知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特開2025-13323宣威ハム由来の抗酸化ペプチド及びその調製法と活性測定方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025013323
(43)【公開日】2025-01-24
(54)【発明の名称】宣威ハム由来の抗酸化ペプチド及びその調製法と活性測定方法
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20250117BHJP
C07K 7/00 20060101ALI20250117BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20250117BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20250117BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K7/00
C07K14/47
G01N33/68
C07K19/00
【審査請求】有
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024113374
(22)【出願日】2024-07-16
(31)【優先権主張番号】202310867302.8
(32)【優先日】2023-07-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】517062562
【氏名又は名称】合肥工▲業▼大学
【氏名又は名称原語表記】ＨｅＦｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１９３， Ｔｕｎｘｉ Ｒｏａｄ， Ｂａｏｈｅ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， ＨｅＦｅｉ， Ａｎｈｕｉ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】徐宝才
(72)【発明者】
【氏名】葛金霞
(72)【発明者】
【氏名】蔡克周
(72)【発明者】
【氏名】徐斐然
(72)【発明者】
【氏名】扈瑩瑩
(72)【発明者】
【氏名】崔偉
(72)【発明者】
【氏名】孔令傑
(72)【発明者】
【氏名】謝勇
【テーマコード（参考）】
2G045
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045DA36
2G045FB01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA21
4H045BA41
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】 （修正有）
【課題】宣威ハム由来の抗酸化ペプチド、及びその調製法と活性測定方法を提供する。
【解決手段】本発明は、宣威ハム由来の特定のアミノ酸配列を有する抗酸化ペプチドを提供する。本発明は、剛体連結ペプチドと柔軟連結ペプチドを使用して宣威ハム由来のヘキサペプチドを連結し、ペプチド鎖を成長させて遺伝子組換え発現に適したものにすると同時に、組換えタンパク質中の標的ポリペプチドの割合を増加させ、発現量を大幅に増加させ、次に、剛体連結ペプチドはαヘリックス構造を持っており、これにより直列連結後の抗酸化ペプチドが安定した二次構造を形成しやすくなり、活性な機能ドメインを効果的に分離することができ、柔軟連結ペプチドは主にグリシンＧｌｙで構成されており、分子量が小さいため、ポリペプチド骨格構造の自由度が確保される。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、宣威ハム由来の特定のアミノ酸配列を有する抗酸化ペプチドを提供する。本発明は、剛体連結ペプチドと柔軟連結ペプチドを使用して宣威ハム由来のヘキサペプチドを連結し、ペプチド鎖を成長させて遺伝子組換え発現に適したものにすると同時に、組換えタンパク質中の標的ポリペプチドの割合を増加させ、発現量を大幅に増加させ、次に、剛体連結ペプチドはαヘリックス構造を持っており、これにより直列連結後の抗酸化ペプチドが安定した二次構造を形成しやすくなり、活性な機能ドメインを効果的に分離することができ、柔軟連結ペプチドは主にグリシンＧｌｙで構成されており、分子量が小さいため、ポリペプチド骨格構造の自由度が確保される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
宣威ハム由来の抗酸化ペプチドであって、そのアミノ酸配列を配列番号１または配列番号２に示すことを特徴とする宣威ハム由来の抗酸化ペプチド。
【請求項2】
対応する遺伝子配列を配列番号３または配列番号４に示すことを特徴とする請求項１に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチド。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法であって、
宣威ハムペプチドのアミノ酸配列に従って、剛体連結ペプチドまたは柔軟連結ペプチドを使用して宣威ハムペプチドを６倍体に連結し、標的遺伝子を取得し、前記宣威ハムペプチド、剛体連結ペプチド及び柔軟連結ペプチドの配列を配列番号９～１１に示し、前記標的遺伝子の配列を配列番号３または配列番号４に示すステップ（１）と、
標的遺伝子および原核生物発現プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉで二重酵素切断し、ＤＮＡリガーゼを介して接続して、原核生物組換え発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を得るステップ（２）と、
原核生物組換え発現ベクターをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、組換え工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を構築するステップ（３）と、
コロニーＰＣＲにより組換え発現ベクターの形質転換が成功したことを検証するステップ（４）と、
工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６の発現においてＨｉｓタグ付き直列連結組換えポリペプチドの発現を誘導するステップ（５）と、
発現されたＨｉｓタグ付き融合タンパク質を、ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して精製し、タンパク質をロードすると、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がニッケルカラムに特異的に結合し、不純物タンパク質はニッケルカラムへの非特異的結合により流出し、イミダゾール勾配溶出を使用し、イミダゾールとＮｉ２＋の組み合わせが競合的にニッケルカラムに結合し、それによって融合タンパク質が放出され、溶出液を収集するステップ（６）と、
ＲＰ－ＨＰＬＣを純度試験に使用して、高純度の直列連結組換え抗酸化ペプチドを取得するステップ（７）と、を含むことを特徴とする宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法。
宣威ハムペプチドのアミノ酸配列に従って、剛体連結ペプチドまたは柔軟連結ペプチドを使用して宣威ハムペプチドを６倍体に連結し、標的遺伝子を取得し、前記宣威ハムペプチド、剛体連結ペプチド及び柔軟連結ペプチドの配列を配列番号９～１１に示し、前記標的遺伝子の配列を配列番号３または配列番号４に示すステップ（１）と、
標的遺伝子および原核生物発現プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉで二重酵素切断し、ＤＮＡリガーゼを介して接続して、原核生物組換え発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を得るステップ（２）と、
原核生物組換え発現ベクターをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、組換え工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を構築するステップ（３）と、
コロニーＰＣＲにより組換え発現ベクターの形質転換が成功したことを検証するステップ（４）と、
工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６の発現においてＨｉｓタグ付き直列連結組換えポリペプチドの発現を誘導するステップ（５）と、
発現されたＨｉｓタグ付き融合タンパク質を、ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して精製し、タンパク質をロードすると、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がニッケルカラムに特異的に結合し、不純物タンパク質はニッケルカラムへの非特異的結合により流出し、イミダゾール勾配溶出を使用し、イミダゾールとＮｉ２＋の組み合わせが競合的にニッケルカラムに結合し、それによって融合タンパク質が放出され、溶出液を収集するステップ（６）と、
ＲＰ－ＨＰＬＣを純度試験に使用して、高純度の直列連結組換え抗酸化ペプチドを取得するステップ（７）と、を含むことを特徴とする宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法。
【請求項4】
前記ステップ（４）のコロニーＰＣＲで使用するプライマーは
ＸＨＰ－Ｇ６上流プライマー：５’－ＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＡＧ－３’、下流プライマー：５’－ＴＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧ－３’、
ＸＨＰ－Ｒ６上流プライマー：５’－ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧ－３’、下流プライマー：５’－ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧ－３’であり、
配列を配列番号５～８に示すことを特徴とする請求項３に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法。
ＸＨＰ－Ｇ６上流プライマー：５’－ＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＡＧ－３’、下流プライマー：５’－ＴＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧ－３’、
ＸＨＰ－Ｒ６上流プライマー：５’－ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧ－３’、下流プライマー：５’－ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧ－３’であり、
配列を配列番号５～８に示すことを特徴とする請求項３に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法。
【請求項5】
ポリペプチドの発現を誘導するための発酵条件は、イソプロピルチオガラクトピラノシドを最終濃度０．５ｍｍｏｌ／Ｌまで添加し、３７℃、２２０ｒ／分で８時間培養することであることを特徴とする請求項４に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法。
【請求項6】
請求項１又は２に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法であって、
ヒドロキシルラジカル消去法とＤＰＰＨラジカル消去法を含むことを特徴とする方法。
ヒドロキシルラジカル消去法とＤＰＰＨラジカル消去法を含むことを特徴とする方法。
【請求項7】
前記ヒドロキシルラジカル消去法は、組換えポリペプチドサンプル１ｍＬを硫酸第一鉄１ｍＬおよび過酸化水素１ｍＬと混合し、３７℃で１０分間保持した後、溶液をサリチル酸１ｍＬと混合し、対照群では、サンプル溶液の代わりに蒸留水を使用し、３０分間インキュベートした後、５１０ｎｍでの吸光度を測定することであり、
ヒドロキシルラジカル消去活性は次の式に従って計算され、
ここで、Ａｉ：サンプルの吸光度、
Ａ０：ブランク対照群の吸光度であることを特徴とする請求項６に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法。
ヒドロキシルラジカル消去活性は次の式に従って計算され、
【数1】
ここで、Ａｉ：サンプルの吸光度、
Ａ０：ブランク対照群の吸光度であることを特徴とする請求項６に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法。
【請求項8】
前記ＤＰＰＨラジカル消去法は、一定量のＤＰＰＨを秤量し、無水エタノールを用いて０．０４ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液を調製し、１ｍｇ／ｍＬの異なる濃度の組換えポリペプチド溶液２ｍＬを取り、ＤＰＰＨ溶液２ｍＬを加えて均一に混合し、室温で３０分間放置した後、５０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、上清を取り、５１７ｎｍでの吸光度を測定し、Ｖｃをポジティブコントロールとして使用することであり、サンプルによるＤＰＰＨラジカルの消去率は、次の式を使用して計算され、
Ａ０は、２ｍＬ無水エタノール＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度であり、
Ａ１は、２ｍＬサンプル液＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度であり、
Ａ２は、２ｍＬサンプル溶液＋２ｍＬ無水エタノールの吸光度であることを特徴とする請求項７に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法。
【数2】
Ａ０は、２ｍＬ無水エタノール＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度であり、
Ａ１は、２ｍＬサンプル液＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度であり、
Ａ２は、２ｍＬサンプル溶液＋２ｍＬ無水エタノールの吸光度であることを特徴とする請求項７に記載の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗酸化ペプチドの技術分野に関し、具体的には、宣威ハム由来の抗酸化ペプチド、調製法と活性測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
今日の社会では、人々の健康と長寿への関心がますます高まっており、抗酸化剤はこの分野で広く関心を集めている。酸化ストレスは、ラジカルや酸化物質の過剰な蓄積によって引き起こされる生化学的不均衡であり、脂質の酸化、タンパク質の酸化、ＤＮＡ損傷等を引き起こす可能性がある。これらの酸化プロセスは、心血管疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、がんなどの多くの病気の発症と密接に関係している。近年、研究者は生物活性ペプチドに注目し続けており、さまざまな生ハムからさまざまな生物活性ペプチドが単離・同定され、豊富なアミノ酸配列と、抗酸化作用、血圧降下作用、脂質低下作用、血糖降下作用などのさまざまな生物学的機能を有しており、潜在的な健康上の利点があると考えられている。例えば、非特許文献１は、スペイン産生ハムから抽出した分子量１７００Ｄａ以下のペプチド抽出物が、降圧作用と抗酸化作用を示すことを発見し、非特許文献２は、金華ハムから抽出・単離された天然ペプチドが、高いラジカル消去活性を持っていることを発見する。これらの活性ペプチドの分子量は４００～２０００Ｄａ、配列長は５～２０アミノ酸であり、機能性食品や病気の治療薬として利用できる。特許文献１は、分子量＜３．０ｋＤａの４２個のペプチドセグメントを含む生ハム由来の抗酸化ペプチド複合体を開示し、最も高い割合を有する３つのペプチドセグメントはそれぞれ、２３．５６％を占める生物活性ペプチド１、１３．６４％を占める生物活性ペプチド２、１２．９８％を占める生物活性ペプチド３であり、前記生物活性ペプチド１のアミノ酸配列はＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡＫ、前記生物活性ペプチド２のアミノ酸配列はＧＨＹＴＥＧＡＥＬＶＤＳＶＬＤＶＶＲ、前記生物活性ペプチド３のアミノ酸配列はＤＬＶＩＬＬＹＥＴＡＬＬＳＳＧＦＳＬＥＤＰＱＴＨＡＮＲである。
【0003】
しかしながら、ほとんどの抗酸化ペプチドと同様に、ハムから単離・抽出されたポリペプチドの収量が低く、コストが高く、単離プロセスは時間がかかるため、大規模に調製することは困難である。現在では、ほとんどの抗酸化ペプチドはまだ実験室規模の研究段階にあり、この分離および抽出方法で抗酸化ペプチドを取得しても工業生産の要件を満たすことができないことが示されている。さらに、ハムから単離された抗酸化ペプチドの配列には通常５～２０個のアミノ酸が含まれており、これらは比較的短く、大腸菌発現系のプロテアーゼやペプチダーゼによって容易に分解される。したがって、これらのペプチドを直接発現させることは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｅｓｃｕｄｅｒｏ（Ｅｓｃｕｄｅｒｏ，Ｅ．，Ａｒｉｓｔｏｙ，Ｍ．－Ｃ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ａｒｉｈａｒａ，Ｋ．，＆Ｔｏｌｄｒａ（ａはアキュートアクセント付き），Ｆ．（２０１２）．Ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｐａｎｉｓｈ ｄｒｙ－ｃｕｒｅｄ ｈａｍ．Ｍｅａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９１（３），３０６－３１１．）
【非特許文献2】Ｃｈａｏ－Ｚｈｉ（Ｚｈｕ，Ｃ．Ｚ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｇ．，Ｋａｎｇ，Ｚ．Ｌ．，Ｚｈｏｕ，Ｇ．Ｈ．，＆Ｘｕ，Ｘ．Ｌ．（２０１４）．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｊｉｎｈｕａ ｈａｍ．Ｍｅａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９６（２），７８３－７８９）
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】中国特許出願公開第１１５２６０２８８Ａ号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
オリゴペプチドは直接組換え発現過程で正常に転写・翻訳されにくく、大腸菌発現系のプロテアーゼやペプチダーゼにより分解されやすいという問題を解決し、ポリペプチドの活性を向上させるために、本発明の第一の目的は、宣威ハム由来の抗酸化ペプチドを提供することである。
【0007】
本発明の第二の目的は、宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法を提供することである。
【0008】
本発明の第三の目的は、宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法を提供することである。
【0009】
本発明は、宣威ハムペプチドを原料として使用し、直列連結により繰り返し発現させ、異なる連結方法を使用して同じペプチド配列を繰り返し連結してポリペプチド分子を形成し、その安定性、生物学的活性および収量を増加させることができる。本発明は、大腸菌において宣威ハムペプチド遺伝子の発現ベクターを構築することにより、宣威ハムペプチドの高レベル発現を実現する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記目的を達成するために、本発明は以下の技術解決手段を提供する。
【0011】
宣威ハム由来の抗酸化ペプチドであって、そのアミノ酸配列を配列番号１または配列番号２に示す。対応する遺伝子配列を配列番号３または配列番号４に示す。
【0012】
宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法であって、
宣威ハムペプチドＮＰＰＫＦＤのアミノ酸配列に従って、剛体連結ペプチド（ＥＡＡＡＫ）２または柔軟連結ペプチド（ＧＧＧＧＳ）２を使用して宣威ハムペプチドＮＰＰＫＦＤを６倍体に連結し、標的遺伝子を取得し、前記宣威ハムペプチド、剛体連結ペプチド及び柔軟連結ペプチドの配列を配列番号９～１１に示し、前記標的遺伝子の配列を配列番号３または配列番号４に示すステップ（１）と、
標的遺伝子および原核生物発現プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉで二重酵素切断し、ＤＮＡリガーゼを介して接続して、原核生物組換え発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を得るステップ（２）と、
原核生物組換え発現ベクターをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、組換え工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を構築するステップ（３）と、
コロニーＰＣＲにより組換え発現ベクターの形質転換が成功したことを検証するステップ（４）と、
工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６の発現においてＨｉｓタグ付き直列連結組換えポリペプチドの発現を誘導するステップ（５）と、
発現されたＨｉｓタグ付き融合タンパク質を、ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して精製し、タンパク質をロードすると、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がニッケルカラムに特異的に結合し、不純物タンパク質はニッケルカラムへの非特異的結合により流出し、イミダゾール勾配溶出を使用し、イミダゾールとＮｉ２＋の組み合わせが競合的にニッケルカラムに結合し、それによって融合タンパク質が放出され、溶出液を収集するステップ（６）と、
ＲＰ－ＨＰＬＣを純度試験に使用して、高純度の直列連結組換え抗酸化ペプチドを取得するステップ（７）と、
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質濃度を測定し、５９５ｎｍでの吸光度を検出し、標準曲線（ｙ＝０．６３６１ｘ＋０．４７７、Ｒ２＝０．９９２３）に従ってサンプルの総タンパク質濃度を計算するタンパク質濃度の測定ステップ（８）と、を含む。
宣威ハムペプチドＮＰＰＫＦＤのアミノ酸配列に従って、剛体連結ペプチド（ＥＡＡＡＫ）２または柔軟連結ペプチド（ＧＧＧＧＳ）２を使用して宣威ハムペプチドＮＰＰＫＦＤを６倍体に連結し、標的遺伝子を取得し、前記宣威ハムペプチド、剛体連結ペプチド及び柔軟連結ペプチドの配列を配列番号９～１１に示し、前記標的遺伝子の配列を配列番号３または配列番号４に示すステップ（１）と、
標的遺伝子および原核生物発現プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉで二重酵素切断し、ＤＮＡリガーゼを介して接続して、原核生物組換え発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を得るステップ（２）と、
原核生物組換え発現ベクターをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、組換え工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を構築するステップ（３）と、
コロニーＰＣＲにより組換え発現ベクターの形質転換が成功したことを検証するステップ（４）と、
工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６の発現においてＨｉｓタグ付き直列連結組換えポリペプチドの発現を誘導するステップ（５）と、
発現されたＨｉｓタグ付き融合タンパク質を、ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して精製し、タンパク質をロードすると、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がニッケルカラムに特異的に結合し、不純物タンパク質はニッケルカラムへの非特異的結合により流出し、イミダゾール勾配溶出を使用し、イミダゾールとＮｉ２＋の組み合わせが競合的にニッケルカラムに結合し、それによって融合タンパク質が放出され、溶出液を収集するステップ（６）と、
ＲＰ－ＨＰＬＣを純度試験に使用して、高純度の直列連結組換え抗酸化ペプチドを取得するステップ（７）と、
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質濃度を測定し、５９５ｎｍでの吸光度を検出し、標準曲線（ｙ＝０．６３６１ｘ＋０．４７７、Ｒ２＝０．９９２３）に従ってサンプルの総タンパク質濃度を計算するタンパク質濃度の測定ステップ（８）と、を含む。
【0013】
本発明で使用する剛体連結ペプチド（ＥＡＡＡＫ）２はαヘリックス構造を有しており、これにより直列連結後の抗酸化ペプチドが安定な二次構造を形成しやすくなり、同時に、活性な機能ドメインを効果的に分離することができるため、融合タンパク質は親タンパク質よりも高い活性を有する。
【0014】
本発明で使用する柔軟連結ペプチド（ＧＧＧＧＳ）２は、グリシンＧｌｙを主成分とし、分子量が小さいため、ポリペプチド骨格構造の自由度を最大限に確保され、これにより、タンパク質は本来の生物学的活性を得るのに十分な空間的折り畳みを得ることができる。
【0015】
本発明は、２つのＨｉｓタグを含むｐＥＴ－２８ａ（＋）プラスミドを使用し、Ｈｉｓタグは、その後のタンパク質の精製および位置決めを容易にする６つのヒスチジン残基を有するポリペプチド配列である。
【0016】
本発明の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法において、コロニーＰＣＲに使用するプライマーは、
ＸＨＰ－Ｇ６ 上流プライマー：５’－ＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＡＧ－３’、下流プライマー：５’－ＴＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧ－３’、
ＸＨＰ－Ｒ６ 上流プライマー：５’－ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧ－３’、下流プライマー：５’－ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧ－３’であり、配列を配列番号５～８に示す。
ＸＨＰ－Ｇ６ 上流プライマー：５’－ＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＡＧ－３’、下流プライマー：５’－ＴＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧ－３’、
ＸＨＰ－Ｒ６ 上流プライマー：５’－ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧ－３’、下流プライマー：５’－ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧ－３’であり、配列を配列番号５～８に示す。
【0017】
本発明の宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法において、ポリペプチドの発現を誘導するための発酵条件は、イソプロピルチオガラクトピラノシドを最終濃度０．５ｍｍｏｌ／Ｌまで添加し、３７℃、２２０ｒ／分で８時間培養することである。
【0018】
本発明の前記宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの活性測定方法は、ヒドロキシルラジカル消去法及びＤＰＰＨラジカル消去法を含む。ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）は、体内で酸化ストレスを引き起こし、細胞の損傷や病気を引き起こす可能性がある高活性酸素ラジカルである。したがって、抗酸化物質のヒドロキシラジカル消去能力の測定は、その抗酸化活性を間接的に評価することができる。ＤＰＰＨラジカル消去法は、サンプルの２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカルの消去能力を測定することにより、サンプルの抗酸化能力を評価する。ＤＰＰＨ溶液は紫色で、最大吸収ピークがあり、抗酸化物質と反応すると退色し、分光光度計を用いて溶液の吸収変化を測定することにより消去率を計算する。
【0019】
このうち、前記ヒドロキシルラジカル消去法は、具体的には、組換えポリペプチドサンプル１ｍＬと硫酸第一鉄１ｍＬおよび過酸化水素１ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保持した後、溶液をサリチル酸１ｍＬと混合し、対照群では、サンプル溶液の代わりに蒸留水を使用し、３０分間インキュベートした後、５１０ｎｍで吸光度を測定することであり、
ヒドロキシルラジカル消去活性は次の式に従って計算される：
ここで、Ａｉ：サンプルの吸光度、
Ａ０：ブランク対照群の吸光度である。
ヒドロキシルラジカル消去活性は次の式に従って計算される：
【数1】
ここで、Ａｉ：サンプルの吸光度、
Ａ０：ブランク対照群の吸光度である。
【0020】
ここで、前記ＤＰＰＨラジカル消去法は具体的には、一定量のＤＰＰＨを秤量し、無水エタノールを用いて０．０４ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液を調製し、１ｍｇ／ｍＬの異なる濃度の組換えポリペプチド溶液を２ｍＬ取り、ＤＰＰＨ溶液２ｍＬを加え、均一に混合し、室温で３０分間放置した後、５０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、上清を取り、５１７ｎｍでの吸光度を測定し、Ｖｃをポジティブコントロールとして使用することであり、サンプルによるＤＰＰＨラジカルの消去率は、次の式を使用して計算され、
Ａ０は、２ｍＬ無水エタノール＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度であり、
Ａ１は、２ｍＬサンプル液＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度であり、
Ａ２は、２ｍＬサンプル溶液＋２ｍＬ無水エタノールの吸光度である。
【数2】
Ａ０は、２ｍＬ無水エタノール＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度であり、
Ａ１は、２ｍＬサンプル液＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度であり、
Ａ２は、２ｍＬサンプル溶液＋２ｍＬ無水エタノールの吸光度である。
【発明の効果】
【0021】
従来技術に比べて、本発明の有益な効果は以下のとおりである：
本発明は、剛体連結ペプチド（ＥＡＡＡＫ）２と柔軟連結ペプチド（ＧＧＧＧＳ）２を使用して宣威ハム由来のヘキサペプチドを連結し、ペプチド鎖を成長させて遺伝子組換え発現に適したものにすることができ、同時に、組換えタンパク質中の標的ポリペプチドの割合が増加し、発現量が大幅に増加し、次に、剛体連結ペプチドはαヘリックス構造を持っており、これにより直列連結後の抗酸化ペプチドが安定した二次構造を形成しやすくなり、活性な機能ドメインを効果的に分離することができ、柔軟連結ペプチドは主にグリシンＧｌｙで構成されており、分子量が小さいため、ポリペプチド骨格構造の自由度が最大限に確保され、これにより、タンパク質は本来の生物学的活性を得るのに十分な空間的折り畳みを得ることができ、それによって融合タンパク質は親タンパク質よりも高い活性を得ることができる。
本発明は、剛体連結ペプチド（ＥＡＡＡＫ）２と柔軟連結ペプチド（ＧＧＧＧＳ）２を使用して宣威ハム由来のヘキサペプチドを連結し、ペプチド鎖を成長させて遺伝子組換え発現に適したものにすることができ、同時に、組換えタンパク質中の標的ポリペプチドの割合が増加し、発現量が大幅に増加し、次に、剛体連結ペプチドはαヘリックス構造を持っており、これにより直列連結後の抗酸化ペプチドが安定した二次構造を形成しやすくなり、活性な機能ドメインを効果的に分離することができ、柔軟連結ペプチドは主にグリシンＧｌｙで構成されており、分子量が小さいため、ポリペプチド骨格構造の自由度が最大限に確保され、これにより、タンパク質は本来の生物学的活性を得るのに十分な空間的折り畳みを得ることができ、それによって融合タンパク質は親タンパク質よりも高い活性を得ることができる。
【0022】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィー精製のためにｐＥＴ－２８ａ（＋）上のより小さなＨｉｓタグを利用して、分離精製されたタンパク質は高純度であり、特異性が強く、精製効率を改善し、ポリペプチド分離の困難さを軽減する。
【0023】
本発明で使用される大腸菌発現系は、発現バックグラウンドが明確で、発現レベルが高く、操作が簡単で、培養期間が短く、強力な汚染防止能力を有する。第二に、大腸菌を増殖させるための培地の原料が安価であり、抗酸化活性ペプチド物質を大量かつ大規模に生産することは容易であり、従来の酵素分解法と比較して経済的なコスト削減が可能である。
【0024】
本発明の調製法は操作が簡単であり、組換え直列連結抗酸化ペプチド融合遺伝子の原核生物発現する工学菌株を迅速に構築することができ、実施例では、直列連結後の抗酸化ペプチドのヒドロキシルラジカル消去能力が修飾前に比べて約３倍高いことが証明されており、これはその後の健康食品分野における小分子活性ペプチドの応用の基礎となる。
【0025】
本発明の研究はさらに、宣威ハムペプチドの生物学的機能および栄養価を探索するための新しいデータおよび証拠を提供し、バイオテクノロジー産業の発展および革新に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】それぞれＸＨＰ－Ｇ６（左図）とＸＨＰ－Ｒ６（右図）の制限酵素電気泳動図である。Ｍ：ＤＮＡ標準分子量、レーン１：元のプラスミド電気泳動、レーン２：ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ酵素切断した後のフラグメントの分子量。
【図2】アガロース電気泳動図である。レーンＭ：ＤＮＡ標準分子量、レーン１～２はそれぞれＸＨＰ－Ｇ６、ＸＨＰ－Ｒ６の標的遺伝子の分子量である。
【図3】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。レーンＭ：タンパク質Ｍａｒｋｅｒ。レーン１～２はそれぞれＸＨＰ－Ｇ６、ＸＨＰ－Ｒ６の組換えタンパク質である。
【図4】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。レーンＭ：タンパク質Ｍａｒｋｅｒ。レーン１～２はそれぞれＸＨＰ－Ｇ６、ＸＨＰ－Ｒ６の精製タンパク質である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
以下に本発明の実施例における添付図面を参照して本発明の実施例における技術的解決策を明確かつ完全に説明し、明らかに、説明した実施例は本発明の実施例の一部にすぎず、すべての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、創造的な努力なしに当業者によって得られる他のすべての実施例は、本発明の保護の範囲内に含まれる。
【0028】
実施例１ 組換え宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの遺伝子設計及び原核生物発現の方法
（１）宣威ハム由来の抗酸化ペプチド配列の直列連結設計
該方法は、ＮＰＰＫＦＤペプチド配列を拡張し、遺伝子組換え発現に適したＮＰＰＫＦＤ配列を含む設計を構築し、具体的な操作は、剛体連結ペプチド（ＥＡＡＡＫ）２、柔軟連結ペプチド（ＧＧＧＧＳ）２を使用して、それぞれ６倍体ＮＰＰＫＦＤを連結したことであり、したがって、設計されたペプチドセグメントの新たなアミノ酸配列は、最終的に配列番号１または配列番号２に示される。
（２）直列連結抗酸化ペプチド標的遺伝子の構築
直列連結抗酸化ペプチドのアミノ酸配列に従って、コンピューターソフトウェアＰｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０を使用して、大腸菌のコドン優先度に従って直列連結抗酸化ペプチドのアミノ酸配列に対応するｍＲＮＡ配列を設計した。剛体連結ペプチドを使用して直列連結に設計された遺伝子配列を配列番号３に示す。柔軟連結ペプチドを使用して直列連結に設計された遺伝子配列を配列番号４に示す。
大腸菌内でタンパク質をよりよく発現させるために、８６アミノ酸のタンパク質配列が最適化された。コドン使用優先度を、標的宿主の最も高い発現プロファイルに適合するように調整し、ＣＡＩ（コドン適応指数）はそれぞれ０．８７と０．９にアップグレードされた。（０．８～１．０のＣＡＩが、高い発現にとって適切な値であると考えられる）。平均ＧＣ含有量をそれぞれ５５．０７％と６４．８６％に調整し、好ましくないピークを除去した。元の配列の繰り返し領域を削除して、ｍＲＮＡのステムループ構造を回避し、合成プロセスを促進した。サブクローニング用の制限性酵素切断部位やネガティブシス作用部位などの不要なモチーフを修飾した。翻訳効率を向上させ、ｍＲＮＡの半減期を延長するために、配列全体を微調整した。最適化された遺伝子配列を、上海生工生物有限公司によって合成した。
（３）遺伝子発現ベクターの構築
活性ペプチドの両端に付加された酵素切断部位は、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉであり、図１の電気泳動図に示すように、ｐＥＴ－２８ａ（＋）をＮｄｅ ＩとＸｈｏ Ｉで二重酵素切断した後、ＤＮＡリガーゼを使用して標的遺伝子をｐＥＴ－２８ａ（＋）プラスミドにクローニングし、組換え発現プラスミドを構築し、少量の組換えプラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６および大腸菌ＢＬ２１（Ｄ Ｅ３）コンピテントセルを取り、軽くて均一に混合し、氷浴中に３０分間保持し、氷浴後、４２℃で９０秒間ヒートショックを与え、すぐに氷に入れて１～２分間冷却した。
ＬＢ液体培地９００マイクロリットルを加え、軽くて均一に混合し、３７℃で震動して１時間培養し、細菌を十分に復活させ、菌液を適量とり、ＬＢ固体培地（カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ含有）に塗布し、陽性プラスミドをスクリーニングし、３７℃で一晩逆さにして培養し、培養コロニーを確認し、ＤＮＡ配列決定により、組換えプラスミドが正しく構築されたことが確認された。
ＬＢ培地：トリプトン１０．０ｇ、酵母粉末５．０ｇ、ＮａＣｌ １０．０ｇ。固体培地を使用する場合、粉末寒天を２０．０ｇ加えた。
（４）コロニーＰＣＲ検証
滅菌した１０μＬピペットチップを使用して、一晩培養したスクリーニングプレートからモノクローナルコロニーを選択し、１０μＬの滅菌ｄｄＨ２Ｏを含むＰＣＲチューブに置き、コロニーＰＣＲにより体系を検証する。
（１）宣威ハム由来の抗酸化ペプチド配列の直列連結設計
該方法は、ＮＰＰＫＦＤペプチド配列を拡張し、遺伝子組換え発現に適したＮＰＰＫＦＤ配列を含む設計を構築し、具体的な操作は、剛体連結ペプチド（ＥＡＡＡＫ）２、柔軟連結ペプチド（ＧＧＧＧＳ）２を使用して、それぞれ６倍体ＮＰＰＫＦＤを連結したことであり、したがって、設計されたペプチドセグメントの新たなアミノ酸配列は、最終的に配列番号１または配列番号２に示される。
（２）直列連結抗酸化ペプチド標的遺伝子の構築
直列連結抗酸化ペプチドのアミノ酸配列に従って、コンピューターソフトウェアＰｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０を使用して、大腸菌のコドン優先度に従って直列連結抗酸化ペプチドのアミノ酸配列に対応するｍＲＮＡ配列を設計した。剛体連結ペプチドを使用して直列連結に設計された遺伝子配列を配列番号３に示す。柔軟連結ペプチドを使用して直列連結に設計された遺伝子配列を配列番号４に示す。
大腸菌内でタンパク質をよりよく発現させるために、８６アミノ酸のタンパク質配列が最適化された。コドン使用優先度を、標的宿主の最も高い発現プロファイルに適合するように調整し、ＣＡＩ（コドン適応指数）はそれぞれ０．８７と０．９にアップグレードされた。（０．８～１．０のＣＡＩが、高い発現にとって適切な値であると考えられる）。平均ＧＣ含有量をそれぞれ５５．０７％と６４．８６％に調整し、好ましくないピークを除去した。元の配列の繰り返し領域を削除して、ｍＲＮＡのステムループ構造を回避し、合成プロセスを促進した。サブクローニング用の制限性酵素切断部位やネガティブシス作用部位などの不要なモチーフを修飾した。翻訳効率を向上させ、ｍＲＮＡの半減期を延長するために、配列全体を微調整した。最適化された遺伝子配列を、上海生工生物有限公司によって合成した。
（３）遺伝子発現ベクターの構築
活性ペプチドの両端に付加された酵素切断部位は、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉであり、図１の電気泳動図に示すように、ｐＥＴ－２８ａ（＋）をＮｄｅ ＩとＸｈｏ Ｉで二重酵素切断した後、ＤＮＡリガーゼを使用して標的遺伝子をｐＥＴ－２８ａ（＋）プラスミドにクローニングし、組換え発現プラスミドを構築し、少量の組換えプラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６および大腸菌ＢＬ２１（Ｄ Ｅ３）コンピテントセルを取り、軽くて均一に混合し、氷浴中に３０分間保持し、氷浴後、４２℃で９０秒間ヒートショックを与え、すぐに氷に入れて１～２分間冷却した。
ＬＢ液体培地９００マイクロリットルを加え、軽くて均一に混合し、３７℃で震動して１時間培養し、細菌を十分に復活させ、菌液を適量とり、ＬＢ固体培地（カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ含有）に塗布し、陽性プラスミドをスクリーニングし、３７℃で一晩逆さにして培養し、培養コロニーを確認し、ＤＮＡ配列決定により、組換えプラスミドが正しく構築されたことが確認された。
ＬＢ培地：トリプトン１０．０ｇ、酵母粉末５．０ｇ、ＮａＣｌ １０．０ｇ。固体培地を使用する場合、粉末寒天を２０．０ｇ加えた。
（４）コロニーＰＣＲ検証
滅菌した１０μＬピペットチップを使用して、一晩培養したスクリーニングプレートからモノクローナルコロニーを選択し、１０μＬの滅菌ｄｄＨ２Ｏを含むＰＣＲチューブに置き、コロニーＰＣＲにより体系を検証する。
【0029】
ＰＣＲ増幅プログラムは、９４℃で４分間の初期変性、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４０秒間の合計３５回の増幅サイクル、７２℃で１０分間の伸長であった。ＰＣＲ反応終了後、核酸電気泳動を行った。ＸＨＰ－Ｇ６の上流プライマーは５’－ＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＡＧ－３’、下流プライマーは５’－ＴＣＴＴＴＣＧＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧ－３’、ＸＨＰ－Ｒ６の上流プライマーは５’－ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＧＡＡＡＴＴＣＧ－３’、下流プライマーは５’－ＣＴＣＧＡＧ ＡＴＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧ－３’であった。配列番号５～８に示す。電気泳動図を図２に示す。
【0030】
【表1】
【0031】
（５）大腸菌の組換え菌株の誘導発現
ＰＣＲによって検証された選択された組換え菌株を、耐性を含むＬＢ培地３ｍｌに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで１２時間培養した菌種液を、１００ｍｌのＬＢ液体培地に１％の割合で接種し、培養を拡大し、同時にカナマイシンを使用濃度１００μｇ／ｍｌまで添加した。菌液のＯＤ６００ｎｍが０．６の場合、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）の最終濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌとなり、３７℃、２２０ｒ／ｍｉｎで８時間培養した。誘導が完了した菌液を５０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、上清を捨て、細菌沈殿を収集し、菌体をリン酸塩緩衝液に再懸濁し、均一に混合した後、氷水浴中で超音波破砕を行い、超音波破砕条件は、２５０Ｗ、超音波３秒、インターバル５秒、１５分間であった。このとき、全菌体タンパク質であり、菌液は澄んで透明であった。超音波破砕された菌液を１２０００ｒ／ｍｉｎで１５分間遠心分離し、上清は上清タンパク質であり、上清と沈殿を分離し、得られた全菌液、上清、沈殿サンプルをそれぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、融合タンパク質の発現を測定した。
ＰＣＲによって検証された選択された組換え菌株を、耐性を含むＬＢ培地３ｍｌに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで１２時間培養した菌種液を、１００ｍｌのＬＢ液体培地に１％の割合で接種し、培養を拡大し、同時にカナマイシンを使用濃度１００μｇ／ｍｌまで添加した。菌液のＯＤ６００ｎｍが０．６の場合、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）の最終濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌとなり、３７℃、２２０ｒ／ｍｉｎで８時間培養した。誘導が完了した菌液を５０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、上清を捨て、細菌沈殿を収集し、菌体をリン酸塩緩衝液に再懸濁し、均一に混合した後、氷水浴中で超音波破砕を行い、超音波破砕条件は、２５０Ｗ、超音波３秒、インターバル５秒、１５分間であった。このとき、全菌体タンパク質であり、菌液は澄んで透明であった。超音波破砕された菌液を１２０００ｒ／ｍｉｎで１５分間遠心分離し、上清は上清タンパク質であり、上清と沈殿を分離し、得られた全菌液、上清、沈殿サンプルをそれぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、融合タンパク質の発現を測定した。
【0032】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析：平坦／凹面ガラス板を取り出して洗浄し、乾燥させ、ガラス板をホルダーでグルーメーカーに固定した。分離ゲルを調製し、各成分を加えた後、ピペットを使用して吹き付けて均一に混合し、ガラス板の隙間に沿って壁に貼り付け、蒸留水を使用してゴムの表面を密封し、平らにし、液面に明確な分割線が現れるまで室温に放置し、蒸留水を捨て、分離ゲルの調製が完了した。上層の濃縮ゲルを調製し、各成分を加えて均一に混合した後、隙間に沿って上層ゲルを加え、櫛を差し込み、上層ゲルが固まるまで室温で放置した。重合後、２枚の短いゲル板を内側に向けて溝に取り付け、内溝固定金具を組み立てた。固定装置全体を電気泳動槽に入れ、電気泳動緩衝液（電気泳動緩衝液配合：Ｔｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ８．３）、グリシン（１９０ｍＭ）、ＳＤＳ（０．１％））を加え、櫛を引き出し、５μｌの標準タンパク質とサンプルをゲルレーンに加え、余分なサンプリングホールがある場合、ローディング緩衝液を追加し、電源を入れ、開始電圧は８０Ｖ、約３０分間であり、濃縮ゲルに入った後、電圧を１２０Ｖに変更し、ブロモフェノールブルーの先端が電気泳動溝の底に到達したら、電源を切った（約２～３時間）。
【0033】
サンプルの処理：大腸菌破砕液と遠心分離後の上清を取り、ローディング緩衝液と混合し、４０μｌのＰＢＳ緩衝液と１０μｌの５ｘＳＤＳローディング緩衝液を沈殿に加え、遠心分離後の上清４０μｌを５ｘＳＤＳローディング緩衝液１０μｌと混合し、沸騰水浴中で５分間煮沸し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を取り、タンパク質電気泳動用のサンプルを５μｌ取った。電気泳動が終了したら、ガラス板を取り出し、慎重にガラス板をこじ開け、濃縮ゲルを切り捨て、ゲル作成ボードからゲルを剥がし、脱イオン水の中に入れ、ゲルを水洗いし、プロテインゲルを染色ボックスに入れ、クマシーブリリアントブルー Ｒ－２５０で２時間染色した。染色後、ゲルを脱色液に入れ、背景版の青色が消えるまで拡散脱色し、バンドを見た後、ゲルイメージングを使用して写真を撮り、記録した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を図３に示す。
【0034】
実施例２ 組換え直列連結抗酸化ペプチドの精製
５ｍＬのＮｉ－ＩＤＡプレパックカラムを取り出し、重力によって保存緩衝液を流出させた。カラムをカラム容量の２倍のＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ ８．０）で平衡化し、流速０．５～１ｍＬ／ｍｉｎを使用してＢｕｆｆｅｒから樹脂をゆっくりと排出した。上清を０．４５μｍの微多孔性フィルター膜に通し、カラムに加え、通過液を遠心管に収集し、次に、カラム容量の２倍のＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒでカラムを洗浄し、通過液を収集し、最後に、カラム容量の２倍のＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ ８．０）を使用して、カラム上のヒスチジンタグ付きタンパク質を溶出し、２８０ｎｍでの溶出液の吸光度がベースラインに近づくまで、各溶出液を別々に保管した。収集した溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＲＰ－ＨＰＬＣに供して純度を分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を図４に示し、ＲＰ－ＨＰＬＣ図を図５（ａ）及び図５（ｂ）に示す。
５ｍＬのＮｉ－ＩＤＡプレパックカラムを取り出し、重力によって保存緩衝液を流出させた。カラムをカラム容量の２倍のＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ ８．０）で平衡化し、流速０．５～１ｍＬ／ｍｉｎを使用してＢｕｆｆｅｒから樹脂をゆっくりと排出した。上清を０．４５μｍの微多孔性フィルター膜に通し、カラムに加え、通過液を遠心管に収集し、次に、カラム容量の２倍のＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒでカラムを洗浄し、通過液を収集し、最後に、カラム容量の２倍のＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ ８．０）を使用して、カラム上のヒスチジンタグ付きタンパク質を溶出し、２８０ｎｍでの溶出液の吸光度がベースラインに近づくまで、各溶出液を別々に保管した。収集した溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＲＰ－ＨＰＬＣに供して純度を分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を図４に示し、ＲＰ－ＨＰＬＣ図を図５（ａ）及び図５（ｂ）に示す。
【0035】
ＲＰ－ＨＰＬＣ条件：Ａｃｑｕｉｔｙ（ワッツ株式会社）を使用した。ＨＰＬＣシステムには、逆相ＢＥＨ Ｃ１８分析カラム（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ、ワッツ株式会社）が装備された。
移動相：Ａ相は超純水（０．１％トリフルオロ酢酸）、Ｂ相はアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）、流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、注入量：８μＬ、カラム温度：３０℃、ＵＶ検出波長：２２０ｎｍ。
タンパク質濃度の測定：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質濃度を測定し、５９５ｎｍでの吸光度を検出し、標準曲線（ｙ＝０．６３６１ｘ＋０．４７７、Ｒ２＝０．９９２３）に従ってサンプルの総タンパク質濃度を計算し、変換後の総タンパク質濃度は１１．９５ｍｇ／Ｌになった。
移動相：Ａ相は超純水（０．１％トリフルオロ酢酸）、Ｂ相はアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）、流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、注入量：８μＬ、カラム温度：３０℃、ＵＶ検出波長：２２０ｎｍ。
タンパク質濃度の測定：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質濃度を測定し、５９５ｎｍでの吸光度を検出し、標準曲線（ｙ＝０．６３６１ｘ＋０．４７７、Ｒ２＝０．９９２３）に従ってサンプルの総タンパク質濃度を計算し、変換後の総タンパク質濃度は１１．９５ｍｇ／Ｌになった。
【0036】
実施例３ 宣威ハム由来の直列連結抗酸化ペプチドの活性検証
（１）ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定
一定量のＤＰＰＨを秤量し、無水エタノールを用いて０．０４ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液を調製した。１ｍｇ／ｍＬの異なる濃度の組換えポリペプチド溶液２ｍＬを取り、ＤＰＰＨ溶液２ｍＬを加えて均一に混合し、室温で３０分間放置した後、５０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離した。上清を取り、５１７ｎｍでの吸光度を測定した。Ｖｃをポジティブコントロールとして使用した。
サンプルによるＤＰＰＨラジカルの消去率は、次の式を使用して計算された。
Ａ０ －２ｍＬ無水エタノール＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度
Ａ１ －２ｍＬサンプル液＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度
Ａ２ －２ｍＬサンプル溶液＋２ｍＬ無水エタノールの吸光度。
（２）ヒドロキシルラジカル消去活性の測定
組換えポリペプチドサンプル１ｍＬを硫酸第一鉄（９ｍｍｏｌ／Ｌ）１ｍＬおよび過酸化水素１ｍＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）と混合した。３７℃で１０分間保持した後、溶液を１ｍＬのサリチル酸（９ｍｍｏｌ／Ｌ）と混合した。対照群では、サンプル溶液の代わりに蒸留水を使用した。３０分間インキュベートした後、５１０ｎｍで吸光度を測定した。
ヒドロキシルラジカル消去活性は次の式に従って計算された。
ここで、Ａｉ：サンプルの吸光度、
Ａ０：ブランク対照群の吸光度である。
（１）ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定
一定量のＤＰＰＨを秤量し、無水エタノールを用いて０．０４ｍｇ／ｍＬのＤＰＰＨ溶液を調製した。１ｍｇ／ｍＬの異なる濃度の組換えポリペプチド溶液２ｍＬを取り、ＤＰＰＨ溶液２ｍＬを加えて均一に混合し、室温で３０分間放置した後、５０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離した。上清を取り、５１７ｎｍでの吸光度を測定した。Ｖｃをポジティブコントロールとして使用した。
サンプルによるＤＰＰＨラジカルの消去率は、次の式を使用して計算された。
【数3】
Ａ０ －２ｍＬ無水エタノール＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度
Ａ１ －２ｍＬサンプル液＋２ｍＬ ＤＰＰＨ溶液の吸光度
Ａ２ －２ｍＬサンプル溶液＋２ｍＬ無水エタノールの吸光度。
（２）ヒドロキシルラジカル消去活性の測定
組換えポリペプチドサンプル１ｍＬを硫酸第一鉄（９ｍｍｏｌ／Ｌ）１ｍＬおよび過酸化水素１ｍＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）と混合した。３７℃で１０分間保持した後、溶液を１ｍＬのサリチル酸（９ｍｍｏｌ／Ｌ）と混合した。対照群では、サンプル溶液の代わりに蒸留水を使用した。３０分間インキュベートした後、５１０ｎｍで吸光度を測定した。
ヒドロキシルラジカル消去活性は次の式に従って計算された。
【数4】
ここで、Ａｉ：サンプルの吸光度、
Ａ０：ブランク対照群の吸光度である。
【0037】
結果は、本発明の剛体連結ペプチドを使用して直列連結に調製された抗酸化ペプチドのヒドロキシルラジカルおよびＤＰＰＨラジカル消去能力がそれぞれ７９．４６％および５７．２５％であり、本発明の柔軟連結ペプチドを使用して直列連結に調製された抗酸化ペプチドのヒドロキシルラジカルおよびＤＰＰＨラジカル消去能力がそれぞれ８７．４２％および６８．０５％であることを示し、本発明で調製されたポリペプチドの抗酸化能力は、宣威ハムから単離抽出されたポリペプチドの抗酸化能力よりも約３倍高い。
【0038】
本発明の実施例を図示し説明してきたが、当業者であれば、本発明の原理および精神から逸脱することなく、これらの実施例に対してさまざまな変更、修正、置換および変形を行うことができることが理解され、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその等価物によって限定される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0002】
今日の社会では、人々の健康と長寿への関心がますます高まっており、抗酸化剤はこの分野で広く関心を集めている。酸化ストレスは、ラジカルや酸化物質の過剰な蓄積によって引き起こされる生化学的不均衡であり、脂質の酸化、タンパク質の酸化、ＤＮＡ損傷等を引き起こす可能性がある。これらの酸化プロセスは、心血管疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、がんなどの多くの病気の発症と密接に関係している。近年、研究者は生物活性ペプチドに注目し続けており、さまざまな生ハムからさまざまな生物活性ペプチドが単離・同定され、豊富なアミノ酸配列と、抗酸化作用、血圧降下作用、脂質低下作用、血糖降下作用などのさまざまな生物学的機能を有しており、潜在的な健康上の利点があると考えられている。例えば、非特許文献１は、スペイン産生ハムから抽出した分子量１７００Ｄａ以下のペプチド抽出物が、降圧作用と抗酸化作用を示すことを発見し、非特許文献２は、金華ハムから抽出・単離された天然ペプチドが、高いラジカル消去活性を持っていることを発見する。これらの活性ペプチドの分子量は４００～２０００Ｄａ、配列長は５～２０アミノ酸であり、機能性食品や病気の治療薬として利用できる。特許文献１は、分子量＜３．０ｋＤａの４２個のペプチドセグメントを含む生ハム由来の抗酸化ペプチド複合体を開示し、最も高い割合を有する３つのペプチドセグメントはそれぞれ、２３．５６％を占める生物活性ペプチド１、１３．６４％を占める生物活性ペプチド２、１２．９８％を占める生物活性ペプチド３であり、前記生物活性ペプチド１のアミノ酸配列はＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、前記生物活性ペプチド２のアミノ酸配列はＧＨＹＴＥＧＡＥＬＶＤＳＶＬＤＶＶＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、前記生物活性ペプチド３のアミノ酸配列はＤＬＶＩＬＬＹＥＴＡＬＬＳＳＧＦＳＬＥＤＰＱＴＨＡＮＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）である。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0012】
宣威ハム由来の抗酸化ペプチドの調製法であって、
宣威ハムペプチドＮＰＰＫＦＤのアミノ酸配列に従って、剛体連結ペプチド（ＥＡＡＡＫ）２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）または柔軟連結ペプチド（ＧＧＧＧＳ）２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を使用して宣威ハムペプチドＮＰＰＫＦＤを６倍体に連結し、標的遺伝子を取得し、前記宣威ハムペプチド、剛体連結ペプチド及び柔軟連結ペプチドの配列を配列番号９～１１に示し、前記標的遺伝子の配列を配列番号３または配列番号４に示すステップ（１）と、
標的遺伝子および原核生物発現プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉで二重酵素切断し、ＤＮＡリガーゼを介して接続して、原核生物組換え発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を得るステップ（２）と、
原核生物組換え発現ベクターをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、組換え工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を構築するステップ（３）と、
コロニーＰＣＲにより組換え発現ベクターの形質転換が成功したことを検証するステップ（４）と、
工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６の発現においてＨｉｓタグ付き直列連結組換えポリペプチドの発現を誘導するステップ（５）と、
発現されたＨｉｓタグ付き融合タンパク質を、ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して精製し、タンパク質をロードすると、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がニッケルカラムに特異的に結合し、不純物タンパク質はニッケルカラムへの非特異的結合により流出し、イミダゾール勾配溶出を使用し、イミダゾールとＮｉ２＋の組み合わせが競合的にニッケルカラムに結合し、それによって融合タンパク質が放出され、溶出液を収集するステップ（６）と、
ＲＰ－ＨＰＬＣを純度試験に使用して、高純度の直列連結組換え抗酸化ペプチドを取得するステップ（７）と、
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質濃度を測定し、５９５ｎｍでの吸光度を検出し、標準曲線（ｙ＝０．６３６１ｘ＋０．４７７、Ｒ２＝０．９９２３）に従ってサンプルの総タンパク質濃度を計算するタンパク質濃度の測定ステップ（８）と、を含む。
宣威ハムペプチドＮＰＰＫＦＤのアミノ酸配列に従って、剛体連結ペプチド（ＥＡＡＡＫ）２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）または柔軟連結ペプチド（ＧＧＧＧＳ）２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を使用して宣威ハムペプチドＮＰＰＫＦＤを６倍体に連結し、標的遺伝子を取得し、前記宣威ハムペプチド、剛体連結ペプチド及び柔軟連結ペプチドの配列を配列番号９～１１に示し、前記標的遺伝子の配列を配列番号３または配列番号４に示すステップ（１）と、
標的遺伝子および原核生物発現プラスミドｐＥＴ－２８ａ（＋）を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉで二重酵素切断し、ＤＮＡリガーゼを介して接続して、原核生物組換え発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を得るステップ（２）と、
原核生物組換え発現ベクターをヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、組換え工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６を構築するステップ（３）と、
コロニーＰＣＲにより組換え発現ベクターの形質転換が成功したことを検証するステップ（４）と、
工学菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｇ６、ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＥＴ－２８ａ（＋）－Ｒ６の発現においてＨｉｓタグ付き直列連結組換えポリペプチドの発現を誘導するステップ（５）と、
発現されたＨｉｓタグ付き融合タンパク質を、ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して精製し、タンパク質をロードすると、Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質がニッケルカラムに特異的に結合し、不純物タンパク質はニッケルカラムへの非特異的結合により流出し、イミダゾール勾配溶出を使用し、イミダゾールとＮｉ２＋の組み合わせが競合的にニッケルカラムに結合し、それによって融合タンパク質が放出され、溶出液を収集するステップ（６）と、
ＲＰ－ＨＰＬＣを純度試験に使用して、高純度の直列連結組換え抗酸化ペプチドを取得するステップ（７）と、
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用してタンパク質濃度を測定し、５９５ｎｍでの吸光度を検出し、標準曲線（ｙ＝０．６３６１ｘ＋０．４７７、Ｒ２＝０．９９２３）に従ってサンプルの総タンパク質濃度を計算するタンパク質濃度の測定ステップ（８）と、を含む。
【外国語明細書】