences, Pharmingen（商標））で洗浄し、遠心分離した。次に、細胞を1×PBSに再懸濁し、IgGアイソタイプコントロール-Alexa488（Bioss Antibodies Inc., MA, USA）または抗Pax-7-Alexa488（Bioss Antibodies Inc., MA, USA）と暗所にて4℃で1時間インキュベートした。続いて、細胞を遠心分離し、BD Perm/Wash緩衝液（aqua destで1:10に希釈）で洗浄し、最後の遠心分離ステップの後、1×PBSに再懸濁した。Guava InCyte（商標）v.2.3ソフトウェアを使用して細胞事象を取得しました。ヒストグラムを、1.8μl/mlのサンプル流量において最低3000事象で生成した。陽性細胞のパーセンテージを、99％陰性として設定されたアイソタイプ対照との比較によって得た。
【0167】
［実施例１７－酵素活性の分析］
［アセチルコリンエステラーゼ活性測定］
＜試薬と標準的な調製＞
米国公衆衛生学会（APHA）リン酸緩衝液、pH 7.2（Sigma-Aldrich Co. LLC, Germany）を製造元の指示に従って調製した。要約すると、17gの粉末混合物（リン酸一カリウム、22.66g/Lおよび炭酸ナトリウム7.78g/L）を400mLの蒸留水に加えた。0.5mL Triton X-100を加えた後、混合物を室温で30分間、マグネチックスターラー上で溶解した。最終容量をメスシリンダー中で500mLにし、さらに希釈することなく使用した。緩衝液は使用するまで4℃で保存した。エルマン試薬（5,5'-ジチオビス-2-ニトロ安息香酸、DTNB、0.5mM）を、1.5mL Eppendorfチューブに2mgを秤量することにより、各AChE分析用に新たに調製した。それを、1～2分間ボルテックスして1mLのリン酸緩衝液（0.1％ triton X-100を含むpH 7.2）に溶解した。最終容量を、リン酸緩衝液（0.1％ triton X-100を含むpH 7.2）を含む15mLファルコンチューブ中で10mLにし、使用するまで4℃で保存した。アセチルコリンチオヨージド（ATI、5.76mM）を、1.5mL Eppendorfチューブに2mgを秤量することにより、各AChE分析用に新たに調製した。それを、1～2分間ボルテックスして1.2mLの蒸留水に溶解し、使用するまで4℃で保存した。
［アセチルコリンエステラーゼ活性測定］
＜試薬と標準的な調製＞
米国公衆衛生学会（APHA）リン酸緩衝液、pH 7.2（Sigma-Aldrich Co. LLC, Germany）を製造元の指示に従って調製した。要約すると、17gの粉末混合物（リン酸一カリウム、22.66g/Lおよび炭酸ナトリウム7.78g/L）を400mLの蒸留水に加えた。0.5mL Triton X-100を加えた後、混合物を室温で30分間、マグネチックスターラー上で溶解した。最終容量をメスシリンダー中で500mLにし、さらに希釈することなく使用した。緩衝液は使用するまで4℃で保存した。エルマン試薬（5,5'-ジチオビス-2-ニトロ安息香酸、DTNB、0.5mM）を、1.5mL Eppendorfチューブに2mgを秤量することにより、各AChE分析用に新たに調製した。それを、1～2分間ボルテックスして1mLのリン酸緩衝液（0.1％ triton X-100を含むpH 7.2）に溶解した。最終容量を、リン酸緩衝液（0.1％ triton X-100を含むpH 7.2）を含む15mLファルコンチューブ中で10mLにし、使用するまで4℃で保存した。アセチルコリンチオヨージド（ATI、5.76mM）を、1.5mL Eppendorfチューブに2mgを秤量することにより、各AChE分析用に新たに調製した。それを、1～2分間ボルテックスして1.2mLの蒸留水に溶解し、使用するまで4℃で保存した。
【0168】
AChE標準希釈液をリン酸緩衝液（0.1％ triton X-100を含むpH 7.2）で調製し、すぐに使用した。すぐに使用できる50U/mL AChEストック（Electrophorus electricusから）を、AAT Bioquest（登録商標） Inc., Sunnyvale, CA, USAから購入した。製造元の指示に従って1000mU/mLのAChEを調製するために希釈し、さらに1:2の比率で希釈して、4～500mU/mLの範囲の8つの異なる希釈液を得た。
【0169】
＜比色測定＞
AChEの活性を測定するために、実施例３に従って骨格筋分化培地で培養することにより得られた細胞を以下のように処理した。分化培地を24ウェルプレートから注意深く除去し、300μLの0.5mM DTNB溶液（リン酸緩衝液、0.1％ triton X-100を含むpH 7.2で調製）を直ちに添加した。暗所において室温で2分間インキュベートした後、50μLの5.76mM ATI（蒸留水で調製）を添加した。反応内容物を暗所において30℃で60分間インキュベートした後、Anthos Zenyth 340rtマイクロプレートリーダー（Biochrom Ltd., Cambridge, UK）で412nmにおけるODを測定した。
AChEの活性を測定するために、実施例３に従って骨格筋分化培地で培養することにより得られた細胞を以下のように処理した。分化培地を24ウェルプレートから注意深く除去し、300μLの0.5mM DTNB溶液（リン酸緩衝液、0.1％ triton X-100を含むpH 7.2で調製）を直ちに添加した。暗所において室温で2分間インキュベートした後、50μLの5.76mM ATI（蒸留水で調製）を添加した。反応内容物を暗所において30℃で60分間インキュベートした後、Anthos Zenyth 340rtマイクロプレートリーダー（Biochrom Ltd., Cambridge, UK）で412nmにおけるODを測定した。
【0170】
AChE酵素標準分析の場合、500～4mU/mlの範囲のAChE酵素標準（AAT（登録商標） Bioquest, Sunnyvale, USA）の希釈液を上記のように調製し、200μLの各AChE標準酵素希釈液を300μLの0.5mM DTNBおよび50μLの5.76mM ATIと混合した。混合物のODを24ウェルプレートで60分間測定した。
【0171】
＜AChE mUrel/mg-タンパク質の計算＞
AChE mUrelを、AChE標準測定（7または8分後の412nmでのOD）から得られた線形標準曲線の外挿による細胞の60分の比色測定から得られたOD412値に基づいて計算した。次に、AChE mUrel/mgタンパク質値を、骨格筋分化培地で培養された対応する細胞の総タンパク質のmg（実施例１９に従って計算された）でAChE mUrelを割ることによって計算した。
AChE mUrelを、AChE標準測定（7または8分後の412nmでのOD）から得られた線形標準曲線の外挿による細胞の60分の比色測定から得られたOD412値に基づいて計算した。次に、AChE mUrel/mgタンパク質値を、骨格筋分化培地で培養された対応する細胞の総タンパク質のmg（実施例１９に従って計算された）でAChE mUrelを割ることによって計算した。
【0172】
［クレアチンキナーゼ活性測定］
AChEの活性を測定するために、実施例３に従って骨格筋分化培地で培養することにより得られた細胞を以下のように処理した。24ウェルプレート上で増殖した細胞から培地を穏やかに除去し、細胞を1mlのTryrodeの塩溶液（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）で洗浄した。その直後に、70μlの溶解緩衝液を細胞に直接加えた。溶解緩衝液は、10μlのTriton-X-100を10mlのdH2O（LC-MS-Ultrachromasol, Fluka）に加えることによって調製した。暗所において4℃で5分間インキュベートした後、10mlのdH2Oを添加してあらかじめ溶解した400μlのCK-NAC（Thermo Scientific, MA, USA）を添加した。30℃に設定されたAnthos Zenith 340rtマイクロプレートリーダー（Biochrom Ltd., Cambridge, UK）で、340nmでのOD吸光度を測定することによって反応を分析した。特に明記しない限り、CK-NACの添加から21分後に取得したOD340nm値を、その後の分析に使用した。mUrelでのCK活性を製造元の指示に従って計算し、特に明記しない限り、対応する細胞のmg総タンパク質で割ることによって規準化した。
AChEの活性を測定するために、実施例３に従って骨格筋分化培地で培養することにより得られた細胞を以下のように処理した。24ウェルプレート上で増殖した細胞から培地を穏やかに除去し、細胞を1mlのTryrodeの塩溶液（Sigma-Aldrich Co. LLC, MO, USA）で洗浄した。その直後に、70μlの溶解緩衝液を細胞に直接加えた。溶解緩衝液は、10μlのTriton-X-100を10mlのdH2O（LC-MS-Ultrachromasol, Fluka）に加えることによって調製した。暗所において4℃で5分間インキュベートした後、10mlのdH2Oを添加してあらかじめ溶解した400μlのCK-NAC（Thermo Scientific, MA, USA）を添加した。30℃に設定されたAnthos Zenith 340rtマイクロプレートリーダー（Biochrom Ltd., Cambridge, UK）で、340nmでのOD吸光度を測定することによって反応を分析した。特に明記しない限り、CK-NACの添加から21分後に取得したOD340nm値を、その後の分析に使用した。mUrelでのCK活性を製造元の指示に従って計算し、特に明記しない限り、対応する細胞のmg総タンパク質で割ることによって規準化した。
【0173】
この実施例に従ってACHE活性およびCK活性を分析した実施例３のMPCは、AChE+およびCK+であることが見出されたが、本発明のiSMC（実施例３）は、AChE-およびCK-であることが見出された（図１４）。
【0174】
［実施例１８－本発明による細胞と当技術分野で知られている細胞との比較］
Thurner et al. 2018は、CD56+またはCD56-のいずれかとして特徴付けられたSMDCの単離について説明した。Thurner et al. 2018によって説明された細胞を本発明の細胞と比較するために、参照された研究の著者に連絡を取り、試料の提供を求めた。著者らは、Thurner et al. 2018に従って単離された細胞を与えることに同意し、したがって、これらの細胞を、本発明の実施例３、４、５、７、８、９、１６および１７に従って試験することができ、実施例１によって単離されたMPC、MSC、MPC-iSMCおよびMSC-iSMCと比較した。結果を図１５に示す。
Thurner et al. 2018は、CD56+またはCD56-のいずれかとして特徴付けられたSMDCの単離について説明した。Thurner et al. 2018によって説明された細胞を本発明の細胞と比較するために、参照された研究の著者に連絡を取り、試料の提供を求めた。著者らは、Thurner et al. 2018に従って単離された細胞を与えることに同意し、したがって、これらの細胞を、本発明の実施例３、４、５、７、８、９、１６および１７に従って試験することができ、実施例１によって単離されたMPC、MSC、MPC-iSMCおよびMSC-iSMCと比較した。結果を図１５に示す。
【0175】
Frudinger et al. 2018は、CD56+として特徴付けられたSMDCの分離について説明した。Frudinger et al. 2018によって説明された細胞を本発明の細胞と比較するために、参照された研究の著者に連絡を取り、試料の提供を求めた。著者らは、Frudinger et al. 2018に従って単離された細胞を与えることに同意し、したがって、これらの細胞を、本発明の実施例３、４、５、７、８、９、１６および１７に従って試験することができ、実施例１によって単離されたMPC、MSC、MPC-iSMCおよびMSC-iSMCと比較した。結果を図１５に示す。
【0176】
［実施例１９－タンパク質の定量化］
実施例３に従って骨格筋分化培地中で培養することによって得られた細胞を、Thurner et al. 2018に従って総タンパク質の定量化の分析を行った。したがって、付着細胞を最初にPBSで２回洗浄し、続いてPBST（0.1％ Triton X-100）で覆い、次に室温で10分間インキュベートした。次に、可溶化液を再懸濁してEppendorf（登録商標）チューブに移し、短時間ボルテックスした後、1200×gで4分間遠心分離した。最後に、透明な上清を新しいEppendorfチューブに移し、Pierce BCAタンパク質分析キット（Thermo Scientific, MA, USA）を製造元の指示に従って使用して、Anthos Zenyth 340rtマイクロプレートリーダー（Biochrom Ltd., Cambridge, UK）で540nmのODを測定することにより、タンパク質濃度を測定した。
実施例３に従って骨格筋分化培地中で培養することによって得られた細胞を、Thurner et al. 2018に従って総タンパク質の定量化の分析を行った。したがって、付着細胞を最初にPBSで２回洗浄し、続いてPBST（0.1％ Triton X-100）で覆い、次に室温で10分間インキュベートした。次に、可溶化液を再懸濁してEppendorf（登録商標）チューブに移し、短時間ボルテックスした後、1200×gで4分間遠心分離した。最後に、透明な上清を新しいEppendorfチューブに移し、Pierce BCAタンパク質分析キット（Thermo Scientific, MA, USA）を製造元の指示に従って使用して、Anthos Zenyth 340rtマイクロプレートリーダー（Biochrom Ltd., Cambridge, UK）で540nmのODを測定することにより、タンパク質濃度を測定した。
【0177】
［参考文献］
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Yin, H., Price, F., & Rudnicki, M. A. (2013). Physiological Reviews, 93(1), 23-67.
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【手続補正書】
【提出日】2024-10-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
筋形成前駆細胞（MPC）から得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団であって、MPCが、
（i）筋原性系統に関与する間葉系オリゴポテント細胞であること、および、
（ii）CD56およびデスミンの陽性発現、およびCD34およびaSMAの陰性発現
によって特徴付けられ、
誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団が、aSMA、デスミン、CD56、CD49aおよびCD146の陽性発現、CD34およびAChEの陰性発現によって特徴付けられ、さらに、iSMCが、CD49eの陰性発現、および非融合コンピテントであることによって特徴付けられる、筋形成前駆細胞（MPC）から得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
（i）筋原性系統に関与する間葉系オリゴポテント細胞であること、および、
（ii）CD56およびデスミンの陽性発現、およびCD34およびaSMAの陰性発現
によって特徴付けられ、
誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団が、aSMA、デスミン、CD56、CD49aおよびCD146の陽性発現、CD34およびAChEの陰性発現によって特徴付けられ、さらに、iSMCが、CD49eの陰性発現、および非融合コンピテントであることによって特徴付けられる、筋形成前駆細胞（MPC）から得られた誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
【請求項2】
iSMCが、機能的なカルシウムチャネルおよび／またはカリウムチャネルを発現する、請求項１に記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
【請求項3】
前記集団が、
（ａ）対象から得られた骨格筋組織から骨格筋由来細胞を単離するステップ、
（ｂ）TGF-ベータおよびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって骨格筋由来細胞を分化転換してiSMCを得るステップ
を含むインビトロまたはエキソビボの方法によって前記MPCから得られる、請求項１または２に記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
（ａ）対象から得られた骨格筋組織から骨格筋由来細胞を単離するステップ、
（ｂ）TGF-ベータおよびヘパリンを含む培地で細胞を培養することによって骨格筋由来細胞を分化転換してiSMCを得るステップ
を含むインビトロまたはエキソビボの方法によって前記MPCから得られる、請求項１または２に記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
【請求項4】
培地が、TGFb1、TGFb2および／またはTGFb3を含む、請求項３に記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
【請求項5】
培地が、TGFb1を含む、請求項３または４に記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
【請求項6】
ステップ（ａ）の後に、骨格筋由来細胞を増殖させることを含むステップ（ａ１）が行われる、請求項３から５のいずれかに記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
【請求項7】
ステップ（ａ１）が、20～40×10
6
個の細胞を受け取るように行われる、請求項６に記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
【請求項8】
ステップ（ｂ）が、１日から６日間または３日から６日間行われる、請求項３から７のいずれかに記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
【請求項9】
ステップ（ｂ）が、1～10μg/mlのTGFb1および10～30μg/mlのヘパリンまたは1～6U/mlのヘパリンを含む細胞培養培地中で行われる、請求項３から８のいずれかに記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
【請求項10】
対象の疾患または障害を治療する方法で使用するための、請求項１から９のいずれかに記載の誘導平滑筋細胞（iSMC）の集団。
【請求項11】
疾患または障害が、平滑筋欠損症である、請求項１０に記載の使用のための誘導平滑筋細胞の集団。
【請求項12】
平滑筋欠損症が、肛門失禁、尿失禁、逆流症、胃不全麻痺、過活動性の膀胱および過小活動性の膀胱からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用のための誘導平滑筋細胞の集団。
【請求項13】
平滑筋欠損症が、括約筋の欠損症である、請求項１０または１１に記載の誘導平滑筋細胞の集団。
【請求項14】
組織工学または細胞治療で使用するための、請求項１から９のいずれかに記載の誘導平滑筋細胞の集団。
【請求項15】
薬物スクリーニングのための、請求項１から９のいずれかに記載の誘導平滑筋細胞のインビトロでの使用。