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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025011954
(43)【公開日】2025-01-24
(54)【発明の名称】押付治具および細胞培養方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20250117BHJP
C12N 5/00 20060101ALI20250117BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 C
C12N5/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023114428
(22)【出願日】2023-07-12
(71)【出願人】
【識別番号】000207551
【氏名又は名称】株式会社ＳＣＲＥＥＮホールディングス
(71)【出願人】
【識別番号】517432385
【氏名又は名称】京ダイアグノスティクス株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】100135013
【弁理士】
【氏名又は名称】西田 隆美
(72)【発明者】
【氏名】上村 祥文
(72)【発明者】
【氏名】竹村 幸敏
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029AA08
4B029BB11
4B029CC02
4B029DG10
4B029GA03
4B029GB10
4B029HA10
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BC41
4B065BD50
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】ゲル状培地を用いて細胞を培養する場合に、ゲル状培地を所望の形状に成型できる技術を提供する。
【解決手段】この押付治具２は、上部が開口したカップ状の培養室１０を有する培養容器１とともに用いられる。押付治具２は、固定部２２と、押付面２０とを有する。固定部２２は、上部において水平方向に延びる。押付面２０は、固定部２２よりも下方に配置され、培養室１０の底部１１と間隔を空けて向かい合う。押付治具２を培養容器１に取り付けた状態において、固定部２２は、培養室１０の開口の縁部に載置されるとともに、押付面２０は、培養室１０の底面１１と間隔を空けて向かい合う。これにより、ゲル状培地を所望の形状に成型できる。したがって、ゲル状培地による細胞の３次元培養を行う場合に、観察や撮像を行いやすくなる。
【選択図】図９
【解決手段】この押付治具２は、上部が開口したカップ状の培養室１０を有する培養容器１とともに用いられる。押付治具２は、固定部２２と、押付面２０とを有する。固定部２２は、上部において水平方向に延びる。押付面２０は、固定部２２よりも下方に配置され、培養室１０の底部１１と間隔を空けて向かい合う。押付治具２を培養容器１に取り付けた状態において、固定部２２は、培養室１０の開口の縁部に載置されるとともに、押付面２０は、培養室１０の底面１１と間隔を空けて向かい合う。これにより、ゲル状培地を所望の形状に成型できる。したがって、ゲル状培地による細胞の３次元培養を行う場合に、観察や撮像を行いやすくなる。
【選択図】図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
上部が開口したカップ状の培養室を有する培養容器とともに用いられる押付治具であって、
上部において水平方向に延びる固定部と、
前記固定部よりも下方に配置され、水平方向に拡がる押付面と、
を有し、
前記押付治具を前記培養容器に取り付けた状態において、前記固定部は、前記培養容器の前記培養室の開口の縁部に載置されるとともに、前記押付面は、前記培養室の底面と間隔を空けて向かい合う、押付治具。
上部において水平方向に延びる固定部と、
前記固定部よりも下方に配置され、水平方向に拡がる押付面と、
を有し、
前記押付治具を前記培養容器に取り付けた状態において、前記固定部は、前記培養容器の前記培養室の開口の縁部に載置されるとともに、前記押付面は、前記培養室の底面と間隔を空けて向かい合う、押付治具。
【請求項2】
請求項１に記載の押付治具であって、
筒状に延びる外周面を有し、下端部に前記押付面を有する胴部
をさらに有し、
前記固定部は、前記胴部の上端部から水平方向に延びる、押付治具。
筒状に延びる外周面を有し、下端部に前記押付面を有する胴部
をさらに有し、
前記固定部は、前記胴部の上端部から水平方向に延びる、押付治具。
【請求項3】
請求項２に記載の押付治具であって、
前記胴部の下端部の外周部から下方へ延びる脚部
をさらに有する、押付治具。
前記胴部の下端部の外周部から下方へ延びる脚部
をさらに有する、押付治具。
【請求項4】
請求項２に記載の押付治具であって、
前記胴部は、
上端面に設けられた上部開口と、前記押付面の中央に設けられた下部開口との間において、上下方向に貫通する貫通孔
を有する、押付治具。
前記胴部は、
上端面に設けられた上部開口と、前記押付面の中央に設けられた下部開口との間において、上下方向に貫通する貫通孔
を有する、押付治具。
【請求項5】
請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の押付治具であって、
前記培養容器は、複数の前記培養室を有するウェルプレートであり、
複数の前記押付面を有する、押付治具。
前記培養容器は、複数の前記培養室を有するウェルプレートであり、
複数の前記押付面を有する、押付治具。
【請求項6】
請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の押付治具を用いた細胞培養方法であって、
ａ）細胞および液状化ゲルの懸濁液を前記培養室に滴下する工程と、
ｂ）前記押付治具を前記培養容器に固定し、前記押付面を前記懸濁液に接触させる工程と、
ｃ）前記液状化ゲルを固化させて、前記細胞を内包するゲルを得る工程と、
ｄ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、
ｅ）前記培養室に液体培地を滴下し、前記細胞を培養する工程と、
を有する、細胞培養方法。
ａ）細胞および液状化ゲルの懸濁液を前記培養室に滴下する工程と、
ｂ）前記押付治具を前記培養容器に固定し、前記押付面を前記懸濁液に接触させる工程と、
ｃ）前記液状化ゲルを固化させて、前記細胞を内包するゲルを得る工程と、
ｄ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、
ｅ）前記培養室に液体培地を滴下し、前記細胞を培養する工程と、
を有する、細胞培養方法。
【請求項7】
請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の押付治具を用いた細胞培養方法であって、
Ａ）液状化ゲルを前記培養室に滴下する工程と、
Ｂ）前記押付治具を前記培養容器に固定し、前記押付面を前記液状化ゲルに接触させる工程と、
Ｃ）前記液状化ゲルを固化させて、細胞を含まないゲルを得る工程と、
Ｄ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、
Ｅ）前記培養室に細胞と液体培地との懸濁液を滴下し、前記細胞を培養する工程と、
を有する、細胞培養方法。
Ａ）液状化ゲルを前記培養室に滴下する工程と、
Ｂ）前記押付治具を前記培養容器に固定し、前記押付面を前記液状化ゲルに接触させる工程と、
Ｃ）前記液状化ゲルを固化させて、細胞を含まないゲルを得る工程と、
Ｄ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、
Ｅ）前記培養室に細胞と液体培地との懸濁液を滴下し、前記細胞を培養する工程と、
を有する、細胞培養方法。
【請求項8】
請求項４に記載の押付治具を用いた細胞培養方法であって、
ｐ）前記押付治具を前記培養容器に固定する工程と、
ｑ）前記貫通孔を介して、前記押付面の下方に細胞および液状化ゲルの懸濁液を注入する工程と、
ｒ）前記液状化ゲルを固化させて、前記細胞を内包するゲルを得る工程と、
ｓ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、
ｔ）前記培養室に液体培地を滴下し、前記細胞を培養する工程と、
を有する、細胞培養方法。
ｐ）前記押付治具を前記培養容器に固定する工程と、
ｑ）前記貫通孔を介して、前記押付面の下方に細胞および液状化ゲルの懸濁液を注入する工程と、
ｒ）前記液状化ゲルを固化させて、前記細胞を内包するゲルを得る工程と、
ｓ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、
ｔ）前記培養室に液体培地を滴下し、前記細胞を培養する工程と、
を有する、細胞培養方法。
【請求項9】
請求項４に記載の押付治具を用いた細胞培養方法であって、
Ｐ）前記押付治具を前記培養容器に固定する工程と、
Ｑ）前記貫通孔を介して、前記押付面の下方に液状化ゲルを注入する工程と、
Ｒ）前記液状化ゲルを固化させて、細胞を含まないゲルを得る工程と、
Ｓ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、
Ｔ）前記培養室に細胞と液体培地との懸濁液を滴下し、前記細胞を培養する工程と、
を有する、細胞培養方法。
Ｐ）前記押付治具を前記培養容器に固定する工程と、
Ｑ）前記貫通孔を介して、前記押付面の下方に液状化ゲルを注入する工程と、
Ｒ）前記液状化ゲルを固化させて、細胞を含まないゲルを得る工程と、
Ｓ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、
Ｔ）前記培養室に細胞と液体培地との懸濁液を滴下し、前記細胞を培養する工程と、
を有する、細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞を培養する際に用いられる押付治具、および当該押付治具を用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、容器内で培養された細胞の薬剤感受性の画像解析が行われている。このような研究において、３次元細胞塊を用いることにより、２次元的に培養された細胞に比べて生体内に近い条件になることから、３次元細胞塊の培養を行うことが求められている。
【0003】
特に、がん細胞に対する抗がん剤の評価においては、２次元培養では腫瘍微小環境が再現できないことから、３次元培養の必要性が高いことが知られている。がん細胞の３次元培養、特にスフェロイド培養では、アガロースゲル、ハイドロゲルといった各種ゲル成分を含むゲル状培地を用いて３次元培養を行う。このように、ゲル状培地を用いて３次元培養を行うことについては、例えば、特許文献１に記載されている。
【0004】
特に、Ｃｏｒｎｉｎｇ社のゲル状培地「マトリゲル」は、ＥＨＳマウス腫瘍細胞から単離された基底膜成分を含んでおり、マトリゲルに包埋されたがん細胞は、部位特有の挙動を示すことがわかっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０２２－１８１０７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ゲル状培地による細胞の３次元培養を行う場合、ゲル状培地の形状によって観察が行いにくくなる場合がある。例えば、その細胞に特異的なタンパク質の局在を可視化するために、蛍光染色を行う場合には、蛍光物質に励起光を照射し、放出された蛍光を検出する。このとき、ゲルに厚みがあると、励起光の減衰および散乱が生じるため、検出できる蛍光が弱くなる。
【0007】
また、ゲルの厚みが大きい場合、明視野撮像、蛍光撮像に関わらず、Ｚ方向（高さ方向）に細胞が分布するため、Ｚ方向の各位置にフォーカスして画像を取得しようとすると、撮影に多大な時間がかかるという問題が生じる。
【0008】
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、ゲル状培地を用いて細胞を培養する場合に、ゲル状培地を所望の形状に成型できる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記課題を解決するため、本願の第１発明は、上部が開口したカップ状の培養室を有する培養容器とともに用いられる押付治具であって、上部において水平方向に延びる固定部と、前記固定部よりも下方に配置され、水平方向に拡がる押付面と、を有し、前記押付治具を前記培養容器に取り付けた状態において、前記固定部は、前記培養容器の前記培養室の開口の縁部に載置されるとともに、前記押付面は、前記培養室の底面と間隔を空けて向かい合う。
【0010】
本願の第２発明は、第１発明の押付治具であって、筒状に延びる外周面を有し、下端部に前記押付面を有する胴部をさらに有し、前記固定部は、前記胴部の上端部から水平方向に延びる。
【0011】
本願の第３発明は、第２発明の押付治具であって、前記胴部の下端部の外周部から下方へ延びる脚部をさらに有する。
【0012】
本願の第４発明は、第２発明の押付治具であって、前記胴部は、上端面に設けられた上部開口と、前記押付面の中央に設けられた下部開口との間において、上下方向に貫通する貫通孔を有する。
【0013】
本願の第５発明は、第１発明ないし第４発明のいずれか一発明の押付治具であって、前記培養容器は、複数の前記培養室を有するウェルプレートであり、複数の前記押付面を有する。
【0014】
本願の第６発明は、第１発明ないし第３発明のいずれか一発明の押付治具を用いた細胞培養方法であって、ａ）細胞および液状化ゲルの懸濁液を前記培養室に滴下する工程と、ｂ）前記押付治具を前記培養容器に固定し、前記押付面を前記懸濁液に接触させる工程と、ｃ）前記液状化ゲルを固化させて、前記細胞を内包するゲルを得る工程と、ｄ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、ｅ）前記培養室に液体培地を滴下し、前記細胞を培養する工程と、を有する。
【0015】
本願の第７発明は、第１発明ないし第３発明のいずれか一発明の押付治具を用いた細胞培養方法であって、Ａ）液状化ゲルを前記培養室に滴下する工程と、Ｂ）前記押付治具を前記培養容器に固定し、前記押付面を前記液状化ゲルに接触させる工程と、Ｃ）前記液状化ゲルを固化させて、細胞を含まないゲルを得る工程と、Ｄ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、Ｅ）前記培養室に細胞と液体培地との懸濁液を滴下し、前記細胞を培養する工程と、を有する。
【0016】
本願の第８発明は、第４発明の押付治具を用いた細胞培養方法であって、ｐ）前記押付治具を前記培養容器に固定する工程と、ｑ）前記貫通孔を介して、前記押付面の下方に細胞および液状化ゲルの懸濁液を注入する工程と、ｒ）前記液状化ゲルを固化させて、前記細胞を内包するゲルを得る工程と、ｓ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、ｔ）前記培養室に液体培地を滴下し、前記細胞を培養する工程と、を有する。
【0017】
本願の第９発明は、第４発明の押付治具を用いた細胞培養方法であって、Ｐ）前記押付治具を前記培養容器に固定する工程と、Ｑ）前記貫通孔を介して、前記押付面の下方に液状化ゲルを注入する工程と、Ｒ）前記液状化ゲルを固化させて、細胞を含まないゲルを得る工程と、Ｓ）前記押付治具を前記培養容器から取り外す工程と、Ｔ）前記培養室に細胞と液体培地との懸濁液を滴下し、前記細胞を培養する工程と、を有する。
【発明の効果】
【0018】
本願の第１発明～第９発明によれば、ゲル状培地を所望の形状に成型できる。これにより、ゲル状培地による細胞の３次元培養を行う場合に、観察や撮像を行いやすくなる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】ウェルプレートの斜視図である。
【図2】ウェルプレートの縦断面図である。
【図3】従来の細胞培養の様子を示したウェルプレートの部分断面図である。
【図4】従来の細胞培養の様子を示したウェルプレートの部分断面図である。
【図5】第１実施形態に係る押付治具の斜視図である。
【図6】第１実施形態に係る押付治具をウェルに挿入した様子を示した図である。
【図7】第１実施形態に係る押付治具を用いた第１細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。
【図8】第１細胞培養方法の細胞・ゲル懸濁液滴下工程の様子を示した図である。
【図9】第１細胞培養方法の押付治具配置工程の様子を示した図である。
【図10】第１細胞培養方法の細胞培養工程の様子を示した図である。
【図11】第１実施形態に係る押付治具を用いた第２細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。
【図12】第２細胞培養方法の液状化ゲル滴下工程の様子を示した図である。
【図13】第２細胞培養方法の押付治具配置工程の様子を示した図である。
【図14】第２細胞培養方法の細胞・培地懸濁液滴下工程の様子を示した図である。
【図15】第２細胞培養方法の細胞培養工程の様子を示した図である。
【図16】第２実施形態に係る押付治具の斜視図である。
【図17】第２実施形態に係る押付治具をウェルに挿入した様子を示した図である。
【図18】第２実施形態に係る押付治具を用いた第３細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。
【図19】第２実施形態に係る押付治具を用いた第４細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。
【図20】第１変形例に係る押付治具の斜視図である。
【図21】第１変形例に係る押付治具をウェルに挿入した様子を示した図である。
【図22】第２変形例に係る押付治具の斜視図である。
【図23】第３変形例に係る押付治具およびウェルプレートの縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
【0021】
＜１．ウェルプレートの構成＞
図１は、培養容器の一例であるウェルプレート１の斜視図である。図２は、ウェルプレート１の縦断面図である。このウェルプレート１は、複数のウェル（凹部）１０を有する略板状の容器である。ウェルプレート１の材料には、例えば、光を透過する透明な樹脂が使用される。図１に示すように、複数のウェル１０は、ウェルプレート１の上面に、規則的に配列されている。本実施形態では、上面視におけるウェル１０の形状が、円形である。ただし、上面視におけるウェル１０の形状は、矩形等の他の形状であってもよい。
図１は、培養容器の一例であるウェルプレート１の斜視図である。図２は、ウェルプレート１の縦断面図である。このウェルプレート１は、複数のウェル（凹部）１０を有する略板状の容器である。ウェルプレート１の材料には、例えば、光を透過する透明な樹脂が使用される。図１に示すように、複数のウェル１０は、ウェルプレート１の上面に、規則的に配列されている。本実施形態では、上面視におけるウェル１０の形状が、円形である。ただし、上面視におけるウェル１０の形状は、矩形等の他の形状であってもよい。
【0022】
各ウェル１０内には、液体培地やゲル状培地とともに、観察対象となる生体試料が保持される。これにより、各ウェル１０内において、細胞等の生体試料が培養される。
【0023】
図３および図４は、従来の細胞の３次元培養の様子を示したウェルプレート１の部分断面図である。図３および図４において、１つのウェル１０の付近の様子が示されている。図３および図４に示すように、ウェル１０は、底面１１と側面１２とを有する。底面１１は、上下方向に対して垂直に広がる平坦な面である。側面１２は、底面１１の周縁部から上方へ向けて延びる、円筒状の面である。なお、ウェルプレート１の成型時に金型からの離型を容易とするために、側面１２は、上方へ向かうにつれて僅かに拡径するテーパ状となっていてもよい。
【0024】
このようなウェルプレート１において、ゲル状培地を用いて細胞９を３次元培養する従来の手順の一例を説明する。以下では、液状化したゲル状培地を「液状化ゲル」、細胞と液状化ゲルとの懸濁液を「細胞・ゲル懸濁液」と称する。
【0025】
ゲル状培地を用いて細胞を３次元培養する際には、まず、細胞・ゲル懸濁液をウェル１０の底面１１上に滴下する。その後、液状化ゲルを固化させて、ゲル状培地９１を得る。その後、液体培地９２をウェル１０内に滴下し、ウェル１０を液体培地９２で満たす。そして、この状態で細胞９が培養される。
【0026】
ゲル状培地９１には、例えば、アガロースゲル、ハイドロゲルといった各種ゲル成分を含むゲル状培地が用いられる。本実施形態では、ゲル状培地９１として、Ｃｏｒｎｉｎｇ社のゲル状培地「マトリゲル」を用いる。マトリゲルは、－２０℃で固体となり、０～４℃付近で液状化し、３７℃で固化してゲル状となる。このため、液状化ゲルの温度は０～４℃付近であり、液状化ゲルをインキュベータ内で加温することにより、固化してゲル状となる。
【0027】
液体培地９２には、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所培地）、生理食塩水などが用いられる。細胞９は、単一の細胞であってもよく、あるいは、複数の細胞により形成される細胞塊（スフェロイド）であってもよい。
【0028】
上記の手順で細胞９を培養する場合、液状化ゲルは、流動性はあるものの、粘性があるため、底面１１と平行に平らに拡がらない。また、液状化ゲルが側面１２に接触すると、メニスカスを形成する。このため、液状化ゲルの厚みを一定とすることが難しい。
【0029】
＜２．第１実施形態＞
＜２－１．押付治具の構成＞
続いて、本発明の第１実施形態に係る押付治具２について説明する。図５は、第１実施形態に係る押付治具２の斜視図である。図６は、押付治具２の使用時におけるウェルプレート１および押付治具２の部分断面図である。
＜２－１．押付治具の構成＞
続いて、本発明の第１実施形態に係る押付治具２について説明する。図５は、第１実施形態に係る押付治具２の斜視図である。図６は、押付治具２の使用時におけるウェルプレート１および押付治具２の部分断面図である。
【0030】
押付治具２は、ウェルプレート１のように、上部が開口したカップ状の培養室（ウェル１０）を有する培養容器とともに用いられる。本実施形態の押付治具２は、ウェルプレート１の１つのウェル１０に対して用いられる。
【0031】
押付治具２は、胴部２１と、固定部２２とを有する。押付治具２は、例えば、アクリル樹脂や、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の樹脂や弾性材料により一体成型される。押付治具２の材料には、ＰＤＭＳのように離型性に優れていて、１２０℃以上の耐熱性を有する材料を用いることが好ましい。耐熱性を有する材料により形成されていれば、押付治具２をオートクレーブ処理することができる。また、ＰＤＭＳのような弾性材料を用いる場合、精度の観点から、ＪＩＳ Ｋ６２５３に規定されるタイプＡデュロメータにより測定される硬さが５０度以上であることが好ましい。
【0032】
胴部２１は、上下に延びる円柱状の部位である。胴部２１の径は、ウェル１０の径よりも小さい。このため、胴部２１をウェル１０内に挿入することができる。胴部２１は、その下端部に押付面２０を有する。すなわち、押付面２０は、胴部２１の円形の下端面である。押付面２０は、固定部２２よりも下方に配置され、水平方向に拡がる。
【0033】
なお、本実施形態では、ウェル１０の上下方向から見た断面が円形であり、押付面２０も円形であるが、本発明はこれに限られない。押付面２０の形状は、ウェル１０の形状によって適宜変更しうる。
【0034】
固定部２２は、押付治具２の上部において水平方向に延びる部位である。具体的には、固定部２２は、胴部２１の上端部から水平方向に円環状に延びるフランジである。
【0035】
押付治具２をウェルプレート１に取り付けた状態において、固定部２２は、ウェル１０の上部の開口の縁部に載置される。また、胴部２１の長さは、ウェル１０の深さよりも少し小さい。これにより、押付治具２をウェルプレート１に取り付けた状態において、押付面２０は、ウェル１０の底部と上下方向に間隔を空けて向かい合う。
【0036】
＜２－２．第１細胞培養方法＞
続いて、第１実施形態に係る押付治具２を用いた第１細胞培養方法について、図７～図１０を参照しつつ説明する。図７は、押付治具２を用いた第１細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。図８は、第１細胞培養方法の細胞・ゲル懸濁液滴下工程（ステップＳ１０１）の様子を示した図である。図９は、第１細胞培養方法の押付治具配置工程（ステップＳ１０２）の様子を示した図である。図１０は、第１細胞培養方法の細胞培養工程（ステップＳ１０５）の様子を示した図である。
続いて、第１実施形態に係る押付治具２を用いた第１細胞培養方法について、図７～図１０を参照しつつ説明する。図７は、押付治具２を用いた第１細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。図８は、第１細胞培養方法の細胞・ゲル懸濁液滴下工程（ステップＳ１０１）の様子を示した図である。図９は、第１細胞培養方法の押付治具配置工程（ステップＳ１０２）の様子を示した図である。図１０は、第１細胞培養方法の細胞培養工程（ステップＳ１０５）の様子を示した図である。
【0037】
この第１細胞培養方法では、まず、液状化したゲル培地８１に細胞９を混和させた細胞・ゲル懸濁液８２を、ウェル１０内に適量滴下する（ステップＳ１０１：細胞・ゲル懸濁液滴下工程）。このとき、液状化したゲル培地８１に混和される細胞９には、細胞塊が含まれてもよい。また、このとき、液状化したゲル培地８１の温度は、０～４℃である。これにより、図８に示すように、ウェル１０の底面１１上に細胞・ゲル懸濁液８２がドーム状に載置される。
【0038】
次に、押付治具２をウェルプレート１に固定し、押付面２０を細胞・ゲル懸濁液８２に接触させる（ステップＳ１０２：押付治具配置工程）。これにより、図９に示すように、細胞・ゲル懸濁液８２の上面が押付面２０によって平らに成型される。
【0039】
続いて、押付治具２をウェルプレート１に固定したまま、液状化ゲル８１を固化させ、細胞９を内包するゲル状培地９１を得る（ステップＳ１０３：ゲル固化工程）。具体的には、ウェルプレート１をインキュベータ内に載置し、ウェルプレート１を約３７℃まで加温する。その後、押付治具２をウェルプレート１から取り外す（ステップＳ１０４：押付治具取外し工程）。これにより、ウェル１０の底面１１上に、一定の厚みを有し、細胞９を内包するゲル状培地９１が形成される。
【0040】
その後、図１０に示すように、ウェル１０内に液体培地９２を滴下し、ゲル状培地９１に内包された状態の細胞９を培養する（ステップＳ１０５：細胞培養工程）。このようにすれば、平らに成型されたゲル状培地９１の内部で、細胞９が３次元的に培養される。
【0041】
このように、押付治具２を用いることにより、液状化ゲル８１を、所望の形状に成型して固化させることができる。これにより、ゲル状培地９１を一定の厚みにすることができる。その結果、培養した細胞９のＺ方向の分布範囲を所定の範囲内とすることができる。したがって、培養した細胞９の撮像および観察を行いやすくなる。
【0042】
＜２－３．第２細胞培養方法＞
続いて、第１実施形態に係る押付治具２を用いた第２細胞培養方法について、図１１～図１５を参照しつつ説明する。図１１は、押付治具２を用いた第２細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。図１２は、第２細胞培養方法の液状化ゲル滴下工程（ステップＳ２０１）の様子を示した図である。図１３は、第２細胞培養方法の押付治具配置工程（ステップＳ２０２）の様子を示した図である。図１４は、第２細胞培養方法の細胞・液体培地懸濁液滴下工程（ステップＳ２０５）の様子を示した図である。図１５は、第２細胞培養方法の細胞培養工程（ステップＳ２０６）の様子を示した図である。
続いて、第１実施形態に係る押付治具２を用いた第２細胞培養方法について、図１１～図１５を参照しつつ説明する。図１１は、押付治具２を用いた第２細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。図１２は、第２細胞培養方法の液状化ゲル滴下工程（ステップＳ２０１）の様子を示した図である。図１３は、第２細胞培養方法の押付治具配置工程（ステップＳ２０２）の様子を示した図である。図１４は、第２細胞培養方法の細胞・液体培地懸濁液滴下工程（ステップＳ２０５）の様子を示した図である。図１５は、第２細胞培養方法の細胞培養工程（ステップＳ２０６）の様子を示した図である。
【0043】
この第２細胞培養方法では、まず、液状化したゲル培地８１を、ウェル１０内に適量滴下する（ステップＳ２０１：液状化ゲル滴下工程）。このとき、液状化したゲル培地８１の温度は、０～４℃である。これにより、図１２に示すように、ウェル１０の底面１１上に液状化したゲル培地８１がドーム状に載置される。
【0044】
次に、押付治具２をウェルプレート１に固定し、押付面２０を液状化したゲル培地８１に接触させる（ステップＳ２０２：押付治具配置工程）。これにより、図１３に示すように、液状化したゲル培地８１の上面が押付面２０によって平らに成型される。
【0045】
続いて、押付治具２をウェルプレート１に固定したまま、液状化ゲル８１を固化させ、ゲル状培地９１を得る（ステップＳ２０３：ゲル固化工程）。具体的には、ウェルプレート１をインキュベータ内に載置し、ウェルプレート１を約３７℃まで加温する。その後、押付治具２をウェルプレート１から取り外す（ステップＳ１０４：押付治具取外し工程）。これにより、ウェル１０の底面１１上に、一定の厚みを有するゲル状培地９１が形成される。
【0046】
その後、図１４に示すように、ウェル１０内に、細胞９を液体培地９２に混和させた細胞・液体培地懸濁液８３を滴下する（ステップＳ２０５：細胞・液体培地懸濁液滴下工程）。そして、そのまま静置することにより、図１５のように、細胞・液体培地懸濁液８３中の細胞９が沈み、ゲル状培地９１の上面に載る。その状態で細胞９を培養することにより、平らに成型されたゲル状培地９１の上面付近で、細胞９が３次元的に培養される（ステップＳ２０６：静置・細胞培養工程）。
【0047】
このように、押付治具２を用いることにより、液状化ゲル８１を、所望の形状に成型して固化させることができる。これにより、ゲル状培地９１を一定の厚みにすることができる。その結果、培養した細胞９のＺ方向の分布範囲を所定の範囲内とすることができる。したがって、培養した細胞９の撮像および観察を行いやすくなる。
【0048】
＜３．第２実施形態＞
＜３－１．押付治具の構成＞
続いて、本発明の第２実施形態に係る押付治具２Ａについて説明する。図１６は、第２実施形態に係る押付治具２Ａの斜視図である。図１７は、押付治具２Ａの使用時におけるウェルプレート１および押付治具２Ａの部分断面図である。以下では、第２実施形態に係る押付治具２Ａについて、主に、第１実施形態に係る押付治具２との相違点について説明する。それ以外の点については、第１実施形態に係る押付治具２と同様である。
＜３－１．押付治具の構成＞
続いて、本発明の第２実施形態に係る押付治具２Ａについて説明する。図１６は、第２実施形態に係る押付治具２Ａの斜視図である。図１７は、押付治具２Ａの使用時におけるウェルプレート１および押付治具２Ａの部分断面図である。以下では、第２実施形態に係る押付治具２Ａについて、主に、第１実施形態に係る押付治具２との相違点について説明する。それ以外の点については、第１実施形態に係る押付治具２と同様である。
【0049】
押付治具２Ａは、胴部２１Ａと、固定部２２Ａとを有する。胴部２１Ａは、上下に延びる円柱状の部位である。胴部２１Ａは、その下端部に押付面２０Ａを有する。すなわち、押付面２０は、胴部２１Ａの円形の下端面である。胴部２１Ａは、その上端面に設けられた上部開口２１１Ａと、下端面である押付面２０Ａの中央に設けられた下部開口２１２Ａとを有する。また、胴部２１Ａは、上部開口２１１Ａと下部開口２１２Ａとの間において、胴部２１Ａを上下方向に貫通する貫通孔２１０Ａを有する。
【0050】
この押付治具２Ａは、貫通孔２１０Ａを有することにより、ウェルプレート１に押付治具２Ａを取り付けた状態で、ウェル１０の底面１１上に液体等を滴下することが可能である。このため、ウェルプレート１に押付治具２Ａを取り付けた後に、液状化したゲル培地８１や、細胞・ゲル懸濁液８２をウェル１０の底面１１上に滴下することができる。
【0051】
＜３－２．第３細胞培養方法＞
続いて、第２実施形態に係る押付治具２Ａを用いた第３細胞培養方法について、図１１を参照しつつ説明する。図１８は、押付治具２Ａを用いた第３細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。
続いて、第２実施形態に係る押付治具２Ａを用いた第３細胞培養方法について、図１１を参照しつつ説明する。図１８は、押付治具２Ａを用いた第３細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。
【0052】
この第３細胞培養方法では、まず、押付治具２Ａをウェルプレート１に固定する（ステップＳ３０１：押付治具配置工程）。このとき、ウェル１０の底面１１と押付治具２Ａの押付面２０Ａとの間の空間には、何も配置されていない。
【0053】
次に、液状化したゲル培地８１に細胞９を混和させた細胞・ゲル懸濁液８２を、マイクロピペット等を用いて、貫通孔２１０Ａを介して、ウェル１０の底面１１と押付治具２Ａの押付面２０Ａとの間の空間に注入する（ステップＳ３０２：細胞・ゲル懸濁液注入工程）。これにより、細胞・ゲル懸濁液８２が、ウェル１０の底面１１と押付治具２Ａの押付面２０Ａとの間の空間を満たす。すなわち、細胞・ゲル懸濁液８２の上面は押付治具２Ａの押付面２０Ａに沿って平らに成型される。このとき、細胞・ゲル懸濁液８２の温度は、０～４℃である。
【0054】
続いて、押付治具２Ａをウェルプレート１に固定したまま、液状化ゲル８１を固化させ、細胞９を内包するゲル状培地９１を得る（ステップＳ３０３：ゲル固化工程）。具体的には、ウェルプレート１をインキュベータ内に載置し、ウェルプレート１を約３７℃まで加温する。その後、押付治具２Ａをウェルプレート１から取り外す（ステップＳ３０４：押付治具取外し工程）。これにより、ウェル１０の底面１１上に、一定の厚みを有し、細胞９を内包するゲル状培地９１が形成される。
【0055】
その後、ウェル１０内に液体培地９２を滴下し、ゲル状培地９１に内包された状態の細胞９を培養する（ステップＳ３０５：細胞培養工程）。このようにすれば、平らに成型されたゲル状培地９１の内部で、細胞９が３次元的に培養される。
【0056】
このように、本実施形態の押付治具２Ａを用いることにより、先に押付治具２Ａをウェルプレート１に固定してから、ウェル１０内に細胞・ゲル懸濁液８２を注入できる。
【0057】
また、本実施形態でも、液状化ゲル８１を、所望の形状に成型して固化させることができる。これにより、ゲル状培地９１を一定の厚みにすることができる。その結果、培養した細胞９のＺ方向の分布範囲を所定の範囲内とすることができる。したがって、培養した細胞９の撮像および観察を行いやすくなる。
【0058】
＜３－３．第４細胞培養方法＞
続いて、第２実施形態に係る押付治具２Ａを用いた第４細胞培養方法について、図１９を参照しつつ説明する。図１９は、押付治具２Ａを用いた第４細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。
続いて、第２実施形態に係る押付治具２Ａを用いた第４細胞培養方法について、図１９を参照しつつ説明する。図１９は、押付治具２Ａを用いた第４細胞培養方法の流れを示したフローチャートである。
【0059】
この第４細胞培養方法では、まず、押付治具２Ａをウェルプレート１に固定する（ステップＳ４０１：押付治具配置工程）。このとき、ウェル１０の底面１１と押付治具２Ａの押付面２０Ａとの間の空間には、何も配置されていない。
【0060】
次に、液状化したゲル培地８１を、マイクロピペット等を用いて、貫通孔２１０Ａを介して、ウェル１０の底面１１と押付治具２Ａの押付面２０Ａとの間の空間に注入する（ステップＳ４０２：ゲル注入工程）。これにより、液状化したゲル培地８１が、ウェル１０の底面１１と押付治具２Ａの押付面２０Ａとの間の空間を満たす。すなわち、液状化したゲル培地８１の上面は押付治具２Ａの押付面２０Ａに沿って平らに成型される。このとき、液状化したゲル培地８１の温度は、０～４℃である。
【0061】
続いて、押付治具２Ａをウェルプレート１に固定したまま、液状化ゲル８１を固化させ、ゲル状培地９１を得る（ステップＳ４０３：ゲル固化工程）。具体的には、ウェルプレート１をインキュベータ内に載置し、ウェルプレート１を約３７℃まで加温する。その後、押付治具２Ａをウェルプレート１から取り外す（ステップＳＡ０４：押付治具取外し工程）。これにより、ウェル１０の底面１１上に、一定の厚みを有するゲル状培地９１が形成される。
【0062】
その後、ウェル１０内に、細胞９を液体培地９２に混和させた細胞・液体培地懸濁液８３を滴下する（ステップＳ４０５：細胞・液体培地懸濁液滴下工程）。そして、そのまま静置することにより、細胞・液体培地懸濁液８３中の細胞９が沈み、ゲル状培地９１の上面に載る。その状態で細胞９を培養することにより、平らに成型されたゲル状培地９１の上面付近で、細胞９が３次元的に培養される（ステップＳ４０６：静置・細胞培養工程）。
【0063】
このように、押付治具２Ａを用いることにより、液状化ゲル８１を、所望の形状に成型して固化させることができる。これにより、ゲル状培地９１を一定の厚みにすることができる。その結果、培養した細胞９のＺ方向の分布範囲を所定の範囲内とすることができる。したがって、培養した細胞９の撮像および観察を行いやすくなる。
【0064】
＜４．変形例＞
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。
【0065】
【0066】
図２０および図２１に示すように、押付治具２Ｂは、胴部２１Ｂと、固定部２２Ｂとに加えて、脚部２３Ｂを有する。胴部２１Ｂおよび固定部２２Ｂの構成は、第１実施形態に係る押付治具２と同様であるため、説明を省略する。
【0067】
脚部２３Ｂは、胴部２１Ｂの下端部の外周部から下方へ延びる。第１変形例に係る押付治具２Ｂでは、脚部２３Ｂは、押付面２０Ｂの外周から下方へ延びる円筒状の部位である。
【0068】
第１実施形態に係る押付治具２においては、ウェルプレート１や押付治具２の製造誤差等により、ウェル１０の底面１１と押付面２０との間隔が想定よりも小さくなってしまう可能性がある。その場合、押付治具２をウェル１０内に挿入した際に、先に底面１１上に滴下された液状化されたゲル状培地８１または細胞・ゲル懸濁液８２が側面１２に接触し、さらに側面１２に沿って上方へ伝わる虞がある。この場合、ゲル状培地９１のＺ方向の分布範囲を所定の範囲内とすることができなくなってしまう。
【0069】
第１変形例に係る押付治具２Ｂでは、脚部２３Ｂがあることにより、ウェル１０の底面１１と押付面２０Ｂとの間隔が脚部２３Ｂの長さよりも小さくなることを抑制できる。その結果、ゲル状培地９１が側面１２に接触するのを抑制できる。
【0070】
＜４－２．第２変形例＞
図２２は、第２変形例に係る押付治具２Ｃの斜視図である。この押付治具２Ｃも、第１変形例に係る押付治具２Ｃと同様、脚部２３Ｃを有する。ただし、この押付治具２Ｃの脚部２３Ｃは、胴部２１Ｃの下端部の外周部のうち、周方向に間隔を空けた数カ所から下方へ延びる。このように、脚部２３Ｃは、筒状に繋がったものでなくてもよい。
図２２は、第２変形例に係る押付治具２Ｃの斜視図である。この押付治具２Ｃも、第１変形例に係る押付治具２Ｃと同様、脚部２３Ｃを有する。ただし、この押付治具２Ｃの脚部２３Ｃは、胴部２１Ｃの下端部の外周部のうち、周方向に間隔を空けた数カ所から下方へ延びる。このように、脚部２３Ｃは、筒状に繋がったものでなくてもよい。
【0071】
＜４－３．第３変形例＞
図２３は、第３変形例に係る押付治具２Ｄの斜視図である。この押付治具２Ｄは、複数のウェル１０のそれぞれに挿入される複数の胴部２１Ｄと、単一の固定部２２Ｄとを有する。固定部２２Ｄは、ウェルプレート１の上面に沿って板状に拡がり、複数の胴部２１Ｄのそれぞれの上端部と接続されている。そして、各胴部２１Ｄはそれぞれ下端部に押付面２０Ｄを有する。すなわち、この押付治具２Ｄは、同時に複数のウェル１０の底面１１と間隔を空けて配置される複数の押付面２０Ｄを有する。このように、押付治具２Ｄは、複数のウェル１０に同時に使用できるものであってもよい。
図２３は、第３変形例に係る押付治具２Ｄの斜視図である。この押付治具２Ｄは、複数のウェル１０のそれぞれに挿入される複数の胴部２１Ｄと、単一の固定部２２Ｄとを有する。固定部２２Ｄは、ウェルプレート１の上面に沿って板状に拡がり、複数の胴部２１Ｄのそれぞれの上端部と接続されている。そして、各胴部２１Ｄはそれぞれ下端部に押付面２０Ｄを有する。すなわち、この押付治具２Ｄは、同時に複数のウェル１０の底面１１と間隔を空けて配置される複数の押付面２０Ｄを有する。このように、押付治具２Ｄは、複数のウェル１０に同時に使用できるものであってもよい。
【0072】
＜４－４．他の変形例＞
また、上記の実施形態では、複数のウェル（培養室）１０を有するウェルプレート１について説明した。しかしながら、本発明の培養容器は、１つの凹部を有するシャーレ（ペトリディッシュ）やビーカーであってもよい。
また、上記の実施形態では、複数のウェル（培養室）１０を有するウェルプレート１について説明した。しかしながら、本発明の培養容器は、１つの凹部を有するシャーレ（ペトリディッシュ）やビーカーであってもよい。
【0073】
また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。
【符号の説明】
【0074】
１ ウェルプレート（培養容器）
２，２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，２Ｄ 押付治具
９ 細胞
１０ ウェル（培養室）
１１ 底面
１２ 側面
２０，２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｄ 押付面
２１，２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｄ 胴部
２２，２２Ａ，２２Ｂ，２２Ｄ 固定部
２３Ｂ，２３Ｃ ：脚部
８１ 液状化ゲル
８２ 細胞・ゲル懸濁液
８３ 細胞・液体培地懸濁液
９１ ゲル状培地
９２ 液体培地
２１０Ａ 貫通孔
２１１Ａ 上部開口
２１２Ａ 下部開口
２，２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，２Ｄ 押付治具
９ 細胞
１０ ウェル（培養室）
１１ 底面
１２ 側面
２０，２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｄ 押付面
２１，２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｄ 胴部
２２，２２Ａ，２２Ｂ，２２Ｄ 固定部
２３Ｂ，２３Ｃ ：脚部
８１ 液状化ゲル
８２ 細胞・ゲル懸濁液
８３ 細胞・液体培地懸濁液
９１ ゲル状培地
９２ 液体培地
２１０Ａ 貫通孔
２１１Ａ 上部開口
２１２Ａ 下部開口
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】