特開 2025-140485 細胞配置の制御方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025140485

(43)【公開日】2025-09-29

(54)【発明の名称】細胞配置の制御方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20250919BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20250919BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20250919BHJP

【ＦＩ】

C12N1/00 B

C12M1/00 A

C12N5/071

【審査請求】未請求

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024039916

(22)【出願日】2024-03-14

(71)【出願人】

【識別番号】000102692

【氏名又は名称】ＮＴＮ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】近江 ▲祥▼平

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA21

4B029BB11

4B029CC05

4B029GA03

4B029GB09

4B065AA90X

4B065BC46

4B065BD07

(57)【要約】

【課題】３個以上の液滴の連結されたスフェロイドの形成時に、液滴の位置精度を高め、細胞同士の自己凝集性が高められる細胞配置の制御方法を提供する。
【解決手段】培養すべき細胞を供給するための基板が準備される。第１溶媒を含む第１塗布液Ａを少なくとも１回基板上に塗布する第１塗布液塗布工程がなされる。第１塗布液Ａを覆うように、第２塗布液Ｂが滴下される。第１塗布液塗布工程における第１塗布液Ａの塗布のうち、少なくとも１回の塗布に細胞が含まれる。基板は細胞低接着基板である。
【選択図】図１６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

培養すべき細胞を供給するための基板を準備する工程と、
第１溶媒を含む第１塗布液を少なくとも１回前記基板上に塗布する、第１塗布液塗布工程と、
前記第１塗布液を覆うように、増粘剤および第２溶媒を含む第２塗布液を滴下する第２塗布液滴下工程とを備え、
前記第１塗布液塗布工程における前記第１塗布液の塗布のうち、少なくとも１回の塗布に前記細胞が含まれ、
前記基板は細胞低接着基板である、細胞配置の制御方法。

【請求項2】

前記基板の表面にＭＰＣポリマーおよびＰ－ＨＥＭＡのいずれかがコーティングされることにより、前記細胞低接着基板が形成される、請求項１に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項3】

前記基板の表面に放射線を照射することにより、前記表面の水に対する接触角を制御する工程をさらに備える、請求項１に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項4】

前記細胞低接着基板の表面には凹部が複数形成されており、
前記複数の凹部の、前記表面からもっとも離れた底面は前記表面に沿うように拡がる平面である、請求項１または２に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項5】

前記細胞低接着基板の表面には凹部が複数形成されており、
前記複数の凹部の、前記表面からもっとも離れた底面は曲面状である、請求項１または２に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項6】

前記細胞低接着基板の表面には凹部が複数形成されており、
前記複数の凹部の、前記表面からもっとも離れた底面は前記表面に垂直な方向に対して傾斜する壁面であり、前記壁面のうち前記表面からもっとも離れた部分は尖った形状を有する、請求項１または２に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項7】

前記細胞低接着基板の表面には凹部が複数形成されており、
前記凹部の平面視における最大寸法は１ｍｍ未満である、請求項１または２に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項8】

前記基板上に塗布する工程においては、前記第１塗布液が３回以上前記基板上に塗布され前記基板上に並べられる、請求項１または２に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項9】

前記基板上に塗布する工程において、前記第１塗布液はＮ個（Ｎは２以上の自然数）塗布され、
前記基板上に塗布する工程では、前記Ｎ個の前記第１塗布液のうち任意に選択された２個の前記第１塗布液のそれぞれの寸法をｒ_１ｎ、ｒ_{１（ｎ＋１）}（ｎは１≦ｎ≦Ｎ－１の自然数）とし、前記２個の前記第１塗布液のそれぞれの図心間の距離をｄ_{ｎ，ｎ＋１}とすれば、
（数１）ｄ_{ｎ，ｎ＋１}≦ｒ_{１（ｎ＋１）}－ｒ_１ｎ・・・（１）
および
（数２）ｒ_{１（ｎ＋１）}－ｒ_１ｎ＜ｄ_{ｎ，ｎ＋１}＜ｒ_１ｎ＋ｒ_{１（ｎ＋１）}・・・（２）
のいずれかが成立する位置に前記第１塗布液が塗布される、請求項１または２に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項10】

前記第１塗布液がＮ個塗布される場合において、Ｎ個のそれぞれの前記第１塗布液の構成成分が互いに同一である、請求項９に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項11】

前記第１塗布液がＮ個塗布される場合において、Ｎ個のそれぞれの前記第１塗布液の構成成分が互いに異なる、請求項９に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項12】

前記第１塗布液がＮ個塗布される場合において、Ｎ個のうち少なくとも２個の前記第１塗布液に含まれる前記細胞の種類は互いに異なる、請求項９に記載の細胞配置の制御方法。

【請求項13】

前記基板上に塗布する工程には、塗布針方式バイオプリンター、ディスペンサー、インクジェット、ピペットからなる群から選択されるいずれかが用いられる、請求項１または２に記載の細胞配置の制御方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞配置の制御方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、オルガノイドの研究において、細胞組織内の細胞・タンパク・添加因子の配置を制御することが重要であると報告されている。この方法としては、第１に、２種類の細胞組織を近接させ１つの細胞組織にする方法がある。またこの方法としては、第２に、１つの細胞組織の一方向から化学的刺激、物理的刺激および電気的刺激を与え、細胞組織内で分化させる方法がある。

【0003】

以下の非特許文献１では、前腸と後腸とのオルガノイドが作製され、その後、前腸と中腸とのオルガノイドが近接されることで、１つの細胞組織とされた。さらに培養することで、前腸および中腸の境界から肝臓域、胆のう域および膵臓域が発生することが、非特許文献１に併せて報告されている。

【0004】

特許第７１４２８４０号公報（特許文献１）では、気相中、撥水処理された基板が準備される。基板上には、第一のハイドロゲル液滴と第二のハイドロゲル液滴とが連結された状態でゲル化される。これにより細胞含有ハイドロゲル体が形成される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第７１４２８４０号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Hiroyuki Koike et al., "Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary", Nature 574, p.112-116 (2019)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

非特許文献１においては、細胞組織を含む２個のハイドロゲルを近接させる技術が開示される。しかし非特許文献１では、３個以上のハイドロゲルを近接させることは困難と推察される。

【0008】

一方、特許文献１によれば３個以上のハイドロゲル液滴を連結させ３個以上のハイドロゲルが連結した細胞組織（スフェロイド）を構築可能と考えられる。しかし特許文献１では液滴の位置、および液滴の供給される順番などの配置制御について考慮されていない。特許文献１では液滴が供給される基板についての考慮がない。このため特許文献１では３個以上の液滴の連結された細胞組織（スフェロイド）を形成する際に、各液滴の位置精度を向上させ、細胞同士の凝集性を高めることが難しい可能性がある。したがって特許文献１では各液滴の位置精度および細胞同士の凝集性の観点から改善の余地がある。

【0009】

本発明は以上の課題に鑑みなされたものである。本発明の目的は、３個以上の液滴の連結されたスフェロイドの形成時に、液滴の位置精度を高め、細胞同士の自己凝集性が高められる細胞配置の制御方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本開示に従った細胞配置の制御方法は、培養すべき細胞を供給するための基板が準備される。第１溶媒を含む第１塗布液を少なくとも１回基板上に塗布する、第１塗布液塗布工程がなされる。第１塗布液を覆うように、増粘剤および第２溶媒を含む第２塗布液を滴下する第２塗布液滴下工程がなされる。第１塗布液塗布工程における第１塗布液の塗布のうち、少なくとも１回の塗布に上記細胞が含まれる。基板は細胞低接着基板である。

【発明の効果】

【0011】

上記の制御方法では、第１塗布液およびこれを覆う第２塗布液の供給工程を有し、かつ基板が細胞低接着基板である。これにより、３個以上の液滴の連結されたスフェロイドの形成時に、液滴の位置精度を高め、細胞同士の自己凝集性が高められる細胞配置の制御方法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】実施の形態に係る塗布装置の一例を示す概略正面図である。

【図2】図１に示した塗布装置の針塗布機構を示す模式図である。

【図3】細胞低接着基板としてのプレートの概略斜視図である。

【図4】プレートに形成されるウェルの形状の第１例を示す概略断面図である。

【図5】プレートに形成されるウェルの形状の第２例を示す概略断面図である。

【図6】プレートに形成されるウェルの形状の第３例を示す概略断面図である。

【図7】ディッシュの概略図である。

【図8】ディッシュの底面の概略断面図である。

【図9】２個の第１塗布液の配置関係を示す概略図である。

【図10】第１塗布液と第２塗布液との位置関係の一例を示す概略図である。

【図11】実施の形態における第１塗布液が塗布される前の態様を示す概略図である。

【図12】実施の形態における第１塗布液の組成を示す概略図である。

【図13】実施の形態における第１塗布液が塗布される工程を示す概略図である。

【図14】実施の形態における第１塗布液が塗布された後の態様を示す概略図である。

【図15】実施の形態における第２塗布液が供給される工程を示す概略図である。

【図16】図１５の工程がなされた後のウェル内の態様を示す概略図である。

【図17】実施の形態における培地が供給される工程を示す概略図である。

【図18】培養前の第１塗布液内の細胞の態様を示す概略図である。

【図19】培養後の第１塗布液内の細胞の態様を示す概略図である。

【図20】実施例１における塗布液の塗布直後と、培養後との位相差顕微鏡像である。

【図21】実施例２における第１塗布液Ａ１および第１塗布液Ａ２の塗布態様を示す概略図である。

【図22】実施例２における塗布液の塗布直後と、培養後との位相差顕微鏡像および蛍光顕微鏡像である。

【図23】実施例３における第１塗布液Ａ１および第１塗布液Ａ２の塗布態様を示す概略図である。

【図24】実施例３における塗布液の塗布直後と、培養後との位相差顕微鏡像および蛍光顕微鏡像である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

（はじめに）
はじめに、本実施の形態に係る細胞配置の制御方法について簡単に説明する。図１６に示されるように、本実施の形態に係る細胞配置の制御方法では、まず培養すべき細胞を供給するための基板（プレート８：図３参照）が準備される。第１溶媒を含む第１塗布液Ａを少なくとも１回基板上に塗布する、第１塗布液塗布工程がなされる。第１塗布液Ａを覆うように、増粘剤および第２溶媒を含む第２塗布液Ｂを滴下する第２塗布液滴下工程がなされる。第１塗布液塗布工程における第１塗布液Ａの塗布のうち、少なくとも１回の塗布に上記細胞が含まれる。上記基板は細胞低接着基板である。つまり基板は、たとえば塗布液に含まれる細胞が接着しにくい性質を有する。より詳しくは、細胞低接着基板とは、表面に付着する水（純水）の接触角が６０°以上７０°以下を除く角度である基板を意味する。つまり細胞低接着基板は、表面に付着する水（純水）の接触角が０°越え６０°未満、または７０°超え１８０°未満である。

【0014】

なお本明細書にて「細胞組織」は、塗布装置１００から１回の第１塗布液の塗布により放出された、細胞を含む塗布液（バイオインク）の１単位（１個分）を意味するものとする（細胞の凝集は考慮しない）。本明細書にて「スフェロイド」は、細胞組織中の複数、たとえば１０００個以上の細胞同士が凝集して３次元培養により球状またはそれに近い形状の一つの塊となるよう組織化されたものとなったものを意味する。つまり本実施の形態では、たとえば３個以上の細胞組織が互いに連結し、細胞組織に含まれる細胞同士が凝集することによりスフェロイドが形成される。

【0015】

（実施の形態）
（装置構成）
図１は、実施の形態に係る塗布装置の一例を示す概略正面図である。なお説明の便宜上、Ｘ方向、Ｙ方向およびＺ方向が導入される。図１に示されるように、塗布装置１００は、塗布されるべき塗布材料を供給可能な塗布機構１０７として、針塗布機構１０４と、滴下機構１０５とを備えている。本明細書では「塗布」とは、後述する塗布針を用いた塗布材料（塗布液）の供給と、塗布材料の滴下による供給との双方を含める場合がある。このため前者の塗布針を用いた塗布液の供給を、特に図１の説明箇所において「針塗布」と称する場合がある。図１の塗布装置１００は、２つの針塗布機構１０４と、２つの滴下機構１０５とを備えている。２つの針塗布機構１０４は、針塗布機構１０４－１と、針塗布機構１０４－２とであり、Ｘ方向に間隔をあけて並んでいる。２つの滴下機構１０５（ディスペンサー）は、滴下機構１０５－１と、滴下機構１０５－２とであり、Ｘ方向に間隔をあけて並んでいる。また針塗布機構１０４と滴下機構１０５とは、Ｘ方向に間隔をあけて並んでいる。

【0016】

Ｘ軸ステージ１０１は、水平方向であるＸ方向に沿って移動可能である。またＹ軸ステージ１０２は、水平方向であるＹ方向に沿って移動可能である。具体的には、たとえばＸ軸ステージ１０１またはＹ軸ステージ１０２の下面にガイド部が設置されている。当該ガイド部は、図示されないガイドレールに摺動可能に接続されている。たとえばＸ軸ステージ１０１の上側の表面は、プレート８を載置可能な搭載面となっている。図１ではＹ軸ステージ１０２の上にＸ軸ステージ１０１が配置され、Ｘ軸ステージ１０１の上にプレート８が載置される。しかし逆に、Ｙ軸ステージ１０２の上にＸ軸ステージ１０１が配置され、Ｘ軸ステージ１０１の上にプレート８が載置されてもよい。

【0017】

針塗布機構１０４、滴下機構１０５および観察光学系１０６は、Ｚ方向に移動可能な部材であるたとえばＺ軸テーブルに接続されている。つまり針塗布機構１０４、滴下機構１０５および観察光学系１０６は、塗布装置１００内において、Ｚ方向に移動可能に保持されている。観察光学系１０６はプレート８上の塗布材料を塗布すべき位置などを観察し測定する。観察光学系１０６には、観察した画像を電気信号に変換するＣＣＤカメラが設置されていてもよい。観察光学系１０６によるプレート８などの観察は、可視光によりなされてもよい。しかしプレート８などの観察は、可視光に限らず、赤外線、Ｘ線、超音波などによりなされてもよく、プレート８の材質によっては磁気を用いてプレート８の観察が可能である。可視光以外の手段により観察されるプレート８は、透明または半透明である必要はなく、不透明であってもよい。

【0018】

図２は、図１に示した塗布装置の針塗布機構を示す模式図である。図２に示されるように、本実施の形態の針塗布機構１０４は、サーボモータ４１、カム４３、当該カム４３のカム面に接触した状態で保持されている軸受４４、カム連結板４５、可動部４６、塗布針ホルダ２０を保持する可動ベース３５、および塗布材料容器２１を主に含む。図２に示す針塗布機構１０４の構成は、図１の針塗布機構１０４－１および針塗布機構１０４－２の双方に共通の構成である。塗布針ホルダ２０は可動ベース３５と着脱可能になっている。言い換えれば、ベース体としての可動ベース３５は、塗布針ホルダ２０を着脱可能に保持する。

【0019】

針塗布機構１０４において、サーボモータ４１は、図１に示したＺ軸方向に沿った方向に中心軸が延びるように設置されている。サーボモータ４１の回転軸にはカム４３が接続されている。カム４３は、サーボモータ４１の中心軸を中心として回転可能になっている。カム４３は、サーボモータ４１の回転軸に接続された中心部と、当該中心部の一方端部に接続されたフランジ部とを含む。フランジ部の上部表面（サーボモータ４１側の表面）はカム面となっている。このカム面は、中心部の外周に沿って円環状に形成されているとともに、フランジ部の底面からの距離が変動するようにスロープ状に形成されている。具体的には、カム面は底面からの距離が最も遠くなっている（厚みの厚い）上端フラット領域と、この上端フラット領域から間隔を隔てて配置された下端フラット領域と、この上端フラット領域と下端フラット領域との間を滑らかに接続するスロープ部とを含む。下端フラット領域は、底面からの距離が最も近くなっている（厚みの薄い）領域である。

【0020】

このカム４３のカム面に接するように軸受４４が配置されている。この軸受４４にカム連結板４５が接続されている。カム連結板４５において、軸受４４と接続された一方端部と反対側の他方端部は可動部４６に固定されている。この可動部４６には、ベース体としての可動ベース３５が接続されている。この可動ベース３５に塗布針ホルダ２０が設置されている。塗布針ホルダ２０は塗布針２４を含む。塗布針２４は、プレート８のたとえばウェル９Ａに塗布材料を塗布可能である。塗布針２４は、塗布針ホルダ２０の下面（サーボモータ４１が位置する側と反対側である下側）において塗布針ホルダ２０から突出するように配置されている。塗布針ホルダ２０下には塗布材料容器２１が配置されている。塗布材料容器２１に塗布針２４は挿入された状態で保持されている。

【0021】

可動部４６には固定ピンが固定されている。また、サーボモータ４１を保持している架台には他方の固定ピンが固定されている。この固定ピンの間を繋ぐようにバネが設置されている。このバネにより、可動部４６は塗布材料容器２１側に向けた力を受けた状態になっている。また、このバネの力によって、軸受４４はカム４３のカム面に押圧された状態を維持している。

【0022】

また、可動部４６、可動ベース３５は、サーボモータ４１を保持する架台に設置されたリニアガイドに接続され、Ｚ軸方向に沿って移動可能になっている。

【0023】

上述した針塗布機構１０４においては、サーボモータ４１を駆動することにより当該サーボモータ４１の回転軸を回転させてカム４３を回転させる。この結果、カム４３のカム面に接触している軸受４４のＺ軸方向における位置がサーボモータ４１の回転軸の回転に応じて変動する。そして、この軸受４４のＺ軸方向での位置変動に応じて、可動部４６、可動ベース３５がＺ軸方向に移動することにより、塗布針２４のＺ軸方向における位置を変化させることができる。つまり塗布針２４をＺ軸方向に往復運動させることができる。この動作により、塗布針２４がＺ軸方向の上方にある時には、液体材料が収納された塗布材料容器２１内に塗布針２４の先端が浸漬される。この状態に対し、塗布針２４は塗布材料容器２１の底面の先端穴から下方に突出することで塗布動作がなされる。塗布針２４の先端に液体材料が付着した状態で、塗布針２４の先端が塗布材料容器２１の先端穴から突出し、塗布材料容器２１の外に出る。このとき、表面張力によって液体材料が上方に引き上げられ、塗布針２４の先端にはほぼ一定量の液体材料が付着した状態となる。このように付着した液体材料がプレート８のウェル９Ａ内に転写されることで、再現性の高い塗布工程が実現できる。

【0024】

図３は、細胞低接着基板としてのプレートの概略斜視図である。図３に示されるように、本実施の形態では、液体材料としての塗布液は、上記の「液滴」と同義である。また塗布液は、「バイオインク」と同義である。塗布液は、プレート８（細胞低接着基板）に複数形成されたウェル９Ａ（凹部）の内部に塗布供給される。プレート８はＺ軸方向に厚みを有し、プレート本体８Ａにより形成されている。プレート本体８Ａの最上面に複数のウェル９Ａが形成されている。複数のウェル９Ａは、プレート８（プレート本体８Ａ）の上面がくぼんだ凹形状の部分である。複数のウェル９Ａは互いに間隔をあけて、たとえば図３のＹ軸方向に８列、Ｘ軸方向に１２列で合計９６個形成されてもよい。ウェル９ＡをＺ方向の上方から見たときの平面形状は円形、長方形、正方形など任意である。またプレート８に形成されるウェル９Ａの数は上記の９６個に限られない。プレート８のウェル９Ａの数は６個、１２個、２４個、４８個、９６個、３８４個、１５３６個のいずれかであってもよい。通常はウェル９Ａを上方から平面視したときの最大寸法は１ｍｍを超える。ここで最大寸法とは、ウェル９Ａの平面視における寸法のうち最大の部分の値である。たとえばウェル９Ａが楕円形であれば、最大寸法はその長軸方向の寸法である。

【0025】

図４は、プレートに形成されるウェルの形状の第１例を示す概略断面図である。図４に示されるように、プレート８（プレート本体８Ａ）の表面に複数形成されるウェル９Ａは、表面（最上面９０）に交差する方向に延びる壁面９１と、表面（最上面９０）に沿うように拡がる底面９２とを有するように形成されてもよい。底面９２はウェル９Ａのうち、最上面９０からもっとも離れた位置に存在する平面である。底面９２と、底面９２の外縁に連なり底面９２と交差するように拡がる壁面９１とにより、ウェル９Ａが形成される。

【0026】

図４のウェル９Ａは、壁面９１と底面９２との境界が、２つの平面の交差する部分のような稜線を形成している。図４では壁面９１が表面（最上面９０）に直交する方向に対してやや傾斜している。このため底面９２の面積は、最上面９０がウェル９Ａにより欠落する開口部の平面視での面積よりも小さい。このような態様であってもよい。ただし他の例として壁面９１は最上面９０に直交してもよい。つまり図４の断面において壁面９１は最上面９０に直交してもよいし、直交せず傾斜してもよい。図４の断面とは上下方向に延びる直線に沿うように拡がる断面（平面）を意味し、これは次の図５、図６においても同じである。壁面９１は円柱または円錐の側面の一部のような形状であってもよい。あるいは壁面９１は、角柱または角錐の側面の一部のような形状であってもよい。

【0027】

図５は、プレートに形成されるウェルの形状の第２例を示す概略断面図である。図５に示されるように、プレート本体８Ａに形成されるウェル９Ａは、壁面９１と底面９２とを有する。壁面９１については図４のウェル９Ａと同様である。壁面９１の最下部に連なるように底面９２が配置される。図５のウェル９Ａは底面９２（最上面９０からもっとも離れた底部）が曲面状である。底面９２としての曲面は球面の一部であってもよいし、楕円体の表面の一部であってもよい。図５では、平面である壁面９１と底面９２との境界が、図５の断面において丸みを帯びた曲面状である。この境界の部分も、球面の一部であってもよいし、楕円体の表面の一部であってもよい。以上により、図５の断面における底面９２の形状はＵ字状である。

【0028】

図６は、プレートに形成されるウェルの形状の第３例を示す概略断面図である。図６に示すように、プレート本体８Ａに形成されるウェル９Ａは、壁面９１と底面９２とを有する。壁面９１については図４のウェル９Ａと同様である。図６の断面では壁面９１と底面９２との双方が最上面９０に垂直な上下方向に対して傾斜している。プレート本体８Ａに形成されるウェル９Ａは、底面９２（最上面９０からもっとも離れた底部）と壁面９１との間で、上下方向に延びる直線に対する角度が互いに異なっている。図６では壁面９１とこれに連なる底面９２との境界が稜線を形成している。図６の断面では、壁面９１よりも底面９２の方が、上下方向に延びる直線に対して大きな角度を有する。

【0029】

図６の底面９２はたとえば円錐または角錐の側面のような形状である。このため底面９２の最下部は、図６の断面において、円錐または角錐の頂点のように尖った形状であってもよい。以上により、図６の断面における底面９２の形状はＶ字状である。

【0030】

細胞低接着基板としてのプレート８は、いわゆるマルチウェルプレートであってもよい。マルチウェルプレートは、図４～図６のいずれかのような形状のウェル９Ａが複数、行列状に並べられている。つまり図３のプレート８はマルチウェルプレートである。本実施の形態では、マルチウェルプレートを用いて、たとえば３個以上の塗布液を用いた細胞組織からスフェロイドが形成されてもよい。この場合、ウェル９Ａ内に供給された塗布液により、ウェル９Ａ内にスフェロイドが形成されてもよい。

【0031】

ただしプレート８（細胞低接着基板）はマルチウェルプレートに限られない。プレート８は、スライドガラス、ディッシュ、セルデスクＬＦのいずれかであってもよい。

【0032】

図７は、ディッシュの概略図である。図８は、ディッシュの底面の概略断面図である。プレート８が図７に示されるようなディッシュであれば、塗布液は、ディッシュ内の底面上に供給される。図８に示されるように、ディッシュの底面の表面（最上面９０）には凹部としてのくぼみ９Ｂが複数形成されている。くぼみ９Ｂは特殊な微細加工によりディッシュの底面の表面（最上面９０）に形成されたものである。くぼみ９Ｂのサイズはランダムであってもよいが、たとえばその平面視における最大寸法は１ｍｍ未満である。つまりくぼみ９Ｂは通常、マルチウェルプレートのウェル９Ａよりもサイズが小さい。したがってサイズにより、マルチウェルプレートのウェル９Ａとディッシュのくぼみ９Ｂとを判別できる場合がある。一例として、くぼみ９Ｂは平面視にてほぼ円形であり、口径が４００μｍ以上５００μｍ以下、深さが１００μｍ以上２００μｍ以下であってもよい。

【0033】

図８に示すように、ディッシュの底面上のくぼみ９Ｂの内部に塗布液が供給される。これによりくぼみ９Ｂ内にスフェロイドが形成されてもよい。くぼみ９Ｂは、たとえばスフェロイド形成用のスライドガラスに形成されてもよい。

【0034】

プレート８が図３のようなマルチウェルプレートであれば、これに形成される複数のウェル９Ａ内に第１塗布液Ａなどを直接供給するだけで、簡便に細胞配置が制御されたスフェロイドを作製できる。プレート８がいわゆるディッシュであっても、ディッシュの底面に第１塗布液Ａなどを複数間隔をあけて並べるように供給すればよい。ディッシュは、円形であり大きい平面状の底面の外縁に壁面が設けられた器材である。このようにすれば、ディッシュを用いた場合にて、簡便に細胞配置が制御されたスフェロイドを作製できる。つまり、プレート８がマルチウェルプレートであってもディッシュであっても、たとえば基板の表面上に供給された液滴を培養容器内に移し替える工程を要さない。このため当該移し替える工程を要する場合に比べて簡易に塗布液等を供給できる。また液滴の移し替え作業に伴う塗布液の意図せぬ移動または形状崩壊に起因する細胞配置位置の精度低下、およびそれに伴う液滴内の複数の細胞の凝集性の低下を抑制できる。

【0035】

プレート８が細胞低接着基板である場合においても、塗布液自体のプレート８への付着のしにくさは問題ではない。プレート８が細胞低接着基板である場合、プレート８の表面には塗布液に含まれる細胞が付着しにくくなる。そのようにする観点から、プレート８の表面に付着する水（純水）の接触角は、６０°以上７０°以下を除く角度であることが好ましい。つまり接触角は６０°未満の小さい角度であってもよく、７０°を超え１８０°未満の大きい角度であってもよい。上記の水の接触角の数値範囲は、塗布液に含まれる細胞の種類に依って変化する場合がある。

【0036】

第１に、水の接触角を６０°未満の小さい角度にすることは、ウェル９Ａの底面９２、ディッシュの底面などを含むプレート８の表面を親水性にすることを意味する。そのための方法について具体的に説明する。

【0037】

異なる観点から言えば、プレート８の表面におけるタンパク質の吸着を抑制することにより、当該表面を親水性化し、細胞を接着しにくくすることもできる。細胞接着は、細胞が培養されるべき基板の上に、細胞培養培地に添加された細胞接着性タンパク質が付着し、そのタンパク質の上に細胞が接着することにより生じる。そのため、当該基板上にタンパク質が付着しないようにすれば、当該基板を細胞低接着基板にできる。当該基板上にタンパク質を付着させないためには、熱力学的推進力の自由エネルギーを減少させ、かつ基板と水との界面の自由エネルギーを減少させることが好ましい。つまり細胞が培養されるべき基板の表面を非イオン性の親水性表面にすることで、表面での水の接触角が小さくなり、表面でのタンパク質の付着が抑制できる。そのため表面への細胞の接着を抑制できる。

【0038】

なお上記において、細胞が培養されるべき基板（タンパク質が付着する基板）は、本実施の形態におけるプレート８であり、より詳しくはマルチウェルプレートのウェル９Ａの底面９２、ディッシュの最上面９０、くぼみ９Ｂ内の表面などである。細胞培養培地は、後述する培地Ｍ（図１７参照）であってもよいが、第１塗布液Ａ中に第１溶媒として含まれる培地であってもよい。細胞培養培地に添加される細胞接着性タンパク質は、塗布液などにコラーゲン、フィブリネクチンなどを単体で溶かしたものであってもよい。あるいは細胞接着性タンパク質は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはウマの血清であってもよい。

【0039】

ウェル９Ａおよびくぼみ９Ｂの凹部は、プレート８の表面における水の接触角の制御には必ずしも寄与しない。マルチウェルプレートのウェル９Ａ、ディッシュの最上面９０に形成されるくぼみ９Ｂは、スフェロイドを形成するための容器としての役割を有する。１個のウェル９Ａ内または１個のくぼみ９Ｂ内にはたとえば１個のスフェロイドを形成できる。

【0040】

プレート８の種類にかかわらず、プレート８は細胞低接着高分子を用いて形成されることが好ましい。ここで細胞低接着高分子は、たとえばＭＰＣポリマーおよびＰ－ＨＥＭＡのいずれかであってもよい。たとえば基板の表面にＭＰＣポリマーおよびＰ－ＨＥＭＡのいずれかがコーティングされたプレート８が形成されてもよい。ＭＰＣポリマーは、タンパク質の吸着を抑制するバイオマテリアルである。このためＭＰＣポリマーを用いれば、細胞低接着基板を得ることができる。

【0041】

ＭＰＣポリマーがコーティングされたプレート８を形成する方法の一例は、次のとおりである。ＭＰＣポリマーの溶液を、プレート８であるマルチウェルプレート、ディッシュなどの表面に流す。余った溶液がプレート８から除去される。その後、プレート８を乾燥させる。

【0042】

その他、プレート８の表面を親水性化する観点から、次のようにすることもできる。プレート８の種類にかかわらず、プレート８は、表面への水（純水）の接触角が放射線により制御されてもよい。つまりプレート８は、その表面に放射線が照射されることにより、当該表面の水に対する接触角が制御されてもよい。プレート８に照射される放射線として、たとえばγ線が挙げられる。放射線の照射により、プレート８の表面が親水性化される。その結果、プレート８は細胞非接着基板としての性質を有するようになる。

【0043】

さらに他の方法として、プレート８（マルチウェルプレートのウェル９Ａ、ディッシュのくぼみ９Ｂなど）の表面にプラズマが照射されてもよい。これによりプレート８の表面が親水性化され、ウェル９Ａ、くぼみ９Ｂに細胞が接着しにくくなる効果を得られる。

【0044】

第２に、水の接触角を７０°越えで１８０°に近づける、大きな角度にすることは、ウェル９Ａの底面９２、ディッシュの底面などを含むプレート８の表面を疎水性にすることを意味する。そのための方法としては、疎水性ポリマーで表面がコートされたプレート８が用いられることが好ましい。

【0045】

（製造方法の特徴）
本実施の形態に係る製造方法、すなわち細胞配置の制御方法（スフェロイドの製造方法）は次に述べる通りである。まず、培養すべき細胞を供給するためのプレート８として、上記のマルチウェルプレート、ディッシュなどの細胞低接着基板が準備される。

【0046】

次に、第１溶媒を含む第１塗布液が少なくとも１回、プレート８上に塗布される。この工程を第１塗布液塗布工程と呼ぶ。第１塗布液は第１溶媒に加え、ゲルとなるべき材料であるゲル原料を含むことが好ましい。プレート８がマルチウェルプレートであれば、複数のウェル９Ａから選ばれた１つのウェル９Ａに、第１塗布液が塗布される。プレート８がディッシュであればディッシュのくぼみ９Ｂ内を含むように、第１塗布液が塗布される。いずれの場合においても、１回の塗布により供給される、球状またはそれに近い形状の液滴が、ここでは１個の塗布液と表記される。したがって、少なくとも１回の塗布により少なくとも１個の第１塗布液が供給される。

【0047】

なお複数の第１塗布液は、１つの針塗布機構により時間的に連続して供給された液体によるものを１個とする。１つの針塗布機構により時間的に分断されながら供給された液体による第１塗布液は互いに別個のものとする。また時間的に同時であっても、互いに異なる針塗布機構から供給された液体による第１塗布液は互いに別個のものとする。

【0048】

第１塗布液塗布工程においては、第１塗布液の塗布が、少なくとも１回（１回または２回以上）行なわれる。第１塗布液塗布工程では、少なくとも１個（１個または２個以上）の第１塗布液が塗布される。第１塗布液塗布工程における第１塗布液の塗布のうち、少なくとも１回の塗布では、第１塗布液内に、培養すべき細胞が含まれる。２個以上の第１塗布液を塗布する場合、たとえば１回目に塗布される第１塗布液中には１種類以上の細胞が含まれる。しかし２個以上の第１塗布液を塗布する場合、２回目以降に塗布される第１塗布液中には細胞が含まれなくてもよい。２回目以降に塗布される第１塗布液中にも細胞が含まれてもよい。あるいは１回目に塗布される第１塗布液中には細胞が含まれず、２回目以降のいずれか１回において塗布される第１塗布液中に細胞が含まれてもよい。

【0049】

プレート８上に第１塗布液を塗布する工程においては、第１塗布液はＮ個（Ｎは２以上の自然数）塗布される。特にプレート８上に第１塗布液を塗布する工程においては、第１塗布液が３回以上プレート８上（ウェル９Ａ内など）に塗布されプレート８上（ウェル９Ａ内など）に並べられてもよい。特に上記工程においては、第１塗布液が４回以上プレート８上（ウェル９Ａ内など）に塗布され、プレート８上（ウェル９Ａ内など）に並べられてもよい。

【0050】

図９は、２個の第１塗布液の配置関係を示す概略図である。図９に示されるように、第１塗布液Ａの寸法を第１寸法ｒ_１ｎ（１≦ｎ≦Ｎ）とする。すなわちＮ個の第１塗布液Ａのうち１個目の第１寸法はｒ_１１で表記され、２個目の第１寸法はｒ_１２で表記される。図９ではＮ個（Ｎは２以上の自然数）のうち任意に選択された２個の第１塗布液Ａのそれぞれの寸法がｒ_１ｎ、ｒ_{１（ｎ＋１）}（ｎは１≦ｎ≦Ｎ－１の自然数）とされる。２個の第１塗布液Ａのそれぞれの中心（図心）間の距離をｄ_{ｎ，ｎ＋１}とする。このとき２個の第１塗布液の配置関係は、図９中の（Ａ）のように互いに重ならない場合と、（Ｂ）のように一方が他方の内部に完全に収まる場合と、（Ｃ）のように両者が部分的に重なる場合とがある。（Ａ）には両者が互いに外接する場合を含む。（Ｂ）には一方が他方に内接する場合を含む。

【0051】

図９中の（Ａ）の場合には以下の式（１）が、（Ｂ）の場合には以下の式（２）が、（Ｃ）の場合には以下の式（３）が、それぞれ成立する。式（１）中の等号は図９の（Ａ）にて２つの第１塗布液Ａが互いに外接する場合である。式（２）中の等号は図９の（Ｂ）にて一方の第１塗布液Ａが他方に内接する場合である。式（３）にてｒ_１ｎ＝ｒ_{１（ｎ＋１）}であれば、ｄ_{ｎ，ｎ＋１}＜ｒ_１ｎ＋ｒ_{１（ｎ＋１）}のみ成立する。

【0052】

（数１）ｄ_{ｎ，ｎ＋１}≧ｒ_１ｎ＋ｒ_{１（ｎ＋１）}・・・（１）
（数２）ｄ_{ｎ，ｎ＋１}≦ｒ_{１（ｎ＋１）}－ｒ_１ｎ・・・（２）
（数３）ｒ_{１（ｎ＋１）}－ｒ_１ｎ＜ｄ_{ｎ，ｎ＋１}＜ｒ_１ｎ＋ｒ_{１（ｎ＋１）}・・・（３）
本実施の形態においては上記の式（２）および式（３）のいずれかが成立する位置に第１塗布液Ａが塗布される。これにより、複数の第１塗布液Ａを連結させたスフェロイドを形成できる。

【0053】

第１塗布液がＮ個（Ｎは２以上の自然数）塗布される場合において、Ｎ個のそれぞれの第１塗布液の構成成分（たとえば含まれる第１溶媒の種類）が同じであってもよい。ただし上記のＮ個のそれぞれの第１塗布液の構成成分が互いに異なってもよい。Ｎ個の第１塗布液の構成成分のうち一部は同じであり、他の一部は上記一部とは異なっていてもよい。いずれの場合においても、本実施の形態の作用効果を得ることができる。

【0054】

第１塗布液がＮ個（Ｎは２以上の自然数）塗布される場合において、Ｎ個のうち少なくとも２個の第１塗布液に含まれる細胞の種類が互いに異なってもよい。あるいはＮ個の第１塗布液に含まれる細胞の種類がすべて同じであってもよい。Ｎ個のうち一部に含まれる細胞の種類が同じであり、他の一部に含まれる細胞の種類が上記一部に含まれる細胞の種類と異なってもよい。これらのいずれの場合においても、本実施の形態の作用効果を得ることができる。

【0055】

第１塗布液を塗布する工程は、バイオプリンターによる塗布針方式が用いられる。つまり第１塗布液は、たとえば図１の針塗布機構１０４（針塗布機構１０４－１，１０４－２）により塗布される。これにより、第１塗布液をウェル９Ａ内などに微小量、すなわち非常に小さい寸法となるように塗布することができる。また塗布針方式によれば、第１塗布液が高粘度であっても塗布可能である。ただし第１塗布液は、塗布針方式以外により塗布（供給）されてもよい。第１塗布液を塗布する工程には、塗布針方式バイオプリンター、ディスペンサー（滴下機構１０５（図１参照）など）、インクジェット、ピペットからなる群から選択されるいずれかが用いられてもよい。これらの各方法により、第１塗布液を所望の位置に安定供給できる。

【0056】

第１塗布液Ａを覆うように、第２塗布液が滴下（塗布）される。この工程を第２塗布液滴下工程と呼ぶ。第２塗布液は増粘剤および第２溶媒を含む。第２塗布液は上記に加え、各種添加物が加えられてもよい。図１０は、第１塗布液と第２塗布液との位置関係の一例を示す概略図である。図１０に示されるように、本実施の形態では、第２塗布液Ｂに内接、外接のいずれもしないように第１塗布液Ａが配置されればよい。第２塗布液Ｂは複数回滴下されることで１つの第２塗布液Ｂとしてまとまった態様を有してもよい。図１０では１例として、図９の（Ｃ）のように配置される２個の第１塗布液Ａ１，Ａ２を覆うように、（たとえばウェル９Ａ内に）第２塗布液Ｂが供給される。ただし図９の（Ｂ）のように配置される２個の第１塗布液Ａ１，Ａ２を覆うように、（たとえばウェル９Ａ内に）第２塗布液Ｂが供給されてもよい。

【0057】

第２塗布液Ｂを滴下する工程は、ディスペンサーによりなされる。つまり第２塗布液Ｂは、たとえば図１の滴下機構１０５（滴下機構１０５－１）により滴下される。ただしこれに限られない。第２塗布液Ｂを塗布する工程は上記の他、塗布針方式、インクジェット方式、ピペット（手動）からなる群から選択されるいずれかが用いられてもよい。

【0058】

第２塗布液Ｂの供給後、たとえばウェル９Ａ内の第１塗布液Ａおよび第２塗布液Ｂの上に培地（次に述べる培地Ｍ）を滴下することにより、細胞組織が連結されたスフェロイドが形成される。

【0059】

培地を滴下する工程は、ディスペンサーによりなされる。つまり培地は、たとえば図１の滴下機構１０５（滴下機構１０５－２）により滴下される。ただしこれに限られない。培地を塗布する工程は上記の他、塗布針方式、インクジェット方式、分注機、マイクロポンプ、ピペット（手動）からなる群から選択されるいずれかが用いられてもよい。

【0060】

（図を用いた具体的な製造方法の説明）
ここではマルチウェルプレートを用いた例を図示している。しかしマルチウェルプレート以外の器材、たとえばディッシュ、スライドガラス等を用いた場合についてもこれと同様の手順である。図１１は、実施の形態における第１塗布液が塗布される前の態様を示す概略図である。図１１に示されるように、まずバイオプリンターを構成する塗布針２４の先端が、第１塗布液Ａ（第１バイオインク）に浸漬され、第１塗布液Ａが塗布針２４の先端に付着される。図１２は、実施の形態における第１塗布液の組成を示す概略図である。図１２に示されるように、第１塗布液Ａは、培養すべき細胞Ｃと、ゲル化剤（ゲル原料）としてのコラーゲンと、第１溶媒ｍとの混合により得られる。図１２の細胞ＣはＣ１とＣ２とを含むが、これらについては後述する。図１３は、実施の形態における第１塗布液が塗布される工程を示す概略図である。図１３に示されるように、第１塗布液Ａが付着された塗布針２４の先端が、ウェル９Ａ（図４参照）のたとえば底面９２（図４参照）に接触する。これは第１塗布液Ａが付着された塗布針２４が図１１の矢印Ｍ１に示すように下方に移動することによりなされる。これによりウェル９Ａの底面９２に第１塗布液Ａが塗布される。図１４は、実施の形態における第１塗布液が塗布された後の態様を示す概略図である。図１４に示されるように、その後塗布針２４が矢印Ｍ２に示すように上方に移動する。このように、第１塗布液Ａはいわゆるピン方式（図１の針塗布機構１０４のような塗布針方式）のバイオプリンターを用いてウェル９Ａなどの容器に塗布される。

【0061】

図１５は、実施の形態における第２塗布液が供給される工程を示す概略図である。図１６は、図１５の工程がなされた後のウェル内の態様を示す概略図である。図１５および図１６に示されるように、ウェル９Ａ内に塗布された第１塗布液Ａを覆うように、ウェル９Ａ内に第２塗布液Ｂ（第２バイオインク）が供給される。第２塗布液Ｂはたとえばディスペンサーにより滴下されてもよいが、第２塗布液Ｂの供給方法はこれに限られない。第２塗布液Ｂは、ピン方式、インクジェット方式、ディスペンサー方式（図１の滴下機構１０５を用いた方式）、ピペットを用いた手動、からなる群から選択されるいずれかにより供給されてもよい。

【0062】

図１７は、実施の形態における培地が供給される工程を示す概略図である。図１７に示されるように、第２塗布液Ｂを供給する工程の後に、培地Ｍがウェル９Ａ内に供給される。培地Ｍは第１塗布液Ａおよび第２塗布液Ｂが浸され覆われるように供給される。培地Ｍの滴下方法は特に限定されない。培地Ｍは、ピン方式、インクジェット方式、ディスペンサー方式、ピペットを用いた手動、からなる群から選択されるいずれかにより供給されてもよい。あるいは培地Ｍは、分注機またはマイクロポンプにより供給されてもよい。

【0063】

図１８は、培養前の第１塗布液内の細胞の態様を示す概略図である。図１９は、培養後の第１塗布液内の細胞の態様を示す概略図である。図１８、図１９（および図１２）に示されるように、培養前の第１塗布液Ａ内の細胞Ｃは、心筋細胞Ｃ１と、心臓線維芽細胞Ｃ２とを含んでいる。細胞Ｃ中の心筋細胞Ｃ１の個数の比率は７５％以上であるが、８０％以上であることが好ましい。細胞Ｃ中の心臓線維芽細胞Ｃ２の個数の比率は２０％以下である。したがって、最も心筋細胞Ｃ１の個数の比率が低い場合はＣ１：Ｃ２＝８０：２０であり、最も心筋細胞Ｃ１の個数の比率が高い場合はＣ１：Ｃ２＝１００：０である。言い換えれば、上記の比例式において、細胞Ｃ中の個数比率（％）は８０≦Ｃ１≦１００（または７５≦Ｃ１≦１００）であり、０≦Ｃ２≦２０である。第１塗布液Ａ中に含まれる心筋細胞Ｃ１と心臓線維芽細胞Ｃ２との細胞体積濃度は０．００１ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％以下であることが好ましい。その中でも細胞体積濃度は１ｖｏｌ％以上３０ｖｏｌ％以下であることがより好ましい。その中でも細胞体積濃度は２５ｖｏｌ％であることが最も好ましい。心筋細胞Ｃ１と心臓線維芽細胞Ｃ２との個数の比率および細胞体積濃度を上記のようにすることにより、後述の実施例のように、細胞を培養させることによる細胞組織を安定的に形成できる。培養により、心筋細胞Ｃ１および心臓線維芽細胞Ｃ２はいずれも図１８の状態から図１９のように成長し、心筋組織が形成される。

【0064】

（材料）
第１塗布液Ａは、培養しようとする細胞と、スフェロイドを作製するためのゲル（液状であればゲル原料）と、第１溶媒とから構成される。第１塗布液Ａには上記の他、各種添加物が加えられてもよい。

【0065】

細胞の種類は特に限定されない。細胞として、正常細胞または各種疾患由来細胞が用いられてもよい。あるいは細胞として、遺伝子導入・遺伝子改変・および遺伝子組み換えのいずれかが行なわれた細胞が用いられてもよい。細胞は、ヒト、マウス、ラットおよびサルのいずれかの動物のもの（動物由来のもの）であってもよい。細胞は、幹細胞由来の分化細胞であってもよい。つまり細胞は、ｉＰＳ細胞由来またはＥＳ細胞由来の分化細胞であってもよい。細胞は間葉系幹細胞であってもよい。細胞は、初代細胞であってもよいし、ライン化された細胞であってもよい。

【0066】

細胞の種類は、神経細胞、心筋細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、肝細胞、クッパー細胞、肝星細胞、ピット細胞、上皮細胞および骨格筋細胞のいずれか、すなわち各種臓器由来の細胞であってもよい。神経細胞は、中枢神経細胞、交感神経細胞、副交感神経細胞、感覚神経細胞、介在神経細胞、運動神経細胞、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、シュワン細胞、サテライト細胞等である。心筋細胞は、心室筋細胞、心房筋細胞等である。

【0067】

第１塗布液Ａにおける細胞の密度は特に限定されない。しかし当該細胞の密度は、たとえば１×１０^２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であってもよい。

【0068】

第１塗布液Ａにはゲル（固化前であればゲル原料：以下ゲル）が必ずしも含まれなくてもよい。たとえば第１塗布液Ａ中に天然高分子および合成高分子のいずれかが含まれてもよい。第１塗布液Ａにゲルが用いられる場合、ゲルの材料は特に限定されない。第１塗布液Ａ中のゲルは、たとえばコラーゲン、フィブリン、マトリゲル、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチンメタクリロイル（ＧｅｌＭＡ）、セルロース、セルロースナノファイバー、キチン、キトサン、キチンナノファイバー、キトサンナノファイバーメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシブチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ジェランガム、カラギーナン、ペクチン、キサンタンガム、ゼラチン、アガロースおよびポリビニルアルコールのいずれかであってもよい。

【0069】

第１溶媒の材料は特に限定されない。ただし第１溶媒は、培地と同一材料、または緩衝液であってもよい。第１溶媒はたとえば、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ－１２、αＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、ウイリアム培地、Ｍ１９９、市販の各種細胞用の専用培地、ＰＢＳ溶液（＋または－）、トリス緩衝液およびタイロード緩衝液のいずれかであってもよい。

【0070】

第１塗布液中の各種添加物の材料は特に限定されない。各種添加物は、細胞に作用する薬剤、細胞成長因子、サイトカイン、ホルモン、転写因子、ECM、タンパク、抗体、増粘剤、塩等であってもよい。各種添加物は、低分子化合物、中分子化合物、高分子化合物のいずれであってもよい。たとえば当該添加物は、Ｔ３、Ｔ４、ＩＧＦ（インシュリン様成長因子：ＩＧＦ－Ｉ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、顆粒球コロニー形成刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＥＰＯ、ＴＰＯ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インシュリン、デキサメタゾン、イソプロテレノール、B27（登録商標）supplement、N2 supplement、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、コラーゲン、フィブリン、マトリゲル、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、ニドゲン、ROCK inhibitor、アルギン酸ナトリウム、ゼラチンメタクリロイル（ＧｅｌＭＡ）、セルロース、セルロースナノファイバー、キチン、キトサン、キチンナノファイバー、キトサンナノファイバーメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシブチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ジェランガム、カラギーナン、ペクチン、キサンタンガム、ゼラチン、アガロースおよびポリビニルアルコールのいずれかであってもよい。

【0071】

第２塗布液Ｂに含まれる増粘剤の種類は特に限定されない。たとえば増粘剤は、セルロース、セルロースナノファイバー、キチン、キトサン、キチンナノファイバー、キトサンナノファイバーメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシブチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ジェランガム、カラギーナン、ペクチン、キサンタンガム、ゼラチン、アガロースおよびポリビニルアルコールのいずれかであってもよい。

【0072】

第２溶媒の材料は特に限定されないが、第１溶媒の材料と同一の種類を適用できる。第２塗布液中の各種添加物は特に限定されないが、第１塗布液中の各種添加物の材料と同一の種類を適用できる。

【0073】

スフェロイドを培養する培地、すなわち製造工程において第２塗布液Ｂの後に塗布される培地Ｍ（図１５参照）の材料は特に限定されない。ただし培地Ｍはたとえば、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ－１２、αＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、ウイリアム培地、Ｍ１９９、および市販の各種細胞用の専用培地のいずれかであってもよい。これらの各種の培地Ｍが任意の比率で混合されてもよい。また培地Ｍには各種添加物を追加できる。培地Ｍへの各種添加物の材料は、上記の第１塗布液Ａまたは第２塗布液Ｂの各種添加物と同一の種類を適用できる。

【0074】

（作用効果）
本実施の形態に係る細胞配置の制御方法（スフェロイドの製造方法）では、培養すべき細胞Ｃを供給するための基板（プレート８）が準備される。第１溶媒ｍを含む第１塗布液Ａを少なくとも１回プレート８上に塗布する、第１塗布液塗布工程がなされる。第１塗布液Ａを覆うように、増粘剤および第２溶媒を含む第２塗布液Ｂを滴下する第２塗布液滴下工程がなされる。第１塗布液塗布工程における第１塗布液Ａの塗布のうち、少なくとも１回の塗布に細胞Ｃが含まれる。プレート８は細胞低接着基板である。

【0075】

本実施の形態においては第１塗布液Ａを覆うように、増粘剤と第２溶媒とを含む第２塗布液Ｂが滴下される。このため第１塗布液Ａの位置が固定するよう制御しやすくなる。したがって、細胞同士が自己凝集したスフェロイドを形成しやすくなる。第１塗布液Ａが第２塗布液Ｂで覆われることにより、第１塗布液Ａの乾燥を抑制できる。このため第１塗布液Ａ中の細胞の死滅を抑制できる。

【0076】

基板（プレート８）として細胞低接着基板が用いられる。このため、第１塗布液Ａなどの基板上への塗布後に、第１塗布液Ａに含まれる細胞が基板の表面上に接着しにくくなる。仮に第１塗布液Ａ内の細胞が基板上に接着して広がれば、細胞Ｃ（図１２参照）同士が凝集しにくくなり、スフェロイドを構成する塗布液の位置がずれる。そうすると、塗布液、細胞Ｃの位置精度および、塗布液内の細胞Ｃ同士の凝集性の高いスフェロイドの作製が困難となる。このような課題を解決するため本実施の形態のように基板上への細胞の接着が抑制される。これにより、たとえば第１塗布液Ａが３個以上形成される場合においても、第１塗布液Ａ、細胞Ｃの位置精度が高く、第１塗布液Ａ内の細胞Ｃ同士の凝集性が高いスフェロイドを作製できる。複数個の第１塗布液Ａの位置精度を高めることで、細胞、タンパク、添加因子等の位置を高精度に制御できる。

【0077】

上記細胞配置の制御方法では、プレート８上に第１塗布液Ａを塗布する工程においては、第１塗布液Ａが３回以上プレート８上に塗布されプレート８上に並べられる。つまり本実施の形態の上記手法に依れば、第１塗布液Ａを３個以上塗布された第１塗布液Ａの液滴（バイオインク）が連結して得られるスフェロイドの形成時に、液滴の位置精度を高め、第１塗布液Ａ中の細胞Ｃ同士の自己凝集性を高められる。

【0078】

上記細胞配置の制御方法では、基板の表面にＭＰＣポリマーおよびＰ－ＨＥＭＡのいずれかがコーティングされることにより、細胞低接着基板が形成されてもよい。これにより、プレート８の表面（ウェル９Ａの底面、くぼみ９Ｂの表面など）を親水性化し、プレート８を細胞非接着基板とすることができる。このため上記の通り、たとえば第１塗布液Ａを３個以上塗布された第１塗布液Ａの液滴（バイオインク）が連結して得られるスフェロイドの形成時に、液滴および細胞の位置精度を高め、第１塗布液Ａ中の細胞Ｃ同士の自己凝集性を高められる。

【0079】

上記細胞配置の制御方法では、プレート８の表面に放射線を照射することにより、当該表面の水に対する接触角を制御する工程をさらに備えてもよい。これにより、プレート８の表面（ウェル９Ａの底面、くぼみ９Ｂの表面など）を親水性化し、プレート８を細胞非接着基板とすることができる。このため上記の通り、たとえば第１塗布液Ａを３個以上塗布された第１塗布液Ａの液滴（バイオインク）が連結して得られるスフェロイドの形成時に、液滴および細胞の位置精度を高め、第１塗布液Ａ中の細胞Ｃ同士の自己凝集性を高められる。

【0080】

上記細胞配置の制御方法では、細胞低接着基板（プレート８）の表面には凹部（ウェル９Ａ）が複数形成されている。複数のウェル９Ａの、プレート８の表面（最上面９０）からもっとも離れた底面９２は最上面９０に沿うように拡がる平面である。これによっても上記と同様、ウェル９Ａ内でのスフェロイドの形成時に、液滴および細胞の位置精度を高め、第１塗布液Ａ中の細胞Ｃ同士の自己凝集性を高められる。

【0081】

上記細胞配置の制御方法では、細胞低接着基板（プレート８）の表面には凹部（ウェル９Ａ）が複数形成されている。複数のウェル９Ａの、プレート８の表面（最上面９０）からもっとも離れた底面９２は曲面状である。つまり底面９２がＵ字のような断面形状を有してもよい。これによっても上記と同様、スフェロイドの形成時に、液滴および細胞の位置精度を高め、第１塗布液Ａ中の細胞Ｃ同士の自己凝集性を高められる。なお底面９２が曲面状（球面の一部など）であることにより、これが平面状である場合に比べて、細胞Ｃ同士の自己凝集性をいっそう高められる。

【0082】

上記細胞配置の制御方法では、細胞低接着基板（プレート８）の表面には凹部（ウェル９Ａ）が複数形成されている。複数のウェル９Ａの、プレート８の表面（最上面９０）からもっとも離れた底面９２は、最上面９０に垂直な方向（上下方向）に対して傾斜する壁面である。当該壁面のうち最上面９０からもっとも離れた部分は尖った形状を有する。つまり底面９２がＶ字のような断面形状を有してもよい。これによっても上記と同様、スフェロイドの形成時に、液滴および細胞の位置精度を高め、第１塗布液Ａ中の細胞Ｃ同士の自己凝集性を高められる。なお底面９２が曲面状（円錐の側面の一部など）であることにより、これが平面状（角錐の側面の一部など）である場合に比べて、細胞Ｃ同士の自己凝集性をいっそう高められる。

【0083】

上記細胞配置の制御方法では、細胞低接着基板（プレート８）の表面（底面の最上面９０）には凹部（くぼみ９Ｂ）が複数形成されている。くぼみ９Ｂの平面視における最大寸法は１ｍｍ未満である。これによっても上記と同様、スフェロイドの形成時に、液滴および細胞の位置精度を高め、第１塗布液Ａ中の細胞Ｃ同士の自己凝集性を高められる。なおディッシュの底面の最上面９０がくぼみ９Ｂを有することにより、当該最上面９０がくぼみを有さず平面状である場合に比べて、細胞Ｃ同士の自己凝集性をいっそう高められる。

【0084】

変形例として、図４～図６のウェル９Ａの底面９２上に、図８のようなくぼみ９Ｂが形成されてもよい。これにより、細胞Ｃ同士の自己凝集性をいっそう高められる。

【実施例0085】

本実施の形態の細胞配置の制御方法に基づき、実際にスフェロイドが形成される実験がなされた。当該実験では、図１の塗布装置１００のような複数の塗布液を供給可能な装置を用いて、次のように塗布液が準備された。

【0086】

プレート８は、図３に示す９６個のウェル９Ａを有するマルチウェルプレートが用いられた。ウェル９Ａ内に次に述べる各液滴が供給された。

【0087】

第１塗布液Ａは、第１溶媒としてＲＰＭＩ－１６４０が用いられ、ゲル原料として０．７ｍｇ／ｍＬのコラーゲンｔｙｐｅＩ－Ａが含められた。この溶媒に１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの正常ヒト心臓線維芽細胞が含められた。第２塗布液Ｂは、第２溶媒としてリン酸緩衝生理食塩水（＋）（ＰＢＳ（＋））が用いられた。この溶媒に増粘剤としてのメチルセルロースが含められた。培地Ｍは、ＦＧＭ－３であった。

【0088】

針塗布機構の直径１０００μｍの塗布針（図１の針塗布機構１０４、図２の塗布針２４参照）を用いて、第１塗布液Ａがプレート８の１つのウェル９Ａ内に１個塗布された。次に第１塗布液Ａを覆うように、第２塗布液Ｂが滴下された。第２塗布液Ｂはディスペンサー（図１の滴下機構１０５参照）を用いて滴下された。さらにこれらを覆うように培地Ｍが滴下された。培地Ｍは手動のピペットを用いて滴下された。培地Ｍで細胞を培養することでスフェロイドが構築された。このプロセスは（図を用いた具体的な製造方法の説明）の欄に記載した通りである。

【0089】

図２０は、実施例１における塗布液の塗布直後と、培養後との位相差顕微鏡像である。図２０に示されるように、塗布直後（Ｄａｙ０）に比べ、培養後（Ｄａｙ６）には、塗布液の径が小さくなっている。図２０に示すように、培養により塗布液Ａ内の多数の細胞Ｃが自己凝集し、スフェロイドが得られた。なお上記の径は、塗布液（細胞組織）が球形に近い非球形である場合には、これを同体積の球形であると仮定したときの径として求められる。

【実施例0090】

第１塗布液Ａが複数個塗布されることによりスフェロイドを形成する実験がなされた。本実験に用いられたプレート８、第１塗布液Ａ、第２塗布液Ｂ、培地Ｍの種類は実施例１と同様である。ただし本実験では、第１塗布液Ａが２種類に分けられた。２種類の第１塗布液は、第１塗布液Ａ１および第１塗布液Ａ２（図１０参照）である。セルトラッカーにより、第１塗布液Ａ１に含まれる細胞が赤に染色され、第１塗布液Ａ２に含まれる細胞が緑に染色された。

【0091】

針塗布機構の直径１０００μｍの塗布針（図１の針塗布機構１０４、図２の塗布針２４参照）を用いて、第１塗布液Ａ１がプレート８の１つのウェル９Ａ内に塗布された。次に第１塗布液Ａ１が塗布されたのと同一のウェル９Ａ内の第１塗布液Ａ１の近傍に、第１塗布液Ａ２が塗布された。図２１は、実施例２における第１塗布液Ａ１および第１塗布液Ａ２の塗布態様を示す概略図である。図２１の（Ａ）のように第１塗布液Ａ１と第１塗布液Ａ２とが１個ずつ塗布されたものと、図２１の（Ｂ）のようにこれらが２個ずつ塗布されたものとが準備された。図２１の（Ａ）では第１塗布液Ａ１と第１塗布液Ａ２とが１個ずつたがいに接触するように並んでいる。図２１の（Ｂ）では２個の第１塗布液Ａ１が互いに接触するように並んでいる。２個の第１塗布液Ａ２は、上記２個の第１塗布液Ａ１を挟むように並んでいる。２個の第１塗布液Ａ２はいずれも第１塗布液Ａ１に接触している。一方の第１塗布液Ａ２と他方の第１塗布液Ａ２とは互いに接触していない。この結果、２個の第１塗布液Ａ１と２個の第１塗布液Ａ２とが四辺形の４つの角の部分に配置され、２個の第１塗布液Ａ１がその一方の対角線上に、２個の第１塗布液Ａ２がその他方の対角線上に乗ったような態様を有する。その後、これら双方に対し、実施例１と同様に、第２塗布液Ｂと培地Ｍとが滴下され、細胞Ｃが培養されることでスフェロイドが構築された。

【0092】

図２２は、実施例２における塗布液の塗布直後と、培養後との位相差顕微鏡像および蛍光顕微鏡像である。図２２の（Ａ）は図２１の（Ａ）のように１個ずつの２種類の塗布液が供給された例に対応する。図２２の（Ｂ）は図２１の（Ｂ）のように２個ずつの２種類の塗布液が供給された例に対応する。図２２の（Ａ）、（Ｂ）ともに、左側が位相差顕微鏡像であり、右側が蛍光顕微鏡像である。図２２の（Ａ）に示すように、赤い第１塗布液Ａ１および緑の第１塗布液Ａ２が１個ずつ合計２個塗布された。これにより、赤に染色した細胞組織と緑に染色した細胞組織とが局在した形状のスフェロイドが得られた。図２２の（Ｂ）に示すように、赤い第１塗布液Ａ１および緑の第１塗布液Ａ２が２個ずつ合計４個塗布された。赤に染色した細胞組織が２つ連結して１つのように見えるようになった。この赤の細胞組織を両側から挟むように２つの緑に染色した細胞組織が局在した。これらの各細胞組織が連結して一体となった形状のスフェロイドが得られた。

【0093】

図２２の（Ａ）、（Ｂ）から、本実施の形態の手法により、第１塗布液Ａの個数が２個であっても３個以上（４個）であっても、高い位置精度で細胞が高密度に自己凝集されたスフェロイドを形成することができた。