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特開2025-14677血管平滑筋細胞指向カプシド、アデノ随伴ウイルスベクター、医薬組成物、治療方法、核酸導入方法、及びカプシド製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025014677
(43)【公開日】2025-01-30
(54)【発明の名称】血管平滑筋細胞指向カプシド、アデノ随伴ウイルスベクター、医薬組成物、治療方法、核酸導入方法、及びカプシド製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20250123BHJP
C07K 14/015 20060101ALI20250123BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250123BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20250123BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20250123BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20250123BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20250123BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250123BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250123BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20250123BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250123BHJP
C12N 15/34 20060101ALN20250123BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C07K14/015 ZNA
C12N5/10
C12P21/02 A
A61P9/00
A61P9/10 101
A61P25/28
A61P43/00 105
A61P29/00
A61K35/76
A61K48/00
C12N15/34
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023117434
(22)【出願日】2023-07-19
(71)【出願人】
【識別番号】505246789
【氏名又は名称】学校法人自治医科大学
(71)【出願人】
【識別番号】504145364
【氏名又は名称】国立大学法人群馬大学
(74)【代理人】
【識別番号】100097113
【弁理士】
【氏名又は名称】堀 城之
(74)【代理人】
【識別番号】100162363
【弁理士】
【氏名又は名称】前島 幸彦
(74)【代理人】
【識別番号】100194283
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 大勇
(72)【発明者】
【氏名】瀬原 吉英
(72)【発明者】
【氏名】今野 歩
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA20
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA93X
4B065AA97X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA361
4C084ZA451
4C084ZB111
4C084ZB211
4C084ZC611
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA05
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA15
4C087ZA36
4C087ZA45
4C087ZB11
4C087ZB21
4C087ZC61
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA01
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】血管平滑筋への感染率を高めた血管平滑筋細胞指向カプシドを提供する。
【解決手段】
アデノ随伴ウイルスのカプシドであり、血管平滑筋細胞への指向性因子が付加されたことを特徴とする。この指向性因子は、ウイルス粒子の表面に提示されるペプチドである。ペプチドは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、「ＲＥＮＫＬＧＥ」「ＫＤＴＶＰＲＥ」「ＴＥＴＧＫＴＡ」「ＳＴＰＡＡＫＥ」「ＲＮＲＥＰＴＥ」「ＡＲＮＧＴＴＥ」「ＫＤＴＡＥＲＱ」「ＮＲＧＧＮＱＤ」「ＮＲＰＤＴＮＳ」「ＴＲＡＴＳＱＥ」のいずれかを含む。ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、「ＮＲＰＥＴＮＰ」「ＳＨＤＰＳＫＥ」「ＳＥＩＲＲＤＱ」「ＮＲＮＫＨＥＥ」「ＲＱＤＮＫＭＥ」「ＴＨＰＰＡＰＱ」「ＴＲＧＧＧＳＥ」「ＴＥＫＱＴＮＳ」「ＲＶＴＭＧＳＥ」「ＡＴＫＮＱＮＥ」のいずれかを含む。
【選択図】図４
【解決手段】
アデノ随伴ウイルスのカプシドであり、血管平滑筋細胞への指向性因子が付加されたことを特徴とする。この指向性因子は、ウイルス粒子の表面に提示されるペプチドである。ペプチドは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、「ＲＥＮＫＬＧＥ」「ＫＤＴＶＰＲＥ」「ＴＥＴＧＫＴＡ」「ＳＴＰＡＡＫＥ」「ＲＮＲＥＰＴＥ」「ＡＲＮＧＴＴＥ」「ＫＤＴＡＥＲＱ」「ＮＲＧＧＮＱＤ」「ＮＲＰＤＴＮＳ」「ＴＲＡＴＳＱＥ」のいずれかを含む。ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、「ＮＲＰＥＴＮＰ」「ＳＨＤＰＳＫＥ」「ＳＥＩＲＲＤＱ」「ＮＲＮＫＨＥＥ」「ＲＱＤＮＫＭＥ」「ＴＨＰＰＡＰＱ」「ＴＲＧＧＧＳＥ」「ＴＥＫＱＴＮＳ」「ＲＶＴＭＧＳＥ」「ＡＴＫＮＱＮＥ」のいずれかを含む。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アデノ随伴ウイルスのカプシドであって、
血管平滑筋細胞への指向性因子が付加された
ことを特徴とする血管平滑筋細胞指向カプシド。
血管平滑筋細胞への指向性因子が付加された
ことを特徴とする血管平滑筋細胞指向カプシド。
【請求項2】
前記指向性因子は、ウイルス粒子の表面に提示されるペプチドである
ことを特徴とする請求項１に記載の血管平滑筋細胞指向カプシド。
ことを特徴とする請求項１に記載の血管平滑筋細胞指向カプシド。
【請求項3】
前記ペプチドは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、「ＲＥＮＫＬＧＥ」（配列番号５）、「ＫＤＴＶＰＲＥ」（配列番号６）、「ＴＥＴＧＫＴＡ」（配列番号７）、「ＳＴＰＡＡＫＥ」（配列番号８）、「ＲＮＲＥＰＴＥ」（配列番号９）、「ＡＲＮＧＴＴＥ」（配列番号１０）、「ＫＤＴＡＥＲＱ」（配列番号１１）、「ＮＲＧＧＮＱＤ」（配列番号１２）、「ＮＲＰＤＴＮＳ」（配列番号１３）、及び「ＴＲＡＴＳＱＥ」（配列番号１４）のアミノ酸配列のいずれかを含む
ことを特徴とする請求項２に記載の血管平滑筋細胞指向カプシド。
ことを特徴とする請求項２に記載の血管平滑筋細胞指向カプシド。
【請求項4】
前記ペプチドは、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、「ＮＲＰＥＴＮＰ」（配列番号１５）、「ＳＨＤＰＳＫＥ」（配列番号１６）、「ＳＥＩＲＲＤＱ」（配列番号１７）、「ＮＲＮＫＨＥＥ」（配列番号１８）、「ＲＱＤＮＫＭＥ」（配列番号１９）、「ＴＨＰＰＡＰＱ」（配列番号２０）、「ＴＲＧＧＧＳＥ」（配列番号２１）、「ＴＥＫＱＴＮＳ」（配列番号２２）、「ＲＶＴＭＧＳＥ」（配列番号２３）、「ＡＴＫＮＱＮＥ」（配列番号２４）のアミノ酸配列のいずれかを含む
ことを特徴とする請求項２に記載の血管平滑筋細胞指向カプシド。
ことを特徴とする請求項２に記載の血管平滑筋細胞指向カプシド。
【請求項5】
請求項１乃至４のいずれかに記載の血管平滑筋細胞指向カプシドを備える
ことを特徴とするアデノ随伴ウイルスベクター。
ことを特徴とするアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項6】
請求項１乃至４のいずれかに記載の血管平滑筋細胞指向カプシドを備える
ことを特徴とする医薬組成物。
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項7】
病気の治療用の組成物が含まれる請求項１乃至４のいずれかに記載の血管平滑筋細胞指向カプシドである
ことを特徴とする医薬組成物。
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項8】
動物の治療方法であって、
請求項１乃至４のいずれかに記載の血管平滑筋細胞指向カプシドにより治療用の組成物を前記血管平滑筋細胞に導入する
ことを特徴とする治療方法。
請求項１乃至４のいずれかに記載の血管平滑筋細胞指向カプシドにより治療用の組成物を前記血管平滑筋細胞に導入する
ことを特徴とする治療方法。
【請求項9】
請求項５に記載のアデノ随伴ウイルスベクターにより、核酸分子を前記血管平滑筋細胞に導入する
ことを特徴とする核酸導入方法。
ことを特徴とする核酸導入方法。
【請求項10】
アデノ随伴ウイルスのカプシド製造方法であって、
血管平滑筋細胞への指向性因子を付加する
ことを特徴とするカプシド製造方法。
血管平滑筋細胞への指向性因子を付加する
ことを特徴とするカプシド製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血管平滑筋細胞を指向するアデノ随伴ウイルスの血管平滑筋細胞指向カプシド、アデノ随伴ウイルスベクター、医薬組成物、治療方法、核酸導入方法、及びカプシド製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ。以下、「ＡＡＶ」という。）は１９６５年の発見以来、病原性がないウイルスとして存在が知られてきた。ＡＡＶは、単独での増殖能力がなく、アデノウイルスやヘルペスウイルス等に依存して宿主細胞内で増殖が可能となるウイルスであり、ヒトにおける病原性を示す報告はない。このため、近年では、ＡＡＶは、病原性がないため安全な遺伝子導入のツールとして、遺伝子治療や再生医療においての活用が期待されている。
従来、１００種類以上の野生型のＡＡＶが同定されている。これらのＡＡＶは、最表面を構成する外被タンパク質（以下、「カプシド」という。）のアミノ酸配列が、それぞれ異なっている。このカプシドのアミノ酸配列の相違が、それぞれのＡＡＶの臓器、細胞種への感染特異性（以下、「指向性（Ｔｒｏｐｉｓｍ）」という。）に関連している。
従来、１００種類以上の野生型のＡＡＶが同定されている。これらのＡＡＶは、最表面を構成する外被タンパク質（以下、「カプシド」という。）のアミノ酸配列が、それぞれ異なっている。このカプシドのアミノ酸配列の相違が、それぞれのＡＡＶの臓器、細胞種への感染特異性（以下、「指向性（Ｔｒｏｐｉｓｍ）」という。）に関連している。
【0003】
特許文献１を参照すると、親ＡＡＶカプシドタンパク質に対して１つ以上の修飾をアミノ酸配列に有し、ＡＡＶビリオン中に存在する場合、未修飾の親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる筋肉細胞の感染性と比較して増加した１種以上の筋肉細胞の感染性をもたらすＡＡＶのカプシドタンパク質が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特表２０２０－５３７５０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、特許文献１に記載のカプシドタンパク質を用いたＡＡＶは、骨格筋については感染性を高めているものの、血管平滑筋への感染率は十分ではなかった。
【0006】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の血管平滑筋細胞指向カプシドは、アデノ随伴ウイルスのカプシドであって、血管平滑筋細胞への指向性因子が付加されたことを特徴とする。
本発明の血管平滑筋細胞指向カプシドは、前記指向性因子は、ウイルス粒子の表面に提示されるペプチドであることを特徴とする。
本発明の血管平滑筋細胞指向カプシドは、前記ペプチドは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、「ＲＥＮＫＬＧＥ」（配列番号５）、「ＫＤＴＶＰＲＥ」（配列番号６）、「ＴＥＴＧＫＴＡ」（配列番号７）、「ＳＴＰＡＡＫＥ」（配列番号８）、「ＲＮＲＥＰＴＥ」（配列番号９）、「ＡＲＮＧＴＴＥ」（配列番号１０）、「ＫＤＴＡＥＲＱ」（配列番号１１）、「ＮＲＧＧＮＱＤ」（配列番号１２）、「ＮＲＰＤＴＮＳ」（配列番号１３）、及び「ＴＲＡＴＳＱＥ」（配列番号１４）のアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする。
本発明の血管平滑筋細胞指向カプシドは、前記ペプチドは、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、「ＮＲＰＥＴＮＰ」（配列番号１５）、「ＳＨＤＰＳＫＥ」（配列番号１６）、「ＳＥＩＲＲＤＱ」（配列番号１７）、「ＮＲＮＫＨＥＥ」（配列番号１８）、「ＲＱＤＮＫＭＥ」（配列番号１９）、「ＴＨＰＰＡＰＱ」（配列番号２０）、「ＴＲＧＧＧＳＥ」（配列番号２１）、「ＴＥＫＱＴＮＳ」（配列番号２２）、「ＲＶＴＭＧＳＥ」（配列番号２３）、「ＡＴＫＮＱＮＥ」（配列番号２４）のアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする。
本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、前記血管平滑筋細胞指向カプシドを備えることを特徴とする。
本発明の医薬組成物は、前記血管平滑筋細胞指向カプシドを備えることを特徴とする。
本発明の医薬組成物は、病気の治療用の組成物が含まれる前記血管平滑筋細胞指向カプシドであることを特徴とする。
本発明の治療方法は、動物の治療方法であって、前記血管平滑筋細胞指向カプシドにより治療用の組成物を前記血管平滑筋細胞に導入することを特徴とする。
本発明の核酸導入方法は、前記アデノ随伴ウイルスベクターにより、核酸分子を前記血管平滑筋細胞に導入することを特徴とする。
本発明のカプシド製造方法は、アデノ随伴ウイルスのカプシド製造方法であって、血管平滑筋細胞への指向性因子を付加することを特徴とする。
本発明の血管平滑筋細胞指向カプシドは、前記指向性因子は、ウイルス粒子の表面に提示されるペプチドであることを特徴とする。
本発明の血管平滑筋細胞指向カプシドは、前記ペプチドは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、「ＲＥＮＫＬＧＥ」（配列番号５）、「ＫＤＴＶＰＲＥ」（配列番号６）、「ＴＥＴＧＫＴＡ」（配列番号７）、「ＳＴＰＡＡＫＥ」（配列番号８）、「ＲＮＲＥＰＴＥ」（配列番号９）、「ＡＲＮＧＴＴＥ」（配列番号１０）、「ＫＤＴＡＥＲＱ」（配列番号１１）、「ＮＲＧＧＮＱＤ」（配列番号１２）、「ＮＲＰＤＴＮＳ」（配列番号１３）、及び「ＴＲＡＴＳＱＥ」（配列番号１４）のアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする。
本発明の血管平滑筋細胞指向カプシドは、前記ペプチドは、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、「ＮＲＰＥＴＮＰ」（配列番号１５）、「ＳＨＤＰＳＫＥ」（配列番号１６）、「ＳＥＩＲＲＤＱ」（配列番号１７）、「ＮＲＮＫＨＥＥ」（配列番号１８）、「ＲＱＤＮＫＭＥ」（配列番号１９）、「ＴＨＰＰＡＰＱ」（配列番号２０）、「ＴＲＧＧＧＳＥ」（配列番号２１）、「ＴＥＫＱＴＮＳ」（配列番号２２）、「ＲＶＴＭＧＳＥ」（配列番号２３）、「ＡＴＫＮＱＮＥ」（配列番号２４）のアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする。
本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、前記血管平滑筋細胞指向カプシドを備えることを特徴とする。
本発明の医薬組成物は、前記血管平滑筋細胞指向カプシドを備えることを特徴とする。
本発明の医薬組成物は、病気の治療用の組成物が含まれる前記血管平滑筋細胞指向カプシドであることを特徴とする。
本発明の治療方法は、動物の治療方法であって、前記血管平滑筋細胞指向カプシドにより治療用の組成物を前記血管平滑筋細胞に導入することを特徴とする。
本発明の核酸導入方法は、前記アデノ随伴ウイルスベクターにより、核酸分子を前記血管平滑筋細胞に導入することを特徴とする。
本発明のカプシド製造方法は、アデノ随伴ウイルスのカプシド製造方法であって、血管平滑筋細胞への指向性因子を付加することを特徴とする。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、血管平滑筋細胞への指向性因子が付加されたことで、血管平滑筋への感染率を従来より高めたＡＡＶを製造可能な血管平滑筋細胞指向カプシドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】本発明の実施例に係る血管平滑筋指向性ＡＡＶの作製方法の概念図である。
【図2】本発明の実施例に係るＡＡＶのカプシド以外プラスミドの構造を示す概念図である。
【図3】本発明の実施例に係るＡＡＶの配列付加カプシドプラスミドの構造を示す概念図である。
【図4】本発明の実施例に係るマウス大動脈平滑筋細胞でのスクリーニング結果を示す写真及びグラフである。
【図5】本発明の実施例に係るヒト脳小血管平滑筋細胞でのスクリーニング結果を示す写真及びグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
＜実施の形態＞
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、長期に安全な遺伝子導入を可能とする。これは、病原性がなく、宿主ゲノムへの組み込みが少ない等の特徴があるためである。また、ＡＡＶベクターは、ヘルパーウイルスの非存在下では増殖しないため、分裂が盛んな細胞では細胞あたりの導入遺伝子コピー数が次第に低下する点も安全性に資する。加えて、ＡＡＶベクターは、長期保存可能であり、分裂細胞、非分裂細胞ともに高効率の遺伝子導入が可能であるという特徴も備えている。
一方、近年、脳小血管病等を含む幅広い疾患において、血管平滑筋に特異的な遺伝子治療の必用性が増している。しかしながら、従来、血管平滑筋への明らかな指向性を持つＡＡＶは存在しなかった。すなわち、従来のＡＡＶベクターは、血管平滑筋への遺伝子導入効率は高いとは言えなかった。さらに、血管平滑筋への遺伝子導入を目指したＡＡＶベクターは、開発されていなかった。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、長期に安全な遺伝子導入を可能とする。これは、病原性がなく、宿主ゲノムへの組み込みが少ない等の特徴があるためである。また、ＡＡＶベクターは、ヘルパーウイルスの非存在下では増殖しないため、分裂が盛んな細胞では細胞あたりの導入遺伝子コピー数が次第に低下する点も安全性に資する。加えて、ＡＡＶベクターは、長期保存可能であり、分裂細胞、非分裂細胞ともに高効率の遺伝子導入が可能であるという特徴も備えている。
一方、近年、脳小血管病等を含む幅広い疾患において、血管平滑筋に特異的な遺伝子治療の必用性が増している。しかしながら、従来、血管平滑筋への明らかな指向性を持つＡＡＶは存在しなかった。すなわち、従来のＡＡＶベクターは、血管平滑筋への遺伝子導入効率は高いとは言えなかった。さらに、血管平滑筋への遺伝子導入を目指したＡＡＶベクターは、開発されていなかった。
【0011】
このため、本発明者らは、鋭意実験を繰り返し、ＡＡＶの表面構造であるカプシドタンパク質のアミノ酸配列を一部ランダムに改変し、培養血管平滑筋細胞に感染させた。そして、この培養血管平滑筋細胞を回収し、解析することによって、血管平滑筋へ遺伝子導入するのに好適な指向性を備えるＡＡＶのアミノ酸の配列を同定した。これにより、血管平滑筋細胞への指向性因子が付加されたＡＡＶのカプシドを作製することに成功した。この血管平滑筋細胞指向カプシドを用いることで、血管平滑筋への明らかな指向性を持つＡＡＶを製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。
【0012】
より詳細に説明すると、野生株のＡＡＶは、主に複製に関わる遺伝子であるＲｅｐ、及び主に表面を構成するカプシドをコードするＣａｐの２つの遺伝子から構成される、直径２５ｎｍの単鎖ＤＮＡウイルスである。さらに、ＡＡＶは自己複製能を持たないため、培養細胞での増殖にはアデノウイルス由来のヘルパー遺伝子を同時に導入する必要がある。
本実施形態においては、ＡＡＶのカプシドのアミノ酸配列の中で、最表層に位置すると予測される部位にランダムな７アミノ酸を挿入し、ＡＡＶを作製した。このＡＡＶを培養血管平滑筋細胞に感染させ、ＡＡＶゲノムを回収し、ＰＣＲで増幅し再度ＡＡＶ作製するというスクリーニングのサイクルを繰り返すことにより、血管平滑筋への遺伝子導入効率に優れたＡＡＶベクターを作製した。
以下、本実施形態に係る血管平滑筋細胞指向カプシド、及びこれを含むＡＡＶ、医薬組成物、治療方法、核酸導入方法、及びカプシド製造方法の詳細について説明する。
本実施形態においては、ＡＡＶのカプシドのアミノ酸配列の中で、最表層に位置すると予測される部位にランダムな７アミノ酸を挿入し、ＡＡＶを作製した。このＡＡＶを培養血管平滑筋細胞に感染させ、ＡＡＶゲノムを回収し、ＰＣＲで増幅し再度ＡＡＶ作製するというスクリーニングのサイクルを繰り返すことにより、血管平滑筋への遺伝子導入効率に優れたＡＡＶベクターを作製した。
以下、本実施形態に係る血管平滑筋細胞指向カプシド、及びこれを含むＡＡＶ、医薬組成物、治療方法、核酸導入方法、及びカプシド製造方法の詳細について説明する。
【0013】
〔血管平滑筋細胞指向カプシド、カプシド製造方法、ＡＡＶベクター〕
本実施形態に係る血管平滑筋細胞指向カプシドは、ＡＡＶのカプシドであって、血管平滑筋細胞への指向性因子が付加されたことを特徴とする。
本実施形態に係る血管平滑筋細胞指向カプシドは、ＡＡＶのカプシドであって、血管平滑筋細胞への指向性因子が付加されたことを特徴とする。
【0014】
本実施形態において、血管平滑筋細胞は、成熟血管を構成する平滑筋の主な細胞である。この血管平滑筋細胞により構成される血管平滑筋は、収縮、弛緩することにより、血管径の調節を行う。平滑筋が収縮すると血管径が細くなり、血圧が上昇する。
【0015】
本実施形態において、血管平滑筋細胞への指向性因子は、ウイルス粒子の表面に提示されるペプチドであってもよい。より具体的には、この血管平滑筋細胞への指向性因子となるペプチドは、ＡＡＶがアセンブルされた後に、カプシドの表面に提示されるものであってもよい。たとえば、このペプチドは、カプシドの表面に提示されることが知られている野生株ＡＡＶ２のＶＰ１ ５８７番目から５８８番目のアミノ酸の間の位置に付加されてもよい。さらに、このペプチドは、カプシドの表面に提示されるのであれば、この位置でなくてもよい。加えて、立体障害を避けるために、リンカーやスペーサー等の配列を介して、このペプチドが付加されていてもよい。このリンカーやスペーサー等の配列としては、例えば、「ＧＧＧＧＳ」×３の配列であるＧＳリンカー等、当業者に一般的な配列であってもよい。
【0016】
より具体的には、本実施形態において、このペプチドは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、例えば、「ＲＥＮＫＬＧＥ」（配列番号５）、「ＫＤＴＶＰＲＥ」（配列番号６）、「ＴＥＴＧＫＴＡ」（配列番号７）、「ＳＴＰＡＡＫＥ」（配列番号８）、「ＲＮＲＥＰＴＥ」（配列番号９）、「ＡＲＮＧＴＴＥ」（配列番号１０）、「ＫＤＴＡＥＲＱ」（配列番号１１）、「ＮＲＧＧＮＱＤ」（配列番号１２）、「ＮＲＰＤＴＮＳ」（配列番号１３）、及び「ＴＲＡＴＳＱＥ」（配列番号１４）のアミノ酸配列のいずれかを含んでいてもよい。このうち、配列番号５、６のペプチドが、特に、マウスの血管平滑筋細胞への指向性が高く、好適に使用可能である。
【0017】
また、本実施形態において、このペプチドは、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の血管平滑筋細胞を感染対象とする場合、例えば、「ＮＲＰＥＴＮＰ」（配列番号１５）、「ＳＨＤＰＳＫＥ」（配列番号１６）、「ＳＥＩＲＲＤＱ」（配列番号１７）、「ＮＲＮＫＨＥＥ」（配列番号１８）、「ＲＱＤＮＫＭＥ」（配列番号１９）、「ＴＨＰＰＡＰＱ」（配列番号２０）、「ＴＲＧＧＧＳＥ」（配列番号２１）、「ＴＥＫＱＴＮＳ」（配列番号２２）、「ＲＶＴＭＧＳＥ」（配列番号２３）、「ＡＴＫＮＱＮＥ」（配列番号２４）のアミノ酸配列のいずれかを含んでいてもよい。このうち、配列番号１５、１６のペプチドが、特に、ヒトの血管平滑筋細胞への指向性が高く、好適に使用可能である。
【0018】
本実施形態に係るカプシド製造方法は、ＡＡＶのカプシド製造方法であって、血管平滑筋細胞への指向性因子を付加することを特徴とする。
すなわち、本実施形態に係る血管平滑筋細胞指向カプシドとして、血管平滑筋細胞への指向性因子、例えば上述のペプチドが付加されたものを作製するように構成することが可能である。このため、本実施形態に係るカプシドが翻訳されるＤＮＡ又はＲＮＡの配列に、上述のペプチドが翻訳されるようなコドンの配列が含まれていてもよい。すなわち、本実施形態に係る指向性因子として、ＡＡＶの製造時に必用なＤＮＡ又はＲＮＡに、このペプチドの配列が翻訳されるようなコドンが含まれていてもよい。このコドンは、例えば、生物種に応じてより翻訳されやすく、下記で示すＡＡＶを製造しやすくするために、最適化されていてもよい。
すなわち、本実施形態に係る血管平滑筋細胞指向カプシドとして、血管平滑筋細胞への指向性因子、例えば上述のペプチドが付加されたものを作製するように構成することが可能である。このため、本実施形態に係るカプシドが翻訳されるＤＮＡ又はＲＮＡの配列に、上述のペプチドが翻訳されるようなコドンの配列が含まれていてもよい。すなわち、本実施形態に係る指向性因子として、ＡＡＶの製造時に必用なＤＮＡ又はＲＮＡに、このペプチドの配列が翻訳されるようなコドンが含まれていてもよい。このコドンは、例えば、生物種に応じてより翻訳されやすく、下記で示すＡＡＶを製造しやすくするために、最適化されていてもよい。
【0019】
また、本実施形態に係るＡＡＶベクターは、この血管平滑筋細胞指向カプシドを備えることを特徴とする。すなわち、本実施形態に係るＡＡＶベクターは、各種のＡＡＶについて、翻訳時に血管平滑筋細胞指向カプシドが生成されて、他のＡＡＶの構成要素とアセンブルされるようなＤＮＡ又はＲＮＡの配列で構成されてもよい。
ここで、本実施形態に係るＡＡＶベクターは、上述のペプチドが付加されたカプシドのＤＮＡ又はＲＮＡの配列を含む単独のＡＡＶベクターとして用意されてもよい。または、下記の実施例で示すように、カプシドが翻訳されないＡＡＶベクターと、上述のペプチドが付加されたカプシドのベクターとに分けて提供されてもよい。
ここで、本実施形態に係るＡＡＶベクターは、上述のペプチドが付加されたカプシドのＤＮＡ又はＲＮＡの配列を含む単独のＡＡＶベクターとして用意されてもよい。または、下記の実施例で示すように、カプシドが翻訳されないＡＡＶベクターと、上述のペプチドが付加されたカプシドのベクターとに分けて提供されてもよい。
【0020】
本実施形態に係るＡＡＶベクターに用いるＡＡＶの種類としては、ＡＡＶ２又はＡＡＶ９が血管平滑筋への指向性を付与するために、特に好適である。これに加えて、複数のＡＡＶを掛け合わせたもの、人工的に生成したＡＡＶ、他の種類のＡＡＶ、突然変異を付加したＡＡＶ等も用いることができる。
【0021】
本実施形態に係るＡＡＶベクター及びＡＡＶの製造方法は、当業者に一般的な手法を用いて、上述のＡＡＶベクターを、アデノウイルスやヘルペスウイルス等に由来するヘルパー遺伝子と供に細胞内で翻訳させてＡＡＶのウイルスパーティクルを生成させ、これを超遠心法等の各種手法で精製して製造することが可能である。
製造されたＡＡＶは、当業者に一般的な手法にて、例えば特定の保存用液に入れて、又は乾燥し、冷蔵、冷凍等して、長期間、保存することが可能である。
製造されたＡＡＶは、当業者に一般的な手法にて、例えば特定の保存用液に入れて、又は乾燥し、冷蔵、冷凍等して、長期間、保存することが可能である。
【0022】
〔医薬組成物〕
本実施形態に係る医療用組成物（医薬、医薬組成物）は、上述の血管平滑筋細胞指向カプシドを備えることを特徴とする。
具体的には、本実施形態に係る医薬組成物は、病気の治療用の組成物が含まれる血管平滑筋細胞指向カプシドであり、この治療用の組成物を血管平滑筋細胞に導入することを特徴とする。すなわち、本実施形態に係る医薬組成物は、血管平滑筋細胞が治療対象となる血管病を治療する物質（治療用の組成物）を、血管平滑筋細胞内に送達する。
本実施形態に係る医療用組成物（医薬、医薬組成物）は、上述の血管平滑筋細胞指向カプシドを備えることを特徴とする。
具体的には、本実施形態に係る医薬組成物は、病気の治療用の組成物が含まれる血管平滑筋細胞指向カプシドであり、この治療用の組成物を血管平滑筋細胞に導入することを特徴とする。すなわち、本実施形態に係る医薬組成物は、血管平滑筋細胞が治療対象となる血管病を治療する物質（治療用の組成物）を、血管平滑筋細胞内に送達する。
【0023】
より具体的には、血管平滑筋細胞指向カプシドを備えたＡＡＶベクターにより、核酸分子を血管平滑筋細胞に導入することを特徴とする。この核酸分子を、血管平滑筋細胞内で、転写、翻訳等させて機能させることで、医薬としての遺伝子治療等の効果を実現できる。すなわち、本実施形態においては、この核酸分子が治療用の組成物であってもよい。これにより、疾病において必用な酵素、構造タンパク質、機能性タンパク質、代謝産物、その他の薬理物質等の治療用のタンパク質を生成させ、又は遺伝子の発現を調節する等して、病態を改善させることが可能となる。また、この核酸分子は、上述の治療用のタンパク質以外にも、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等の核酸分子の医薬を用いることが可能である。また、発現調整の対象とする遺伝子やパスウェイに対する作用を介した遺伝子治療を行うことも可能である。
このように、本実施形態に係るＡＡＶベクターは、病気を治療するツールとすることが可能である。
このように、本実施形態に係るＡＡＶベクターは、病気を治療するツールとすることが可能である。
【0024】
さらに、本実施形態の医薬組成物としては、血管平滑筋細胞指向カプシド内に、核酸以外の治療用の組成物である薬剤を含ませてもよい。この薬剤は、血管平滑筋細胞が関連する下記の各種疾患、疾病、症状（以下、単に「病気」という。）に対する低分子医薬、抗体医薬、神経伝達物質、ホルモン、その他の薬剤、健康増進用の薬剤、栄養剤等であってもよい。すなわち、本実施形態に係る血管平滑筋細胞指向カプシドを、血管平滑筋細胞指向性のあるＤＤＳ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）のように用いることも可能である。
【0025】
本実施形態に係る医療用組成物の対象としては、血管平滑筋細胞に関する病気等であってもよい。
より具体的には、本実施形態に係る医療用組成物は、例えば、脳小血管病（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｓｍａｌｌ Ｖｅｓｓｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、ｃｅｒｅｂｒａｌ ＳＶＤ）に対する治療用に用いることが可能である。
より具体的には、本実施形態に係る医療用組成物は、例えば、脳小血管病（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｓｍａｌｌ Ｖｅｓｓｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、ｃｅｒｅｂｒａｌ ＳＶＤ）に対する治療用に用いることが可能である。
【0026】
本実施形態に係る脳小血管病は、広い概念であり、Ｔｙｐｅ １～Ｔｙｐｅ ６に分類される。Ｔｙｐｅ １は、生活習慣病の動脈硬化症であり、フィブリノイド壊死、脂肪硝子変性、微小粥腫、微小動脈瘤等を代表的病態とする。Ｔｙｐｅ ２は、脳アミロイドアンギオパチーである。Ｔｙｐｅ ３は、遺伝性脳小血管病であり、Ｆａｂｒｙ病、ＣＡＤＡＳＩＬ（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ Ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ Ｉｎｆａｒｃｔ ａｎｄ Ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、ＣＡＲＡＳＩＬ（Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ Ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ Ｓｕｂｃｏｒｔｉｃａｌ Ｉｓｃｈａｅｍｉｃ Ｓｔｒｏｋｅｓ ａｎｄ Ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、ＣＡＲＡＳＡＬ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ａ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｏｋｅｓ ａｎｄ Ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、ＰＡＤＭＡＬ（Ｐｏｎｔｉｎｅ Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ Ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）等である。Ｔｙｐｅ ４は、免疫介在性小血管病であり、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、Ｃｈｕｒｇ Ｓｔｒａｕｓｓ症候群、ＩｇＡ血管炎等である。Ｔｙｐｅ ５は、静脈性膠原線維症（Ｖｅｎｏｕｓ Ｃｏｌｌａｇｅｎｏｓｉｓ）等である。
Ｔｙｐｅ ６は、その他、放射線療法後血管炎、非アミロイド性微小血管変性等である。
より具体的には、本実施形態に係る医療用組成物は、特に、Ｆａｂｙ病、ＣＡＤＡＳＩＬ等の単一遺伝子の異常が先天的に存在する遺伝性脳小血管病の遺伝子治療に用いることが可能である。
Ｔｙｐｅ ６は、その他、放射線療法後血管炎、非アミロイド性微小血管変性等である。
より具体的には、本実施形態に係る医療用組成物は、特に、Ｆａｂｙ病、ＣＡＤＡＳＩＬ等の単一遺伝子の異常が先天的に存在する遺伝性脳小血管病の遺伝子治療に用いることが可能である。
【0027】
加えて、本実施形態に係る医療用組成物は、脳小血管病以外の血管平滑筋細胞に関する病態が生じる病気の治療に用いることも可能である。
これらの病気の治療は、例えば、全身の動脈硬化に関する酸化ＬＤＬのアテローム性プラークを、免疫系等により除去させるものであってもよい。
または、血管平滑筋細胞にβアミロイド等の異常タンパク質が蓄積された場合、これを除去するような治療に用いることも可能である。
さらに、血管の可塑性自体を上昇させたり、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）の透過率の制御をしたりするような治療を行うことも可能である。
これらの病気の治療は、例えば、全身の動脈硬化に関する酸化ＬＤＬのアテローム性プラークを、免疫系等により除去させるものであってもよい。
または、血管平滑筋細胞にβアミロイド等の異常タンパク質が蓄積された場合、これを除去するような治療に用いることも可能である。
さらに、血管の可塑性自体を上昇させたり、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）の透過率の制御をしたりするような治療を行うことも可能である。
【0028】
また、本実施形態に係る医療用組成物は、任意の製剤上許容しうる担体を含んでいてもよい。この担体は、例えば、リポソーム担体、コロイド金粒子、ポリペプチド、リポ多糖類、多糖類、脂質膜等であってもよい。
【0029】
さらに、本実施形態に係る医療用組成物は、製薬上許容される担体として、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等を含んでいてもよい。さらに、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－５０等と共に投与することが可能である。また、適切な賦形剤等を更に含んでもよい。
【0030】
また、本実施形態に係る医療用組成物は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含んでいてもよい。このキャリアは、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。また、キャリアは、乳濁液として提供されてもよい。さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤等の製剤用添加物のいずれか又は任意の組み合わせを含有させてもよい。
【0031】
本実施形態に係る医療用組成物の投与経路は、特に限定されず、非経口的又は経口的に投与を行うことが可能である。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、鼻腔、皮下、真皮内、筋肉内、腹腔内の投与、又は、脳血管等への直接投与が可能である。
本発明の実施の形態に係る血管平滑筋用医薬は、非経口的又は経口的の投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明の実施の形態に係る血管平滑筋用医薬は、非経口的又は経口的の投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
【0032】
本実施形態に係る医療用組成物を上述の治療に用いる際に、投与間隔及び投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
本実施形態に係る医療用組成物の１回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回～数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
本実施形態に係る医療用組成物の１回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回～数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
【0033】
加えて、本実施形態に係る医療用組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
【0034】
〔治療法、創薬方法〕
本実施形態に係る治療方法は、動物の治療方法であって、上述の血管平滑筋細胞指向カプシドを含む医療用組成物を、血管平滑筋細胞に導入することを特徴とする。
遺伝子治療を行う場合は、本実施形態に係る核酸導入方法として、上述の血管平滑筋細胞指向カプシドを含むＡＡＶベクターにより、核酸分子を血管平滑筋細胞に導入してもよい。
または、上述の血管平滑筋細胞指向カプシド内に薬剤を含ませた場合、この薬剤を血管平滑筋細胞に導入することで、病気を治療してもよい。
本実施形態に係る治療方法は、動物の治療方法であって、上述の血管平滑筋細胞指向カプシドを含む医療用組成物を、血管平滑筋細胞に導入することを特徴とする。
遺伝子治療を行う場合は、本実施形態に係る核酸導入方法として、上述の血管平滑筋細胞指向カプシドを含むＡＡＶベクターにより、核酸分子を血管平滑筋細胞に導入してもよい。
または、上述の血管平滑筋細胞指向カプシド内に薬剤を含ませた場合、この薬剤を血管平滑筋細胞に導入することで、病気を治療してもよい。
【0035】
具体的には、本発明の実施の形態に係る血管平滑筋用医薬は、動物の治療を行う動物治療にも用いることが可能である。この動物は、例えば、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット、フェレット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ヒト以外のサルや類人猿の霊長類等の哺乳類であってもよい。また、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含んでいてもよい。
【0036】
すなわち、本発明の実施の形態に係る血管平滑筋用医薬は、ヒトの治療の他に、各種動物の治療、家畜の発育増進等の方法にも用いることができる。
なお、日本を含む医師の行う治療法が産業上の利用可能性がない国では、本実施形態に係る治療法は、ヒトに対する治療を除いてもよい。
なお、日本を含む医師の行う治療法が産業上の利用可能性がない国では、本実施形態に係る治療法は、ヒトに対する治療を除いてもよい。
【0037】
加えて、本発明の実施の形態に係る血管平滑筋用医薬は、動物の体内の一部分、又は動物から摘出または排出された臓器や組織等についても、治療用の対象とすることができる。さらに、この治療は広義の治療であり、バイオリアクター、モデル動物での培養、人体移植様の培養臓器の培養等にも適用可能である。
【0038】
また、本実施形態に係る上述の血管平滑筋細胞指向カプシドを含むＡＡＶベクターにより、核酸分子を血管平滑筋細胞に導入することで、疾患モデル細胞に対して治療したり、疾患モデル細胞自体を作製したりして、創薬に用いることも可能である。この場合、細胞質内にて上述の核酸分子が翻訳されるようにして、疾患モデルに対する医療用組成物の作用を確かめることが可能である。
【0039】
または、本実施形態に係るＡＡＶベクターにより、疾患モデル動物の作製に用いることも可能である。この場合、ＡＡＶの遺伝子は核内に移行しにくいため、逆転写酵素の遺伝子等を含ませて、核内に組み込まれるようにしてもよい。
このようにして、本実施形態に係るＡＡＶベクターを、ヒトの病気の遺伝子治療開発のための創薬用に用いることが可能である。
このようにして、本実施形態に係るＡＡＶベクターを、ヒトの病気の遺伝子治療開発のための創薬用に用いることが可能である。
【0040】
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
従来から、病原性のないＡＡＶベクターによる治療が期待されていた。しかしながら、上述のように、従来のＡＡＶは血管平滑筋への遺伝子導入効率が高いとはいえず、明らかな血管平滑筋指向性を示すものがなかった。このため、血管病を治療するため、血管平滑筋への遺伝子導入を目指したＡＡＶの技術的なニーズがあった。
従来から、病原性のないＡＡＶベクターによる治療が期待されていた。しかしながら、上述のように、従来のＡＡＶは血管平滑筋への遺伝子導入効率が高いとはいえず、明らかな血管平滑筋指向性を示すものがなかった。このため、血管病を治療するため、血管平滑筋への遺伝子導入を目指したＡＡＶの技術的なニーズがあった。
【0041】
これに対して、本実施形態に係る血管平滑筋細胞指向カプシドは、血管平滑筋細胞への指向性因子が付加されたことで、血管平滑筋への感染率を従来より高めたＡＡＶを製造可能となる。すなわち、従来より、血管平滑筋細胞へ遺伝子導入するために優れた指向性を備えたＡＡＶベクターを提供することができる。
【0042】
これにより、血管病を治療するための、血管平滑筋への効果的な遺伝子導入が可能となる。すなわち、本実施形態に係るＡＡＶベクターに任意の遺伝子を搭載し投与することにより、血管平滑筋への遺伝子導入効率の向上が期待できる。また、本実施形態に係るＡＡＶベクターに、病気の治療剤となる物質を搭載し、その治療に利用することができる。よって、血管病に対する効果的な遺伝子治療が期待される。特に、単一遺伝子の異常が先天的に存在する遺伝性脳小血管病の遺伝子治療、脳梗塞等の血管病の治療等に対して、十分な遺伝子の導入により、効果的な治療が期待できる。
また、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶそのものに病原性がなく、自己増殖能を持たない。このため、血管平滑筋のような分裂能に乏しい組織では、長期の発現による治療効果の持続性が期待できる。
また、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶそのものに病原性がなく、自己増殖能を持たない。このため、血管平滑筋のような分裂能に乏しい組織では、長期の発現による治療効果の持続性が期待できる。
【0043】
なお、本発明の実施の形態に係る医薬は、他の組成物等と併用することも可能である。本発明の組成物を、他の組成物と同時に投与、散布、塗布等をしてもよい。
加えて、ＡＡＶベクターを、医薬以外の用途に用いることも可能である。
加えて、ＡＡＶベクターを、医薬以外の用途に用いることも可能である。
【実施例0044】
以下で、本発明の実施の形態に係るＡＡＶベクターについて、実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。
【0045】
〔材料と方法〕
本実施例においては、野生株ＡＡＶ２及びＡＡＶ９を用いて、主にカプシドをコードするＣａｐの領域で、表面に突出していると考えられるカプシドタンパク質ＶＰ１の配列の５８７番目、５８８番目のアミノ酸の位置の間に、ランダムな７アミノ酸を挿入する人工改変を行い、培養血管平滑筋細胞でスクリーニングを行った。
本実施例においては、野生株ＡＡＶ２及びＡＡＶ９を用いて、主にカプシドをコードするＣａｐの領域で、表面に突出していると考えられるカプシドタンパク質ＶＰ１の配列の５８７番目、５８８番目のアミノ酸の位置の間に、ランダムな７アミノ酸を挿入する人工改変を行い、培養血管平滑筋細胞でスクリーニングを行った。
【0046】
具体的に、本実施例では、下記のスクリーニングの工程を複数回、繰り返すことにより、血管平滑筋への指向性を付与されたアデノ随伴ウイルスベクターを作製した：
（１）配列番号１、２、３の配列を用いたコンストラクトにより、ＡＡＶベクターの表面構造であるカプシドタンパク質の一部に、７アミノ酸分のランダム化されたアミノ酸配列を付加にした。
（２）ランダム化されたアミノ酸配列が付加されたカプシドを有するＡＡＶを作製し、培養血管平滑筋細胞に感染させた。
（３）配列番号１、２、４の配列を用いて、当該ＡＡＶが感染した血管平滑筋細胞を回収し、感染ウイルスのカプシドのアミノ酸配列と感染性との関係を解析した。
（４）結果として、血管平滑筋細胞への感染性の高い（指向性の高い、遺伝子導入に優れた）ＡＡＶのカプシドタンパク質に付加するアミノ酸配列を、血管平滑筋細胞への指向性因子として同定した。
以下、このＡＡＶベクターの製造とスクリーニングの詳細について説明する。
（１）配列番号１、２、３の配列を用いたコンストラクトにより、ＡＡＶベクターの表面構造であるカプシドタンパク質の一部に、７アミノ酸分のランダム化されたアミノ酸配列を付加にした。
（２）ランダム化されたアミノ酸配列が付加されたカプシドを有するＡＡＶを作製し、培養血管平滑筋細胞に感染させた。
（３）配列番号１、２、４の配列を用いて、当該ＡＡＶが感染した血管平滑筋細胞を回収し、感染ウイルスのカプシドのアミノ酸配列と感染性との関係を解析した。
（４）結果として、血管平滑筋細胞への感染性の高い（指向性の高い、遺伝子導入に優れた）ＡＡＶのカプシドタンパク質に付加するアミノ酸配列を、血管平滑筋細胞への指向性因子として同定した。
以下、このＡＡＶベクターの製造とスクリーニングの詳細について説明する。
【0047】
（人工改変ＡＡＶ２の作製）
図２によると、Ｃａｐの一部にコードされるＡｓｓｅｍｂｌｙ－Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＰ）もＡＡＶの粒子形成に必要であるため、ＡＡＰを発現させる目的で、ｐＵＣ－ＧＷ－Ａｍｐ ｖｅｃｔｏｒ（Ａｚｅｎｔａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に、ＡＡＶ９（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＹ５３０５７９．１）のＣａｐのカプシドタンパク質読み枠にのみ終止コドンとなる変異があるように改変したプラスミド（ｐＵＣ－ＧＷ－Ａｍｐ＿Ｒｅｐ２＿Ｃａｐ９Ｓｔｏｐ＿ＡＡＰ、６６３３ｂｐ）を準備した（ＧＥＮＥＷＩＺ社に合成依頼）。すなわち、このプラスミドはＲｅｐとＡＡＰを発現するもののカプシドタンパク質は発現しないため、以下「カプシド以外プラスミド」という。
図２によると、Ｃａｐの一部にコードされるＡｓｓｅｍｂｌｙ－Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＡＰ）もＡＡＶの粒子形成に必要であるため、ＡＡＰを発現させる目的で、ｐＵＣ－ＧＷ－Ａｍｐ ｖｅｃｔｏｒ（Ａｚｅｎｔａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に、ＡＡＶ９（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＹ５３０５７９．１）のＣａｐのカプシドタンパク質読み枠にのみ終止コドンとなる変異があるように改変したプラスミド（ｐＵＣ－ＧＷ－Ａｍｐ＿Ｒｅｐ２＿Ｃａｐ９Ｓｔｏｐ＿ＡＡＰ、６６３３ｂｐ）を準備した（ＧＥＮＥＷＩＺ社に合成依頼）。すなわち、このプラスミドはＲｅｐとＡＡＰを発現するもののカプシドタンパク質は発現しないため、以下「カプシド以外プラスミド」という。
【0048】
次に、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１ ５８７番目と５８８番目の間に７アミノ酸のランダム配列を挿入するための鋳型配列を用意した（Ａｚｅｎｔａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社に合成依頼）。。この鋳型配列を、配列番号１に示す。この鋳型配列は、後述するアセンブリのために、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣ＿００１４０１．２の野生株の配列から、制限酵素ＸｈｏＩ認識部位の「ＣＴＣ」の箇所を「ＣＴＴ」に変更し、制限酵素ＨｐａＩでの認識部位を新たに作製するため、「ＧＴＣ」を「ＧＴＴ」に変更したものである。
【0049】
この上で、鋳型配列について、配列番号２に示すＦｗｄプライマー「ＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡ」と、配列番号３に示すＲｅｖプライマー「ＧＣＣＴＴＧＴＧＴＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＣＧＧＴＡＧＣＴＧＣＴＴＧＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＴＧＧＴＡＧＡ」を用いてランダム配列が挿入された直鎖をＰＣＲで増幅した。配列番号３の「Ｎ」の塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかのランダム（任意）となっている。すなわち、２１個の塩基にて、７コドンのランダムなペプチドの翻訳に対応させた。ＰＣＲは、東洋紡社製＃ＫＭＭ－２０１、ＫＯＤ Ｏｎｅ（登録商標）ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、９８℃１０秒、５８℃５秒、６８℃１秒を３０サイクル行ってＰＣＲ産物を得た。
【0050】
図３によると、このＰＣＲ産物を組み込むＡＡＶ２のカプシドのプラスミドであるｐＡＡＶ－２Ｃａｐ－ａｃｃｅｐｔｏｒを用意した（Ａｚｅｎｔａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社に合成依頼）。このプラスミドは、制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｐａＩで処理して直鎖状にした。同様に、上述のＰＣＲ産物も、制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｐａＩで処理して直鎖状にした。これらを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製、＃Ｅ２６２１）で組み換え、環状にした（以下、「配列付加カプシドプラスミド」という。）。
【0051】
同様に、ＡＡＶ９のカプシドのプラスミド、ｐＡＡＶ－９Ｃａｐ－ａｃｃｅｐｔｏｒを用意し（Ａｚｅｎｔａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社に合成依頼）、これにもＰＣＲ産物を組み換えて、配列付加カプシドプラスミドとして作製した。
【0052】
その後、当業者に一般的なＡＡＶ作製方法と同様に、上述の「カプシド以外プラスミド」、及びＡＡＶ２若しくはＡＡＶ９の「配列付加カプシドプラスミド」と、アデノウイルス由来のヘルパープラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）とを、２９３細胞（ＡＴＧＣ社製）にトランスフェクションし、７２時間後にＡＡＶを回収した。これらの作製されたＡＡＶを以下、「ランダム化ＡＡＶ」という。
【0053】
（候補配列のスクリーニング）
作製されたランダム化ＡＡＶは、マウス大動脈平滑筋細胞（ＡＴＣＣ社製、＃ＣＲＬ２７９７）又はヒト脳小血管平滑筋細胞（Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ、ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、＃１１００）が捲かれた培地に投与された。
ＡＡＶの感染が成立した細胞は、蛍光タンパクであるｍＣｈｅｒｒｙを発現する。これを用いて、７２時間後にセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＴＭ） ＩＩセルソーター）で、ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞を回収した。回収した細胞のＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（５０）（Ｑｉａｇｅｎ社製、＃６９５０４）で抽出した。
作製されたランダム化ＡＡＶは、マウス大動脈平滑筋細胞（ＡＴＣＣ社製、＃ＣＲＬ２７９７）又はヒト脳小血管平滑筋細胞（Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ、ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、＃１１００）が捲かれた培地に投与された。
ＡＡＶの感染が成立した細胞は、蛍光タンパクであるｍＣｈｅｒｒｙを発現する。これを用いて、７２時間後にセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＴＭ） ＩＩセルソーター）で、ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞を回収した。回収した細胞のＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（５０）（Ｑｉａｇｅｎ社製、＃６９５０４）で抽出した。
【0054】
抽出したＤＮＡを鋳型として、配列番号２に示すコレクション（回収）用のＦｗｄプライマー「ＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡ」と、配列番号４に示すＲｅｖプライマー「ＡＧＡＡＣＧＣＣＴＴＧＴＧＴＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＣＧ」とを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、東洋紡、＃ＫＭＭ－２０１、ＫＯＤ Ｏｎｅ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、９８℃１０秒、５８℃５秒、６８℃１秒を３０サイクル行った。
この増幅産物は、上述の例と同様に、ＸｈｏＩとＨｐａＩにより制限酵素処理した。この上で、図３のｐＡＡＶ－２Ｃａｐ－ａｃｃｅｐｔｏｒ又は図示しないＡＡＶ９用のｐＡＡＶ－９Ｃａｐ－ａｃｃｅｐｔｏｒのプラスミドを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（登録商標）で組み換えて、環状プラスミドにした。この環状プラスミドは、配列付加カプシドプラスミドの配列でランダム化された配列のいずれかを備えている。
この増幅産物は、上述の例と同様に、ＸｈｏＩとＨｐａＩにより制限酵素処理した。この上で、図３のｐＡＡＶ－２Ｃａｐ－ａｃｃｅｐｔｏｒ又は図示しないＡＡＶ９用のｐＡＡＶ－９Ｃａｐ－ａｃｃｅｐｔｏｒのプラスミドを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（登録商標）で組み換えて、環状プラスミドにした。この環状プラスミドは、配列付加カプシドプラスミドの配列でランダム化された配列のいずれかを備えている。
【0055】
この環状プラスミドを精製し、上述と同様にカプシド以外プラスミド及びヘルパープラスミドと供に培養平滑筋細胞に再度、投与し、感染させた。７２時間後に回収し、上述と同様に、ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞を回収した。この回収した各ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞について、シークエンス解析を行い（ＦＡＳＭＡＣ社にて外注）、カプシドに付加されたペプチド箇所のＤＮＡ配列を確認した。
これらの感染及び回収のサイクルであるスクリーニングを複数回行って、挿入されたペプチドの配列の分布を調べた。以下、１回目のセルソーターでの回収までをスクリーニングの「１回目」、その後の２回目のセルソーターでの回収までを「２回目」、それ以降のスクリーニングを「３回目」、「４回目」……と記載する。
これらの感染及び回収のサイクルであるスクリーニングを複数回行って、挿入されたペプチドの配列の分布を調べた。以下、１回目のセルソーターでの回収までをスクリーニングの「１回目」、その後の２回目のセルソーターでの回収までを「２回目」、それ以降のスクリーニングを「３回目」、「４回目」……と記載する。
【0056】
〔結果〕
（血管平滑筋指向性ＡＡＶ実験結果）
図４は、マウス大動脈平滑筋細胞でのスクリーニング結果を示す。
図４（ａ）は、１回目に回収を行った際に確認したＰＣＲ産物を示す写真である。下線と「２」にて示す、ＤＮＡマーカーのレーンの左２レーンがＡＡＶ２についてのポジティブコントロール、下線と「９」にて示す次の１レーンがＡＡＶ９についてのポジティブコントロールである。このポジティブコントロールは、作製された状態のランダム化ＡＡＶをＰＣＲしてバンドの発現を調べたものである。
左から次の二レーンが、それぞれ、１回目のスクリーニングでｍＣｈｅｒｒｙ陽性の細胞を、セルソーターで回収した際のＡＡＶ２及びＡＡＶ９についてのＰＣＲ産物を示す。それぞれ下線と「２」「９」にて示す。セルソーターで回収した後では、ＡＡＶ２ではバンドが認められたものの、ＡＡＶ９ではバンドが認められなかった。このため、マウス大動脈平滑筋細胞では、ＡＡＶ２のみが感染すると考えられた。
（血管平滑筋指向性ＡＡＶ実験結果）
図４は、マウス大動脈平滑筋細胞でのスクリーニング結果を示す。
図４（ａ）は、１回目に回収を行った際に確認したＰＣＲ産物を示す写真である。下線と「２」にて示す、ＤＮＡマーカーのレーンの左２レーンがＡＡＶ２についてのポジティブコントロール、下線と「９」にて示す次の１レーンがＡＡＶ９についてのポジティブコントロールである。このポジティブコントロールは、作製された状態のランダム化ＡＡＶをＰＣＲしてバンドの発現を調べたものである。
左から次の二レーンが、それぞれ、１回目のスクリーニングでｍＣｈｅｒｒｙ陽性の細胞を、セルソーターで回収した際のＡＡＶ２及びＡＡＶ９についてのＰＣＲ産物を示す。それぞれ下線と「２」「９」にて示す。セルソーターで回収した後では、ＡＡＶ２ではバンドが認められたものの、ＡＡＶ９ではバンドが認められなかった。このため、マウス大動脈平滑筋細胞では、ＡＡＶ２のみが感染すると考えられた。
【0057】
図４（ｂ）は、マウス大動脈平滑筋細胞への感染と回収を行った際の配列の割合を示すグラフである。培養細胞への感染及び回収を行うスクリーニングのサイクルでは、２回目において、頻度で上位２つの配列が占める割合が増加した。すなわち、回収された細胞のうち、これら上位２つのペプチド配列がカプシドに付加されたＡＡＶ２が感染した細胞の割合（頻度）が多かった。具体的には、マウス血管平滑筋細胞によるスクリーニングでは、２回目のスクリーニング時に、上位から頻度順に「ＲＥＮＫＬＧＥ」（配列番号５）、「ＫＤＴＶＰＲＥ」（配列番号６）、「ＴＥＴＧＫＴＡ」（配列番号７）、「ＳＴＰＡＡＫＥ」（配列番号８）、「ＲＮＲＥＰＴＥ」（配列番号９）、「ＡＲＮＧＴＴＥ」（配列番号１０）、「ＫＤＴＡＥＲＱ」（配列番号１１）、「ＮＲＧＧＮＱＤ」（配列番号１２）、「ＮＲＰＤＴＮＳ」（配列番号１３）、及び「ＴＲＡＴＳＱＥ」（配列番号１４）となるアミノ酸配列が、野生株ＡＡＶ２のＶＰ１ ５８７番目及び５８８番目のアミノ酸の間に付加されることが認められた。
また、スクリーニングのサイクルを続けると、頻度で上位２つの配列の割合は、更に多くなったものの、それ以下の配列の頻度は変化することがあった。
また、スクリーニングのサイクルを続けると、頻度で上位２つの配列の割合は、更に多くなったものの、それ以下の配列の頻度は変化することがあった。
【0058】
図５は、ヒト脳小血管平滑筋細胞でのスクリーニング結果を示す。
図５（ａ）は、１回目のスクリーニングでｍＣｈｅｒｒｙ陽性の細胞を、セルソーターで回収した際のＡＡＶ２及びＡＡＶ９についてのＰＣＲ産物を示す写真である。それぞれ、下線と「２」「９」にて示す。上述のマウス大動脈平滑筋細胞と同様に、セルソーターで回収後には、ＡＡＶ２ではバンドが認められたものの、ＡＡＶ９ではバンドが認められなかった。このため、ヒト脳小血管平滑筋細胞においても、ＡＡＶ２のみが感染すると考えられた。
図５（ａ）は、１回目のスクリーニングでｍＣｈｅｒｒｙ陽性の細胞を、セルソーターで回収した際のＡＡＶ２及びＡＡＶ９についてのＰＣＲ産物を示す写真である。それぞれ、下線と「２」「９」にて示す。上述のマウス大動脈平滑筋細胞と同様に、セルソーターで回収後には、ＡＡＶ２ではバンドが認められたものの、ＡＡＶ９ではバンドが認められなかった。このため、ヒト脳小血管平滑筋細胞においても、ＡＡＶ２のみが感染すると考えられた。
【0059】
図５（ｂ）は、図４（ｂ）と同様に、ヒト脳小血管平滑筋細胞についての感染と回収を行った際の配列の割合を示すグラフである。このヒト脳小血管平滑筋細胞でのスクリーニングのサイクルでは、１回目から頻度で上位２つの配列が占める割合が多かった。具体的には、ヒト血管平滑筋細胞によるスクリーニングでは、２回目のスクリーニング時に上位から頻度順に、「ＮＲＰＥＴＮＰ」（配列番号１５）、「ＳＨＤＰＳＫＥ」（配列番号１６）、「ＳＥＩＲＲＤＱ」（配列番号１７）、「ＮＲＮＫＨＥＥ」（配列番号１８）、「ＲＱＤＮＫＭＥ」（配列番号１９）、「ＴＨＰＰＡＰＱ」（配列番号２０）、「ＴＲＧＧＧＳＥ」（配列番号２１）、「ＴＥＫＱＴＮＳ」（配列番号２２）、「ＲＶＴＭＧＳＥ」（配列番号２３）、「ＡＴＫＮＱＮＥ」（配列番号２４）となるアミノ酸配列が、野生株ＡＡＶ２ ＶＰ１ ５８７番目と５８８番目アミノ酸の間に付加されることが認められた。また、スクリーニングのサイクルを続けると、頻度で上位２つの配列の割合は、更に多くなり、ほぼ支配的になった。
【0060】
以上のように、これらのペプチドのコドンに対応する配列をＡＡＶに人工的に挿入することにより、血管平滑筋に優れた遺伝子導入効率が得られた。
【0061】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【0062】
本発明によれば、血液中に存在するＡＡＶベクターを血管平滑筋特異的バイオマーカーとして用いることで、血管平滑筋の早期診断と治療用の医薬の提供が期待でき、産業上利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】