特開 2025-144141 細胞剥離方法、細胞剥離装置及び細胞凍結保管システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025144141

(43)【公開日】2025-10-02

(54)【発明の名称】細胞剥離方法、細胞剥離装置及び細胞凍結保管システム

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/07 20100101AFI20250925BHJP

   C12N 1/04 20060101ALI20250925BHJP

   C12M 1/26 20060101ALI20250925BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20250925BHJP

【ＦＩ】

C12N5/07

C12N1/04

C12M1/26

C12M1/00 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】19

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024043771

(22)【出願日】2024-03-19

(71)【出願人】

【識別番号】000001007

【氏名又は名称】キヤノン株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】594164542

【氏名又は名称】キヤノンメディカルシステムズ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110003708

【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所

(72)【発明者】

【氏名】樋口 雄飛

(72)【発明者】

【氏名】池田 周平

(72)【発明者】

【氏名】大脇 悠介

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029BB11

4B029CC01

4B029CC02

4B029DG08

4B029GB05

4B065AA90X

4B065BB40

4B065BD09

(57)【要約】

【課題】細胞の損失を低減しつつ培養容器から細胞を回収すること。
【解決手段】 実施形態に係る細胞剥離方法は、剥離工程と回収工程とを有する。剥離工程では、細胞が培養された培養容器の細胞が接している面に対して細胞の凍結保存に用いる液を吐出することにより、細胞を当該面から剥離する。回収工程では、剥離された細胞を、吐出された凍結保存に用いる液と共に回収する。
【選択図】 図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞が培養された培養容器の前記細胞が接している面に向けて前記細胞の凍結保存に用いる液を吐出することにより、前記細胞を前記面から剥離する剥離工程と、
剥離された前記細胞を、吐出された前記凍結保存に用いる液と共に回収する回収工程と、
を具備する細胞剥離方法。

【請求項2】

前記凍結保存に用いる液は、凍結保護剤と培地を含む溶液である、請求項１記載の細胞剥離方法。

【請求項3】

前記凍結保存に用いる溶液は、凍結保護材を含み、
前記凍結保護剤は、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、デキストラン及び／又はトレハロースを含む、請求項１記載の細胞剥離方法。

【請求項4】

前記回収工程では、吐出により生じた泡を避けて、剥離された前記細胞を、吐出された前記凍結保存に用いる液と共に回収する、請求項１記載の細胞剥離方法。

【請求項5】

前記剥離工程では、前記凍結保存に用いる液を前記面に向けて複数の液滴として吐出すること、前記凍結保存に用いる液を前記細胞に吐出すること、又は前記凍結保存に用いる液の送液若しくは振動により発生した水流により、前記細胞を前記面から剥離する、請求項１記載の細胞剥離方法。

【請求項6】

前記剥離工程の前段において、前記面に対する前記細胞の接着を弱めるために、前記培養容器に含まれる前記細胞に剥離液を添加する添加工程を更に備える、請求項１記載の細胞剥離方法。

【請求項7】

前記剥離液は、タンパク質分解酵素及び／又はキレート剤を含む、請求項６記載の細胞剥離方法。

【請求項8】

前記剥離工程の前段において、前記面に前記細胞が接着している前記培養容器を洗浄液で洗浄することにより、前記培養容器から不純物を除去する洗浄工程を更に備える、請求項１記載の細胞剥離方法。

【請求項9】

前記洗浄液は、生理食塩水又は液体培地である、請求項８記載の細胞剥離方法。

【請求項10】

回収された前記細胞と前記凍結保存に用いる液との懸濁液の濃度を所定値に調整するために、前記懸濁液に前記凍結保存に用いる液を追加する追加工程を更に備える、請求項１記載の細胞剥離方法。

【請求項11】

回収された前記細胞が前記凍結保存に用いる液に懸濁された懸濁液を凍結させる凍結工程と、を更に備える、請求項１記載の細胞剥離方法。

【請求項12】

前記凍結工程は、
前記懸濁液を前記細胞が代謝可能な第１の温度域で凍結させる第１の凍結工程と、
前記第１の凍結工程の後、前記懸濁液を前記細胞が代謝不能な、前記第１の温度域に比して低い第２の温度域で凍結保管する第２の凍結工程と、を有する、
請求項１１記載の細胞剥離方法。

【請求項13】

細胞が培養された培養容器の前記細胞が接している面に向けて液を吐出することにより、前記細胞を前記面から剥離する剥離工程と、
剥離された前記細胞を、吐出された前記液と共に回収する回収工程と、
回収された前記細胞と前記液とを凍結させる凍結工程と、
を具備する細胞剥離方法。

【請求項14】

細胞が培養された培養容器の前記細胞が接している面に向けて前記細胞の凍結保存に用いる液を吐出することにより、前記細胞を前記面から剥離する剥離部と、
剥離された前記細胞を、吐出された前記凍結保存に用いる液と共に回収する回収部と、
を具備する細胞剥離装置。

【請求項15】

前記回収部は、
前記凍結保存に用いる液が流通する吸引管と、
前記吸引管に着脱可能に設けられた凍結保管容器と、
前記吸引管を介して、剥離された前記細胞が、吐出された前記凍結保存に用いる液に懸濁された懸濁液を吸引し前記凍結保管容器に送液するポンプと、を有する、
請求項１４記載の細胞剥離装置。

【請求項16】

前記凍結保管容器が収容され、前記凍結保管容器に含まれる前記懸濁液を凍結する冷凍庫を含む凍結部を更に備える、請求項１５記載の細胞剥離装置。

【請求項17】

前記回収部は、更に、前記培養容器における前記吸引管が挿し入れられる第１の位置の前記懸濁液の深さが、他の第２の位置の前記懸濁液の深さに比して深くなるように、前記培養容器を水平に対して傾ける傾動機構を更に備え、
前記ポンプは、前記第１の位置に挿し入れられた前記吸引管を介して前記懸濁液を吸引する、
請求項１５記載の細胞剥離装置。

【請求項18】

前記剥離部は、前記凍結保存に用いる液を前記面に対して噴霧するノズルを有する、請求項１４記載の細胞剥離装置。

【請求項19】

細胞が培養された培養容器の前記細胞が接している面に向けて液を吐出することにより、前記細胞を前記面から剥離する吐出部と、
剥離された前記細胞を、吐出された前記液と共に回収する回収部と、
回収された前記細胞と前記液とを凍結させる凍結部と、
を具備する細胞凍結保管システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書及び図面に開示の実施形態は、細胞剥離方法、細胞剥離装置及び細胞凍結保管システムに関する。

【背景技術】

【0002】

培養容器において細胞を培養した後、生理食塩水や剥離液を用いて培養容器から細胞が剥離される。剥離された細胞を継代せずに長期間保管する場合、剥離された細胞が懸濁された懸濁液（以下、細胞懸濁剥離液）の溶媒を凍結保存液に置換し、細胞が懸濁された凍結保存液（以下、細胞懸濁保存液）を凍結保管している。

【0003】

液置換の一方法として、フィルタを用いた方法（以下、フィルタ液置換法）がある。フィルタ液置換法では、細胞懸濁剥離液をフィルタに通すことにより細胞を捕捉し，当該フィルタに凍結保存液を通すことにより細胞を回収する。しかしながら、フィルタ液置換法では、細胞懸濁剥離液に懸濁されている細胞の多くを回収することができず、細胞の損失が多い。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平９－０５６８１３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本明細書及び図面に開示の実施形態が解決しようとする課題の一つは、細胞の損失を低減しつつ培養容器から細胞を回収することである。ただし、本明細書及び図面に開示の実施形態により解決しようとする課題は上記課題に限られない。後述する実施形態に示す各構成による各効果に対応する課題を他の課題として位置づけることもできる。

【課題を解決するための手段】

【0006】

実施形態に係る細胞剥離方法は、剥離工程と回収工程とを有する。前記剥離工程では、細胞が培養された培養容器の前記細胞が接している面に向けて前記細胞の凍結保存に用いる液を吐出することにより、前記細胞を前記面から剥離する。前記回収工程では、剥離された前記細胞を、吐出された前記凍結保存に用いる液と共に回収する。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１は、細胞凍結保管システムの構成例を示す図である。

【図2】図２は、細胞剥離装置の構成例を示す図である。

【図3】図３は、剥離機構の外観を模式的に示す図である。

【図4】図４は、細胞凍結保管システムによる剥離凍結保管の処理手順の一例を示す図である。

【図5】図５は、図４のステップＳ１～Ｓ８の処理手順を模式的に示す図である。

【図6】図６は、回収工程（Ｓ８）の処理手順を模式的に示す図である。

【図7】図７は、解凍して培養した後のｉＰＳ細胞の細胞数を本実施例と比較例とで比較した図である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

以下、図面を参照しながら、本実施形態に係る細胞剥離方法、細胞剥離装置及び細胞凍結保管システムについて詳細に説明する。

【0009】

図１は、本実施形態に係る細胞凍結保管システム１の構成例を示す図である。図１に示すように、細胞凍結保管システム１は、細胞を凍結して保管する機械システムである。本実施形態に係る細胞は、特に限定されず、如何なる種類の細胞でも良いが、一例として、ｉＰＳ（induced Pluripotent Stem）細胞、上皮細胞、内皮細胞、滑膜細胞、心筋細胞、筋芽細胞、線維芽細胞及び神経芽細胞等であるとする。

【0010】

図１に示すように、細胞凍結保管システム１は、細胞剥離装置１０と凍結保管ユニット２０と恒温器（インキュベータ）３０とを有する。細胞剥離装置１０は、培養容器において培養された細胞を、培養容器から剥離し、剥離された細胞を細胞容器から回収する機械装置である。具体的には、細胞剥離装置１０は、剥離機構１１と回収機構１３と制御装置１５とを有する。剥離機構１１は、培養容器において培養された細胞を、培養容器から剥離するための器具を装備した機械的な機構である。剥離機構１１は、細胞が培養された培養容器の、細胞が接している面（以下、培養面）に向けて、細胞の凍結保存に用いる液（以下、凍結保存液）を吐出することにより、細胞を培養面から剥離する。回収機構１３は、培養容器から剥離された細胞を、培養容器から回収するための器具を装備した機械的な機構である。回収機構１３は、剥離機構１１により剥離された細胞を、吐出された凍結保存液と共に回収する。細胞が懸濁された凍結保存液を細胞懸濁保存液と呼ぶことにする。制御装置１５は、回収機構１３と制御装置１５とを統括的に制御するプロセッサを含むコンピュータである。回収機構１３と制御装置１５とは、制御装置１５からの指令に従い動作する。

【0011】

凍結保管ユニット２０は、細胞剥離装置１００により回収された細胞を凍結したうえで保管する機械システムである。具体的には、凍結保管ユニット２０は、超低温冷凍庫２１と冷凍保管容器２２とを有する。超低温冷凍庫２１は、細胞懸濁保存液を当該細胞が代謝可能な第１の温度域で凍結させる。超低温冷凍庫２１は、断熱の冷凍庫と、当該冷凍庫内への冷媒の循環と当該冷媒の冷却とを行う冷却循環装置とを有する。第１の温度域は、一例として、摂氏－９０度～－５０度程度を想定する。超低温冷凍庫２１は、ディープフリーザとも呼ばれる。冷凍保管容器２２は、超低温冷凍庫２１による第１の凍結工程の後、細胞懸濁保存液を、当該細胞が代謝不能な、第１の温度域に比して低い第２の温度域で凍結保管する。この場合、第２の温度域は、摂氏－２００度～－１５０度程度を想定する。

【0012】

恒温器３０は、培養容器が収容されるチャンバと、当該チャンバ内の温度及び／又は湿度を一定に保つ制御回路とを含む。恒温器３０は、細胞剥離装置１０と別体で構成されても良いし、細胞剥離装置１０が恒温器３０を含んでも良い。後者の場合、一例として、チャンバ内に剥離機構１１と回収機構１３との全部又は一部の構成要素が設けられると良い。当該構成により細胞剥離装置１０にて細胞を培養することが可能である。

【0013】

図２は、細胞剥離装置１０の構成例を示す図である。図２に示すように、細胞剥離装置１０は、剥離機構１１と回収機構１３と制御装置１５とを有する。剥離機構１１と回収機構１３と制御装置１５とは有線又は無線の信号線を介して接続されている。剥離機構１１は、剥離液ポンプ１１１、送液管１１２、洗浄液ポンプ１１３、送液管１１４、凍結保存液ポンプ１１５、送液管１１６、廃液ポンプ１１７、吸引管１１８、駆動機器１１９及び支持機構１２１を有する。

【0014】

図２に示すように、剥離機構１１及び回収機構１３がアクセス可能な位置に培養容器４０が設置されている。培養容器４０において細胞が培養される。培養容器４０の形状は、特に限定されないが、剥離機構１１及び回収機構１３が培養容器４０内にアクセス可能な開口を有するディッシュ、シャーレ、フラスコ、ウェルプレート等を想定する。培養容器４０の内底面を培養面４１と呼ぶ。培養面４１には培養された細胞が接している。剥離機構１１による細胞の剥離処理前においては、培養容器４０に細胞の複数の塊（コロニー）が形成されており、培養面４１に接着している。

【0015】

剥離液ポンプ１１１は、駆動機器１１９からの駆動信号に応答して、送液管１１２を介して剥離液を吐出する。剥離液は、細胞と培養面４１との接着や細胞間の接着を弱める作用を有する。一例として、剥離液は、タンパク質分解酵素及び／又はキレート剤を含む溶液である。剥離液は、図示しない剥離液タンクに収容されている。剥離液ポンプ１１１は、当該剥離液タンクから剥離液を吸引し、吸引された剥離液を、送液管１１２を介して培養容器４０に吐出することにより、培養容器４０に含まれる細胞に剥離液を添加する。

【0016】

送液管１１２は、剥離液ポンプ１１１に接続された、剥離液が流通する筒状構造物であり、例えば、チューブである。送液管１１２は、支持機構１２１により上下動可能に支持されている。支持機構１２１により、送液管１１２は、剥離液の吐出のため、培養面４１に向けて下降し、剥離液の吐出の終了後、上昇する。支持機構１２１は上下動が不可能な態様であってもよい。

【0017】

洗浄液ポンプ１１３は、駆動機器１１９からの駆動信号に応答して、送液管１１４を介して洗浄液を吐出する。洗浄液は、培養容器４０や不純物を洗い流すために使用される。一例として、洗浄液は、生理食塩水又は液体培地が使用される。洗浄液は、図示しない洗浄液タンクに収容されている。洗浄液ポンプ１１３は、当該洗浄液タンクから洗浄液を吸引し、吸引された洗浄液を、送液管１１４を介して培養容器４０に吐出することにより、培養容器４０及び／又は細胞を洗浄する。不純物は、例えば、洗浄液に浮遊している死細胞、培養容器４０の培地に存在するカルシウムイオンやマグネシウムイオンである。洗浄が不十分であると、キレート剤が細胞間の結合を十分に切断できない虞がある。洗浄が不十分であると、培地中に存在するカルシウムイオンやマグネシウムイオンと、キレート剤と、が反応してしまう虞がある。

【0018】

送液管１１４は、洗浄液ポンプ１１３に接続された、洗浄液が流通する筒状構造物であり、例えば、チューブである。送液管１１４は、支持機構１２１により上下動可能に支持されている。支持機構１２１により、送液管１１４は、洗浄液の吐出のため、培養面４１に向けて下降し、洗浄液の吐出の終了後、上昇する。

【0019】

凍結保存液ポンプ１１５は、駆動機器１１９からの駆動信号に応答して、送液管１１４を介して凍結保存液を吐出する。凍結保存液は、細胞を凍結して保管する際、当該細胞への損傷を低減するために使用される。凍結保存液は、凍結保護剤を含む溶液である。凍結保護剤は、細胞の脱水を促進させ、氷の結晶速度を遅らせ、氷の形成を阻害する作用を有する。当該作用により、氷の結晶が細胞の細胞膜を損傷することが抑制される。一例として、凍結保護剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：Dimethyl sulfoxide）、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、デキストラン及び／又はトレハロースを含む。凍結保存液は、STEM-CELLBANKER（登録商標）等の市販の製品が用いられても良いし、培地に凍結保護剤を混ぜた液が用いられても良い。凍結保存液は、図示しない凍結保存液タンクに収容されている。凍結保存液ポンプ１１５は、当該凍結保存液タンクから凍結保存液を吸引し、吸引された凍結保存液を送液管１１６を介して培養容器４０の培養面４１に向けて吐出することにより、培養面４１に接する細胞を培養面４１から剥離する。

【0020】

送液管１１６は、凍結保存液ポンプ１１５に接続された、凍結保存液が流通する筒状構造物であり、例えば、チューブである。送液管１１６は、支持機構１２１により上下動可能に支持されている。支持機構１２１により、送液管１１６の先端部が、凍結保存液の吐出の際、培養面４１に向けて下降し、凍結保存液の吐出の終了後、上昇して培養面４１から遠ざけられる。

【0021】

廃液ポンプ１１７は、駆動機器１１９からの駆動信号に応答して、培養容器４０に含まれる各種廃液を吸引管１１８を介して吸引する。廃液としては、例えば、培養容器４０に吐出された剥離液や洗浄液が想定される。吸引された廃棄は、図示しない廃管を介して廃液タンクに収容される。

【0022】

吸引管１１８は、廃液ポンプ１１７に接続された、廃液が流通する筒状構造物であり、例えば、チューブである。吸引管１１８は、支持機構１２１により上下動可能に支持されている。支持機構１２１により、吸引管１１８は、廃液の吸引のため、培養面４１に向けて下降し、廃液の吸引の終了後、上昇する。

【0023】

駆動機器１１９は、制御装置１５からの指令に従い剥離液ポンプ１１１、洗浄液ポンプ１１３、凍結保存液ポンプ１１５及び廃液ポンプ１１７に駆動信号を個別に供給することにより、当該駆動信号に応じて剥離液ポンプ１１１、洗浄液ポンプ１１３、凍結保存液ポンプ１１５及び廃液ポンプ１１７を作動する。また、駆動機器１１９は、制御装置１５からの指令に従い支持機構１２１に駆動信号を供給することにより、当該駆動信号に応じて送液管１１２、送液管１１４、送液管１１６又は吸引管１１８を上下動する。駆動機器１１９としては、一例として、モータが用いられる。

【0024】

なお、図２において駆動機器１１９は、１台で剥離液ポンプ１１１、洗浄液ポンプ１１３、凍結保存液ポンプ１１５、廃液ポンプ１１７及び支持機構１２１の全部を駆動するものとしたが、本実施形態はこれに限定されない。剥離液ポンプ１１１、洗浄液ポンプ１１３、凍結保存液ポンプ１１５、廃液ポンプ１１７及び支持機構１２１各々に対して駆動機器１１９が設けられても良いし、剥離液ポンプ１１１、洗浄液ポンプ１１３、凍結保存液ポンプ１１５、廃液ポンプ１１７及び支持機構１２１のうちの任意の組合せ毎に駆動機器１１９が設けられても良い。

【0025】

回収機構１３は、回収ポンプ１３１、吸引管１３２、凍結保存容器１３３、駆動機器１３４、傾動機構１３５及び駆動機器１３６を有する。

【0026】

回収ポンプ１３１は、駆動機器１３４からの駆動信号に応答して、吸引管１３２を介して、凍結保存液の吐出により剥離された細胞を凍結保存液と共に回収する。上記の通り、細胞が懸濁された凍結保存液を細胞懸濁保存液と呼ぶ。細胞懸濁保存液は凍結保存容器１３３に収容される。

【0027】

具体的には、吸引管１３２は、回収ポンプ１３１に接続された、細胞懸濁保存液が流通する筒状構造物である。吸引管１３２は、培養容器４０から細胞懸濁保存液を吸引するための吸引枝管１４１と、吸引された細胞懸濁保存液を凍結保存容器１３３に送液するための送液枝管１４２と、吸引された細胞懸濁保存液を吸引枝管１４１から送液枝管１４２に送液するための弁１４３とを有する。弁１４３は、駆動機器１３４からの駆動信号に応答して切り替えられる。

【0028】

吸引枝管１４１は、支持機構１２１により上下動可能に支持されている。支持機構１２１により、吸引枝管１４１の先端部が、細胞懸濁保存液の吸引の際、培養面４１に向けて下降し、細胞懸濁保存液の吸引の終了後、上昇して培養面４１から遠ざけられる。

【0029】

送液枝管１４２には複数個の凍結保存容器１３３が着脱可能に接続されている。吸引枝管１４１に吸引された細胞懸濁保存液は、送液枝管１４２を流通して、複数個の凍結保存容器１３３に順次に収容される。図２においては、一例として、４個の凍結保存容器１３３が接続されている。凍結保存容器１３３は、冷凍保管容器２２による第２の温度域での凍結保管でも破損しない程度の耐久力を有する素材及び／又は構造を有する。一例として、凍結保存容器１３３としては、ポリプロピレン製のクライオチューブやポリオレフィン系の素材のフローズバッグ等が使用されれば良い。なお、送液枝管１４２に接続される凍結保存容器１３３の個数は複数個に限定されず、１個でも良い。

【0030】

駆動機器１３４は、制御装置１５からの指令に従い回収ポンプ１３１に駆動信号を供給することにより、当該駆動信号に応じて回収ポンプ１３１を作動する。駆動機器１３４としては、一例として、モータが用いられる。

【0031】

傾動機構１３５は、駆動機器１３６からの駆動信号に応答して、培養容器４０を水平に対して傾動するための機械的な機構である。具体的には、傾動機構１３５は、培養容器４０において吸引管１３２が挿し入れられる第１の位置の細胞懸濁保管の深さが、他の第２の位置の細胞懸濁保存液の深さに比して深くなるように、培養容器４０を水平に対して傾ける。傾動機構１３５の具体的な構造は特に限定されない。

【0032】

駆動機器１３６は、制御装置１５からの指令に従い傾動機構１３５に駆動信号を供給することにより、当該駆動信号に応じて傾動機構１３５を作動する。駆動機器１３６としては、一例として、モータが用いられる。

【0033】

制御装置１５は、剥離液ポンプ１１１、洗浄液ポンプ１１３、凍結保存液ポンプ１１５、廃液ポンプ１１７、回収ポンプ１３１及び傾動機構１３５を介して細胞の剥離及び回収を自動的に行うために、駆動機器１１９、駆動機器１３４及び駆動機器１３６を予め定められた順序に従い制御する。この際、制御装置１５は、剥離液、洗浄液、凍結保存液、細胞懸濁保存液の吐出及び吸引の流量制御、上記各種液体の吐出及び吸引のタイミング制御等を行う。

【0034】

以下の実施形態の説明において「細胞」はｉＰＳ細胞であるとする。剥離機構１１は、培養面４１に対して凍結保存液を噴霧することにより、培養面４１からｉＰＳ細胞を剥離するものとする。

【0035】

図３は、剥離機構１１の外観を模式的に示す図である。図３に示すように、剥離機構１１は、支持機構１２１を有する。支持機構１２１は、送液管１１２、送液管１１４、送液管１１６、吸引管１１８及び吸引枝管１４１各々を個別に上下動可能に支持する構造体である。一例として、支持機構１２１は、ボールネジやリニアガイド等が使用されれば良い。

【0036】

送液管１１２、送液管１１４、送液管１１６、吸引管１１８及び吸引枝管１４１の下方には載置面５１が設けられ、載置面５１のうちの送液管１１４、送液管１１６、吸引管１１８及び吸引枝管１４１の直下に培養容器４０が設置される。

【0037】

送液管１１６の先端部にはノズル１２３が設けられる。ノズル１２３は、凍結保存液ポンプ１１５により送液管１１６を介して送液された凍結保存液を複数の液滴として吐出するための機械部品である。具体的には、ノズル１２３は、凍結保存液を噴霧、すなわち複数の微小な液滴に変換して霧状に吐出する。凍結保存液を霧状の微小な液滴に変換するため、ノズル１２３には微小な孔が形成される。孔の数は１つでも複数でもよい。凍結保存液ポンプ１１５により送液管１１６を介してノズル１２３に送液された凍結保存液は、ノズル１２３に形成された微小の孔を通過して微小な液滴に形成されて吐出される。これにより凍結保存液が培養容器４０の培養面４１に向けて噴霧され、噴霧された凍結保存液の力学的作用により、培養面４１に接する細胞が剥離されることとなる。なお、凍結保存液の液滴の径や吐出速度、液量、範囲等は、任意に設定可能である。

【0038】

凍結保存液を培養面４１の全面に向けて吐出するため、送液管１１６及びノズル１２３は、培養面４１の略中心Ａ１の略上方に位置するように、支持機構１２１に搭載されると良い。なお、送液管１１６及びノズル１２３は、一体に形成されても良い。

【0039】

載置面５１の下方には傾動機構１３５が埋設される。傾動機構１３５は、空気の出し入れにより膨張及び伸縮するバルーンを想定する。この場合、駆動機器１３６はバルーン１３５に対して空気を出し入れする空気圧縮機やモータシリンダ、エアシリンダ等が想定される。バルーン１３５は培養容器４０の一端部（以下、上昇側端部）４２の下方に設置される。空気圧縮機を用いる場合、空気圧縮機によりバルーン１３５に空気が入り膨張することにより、バルーン１３５が上昇側端部４２を押し上げることにより培養容器４０を傾ける。これにより培養容器４０に含まれる廃液や細胞懸濁保存液等が、培養容器４０の他端部（以下、固定側端部）４３に集まることとなる。固定側端部４３は培養面４１の略中心Ａ１を挟んで上昇側端部４２の反対側にある領域を指す。

【0040】

培養容器４０から溶液を吸引することを容易にするため、吸引管１１８及び吸引枝管１４１は、固定側端部４３の上方に位置するように、支持機構１２１に搭載されると良い。送液管１１２及び送液管１１４の位置は、特に限定されず、送液管１１６、吸引管１１８及び吸引枝管１４１の動作の妨げにならない位置に設けられれば良い。

【0041】

次に、図４及び図５を参照しながら、細胞凍結保管システム１による剥離凍結保管の処理手順について説明する。図４は、細胞凍結保管システム１による剥離凍結保管の処理手順の一例を示す図である。図４のステップＳ１～Ｓ８は、制御装置１５による、剥離機構１１の駆動機器１１９と回収機構１３の駆動機器１３４及び駆動機器１３６とに対するシーケンス制御及び／又はフィードバック制御により自動的に行われる。図５は、図４のステップＳ１～Ｓ８の処理手順を模式的に示す図である。図５においては各工程の説明に必要な構成のみが図示されており、説明に必要ない構成については適宜省略している。なお、恒温器３０と細胞剥離装置１０とは、一体に形成されているものとする。具体的には、恒温器３０のチャンバ内に送液管１１２、送液管１１４、送液管１１６、吸引管１１８及びノズル１２３が設けられているものとする。

【0042】

図４及び図５に示すように、ステップＳ１の開始時点において培養容器４０は載置面５１に載置されている。培養容器４０には、培養されたｉＰＳ細胞のコロニーと当該培養に使用された培地とが収容されている。ｉＰＳ細胞の培養は、恒温器３０により行われても良いし、他の恒温器により行われても良い。

【0043】

まず、培養容器４０から培地が除去される（ステップＳ１）。具体的には、制御装置１５は、駆動機器１１９を介して廃液ポンプ１１７を作動する。廃液ポンプ１１７は、吸引管１１８を介して、培養容器４０から培地を吸引することにより、培養容器４０から培地を除去する。培養容器４０内には、吸引されずに残留した培地等の不純物が残留することとなる。

【0044】

ステップＳ１が行われると、洗浄液でｉＰＳ細胞が洗浄される（ステップＳ２）。培地の中には、ｉＰＳ細胞の他、栄養成分等を含む不純物が含まれている。ステップＳ２において制御装置１５は、駆動機器１１９を介して洗浄液ポンプ１１３を作動する。洗浄液ポンプ１１３は、送液管１１４を介して、培養容器４０内に洗浄液を吐出する。吐出された洗浄液により不純物が洗い流される。その後、廃液ポンプ１１７は、吸引管１１８を介して、培養容器４０から、洗い流された不純物を含む洗浄液を吸引する。これにより培養容器４０やｉＰＳ細胞が洗浄される。

【0045】

ステップＳ２が行われると、剥離液が添加される（ステップＳ３）。ステップＳ３において制御装置１５は、駆動機器１１９を介して剥離液ポンプ１１１を作動する。剥離液ポンプ１１１は、送液管１１２を介して、培養容器４０内に剥離液を吐出する。吐出された剥離液はｉＰＳ細胞に添加される。

【0046】

ステップＳ３が行われると、浸漬処理が行われる（ステップＳ４）。浸漬処理には、インキュベートも含まれうる。インキュベートを含む場合は、具体的には、制御装置１５は、恒温器３０にインキュベートの開始指令を通知する。開始指令を受けて恒温器３０は、所定の恒温期間、剥離液が添加されたｉＰＳ細胞を含む培養容器４０の環境を、一定の温度及び湿度に保つ。一定の温度及び湿度は、ｉＰＳ細胞の培養に適した条件に設定されれば良く、例えば、温度は３７度程度、湿度は９５％程度に設定されれば良い。インキュベートの間、剥離液の作用により、ｉＰＳ細胞間の接着やｉＰＳ細胞と培養面４１との接着が低減される。恒温期間は、接着が十分に低減する時間長として経験的に定められた値に設定されれば良い。恒温期間の経過後、恒温器３０は、温度及び湿度の制御を終了する。インキュベートを含まない場合は、浸漬処理の時間を管理する。浸漬期間は、接着が十分に低減する時間長として経験的に定められた値に設定されれば良い。浸漬期間の経過後、ステップＳ５に進む。ステップＳ４においてインキュベートを行わない場合、恒温器３０は細胞凍結保管システム１に含まれなくても良い。

【0047】

ステップＳ４が行われると、剥離液が除去される（ステップＳ５）。ステップＳ５において制御装置１５は、駆動機器１１９を介して廃液ポンプ１１７を作動する。廃液ポンプ１１７は、吸引管１１８を介して、培養容器４０から剥離液を吸引する。培養容器４０には、吸引されずに残留した剥離液等の不純物が存在することとなる。

【0048】

ステップＳ５が行われると、洗浄液でｉＰＳ細胞が洗浄される（ステップＳ６）。ステップＳ６において制御装置１５は、駆動機器１１９を介して洗浄液ポンプ１１３を作動する。洗浄液ポンプ１１３は、送液管１１４を介して、培養容器４０内に洗浄液を吐出する。吐出された洗浄液により培養容器４０やｉＰＳ細胞に付着する不純物が洗い流される。その後、廃液ポンプ１１７は、吸引管１１８を介して、洗い流された不純物を含む洗浄液を培養容器４０から吸引する。

【0049】

ステップＳ６が行われると、培養容器４０の培養面４１に対して凍結保存液が吐出される（ステップＳ７）。ステップＳ７において制御装置１５は、駆動機器１１９を介して凍結保存液ポンプ１１５を作動する。凍結保存液ポンプ１１５は、送液管１１６及びノズル１２３を介して、凍結保存液を培養面４１に対して噴霧する。剥離剤によりｉＰＳ細胞と培養面４１との接着が弱まっているので、噴霧された凍結保存液の液滴の力学的作用により、ｉＰＳ細胞が培養面４１から剥離されることとなる。

【0050】

ステップＳ７が行われると、ｉＰＳ細胞が懸濁された凍結保存液（細胞懸濁保存液）が、凍結保存容器１３３に回収される（ステップＳ８）。ステップＳ７において制御装置１５は、駆動機器１３４を介して回収ポンプ１３１を作動する。回収ポンプ１３１は、吸引枝管１４１を介して、培養容器４０から細胞懸濁保存液を吸引する。吸引された細胞懸濁保存液は、送液枝管１４２を介して凍結保存容器１３３に送液される。

【0051】

ここで、図６を参照しながら、回収工程（Ｓ８）の詳細について説明する。図６は、回収工程（Ｓ８）の処理手順を模式的に示す図である。図６の左図に示すように、凍結保存液を噴霧することにより、培養容器４０に凍結保存液の泡が発生する。泡は培養容器４０の培養面４１の全体に発生する傾向にある。泡と共にｉＰＳ細胞を凍結保存容器１３３に収容すると、泡の破裂によりｉＰＳ細胞が損傷する虞がある。この虞を低減するため、バルーン１３５により培養容器４０を傾けることにより、泡を避けて、細胞懸濁保存液を吸引する。

【0052】

具体的には、図６の右図に示すように、空気圧縮機１３６は、バルーン１３５を膨らませることにより培養容器４０の上昇側端部４２を持ち上げて傾ける。培養容器４０を傾けることにより、固定側端部４３に細胞懸濁保存液が集まる。その結果、細胞懸濁保存液の深さは、上昇側端部４２に比して固定側端部４３の方が深くなる。泡は軽いので上澄みとなる。固定側端部４３において吸引枝管１４１を下降させ、吸引枝管１４１の先端部を泡よりも深い位置に到達させ、泡を避けるように細胞懸濁保存液を吸引する。泡を避けて細胞懸濁保存液を吸引することにより、培養面４１に噴霧した細胞懸濁保存液のうちの９５％程度を回収できることが見込まれる。

【0053】

ステップＳ８が行われると、細胞懸濁保存液の濃度が調整される（ステップＳ９）。具体的には、凍結保存容器１３３内の細胞懸濁保存液の濃度が所定値になるように、凍結保存容器１３３に凍結保存液が追加される。所定値は、一例として、２００μｌの細胞懸濁保存液に含まれるｉＰＳ細胞の個数が３．０×１０^５個以上７．０×１０^５以下の範囲になる割合である。細胞懸濁保存液の濃度は、フローサイトメータやセルカウンタ、濁度法その他の任意の方法により測定されれば良い。凍結保存液は、凍結保存液ポンプ１１５により送液管１１６を介して凍結保存容器１３３に注入されても良いし、人手により注入されても良い。

【0054】

ステップＳ９が行われると、凍結保存容器１３３が超低温冷凍庫２１に収容され、細胞懸濁保存液が凍結される（ステップＳ１０）。具体的には、作業者等により凍結保存容器１３３が送液枝管１４２から切り離され、超低温冷凍庫２１に収容される。超低温冷凍庫２１は、－８０度程度の第１の温度域に庫内温度を維持する。これによりｉＰＳ細胞を－８０度程度で凍結することが可能である。超低温冷凍庫２１では比較的短時間の所定期間（以下、第１保管期間）だけ保管される。

【0055】

室温に馴染んでいるｉＰＳ細胞を、第１の温度域に比して低く代謝不能な第２の温度域で急激に凍結すれば、凍結保護剤を凍結保存液に含有させていたとしても、ｉＰＳ細胞が損傷する虞がある。この急激な温度低下によるｉＰＳ細胞の損傷を低減するため、一時的に、代謝可能な第１の温度域での凍結が行われる。第１保管期間は、１日程度の比較的短期間が想定される。なお、上記の通り、第１の温度域ではｉＰＳ細胞は代謝が可能であるため、一ヶ月程度が第１保管期間の上限である。

【0056】

ステップＳ１０が行われると、凍結保存容器１３３が冷凍保管容器２２に収容され、細胞懸濁保存液が凍結保管される（ステップＳ１１）。冷凍保管容器２２としては、一例として、液体窒素が充填された断熱容器である液体窒素保存容器が用いられる。この場合、冷凍保管容器２２内は、摂氏－１８０度程度の第２の温度域に維持される。上記の通り、第１の温度域でｉＰＳ細胞を凍結させた後、第２の温度域で凍結させているので、第２の温度域という極低温での凍結によるｉＰＳ細胞の損傷を低減することが可能である。冷凍保管容器２２では比較的長時間の所定期間（以下、第２保管期間）だけ保管される。第２の温度域ではｉＰＳ細胞は代謝が不能であり、数年間保管することが可能である。

【0057】

以上により、細胞凍結保管システム１による剥離凍結保管が終了する。

【0058】

図７は、解凍して培養した後のｉＰＳ細胞の細胞数を本実施例と比較例とで比較した図である。「本実施例」は、上記の通り、凍結保存液を噴霧して剥離し、細胞懸濁保存液に対して液置換を行わずに凍結した。比較例は、生理食塩水を用いて手技で剥離し、ｉＰＳ細胞が懸濁した生理食塩水に対して、遠心分離を用いた液置換を実施し、生理食塩水を凍結保存液に置換した後に凍結した。図７の縦軸は、解凍して培養した後のｉＰＳ細胞の細胞数を表す。図７の横軸は培養条件の分類を表す。「ｎ＝１、Ｐ３＿Ｄａｙ７」はラベル「１」の細胞種のｉＰＳ細胞を、継代数「３」、培養期間「７日間」で培養したことを表す。同様に、「ｎ＝１、Ｐ４＿Ｄａｙ７」はラベル「１」の細胞種のｉＰＳ細胞を、継代数「４」、培養期間「７日間」で培養したことを表し、「ｎ＝２、Ｐ３＿Ｄａｙ７」はラベル「２」の細胞種のｉＰＳ細胞を、継代数「３」、培養期間「７日間」で培養したことを表し、「ｎ＝２、Ｐ４＿Ｄａｙ７」はラベル「２」の細胞種のｉＰＳ細胞を、継代数「４」、培養期間「７日間」で培養したことを表す。

【0059】

図７に示すように、何れの培養条件においても本実施例が比較例に比してｉＰＳ細胞の細胞数が多い。これは、本実施例は、比較例に比して、液置換工程が不要なため、ｉＰＳ細胞の損傷が低減されていることが一要因にあると考えられる。したがって、解凍後のｉＰＳ細胞数の観点から、本実施形態が比較例に比して優れていることが分かる。

【0060】

図４に示す剥離凍結保管の処理手順は、一例であり、発明の趣旨を逸脱しない限り、種々の要素の削除、追加及び／又は変更が可能である。

【0061】

一例として、細胞懸濁保存液の濃度が既に適正である場合や濃度の調整が不要である場合、調整工程（Ｓ９）は省略可能である。他の例として、細胞懸濁保存液を凍結する必要がない場合、凍結工程（Ｓ１０）及び凍結保管工程（Ｓ１１）は省略可能である。他の例として、剥離液の添加をすることなく、凍結保存液を噴霧可能であれば、添加工程（Ｓ３）、インキュベート工程（Ｓ４）、除去工程（Ｓ５）及び洗浄工程（Ｓ６）は省略可能である。

【0062】

他の例として、培養容器４０を傾動する機構１３６は、バルーンを膨張する方法のみに限定されない。一例として、傾動機構１３５は、シリンダの伸長により培養容器４０の上昇側端部４２を押し上げることにより培養容器４０を傾動する機構、ワイヤ等で上昇側端部４２を吊り上げることにより培養容器４０を傾動する機構等でも実現可能である。

【0063】

他の例として、ｉＰＳ細胞の剥離は、凍結保存液の噴霧による方法のみに限定されない。一例として、凍結保存液ポンプ１１５により、送液管１１６を介して凍結保存液をｉＰＳ細胞に吐出し、吐出された凍結保存液の力学的作用によりｉＰＳ細胞を培養面４１から剥離しても良い。他の例として、凍結保存液ポンプ１１５により、送液管１１６を介して凍結保存液を培養容器４０内に送液し、当該送液により発生した水流によりｉＰＳ細胞を培養面４１から剥離しても良い。他の例として、凍結保存液ポンプ１１５により、送液管１１６を介して凍結保存液を培養容器４０内に送液し、傾動機構１３５により培養容器４０を振動し、当該振動により発生した水流によりｉＰＳ細胞を培養面４１から剥離しても良い。

【0064】

他の例として、傾動機構１３５は、廃液ポンプ１１７による各種廃液の吸引時にも使用可能である。具体的には、傾動機構１３５は、廃液ポンプ１１７が吸引管１１８を介して各種廃液を吸引する際、吸引管１１８が挿し込まれる位置の廃液の深さを増加させるために、培養容器４０を傾ける。これにより培養容器４０から各種廃液を容易に回収することが可能である。

【0065】

他の例として、ステップＳ１～Ｓ８の全ての工程を剥離機構１１が実行する必要はなく、ステップＳ１～Ｓ８の一部又は全ての工程を作業員の用手的に実行することも可能である。一例として、吐出工程（Ｓ７）については、作業員がピペット等で凍結保存液を培養面４１に吐出することによりｉＰＳ細胞を培養面４１から剥離しても良い。回収工程（Ｓ８）については、作業員がピペット等で、培養容器４０から細胞懸濁保存液を吸引し、吸引された細胞懸濁保存液を凍結保存容器１３３に吐出することにより、細胞懸濁保存液を回収しても良い。

【0066】

上記の通り、本実施形態に係る細胞剥離方法は、剥離工程と回収工程とを有する。剥離工程では、ｉＰＳ細胞が培養された培養容器のｉＰＳ細胞が接している培養面に向けて細胞の凍結保存液を吐出することにより、ｉＰＳ細胞を培養面から剥離する。回収工程では、剥離されたｉＰＳ細胞を、吐出された凍結保存液と共に回収する。

【0067】

上記の構成によれば、細胞が懸濁された凍結保存液（細胞懸濁保存液）を培養容器から回収することが可能である。換言すれば、回収された細胞懸濁保存液を、そのまま凍結又は凍結保管することが可能であるので、生理食塩水等の剥離用の溶液で細胞を培養面から剥離する場合とは異なり、液置換工程を省略することが可能になる。したがって本実施形態は、液置換工程に要する手間を削減することが可能になる。液置換工程は、細胞懸濁剥離液に懸濁されている細胞の多くを回収することができず細胞の損失が大きいという問題があるが、本実施形態は、培養容器から回収された細胞懸濁保存液をそのまま凍結することが可能であるので、液置換工程に伴う細胞の損失を無くすことが可能である。また、本実施形態は、液置換工程が不要であるので、培養容器から回収された細胞を迅速に凍結することができるので、常温に曝すことに伴う細胞への損傷を、液置換工程を実施する場合に比して低減することが可能である。

【0068】

以上説明した少なくとも１つの実施形態によれば、細胞の損失を低減しつつ培養容器から細胞を回収することができる。

【0069】

上記説明において用いた「プロセッサ」という文言は、例えば、ＣＰＵ、ＧＰＵ、或いは、特定用途向け集積回路（Application Specific Integrated Circuit：ＡＳＩＣ）、プログラマブル論理デバイス（例えば、単純プログラマブル論理デバイス（Simple Programmable Logic Device：ＳＰＬＤ）、複合プログラマブル論理デバイス（Complex Programmable Logic Device：ＣＰＬＤ）、及びフィールドプログラマブルゲートアレイ（Field Programmable Gate Array：ＦＰＧＡ））等の回路を意味する。プロセッサは記憶回路に保存されたプログラムを読み出し実行することで機能を実現する。なお、記憶回路にプログラムを保存する代わりに、プロセッサの回路内にプログラムを直接組み込むよう構成しても構わない。この場合、プロセッサは回路内に組み込まれたプログラムを読み出し実行することで機能を実現する。一方、プロセッサが例えばＡＳＩＣである場合、プログラムが記憶回路に保存される代わりに、当該機能がプロセッサの回路内に論理回路として直接組み込まれる。なお、本実施形態の各プロセッサは、プロセッサごとに単一の回路として構成される場合に限らず、複数の独立した回路を組み合わせて１つのプロセッサとして構成し、その機能を実現するようにしてもよい。さらに、図１及び図２における複数の構成要素を１つのプロセッサへ統合してその機能を実現するようにしてもよい。

【0070】

いくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更、実施形態同士の組み合わせを行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

【符号の説明】

【0071】

１ 細胞凍結保管システム
１０ 細胞剥離装置
１１ 剥離機構
１３ 回収機構
１５ 制御装置
２０ 凍結保管ユニット
２１ 超低温冷凍庫
２２ 冷凍保管容器
３０ 恒温器（インキュベータ）
４０ 培養容器
４１ 培養面
４２ 上昇側端部
４３ 固定側端部
５１ 載置面
１００ 細胞剥離装置
１１１ 剥離液ポンプ
１１２ 送液管
１１３ 洗浄液ポンプ
１１４ 送液管
１１５ 凍結保存液ポンプ
１１６ 送液管
１１７ 廃液ポンプ
１１８ 吸引管
１１９ 駆動機器
１２１ 支持機構
１２３ ノズル
１３１ 回収ポンプ
１３２ 吸引管
１３３ 凍結保存容器
１３４ 駆動機器
１３５ 傾動機構，バルーン
１３６ 駆動機器，空気圧縮機
１４１ 吸引枝管
１４２ 送液枝管
１４３ 弁

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】