知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025012226
(43)【公開日】2025-01-24
(54)【発明の名称】プロテアーゼ共発現による組換えタンパク質の製造法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20250117BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20250117BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20250117BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20250117BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P21/02 C
C12N15/50
C12N15/57
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023114926
(22)【出願日】2023-07-13
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000173762
【氏名又は名称】公益財団法人相模中央化学研究所
(72)【発明者】
【氏名】穂谷 恵
(72)【発明者】
【氏名】井上 宗宣
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B064DA16
4B064DA20
4B065AA26X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD39
4B065CA44
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】タンパク質発現系において、組換えタンパク質が含む不要なアミノ酸配列を形質転換体細胞内または分泌された培地内で除去した組換えタンパク質を生産し、かつ不要なアミノ酸配列が除去された組換えタンパク質を抽出・精製する方法を提供すること。
【解決手段】プロテアーゼと、当該プロテアーゼの消化配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質を共発現し、形質転換体細胞内または分泌された培地内で消化配列を消化すること、加えて、消化配列が消化された組換えタンパク質を界面活性剤および/またはアルギニンを含む溶液を用いて抽出・精製することにより、前記課題を解決する。
【選択図】なし
【解決手段】プロテアーゼと、当該プロテアーゼの消化配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質を共発現し、形質転換体細胞内または分泌された培地内で消化配列を消化すること、加えて、消化配列が消化された組換えタンパク質を界面活性剤および/またはアルギニンを含む溶液を用いて抽出・精製することにより、前記課題を解決する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロテアーゼの遺伝子、および当該プロテアーゼが消化可能な配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項2】
プロテアーゼがコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のメインプロテアーゼである、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項3】
プロテアーゼが以下の少なくとも（ａ）から（ｃ）のいずれかから選択されるタンパク質である、請求項２に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項4】
形質転換体の宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項5】
タンパク質がストレプトアビジンまたはイクイナトキシンのアミノ酸配列のいずれか一方を少なくとも含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項6】
タンパク質が以下の少なくとも（ｄ）から（ｆ）のいずれかから選択されるタンパク質である、請求項１から３のいずれか１項に記載の形質転換体。
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含む、タンパク質；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつビオチン結合性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつビオチン結合性を有するタンパク質。
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含む、タンパク質；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつビオチン結合性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつビオチン結合性を有するタンパク質。
【請求項7】
タンパク質が以下の少なくとも（g）から（i）のいずれかから選択されるタンパク質である、請求項１から３のいずれか１項に記載の形質転換体。
（ｇ）配列番号3に記載のアミノ酸配列を少なくとも含む、タンパク質；
（ｈ）配列番号3に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合性を有するタンパク質；
（i）配列番号3に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合性を有するタンパク質。
（ｇ）配列番号3に記載のアミノ酸配列を少なくとも含む、タンパク質；
（ｈ）配列番号3に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合性を有するタンパク質；
（i）配列番号3に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合性を有するタンパク質。
【請求項8】
少なくとも下記（１）～（４）の工程を含むタンパク質製造方法。
（１）請求項１に記載の形質転換体を培養する工程
（２）当該形質転換体細胞内で、導入された遺伝子により生産されたプロテアーゼが導入された遺伝子により生産されたタンパク質を消化する工程
（３）培養物から消化されたタンパク質を抽出する工程
（４）抽出液からタンパク質を精製する工程
（１）請求項１に記載の形質転換体を培養する工程
（２）当該形質転換体細胞内で、導入された遺伝子により生産されたプロテアーゼが導入された遺伝子により生産されたタンパク質を消化する工程
（３）培養物から消化されたタンパク質を抽出する工程
（４）抽出液からタンパク質を精製する工程
【請求項9】
抽出および／または精製工程で界面活性剤またはアルギニンのいずれか一方を使用する請求項８に記載のタンパク質製造方法。
【請求項10】
界面活性剤がポリソルベートである請求項９に記載のタンパク質製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プロテアーゼ消化配列を有した融合タンパク質とプロテアーゼを共発現可能な形質転換体、および共発現させる方法とプロテアーゼにより消化されたタンパク質を抽出、精製する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質は有用な高分子であり、医薬・化成品・食品産業への利用のため、様々な組換えタンパク質が生産されている。組換えタンパク質の生産において、費用と時間を節約できる点で宿主細胞は大腸菌が好ましい。しかし大腸菌による発現系において、タンパク質の種類によっては発現タンパク質の多くが不溶性の封入体となり、本来の構造を維持した組換えタンパク質を得られないことがある。組換えタンパク質の本来の構造を維持し、可溶性の組換えタンパク質を得る目的で、可溶性が高いタンパク質（可溶化タグ）と融合する方法が知られている。例えば可溶性タグとしては、ＳＵＭＯ（ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）等が広く利用されているほか、大腸菌で高発現性のタンパク質である抗体結合性タンパク質Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのＢドメインの変異型であるＺドメインタンパク質も利用することもできる（特許文献１）。可溶化タグを用いた方法は、目的の組換えタンパク質を得るためには発現後に可溶化タグを除去する工程が必要とし、一般的には可溶化タグと目的タンパク質の間にプロテアーゼ消化配列を配し、発現・抽出後にプロテアーゼによる消化反応による可溶化タグの切り離しが行われる。しかし、消化反応やその後の精製工程など、操作が煩雑である点が課題であった。
【0003】
可溶化タグと融合したタンパク質をプロテアーゼと共発現し、細胞内で可溶化タグを切り離して発現する手法は、可溶化タグとしてＳＵＭＯを融合したキイロショウジョウバエの発生過程やシグナル伝達に関与するタンパク質Ｇｒｏｕｃｈｏ Ｑと、Ｕｌｐ１プロテアーゼの共発現で報告されている（非特許文献１）。プロテアーゼにより細胞内で消化された目的タンパク質が得られたものの、本手法が他のタンパク質に応用された報告はない。
【0004】
メインプロテアーゼはコロナウイルスがもつプロテアーゼであり、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のプロテアーゼは抗ウイルス薬のターゲットとして広く研究されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のメインプロテアーゼはＧＳＴなどの可溶化タグ融合により大腸菌で発現し、可溶化タグとプロテアーゼ配列間に消化配列を配することで、細胞内で可溶化タグを消化した状態で発現することが知られている（非特許文献２）。メインプロテアーゼの消化配列は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ，ＰｈｅまたはＶａｌのいずれか一残基の次にＧｌｎ、その次にＳｅｒ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＡｓｎのいずれか１残基が続く３残基で、ＧｌｎのＣ末端側を消化することが知られている（非特許文献２）。しかし、コロナウイルス由来のメインプロテアーゼを、メインプロテアーゼ以外の可溶化タグ融合タンパク質と共発現することにより、可溶化タグが培養中に除去された目的タンパク質を可溶化発現させた報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０２３－８７９３６号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．，２０１１年，７６巻， ６５－７１頁
【非特許文献2】Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．，２０２０年，１１巻，５８７７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、タンパク質発現系において、タンパク質発現させる培養の工程で組換えタンパク質から不要なアミノ酸配列を除去し、かつ不要なアミノ酸配列が除去された組換えタンパク質を回収する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは前記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、プロテアーゼの遺伝子と、当該プロテアーゼの消化配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質の遺伝子が導入された形質転換体を培養することにより、導入された遺伝子により生産された組換えタンパク質内の消化配列が培養の工程で消化され、かつ消化された組換えタンパク質の可溶性を維持しながら回収・精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち本発明は、以下の［１］から［１０］に記載した発明を包含するものである。
［１］
プロテアーゼの遺伝子、および当該プロテアーゼが消化可能な配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質の遺伝子が導入された形質転換体。
［２］
プロテアーゼがコロナウイルスのメインプロテアーゼである、前記［１］に記載の形質転換体。
［３］
プロテアーゼが以下の少なくとも（ａ）から（ｃ）のいずれかから選択されるタンパク質である、前記［２］に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
［４］
形質転換体の宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、前記［１］から［３］いずれか一項に記載の形質転換体。
［５］
タンパク質がストレプトアビジンまたはイクイナトキシンのアミノ酸配列のいずれか一方を少なくとも含む、前記［１］から［３］のいずれか１項に記載の形質転換体。
［６］
タンパク質が以下の少なくとも（ｄ）から（ｆ）のいずれかから選択されるタンパク質である、前記［１］から［２］のいずれか１項に記載の形質転換体。
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含む、タンパク質；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつビオチン結合性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつビオチン結合性を有するタンパク質。
［７］
タンパク質が以下の少なくとも（ｇ）から（ｉ）のいずれかから選択されるタンパク質である、前記［１］から［３］のいずれか１項に記載の形質転換体。
（ｇ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を少なくとも含む、タンパク質；
（ｈ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合性を有するタンパク質；
（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合性を有するタンパク質。
［８］
少なくとも下記１～４の工程を含むタンパク質製造方法。
１）請求項１に記載の形質転換体を培養する工程
２）当該形質転換体細胞内で、導入された遺伝子により生産されたプロテアーゼが導入された遺伝子により生産されたタンパク質を消化する工程
３）培養物から消化された組換えタンパク質を抽出する工程
４）抽出液からタンパク質を精製する工程
［９］
抽出および／または精製工程で界面活性剤またはアルギニンのいずれか一方を使用する前記［８］に記載のタンパク質製造方法。
［１０］
界面活性剤がポリソルベートである前記［９］に記載のタンパク質回収工程。
［１］
プロテアーゼの遺伝子、および当該プロテアーゼが消化可能な配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質の遺伝子が導入された形質転換体。
［２］
プロテアーゼがコロナウイルスのメインプロテアーゼである、前記［１］に記載の形質転換体。
［３］
プロテアーゼが以下の少なくとも（ａ）から（ｃ）のいずれかから選択されるタンパク質である、前記［２］に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
［４］
形質転換体の宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、前記［１］から［３］いずれか一項に記載の形質転換体。
［５］
タンパク質がストレプトアビジンまたはイクイナトキシンのアミノ酸配列のいずれか一方を少なくとも含む、前記［１］から［３］のいずれか１項に記載の形質転換体。
［６］
タンパク質が以下の少なくとも（ｄ）から（ｆ）のいずれかから選択されるタンパク質である、前記［１］から［２］のいずれか１項に記載の形質転換体。
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含む、タンパク質；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつビオチン結合性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつビオチン結合性を有するタンパク質。
［７］
タンパク質が以下の少なくとも（ｇ）から（ｉ）のいずれかから選択されるタンパク質である、前記［１］から［３］のいずれか１項に記載の形質転換体。
（ｇ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を少なくとも含む、タンパク質；
（ｈ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合性を有するタンパク質；
（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合性を有するタンパク質。
［８］
少なくとも下記１～４の工程を含むタンパク質製造方法。
１）請求項１に記載の形質転換体を培養する工程
２）当該形質転換体細胞内で、導入された遺伝子により生産されたプロテアーゼが導入された遺伝子により生産されたタンパク質を消化する工程
３）培養物から消化された組換えタンパク質を抽出する工程
４）抽出液からタンパク質を精製する工程
［９］
抽出および／または精製工程で界面活性剤またはアルギニンのいずれか一方を使用する前記［８］に記載のタンパク質製造方法。
［１０］
界面活性剤がポリソルベートである前記［９］に記載のタンパク質回収工程。
【0010】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【0011】
本発明の形質転換体は、プロテアーゼの遺伝子と、当該プロテアーゼが消化可能な配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質の遺伝子の両方が導入されたことを特徴とする。
【0012】
本発明プロテアーゼは、形質転換体細胞内または分泌された培地内でプロテアーゼ活性を有する限りＮ末端側またはＣ末端側に酵素活性を有しないポリペプチドや分子が付加されていてもよく、特に制限はないが、形質転換体の生育の妨げにならないよう、消化配列の特異性が高い、および／または短時間で失活するものが好ましい。一例として、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のメインプロテアーゼのアミノ酸配列である配列番号１で示される３０６アミノ酸残基（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０ＤＴＤ１，３２６４－３５６９番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）の他、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）やＵｌｐ１プロテアーゼが挙げられる。中でも、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のメインプロテアーゼは、形質転換した大腸菌細胞内でプロテアーゼで発現し、さらに短時間で失活するため形質転換体の生育への影響が小さい点で、プロテアーゼの好ましい態様といえる。
【0013】
プロテアーゼが消化可能な配列は、プロテアーゼの種類により異なり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のメインプロテアーゼの場合はＬｅｕ／Ｍｅｔ／Ｐｈｅ／Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｇｌｙ／Ａｓｎ（ＧｌｎのＣ末端側で切断）、ＴＥＶプロテアーゼ ではＧｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（ＧｌｎのＣ末端側で切断）、Ｕｌｐ１プロテアーゼではＳＵＭＯ配列Ｃ末端のグリシンモチーフである。
【0014】
プロテアーゼが消化可能な配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質は、前述のプロテアーゼ消化配列が分子表面に露出し、プロテアーゼが結合・消化が可能な構造であれよく、例えば可溶化発現性が高く可溶化タグとして使用されるＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＳＵＭＯ（ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、Ｔｒｘ（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）、ＮｕｓＡ（Ｎ－ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａのドメインの変異型であるＺドメインと、可溶化タグにより可溶化発現量が改善される組換えタンパク質の融合タンパク質のドメイン間にプロテアーゼが消化可能な配列を配したタンパク質が挙げられる。可溶化タグにより可溶化発現が改善される組換えタンパク質の一例として、配列番号２で示されるビオチン結合タンパク質である単量体ストレプトアビジン（ｍＳＡ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎｏ．６ＺＹＴ、１７－１３５番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）の２５番目のセリンをヒスチジンに置換（Ｓ２５Ｈ、変異部位は６ＺＹＴのポリヒスチジンから数えて２５番目のセリン）した変異型配列が挙げられる。ｍＳＡおよびその変異型配列は単独では大腸菌の細胞内で可溶化発現しないが、ＳＵＭＯなどの可溶化タグを融合することにより可溶化発現することが知られている（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１４年，９８巻，６２８５－６２９５頁）。なおＳ２５Ｈ変異導入によりビオチンとの親和性が野生型より高くなることが知られている（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２０１３年，８１巻，１６２１－１６３３頁）。また、配列番号３で示されるウメボシイソギンチャク（Ａｃｔｉｎｉａ ｅｑｕｉｎａ）由来の毒性タンパク質のイクイナトキシンＩＩ（ＥｑｔＩＩ）配列（ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６１９１４の３６番目から２１４番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）に無毒性２重変異（Ｖ８Ｃ／Ｋ６９Ｃ、８番目のバリンと６９番目のリジンをシステインに置換）を導入したものは、単独では大腸菌の細胞内での可溶化発現量は少ないが、Ｚドメインなどの可溶化タグとの融合型組換えタンパク質により生産性が改善される（特開２０２３－８７９３６）。このほか、可溶化タグにより可溶化発現が改善される組換えタンパク質としては、ビオチン結合性タンパク質の単量体ストレプトアビジン、スフィンゴミエリン結合性タンパク質のライセニン、サイトカイン、ケモカイン、α－アミラーゼ、インターロイキンが挙げられる。また、プロテアーゼが消化可能な配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質は、プロテアーゼの消化の妨げにならない限り複数のタンパク質の融合型またはポリペプチドが付加されていてもよく、一例として、ＳｐｙＴａｇ配列と結合性をもつタンパク質タグＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎｏ．４ＭＬＩのＣｈａｉｎ ＡおよびＢ、１１６アミノ酸残基）、異なるタンパク質を連結するときのスペーサーとして使われるＧＳリンカー（グリシン４残基とセリン１残基の繰り返しからなるリンカー）、タンパク質の分離精製用タグであるポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、ｃ－ｍｙｃタグが挙げられる。
【0015】
本発明においてプロテアーゼ、ストレプトアビジンおよびイクイナトキシンとは、天然に存在する配列に限らず、各タンパク質の機能性（プロテアーゼのプロテアーゼ活性、ストレプトアビジンのビオチン結合性、イクイナトキシンのスフィンゴミエリン結合性）を有する限り、前記タンパク質においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上有してもよい（以下、「変異体」とも表記する）。なお前記アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加は、当業者に周知の遺伝子工学的な方法を用いて行なうことができる。
【0016】
変異体の具体例として、以下の（ｉ）または（ｉｉ）に示す、機能性を有したタンパク質が挙げられる。
（ｉ）配列番号１から３に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基のいずれか１つを少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したタンパク質；
（ｉｉ）配列番号１から３に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基をいずれか１つを少なくとも含むタンパク質。
（ｉ）配列番号１から３に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基のいずれか１つを少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したタンパク質；
（ｉｉ）配列番号１から３に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基をいずれか１つを少なくとも含むタンパク質。
【0017】
前記（ｉ）において「１もしくは数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上５個以下、１個以上３個以下のいずれかを意味する。また前記（ｉ）に記載の「置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いなどに基づく、天然にも生じ得る変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0018】
（ｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上であればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本発明において相同性とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。アミノ酸配列間の同一性とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の類似性とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
【0019】
本発明の形質転換体の作製は、当業者が通常用いる方法でよく、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド等を基にしたベクター中の適切な位置に前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入して当該タンパク質の発現ベクターを作製後、当該ベクターを用いて宿主を形質転換し得ればよい。前記宿主はプロテアーゼおよび当該プロテアーゼが消化可能な配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質が酵素活性および正しい構造を保持して発現する限り特に制限はないが、遺伝子工学に関する実験が容易な点で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。好ましい大腸菌の一例として、大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株が挙げられる。また、前記発現ベクターを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。
【0020】
前述したプロテアーゼおよび当該プロテアーゼが消化可能な配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質の培養および消化方法、組換えタンパク質の抽出および精製する方法に特に制限はなく、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。具体的には、プロテアーゼおよび当該プロテアーゼが消化可能な配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質の培養および消化方法に関しては、プロテアーゼおよび当該プロテアーゼが消化可能な配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドで宿主を形質転換し得られた形質転換体を用いて、プロテアーゼおよびプロテアーゼが消化可能な配列を含む発現タンパク質が酵素活性および正しい構造に折りたたまれるような適切な培地、温度、ｐＨ、時間、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）などの発現誘導物質の種類・濃度下で培養することにより行えばよい。培地は宿主の種類や分泌発現の場合はプロテアーゼの至適ｐＨや塩濃度など反応に影響する条件を考慮しつつ、組換えタンパク質の収率を確保するため、形質転換体の増殖が円滑に行われる培地を選択する必要がある。一例として宿主が大腸菌の場合は、当業者が組換えタンパク質の製造に使用する一般的な培地として、ＬＢ培地、２ＹＴ培地、ＴＢ培地が挙げられる。発現培養時の温度とｐＨは、宿主の生育および発現したプロテアーゼが消化反応に適した条件であり、消化対象のタンパク質については少なくとも消化を阻害しない構造を保持する必要であり、一例として宿主が大腸菌の場合でプロテアーゼがコロナウイルスのメインプロテアーゼの場合、当業者が組換えタンパク質の製造に使用する一般的な温度とｐＨとして、培養温度としては１５℃から４０℃、ｐＨは６から９が挙げられる。培養時間については、生産するタンパク質の収率確保のため形質転換体の菌数を確保するため、当業者が組換えタンパク質の製造に使用する一般的な培養時間として、４時間から４８時間が挙げられる。プロテアーゼおよび消化対象の組換えタンパク質の発現場所は、プロテアーゼによる消化を促進する点で、発現したプロテアーゼおよび消化対象のタンパク質が同じ場所に存在し、かつその場所がプロテアーゼの活性を保持し、消化対象のタンパク質については少なくとも消化を阻害しない構造を有する必要である。当業者が組換えタンパク質の製造に使用する一般的な発現場所としては細胞内発現と培地中への分泌発現が挙げられるが、プロテアーゼと消化対象のタンパク質が高濃度で存在し、消化効率が促進される点で細胞内発現が好ましい。また、プロテアーゼによる消化効率を上げるため、プロテアーゼの発現量を形質転換体の生育に影響しない程度に高める必要がある。発現量を上げる方法として、使用する発現ベクターの細胞内コピー数やプロモーターの種類、ベクターへ導入する遺伝子導入数の変更が挙げられる。一例として、大腸菌宿主を形質転換体とし、プロテアーゼとしてコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のメインプロテアーゼを使用した場合は、細胞内コピー数が１細胞当たり２０－４０個のＴ７プロモーターの発現ベクターにプロテアーゼの遺伝子を１から３つ導入した発現系が、消化対象のタンパク質の消化効率が高く、かつ形質転換体の顕著な生育阻害は見られない点で好ましい。
【0021】
培養工程中にプロテアーゼによりアミノ酸配列内の消化可能な配列で消化されたタンパク質を抽出・精製する方法は、培養物（培養された形質転換体自体や分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる）を遠心分離して得られる形質転換体を適切な緩衝液で懸濁し、薬剤や超音波により細胞を破砕後、遠心分離による破砕残渣の除去により目的タンパク質を含む可溶性タンパク質抽出液を得る工程、得られた可溶性タンパク質抽出液をアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、などの液体クロマトグラフィーにより精製する工程により、形質転換体細胞内または分泌された培地内でアミノ酸配列内の消化可能な配列で消化された目的タンパク質を製造すればよい。ただし、タンパク質の種類によっては、プロテアーゼにより消化された後のタンパク質構造が不安定で、精製工程の途中で立体構造が崩れ、不溶性化する場合がある。これを防ぐため、目的タンパク質を含む可溶性タンパク質抽出液以降の工程に界面活性剤および／またはアルギニンを添加してもよい。界面活性剤はタンパク質の変性を最小限にしながら凝集を防ぐ効果を有するものとして、ポリソルベートやデオキシコール酸、コール酸が挙げられる。特に変性作用が強くない点でポリソルベートが好ましく、具体的には、タンパク質溶液に一般的に使用され、入手が容易である点でＴｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０が好ましく、タンパク質の凝集と非特異的吸着を防ぐ効果が期待される点で、濃度は０．０１％以上０．１％以下が好ましい。アルギニンも凝集および非特異的吸着の防止が期待され、その効果を発揮し、かつニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製工程を阻害しない点で、濃度は１０ｍＭから２００ｍＭが好ましい。アルギニンの他にタンパク質の溶液中での安定化を促進する添加物として、ヒスチジン、リジン、グリシン、プロリン、グリセロール、ショ糖、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【発明の効果】
【0022】
本発明の形質転換体は、プロテアーゼと当該プロテアーゼが消化可能な配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質を共発現することにより、培養工程で発現後に消化配列を消化し、アミノ酸配列の一部を除去した組換えタンパク質を生産することができ、かつ消化された目的タンパク質の構造を維持しながら回収する工程により、発現後の不要なアミノ酸配列の消化・除去工程を省略することができ、迅速に目的タンパク質を効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】作製例１から４で作製した、発現ベクターが生産可能なポリペプチドの模式図。
【図2】実施例１および２ならびに比較例１および２の形質転換体を用いた発現培養で得られた可溶性画分およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィー精製液のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図。
【図3】実施例３および５の形質転換体を用いた発現培養で得られた可溶性画分およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィー精製液のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図。
【図4】実施例３から５の形質転換体を用いた発現培養で得られたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィー精製液の濃縮精製液のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図。
【図5】実施例６および比較例３の形質転換体を用いた発現培養で得られたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィー製液のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図。
【実施例0024】
以下、作製例、実施例、比較例および実験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
作製例１ メインプロテアーゼ発現ベクターの作製
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のメインプロテアーゼを発現ベクター１分子あたり１コピーまたは２コピー含み、大腸菌で発現可能な発現ベクターを作製した。
作製例１ メインプロテアーゼ発現ベクターの作製
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のメインプロテアーゼを発現ベクター１分子あたり１コピーまたは２コピー含み、大腸菌で発現可能な発現ベクターを作製した。
【0025】
＜１＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のメインプロテアーゼ（３ＣＬ）配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０ＤＴＤ１， ３２６４－３５６９ 番目のアミノ酸配列， ３０６アミノ酸残基）（配列番号１）のＮ末端側にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのＺドメイン（Ｚｓｐａ、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ０５２７３０の４番目から６１番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）を付加し、両配列間にメインプロテアーゼの消化配列Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ（ＦＱＳ）を配したポリペプチドＺ－３ＣＬ（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイト２（ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１の２つのマルチクローニングサイトのうち、下流側のマルチクローニングサイト）に挿入することで、メインプロテアーゼを含む組換えタンパク質Ｚ－３ＣＬ（配列番号４）をコードするポリヌクレオチドを発現ベクター１分子あたり１コピー含み、大腸菌で発現可能なベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿Ｚ－３ＣＬを作製した。なお、メインプロテアーゼにより自身のポリペプチドＺ－３ＣＬが消化されると、Ｚドメインが除去されたメインプロテアーゼ配列ｄｉｇ３ＣＬ（配列番号６）が生成する。
【0026】
＜２＞＜１＞で作製した発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿Ｚ－３ＣＬのマルチクローニングサイト１（ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１の２つのマルチクローニングサイトのうち、上流側のマルチクローニングサイト）に、＜１＞と同様にポリペプチドＺ－３ＣＬ（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を挿入することで、組換えタンパク質Ｚ－３ＣＬ（配列番号４）をコードするポリヌクレオチドを発現ベクター１分子あたり２コピー含み、大腸菌で発現可能なベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿２（Ｚ－３ＣＬ）を作製した。なお、当該ベクターで挿入したポリヌクレオチド（配列番号５）は、＜１＞で挿入したポリヌクレオチド（配列番号５）と若干異なるが、コードするアミノ酸配列は同じである。なお、メインプロテアーゼにより自身のポリペプチドＺ－３ＣＬが消化されると、＜１＞と同様にＺドメインが除去されたメインプロテアーゼ配列ｄｉｇ３ＣＬ（配列番号６）が生成する。
【0027】
作製した発現ベクターの詳細を表１および図１に示した。
【0028】
【表1】
【0029】
※１：「Ｎｏ．」は図１、表２と対応する。
※２：メインプロテアーゼの消化配列ＦＱＳで消化される前後のタンパク質配列を示した。消化後の配列は、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーで精製される可能性があるポリヒスチジン配列を含む配列を示した（メインプロテアーゼを除く、※３参照）。
※３：ＡＡはアミノ酸配列、ＤＮＡはヌクレオチド配列を示す。
※４：メインプロテアーゼのＺ－３ＣＬ配列はポリヒスチジン配列を含まれないため、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製液に含まれない。
※２：メインプロテアーゼの消化配列ＦＱＳで消化される前後のタンパク質配列を示した。消化後の配列は、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーで精製される可能性があるポリヒスチジン配列を含む配列を示した（メインプロテアーゼを除く、※３参照）。
※３：ＡＡはアミノ酸配列、ＤＮＡはヌクレオチド配列を示す。
※４：メインプロテアーゼのＺ－３ＣＬ配列はポリヒスチジン配列を含まれないため、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製液に含まれない。
【0030】
作製例２ 可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジン（単量体ストレプトアビジンのＣ末端にポリヒスチジン配列を付与）発現ベクターの作製
単量体ストレプトアビジンのビオチンとの結合親和性改良型である変異型（ｍＳＡｍｕｔ）配列（配列番号１）のＮ末端側に、可溶化タグＳＵＭＯまたはＺドメインを融合し、可溶化タグとｍＳＡｍｕｔ配列の間にメインプロテアーゼ消化配列を配し、さらにＣ末端側にポリヒスチジン配列を付与した組換えタンパク質を、大腸菌で発現可能な発現ベクターを作製した。
【0031】
単量体ストレプトアビジン配列（ＰＤＢ：６ＺＹＴ、１７－１３５番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチド）の２５番目のセリンをヒスチジンに置換した変異型（ｍＳＡｍｕｔ）配列（配列番号２）のＮ末端側に可溶化タグタンパク質のＳＵＭＯ、またはＺドメイン（ＳｐＡＺ、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ０５２７３０の４番目から６１番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）を融合し、両配列間にメインプロテアーゼの消化配列ＦＱＳを配し、さらにｍＳＡｍｕｔ配列のＣ末端にポリヒスチジン配列を付与したポリヌクレオチドを作製し、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、ｍＳＡｍｕｔを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターを作製した。作製した発現ベクターの詳細を作製例１の表１および図１に示した。
【0032】
作製した発現ベクターは、可溶化タグとしてＳＵＭＯを使用した発現ベクターをｐＥＴ＿ＳＵＭＯ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈとし、このベクターは組換えタンパク質ＳＵＭＯ－ｍＳＡｍｕｔ―６Ｈ（配列番号７）を発現可能であり、その配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）を含む。発現する組換えタンパク質はメインプロテアーゼにより消化されると、ＳＵＭＯが除去された、ポリヒスチジン配列を含む組換えタンパク質ｍＳＡｍｕｔ―６Ｈ（配列番号９）が生成する。
【0033】
可溶化タグとしてＺドメインを使用したものをｐＥＴ＿Ｚ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈとし、このベクターは組換えタンパク質Ｚ－ｍＳＡｍｕｔ―６Ｈ（配列番号１０）を発現可能であり、その配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）を含む。発現する組換えタンパク質はメインプロテアーゼにより消化されると、Ｚドメインが除去された、ポリヒスチジン配列を含む組換えタンパク質ｍＳＡｍｕｔ―６Ｈ（配列番号９）が生成する。
作製例３ 可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジン（単量体ストレプトアビジンのＮ末端にポリヒスチジン配列を付与）発現ベクターの作製
単量体ストレプトアビジン配列ｍＳＡｍｕｔのＮ末端側に、可溶化タグＳＵＭＯまたはＺドメインを融合し、可溶化タグとｍＳＡｍｕｔ配列の間にメインプロテアーゼ消化配列を配し、さらに消化配列のＣ末端側（ｍＳＡｍｕｔ配列のＮ末端側）にポリヒスチジン配列を付与した組換えタンパク質を、大腸菌で発現可能な発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターの詳細を作製例１の表１および図１に示した。
作製例３ 可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジン（単量体ストレプトアビジンのＮ末端にポリヒスチジン配列を付与）発現ベクターの作製
単量体ストレプトアビジン配列ｍＳＡｍｕｔのＮ末端側に、可溶化タグＳＵＭＯまたはＺドメインを融合し、可溶化タグとｍＳＡｍｕｔ配列の間にメインプロテアーゼ消化配列を配し、さらに消化配列のＣ末端側（ｍＳＡｍｕｔ配列のＮ末端側）にポリヒスチジン配列を付与した組換えタンパク質を、大腸菌で発現可能な発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターの詳細を作製例１の表１および図１に示した。
【0034】
ｍＳＡｍｕｔ配列（配列番号２）のＮ末端側に可溶化タグタンパク質のＳＵＭＯまたはＺドメインを融合し、両配列間にメインプロテアーゼの消化配列ＦＱＳを配し、さらにｍＳＡｍｕｔ配列のＮ末端にポリヒスチジン配列を付与したポリヌクレオチドを作製し、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、ｍＳＡｍｕｔを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターを作製した。
【0035】
作製した発現ベクターは、可溶化タグとしてＳＵＭＯを使用した発現ベクターをｐＥＴ＿ＳＵＭＯ－６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔとし、このベクターは組換えタンパク質ＳＵＭＯ－６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（配列番号１２）を発現可能であり、その配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３）を含む。発現する組換えタンパク質はメインプロテアーゼにより消化されると、ＳＵＭＯが除去された、ポリヒスチジン配列を含む組換えタンパク質６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（配列番号１４）が生成する。
【0036】
可溶化タグとしてＺドメインを使用したものをｐＥＴ＿Ｚ－６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔとし、このベクターは組換えタンパク質Ｚ－６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（配列番号１５）を発現可能であり、その配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）を含む。発現する組換えタンパク質はメインプロテアーゼにより消化されると、Ｚドメインが除去された、ポリヒスチジン配列を含む組換えタンパク質６Ｈ―ｍＳＡｍｕｔ（配列番号１４）が生成する。
作製例４ 可溶性タグ融合イクイナトキシンとメインプロテアーゼの共発現ベクターの作製
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のメインプロテアーゼと、ＺドメインをＮ末端側に融合したイクイナトキシンをそれぞれ大腸菌で発現可能な共発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターの詳細を作製例１の表１および図１に示した。
作製例４ 可溶性タグ融合イクイナトキシンとメインプロテアーゼの共発現ベクターの作製
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のメインプロテアーゼと、ＺドメインをＮ末端側に融合したイクイナトキシンをそれぞれ大腸菌で発現可能な共発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターの詳細を作製例１の表１および図１に示した。
【0037】
＜１＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のメインプロテアーゼ（３ＣＬ）配列のアミノ酸配列は、作製例１と同様にＮ末端側にＺドメインを付加し、両配列間にメインプロテアーゼの消化配列ＦＱＳを配したポリペプチドＺ－３ＣＬ（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を用い、ｐＥＴＤｕｅｔ－１（メルク製）のマルチクローニングサイト２（ｐＥＴＤｕｅｔ－１の２つのマルチクローニングサイトのうち、下流側のマルチクローニングサイト）に挿入することで、ｐＥＴＤｕｅｔ＿Ｚ－３ＣＬを作製した。
【0038】
ｐＥＴＤｕｅｔ＿Ｚ－３ＣＬのマルチクローニングサイト１（ｐＥＴＤｕｅｔ－１の２つのマルチクローニングサイトのうち、上流側のマルチクローニングサイト）には、以下のＺドメイン、無毒性変異型イクイナトキシンＩＩ（ＥｑｔＩＩ）、タンパク質タグＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣ）配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を挿入した。ポリペプチド配列Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈ（配列番号１７）は、ＥｑｔＩＩ配列（ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６１９１４、３６－２１４番目のアミノ酸配列、の３６番目から２１４番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）の８番目のバリンおよび６９番目のリジンをシステインに置換した無毒性変異型（ＥｑｔＩＩｍｕｔ）配列のＮ末端側にＺドメインを付加し、その両配列間にメインプロテアーゼの消化配列ＦＱＳを配し，さらにそのＣ末端側にＳｐｙＣ配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎｏ．４ＭＬＩのＣｈａｉｎ ＡおよびＢ、１１６アミノ酸残基）を融合し、全融合タンパク質のＣ末端側にポリヒスチジン配列を付与したアミノ酸配列であり、それをコードするポリヌクレオチドが配列番号１８に示される配列である。発現する組換えタンパク質はメインプロテアーゼにより消化されると、Ｚドメインが除去された、ポリヒスチジン配列を含む組換えタンパク質ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈ（配列番号１９）が生成する。
【0039】
＜２＞コントロールとして、ポリペプチドＺ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈを生産可能で、かつメインプロテアーゼを生産しない発現ベクターを、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトにポリペプチドＺ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈ（配列番号１７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８）を挿入することにより作製し、ｐＥＴ＿Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈとした。発現する組換えタンパク質は、別の発現ベクターによりメインプロテアーゼを共発現しない限り、メインプロテアーゼにより消化されることはなく、Ｚドメインが融合された組換えタンパク質Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈ（配列番号１７）のみを生成する。
作製例５ 可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジンとメインプロテアーゼの共発現
作製例１＜１＞で作製した、メインプロテアーゼを含む組換えタンパク質Ｚ－３ＣＬをコードするポリヌクレオチドを発現ベクター１分子あたり１コピー含む発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿Ｚ－３ＣＬと、作製例２で作製したＣ末端にポリヒスチジン配列を付与した可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジン発現ベクターの両方が大腸菌細胞内に導入された共形質転換体を作製し、共発現を行った。
作製例５ 可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジンとメインプロテアーゼの共発現
作製例１＜１＞で作製した、メインプロテアーゼを含む組換えタンパク質Ｚ－３ＣＬをコードするポリヌクレオチドを発現ベクター１分子あたり１コピー含む発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿Ｚ－３ＣＬと、作製例２で作製したＣ末端にポリヒスチジン配列を付与した可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジン発現ベクターの両方が大腸菌細胞内に導入された共形質転換体を作製し、共発現を行った。
【0040】
＜１＞作製例１＜１＞で作製された発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿Ｚ－３ＣＬと、作製例２で作製した発現ベクターｐＥＴ＿ＳＵＭＯ－ｍＳＡｍｕｔ－６ＨまたはｐＥＴ＿Ｚ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈのいずれか１つを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＬＢ寒天培地により選択することにより、組換え大腸菌（共形質転換体）ＥＣ＿Ｚ－３ＣＬ＋ＳＵＭＯ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈ（実施例１）およびＥＣ＿Ｚ－３ＣＬ＋Ｚ＿ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈ（実施例２）を得た。作製した共形質転換体の詳細を表２に示した。
【0041】
【表2】
【0042】
※１：「発現ベクター」の番号［１］～［８］は図１、表１と対応する。
【0043】
＜２＞コントロールとして、可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジン発現ベクターのみを形質転換し、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地で選択した組換え大腸菌（形質転換体）ＥＣ＿ＳＵＭＯ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈ（比較例１）およびＥＣ＿Ｚ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈ（比較例２）を得た。作製した形質転換の詳細を前述の表２に示した。
【0044】
＜３＞得られた形質転換体をＬＢ液体培地（＜１＞の共形質転換体は３０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む、＜２＞の形質転換体は３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に接種し、３７℃で一晩（約１８時間）振盪することで前培養を行ない、前培養液をＴＢ液体培地（＜１＞の共形質転換体は３０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む、＜２＞の形質転換体は３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（ＯＤ６００ｎｍ）が凡そ０．６になったところで、培養温度を２０℃に切り替え、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ添加した後、一晩（約１８時間）振盪することで本培養を行い、メインプロテアーゼおよび可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジンを共発現させた。
【0045】
＜４＞本培養液から菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を添加したＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）に懸濁、室温で１０分間穏やかに振盪した後、１６，０００×ｇで４℃、２０分間遠心分離を行い、上清を可溶性タンパク質抽出液として回収した。
【0046】
＜５＞可溶性タンパク質抽出液に２０ｍＭのアルギニン（ｐＨ８．０）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加し、さらにニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーの一般的なプロトコルに従いレジンへの非特異的吸着を防ぐ目的で５ｍＭイミダゾールと７５ｍＭ塩化ナトリウムを添加した後、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーに供した。クロマトグラフィーの平衡化、洗浄、溶出用緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭアルギニン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０と種々の濃度のイミダゾール（平衡化：５ｍＭ、洗浄：３０ｍＭ、溶出：２５０ｍＭ）を添加し、ｐＨを８．０に調整したものを使用した。溶出用緩衝液により回収したタンパク質溶液をアフィニティーカラム精製液とした。
【0047】
＜６＞＜４＞で得られた可溶性タンパク質抽出液および＜５＞で得られたアフィニティーカラム精製液をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に供した。タンパク質溶液の熱処理は、ＤＴＴを含むサンプルバッファーにより行った。
【0048】
実施例１および２および比較例１および２のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図２に示した。可溶性タグとしてＳＵＭＯを使用したｍＳＡｍｕｔ配列を含む発現ベクターを導入した形質転換体（比較例１）と、メインプロテアーゼとの共形質転換体（実施例１）のアフィニティーカラム精製液では、それぞれ可溶化タグ融合ｍＳＡｍｕｔタンパク質ＳＵＭＯ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈ（理論分子量２７．８ｋＤａ）に相当する分子量のバンドが確認された（レーン２、４、破線矢印）。メインプロテアーゼとの共発現である実施例１では、ＳＵＭＯ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈタンパク質のバンドに加えて、ＳＵＭＯ配列とｍＳａｍｕｔ配列間のプロテアーゼ消化配列で消化されたタンパク質ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈ（理論分子量１４．８ｋＤａ）に相当する分子量バンド（レーン４、実線矢印）が確認され、さらにＳＵＭＯ配列が融合した状態の２８ｋＤａ付近のバンド強度が、実施例１（レーン４、破線矢印）は比較例１（レーン２、破線矢印）に比べ低いことから、メインプロテアーゼとの共発現により、組換えタンパク質ＳＵＭＯ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈの一部でＳＵＭＯ配列が除去され、組換えタンパク質ｍＳＡｍｕｔ―６Ｈが生成したことが示された。
【0049】
可溶化タグとしてＺドメインを使用したｍＳＡｍｕｔ配列を含む発現ベクターを導入した形質転換体（比較例２）およびメインプロテアーゼとの共形質転換体（実施例２）も同様に、可溶化タグ融合ｍＳＡｍｕｔタンパク質Ｚ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈ（理論分子量２３．５ｋＤａ）に相当する分子量のバンド（レーン６、８、破線矢印）の他に、共発現系である実施例２ではＺドメイン配列が除去されたタンパク質ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈ（理論分子量１４．８ｋＤａ）に相当する分子量バンド（レーン８、実線矢印）が確認され、可溶化タグが除去された組換えタンパク質ｍＳＡｍｕｔ―６Ｈが生成したことが示された。なお、比較例２、実施例２の精製液（レーン６、８）には、ＳＵＭＯ融合型の実施例１（レーン４）のｍＳＡｍｕｔ－６Ｈのバンドと同分子量のバンドが見られるが、実施例１および２で得られるｍＳＡｍｕｔ―６Ｈは同分子量であることから、実施例１と同一の位置のバンド（レーン８の実線矢印）はＳＵＭＯ配列が除去されて生じたバンドであり、比較例２および実施例２で見られる低分子側のバンドは、夾雑物によるものと考えられた。
【0050】
以上の結果より、メインプロテアーゼ発現ベクターと可溶化タグとしてＺドメインまたはＳＵＭＯを使用した可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジン発現ベクターの共発現により、可溶化タグが除去された可溶性単量体ストレプトアビジンが得られることが示された。なお、実施例１および２、比較例１および２において、発現培養の生育速度および菌体収量について、顕著な差はみられなかった。
作製例６ 可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジンと、発現量を増加させたメインプロテアーゼの共発現
作製例１＜２＞で作製した、メインプロテアーゼを含む組換えタンパク質Ｚ－３ＣＬをコードするポリヌクレオチドを発現ベクター１分子あたり２コピー含む発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿２（Ｚ－３ＣＬ）と、作製例３で作製したｍＳＡｍｕｔのＮ末端にポリヒスチジン配列を付与した可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジン発現ベクターの両方が大腸菌細胞内に導入された共形質転換体を作製し、共発現を行った。作製した共形質転換の詳細を作製例５の表２に示した。
作製例６ 可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジンと、発現量を増加させたメインプロテアーゼの共発現
作製例１＜２＞で作製した、メインプロテアーゼを含む組換えタンパク質Ｚ－３ＣＬをコードするポリヌクレオチドを発現ベクター１分子あたり２コピー含む発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿２（Ｚ－３ＣＬ）と、作製例３で作製したｍＳＡｍｕｔのＮ末端にポリヒスチジン配列を付与した可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジン発現ベクターの両方が大腸菌細胞内に導入された共形質転換体を作製し、共発現を行った。作製した共形質転換の詳細を作製例５の表２に示した。
【0051】
＜１＞作製例１＜２＞で作製された発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿２（Ｚ－３ＣＬ）と、作製例３で作製した発現ベクターｐＥＴ＿Ｚ－６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔまたはｐＥＴ＿ＳＵＭＯ－６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＬＢ寒天培地により選択することにより、共形質転換体ＥＣ＿２（Ｚ－３ＣＬ）＋Ｚ－６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（実施例３）、およびＥＣ＿２（Ｚ－３ＣＬ）＋ＳＵＭＯ＿６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（実施例４）を得た。
【0052】
＜２＞メインプロテアーゼ発現ベクターに含まれる組換えタンパク質Ｚ－３ＣＬをコードするポリヌクレオチドのコピー数とメインプロテアーゼの消化活性の比較として、Ｚドメインを融合した単量体ストレプトアビジン発現ベクター発現ベクターｐＥＴ＿Ｚ－６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔについては、作製例１＜１＞で作製した組換えタンパク質Ｚ－３ＣＬをコードするポリヌクレオチドを発現ベクター１分子あたり１コピー含む発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿Ｚ－３ＣＬとの共形質転換体ＥＣ＿Ｚ－３ＣＬ＋Ｚ－６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（実施例５）を作製した。
【0053】
＜３＞＜１＞および＜２＞で作製した共形質転換体（実施例３から６）を作製例５＜３＞に記載と同様な方法で発現培養を行った。
【0054】
＜４＞作製例５＜４＞に記載と同様な方法で可溶性タンパク質抽出液を回収した。
【0055】
＜５＞作製例５＜５＞に記載と同様な方法でアフィニティーカラム精製液を回収した。得られたアフィニティーカラム精製液は限外ろ過膜（アミコンウルトラ－０．５ｍＬ 遠心式フィルター、３Ｋデバイス、メルク製）により濃縮用緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ アルギニン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）に置換し、濃縮精製液とした。
＜６＞作製例５＜６＞に記載と同様な方法で＜４＞で得られた可溶性タンパク質抽出液および／または＜５＞で得られたアフィニティーカラム精製液、濃縮精製液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。実施例３および５の可溶性タンパク質抽出液およびアフィニティーカラム精製液のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図３に、濃縮精製液のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図４に示した。可溶性タグとしてＺドメインを融合し、ｍＳＡｍｕｔ配列のＮ末端側にポリヒスチジン配列を付与したｍＳＡｍｕｔ配列を含む発現ベクターとメインプロテアーゼ発現ベクターを導入した共形質転換体（実施例３および５）は、ともに可溶化タグ融合ｍＳＡｍｕｔタンパク質Ｚ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈ（理論分子量２４．５ｋＤａ）に相当する分子量のバンド（図３：レーン２、４、図４：レーン１，２破線矢印）とＺドメイン配列とｍＳＡｍｕｔ配列間のプロテアーゼ消化配列で消化されたタンパク質６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（理論分子量１５．７ｋＤａ）に相当する分子量バンド（図３：レーン２、４、図４：レーン１，２実線矢印）が確認され、ポリヒスチジン配列の位置がｍＳＡｍｕｔ配列のＮ末端側にした場合も、Ｃ末端側の発現ベクターｐＥＴ＿Ｚ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈの場合と同様にメインプロテアーゼ発現ベクターとの共発現系でＺドメイン融合ｍＳＡｍｕｔタンパク質の可溶化発現およびメインプロテアーゼによるＺドメイン配列が除去された組換えタンパク質が生成したことが示された。さらに、共発現したメインプロテアーゼ発現ベクターに含まれるメインプロテアーゼ配列をコードするポリヌクレオチドのコピー数が発現ベクター１分子あたり１コピーの発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿Ｚ－３ＣＬを含む共形質転換体（実施例５）に比べ、２コピーを含む発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿２（Ｚ－３ＣＬ）を含む共形質転換体（実施例３）の方が、可溶化タグが融合したバンド（図３：レーン２、４、図４：レーン１，２破線矢印）の強度が低くプロテアーゼ消化配列で消化されたタンパク質６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（理論分子量１５．７ｋＤａ）のバンド（図３：レーン２、４、図４：レーン１，２実線矢印）の強度が高いことから、メインプロテアーゼ配列をコードするポリヌクレオチドのコピー数が１コピーより２コピーで消化効率が高かった。なお、抽出液中のメインプロテアーゼに該当するバンドとして、メインプロテアーゼ配列を２コピー導入した実施例３では、Ｚドメインが消化されたメインプロテアーゼ配列ｄｉｇ３ＣＬ（理論分子量３４．２ｋＤａ）付近にシグナル強度の高いバンドがあり、１コピー導入の実施例３では見られないことから、２コピー導入により１コピーよりも多くのメインプロテーゼが発現した可能性がある。
＜６＞作製例５＜６＞に記載と同様な方法で＜４＞で得られた可溶性タンパク質抽出液および／または＜５＞で得られたアフィニティーカラム精製液、濃縮精製液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。実施例３および５の可溶性タンパク質抽出液およびアフィニティーカラム精製液のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図３に、濃縮精製液のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図４に示した。可溶性タグとしてＺドメインを融合し、ｍＳＡｍｕｔ配列のＮ末端側にポリヒスチジン配列を付与したｍＳＡｍｕｔ配列を含む発現ベクターとメインプロテアーゼ発現ベクターを導入した共形質転換体（実施例３および５）は、ともに可溶化タグ融合ｍＳＡｍｕｔタンパク質Ｚ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈ（理論分子量２４．５ｋＤａ）に相当する分子量のバンド（図３：レーン２、４、図４：レーン１，２破線矢印）とＺドメイン配列とｍＳＡｍｕｔ配列間のプロテアーゼ消化配列で消化されたタンパク質６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（理論分子量１５．７ｋＤａ）に相当する分子量バンド（図３：レーン２、４、図４：レーン１，２実線矢印）が確認され、ポリヒスチジン配列の位置がｍＳＡｍｕｔ配列のＮ末端側にした場合も、Ｃ末端側の発現ベクターｐＥＴ＿Ｚ－ｍＳＡｍｕｔ－６Ｈの場合と同様にメインプロテアーゼ発現ベクターとの共発現系でＺドメイン融合ｍＳＡｍｕｔタンパク質の可溶化発現およびメインプロテアーゼによるＺドメイン配列が除去された組換えタンパク質が生成したことが示された。さらに、共発現したメインプロテアーゼ発現ベクターに含まれるメインプロテアーゼ配列をコードするポリヌクレオチドのコピー数が発現ベクター１分子あたり１コピーの発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿Ｚ－３ＣＬを含む共形質転換体（実施例５）に比べ、２コピーを含む発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ＿２（Ｚ－３ＣＬ）を含む共形質転換体（実施例３）の方が、可溶化タグが融合したバンド（図３：レーン２、４、図４：レーン１，２破線矢印）の強度が低くプロテアーゼ消化配列で消化されたタンパク質６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（理論分子量１５．７ｋＤａ）のバンド（図３：レーン２、４、図４：レーン１，２実線矢印）の強度が高いことから、メインプロテアーゼ配列をコードするポリヌクレオチドのコピー数が１コピーより２コピーで消化効率が高かった。なお、抽出液中のメインプロテアーゼに該当するバンドとして、メインプロテアーゼ配列を２コピー導入した実施例３では、Ｚドメインが消化されたメインプロテアーゼ配列ｄｉｇ３ＣＬ（理論分子量３４．２ｋＤａ）付近にシグナル強度の高いバンドがあり、１コピー導入の実施例３では見られないことから、２コピー導入により１コピーよりも多くのメインプロテーゼが発現した可能性がある。
【0056】
可溶化タグとしてＳＵＭＯを融合した場合もＺドメインと同様に、メインプロテアーゼ配列をコードするポリヌクレオチドのコピー数が２コピーの発現ベクターと共発現した実施例４で、ＳＵＭＯが融合した状態の組換えタンパク質ＳＵＭＯ－６Ｈ―ｍＳＡｍｕｔの分子量（理論分子量２８．７ｋＤａ、配列番号１２）に相当するバンド（図４、レーン３、破線矢印）よりメインプロテアーゼによりＳＵＭＯ配列が除去された組換えタンパク質バンド６Ｈ－ｍＳＡｍｕｔ（理論分子量１５．７ｋＤａ）に相当するバンド（図４、レーン３、破線矢印）のバンド強度が高く、消化されたタンパク質の方が多く含まれることが示された。ポリヒスチジン配列の位置は異なるが、メインプロテアーゼ発現ベクターのコピー数が１コピーの発現ベクターと共発現した実施例１（図２、レーン８）では、ＳＵＭＯ配列が除去された組換えタンパク質（図２、レーン４、実線矢印）より未消化のＳＵＭＯ融合型（図２、レーン４、破線矢印）のバンド強度が高いことから、メインプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列のコピー数を１から２に増やすことで、ＳＵＭＯ配列の消化効率が上がったことが示唆された。
【0057】
以上の結果より、メインプロテアーゼ発現ベクターと可溶化タグとしてＺドメインまたはＳＵＭＯを使用した可溶性タグ融合単量体ストレプトアビジン発現ベクターの共発現において、メインプロテアーゼ発現ベクターが含むメインプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列のコピー数を発現ベクター１分子あたり１コピーから２コピーに増やすことで、より効率的に可溶化タグが除去され、得られるタンパク質溶液中の可溶性単量体ストレプトアビジンの割合が高まることが示された。なお、実施例３から６において、発現培養の生育速度および菌体収量について、顕著な差はみられなかった。
作製例７ 可溶性タグ融合イクイナトキシンとメインプロテアーゼの共発現
作製例４で作製した、Ｚドメイン融合イクイナトキシンにさらにタンパク質タグＳｐｙＣ配列を付与した配列と、メインプロテアーゼをそれぞれコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、Ｚドメイン融合イクイナトキシン―ＳｐｙＣのヌクレオチド配列のみを含む発現ベクターが大腸菌細胞内に導入された形質転換体をそれぞれ作製し、発現を行った。作製した共形質転換体／形質転換の詳細を作製例５の表２に示した。
作製例７ 可溶性タグ融合イクイナトキシンとメインプロテアーゼの共発現
作製例４で作製した、Ｚドメイン融合イクイナトキシンにさらにタンパク質タグＳｐｙＣ配列を付与した配列と、メインプロテアーゼをそれぞれコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、Ｚドメイン融合イクイナトキシン―ＳｐｙＣのヌクレオチド配列のみを含む発現ベクターが大腸菌細胞内に導入された形質転換体をそれぞれ作製し、発現を行った。作製した共形質転換体／形質転換の詳細を作製例５の表２に示した。
【0058】
＜１＞作製例４＜１＞で作製した発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ＿Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈ／Ｚ－３ＣＬまたは、作製例４＜２＞で作製した発現ベクターｐＥＴ＿Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。形質転換体の選択は、発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ＿Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈ／Ｚ－３ＣＬで６０μｇ／ｍＬのカルベニイシリンを添加したＬＢ寒天培地により、発現ベクターｐＥＴ＿Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈでは３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地により行い、共形質転換体ＥＣ＿Ｚ－３ＣＬ＋Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈ（実施例６）および形質転換体ＥＣ＿Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈ（比較例３）を得た。
【0059】
＜２＞＜１＞で作製した共形質転換体（実施例６）および形質転換体（比較例３）を作製例５＜３＞に記載と同様な方法で発現培養を行った。ただし培地中に添加する抗生物質は、共形質転換体ＥＣ＿Ｚ－３ＣＬ＋Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈは６０μｇ／ｍＬのカルベニイシリン、形質転換体ＥＣ＿Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈは３０μｇ／ｍＬのカナマイシンとした。
【0060】
＜３＞作製例５＜４＞に記載と同様な方法で可溶性タンパク質抽出液を回収した。
【0061】
＜４＞作製例５＜５＞に記載と同様な方法でアフィニティーカラム精製液を回収した。
【0062】
＜５＞作製例５＜６＞に記載と同様な方法で＜４＞で得られたアフィニティーカラム精製液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。実施例５および比較例３のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図５に示した。Ｚドメイン融合イクイナトキシンを含むアミノ酸配列Ｚ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈをコードするヌクレオチド配列のみを含む発現ベクターによる形質転換体（比較例３）と、Ｚドメイン融合イクイナトキシンを含むアミノ酸配列とメインプロテアーゼのヌクレオチド配列の両方を持つ発現ベクターによる形質転換体（実施例６）ではそれぞれＺドメインが融合した状態のＺ－ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈ（理論分子量４４．３ｋＤａ）に相当する分子量のバンドが確認された（レーン１，２、破線矢印）。さらに、当該バンド強度はメインプロテアーゼとの共発現形質転換体（実施例６、レーン２、破線矢印）で低く、Ｚドメイン配列とＥｑｔＩＩ配列間のプロテアーゼ消化配列で消化されたタンパク質ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈ（理論分子量３５．３ｋＤａ）に相当する分子量のバンド（レーン２、実線矢印）の強度が高いことから、メインプロテアーゼとの共発現によりＺドメイン配列が除去されたタンパク質ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈが生成したことが示された。なお、タンパク質ＥｑｔＩＩｍｕｔ－ＳｐｙＣ－６Ｈと同分子量のバンドが比較例３でも見られるが、実施例６に比べバンド強度が低く、かつ実施例６のバンドよりやや分子量が小さいことから、夾雑物によるものと考えられた。比較例３および実施例６の両方に見られる３０ｋＤａ付近のバンドも同様に夾雑物によるものと考えられた。
【0063】
以上の結果より、メインプロテアーゼとＺドメイン融合イクイナトキシンにさらにタンパク質タグＳｐｙＣ配列を付与した配列をそれぞれコードするヌクレオチド配列を含む共発現ベクターによる共発現により、可溶化タグのＺドメインが除去されたイクイナトキシンとタンパク質タグＳｐｙＣ配列からなる可溶性の組換えタンパク質が得られることが示された。なお、実施例６および比較例３において、発現培養の生育速度および菌体収量について、顕著な差はみられなかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】