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特開2025-148269肥満を治療するための単独又は併用療法としてのレプチン受容体アゴニスト抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025148269
(43)【公開日】2025-10-07
(54)【発明の名称】肥満を治療するための単独又は併用療法としてのレプチン受容体アゴニスト抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20250930BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20250930BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20250930BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20250930BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250930BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250930BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250930BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250930BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250930BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250930BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250930BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250930BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20250930BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20250930BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250930BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C07K7/06 ZNA
C07K7/08
C07K14/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/13
C12N15/63 Z
A61K39/395 N
A61K48/00
A61K45/00
A61P3/04
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【請求項の数】51
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2025037068
(22)【出願日】2025-03-10
(31)【優先権主張番号】63/566,017
(32)【優先日】2024-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(74)【代理人】
【識別番号】100221523
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 渉
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(72)【発明者】
【氏名】アイ，ミンロン
(72)【発明者】
【氏名】ブリエール，ダニエル エイ
(72)【発明者】
【氏名】ケイン，ポール エフ
(72)【発明者】
【氏名】チルトン，トッド シー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に対するアゴニスト活性を有し、肥満を治療するための治療剤として使用することができる抗体を提供する。
【解決手段】レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合してこれを刺激させる抗体を提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、特定の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のうちの少なくとも１つ、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【選択図】なし
【解決手段】レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合してこれを刺激させる抗体を提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、特定の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のうちの少なくとも１つ、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する抗体であって、前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨが、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬが、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
ａ）前記ＨＣＤＲ１が配列番号７を含み、
ｂ）前記ＨＣＤＲ２が配列番号８を含み、
ｃ）前記ＨＣＤＲ３が配列番号９を含み、
ｄ）前記ＬＣＤＲ１が配列番号１又は２を含み、
ｅ）前記ＬＣＤＲ２が配列番号３を含み、
ｆ）前記ＬＣＤＲ３が配列番号４、５又は６を含む、
レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する抗体。
ａ）前記ＨＣＤＲ１が配列番号７を含み、
ｂ）前記ＨＣＤＲ２が配列番号８を含み、
ｃ）前記ＨＣＤＲ３が配列番号９を含み、
ｄ）前記ＬＣＤＲ１が配列番号１又は２を含み、
ｅ）前記ＬＣＤＲ２が配列番号３を含み、
ｆ）前記ＬＣＤＲ３が配列番号４、５又は６を含む、
レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する抗体。
【請求項2】
ａ）前記ＬＣＤＲ１が配列番号１を含み、前記ＬＣＤＲ３が配列番号５を含む、
ｂ）前記ＬＣＤＲ１が配列番号１を含み、前記ＬＣＤＲ３が配列番号４を含む、
ｃ）前記ＬＣＤＲ１が配列番号２を含み、前記ＬＣＤＲ３が配列番号５を含む、
ｄ）前記ＬＣＤＲ１が配列番号１を含み、前記ＬＣＤＲ３が配列番号６を含む、
請求項１に記載の抗体。
ｂ）前記ＬＣＤＲ１が配列番号１を含み、前記ＬＣＤＲ３が配列番号４を含む、
ｃ）前記ＬＣＤＲ１が配列番号２を含み、前記ＬＣＤＲ３が配列番号５を含む、
ｄ）前記ＬＣＤＲ１が配列番号１を含み、前記ＬＣＤＲ３が配列番号６を含む、
請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスを有する、請求項１～２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１サブクラスを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
前記ＶＨが配列番号１８を含み、前記ＶＬが配列番号１６を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
前記抗体が、配列番号１９を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１７を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体が、配列番号１９からなる重鎖（ＨＣ）と、配列番号１７からなる軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
前記ＶＨが配列番号１８を含み、前記ＶＬが配列番号１０を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項9】
前記抗体が、配列番号１９を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１１を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１～４及び８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項10】
前記抗体が、配列番号１９からなる重鎖（ＨＣ）と、配列番号１１からなる軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１～４及び８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項11】
前記ＶＨが配列番号１８を含み、前記ＶＬが配列番号１２を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項12】
前記抗体が、配列番号１９を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１３を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１～４及び１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項13】
前記抗体が、配列番号１９からなる重鎖（ＨＣ）と、配列番号１３からなる軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１～４及び１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項14】
前記ＶＨが配列番号１８を含み、前記ＶＬが配列番号１４を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項15】
前記抗体が、配列番号１９を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１５を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１～４及び１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項16】
前記抗体が、配列番号１９からなる重鎖（ＨＣ）と、配列番号１５からなる軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１～４及び１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項17】
前記抗体が、１Ｅ－１０Ｍ～３．０Ｅ－８Ｍの解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＬＥＰＲに結合する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項18】
前記抗体が、１Ｅ－１０～５．０Ｅ－７Ｍの解離平衡定数（ＫＤ）でカニクイザルＬＥＰＲに結合する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項19】
前記抗体が、１Ｅ－１０Ｍ～５．０Ｅ－６Ｍの解離平衡定数（ＫＤ）でイヌＬＥＰＲに結合する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項20】
前記ＫＤが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって決定される、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項21】
前記抗体が、０．４０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（ヒト）を有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項22】
前記抗体が、２．０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（カニクイザル）を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項23】
前記抗体が、１．０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（イヌ）を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項24】
前記ＥＣ５０がｐＳＴＡＴ３アッセイによって決定される、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項25】
前記抗体が、ヒトレプチンと比較して、ヒトＬＥＰＲの５５％～６５％のアゴニズムを提供する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項26】
前記抗体が、ヒトレプチンと比較して、カニクイザルＬＥＰＲの２０％～３０％のアゴニズムを提供する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項27】
前記抗体が、ヒトレプチンと比較して、イヌＬＥＰＲの６５％～８５％のアゴニズムを提供する、請求項１～２６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項28】
前記アゴニズムがｐＳＴＡＴ３アッセイによって決定される、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項29】
配列番号１～２０の少なくとも１つをコードする配列を含む核酸。
【請求項30】
請求項２９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項31】
請求項３０に記載のベクターを含む細胞。
【請求項32】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項33】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項34】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体と、第２の治療剤とを含む医薬組成物。
【請求項35】
前記第２の治療剤が、配列番号４０～４７のいずれか１つに示される薬剤を含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項36】
前記第２の治療剤が、配列番号５０～５１のいずれか１つに示される薬剤を含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項37】
前記第２の治療剤がＧＬＰ－１アゴニスト活性を含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項38】
前記第２の治療剤が、前記ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体のデュアルアゴニストである、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項39】
前記ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体のデュアルアゴニストが配列番号５４を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項40】
前記第２の治療剤が配列番号５６を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項41】
肥満の治療において配列番号３９～５７から選択される第２の治療剤と組み合わせて、同時、別個又は逐次使用するための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項42】
肥満の治療において請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体と組み合わせて、同時、別個又は逐次使用するための配列番号３９～５７から選択される治療剤。
【請求項43】
肥満の治療を必要とする対象において肥満を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～２８及び３３～４０のいずれか一項に記載の抗体又は組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項44】
治療に使用するための、請求項１～２８及び３３～４０のいずれか一項に記載の抗体又は組成物。
【請求項45】
肥満の治療において使用するための、請求項１～２８及び３３～４０のいずれか一項に記載の抗体又は組成物。
【請求項46】
肥満の治療に使用するための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項47】
肥満を治療するための医薬品の製造における、請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項48】
リポジストロフィー障害の治療を必要とする対象においてリポジストロフィー障害を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項49】
リポジストロフィー障害の治療における使用のための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項50】
リポジストロフィー障害の治療における使用のための、請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項51】
リポジストロフィー障害を治療するための医薬品の製造における、請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、レプチン受容体アゴニスト抗体及びそれに関連する治療法に関する。
【背景技術】
【0002】
レプチンは、脂肪細胞によって産生され、放出される循環ホルモンである。レプチンは、代謝及び食欲を調節するために視床下部のニューロンによって発現されるその受容体（ＬＥＰＲ（ＯＢ－Ｒとも呼ばれる））を介してシグナル伝達する。ＬＥＰＲは、クラスＩサイトカイン受容体ファミリーの細胞表面シングルパス膜貫通受容体である。レプチン結合によるＬＥＰＲの活性化は、細胞内Ｊａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）を活性化し、下流のエフェクタータンパク質のリン酸化をもたらす。
【0003】
レプチン又はＬＥＰＲ遺伝子における機能喪失変異は、肥満の重度の幼児期発症を引き起こす。組換えレプチンタンパク質（メトレレプチン）は、レプチン欠損患者及びリポジストロフィー患者の症状を治療するために承認された。メトレレプチン治療はまた、低循環レプチンを有するヒトにおいて体重を減少させることが示され（Ｄｅｐａｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１８ Ｊｕｌ ６７：２９６－ＬＢ）、非アルコール性脂肪性肝炎患者の肝臓の病態を改善する（Ａｋｉｎｃｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄ．２０２１ Ｊｕｌ ９；２（７）：８１４－８３５）。しかしながら、その短い半減期、有害な副作用及び抗レプチン自己抗体の開発のために、メトレレプチンは臨床における適用が制限されている。更に、一般的な肥満の患者は、レプチン抵抗性のためにメトレレプチン治療に応答しない。（Ｆａｒｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｅｎｄｏ Ｄｉａｂ Ｏｂｅｓ．２０１５；２２（５）：３５３－３５９）。
【0004】
更に、ＬＥＰＲ抗体は、国際公開第２０１７０６６２０４（Ａ１）号及び国際公開第２０１９１９５７９６（Ａ１）号に報告されている。しかしながら、望ましい結合親和性でいくつかの種のＬＥＰＲに結合し、いくつかの種のＬＥＰＲを活性化し、Ｆｃγ受容体の結合に関して有益な特性を示し、ＬＥＰＲシグナル伝達を脱感作せず、シグナル伝達欠損ＬＥＰＲを活性化し、及び／又は二次治療剤と有利に組み合わせることができるＬＥＰＲアゴニスト抗体が依然として必要とされている。
【0005】
したがって、ＬＥＰＲ経路を刺激するための新しい治療剤は、臨床応用を著しく広げるであろう。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合してこれを刺激させる抗体を提供する。
【0007】
一実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８及び９のうちの少なくとも１つから選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のうちの少なくとも１つ、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【0008】
一実施形態では、抗体は、配列番号７を有するＨＣＤＲ１、配列番号８を有するＨＣＤＲ２、配列番号９を有するＨＣＤＲ３、配列番号１又は２を有するＬＣＤＲ１、配列番号３を有するＬＣＤＲ２、及び配列番号４、５、又は６を有するＬＣＤＲ３を含む。
【0009】
一実施形態では、抗体は、配列番号１を有するＬＣＤＲ１と、配列番号５を有するＬＣＤＲ３とを含む。一実施形態では、抗体は、配列番号１を有するＬＣＤＲ１と、配列番号４を有するＬＣＤＲ３とを含む。一実施形態では、抗体は、配列番号２を有するＬＣＤＲ１と、配列番号５を有するＬＣＤＲ３とを含む。一実施形態では、抗体は、配列番号１を有するＬＣＤＲ１と、配列番号６を有するＬＣＤＲ３とを含む。
【0010】
一実施形態では、抗体は、配列番号１０、１２、１４、１６、及び１８から選択されるＶＨ及びＶＬ配列、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【0011】
一実施形態では、本開示は、配列番号１８に示されるＶＨ及び配列番号１０に示されるＶＬを有する抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号１８に示されるＶＨ及び配列番号１２に示されるＶＬを有する抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号１８に示されるＶＨ及び配列番号１４に示されるＶＬを有する抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号１８に示されるＶＨ及び配列番号１６に示されるＶＬを有する抗体を提供する。
【0012】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はＩｇＧ４サブクラスである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１サブクラスである。
【0013】
一実施形態では、抗体は、配列番号１１、１３、１５、１７、及び１９から選択されるＨＣ及びＬＣ配列、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【0014】
一実施形態では、本開示は、配列番号１９に示されるＨＣ及び配列番号１１に示されるＬＣを有する抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号１９に示されるＨＣ及び配列番号１３に示されるＬＣを有する抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号１９に示されるＨＣ及び配列番号１５に示されるＬＣを有する抗体を提供する。一実施形態では、本開示は、配列番号１９に示されるＨＣ及び配列番号１７に示されるＬＣを有する抗体を提供する。
【0015】
別の態様において、本開示は、本開示の抗体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本開示の抗体及び第２の治療剤を含む。第２の治療剤は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性を有する薬剤、アミリン受容体アゴニスト活性を有する薬剤、カルシトニン受容体アゴニスト活性を有する薬剤、グルカゴン受容体アゴニスト活性を有する薬剤から選択される。一実施形態では、第２の治療剤は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性及びＧＩＰ受容体アゴニスト活性を有する。別の実施形態では、第２の治療剤は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性、ＧＩＰ受容体アゴニスト活性、及びグルカゴン受容体アゴニスト活性を有する。
【0016】
別の態様では、本開示は、レプチン受容体に関連する疾患又は障害を治療する方法を提供する。一実施形態では、疾患又は障害は、レプチン欠損、レプチン抵抗性に関連するか又はそれによって媒介されるか、又はそうでなければＬＥＰＲを刺激させることによって治療可能である。別の実施形態では、疾患又は障害は、肥満を含む。この態様による方法は、単剤療法又は併用療法として本開示の抗体を投与することを含む。
【0017】
併用療法の場合、本開示の抗体は、第２の治療剤と組み合わせて、同時に、別々に、又は逐次投与される。第２の治療剤は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性、アミリン受容体アゴニスト活性、又はグルカゴン受容体アゴニスト活性を有する薬剤を含む。一実施形態では、第２の治療薬は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性及びＧＩＰ受容体アゴニスト活性を有する。別の実施形態では、第２の治療剤は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性、ＧＩＰ受容体アゴニスト活性、及びグルカゴン受容体アゴニスト活性を有する。
【0018】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、配列番号３９～５７から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】ヒトＬＥＰＲに対する本開示の例示的抗体の結合を示す。
【図2】レプチンタンパク質の存在下におけるｈＬｅｐＲへの本開示の例示的抗体の結合を、対照のパーセンテージとして示す。
【図3】本開示の例示的抗体のＣ１ｑ結合を示す。
【図4】レプチン受容体アゴニストと組み合わせてＧＬＰ－１受容体アゴニストを投与した食餌誘導性肥満マウスの、対照と比較した体重パーセントを示す。
【図5】レプチン受容体アゴニストと組み合わせてデュアルＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲアゴニストを投与した食餌誘導性肥満マウスの、対照と比較した体重パーセントを示す図である。
【図6】レプチン受容体アゴニストと組み合わせてＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニストを投与した食餌誘導性肥満マウスの、対照と比較した体重パーセントを示す。
【図7】レプチン受容体アゴニストと組み合わせてグルカゴン受容体アゴニストを投与した食餌誘導性肥満マウスの、対照と比較した体重パーセントを示す。
【図8】レプチン受容体アゴニストと組み合わせてアミリン受容体アゴニストを投与した食餌誘導性肥満マウスの、対照と比較した体重パーセントを示す。
【図9】アミリン受容体アゴニスト又はアミリン及びカルシトニン受容体コアゴニストのいずれかと組み合わせてレプチン受容体アゴニストを投与した食餌誘導性肥満マウスの、対照と比較した体重パーセントを示す。
【図10】本明細書に開示される例示的抗体を投与したカニクイザルの、対照と比較した体重パーセントを示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本開示は、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合し、これを刺激させる抗体を提供する。本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、ＬＥＰＲは、配列番号２８に示されるようなヒトレプチン受容体（ｈＬｅｐＲ）を指す。ヒトＬＥＰＲの細胞外ドメインを配列番号２９に示す。
【0021】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体の実施形態には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）、抗体断片、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性若しくは多重特異性抗体、又はコンジュゲート抗体が含まれる。抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）、及び任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であってもよい。
【0022】
本開示の例示的な抗体は、４つのポリペプチド鎖：鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）から構成された、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型抗体である。４つのポリペプチド鎖の各々のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１２５個以上のアミノ酸の可変領域を含む。４つのポリペプチド鎖のそれぞれのカルボキシル末端部分は、エフェクター機能及び抗体リサイクルを主に担う定常領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域から構成される。ＩｇＧアイソタイプは、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に更に分割されてもよい。
【0023】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はＩｇＧ４サブクラスである。
【0024】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１サブクラスである。
【0025】
ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）と呼称される、より保存されている領域が散在する、相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼称される、超可変領域に更に細分され得る。ＣＤＲはタンパク質の表面上に露出しており、抗原結合特異性のための抗体の重要な領域である。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。本明細書では、重鎖の３つのＣＤＲを「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３」と称し、軽鎖の３つのＣＤＲを「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。アミノ酸残基のＣＤＲへの割り当ては、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８７，１９６：９０１－９１７；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９７，２７３：９２７－９４８）、Ｎｏｒｔｈ（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１）、又はＩＭＧＴ（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：２０９－２１２を参照のこと）に記載されるものを含む、周知のスキームに従って行われてもよい。特に明記しない限り、Ｎｏｒｔｈ ＣＤＲの定義は、本明細書に記載のヒトＬＥＰＲに結合する抗体に使用される。
【0026】
本開示の実施形態にはまた、本明細書で使用される場合、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ｓｃＦａｂ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、又はＦｄ断片などの、抗原又は抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の少なくとも一部分を含む、抗体断片又は抗原結合断片が含まれる。
【0027】
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原又は抗原のエピトープに結合する分子の一部を指す。
【0028】
本明細書で使用される「二重特異性」という用語は、２つの異なる抗原結合ドメインを含む分子を指す。二重特異性結合分子は、２つの異なる抗原又は同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。本開示の実施形態はまた、ＬＥＰＲに結合する二重特異性抗体を含む。
【0029】
本開示は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＶＨを提供し、これらは次に重鎖（ＨＣ）を含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９の少なくとも１つを含むＶＨを提供する。
【0031】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ＨＣＤＲ１（配列番号７）、ＨＣＤＲ２（配列番号８）及びＨＣＤＲ３（配列番号９）のうちの少なくとも１つを含むＶＨを提供する。例示的なＶＨは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0032】
ＨＣＤＲ１（配列番号７）、ＨＣＤＲ２（配列番号８）、及びＨＣＤＲ３（配列番号９）を有する例示的なＨＣは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１に示されるＬＣＤＲ１及び配列番号５に示されるＬＣＤＲ３を有する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３に示されるＬＣＤＲ２を更に含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１、配列番号３及び配列番号５を含むＶＬを提供する。例示的なＶＬを配列番号１６に示す。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0035】
配列番号１、配列番号３及び配列番号５を有する例示的なＬＣは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一である配列を含む。
【0036】
一実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１９を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１７を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【0037】
一実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１９からなる重鎖（ＨＣ）と、配列番号１７からなる軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１及び配列番号４を有する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３に示されるＬＣＤＲ２を更に含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１、配列番号３及び配列番号４を含むＶＬを提供する。例示的なＶＬを配列番号１０に示す。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0040】
配列番号１、配列番号３及び配列番号４を有する例示的なＬＣは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一である配列を含む。
【0041】
一実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１９を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１１を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【0042】
一実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１９からなる重鎖（ＨＣ）と、配列番号１１からなる軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２及び配列番号５を有する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３に示されるＬＣＤＲ２を更に含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２、配列番号３及び配列番号５を含むＶＬを提供する。例示的なＶＬを配列番号１２に示す。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0045】
配列番号２、配列番号３及び配列番号５を有する例示的なＬＣは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一である配列を含む。
【0046】
一実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１９を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１３を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【0047】
一実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１９からなる重鎖（ＨＣ）と、配列番号１３からなる軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１及び配列番号６を有する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３に示されるＬＣＤＲ２を更に含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１、配列番号３及び配列番号６を含むＶＬを提供する。例示的なＶＬを配列番号１４に示す。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
【0050】
配列番号１、配列番号３及び配列番号５を有する例示的なＬＣは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％同一である配列を含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、配列番号７を含むＨＣＤＲ１、配列番号８を含むＨＣＤＲ２、配列番号９を含むＨＣＤＲ３、配列番号１又は配列番号２を含むＬＣＤＲ１、配列番号３を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５又は配列番号６を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0052】
一実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１９を含む重鎖（ＨＣ）と、配列番号１５を含む軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【0053】
一実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１９からなる重鎖（ＨＣ）と、配列番号１５からなる軽鎖（ＬＣ）とを含む。
【0054】
本開示の抗体の例示的なＣＤＲ
【表1】
【0055】
特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列セットは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択される。
【0056】
本開示の例示的抗体には、配列番号１１によって示されるＬＣ及び配列番号１９によって示されるＨＣを有する抗体が含まれる。本開示の別の例示としては、配列番号１３によって示されるＬＣ及び配列番号１９によって示されるＨＣを有する抗体が挙げられる。本開示の別の例示としては、配列番号１５によって示されるＬＣ及び配列番号１９によって示されるＨＣを有する抗体が挙げられる。本開示の別の例示としては、配列番号１７によって示されるＬＣ及び配列番号１９によって示されるＨＣを有する抗体が挙げられる。
【0057】
いくつかの実施形態では、ＬＣ及び／又はＨＣはシグナルペプチドを含む。例示的なシグナルペプチドには配列番号２０が含まれ、対応するｃＤＮＡは配列番号２１に示されている。
【0058】
２つ以上のアミノ酸配列に関連して、本開示において使用される場合、同一性パーセントは、配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム）を使用して、又は目視検査によって測定されて、最大一致について比較及び整列されたときに、特定されるパーセンテージの同じアミノ酸残基を有する２つ以上の配列を指す。用途に応じて、同一性パーセントは、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在するか、あるいは比較される２つの配列の全長にわたって存在することができる。一例として、配列の同一性パーセントは、参照配列と比較され得る。例えば、配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列をコンピュータに入力することができる（必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムのパラメータと共にサブシーケンス座標を更に指定することができる）。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムのパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。例示的な配列アラインメント及び／又は相同性／相同性アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を通じて利用可能であるか、又は目視検査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、以下を参照されたい）によって利用可能である。配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するために好適であるアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に利用可能である。
【0059】
本開示は、ヒトＬＥＰＲに結合し、ＬＥＰＲを刺激する抗体を提供する。ＬＥＰＲに結合し、これを刺激する本開示のある一定の抗体は、以下の特性の１つ以上を有する：望ましい結合親和性でいくつかの種のＬＥＰＲに結合し、いくつかの種のＬＥＰＲを活性化し、Ｆｃγ受容体の結合に関して有益な特性を有し、ＬＥＰＲシグナル伝達を脱感作せず、シグナル伝達欠損ＬＥＰＲを活性化し、二次治療剤と有利に組み合わせることができる。
【0060】
用語「刺激する」は、本明細書で使用される場合、抗体、抗体断片、又は結合分子が、抗原に関連する１つ以上の活性又は機能を誘導又は増加させる能力を指す。抗原は、抗体、抗体断片、又は結合分子が結合する分子である。抗原は受容体（例えば、ＬＥＰＲ）であり得る。
【0061】
本明細書で使用される場合、アゴニズム及びアゴニズムパーセントは、当技術分野で公知の方法及び／又は例えば以下の実施例４を含む本明細書に本質的に記載される方法によって決定される。
【0062】
本明細書で使用される「結合する」という用語は、別段の定めがない限り、当該分野において既知である一般的な方法によって決定される２つのタンパク質又は分子の近接をもたらす、別のタンパク質若しくは分子との化学結合又は引力相互作用を形成するタンパク質又は分子の能力を意味する。
【0063】
「選択的に結合する」又は「特異的に結合する」という用語は、本開示の抗体が、他の物質よりもヒト及び／又はカニクイザル及び／又はイヌＬＥＰＲと、より頻繁に、より迅速に、より長期間、より高い親和性で、又は上記のいくつかの組み合わせで相互作用することを意味する。抗体は、当技術分野で公知の技術によって測定される場合、異なる抗原又は非抗原標的に結合するよりも少なくとも２５％大きい、少なくとも５０％大きい、少なくとも１００％大きい、少なくとも２００％大きい、又は少なくとも５００％大きい場合、抗原に特異的に結合すると言われ得る。例示的な技術としては、競合ＥＬＩＳＡ又は２５℃又は３０℃でのＳＰＲによるＫＤ測定が挙げられる。
【0064】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、５．０Ｅ－７Ｍ以下のＫＤでヒトＬＥＰＲに結合する。別の実施形態では、本開示の抗体は、５．０Ｅ－８Ｍ以下のＫＤでヒトＬＥＰＲに結合する。別の実施形態では、本開示の抗体は、２．０Ｅ－８Ｍ以下のＫＤでヒトＬＥＰＲに結合する。
【0065】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０Ｍ～５．０Ｅ－７ＭのＫＤでヒトＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０Ｍ～５．０Ｅ－８ＭのＫＤでヒトＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０Ｍ～３．０Ｅ－８ＭのＫＤでヒトＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０Ｍ～２．０Ｅ－８ＭのＫＤでヒトＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－９Ｍ～２．５Ｅ－８ＭのＫＤでヒトＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－９Ｍ～２．０Ｅ－８ＭのＫＤでヒトＬＥＰＲに結合する。
【0066】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、５．０Ｅ－７Ｍ以下のＫＤでカニクイザルＬＥＰＲに結合する。別の実施形態では、本開示の抗体は、５．０Ｅ－８Ｍ以下のＫＤでカニクイザルＬＥＰＲに結合する。別の実施形態では、本開示の抗体は、２．０Ｅ－８Ｍ以下のＫＤでカニクイザルＬＥＰＲに結合する。
【0067】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０～５．０Ｅ－７ＭのＫＤでカニクイザルＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０Ｍ～５．０Ｅ－８ＭのＫＤでカニクイザルＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０～２．０Ｅ－８ＭのＫＤでカニクイザルＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－９～２．０Ｅ－８ＭのＫＤでカニクイザルＬＥＰＲに結合する。
【0068】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、５．０Ｅ－６Ｍ以下のＫＤでイヌＬＥＰＲに結合する。別の実施形態では、本開示の抗体は、５．０Ｅ－７Ｍ以下のＫＤでイヌＬＥＰＲに結合する。別の実施形態では、本開示の抗体は、２．０Ｅ－７Ｍ以下のＫＤでイヌＬＥＰＲに結合する。別の実施形態では、本開示の抗体は、１．５Ｅ－７Ｍ以下のＫＤでイヌＬＥＰＲに結合する。
【0069】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０Ｍ～５．０Ｅ－６ＭのＫＤで、イヌＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０Ｍ～５．０Ｅ－７ＭのＫＤで、イヌＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０Ｍ～３．５Ｅ－７ＭのＫＤで、イヌＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－１０Ｍ～１．５Ｅ－７ＭのＫＤで、イヌＬＥＰＲに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－８Ｍ～１．５Ｅ－７ＭのＫＤで、イヌＬＥＰＲに結合する。
【0070】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１Ｅ－９Ｍ～２．０Ｅ－８ＭのＫＤ（ヒト）、１Ｅ－９～２．０Ｅ－８ＭのＫＤ（カニクイザル）及び１Ｅ－９Ｍ～１．５Ｅ－７ＭのＫＤ（イヌ）を提供する。
【0071】
本明細書で使用される場合、ＫＤは、２５℃又は３０℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含む、当技術分野で公知の方法及び／又は本明細書に本質的に記載される方法によって決定される。例示的な方法は、以下の実施例３に提供される。
【0072】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．５０ｎＭ以下のＥＣ５０（ヒト）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、０．４０ｎＭ以下のＥＣ５０（ヒト）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、０．３０ｎＭ以下のＥＣ５０（ヒト）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、０．２５ｎＭ以下のＥＣ５０（ヒト）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、０．２０ｎＭ以下のＥＣ５０（ヒト）を有する。
【0073】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．５０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（ヒト）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．４０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（ヒト）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．３０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（ヒト）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．２５ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（ヒト）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．２０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（ヒト）を有する。
【0074】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、２ｎＭ以下のＥＣ５０（カニクイザル）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、１．５ｎＭ以下のＥＣ５０（カニクイザル）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、１．０ｎＭ以下のＥＣ５０（カニクイザル）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、０．９ｎＭ以下のＥＣ５０（カニクイザル）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、０．８ｎＭ以下のＥＣ５０（カニクイザル）を有する。
【0075】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、２．０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（カニクイザル）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１．５ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（カニクイザル）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、１．０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（カニクイザル）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．９０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（カニクイザル）を有する。
【0076】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、５ｎＭ以下のＥＣ５０（イヌ）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、２．５ｎＭ以下のＥＣ５０（イヌ）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、２．０ｎＭ以下のＥＣ５０（イヌ）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、１．５ｎＭ以下のＥＣ５０（イヌ）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、１．０ｎＭ以下のＥＣ５０（イヌ）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、０．９ｎＭ以下のＥＣ５０（イヌ）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、０．８ｎＭ以下のＥＣ５０（イヌ）を有する。別の実施形態では、本開示の抗体は、０．７ｎＭ以下のＥＣ５０（イヌ）を有する。
【0077】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、５．０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（イヌ）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、２．５ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（イヌ）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、２．０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（イヌ）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．９０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（イヌ）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．８０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（イヌ）を有する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、０．７０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（イヌ）を有する。
【0078】
一実施形態では、本開示の抗体は、０．２５ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（ヒト）、１．０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（カニクイザル）及び０．７０ｎＭ～０．０１ｎＭのＥＣ５０（イヌ）を提供する。
【0079】
本明細書で使用される場合、ＥＣ５０は、当技術分野で公知の方法及び／又は例えば細胞内ＳＴＡＴ３アッセイのリン酸化を含む本明細書に本質的に記載の方法によって決定される。例示的な方法は、以下の実施例４に提供される。
【0080】
一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、ヒトＬＥＰＲの少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％のアゴニズムを提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、ヒトＬＥＰＲの４５％～７５％のアゴニズムを提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、ヒトＬＥＰＲの５０％～７０％のアゴニズムを提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、ヒトＬＥＰＲの５５％～６５％のアゴニズムを提供する。
【0081】
一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、カニクイザルＬＥＰＲの少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、又は少なくとも３５％のアゴニズムを提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、カニクイザルＬＥＰＲの２０％～５０％のアゴニズムを提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、カニクイザルＬＥＰＲの２０％～４０％のアゴニズムを提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、カニクイザルＬＥＰＲの２０％～３０％のアゴニズムを提供する。
【0082】
一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、イヌＬＥＰＲの少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％のアゴニズムを提供する。
【0083】
一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、イヌＬＥＰＲの４５％～８５％のアゴニズムを提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、イヌＬＥＰＲの５０％～８５％のアゴニズムを提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、イヌＬＥＰＲの６５％～８５％のアゴニズムを提供する。一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、イヌＬＥＰＲの６５％～８０％のアゴニズムを提供する。
【0084】
一実施形態では、本開示の抗体は、ヒトレプチンと比較して、５０～６０％のヒトＬＥＰＲのアゴニズム、２０％以上のカニクイザルＬＥＰＲのアゴニズム、及び７０～８０％のイヌＬＥＰＲのアゴニズムを提供する。
【0085】
本開示は、ヒト、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）及びイヌ（ディンゴ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｄｉｎｇｏ））ＬＥＰＲに選択的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト及びイヌＬＥＰＲに選択的に結合する抗体を提供する。
【0086】
本開示は、ＬＥＰＲシグナル伝達を脱感作しない抗体を提供する。
【0087】
本開示は、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合し、これを刺激させる抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸、又はこのような核酸を含むベクターを提供する。
【0088】
例示的な核酸には、配列番号１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかに示されるポリペプチド配列をコードする核酸配列が含まれる。例示的な核酸には、配列番号２２、２３、２４、２５及び２６が含まれる。
【0089】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で互換的に使用される場合に、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及び／又はヌクレオチドの類似体を組み込んだＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡ分子などの、一本鎖及び／又は二本鎖ヌクレオチド含有分子を含む、ヌクレオチドのポリマーを指す。本開示のポリヌクレオチドはまた、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼ又は合成反応によって、その中に組み込まれた物質を含み得る。
【0090】
本開示のポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドが発現制御配列に作動可能に連結された後に、宿主細胞において発現され得る。作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現が可能な発現制御配列は、当該技術分野において周知である。例えば、発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチドの分泌を促進する１つ以上のシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。シグナルペプチドは、例えば、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種性シグナルペプチドであり得る。目的のポリヌクレオチド（例えば、抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含有する発現ベクターは、周知の方法によって宿主細胞に移入され得る。追加的に、発現ベクターは、所望のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞の検出を助けるために、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、及びジヒドロ葉酸レダクターゼなどの１つ以上の選択マーカーを含み得る。
【0091】
本開示のいくつかの実施形態は、抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸配列を含むベクターを提供し、当該抗体はレプチン受容体に特異的に結合し、レプチン受容体を刺激する。特定の実施形態では、ベクターは、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２２、２３、２４、２５、及び２６の少なくとも１つによる核酸を含む。
【0092】
別の態様では、本開示は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２２、２３、２４、２５及び２６のうちの１つ以上を含む宿主細胞を提供する。
【0093】
いくつかの実施形態では、細胞、例えば宿主細胞は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２２、２３、２４、２５及び２６の少なくとも１つをコードする第１の核酸配列と、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２２、２３、２４、２５及び２６の少なくとも１つをコードする第２の核酸配列とを有するベクターを含む。
【0094】
宿主細胞は、本開示の抗体の全部又は一部分を発現する１つ以上の発現ベクターで安定的に又は一過性にトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染された細胞を含む。いくつかの実施形態によると、宿主細胞は、本開示の抗体のＨＣポリペプチドを発現する発現ベクター及びＬＣポリペプチドを発現する発現ベクターで、安定的に又は一過性にトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本開示の抗体のＨＣ及びＬＣポリペプチドを発現する発現ベクターであり、安定的に又は一過性にトランスフェクト、形質転換、形質導入又は感染され得る。本開示の抗体は、当技術分野で周知の技術に従って、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３又はＣＯＳ細胞などの哺乳動物細胞において産生され得る。
【0095】
本開示は更に、上記の宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞を、抗体が発現するような条件下で培養し、発現した抗体を培養培地から回収することによって、本明細書に記載のレプチン受容体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を産生するプロセスを提供する。
【0096】
本開示の抗体が分泌された培地は、イオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィの混合様式方法などの従来の技術によって精製することができる。例えば、培地は、従来の方法を使用して、プロテインＡ又はプロテインＧカラムに適用され、そこから溶離することができ、イオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィの混合様式方法もまた、使用することができる。可溶性凝集体及び多量体を、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィを含む一般的な技術によって効果的に除去し得る。生成物は、例えば、－７０℃で直ちに凍結させても、冷蔵しても、又は凍結乾燥させてもよい。タンパク質精製の様々な方法が用いられ得、そのような方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：８３－８９（１９９０）、及びＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ（１９９４）に記載される。
【0097】
本開示は更に、本明細書に記載のプロセスのいずれかによって産生される抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0098】
哺乳動物の抗体発現は、典型的にグリコシル化をもたらす。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかである。Ｎ結合グリコシル化とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｏ結合型グリコシル化は、セリン又はトレオニンへの糖、例えばＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの結合を指す。典型的には、グリコシル化は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位（例えば、ＩＭＧＴ又はＥＵインデックスナンバリングによると、ＩｇＧ１における２９７位）での抗体のＦｃ領域に生じる。グリコシル化部位は、グリコシル化を変更するために修飾され得る（例えば、グリコシル化を遮断若しくは低減する、又はアミノ酸配列を変更して追加若しくは多様なグリコシル化を生成する）。
【0099】
ＩｇＧサブクラス由来の抗体の哺乳動物発現は、一方又は両方の重鎖由来のＣ末端アミノ酸のプロセシングをもたらし得る。例えば、ＩｇＧ１抗体の場合に、１つ又は２つのＣ末端アミノ酸が除去され得る。例えば、ＩｇＧ１抗体は、特定の状況下では、Ｃ末端リジンが存在する場合、発現中に切断されるか又は重鎖から切り取られ得る。追加的に、最後から２番目のグリシンも、同様に重鎖から切り詰められるか、切り取られ得る。
【0100】
哺乳動物での抗体の発現はまた、Ｎ末端アミノ酸の修飾ももたらし得る。例えば、重鎖又は軽鎖の最もＮ末端のアミノ酸がグルタミンである場合、ピログルタミン酸に改変され得る。
【0101】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書及び上記に開示される抗体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体の少なくとも１つを更に含み得る。
【0102】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＥＰＲ（本明細書に開示される）に結合し、これを刺激させる抗体と、第２の治療剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0103】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤はレプチン感受性を回復させる。
【0104】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、アミリン受容体アゴニスト活性を有する薬剤を含む。アミリン受容体アゴニスト活性を有する例示的な薬剤としては、アミリン又はアミリン類似体が挙げられる。アミリン受容体アゴニスト活性を有する薬剤の例としては、ペトレリンチド、カグリリンチド、及びプラムリンチドが挙げられる。
【0105】
別の実施形態では、第２の治療剤は、アミリン受容体アゴニスト活性及びカルシトニン受容体アゴニスト活性を有する。
【0106】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、配列番号３９～４７から選択される薬剤を含む。
【0107】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、配列番号４８～４９から選択される薬剤を含む。
【0108】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、配列番号５０～５１から選択される薬剤を含む。
【0109】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１）受容体アゴニスト活性を有する。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性を有する第２の治療剤は、抗体、小分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はアプタマーである。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性を有する第２の治療薬は、エキセナチド、エキセナチド持続放出、ズラグルチド、リラグルチド、リキシセナチド、セマグルチド、コタデュチド、ノイグルチド、オキシントモジュリン、マズデュチド、レタトルチド、チルゼパチド、アルビグルチド、ベイナグルチドＰＥＧ－ロキセナチド、ペムビデュチド、アルビグルチド、エクテンジン－４、フルボデュチド、ペムビデュチド、タスポグルチド、エフペグルナチド、ロチグリプロン、ダヌグリプロン、ブロレナチド、ダピグルチド、シンコニン、エフォシペグトラチド、エフィノペグデュチド、エクノグルチド、オルフォルグリプロン、ロチグリプロン、及びダヌグリプロンから選択される。
【0110】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、次式の化合物
又はその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｒ１は、－Ｃ（＝Ｏ）（ＯＺ１）、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｘ）（Ｙ）、並びにハロゲン、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、－ＯＲ５、Ｃ３～１０シクロアルキル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、及び５～１０員ヘテロシクリルから独立して選択される１～２個のＲ７で場合により置換されるＮ、Ｏ及びＳから選択される１～２個のヘテロ原子を含む５～１０員ヘテロアリールからなる群から選択され、Ｒ２は、－Ｃ（＝Ｏ）（ＯＺ２）、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｘ）（Ｙ）、並びにハロゲン、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、－ＯＲ５、Ｃ３～１０シクロアルキル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、及び５～１０員ヘテロシクリルから独立して選択される１～２個のＲ７で場合により置換されるＮ、Ｏ及びＳから選択される１～２個のヘテロ原子を含む５～１０員ヘテロアリールからなる群から選択され、各Ｒ７は、ハロゲン、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ３～１０シクロアルキル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール及び５～１０員ヘテロシクリルからなる群から独立して選択され、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、－ＯＲ４、ＮＲ５Ｒ６、Ｃ１～６アルキル及びハロＣ１～６アルキルからなる群から選択され、各Ｒ４は、水素、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、Ｃ６～１０アリールオキシ及びＣ６～１０アリールアルコキシからなる群から独立して選択され、各Ｒ５は、独立して、水素又はＣ１～６アルキルであり、各Ｒ６は、独立して、水素又はＣ１～６アルキルであり、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ３～１０シクロアルキル及びＣ６～１０アリールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｚ１及びＺ２の少なくとも１つは水素ではない。
【化1】
【0111】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、次式の化合物
又はその薬学的に許容される塩を含み、式中、
Ａｉｂは２－アニイノイソブチン酸であり、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３の各実例は、独立して、Ａｉｂ、天然に存在するアミノ酸及び非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｕ１は、－（Ｊ４）ｎ１－（Ｊ５）ｎ２－（Ｊ６）ｎ３－（Ｊ７）ｎ４－であり、
Ｕ２は、－（Ｊ８）ｎ５－（Ｊ９）ｎ６－（Ｊ１０）ｎ７－（Ｊ１１）ｎ８－であり、
Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６、Ｊ７、Ｊ８、Ｊ９、Ｊ１０及びＪ１１の各実例は、独立して、天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸であり、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７及びｎ８の各々は独立して０又は１であり、ただし、和ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＋ｎ５＋ｎ６＋ｎ７＋ｎ８は４であり、
Ｒ１は、－Ｃ（＝Ｏ）（ＯＺ１）、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｘ）（Ｙ）並びにＮ、Ｏ及びＳから選択される１～２個のヘテロ原子を含む５～１０員ヘテロアリールからなる群から選択され、ヘテロアリールは、ハロゲン、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、ＯＲ５、Ｃ３～１０シクロアルキル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール及び５～１０員ヘテロシクリルから独立して選択される１～２個のＲ７で場合により置換されており、Ｒ２は、－Ｃ（＝Ｏ）（ＯＺ２）、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｘ）（Ｙ）並びにＮ、Ｏ及びＳから選択される１～２個のヘテロ原子を含む５～１０員ヘテロアリールからなる群から選択され、ヘテロアリールは、ハロゲン、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、－ＯＲ３、Ｃ３～１０シクロアルキル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール及び５～１０員ヘテロシクリルから独立して選択される１～２個のＲ７で場合により置換されており、各Ｒｚは、ハロゲン、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ３～１０シクロアルキル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール及び５～１０員ヘテロシクリルからなる群から独立して選択され、
Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、－ＯＲ４、ＮＲ５Ｒ６、Ｃ１～６アルキル及びハロＣ１～６アルキルからなる群から選択され、各Ｒ４は、独立して、水素Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、Ｃ６～１０アリール及びＣ７～１１アリールアルキルからなる群から選択され、各Ｒ５は、独立して、水素又はＣ１～６アルキルであり、各Ｒ６は、独立して、水素又はＣ１～６アルキルであり、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ３～１０シクロアルキル及びＣ６～１０アリールからなる群から選択される。
【化2】
Ａｉｂは２－アニイノイソブチン酸であり、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３の各実例は、独立して、Ａｉｂ、天然に存在するアミノ酸及び非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｕ１は、－（Ｊ４）ｎ１－（Ｊ５）ｎ２－（Ｊ６）ｎ３－（Ｊ７）ｎ４－であり、
Ｕ２は、－（Ｊ８）ｎ５－（Ｊ９）ｎ６－（Ｊ１０）ｎ７－（Ｊ１１）ｎ８－であり、
Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６、Ｊ７、Ｊ８、Ｊ９、Ｊ１０及びＪ１１の各実例は、独立して、天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸であり、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７及びｎ８の各々は独立して０又は１であり、ただし、和ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４＋ｎ５＋ｎ６＋ｎ７＋ｎ８は４であり、
Ｒ１は、－Ｃ（＝Ｏ）（ＯＺ１）、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｘ）（Ｙ）並びにＮ、Ｏ及びＳから選択される１～２個のヘテロ原子を含む５～１０員ヘテロアリールからなる群から選択され、ヘテロアリールは、ハロゲン、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、ＯＲ５、Ｃ３～１０シクロアルキル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール及び５～１０員ヘテロシクリルから独立して選択される１～２個のＲ７で場合により置換されており、Ｒ２は、－Ｃ（＝Ｏ）（ＯＺ２）、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｘ）（Ｙ）並びにＮ、Ｏ及びＳから選択される１～２個のヘテロ原子を含む５～１０員ヘテロアリールからなる群から選択され、ヘテロアリールは、ハロゲン、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、－ＯＲ３、Ｃ３～１０シクロアルキル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール及び５～１０員ヘテロシクリルから独立して選択される１～２個のＲ７で場合により置換されており、各Ｒｚは、ハロゲン、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ３～１０シクロアルキル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール及び５～１０員ヘテロシクリルからなる群から独立して選択され、
Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、－ＯＲ４、ＮＲ５Ｒ６、Ｃ１～６アルキル及びハロＣ１～６アルキルからなる群から選択され、各Ｒ４は、独立して、水素Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、Ｃ６～１０アリール及びＣ７～１１アリールアルキルからなる群から選択され、各Ｒ５は、独立して、水素又はＣ１～６アルキルであり、各Ｒ６は、独立して、水素又はＣ１～６アルキルであり、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ３～１０シクロアルキル及びＣ６～１０アリールからなる群から選択される。
【0112】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、次式の化合物
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＫＡＸ３ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、
を含み、
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ａｉｂであり、
位置２０のＫは、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈ（式中、ａは１～２であり、ｂは１０～２０である）とのＫ側鎖のε－アミノ基への共役によって化学的に修飾され、
Ｘ３は、Ｐｈｅ又は１－Ｎａｌであり、
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第１級アミドとして場合によりアミド化されている。
ＹＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＸ２ＬＤＫＩＡＱＫＡＸ３ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、
を含み、
式中、
Ｘ１は、Ａｉｂであり、
Ｘ２は、Ａｉｂであり、
位置２０のＫは、（［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＧｌｕ）ａ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｂ－ＣＯ２Ｈ（式中、ａは１～２であり、ｂは１０～２０である）とのＫ側鎖のε－アミノ基への共役によって化学的に修飾され、
Ｘ３は、Ｐｈｅ又は１－Ｎａｌであり、
Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第１級アミドとして場合によりアミド化されている。
【0113】
「Ａｉｂ」はαアミノイソ酪酸であり、「１－Ｎａｌ」は１－ナフチルアラニンである。
【0114】
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性を有する第２の治療剤は、配列番号５２～５６から選択される。
【0115】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、アミリン受容体アゴニスト活性、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性、及びグルカゴン受容体アゴニスト活性の１つ以上を示す薬剤である。
【0116】
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性を有する第２の治療剤は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストとＧＩＰ受容体アゴニストのデュアルアゴニストである。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性を有する第２の治療剤は、ＧＬＰ－１受容体アゴニストとＧＣＧ受容体アゴニストのデュアルアゴニストである。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ受容体のデュアルアゴニスト（ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ）を含む。ＧＬＰ－１受容体とＧＩＰ受容体のデュアルアゴニストの例には、配列番号５３又は配列番号５４に示される化合物が含まれる。
【0117】
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性を有する第２の治療剤は、ＧＬＰ－１、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド）及びグルカゴン受容体（ＧＩＰＲ／ＧＬＰ１Ｒ／ＧＣＧＲ）のトリアゴニストである。ＧＩＰ／ＧＬＰ－１／グルカゴン受容体のトリアゴニストである第２の治療剤の例には、配列番号５５又は配列番号５６に示される化合物が含まれる。
【0118】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、グルカゴン受容体アゴニスト活性を有する。例示的な薬剤としては、グルカゴン又はグルカゴン類似体が挙げられる。グルカゴン受容体アゴニスト活性を有する薬剤の例としては、配列番号５７が挙げられる。
【0119】
別の態様では、本開示は、レプチン欠損、レプチン抵抗性に関連するか又はそれによって媒介されるか、又はそうでなければＬＥＰＲを刺激させることによって治療可能な疾患又は障害を治療する方法を提供する。方法は、治療有効量の本開示の抗体又は組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0120】
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」は、本明細書に開示の障害又は疾患症状の進行を減速、制御、遅延、又は停止し得る全てのプロセスを指すが、必ずしも全ての障害又は疾患症状の完全な消失を示すわけではない。治療は、患者、特にヒトにおける疾患又は障害を治療するためのタンパク質又は核酸又はベクター又は組成物の投与を含む。
【0121】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、化合物又は組成物の、所望の結果を得るのに必要な量を指す。
【0122】
一実施形態では、本開示は、本開示の抗体又は組成物を、それを必要とする対象に投与することによって、シグナル伝達欠損ＬＥＰＲに関連する障害又は疾患を治療する方法を提供する。シグナル伝達欠損ＬＥＰＲとしては、Ａ４０９Ｅ変異を有するＬＥＰＲが挙げられる。
【0123】
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の抗体又は組成物をそれを必要とする対象に投与することによって、レプチン欠損に関連するか又はレプチン欠損によって媒介される疾患又は障害を治療する方法を提供し、疾患又は障害はリポジストロフィー障害を含む。リポジストロフィー障害の例としては、先天性全身型リポジストロフィー、後天性全身型リポジストロフィー、家族性部分型リポジストロフィー、後天性部分型リポジストロフィー、遠心性腹部リポジストロフィー、環状脂肪萎縮症及び限局性リポジストロフィーが挙げられる。
【0124】
一実施形態では、本開示は、本開示の抗体又は組成物を対象に投与することによって、体重減少、体重管理、慢性体重管理を誘導する、又は肥満を治療する方法を提供する。方法は、本開示の抗体又は組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0125】
本明細書で使用される「肥満」という用語は、健康問題のリスクを増加させる過剰な体脂肪を伴う疾患又は障害を指す。一実施形態では、「肥満」という用語は、３０ｋｇ／ｍ２以上の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する成人対象を含む。別の実施形態では、「肥満」という用語は、２５ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人対象を含む。「慢性的な体重管理」とは、体重の所望の減少又は体重の維持を指す。
【0126】
一実施形態では、本開示は、追加の体重管理を必要とする対象における慢性的な体重管理のための方法を提供し、対象が肥満を有するか、又は過体重である。ここで、慢性的な体重管理の方法は、本開示の抗体又は組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0127】
一実施形態では、「過体重」という用語は、２７ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人対象を含む。別の実施形態では、「過体重」という用語は、２３ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人対象を含む。別の実施形態では、「過体重」は、２３～３０、２３～２７、２５～３０、２７～３０、２３～２５、又は２５～２７ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する成人対象を含む。
【0128】
一実施形態では、「慢性的な体重管理」は、現在又は以前に肥満を有すると特徴付けられているか、又は過体重である人において、低カロリー食及び身体活動の増加の補助として減量を維持する方法を意味する。ここで、慢性的な体重管理の方法は、本開示の抗体又は組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0129】
一実施形態では、本開示は、２３～３０、２３～２７、２５～３０、２７～３０、２３～２５、又は２５～２７ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する対象において体重減少を誘導する方法を提供し、方法は、本開示の抗体又は組成物を対象に投与することを含む。
【0130】
本開示の抗体又は組成物は、単剤療法として、又は併用療法として投与され得る。一実施形態では、併用療法は、減量、体重管理、慢性体重管理を誘導するため、又は肥満を治療するための、本明細書に開示される抗体と第２の治療剤との同時、別個、又は逐次の組み合わせを含む。一実施形態では、併用療法は、レプチン欠損、レプチン抵抗性に関連するか又はそれによって媒介される疾患又は障害、又はそうでなければＬＥＰＲを刺激させることによって治療可能な疾患又は障害を治療するための、本明細書に開示される抗体と第２の治療剤との同時、別個、又は逐次の組み合わせを含む。
【0131】
ＬＥＰＲアゴニスト抗体と組み合わせて投与される第２の治療剤が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、レプチン感受性を回復させる治療剤を含む。
【0132】
一実施形態では、本開示は、治療、慢性体重管理、又は肥満の治療に使用するための本開示の抗体又は組成物を提供する。
【0133】
一実施形態では、本開示は、治療、慢性体重管理、又は肥満の治療のための医薬品の製造における、本明細書に開示される抗体の抗体の使用を提供する。
【0134】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、アミリン受容体アゴニスト活性、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性、ＧＩＰ受容体アゴニスト活性、及びグルカゴン受容体アゴニスト活性の１つ以上を示す薬剤である。例示的な第２の治療剤を配列番号３９～５７に示す。
【0135】
本明細書で使用される場合、「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」という単語は、「１つ以上の（one or more）」を意味する。
【0136】
本明細書で使用される場合、本開示の抗体、小分子、タンパク質、ペプチド、又はアプタマーは、それぞれの遊離塩基形態及びその薬学的に許容される塩を含む。
【実施例0137】
実施例１．抗体の発現及び精製
ＣＨＯＫ１細胞誘導体（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いた哺乳動物細胞発現系において、抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤをそれぞれ作製した。抗体をコードするｃＤＮＡ配列をＧＳ含有発現プラスミド骨格（ｐＥＥ１２．４ベースのプラスミド；Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）にサブクローニングした。
ＣＨＯＫ１細胞誘導体（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いた哺乳動物細胞発現系において、抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤをそれぞれ作製した。抗体をコードするｃＤＮＡ配列をＧＳ含有発現プラスミド骨格（ｐＥＥ１２．４ベースのプラスミド；Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ．）にサブクローニングした。
【0138】
【表2】
【0139】
ｃＤＮＡ配列をシグナルペプチド配列ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号２０）のコード配列とインフレームで融合して、組織細胞培地への抗体の分泌を増強した。発現は、ウイルスＣＭＶプロモータによって駆動された。
【0140】
一過性トランスフェクションによって抗体を生成するために、ＣＨＯＫ１由来細胞をバイオリアクタ内で３５～５０ｅ６ｖｃ／ｍＬの密度まで培養した。ＰＥＩに基づく方法を使用して、等しい化学量論比の組換え発現プラスミドで細胞をトランスフェクトした。簡潔には、２０ｅ６細胞／ｍＬの密度の適切な体積のＣＨＯＫ１由来懸濁細胞を振盪フラスコに移し、ＰＥＩ及び組換えプラスミドＤＮＡの両方を細胞に添加した。細胞を３２℃の懸濁培養で７日間インキュベートした。産生期間の終わりに、細胞を遠心分離によって除去し、抗体を清澄化培地から精製した。
【0141】
あるいは、安定なトランスフェクションを介して抗体を作製するために、脂質ベースのトランスフェクション試薬及び適切な量の組換え発現プラスミドを使用してＣＨＯＫ１由来細胞を安定にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を適切な細胞密度で懸濁培養で維持した。トランスフェクトされた細胞の選択を、２５μＭ ＭＳＸ含有化学的に定義された無血清培地中での増殖によって達成し、３２～３７℃及び５～７％ＣＯ２でインキュベートした。その後、細胞を遠心分離によって除去し、抗体を清澄化培地から精製した。
【0142】
抗体をＣＨＯ細胞から培地に分泌し、続いてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィ、続いて陽イオン交換クロマトグラフィによって精製した。具体的には、回収した培地からの抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡプロテインＡ樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）上に捕捉した。次いで、非特異的に結合した物質を除去するために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）又はＴｒｉｓを含有する緩衝液などの洗浄緩衝液で樹脂を短時間洗浄した。１０ｍＭのクエン酸ｐＨ３などの低ｐＨ溶液で樹脂からタンパク質を溶出した。抗体を含有する画分をプールした。次いで、３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．０などの塩基を添加することによって、ｐＨを約５に調整することができる。抗体は、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などの樹脂を使用するイオン交換クロマトグラフィによって更に精製することができる。２０カラム容量にわたって２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の０～１ＭのＮａＣｌ勾配を使用して、抗体をカラムから溶出させることができる。
【0143】
次いで、精製された抗体を濃縮し、及び／又は超濾過／ダイアフィルトレーション法によってリン酸緩衝生理食塩水又は他の適切な製剤緩衝液に緩衝液交換することができる。
【0144】
実施例２．ヒトＬＥＰＲに対する抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ及び抗体Ｄの結合
実施例１に従って抗体を作製し、ヒトＬＥＰＲに結合する能力について試験した。試験はＥＬＩＳＡによって行った。
実施例１に従って抗体を作製し、ヒトＬＥＰＲに結合する能力について試験した。試験はＥＬＩＳＡによって行った。
【0145】
９６ウェル高結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒカタログ番号６５００６１）を、４℃で一晩、炭酸塩緩衝液（５０ｍＭのＮａＨＣＯ３）中２μｇ／ｍＬで５０μＬ／ウェルのヒトＬＥＰＲ ＥＣＤ（配列番号３０）でコーティングした。プレートを自動プレートウォッシャで洗浄し、２００μＬ／ウェルのカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３７５２８）でＲＴで１時間ブロッキングした。次いで、プレートを洗浄した。プレート全体で１：３連続希釈したカゼイン中５０μｇ／ｍＬで開始して、抗体を滴定した。プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄する。
【0146】
カゼイン中１μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトκＡＰコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０６０－０４）を５０μＬ／ウェルで各ウェルに添加した。混合物を室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄する。
【0147】
１５ｍＬの水（展開試薬）中１００μＬ／ウェルＰＭＰ／ＡＭＰ ０．５ｍＬで展開し、５６０ｎＭで読み取る。
【0148】
データを図１に示す。曲線は、ヒトＬＥＰＲに対するＩｇＧ抗体の相対的結合を示す。ＬＥＰＲをＥＬＩＳＡプレートに結合させ、抗体を５０μｇ／ｍＬから開始して３倍の増分で滴定する。
【0149】
概要：図１は、抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが様々な親和性でヒトＬＥＰＲに結合することを実証する。
【0150】
実施例３：様々な種のＬＥＰＲに対する抗体Ａ、Ｂ及びＣの結合親和性及び動態
抗体Ａ、Ｂ及びＣは、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合するＩｇＧ１ ｍＡｂである。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、イヌ及びウサギＬＥＰＲ－ＥＣＤに対する抗体Ａ、Ｂ及びＣの結合親和性及び動態を測定した。Ｈｉｓタグ化ＥＣＤを発現させ、各種について精製し、親和性分析に使用した。この実験では、ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ＋０．０１％ＢＳＡを用いてプロテインＡ／Ｇチップ（Ｘａｎｔｅｃ、カタログ番号ＰＡＧＨＣ２００Ｍ）を利用した。抗体をランニング緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、チップ表面の単一フローセルに捕捉した。ＬＥＰＲ－ＥＣＤの各種をランニング緩衝液で１０００ｎＭに希釈した後、２倍連続希釈した。各リガンド濃度を１００μＬ／分で１５０秒間、全てのフローセルに注入し、続いて６００秒間の解離段階を行った。再生は、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５を１０μＬ／分で３０秒間注入することによって行った。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア３．１において、フローセル１参照減算と０ｎＭブランク減算によって分析した。「１：１結合」結合モデルを使用してデータを全体的に当てはめて、各リガンドのオン速度（ｋａ）及びオフ速度（ｋｄ）を決定した。親和性（ＫＤ）は、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａの関係に従って結合速度論から計算した。データは、実験レプリケートの平均±標準偏差として報告された。
抗体Ａ、Ｂ及びＣは、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合するＩｇＧ１ ｍＡｂである。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、イヌ及びウサギＬＥＰＲ－ＥＣＤに対する抗体Ａ、Ｂ及びＣの結合親和性及び動態を測定した。Ｈｉｓタグ化ＥＣＤを発現させ、各種について精製し、親和性分析に使用した。この実験では、ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ＋０．０１％ＢＳＡを用いてプロテインＡ／Ｇチップ（Ｘａｎｔｅｃ、カタログ番号ＰＡＧＨＣ２００Ｍ）を利用した。抗体をランニング緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、チップ表面の単一フローセルに捕捉した。ＬＥＰＲ－ＥＣＤの各種をランニング緩衝液で１０００ｎＭに希釈した後、２倍連続希釈した。各リガンド濃度を１００μＬ／分で１５０秒間、全てのフローセルに注入し、続いて６００秒間の解離段階を行った。再生は、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５を１０μＬ／分で３０秒間注入することによって行った。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア３．１において、フローセル１参照減算と０ｎＭブランク減算によって分析した。「１：１結合」結合モデルを使用してデータを全体的に当てはめて、各リガンドのオン速度（ｋａ）及びオフ速度（ｋｄ）を決定した。親和性（ＫＤ）は、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａの関係に従って結合速度論から計算した。データは、実験レプリケートの平均±標準偏差として報告された。
【0151】
【表3】
【0152】
概要：表３は、抗体Ａ、Ｂ及びＣがヒト、カニクイザル及びイヌＬＥＰＲに様々な親和性で結合することを実証している。抗体Ａ、Ｂ、及びＣは、マウス、ラット、又はウサギのＬＥＰＲに認識可能な親和性で結合しない。
【0153】
実施例４．抗ＬＥＰＲ抗体Ａ、Ｂ及びＣは、いくつかの種のＬＥＰＲを活性化する
ＬＥＰＲは、細胞表面シングルパス膜貫通受容体である。ＬＥＰＲの活性化は、細胞内ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）のリン酸化及びその後の標的遺伝子転写をもたらす。本開示において抗ＬＥＰＲ抗体によるＬＥＰＲ活性化を測定するために、異なる種の完全長ＬＥＰＲ及びＳＴＡＴ３－ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入することによって、５つの独立したＳＴＡＴ－ルシフェラーゼレポーター細胞株を樹立した（表４）。全長ＬＥＰＲ及びＳＴＡＴ３－ルシフェラーゼを安定に発現するこれらの細胞株を、表４に示すように、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、＃１００８２－１４７）、抗生物質（Ｇｉｂｃｏ、＃１５２４０－０６２）、１ｘピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ，＃１１３０６０－０７０）、１ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ補充物（Ｇｉｂｃｏ、＃３５０５０－０６１）及び耐性選択薬物を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＃１２４３０－０５４）中で維持した。
ＬＥＰＲは、細胞表面シングルパス膜貫通受容体である。ＬＥＰＲの活性化は、細胞内ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）のリン酸化及びその後の標的遺伝子転写をもたらす。本開示において抗ＬＥＰＲ抗体によるＬＥＰＲ活性化を測定するために、異なる種の完全長ＬＥＰＲ及びＳＴＡＴ３－ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入することによって、５つの独立したＳＴＡＴ－ルシフェラーゼレポーター細胞株を樹立した（表４）。全長ＬＥＰＲ及びＳＴＡＴ３－ルシフェラーゼを安定に発現するこれらの細胞株を、表４に示すように、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、＃１００８２－１４７）、抗生物質（Ｇｉｂｃｏ、＃１５２４０－０６２）、１ｘピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ，＃１１３０６０－０７０）、１ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ補充物（Ｇｉｂｃｏ、＃３５０５０－０６１）及び耐性選択薬物を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、＃１２４３０－０５４）中で維持した。
【0154】
ルシフェラーゼアッセイのために細胞を播種する前に、ポリ－Ｄ－リジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、＃３５４６５１）をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１回すすいだ。次いで、２０，０００～２４，０００個のＳＴＡＴ３－ルシフェラーゼレポーター細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１、Ｇｉｂｃｏ、＃９３－０１５２ＤＫ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、＃１００８２－１４７）、１×ＧｌｕｔａＭａｘ補充物（Ｇｉｂｃｏ、＃３５０５００６１）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５６３０－０８０）及び抗生物質（Ｇｉｂｃｏ，１５２４０－０６２号）からなる１００μＬ／ウェルのプレーティング培地中のポリ－Ｄ－リジン９６ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した後、培養培地を、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、＃３１９８５－０７０）、１％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、ＢＳＡ画分Ｖ（７．５％）、＃１５２６０－０３７）及び０．１％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ，＃２６４００－０４４）を含有する７５μＬアッセイ培地に交換した。試験物を２５μＬのアッセイ培地に希釈し、各ウェルに添加した。細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃で２０時間更にインキュベートした。次いで、細胞溶解液及びＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６１２０）を各ウェルに添加し、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）をＣｌａｒｉｏＳｔａｒプレートリーダーで測定した。各レポーター細胞株について、陽性対照ＬＥＰＲ活性化を、２０ｎＭの組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）によって刺激された平均ＲＬＵから、刺激されていない細胞の平均ＲＬＵを差し引いたものとして計算し、最大ＬＥＰＲ活性化（１００％）とした。全ての試験物誘導ＬＥＰＲ活性化を、同じレポーター細胞株のこの陽性対照値に対して正規化した。次いで、濃度応答曲線を、ｌｏｇ薬物濃度の関数に対する最大ＬＥＰＲ活性化のパーセンテージとしてプロットした。
【0155】
表５に示すように、組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）は、ヒト、カニクイザル、イヌ、ラット、及びマウスＬＥＰＲを活性化し、ＥＣ５０値はそれぞれ０．０４９１±０．００４４ｎＭ、０．６７４３±０．１０９８ｎＭ、０．５８１５±０．１７２３ｎＭ、６．２９３±０．６２０２ｎＭ、及び０．０７８８±０．０１７ｎＭであった。抗ＬＥＰＲ抗体Ａ、Ｂ及びＣは、ＨＥＫ２９３－ＳＴＡＴ３Ｌｕｃ－ｈＬｅｐＲ１細胞において、０．１６０４ｎＭ～０．３５７６ｎＭの範囲のＥＣ５０値及び５７．７５％～６０．９４％の範囲の最大ＬＥＰＲ活性化でヒトＬＥＰＲを活性化した。抗ＬＥＰＲ抗体Ａ、Ｂ及びＣはまた、カニクイザル（Macaca fascicularis）ＬＥＰＲ（カニクイザルＬＥＰＲ）を活性化し、ＨＥＫ２９３－ＳＴＡＴ３Ｌｕｃ－ｃｍＬｅｐＲ２細胞において、ＥＣ５０値は０．８７８６ｎＭ～２．０１８７ｎＭの範囲であり、最大ＬＥＰＲ活性化は２０．００％～２１．３０％であった。更に、抗ＬＥＰＲ抗体Ａ、Ｂ及びＣは、ハイイロオオカミ（Canis lupus）ＬＥＰＲ（イヌ－ＬＥＰＲ）を活性化し、ＨＥＫ２９３－ＳＴＡＴ３Ｌｕｃ－ｄＬｅｐＲ７細胞において、ＥＣ５０値は０．４７５１ｎＭ～０．８５４３ｎＭの範囲であり、最大ＬＥＰＲ活性化は７６．４７％～７６．７０％であった。抗ＬＥＰＲ抗体Ａ、Ｂ及びＣは、９０ｎＭまでの濃度でクマネズミ（Rattus rattus）ＬＥＰＲ（ラットＬＥＰＲ）又はハツカネズミ（Mus musculus）ＬＥＰＲ（マウスＬＥＰＲ）を活性化しなかった。
【0156】
【表4】
【0157】
表５．抗体によるＬＥＰＲの効力及び最大活性化
組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）を使用して、用量応答データ及びその後のＰｒｉｚｍソフトウェアによる非線形当てはめ曲線を生成した。各受容体種の非線形フィット曲線の最上部を、２０ｎＭの組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）に対する応答と比較し、アゴニズムのパーセントとして示した。
組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）を使用して、用量応答データ及びその後のＰｒｉｚｍソフトウェアによる非線形当てはめ曲線を生成した。各受容体種の非線形フィット曲線の最上部を、２０ｎＭの組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）に対する応答と比較し、アゴニズムのパーセントとして示した。
【0158】
【表5】
【0159】
抗体ＣＯは、配列番号３６として示されるＨＣ配列及び配列番号３７として示されるＬＣ配列を有する比較ＬＥＰＲ抗体である。
【0160】
要約：抗体Ａ、Ｂ及びＣは、ｐＳＴＡＴ３－ルシフェリーゼレポーターアッセイにおいてヒト、カニクイザル及びイヌＬＥＰＲを活性化した。抗体Ａ、Ｂ及びＣはマウス又はラットＬＥＰＲを活性化しなかった。
【0161】
実施例５：抗体Ａ、Ｂ及びＣは、ＬＥＰＲに結合するためにレプチンと競合しなかった。
ＬＥＰＲに対する抗ＬＥＰＲ抗体の結合がレプチン－ＬＥＰＲ相互作用と競合するかどうかを試験するために、ＥＬＩＳＡに基づく競合結合アッセイを行った。
ＬＥＰＲに対する抗ＬＥＰＲ抗体の結合がレプチン－ＬＥＰＲ相互作用と競合するかどうかを試験するために、ＥＬＩＳＡに基づく競合結合アッセイを行った。
【0162】
ｈＩｇＧ１－Ｆｃ（ＬＥＰＲ－Ｆｃ）に融合した組換えＬＥＰＲ細胞外ドメイン（配列番号３０）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、＃２００１２－０２７）で希釈し、９６ウェルＣｏｓｔａｒアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３６９０）上に５μｇ／ｍＬ及び５０μＬ／ウェルで適用した。溶液を４℃で２０時間インキュベートして、十分なタンパク質コーティングを可能にした。次いで、プレートを１６０μＬ／ウェルの１×洗浄緩衝液（Ｒ＆Ｄ、＃ＷＡ１２６、２５倍）で３回すすぎ、室温で１時間カゼインブロッキング溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃３７５８２）でブロッキングし、洗浄緩衝液で２回すすいだ。次いで、一連の濃度の抗ＬＥＰＲ抗体（抗体Ａ、Ｂ及びＣ）を６０μＬのカゼインブロッキング溶液で希釈し、各ウェルに加えた。レプチンについてプレート結合受容体と競合するために、連続濃度のＬＥＰＲ－Ｆｃ（配列番号３０）を陽性対照として使用した。カゼインブロッキング溶液を陰性対照として使用した。プレートを抗ＬＥＰＲ抗体、陽性対照又は陰性対照のいずれかと室温で９０分間インキュベートした。次に、２０μＬのカゼインブロッキング緩衝液で希釈した組換えヒトレプチンタンパク質（Ｒ＆Ｄ、＃３９８－ＬＰ－０５Ｍ）を各プレートに２ｎＭの最終濃度まで添加した。次いで、プレートを穏やかに振盪しながら３０秒間混合し、続いて室温で更に９０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回すすいだ。カゼインブロッキング溶液で希釈した０．５μｇ／ｍＬのビオチン化抗ｈレプチン抗体（Ａｂｃａｍ、＃ＡＢ２７１２７８）を５０μＬ／ウェルで各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。カゼインブロッキング溶液で１：５，０００に希釈した検出抗体ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃ＳＮＮ２００４）を５０μＬ／ウェルで各ウェルに適用し、室温で２０分間インキュベートした。次いで、プレートを３回洗浄し、次いで、５０μＬの１－Ｓｔｅｐ－Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、＃３４０２９）を各ウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。２５μＬの停止溶液（Ｒ＆Ｄ、＃ＤＹ９９４）を各ウェルに添加することによって反応を停止させた。データは、４５０ｎｍに設定した吸光度でマイクロプレートリーダーによって得た（ＯＤ４５０）。カゼインコーティングウェルにおける平均ＯＤ４５０読み取り値（ＬＥＰＲ－Ｆｃ（配列番号３０）コーティングなし）を全ての生ＯＤ４５０読み取り値から差し引いて、正規化ＯＤ４５０読み取り値を生成した。陰性対照（競合物品なしの２ｎＭレプチンインキュベートウェル）からの平均正規化ＯＤ４５０読み取りを１００パーセント（１００％）結合とした。全ての正規化されたＯＤ４５０読み取り値を、このＯＤ４５０読み取り値と比較し、結合のパーセンテージとして示した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、用量反応曲線の上部及び下部並びにＩＣ５０を計算した。表６及び図２に示されるように、組換えｈＬＥＰＲ－ＴＥＶ－ｈＩｇＧ１Ｆｃは、レプチンと競合して、２．５７５μｇ／ｍＬのＩＣ５０でプレート上のＬＥＰＲに結合した。いずれの抗ＬＥＰＲ抗体（Ａ、Ｂ、及びＣ）もレプチン－ＬＥＰＲ相互作用と競合しなかった。
【0163】
【表6】
【0164】
図２は、ＬＥＰＲに対する抗体及びレプチンの競合的結合アッセイを示し、これは、レプチンタンパク質の存在下でのｈＬｅｐＲに対する本開示の例示的抗体の結合を対照のパーセンテージとして示す。要約：抗体Ａ、Ｂ及びＣは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、その受容体ＬＥＰＲに結合する組換えレプチンタンパク質と競合しなかった。
【0165】
実施例６．抗体Ａ、Ｂ及びＣの細胞表面ＬＥＰＲ結合
抗体Ａ、Ｂ及びＣが生細胞表面のヒト及びカニクイザルＬＥＰＲに結合するかどうかを試験するために、フローサイトメトリーを使用して、蛍光標識された二次抗ヒトＩｇＧを有する細胞表面結合抗体を測定した。ＬＥＰＲに結合する抗体Ａ、Ｂ及びＣの特異性を確実にするために、各実行は、アイソタイプＩｇＧ対照、二次のみの対照、及び２つのチャネル補償対照を含んだ。前述の対照は当技術分野で周知である。例えば、ＩｇＧ対照の場合、それは非結合ＩｇＧであり、ＦｃγＲ結合を排除するＦｃ突然変異を含有する。ＩｇＧ対照は、ＹＴＥ変異を含まない。
抗体Ａ、Ｂ及びＣが生細胞表面のヒト及びカニクイザルＬＥＰＲに結合するかどうかを試験するために、フローサイトメトリーを使用して、蛍光標識された二次抗ヒトＩｇＧを有する細胞表面結合抗体を測定した。ＬＥＰＲに結合する抗体Ａ、Ｂ及びＣの特異性を確実にするために、各実行は、アイソタイプＩｇＧ対照、二次のみの対照、及び２つのチャネル補償対照を含んだ。前述の対照は当技術分野で周知である。例えば、ＩｇＧ対照の場合、それは非結合ＩｇＧであり、ＦｃγＲ結合を排除するＦｃ突然変異を含有する。ＩｇＧ対照は、ＹＴＥ変異を含まない。
【0166】
ＨＥＫ２９３－ＳＴＡＴ３Ｌｕｃ－ｈＬｅｐＲ１及びＨＥＫ２９３－ＳＴＡＴ３Ｌｕｃ－ｃｍＬｅｐＲ２細胞において、生細胞表面上のヒトＬＥＰＲ及びカニクイザルＬＥＰＲに対する抗体Ａ、Ｂ及びＣの結合を評価した（使用した細胞株については表４）。指数期の細胞を、製造業者のガイドラインに従って１×Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃００－４５５５－５６）によって解離させ、４０μｍセルストレイナー（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、＃２２３６３５４７）上で重力流によって歪ませた。細胞を計数し、ペレット化し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃２００１２０２７）、０．３％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５２６０－０３７）、４ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、＃Ｓ２０２－１００Ｇ）、２５μｇ／ｍＬヒトＦｃブロック（ＢＤ、＃５６４２１９）及び１００μｇ／ｍＬヤギγグロブリン（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ、＃００５－０００－００２）を含むブロッキング緩衝液の０．２～０．２６ｅ６細胞当たり２０μＬに再懸濁した。細胞をブロッキング緩衝液中、室温で１０分間インキュベートした。ＰＢＳで１回すすいだ後、細胞をＵ底９６ウェルプレートに２００μＬ及び０．２～０．２６ｅ６細胞／ウェルで移した。ＡｒＣ（商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ１０３４６）及びＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ Ｐｌｕｓ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃０１－３３３－３４２）を添加して、細胞生存率を評価し、フルオロフォア発光スペクトルの補償を可能にした。細胞をペレット化し、ＰＢＳ染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４２３１１３）で１：５００に希釈した３０μＬ／ウェルのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｚｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔで室温で１０分間染色した。染色した細胞を、１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃２００１２０２７）、０．３％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５２６０－０３７）、４ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、＃Ｓ２０２－１００Ｇ）からなるフロー緩衝液で洗浄した。次いで、細胞を、高用量として１０００ｎＭのフロー緩衝液で希釈した３０μＬ／ウェルの抗体とインキュベートし、続いて、０を含まない５倍希釈物を含む９点用量応答（各抗体について合計９つの濃度）を暗所で４℃にて３０分間インキュベートした。フロー緩衝液で３回すすいだ後、細胞を、冷たいフロー緩衝液で希釈した３０μＬ／ウェルのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７－Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ、＃１０９－６０６－１７０）１：１０００と共に４℃で２０分間インキュベートした。細胞を１２０μＬ／ウェルのコールドフロー緩衝液に再懸濁し、以下のチャネルで取得するためにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０フローサイトメーターでフローサイトメトリーに供した：ＦＳＣ、ＳＳＣ、ＢＶ４２１（紫４０５ｎｍ ４５０／５０）及びＡＰＣ／ＡＦ６４７（赤６３３ｎｍ ６７０／３０）、ウェル当たり３０，０００事象制限。ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０ソフトウェアを使用して試料生データを補償及び処理し、次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ非線形回帰非対称シグモイド曲線（濃度対ｇＭＦＩをプロットする）を利用して各抗体についてＥＣ５０を計算した。ヒト及びカニクイザルＬＥＰＲ細胞株の両方を含むこのアッセイを、４つの異なる日に合計４回行い、平均を表７及び表８に示した。
【0167】
【表7】
【0168】
【表8】
【0169】
要約：表７及び８のデータは、抗体Ａ、Ｂ及びＣが様々な親和性で細胞表面のヒト及びカニクイザルＬＥＰＲに結合することを実証している。
【0170】
実施例７．Ｆｃγ受容体への抗体Ａの結合
抗体Ｆｃが抗体ＡのＦｃγ受容体への結合特性に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合を２５℃でＳＰＲによって測定した。抗体Ａ及び抗体Ａ－ＩｇＧ１は同じＣＤＲを有する。抗体Ａは、重鎖（ＨＣ）にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ変異を有することによって、抗体Ａ－ＩｇＧ１とは異なる。ＩｇＧ１陽性対照及びＩｇＧ１非結合対照を使用して、アッセイの適合性を確認した。
抗体Ｆｃが抗体ＡのＦｃγ受容体への結合特性に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合を２５℃でＳＰＲによって測定した。抗体Ａ及び抗体Ａ－ＩｇＧ１は同じＣＤＲを有する。抗体Ａは、重鎖（ＨＣ）にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｓ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ変異を有することによって、抗体Ａ－ＩｇＧ１とは異なる。ＩｇＧ１陽性対照及びＩｇＧ１非結合対照を使用して、アッセイの適合性を確認した。
【0171】
抗体結合のＳＰＲ分析には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（Ｃｙｔｉｖａ）Ｂｉａｃｏｒｅ試薬及びＳｃｒｕｂｂｅｒ２ Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア（Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ２００８）を使用した。製造業者のＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング法（Ｃｙｔｉｖａ Ｐ／Ｎ ＢＲ－１０００－５０）を使用して、シリーズ－Ｓ ＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ Ｐ／Ｎ ＢＲ－１００５－３０）を調製した。要約すると、ＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合物を１０μＬ／分で７分間注入することによって４つ全てのフローセルの表面を活性化させた。プロテインＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｐ／Ｎ ５３９２０２）を１０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ４．５緩衝液中で１００μｇ／ｍＬに希釈し、１０μＬ／分の流速で７分間注入することによって４つ全てのフローセル上に約４０００ＲＵに固定した。未反応部位を、１０μＬ／分で７分間のエタノールアミンの注入によってブロッキングした。ｐＨ１．５の２×１０μＬのグリシン注入を使用して、非共有結合タンパク質を除去した。
【0172】
ＦｃγＲ ＥＣＤ－ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ＿１３１Ｒ、及びＦｃγＲＩＩＡ＿１３１Ｈ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ＿１５８Ｖ、ＦｃγＲＩＩＩＡ＿１５８Ｆ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ、阻害性受容体）（例えば、Ｂｒｕｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９ Ａｐｒ １６；１１３（１６）：３７１６－２５を参照されたい）は、当該技術分野で周知の方法に従って安定したＣＨＯ細胞発現から生成され、ＩｇＧセファロース及びサイズ排除クロマトグラフィを使用して精製された。
【0173】
ＦｃγＲＩ結合のために、抗体をランニング緩衝液（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋、Ｔｅｋｎｏｖａ Ｐ／Ｎ Ｈ８０２２）中で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、およそ１５０ＲＵの各抗体をフローセル２～４に捕捉した（ＲＵ捕捉）。ＦＣ１は参照フローセルであったため、ＦＣ１には抗体は捕捉されなかった。ＦｃγＲＩ ＥＣＤをランニング緩衝液中で２００ｎＭまで希釈し、次いで、ランニング緩衝液中で２倍連続希釈して０．７８ｎＭにした。各濃度の２連注入は、全てのＦＣに４０μＬ／分で１２０秒間注入され、その後１２００秒の解離フェーズが続いた。再生を、ｐＨ１．５の１０ｍＭのグリシン１５μＬを３０μＬ／分で全てのＦＣに注入することによって実施した。参照を差し引いたデータを、ＦＣ２－ＦＣ１、ＦＣ３－ＦＣ１、及びＦＣ４－ＦＣ１として収集した。測定は２５℃で行った。親和性（ＫＤ）は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２ Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアによる定常状態平衡分析又はＢＩＡ評価の「１：１（ラングミュア）結合」モデルのいずれかを使用して計算した。
【0174】
ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ結合のために、抗体をランニング緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈し、およそ５００ＲＵをフローセル２～４に捕捉した（ＲＵ捕捉）。ＦＣ１は参照フローセルである。Ｆｃγ受容体ＥＣＤをランニング緩衝液中で１０μＭに希釈し、次に、ランニング緩衝液中で２倍段階希釈して３９ｎＭにした。各濃度の２連注入は、全てのＦＣに４０μＬ／分で６０秒間注入され、その後１２０秒の解離フェーズが続いた。再生を、ｐＨ１．５の１０ｍＭのグリシン１５μＬを３０μＬ／分で全てのＦＣに注入することによって実施した。
【0175】
参照を差し引いたデータを、ＦＣ２－ＦＣ１、ＦＣ３－ＦＣ１、及びＦＣ４－ＦＣ１として収集した。測定値を２５℃で得た。親和性（ＫＤ）は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２ Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアを用いた定常状態平衡分析を使用して計算された。
【0176】
本質的に先に説明した通りの手順に従って、表９に示されるような以下のデータが得られた。
【0177】
【表9】
＊標準偏差は、＞１０μＭの測定については決定されなかった。
【0178】
概要：ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ＿１３１Ｈ、ＦｃγＲＩＩＡ＿１３１Ｒ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩＡ＿１５８Ｖ及びＦｃγＲＩＩＩＡ＿１５８Ｆに対する抗体Ａ及び様々な対照のＳＰＲ結合データ。抗体Ａは、Ｆｃγ受容体に対する検出可能な結合を示さない。
【0179】
実施例８．抗体Ａ、Ｂ及びＣは、インビトロでＬＥＰＲシグナル伝達を脱感作しなかった。
レプチンによるＬＥＰＲの活性化は、細胞表面からのＬＥＰＲの内在化を引き起こす。結果として、ＬＥＰＲは細胞外リガンドに利用できなくなり、その後のリガンド刺激に応答しなくなる。反復アゴニスト曝露に対する応答の欠如は、受容体脱感作と呼ばれる。抗体Ａ、Ｂ及びＣがＬＥＰＲを脱感作するかどうかを試験するために、ＨＥＫ２９３－ＳＴＡＴ３Ｌｕｃ－ｈＬｅｐＲ１細胞におけるＳＴＡＴ３タンパク質のリン酸化を、曝露、洗い流し及び再曝露プロトコルに従って測定した。
レプチンによるＬＥＰＲの活性化は、細胞表面からのＬＥＰＲの内在化を引き起こす。結果として、ＬＥＰＲは細胞外リガンドに利用できなくなり、その後のリガンド刺激に応答しなくなる。反復アゴニスト曝露に対する応答の欠如は、受容体脱感作と呼ばれる。抗体Ａ、Ｂ及びＣがＬＥＰＲを脱感作するかどうかを試験するために、ＨＥＫ２９３－ＳＴＡＴ３Ｌｕｃ－ｈＬｅｐＲ１細胞におけるＳＴＡＴ３タンパク質のリン酸化を、曝露、洗い流し及び再曝露プロトコルに従って測定した。
【0180】
ＨＥＫ２９３－ＳＴＡＴ３Ｌｕｃ－ｈＬｅｐＲ１細胞を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、＃２４３０－０５４）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、＃１００８２－１４７）、１ｘピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、＃１１３０６０－０７０、１００倍）、１ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント（Ｇｉｂｃｏ、＃３Ａｇ５０５０－０６１）及び抗生物質（Ｇｉｂｃｏ、＃１５２４０－０６２）からなる増殖培地を含むポリ－Ｄ－リジン９６ウェルプレート（約８０，０００細胞／ウェル）に播種した。３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した後、培養培地を除去し、無血清培地で１回洗浄した後、５０μＬ／ウェル無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｇｉｂｃｏ、＃９３－０１５２ＤＫ；０．３％ＢＳＡ、ＢＳＡ画分Ｖ（７．５％）、（Ｇｉｂｃｏ、＃１５２６０－０３７）を添加した。細胞を５０μＬの無血清培地中で１時間インキュベートした。次いで、細胞を対照群及び抗体曝露群に分けた。陰性対照群では、５０μＬの無血清培地を各ウェルに添加した。抗体曝露群では、抗ＬＥＰＲ抗体を５０μＬの無血清培地で希釈し、各抗体について３０ｎＭの最終濃度に達するように細胞に添加した。３０ｎＭ濃度は、本開示における全ての抗ＬＥＰＲ抗体のＥＣ９９濃度を上回るので、細胞を飽和量の抗ＬＥＰＲ抗体に曝露し、曝露中にその抗体による最大ＬＥＰＲ活性化に達した。次いで、全ての群の細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で１時間インキュベートして、抗ＬＥＰＲ抗体によって誘導されるＬＥＰＲ活性化及び潜在的な内在化を可能にした。１時間のインキュベーション後、抗体に曝露された細胞及び対照に曝露された細胞を、１５０μＬ／ウェルの無血清培地でそれぞれ１０分間（３７℃、５％ＣＯ２で）３回すすいだ。次いで、細胞に増殖培地（５０μＬ／ウェル）を与え、３７℃及び５％ＣＯ２で３時間回復させた。次いで、無血清培地で１回洗浄した後、増殖培地を無血清培地（５０μＬ／ウェル）に交換し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で更に１時間インキュベートした。次いで、本開示における各抗ＬＥＰＲ抗体の段階希釈物を、同じ抗体又は対照処理細胞に以前に曝露した細胞に添加して、抗体再曝露によるＬＥＰＲ活性化を可能にした。１５分間のインキュベーション後、細胞を５０μＬ／ウェルの溶解緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃ＡＬＳＵ－ｐＳＴ３－Ａ１０Ｋ）によって溶解し、室温で１０分間振盪することによって混合した。リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）を、製造業者のプロトコルに従ってＡｌｐｈａＬＩＳＡ－ＳｕｒｅＦｉｒｅ－Ｕｌｔｒａ ｐ－Ｓｔａｔ（Ｔｙｒ７０５）アッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃ＡＬＳＵ－ｐＳＴ３－Ａ１０Ｋ）によって測定した。３０ｎＭの組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）によって処理された細胞からの平均ｐＳＴＡＴ３α－シグナルを、陰性対照の平均ｐＳＴＡＴ３α－シグナルで差し引いたものを最大ＳＴＡＴ３リン酸化として設定し、１００％と定義した。次いで、試験物処理のｐＳＴＡＴ３α－シグナル読み取り値を最大ＳＴＡＴ３リン酸化値に対して正規化した。次いで、濃度応答曲線を、各抗体のｌｏｇ薬物濃度の関数に対するｐＳＴＡＴ３α－シグナルのパーセンテージとしてプロットした。
【0181】
表１０に示すように、抗ＬＥＰＲ抗体処理は、ビヒクル曝露細胞と比較して、抗体に事前曝露された細胞において非常に類似した濃度応答曲線をもたらした。抗体Ａは、０．３３０９ｎＭのＥＣ５０及び６８．９３％の最大活性化を有するビヒクル曝露細胞における抗体ＡによるｐＳＴＡＴ３誘導と比較して、０．３６０１ｎＭのＥＣ５０及び７１．９２％の最大活性化を有する抗体Ａ事前曝露細胞及び洗い流された細胞におけるｐＳＴＡＴ３シグナルを誘導した。同様に、抗体Ｂは、０．９８６２ｎＭのＥＣ５０及び７０．４８％の最大活性化を有するビヒクル曝露細胞における抗体ＢによるｐＳＴＡＴ３誘導と比較して、１．０５７ｎＭのＥＣ５０及び７７．５８％の最大活性化を有する抗体Ｂ事前曝露細胞及び洗い流された細胞においてｐＳＴＡＴ３シグナルを誘導した。最後に、抗体Ｃは、１．０３８ｎＭのＥＣ及び７１．６９％の最大活性化を有するビヒクル曝露細胞における抗体ＣによるｐＳＴＡＴ３誘導と比較して、１．１３６ｎＭのＥＣ５０及び７３．６３％の最大活性化を有する抗体Ｃ事前曝露細胞及び洗い流された細胞におけるｐＳＴＡＴ３シグナルを誘導した。
【0182】
【表10】
【0183】
要約：ＬＥＰＲ発現ＨＥＫ２９３細胞を３０ｎＭの抗体Ａ、Ｂ又はＣに１時間事前曝露した後、３時間洗い流しても、抗体Ａ、Ｂ又はＣのその後の濃度応答曲線に影響を及ぼさなかった。これらのデータは、抗ＬＥＰＲ抗体Ａ、Ｂ及びＣがインビトロでヒトＬＥＰＲシグナル伝達経路を脱感作しないことを示した。
【0184】
実施例９．抗体Ａ、Ｂ及びＣによるシグナル伝達欠損ＬＥＰＲの活性化
ＬＥＰＲ遺伝子におけるミスセンス変異Ａ４０９Ｅは、ヒトにおける肥満の常染色体劣性早期発症に関連していた（Ｆａｒｏｏｑｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５６（３）：２３７－２４７）。変異型ヒトＬＥＰＲ－Ａ４０９Ｅ受容体はレプチン刺激に応答しなかった。抗ＬＥＰＲ抗体がこれらの変異型ヒトＬＥＰＲ受容体を活性化できるかどうかを試験するために、ｈＬＥＰＲ－Ａ４０９Ｅを発現するＨＥＫ２９３細胞を使用してＳＴＡＴ３－ルシフェラーゼレポーターアッセイを確立した。これらの細胞を、成長培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、＃１２４３０－０５４）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、＃１００８２－１４７）、抗生物質（Ｇｉｂｃｏ、＃１５２４０－０６２）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、＃１１３６０－０７０）及びＧｌｕｔａＭａｘサプリメント（Ｇｉｂｃｏ、＃３５０５０－０６１）中、薬物選択２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１０６８７０１０）及び８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３０－２３４－Ｃｌ）の存在下で培養した。
ＬＥＰＲ遺伝子におけるミスセンス変異Ａ４０９Ｅは、ヒトにおける肥満の常染色体劣性早期発症に関連していた（Ｆａｒｏｏｑｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５６（３）：２３７－２４７）。変異型ヒトＬＥＰＲ－Ａ４０９Ｅ受容体はレプチン刺激に応答しなかった。抗ＬＥＰＲ抗体がこれらの変異型ヒトＬＥＰＲ受容体を活性化できるかどうかを試験するために、ｈＬＥＰＲ－Ａ４０９Ｅを発現するＨＥＫ２９３細胞を使用してＳＴＡＴ３－ルシフェラーゼレポーターアッセイを確立した。これらの細胞を、成長培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、＃１２４３０－０５４）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、＃１００８２－１４７）、抗生物質（Ｇｉｂｃｏ、＃１５２４０－０６２）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、＃１１３６０－０７０）及びＧｌｕｔａＭａｘサプリメント（Ｇｉｂｃｏ、＃３５０５０－０６１）中、薬物選択２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１０６８７０１０）及び８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３０－２３４－Ｃｌ）の存在下で培養した。
【0185】
ルシフェラーゼアッセイのために細胞を播種する前に、ポリ－Ｄ－リジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｂｉｏ Ｃｏａｔ、＃３５４６５１、ポリ－Ｄ－溶解コーティング）をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１回、及び播種培地によって１回すすいだ。次いで、２０，０００～２４，０００個のＳＴＡＴ３－ルシフェラーゼレポーター細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（３：１、Ｇｉｂｃｏ、＃９３－０１５２ＤＫ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、＃１００８２－１４７）、１×ＧｌｕｔａＭａｘ補充物（Ｇｉｂｃｏ、＃３５０５００６１）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５６３０－０８０）及び抗生物質（Ｇｉｂｃｏ，１５２４０－０６２号）からなる１００μＬ／ウェルのプレーティング培地中のポリ－Ｄ－リジン９６ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した後、培養培地を、１％ＢＳＡ（ＢＳＡ画分Ｖ（７．５％）、Ｇｉｂｃｏ、＃１５２６０－０３７）、０．１％透析ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ，＃２６４００－０４４）を含むＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、＃３１９８５－０７０）を含有する７５μＬアッセイ培地に３７℃、５％ＣＯ２で１時間交換した。試験物を２５μＬのアッセイ培地に希釈し、各ウェルに添加した。細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃で２０時間更にインキュベートした。次いで、細胞溶解液及びＯｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６１２０）を各ウェルに添加し、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）をＣｌａｒｉｏＳｔａｒプレートリーダーで測定した。次いで、濃度応答曲線を、ｌｏｇ薬物濃度の関数に対する生ＲＬＵ読み取り値としてプロットした。ＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
【0186】
表１１に示すように、抗体Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ０．０８８１１ｎＭ、０．２７２ｎＭ及び０．２５３２ｎＭのＥＣ５０で変異型ＬＥＰＲ－Ａ４０９Ｅを活性化した。対照的に、組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）は、ＬＥＰＲ－Ａ４０９Ｅを活性化しなかった。これらの結果は、本開示における抗ＬＥＰＲ抗体が、ＬＥＰＲ遺伝子における稀なミスセンス変異を有する患者を治療するために適用され得ることを示唆している。
【0187】
【表11】
【0188】
要約：抗体Ａ、Ｂ及びＣは、シグナル伝達障害変異型ＬＥＰＲ－Ａ４０９Ｅを活性化した。対照的に、組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）は、シグナル伝達欠損変異型ＬＥＰＲ－Ａ４０９Ｅを活性化しなかった。
【0189】
実施例１０．抗体Ａ、Ｂ及びＣは、ヒトＬＥＰＲ発現ＨＥＫ２９３細胞においてｐＥＲＫを誘導した。
抗体を、ＨＥＫ２９３－ＳＴＡＴ３Ｌｕｃ－ｈＬｅｐＲ１細胞における細胞外シグナル関連キナーゼ（ｐＥＲＫ）のリン酸化を誘導する能力について試験した。ｐＥＲＫ誘導を測定するために、細胞を最初に、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地を含む９６ウェルプレートにおいて３７℃で一晩培養した。２日目に、培地を除去し、細胞を無血清ＤＭＥＭ中で洗浄し、無血清ＤＭＥＭ中で更に２４時間インキュベートした。３日目に、培地を除去し、無血清ＤＭＥＭ中の最高濃度２００ｎＭの抗体Ａ、Ｂ及びＣの１：４系列希釈液を細胞に１５分間添加した。試験は２連で行った。組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）をこのアッセイにおける陽性対照として使用した。Ｆｃγ受容体への結合を消失させるためのＦｃ修飾を有するＩｇＧ１を陰性対照（ＩｇＧアイソタイプ対照）として使用した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐ－ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃ＡＬＳＵ－ＰＥＲＫ－Ａ－ＨＶ）を用いて増幅された発光を測定することによって、全細胞溶解物中のホスホ－ＥＲＫ１／２を評価した。データは、データの４つのパラメータシグモイドフィットを使用して計算した（ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア）。表１２に表される結果は、２つの独立した実験の平均ＥＣ５０である。
抗体を、ＨＥＫ２９３－ＳＴＡＴ３Ｌｕｃ－ｈＬｅｐＲ１細胞における細胞外シグナル関連キナーゼ（ｐＥＲＫ）のリン酸化を誘導する能力について試験した。ｐＥＲＫ誘導を測定するために、細胞を最初に、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地を含む９６ウェルプレートにおいて３７℃で一晩培養した。２日目に、培地を除去し、細胞を無血清ＤＭＥＭ中で洗浄し、無血清ＤＭＥＭ中で更に２４時間インキュベートした。３日目に、培地を除去し、無血清ＤＭＥＭ中の最高濃度２００ｎＭの抗体Ａ、Ｂ及びＣの１：４系列希釈液を細胞に１５分間添加した。試験は２連で行った。組換えヒトレプチンタンパク質（配列番号２７）をこのアッセイにおける陽性対照として使用した。Ｆｃγ受容体への結合を消失させるためのＦｃ修飾を有するＩｇＧ１を陰性対照（ＩｇＧアイソタイプ対照）として使用した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐ－ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃ＡＬＳＵ－ＰＥＲＫ－Ａ－ＨＶ）を用いて増幅された発光を測定することによって、全細胞溶解物中のホスホ－ＥＲＫ１／２を評価した。データは、データの４つのパラメータシグモイドフィットを使用して計算した（ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア）。表１２に表される結果は、２つの独立した実験の平均ＥＣ５０である。
【0190】
【表12】
【0191】
要約：抗体Ａ、Ｂ及びＣは、ヒトＬＥＰＲ発現ＨＥＫ２９３細胞においてＥＲＫのリン酸化を誘導した。
【0192】
実施例１１．ＥＬＩＳＡによる抗体Ａの補体成分Ｃ１ｑ結合
９６ウェルマイクロプレートを、１０μｇ／ｍＬ～０．１９μｇ／ｍＬの濃度範囲で、ＤＰＢＳ（ダルベッコのＨｙＣｌｏｎｅ）で希釈した１００μＬ／ウェルの各抗体でコーティングした。試験を２連のウェルで実施した。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。コーティング試薬を各ウェルから除去し、２００μＬ／ウェルのカゼインブロッキング試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加した。プレートを密封し、室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。各ウェルを洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１×ＴＢＥ）で３回洗浄した。カゼインブロッキング試薬で希釈した１０μｇ／ｍＬのヒトＣ１ｑ（ＭＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）１００マイクロリットル／ウェルを添加し、室温で３時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した後、カゼイン遮断薬中の１００μＬ／ウェルの１：８００希釈のヒツジ抗ヒトＣ１ｑ－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ＃ａｂ４６１９１）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに加え、７分間インキュベートした。１００マイクロリットルの１Ｎ ＨＣｌを各ウェルに添加して反応を停止させた。光学密度を、４５０ｎｍに設定した比色マイクロプレートリーダーを使用して直ちに測定した。
９６ウェルマイクロプレートを、１０μｇ／ｍＬ～０．１９μｇ／ｍＬの濃度範囲で、ＤＰＢＳ（ダルベッコのＨｙＣｌｏｎｅ）で希釈した１００μＬ／ウェルの各抗体でコーティングした。試験を２連のウェルで実施した。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。コーティング試薬を各ウェルから除去し、２００μＬ／ウェルのカゼインブロッキング試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加した。プレートを密封し、室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。各ウェルを洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１×ＴＢＥ）で３回洗浄した。カゼインブロッキング試薬で希釈した１０μｇ／ｍＬのヒトＣ１ｑ（ＭＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）１００マイクロリットル／ウェルを添加し、室温で３時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した後、カゼイン遮断薬中の１００μＬ／ウェルの１：８００希釈のヒツジ抗ヒトＣ１ｑ－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ＃ａｂ４６１９１）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに加え、７分間インキュベートした。１００マイクロリットルの１Ｎ ＨＣｌを各ウェルに添加して反応を停止させた。光学密度を、４５０ｎｍに設定した比色マイクロプレートリーダーを使用して直ちに測定した。
【0193】
図３は、抗体Ａに対するＣ１ｑ結合を示す。実施した３つの実験のうちの１つの結果（平均±ＳＤ）を示す。（Ａ）は、ＩｇＧ１アイソタイプ陽性対照であり、（Ｂ）は、アッセイの適合性を確認するために使用されるＩｇＧ１アイソタイプ非結合対照であった。（Ｃ）は、抗体Ａであり、（Ｄ）は、抗体Ａ－ＩｇＧ１対照であった。カーブフィット：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの４パラメータロジスティック。条件Ｂ及び条件Ｃは重なり合っており、本質的にベースラインにある。
【0194】
要約：抗体ＡはＥＬＩＳＡによって補体成分Ｃ１ｑに結合しない。関連する対照分子及び抗体Ａ－ＩｇＧ１は予想通りに機能した。
【0195】
実施例１２．ＦｃＲｎ－ＨＰＬＣによる抗体Ａの相対的ＦｃＲｎ結合
新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのＩｇＧ結合は、抗体リサイクル及び抗体薬物動態（ＰＫ）の決定因子にとって重要な機構である。抗体のＦｃ領域の修飾は、抗体ＰＫを調節することが示されている。抗体Ａは、ＦｃγＲ及びＣ１ｑ結合を減少させるためのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｓ突然変異、並びに抗体のクリアランスプロファイルを調節するためのＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ突然変異を有するＩｇＧ１ ｍＡｂである。これらの組み合わせ突然変異セットの影響をＦｃＲｎ－ＨＰＬＣによって評価した。ストック抗体溶液を２０ｍＭのＭＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５に１ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＦｃＲｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎ Ｇｅｎ２（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０９４３０８５７００１）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣを、０．２ｍＬ／分の流速で、２０ｍＭのＭＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５で予備平衡化した。２０μＬの抗体注入を行った後、２０ｍＭのＭＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５で１０分間カラム洗浄した。次いで、抗体を９０分間にわたって２０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８へのｐＨ勾配溶出によって溶出した。クロマトグラムをブランク減算してベースラインドリフトを除去した。５０％ピーク高さでの主なピーク保持時間及びピーク幅を表１３に示す。
新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのＩｇＧ結合は、抗体リサイクル及び抗体薬物動態（ＰＫ）の決定因子にとって重要な機構である。抗体のＦｃ領域の修飾は、抗体ＰＫを調節することが示されている。抗体Ａは、ＦｃγＲ及びＣ１ｑ結合を減少させるためのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｓ突然変異、並びに抗体のクリアランスプロファイルを調節するためのＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ突然変異を有するＩｇＧ１ ｍＡｂである。これらの組み合わせ突然変異セットの影響をＦｃＲｎ－ＨＰＬＣによって評価した。ストック抗体溶液を２０ｍＭのＭＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５に１ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＦｃＲｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎ Ｇｅｎ２（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０９４３０８５７００１）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣを、０．２ｍＬ／分の流速で、２０ｍＭのＭＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５で予備平衡化した。２０μＬの抗体注入を行った後、２０ｍＭのＭＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５で１０分間カラム洗浄した。次いで、抗体を９０分間にわたって２０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８へのｐＨ勾配溶出によって溶出した。クロマトグラムをブランク減算してベースラインドリフトを除去した。５０％ピーク高さでの主なピーク保持時間及びピーク幅を表１３に示す。
【0196】
ブリアキヌマブは、無効なＦｃＲｎリサイクルのためにＰＫが損なわれたＩｇＧ１対照であるのに対して、ウステキヌマブは、ＩｇＧに典型的なＦｃＲｎプロファイルを示す。（Ｓｃｈｏｃｈ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒｇｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｎ ＦｃＲｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１５ Ｍａｙ １２；１１２（１９）：５９９７－６００２．）一致したＶＨドメイン及びＶＬドメインを有する比較抗体のパネルをこの研究のために作製したが、それらのＦｃ領域のみが異なっていた：１）非修飾ＩｇＧ１を有する抗体Ａ（抗体Ａ ＩｇＧ１）２）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有するが、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｓを有さない抗体Ａ（抗体Ａ ＩｇＧ１－ＹＴＥ）３）ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａに移植された抗体Ａ（抗体Ａ ＩｇＧ４ＰＡＡ）。
【0197】
ウステキヌマブは、６９．４分の保持時間及び１．９分のピーク幅で比較的鋭いピークを示したが、ブリキヌマブは、８８．９分で広い１０分のピーク幅及び高い保持時間で溶出した。抗体Ａ ＩｇＧ１のＦｃＲｎ結合プロファイルは、ウステキヌマブと非常に類似しており、保持時間及びピーク幅はほぼ同一であった。全てのＹＴＥ含有試料は、類似のＦｃＲｎ結合プロファイルを示し、抗体Ａ ＩｇＧ１と比較して溶出ｐＨ（保持時間）が上昇し、ピーク幅が中程度に広がっていた。
【0198】
【表13】
【0199】
概要：ＦｃＲｎに対する抗体結合をＦｃＲｎ－ＨＰＬＣによって試験した。抗体Ａは、その可変ドメイン一致ＩｇＧ１対照及びウステキヌマブに対して遅延した２．７分のピーク幅及び保持時間でＦｃＲｎ－ＨＰＬＣカラムを溶出した。
【0200】
実施例１４．ＬＥＰＲアゴニストとＧＬＰ－１アゴニストの併用治療は、食餌誘導性肥満マウスにおいて有意な体重減少をもたらした
４週齢の雄黒色６（ＢＬ６）マウスに高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ＃Ｄ１２４９２）を１６週間与えた。これらの２０週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）雄マウスを以下に記載される研究のために使用した。本開示の抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、マウスにおいて交差反応性ではない。Ｆｃ（Ｆｃ－レプチン）（配列番号３８）に融合したレプチンタンパク質を含むレプチン受容体アゴニストが、ＬＥＰＲアゴニスト抗体の代用として使用される。配列番号３８はレプチン受容体に結合し、これを刺激する。研究開始時（１日目）に、食餌を通常の固形飼料食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ＃Ｄ２０１４）に変更した。７日目に、マウスに、ビヒクル（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）（図４、条件Ａ）、４０ｎｍｏｌ／ｋｇのＬＥＰＲアゴニスト（Ｆｃ－レプチン（配列番号３８））（図４、条件Ｂ）、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ－１受容体アゴニスト（配列番号５２）（図４、条件Ｃ）、ＬＥＰＲアゴニスト（配列番号３８）（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（配列番号５２）（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の組み合わせ（図４、条件Ｄ）を毎日皮下注射した。図４に示すように、レプチン受容体アゴニストとＧＬＰ－１受容体アゴニスト（配列番号５２）との併用治療は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト単独又はＬＥＰＲアゴニスト（配列番号３８）単独による治療と比較して、更なる体重減少をもたらした。
４週齢の雄黒色６（ＢＬ６）マウスに高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ＃Ｄ１２４９２）を１６週間与えた。これらの２０週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）雄マウスを以下に記載される研究のために使用した。本開示の抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、マウスにおいて交差反応性ではない。Ｆｃ（Ｆｃ－レプチン）（配列番号３８）に融合したレプチンタンパク質を含むレプチン受容体アゴニストが、ＬＥＰＲアゴニスト抗体の代用として使用される。配列番号３８はレプチン受容体に結合し、これを刺激する。研究開始時（１日目）に、食餌を通常の固形飼料食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ＃Ｄ２０１４）に変更した。７日目に、マウスに、ビヒクル（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）（図４、条件Ａ）、４０ｎｍｏｌ／ｋｇのＬＥＰＲアゴニスト（Ｆｃ－レプチン（配列番号３８））（図４、条件Ｂ）、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ－１受容体アゴニスト（配列番号５２）（図４、条件Ｃ）、ＬＥＰＲアゴニスト（配列番号３８）（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（配列番号５２）（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の組み合わせ（図４、条件Ｄ）を毎日皮下注射した。図４に示すように、レプチン受容体アゴニストとＧＬＰ－１受容体アゴニスト（配列番号５２）との併用治療は、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト単独又はＬＥＰＲアゴニスト（配列番号３８）単独による治療と比較して、更なる体重減少をもたらした。
【0201】
図４は、レプチン受容体アゴニストと組み合わせたＧＬＰ－１受容体アゴニストの治療が肥満マウスにおいて更なる体重減少をもたらしたことを示す。食餌誘導性肥満マウスに、高脂肪食（ＨＦＤ）から通常の固形飼料への食餌切り替えを６日間行った。次いで、これらのマウスに、７日目に開始する化合物の毎日の皮下注射（矢印で示す）を施した。体重を毎日測定した。ベースラインからの体重変化率を時間に対してプロットし、グラフに示した。条件には、（Ａ）ビヒクル対照；（Ｂ）レプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）；（Ｃ）ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（配列番号５２）；（Ｄ）ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（配列番号５２）とレプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）との併用が含まれる。
【0202】
実施例１５．ＬＥＰＲアゴニストとＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニストの併用治療は、食餌誘導性肥満マウスにおいて有意な体重減少をもたらした
４週齢の雄黒色６（ＢＬ６）マウスに高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ＃Ｄ１２４９２）を１６週間与えた。これらの２０週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）雄マウスを以下に記載される研究のために使用した。研究開始時（１日目）に、食餌を通常の固形飼料食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ＃Ｄ２０１４）に変更した。７日目に、マウスに、ビヒクル（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）（図５、条件Ａ）、３ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニスト（配列番号５３）（図５、条件Ｂ）、レプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニスト（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）の組み合わせ（図５、条件Ｃ）を毎日皮下注射した。図５に示すように、レプチン受容体アゴニストとＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニストとの併用治療は、ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニスト単独治療と比較して更なる体重減少をもたらした。
４週齢の雄黒色６（ＢＬ６）マウスに高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ＃Ｄ１２４９２）を１６週間与えた。これらの２０週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）雄マウスを以下に記載される研究のために使用した。研究開始時（１日目）に、食餌を通常の固形飼料食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ＃Ｄ２０１４）に変更した。７日目に、マウスに、ビヒクル（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）（図５、条件Ａ）、３ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニスト（配列番号５３）（図５、条件Ｂ）、レプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニスト（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）の組み合わせ（図５、条件Ｃ）を毎日皮下注射した。図５に示すように、レプチン受容体アゴニストとＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニストとの併用治療は、ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニスト単独治療と比較して更なる体重減少をもたらした。
【0203】
図５は、レプチン受容体アゴニストと組み合わせたデュアルＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲアゴニストの治療が肥満マウスにおいて更なる体重減少をもたらしたことを示す。食餌誘導性肥満マウスに、高脂肪食（ＨＦＤ）から通常の固形飼料への食餌切り替えを６日間行った。次いで、これらのマウスに、７日目に開始する化合物の毎日の皮下注射（矢印で示す）を施した。体重を毎日測定した。ベースラインからの体重変化率を時間に対してプロットし、グラフに示した。条件には、（Ａ）ビヒクル対照；（Ｂ）デュアルＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲアゴニスト（配列番号５３）；（Ｃ）デュアルＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲアゴニスト（配列番号５３）とレプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）の組み合わせが含まれる。
【0204】
実施例１６．ＬＥＰＲアゴニスト及びＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニストの併用治療は、食餌誘導性肥満マウスにおいて有意な体重減少をもたらした
４週齢の雄黒色６（ＢＬ６）マウスに高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ＃Ｄ１２４９２）を１６週間与えた。これらの２０週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）雄マウスを以下に記載される研究のために使用した。研究開始時（１日目）に、食餌を通常の固形飼料食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ＃Ｄ２０１４）に変更した。７日目に、マウスに、ビヒクル（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）（図６、条件Ａ）、レプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）４０ｎｍｏｌ／ｋｇ（図６、条件Ｂ）、ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニスト（配列番号５５）３ｎｍｏｌ／ｋｇ（図６、条件Ｃ）、レプチン受容体アゴニスト（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニスト（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）の組み合わせ（図６、条件Ｄ）を毎日皮下注射した。図６に示すように、レプチン受容体アゴニストとＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニストとの併用治療は、ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニスト単独治療又はレプチン受容体アゴニスト単独治療と比較して、更なる体重減少をもたらした。
４週齢の雄黒色６（ＢＬ６）マウスに高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ＃Ｄ１２４９２）を１６週間与えた。これらの２０週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）雄マウスを以下に記載される研究のために使用した。研究開始時（１日目）に、食餌を通常の固形飼料食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ＃Ｄ２０１４）に変更した。７日目に、マウスに、ビヒクル（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）（図６、条件Ａ）、レプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）４０ｎｍｏｌ／ｋｇ（図６、条件Ｂ）、ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニスト（配列番号５５）３ｎｍｏｌ／ｋｇ（図６、条件Ｃ）、レプチン受容体アゴニスト（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニスト（３ｎｍｏｌ／ｋｇ）の組み合わせ（図６、条件Ｄ）を毎日皮下注射した。図６に示すように、レプチン受容体アゴニストとＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニストとの併用治療は、ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニスト単独治療又はレプチン受容体アゴニスト単独治療と比較して、更なる体重減少をもたらした。
【0205】
図６は、レプチン受容体アゴニストと組み合わせたＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニストの治療が肥満マウスにおいて更なる体重減少をもたらしたことを示す。食餌誘導性肥満マウスに、高脂肪食（ＨＦＤ）から通常の固形飼料への食餌切り替えを６日間行った。次いで、これらのマウスに、７日目に開始する化合物の毎日の皮下注射（矢印で示す）を施した。体重を毎日測定した。ベースラインからの体重変化率を時間に対してプロットし、グラフに示した。ビヒクル対照化合物には、（Ａ）ビヒクル対照；（Ｂ）レプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）；（Ｃ）ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニスト（配列番号５５）；（Ｄ）ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニスト（配列番号５５）とレプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）との組み合わせが含まれる。
【0206】
実施例１７．ＬＥＰＲアゴニストとグルカゴン受容体アゴニストの併用治療は、食餌誘導性肥満マウスにおいて有意な体重減少をもたらした
４週齢の雄黒色６（ＢＬ６）マウスに高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ＃Ｄ１２４９２）を１６週間与えた。これらの２０週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）雄マウスを以下に記載される研究のために使用した。研究開始時（１日目）に、食餌を通常の固形飼料食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ＃Ｄ２０１４）に変更した。７日目に、マウスに、ビヒクル（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）（図７、条件Ａ）、６ｎｍｏｌ／ｋｇのグルカゴン受容体アゴニスト（配列番号５７）（図７、条件Ｂ）、レプチン受容体アゴニスト（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋グルカゴン受容体アゴニスト（６ｎｍｏｌ／ｋｇ）の組み合わせ（図７、条件Ｃ）を毎日皮下注射した。２１日目に、マウスを、試験終了まで１日おき（Ｑ２Ｄ）に皮下化合物投与を受けることに切り替えた。図７に示すように、レプチン受容体アゴニストとグルカゴン受容体アゴニストの併用治療は、グルカゴン受容体アゴニスト単独治療と比較して更なる体重減少をもたらした。
４週齢の雄黒色６（ＢＬ６）マウスに高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ＃Ｄ１２４９２）を１６週間与えた。これらの２０週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）雄マウスを以下に記載される研究のために使用した。研究開始時（１日目）に、食餌を通常の固形飼料食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ＃Ｄ２０１４）に変更した。７日目に、マウスに、ビヒクル（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）（図７、条件Ａ）、６ｎｍｏｌ／ｋｇのグルカゴン受容体アゴニスト（配列番号５７）（図７、条件Ｂ）、レプチン受容体アゴニスト（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋グルカゴン受容体アゴニスト（６ｎｍｏｌ／ｋｇ）の組み合わせ（図７、条件Ｃ）を毎日皮下注射した。２１日目に、マウスを、試験終了まで１日おき（Ｑ２Ｄ）に皮下化合物投与を受けることに切り替えた。図７に示すように、レプチン受容体アゴニストとグルカゴン受容体アゴニストの併用治療は、グルカゴン受容体アゴニスト単独治療と比較して更なる体重減少をもたらした。
【0207】
図７は、レプチン受容体アゴニストと組み合わせたグルカゴン受容体アゴニストの治療が肥満マウスにおいて更なる体重減少をもたらしたことを示す。食餌誘導性肥満マウスに、高脂肪食（ＨＦＤ）から通常の固形飼料への食餌切り替えを６日間行った。次いで、これらのマウスに、７日目に開始する化合物の毎日の皮下注射（矢印で示す）を施した。マウスを、２１日目（Ｑ２Ｄ）から開始して１日おきに皮下化合物注射を受けるように切り替えた。体重を毎日測定した。ベースラインからの体重変化率を時間に対してプロットし、グラフに示した。条件には、（Ａ）ビヒクル対照；（Ｂ）グルカゴン受容体アゴニスト（配列番号５７）；（Ｃ）グルカゴン受容体アゴニスト（配列番号５７）とレプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）との組み合わせが含まれる。
【0208】
要約：本開示の抗体に対する代理ＬＥＰＲアゴニストを、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト活性を有する薬剤、ＧＬＰ１／ＧＩＰ受容体デュアルアゴニスト活性を有する薬剤、又はＧＬＰ１／ＧＩＰ／グルカゴン受容体トリプルアゴニスト活性を有する薬剤のいずれかと組み合わせると、併用治療を受けているＤＩＯマウスでは、単剤による治療よりも有意に大きな体重減少が観察された。更に、グルカゴン受容体アゴニストと組み合わせたレプチン受容体アゴニストは、ＤＩＯマウスにおいてグルカゴン受容体アゴニスト単独よりも有意に大きな体重減少を引き起こした。
【0209】
実施例１８．アミリン受容体アゴニストとＬＥＰＲアゴニストの併用治療は、食餌誘導性肥満ラットにおいて有意な体重減少をもたらした
８週齢の雄ロングエバンスラットに高脂肪食（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｕｓｔｏｍ Ｄｉｅｔ＃９５２１７）を１２週間与えた。得られた２０週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）ラットを試験に使用した。次いで、これらのＤＩＯラットに、アミリン受容体アゴニスト（配列番号３９）（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＬＥＰＲアゴニスト（配列番号３８）（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、アミリン受容体アゴニスト（配列番号３９）（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）とＬＥＰＲアゴニスト（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）との組み合わせ（逐次投与）、又はプラセボを毎日皮下注射した。これらのＤＩＯラットの体重を毎日測定した。図８に示すように、アミリン受容体アゴニストとレプチン受容体アゴニストとの併用治療は、いずれかの単剤治療単独と比較して有意に大きな体重減少をもたらした。
８週齢の雄ロングエバンスラットに高脂肪食（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｕｓｔｏｍ Ｄｉｅｔ＃９５２１７）を１２週間与えた。得られた２０週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）ラットを試験に使用した。次いで、これらのＤＩＯラットに、アミリン受容体アゴニスト（配列番号３９）（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＬＥＰＲアゴニスト（配列番号３８）（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、アミリン受容体アゴニスト（配列番号３９）（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）とＬＥＰＲアゴニスト（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）との組み合わせ（逐次投与）、又はプラセボを毎日皮下注射した。これらのＤＩＯラットの体重を毎日測定した。図８に示すように、アミリン受容体アゴニストとレプチン受容体アゴニストとの併用治療は、いずれかの単剤治療単独と比較して有意に大きな体重減少をもたらした。
【0210】
図８は、レプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）と組み合わせたアミリン受容体アゴニスト（配列番号３９）による治療が、食餌誘導性肥満ラットにおいて更なる体重減少をもたらしたことを示す。高脂肪食を与えられた肥満ラットに、グラフの凡例に示されるように薬物の毎日の皮下注射を与えた。体重を毎日測定した。ベースラインからの体重変化率を時間に対してプロットし、グラフに示した。条件には、（Ａ）ビヒクル対照；（Ｂ）１００ｎｍｏｌ／ｋｇのレプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）；（Ｃ）１０ｎｍｏｌ／ｋｇのアミリン受容体アゴニスト（配列番号３９）；（Ｄ）１０ｎｍｏｌ／ｋｇアミリン受容体アゴニスト（配列番号３９）と１００ｎｍｏｌ／ｋｇレプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）との組み合わせが含まれる。
【0211】
要約：レプチン受容体アゴニストとアミリン受容体アゴニストの併用治療は、ＤＩＯラットにおいていずれかの単剤治療単独よりも多くの体重減少を引き起こした。
【0212】
実施例１９．アミリン受容体アゴニスト又はアミリン及びカルシトニン受容体コアゴニストのいずれかと組み合わせたＬＥＰＲアゴニストは、食餌誘導性肥満ラットの有意な体重減少をもたらした
８週齢の雄ロングエバンスラットに高脂肪食（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｕｓｔｏｍ Ｄｉｅｔ＃９５２１７）を１４週間与えた。得られた２２週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）ラットを試験に使用した。次いで、これらのＤＩＯラットに、アミリン受容体アゴニスト（配列番号４１）（６ｎｍｏｌ／ｋｇ）、アミリン及びカルシトニン受容体コアゴニスト（配列番号５１）（５ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＬＥＰＲアゴニスト（配列番号３８）（９０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、又はそれらの組み合わせの毎日の皮下注射を与えた。これらのＤＩＯラットの体重を毎日測定した。図９に示すように、アミリン受容体アゴニスト及びレプチン受容体アゴニストとの併用治療は、いずれかの単剤治療単独と比較して有意により大きな体重減少をもたらした。同様に、アミリン受容体とカルシトニン受容体コアゴニスト及びレプチン受容体アゴニストとの併用治療もまた、いずれかの単剤治療単独と比較して有意により大きな体重減少をもたらした。
８週齢の雄ロングエバンスラットに高脂肪食（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｕｓｔｏｍ Ｄｉｅｔ＃９５２１７）を１４週間与えた。得られた２２週齢の食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）ラットを試験に使用した。次いで、これらのＤＩＯラットに、アミリン受容体アゴニスト（配列番号４１）（６ｎｍｏｌ／ｋｇ）、アミリン及びカルシトニン受容体コアゴニスト（配列番号５１）（５ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ＬＥＰＲアゴニスト（配列番号３８）（９０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、又はそれらの組み合わせの毎日の皮下注射を与えた。これらのＤＩＯラットの体重を毎日測定した。図９に示すように、アミリン受容体アゴニスト及びレプチン受容体アゴニストとの併用治療は、いずれかの単剤治療単独と比較して有意により大きな体重減少をもたらした。同様に、アミリン受容体とカルシトニン受容体コアゴニスト及びレプチン受容体アゴニストとの併用治療もまた、いずれかの単剤治療単独と比較して有意により大きな体重減少をもたらした。
【0213】
図９は、アミリン受容体アゴニスト（配列番号４１）又はアミリン及びカルシトニン受容体コアゴニスト（配列番号５１）のいずれかと組み合わせたレプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）による治療が、食餌誘導性肥満ラットにおいて更なる体重減少をもたらしたことを示す。高脂肪食を与えられた肥満ラットに、グラフの凡例に示されるように薬物の毎日の皮下注射を与えた。体重を毎日測定した。ベースラインからの体重変化率を時間に対してプロットし、グラフに示した。条件には、（Ａ）ビヒクル対照；（Ｂ）レプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）；（Ｃ）アミリン受容体アゴニスト（配列番号４１）；（Ｄ）アミリン及びカルシトニン受容体コアゴニスト（配列番号５１）；（Ｅ）レプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）とアミリン受容体アゴニスト（配列番号４１）との組み合わせ；（Ｆ）レプチン受容体アゴニスト（配列番号３８）とアミリン及びカルシトニン受容体コアゴニスト（配列番号５１）との組み合わせが含まれる。
【0214】
要約：レプチン受容体アゴニストとアミリン受容体アゴニスト又はアミリン及びカルシトニン受容体コアゴニストのいずれかとの併用治療は、ＤＩＯラットにおいて単剤治療単独よりもより大きな体重減少を引き起こした。
【0215】
実施例２０．抗体Ａによるサルの治療は体重減少をもたらした。
抗体Ａの有効性を非ヒト霊長類で試験した。体重３～５ｋｇの２～５歳の非肥満性カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）雄１４匹を、欧州のケージ（ケージ当たり７匹のサル）に４５日間収容した群とした。次いで、サルを、それらの体重に従って、抗体Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｎ＝７）又はプラセボ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｎ＝７）のいずれかの皮下投与を６週間にわたって週に１回受ける２つの群に無作為化した。サルに、１日に２回食事（Ｐｕｒｉｎａ ４０５９）を与え、研究の全期間にわたって水を自由に摂取させた。体重を、投与期間中に週に２回及び最終投与後更に３週間測定した。体重変化率を時間の関数としてプロットした。図１０及び表１４に示すように、抗体Ａ治療を受けたサルは、プラセボを受けたサルと比較して有意な量の体重を減少させた。
抗体Ａの有効性を非ヒト霊長類で試験した。体重３～５ｋｇの２～５歳の非肥満性カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）雄１４匹を、欧州のケージ（ケージ当たり７匹のサル）に４５日間収容した群とした。次いで、サルを、それらの体重に従って、抗体Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｎ＝７）又はプラセボ（リン酸緩衝生理食塩水、Ｎ＝７）のいずれかの皮下投与を６週間にわたって週に１回受ける２つの群に無作為化した。サルに、１日に２回食事（Ｐｕｒｉｎａ ４０５９）を与え、研究の全期間にわたって水を自由に摂取させた。体重を、投与期間中に週に２回及び最終投与後更に３週間測定した。体重変化率を時間の関数としてプロットした。図１０及び表１４に示すように、抗体Ａ治療を受けたサルは、プラセボを受けたサルと比較して有意な量の体重を減少させた。
【0216】
図１０は、抗体Ａ治療がカニクイザルにおいて有意な体重減少をもたらしたことを示す。雄サル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））にプラセボ（Ａ）又は１０ｍｇ／ｋｇ抗体Ａ（Ｂ）を週１回、６週間皮下投与した。体重を合計１１５日間測定した。０日目のベースラインからの平均体重変化率を各時点でプロットした。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。抗体Ａで治療したサルは、試験の１０１日目までプラセボ群と比較して有意な体重減少を示した。プラセボ群と比較して０日目を除く全ての時点での多重対応なしｔ検定による、＊Ｐ＜０．００５、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ：Ｐ＞０．０５。
【0217】
【表14】
【0218】
要約：抗体Ａ治療は、非肥満カニクイザルにおいてプラセボと比較して有意な体重減少をもたらした。
【0219】
配列表
配列番号１ 抗体Ａ、Ｃ及びＤのＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡ
配列番号１ 抗体Ａ、Ｃ及びＤのＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡ
【0220】
配列番号２ 抗体ＢのＬＣＤＲ１
ＲＶＳＱＧＩＳＳＳＬＡ
ＲＶＳＱＧＩＳＳＳＬＡ
【0221】
配列番号３：抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのＬＣＤＲ２
ＹＴＡＳＴＬＱＳ
ＹＴＡＳＴＬＱＳ
【0222】
配列番号４：抗体ＡのＬＣＤＲ３
ＱＱＬＩＹＹＰＦＴ
ＱＱＬＩＹＹＰＦＴ
【0223】
配列番号５ 抗体Ｂ及びＤのＬＣＤＲ３
ＱＱＬＮＹＹＰＦＴ
ＱＱＬＮＹＹＰＦＴ
【0224】
配列番号６：抗体ＣのＬＣＤＲ３
ＱＱＬＮＹＹＰＦＳ
ＱＱＬＮＹＹＰＦＳ
【0225】
配列番号７ 抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのＨＣＤＲ１
ＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＡＭＳ
ＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＡＭＳ
【0226】
配列番号８ 抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのＨＣＤＲ２
ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹ
ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹ
【0227】
配列番号９ 抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのＨＣＤＲ３
ＡＫＤＱＧＤＷＤＦＬＦＤＹ
ＡＫＤＱＧＤＷＤＦＬＦＤＹ
【0228】
配列番号１０ 抗体ＡのＶＬ
【表15】
【0229】
配列番号１１ 抗体ＡのＬＣ
【表16】
【0230】
配列番号１２ 抗体ＢのＶＬ
【表17】
【0231】
配列番号１３ 抗体ＢのＬＣ
【表18】
【0232】
配列番号１４ 抗体ＣのＶＬ
【表19】
【0233】
配列番号１５ 抗体ＣのＬＣ
【表20】
【0234】
配列番号１６；抗体Ｄ ＶＬ
【表21】
【0235】
配列番号１７；抗体Ｄ ＬＣ
【表22】
【0236】
配列番号１８ 抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのＶＨ
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＳＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＱＧＤＷＤＦＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＳＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＱＧＤＷＤＦＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0237】
配列番号１９ 抗体Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのＨＣ
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＳＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＱＧＤＷＤＦＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＳＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＱＧＤＷＤＦＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0238】
配列番号２０シグナルペプチド配列
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
【0239】
配列番号２１；シグナルペプチドｃＤＮＡ
ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＴ
ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＴ
【0240】
配列番号２２ ＬＣＡ、ｃＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
【0241】
配列番号２３ ＬＣ Ｂ、ｃＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
【0242】
配列番号２４；ＬＣ Ｃ、ｃＤＮＡ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
【0243】
配列番号２５；ＬＣ Ｄ、ｃＤＮＡ
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【0244】
配列番号２６ ＨＣ、ｃＤＮＡ
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【0245】
配列番号２７組換えヒトレプチンバリアント
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【0246】
配列番号２８；ヒトＬＥＰＲ、全長配列（ＮＰ＿００２２９４．２）
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【0247】
配列番号２９；ヒトＬＥＰＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓ
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【0248】
配列番号３０；ヒトＬＥＰＲ ＥＣＤ－ＴＥＶ－Ｆｃ
ＦＮＬＳＹＰＩＴＰＷＲＦＫＬＳＣＭＰＰＮＳＴＹＤＹＦＬＬＰＡＧＬＳＫＮＴＳＮＳＮＧＨＹＥＴＡＶＥＰＫＦＮＳＳＧＴＨＦＳＮＬＳＫＴＴＦＨＣＣＦＲＳＥＱＤＲＮＣＳＬＣＡＤＮＩＥＧＫＴＦＶＳＴＶＮＳＬＶＦＱＱＩＤＡＮＷＮＩＱＣＷＬＫＧＤＬＫＬＦＩＣＹＶＥＳＬＦＫＮＬＦＲＮＹＮＹＫＶＨＬＬＹＶＬＰＥＶＬＥＤＳＰＬＶＰＱＫＧＳＦＱＭＶＨＣＮＣＳＶＨＥＣＣＥＣＬＶＰＶＰＴＡＫＬＮＤＴＬＬＭＣＬＫＩＴＳＧＧＶＩＦＱＳＰＬＭＳＶＱＰＩＮＭＶＫＰＤＰＰＬＧＬＨＭＥＩＴＤＤＧＮＬＫＩＳＷＳＳＰＰＬＶＰＦＰＬＱＹＱＶＫＹＳＥＮＳＴＴＶＩＲＥＡＤＫＩＶＳＡＴＳＬＬＶＤＳＩＬＰＧＳＳＹＥＶＱＶＲＧＫＲＬＤＧＰＧＩＷＳＤＷＳＴＰＲＶＦＴＴＱＤＶＩＹＦＰＰＫＩＬＴＳＶＧＳＮＶＳＦＨＣＩＹＫＫＥＮＫＩＶＰＳＫＥＩＶＷＷＭＮＬＡＥＫＩＰＱＳＱＹＤＶＶＳＤＨＶＳＫＶＴＦＦＮＬＮＥＴＫＰＲＧＫＦＴＹＤＡＶＹＣＣＮＥＨＥＣＨＨＲＹＡＥＬＹＶＩＤＶＮＩＮＩＳＣＥＴＤＧＹＬＴＫＭＴＣＲＷＳＴＳＴＩＱＳＬＡＥＳＴＬＱＬＲＹＨＲＳＳＬＹＣＳＤＩＰＳＩＨＰＩＳＥＰＫＤＣＹＬＱＳＤＧＦＹＥＣＩＦＱＰＩＦＬＬＳＧＹＴＭＷＩＲＩＮＨＳＬＧＳＬＤＳＰＰＴＣＶＬＰＤＳＶＶＫＰＬＰＰＳＳＶＫＡＥＩＴＩＮＩＧＬＬＫＩＳＷＥＫＰＶＦＰＥＮＮＬＱＦＱＩＲＹＧＬＳＧＫＥＶＱＷＫＭＹＥＶＹＤＡＫＳＫＳＶＳＬＰＶＰＤＬＣＡＶＹＡＶＱＶＲＣＫＲＬＤＧＬＧＹＷＳＮＷＳＮＰＡＹＴＶＶＭＤＩＫＶＰＭＲＧＰＥＦＷＲＩＩＮＧＤＴＭＫＫＥＫＮＶＴＬＬＷＫＰＬＭＫＮＤＳＬＣＳＶＱＲＹＶＩＮＨＨＴＳＣＮＧＴＷＳＥＤＶＧＮＨＴＫＦＴＦＬＷＴＥＱＡＨＴＶＴＶＬＡＩＮＳＩＧＡＳＶＡＮＦＮＬＴＦＳＷＰＭＳＫＶＮＩＶＱＳＬＳＡＹＰＬＮＳＳＣＶＩＶＳＷＩＬＳＰＳＤＹＫＬＭＹＦＩＩＥＷＫＮＬＮＥＤＧＥＩＫＷＬＲＩＳＳＳＶＫＫＹＹＩＨＤＨＦＩＰＩＥＫＹＱＦＳＬＹＰＩＦＭＥＧＶＧＫＰＫＩＩＮＳＦＴＱＤＤＩＥＫＨＱＳＤＥＮＬＹＦＱＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＨＨＨＨＨＨ
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【0249】
配列番号３１；カニクイザルＬＥＰＲ（＞ＸＰ＿００５５４３１９４．１（カニクイザル（Macaca fascicularis）））
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【0250】
配列番号３２；イヌＬＥＰＲ；（＞ＸＰ＿０２５２８３７８５．１ディンゴ（Canis lupus dingo））
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【0251】
配列番号３３；ラットＬＥＰＲ；（＞ＸＰ＿０３２７５７５７７．１レプチン受容体［クマネズミ（Rattus rattus）］）
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【0252】
配列番号３４；マウスＬＥＰＲ；（ＸＰ＿０３６０１９６４３．１ハツカネズミ（Mus musculus））
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【0253】
配列番号３５；ウサギＬＥＰＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓ
ＦＮＬＡＹＰＶＴＰＷＲＦＫＬＳＣＭＰＡＮＡＴＨＤＹＦＬＬＰＡＧＩＳＫＮＴＳＮＳＳＧＨＹＥＡＩＩＥＤＫＦＮＳＳＤＴＹＦＳＮＬＳＱＴＴＦＹＣＣＦＷＳＥＱＤＴＮＣＳＶＲＡＤＮＩＥＧＫＴＦＶＳＴＶＮＳＬＶＦＱＱＶＧＡＮＷＤＩＱＣＱＭＫＧＤＬＫＬＦＩＣＹＭＥＳＬＬＫＮＰＦＫＮＶＧＬＫＶＨＬＬＹＶＬＰＥＭＬＥＤＳＬＬＶＰＱＫＧＴＦＱＭＶＱＣＮＣＳＶＨＥＲＣＥＣＨＶＰＶＰＡＡＫＬＮＹＴＬＬＭＹＦＫＶＴＳＧＧＶＦＬＱＳＰＬＭＳＶＱＬＩＤＡＶＫＰＤＰＰＬＧＬＲＭＥＩＴＤＫＧＮＬＫＩＳＷＳＮＰＡＱＶＰＦＰＬＱＹＱＶＫＹＳＥＮＳＴＴＩＩＲＥＶＡＥＩＶＳＡＴＦＬＬＶＤＳＶＬＰＧＳＳＹＫＡＱＶＲＧＲＲＬＤＧＰＧＴＷＳＤＷＳＴＰＱＩＦＶＴＱＤＶＩＹＦＰＰＫＩＬＴＳＶＧＳＮＶＳＦＨＣＩＹＫＮＥＨＫＩＶＳＳＫＱＩＶＷＷＭＮＬＡＥＫＩＰＱＳＱＹＴＶＶＮＤＲＶＳＫＶＴＦＰＮＬＮＡＴＫＰＲＧＫＦＴＹＤＡＶＹＣＣＲＤＨＥＣＨＨＲＹＡＥＬＹＶＶＤＶＮＩＮＩＳＣＥＴＤＧＹＬＴＫＭＴＣＲＷＳＡＮＴＩＱＳＬＶＧＳＴＬＱＬＲＹＨＲＳＳＬＹＣＳＤＩＰＳＩＨＰＩＳＥＰＫＥＣＨＬＱＲＤＧＦＹＥＣＩＦＱＰＩＦＬＬＳＧＹＴＭＷＩＲＶＮＨＳＬＧＳＬＤＳＰＰＴＣＶＬＰＤＳＶＶＫＰＬＰＰＳＩＶＫＡＥＩＴＶＮＩＧＬＬＫＬＳＷＥＫＰＶＦＰＥＮＮＬＱＦＱＩＲＹＧＬＳＧＮＥＫＱＷＫＶＦＥＶＨＤＳＫＳＫＳＡＮＬＳＶＰＤＬＣＡＶＹＡＡＱＶＲＣＫＲＬＤＧＬＧＹＷＳＮＷＳＫＰＡＹＴＶＶＫＤＶＫＶＰＶＲＧＰＥＦＷＲＩＩＤＧＤＶＴＫＫＥＲＮＶＴＬＬＷＫＰＬＭＫＳＤＳＬＣＳＶＳＲＹＶＶＮＨＹＴＳＨＮＧＴＷＳＥＤＶＧＮＨＴＲＦＴＦＩＷＡＥＱＶＨＴＶＴＶＶＡＩＮＳＩＧＡＳＳＳＮＦＮＬＴＦＳＷＰＶＳＫＶＮＴＶＱＳＬＳＡＹＰＬＮＳＳＣＶＩＬＳＷＩＰＬＰＳＤＹＮＬＭＹＦＩＩＥＷＫＮＬＮＥＤＮＥＩＫＷＬＲＩＰＳＳＶＫＫＹＳＩＨＤＮＦＩＰＩＥＫＹＱＦＳＬＹＰＩＦＭＥＧＶＧＫＰＫＩＩＮＳＦＴＱＤＮＤＥＫＬＱＮＤＡＧＡＡＡＨＨＨＨＨＨ
ＦＮＬＡＹＰＶＴＰＷＲＦＫＬＳＣＭＰＡＮＡＴＨＤＹＦＬＬＰＡＧＩＳＫＮＴＳＮＳＳＧＨＹＥＡＩＩＥＤＫＦＮＳＳＤＴＹＦＳＮＬＳＱＴＴＦＹＣＣＦＷＳＥＱＤＴＮＣＳＶＲＡＤＮＩＥＧＫＴＦＶＳＴＶＮＳＬＶＦＱＱＶＧＡＮＷＤＩＱＣＱＭＫＧＤＬＫＬＦＩＣＹＭＥＳＬＬＫＮＰＦＫＮＶＧＬＫＶＨＬＬＹＶＬＰＥＭＬＥＤＳＬＬＶＰＱＫＧＴＦＱＭＶＱＣＮＣＳＶＨＥＲＣＥＣＨＶＰＶＰＡＡＫＬＮＹＴＬＬＭＹＦＫＶＴＳＧＧＶＦＬＱＳＰＬＭＳＶＱＬＩＤＡＶＫＰＤＰＰＬＧＬＲＭＥＩＴＤＫＧＮＬＫＩＳＷＳＮＰＡＱＶＰＦＰＬＱＹＱＶＫＹＳＥＮＳＴＴＩＩＲＥＶＡＥＩＶＳＡＴＦＬＬＶＤＳＶＬＰＧＳＳＹＫＡＱＶＲＧＲＲＬＤＧＰＧＴＷＳＤＷＳＴＰＱＩＦＶＴＱＤＶＩＹＦＰＰＫＩＬＴＳＶＧＳＮＶＳＦＨＣＩＹＫＮＥＨＫＩＶＳＳＫＱＩＶＷＷＭＮＬＡＥＫＩＰＱＳＱＹＴＶＶＮＤＲＶＳＫＶＴＦＰＮＬＮＡＴＫＰＲＧＫＦＴＹＤＡＶＹＣＣＲＤＨＥＣＨＨＲＹＡＥＬＹＶＶＤＶＮＩＮＩＳＣＥＴＤＧＹＬＴＫＭＴＣＲＷＳＡＮＴＩＱＳＬＶＧＳＴＬＱＬＲＹＨＲＳＳＬＹＣＳＤＩＰＳＩＨＰＩＳＥＰＫＥＣＨＬＱＲＤＧＦＹＥＣＩＦＱＰＩＦＬＬＳＧＹＴＭＷＩＲＶＮＨＳＬＧＳＬＤＳＰＰＴＣＶＬＰＤＳＶＶＫＰＬＰＰＳＩＶＫＡＥＩＴＶＮＩＧＬＬＫＬＳＷＥＫＰＶＦＰＥＮＮＬＱＦＱＩＲＹＧＬＳＧＮＥＫＱＷＫＶＦＥＶＨＤＳＫＳＫＳＡＮＬＳＶＰＤＬＣＡＶＹＡＡＱＶＲＣＫＲＬＤＧＬＧＹＷＳＮＷＳＫＰＡＹＴＶＶＫＤＶＫＶＰＶＲＧＰＥＦＷＲＩＩＤＧＤＶＴＫＫＥＲＮＶＴＬＬＷＫＰＬＭＫＳＤＳＬＣＳＶＳＲＹＶＶＮＨＹＴＳＨＮＧＴＷＳＥＤＶＧＮＨＴＲＦＴＦＩＷＡＥＱＶＨＴＶＴＶＶＡＩＮＳＩＧＡＳＳＳＮＦＮＬＴＦＳＷＰＶＳＫＶＮＴＶＱＳＬＳＡＹＰＬＮＳＳＣＶＩＬＳＷＩＰＬＰＳＤＹＮＬＭＹＦＩＩＥＷＫＮＬＮＥＤＮＥＩＫＷＬＲＩＰＳＳＶＫＫＹＳＩＨＤＮＦＩＰＩＥＫＹＱＦＳＬＹＰＩＦＭＥＧＶＧＫＰＫＩＩＮＳＦＴＱＤＮＤＥＫＬＱＮＤＡＧＡＡＡＨＨＨＨＨＨ
【0254】
配列番号３６、抗体ＣＯ ＨＣ
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＳＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＡＭＹＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＬＹＳＤＧＳＮＫＹＹＩＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＴＳＴＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＡＤＤＳＡＬＹＹＣＡＲＬＮＷＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＳＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＡＭＹＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＬＹＳＤＧＳＮＫＹＹＩＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＴＳＴＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＡＤＤＳＡＬＹＹＣＡＲＬＮＷＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【0255】
配列番号３７、抗体ＣＯ ＬＣ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0256】
配列番号３８、マウスＦｃ－レプチン（ＬＥＰＲ Ａｇ Ａｂ代理）
ＶＰＲＤＳＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＧＧＧＳＶＰＩＱＫＶＱＤＤＴＫＴＬＩＫＴＩＶＴＲＩＮＤＩＳＨＴＱＳＶＳＳＫＱＫＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫＭＤＱＴＬＡＶＹＱＱＩＬＴＳＭＰＳＲＮＶＩＱＩＳＮＤＬＥＮＬＲＤＬＬＨＶＬＡＦＳＫＳＣＨＬＰＷＡＳＧＬＥＴＬＤＳＬＧＧＶＬＥＡＳＧＹＳＴＥＶＶＡＬＳＲＬＱＧＳＬＱＤＭＬＷＱＬＤＬＳＰＧＣ
ＶＰＲＤＳＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＧＧＧＳＶＰＩＱＫＶＱＤＤＴＫＴＬＩＫＴＩＶＴＲＩＮＤＩＳＨＴＱＳＶＳＳＫＱＫＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫＭＤＱＴＬＡＶＹＱＱＩＬＴＳＭＰＳＲＮＶＩＱＩＳＮＤＬＥＮＬＲＤＬＬＨＶＬＡＦＳＫＳＣＨＬＰＷＡＳＧＬＥＴＬＤＳＬＧＧＶＬＥＡＳＧＹＳＴＥＶＶＡＬＳＲＬＱＧＳＬＱＤＭＬＷＱＬＤＬＳＰＧＣ
【0257】
配列番号３９ アミリン受容体アゴニスト
【表23】
【0258】
配列番号４０ アミリン受容体アゴニスト
γＥ－ＣＮＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－ＬＡＥ－αＭｅＦ－ＬＶＲＳＳＮ－ＮＭｅＮ－ＦＧＰＫＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
γＥ－ＣＮＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－ＬＡＥ－αＭｅＦ－ＬＶＲＳＳＮ－ＮＭｅＮ－ＦＧＰＫＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
【化3】
【0259】
配列番号４１ アミリン受容体アゴニスト
γＥ－ＣＮＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－ＬＡＥ－αＭｅＦ－ＬＶＲＳＳＮ－ＮＭｅＮ－ＦＧＰＫＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
２６位のリジンは、式（γＥ）２－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈに従う脂肪酸リンカー部分に結合される。
γＥ－ＣＮＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－ＬＡＥ－αＭｅＦ－ＬＶＲＳＳＮ－ＮＭｅＮ－ＦＧＰＫＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
２６位のリジンは、式（γＥ）２－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈに従う脂肪酸リンカー部分に結合される。
【化4】
【0260】
配列番号４２ アミリン受容体アゴニスト活性
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
【表24】
【化5】
【0261】
配列番号４３ アミリン受容体アゴニスト
γＥ－ＣＮＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－ＬＡＥ－αＭｅＦ－ＬＶＲＳＳＮ－ＮＭｅＤ－ＦＧＰＫＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
２６位のリジンは、式（γＥ）２－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈに従う脂肪酸リンカー部分に結合される。
γＥ－ＣＮＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－ＬＡＥ－αＭｅＦ－ＬＶＲＳＳＮ－ＮＭｅＤ－ＦＧＰＫＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
２６位のリジンは、式（γＥ）２－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈに従う脂肪酸リンカー部分に結合される。
【化6】
【0262】
配列番号４４ アミリン受容体アゴニスト
ＫＣＥＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－ＬＡＥ－αＭｅＦ－ＬＶＲＳＳＮ－ＮＭｅＤ－ＦＧＰＩＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
ＫＣＥＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－ＬＡＥ－αＭｅＦ－ＬＶＲＳＳＮ－ＮＭｅＤ－ＦＧＰＩＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
【化7】
【0263】
配列番号４５ アミリン受容体アゴニスト活性
ＫＣＥＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－ＬＡＥ－αＭｅＦ－ＬＶＲＳＳＮ－ＮＭｅＤ－ＦＧＰＩＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
１位のリジンは、式（γＥ）２－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈに従う脂肪酸リンカー部分に結合される。
ＫＣＥＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－ＬＡＥ－αＭｅＦ－ＬＶＲＳＳＮ－ＮＭｅＤ－ＦＧＰＩＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
１位のリジンは、式（γＥ）２－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈに従う脂肪酸リンカー部分に結合される。
【化8】
【0264】
配列番号４６ アミリン受容体アゴニスト
ＫＣＥＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－αＭｅＬ－ＡＥＦＬＶＲＳＳＨＮＦＧＰＩＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
ＫＣＥＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－αＭｅＬ－ＡＥＦＬＶＲＳＳＨＮＦＧＰＩＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
【化9】
【0265】
配列番号４７ アミリン受容体アゴニスト
ＫＣＥＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－αＭｅＬ－ＡＥＦＬＶＲＳＳＨＮＦＧＰＩＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
１位のリジンは、式（γＥ）２－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈに従う脂肪酸リンカー部分に結合される。
ＫＣＥＴＡＴＣＡＴＧ－Ｏｒｎ－αＭｅＬ－ＡＥＦＬＶＲＳＳＨＮＦＧＰＩＬＰＰＴＥＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
２位のシステインと７位のシステインとの間にチオアセタール架橋が存在する。
１位のリジンは、式（γＥ）２－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈに従う脂肪酸リンカー部分に結合される。
【化10】
【0266】
配列番号４８ デュアルアミリン及びカルシトニン受容体アゴニスト
アセチル－ＡＳＨＬＳＴＡＶＬＧＫＬＳ－Ａｉｂ－ＥＬＨＫＬＥＤＹＰＲＴＤＶＧＡＥＳＰ－ＮＨ２
アセチル－ＡＳＨＬＳＴＡＶＬＧＫＬＳ－Ａｉｂ－ＥＬＨＫＬＥＤＹＰＲＴＤＶＧＡＥＳＰ－ＮＨ２
【0267】
配列番号４９ デュアルアミリン及びカルシトニン受容体アゴニスト
アセチル－ＡＳＨＬＳＴＡＶＬＧＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＬＳ－Ａｉｂ－ＥＬＨＫＬＥＤＹＰＲＴＤＶＧＡＥＳＰ－ＮＨ２
アセチル－ＡＳＨＬＳＴＡＶＬＧＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＬＳ－Ａｉｂ－ＥＬＨＫＬＥＤＹＰＲＴＤＶＧＡＥＳＰ－ＮＨ２
【0268】
配列番号５０ アミリン受容体アゴニスト
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
式中、２及び７位にジスルフィド結合が存在する。
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ－ＮＨ２
式中、２及び７位にジスルフィド結合が存在する。
【0269】
配列番号５１ アミリン受容体アゴニスト
ＣＯ２Ｈ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＥ－ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＥＦＬＲＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＰ－ＮＨ２
ｈ－アミリンに対する配列修飾：１４Ｅ、１７Ｒ、２５Ｐ、２８Ｐ、２９Ｐ、３７Ｐ
ＣＯ２Ｈ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ－γＥ－ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＥＦＬＲＨＳＳＮＮＦＧＰＩＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＰ－ＮＨ２
ｈ－アミリンに対する配列修飾：１４Ｅ、１７Ｒ、２５Ｐ、２８Ｐ、２９Ｐ、３７Ｐ
【0270】
配列番号５２ ＧＬＰ－１受容体アゴニスト
Ｈ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
式中、２０位のＫは、Ｋ側鎖のε－アミノ基と（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ２Ｈとのコンジュゲーションによって化学的に修飾されている。
Ｈ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
式中、２０位のＫは、Ｋ側鎖のε－アミノ基と（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ２Ｈとのコンジュゲーションによって化学的に修飾されている。
【化11】
【0271】
配列番号５３、ＧＬＰ－１受容体とＧＩＰ受容体のデュアルアゴニスト
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩ－Ａｉｂ－ＬＤＫＩＡＱＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－γＥ２－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）Ａ－１Ｎａｌ－ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩ－Ａｉｂ－ＬＤＫＩＡＱＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－γＥ２－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）Ａ－１Ｎａｌ－ＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２
【0272】
配列番号５４ ＧＬＰ－１受容体とＧＩＰ受容体のデュアルアゴニスト
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩ－Ａｉｂ－ＬＤＫＩＡＱＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＡＦＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２
２０位のＫは、（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＥ）１－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２ＨでのＫ側鎖のε－アミノ基へのコンジュゲーションを通じて化学的に修飾され、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第１級アミドとしてアミド化されている。
Ｌ－チロシル－２－メチルアラニル－Ｌ－α－グルタミルグリシル－Ｌ－トレオニル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－トレオニル－Ｌ－セリル－Ｌ－α－アスパルチル－Ｌ－チロシル－Ｌ－セリル－Ｌ－イソロイシル－２－メチルアラニル－Ｌ－ロイシル－Ｌ－α－アスパルチル－Ｌ－リシル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミニル－Ｎ６－［（２２Ｓ）－２２，４２－ジカルボキシ－１，１０，１９，２４－テトラオキソ－３，６，１２，１５－テトラオキサ－９，１８，２３－トリアザドテトラコン－１－イル］－Ｌ－リシル－Ｌ－アラニル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－バリル－Ｌ－グルタミニル－Ｌ－トリプトフィル－Ｌ－ロイシル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－アラニルグリシルグリシル－Ｌ－プロリル－Ｌ－セリル－Ｌ－セリルグリシル－Ｌ－アラニル－Ｌ－プロリル－Ｌ－プロリル－Ｌ－プロリル－Ｌ－セリンアミド
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩ－Ａｉｂ－ＬＤＫＩＡＱＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＡＦＶＱＷＬＩＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２
２０位のＫは、（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＥ）１－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２ＨでのＫ側鎖のε－アミノ基へのコンジュゲーションを通じて化学的に修飾され、Ｃ末端アミノ酸は、Ｃ末端第１級アミドとしてアミド化されている。
【化12】
【0273】
配列番号５５、ＧＩＰ／ＧＬＰ－１／グルカゴン受容体のトリアゴニスト
【表25】
【0274】
配列番号５６ トリアゴニストＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲ
Ｙ－Ａｉｂ－ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤＫＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＡＱ－Ａｉｂ－ＡＦＩＥＹＬＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２
式中、１７位のＫは、Ｋ側鎖のε－アミノ基と（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈとのコンジュゲーションにより化学修飾され、Ｃ末端のアミノ酸は、Ｃ末端の第１級アミドとしてアミド化される。
Ｙ－Ａｉｂ－ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤＫＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＡＱ－Ａｉｂ－ＡＦＩＥＹＬＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２
式中、１７位のＫは、Ｋ側鎖のε－アミノ基と（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）－（γＥ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈとのコンジュゲーションにより化学修飾され、Ｃ末端のアミノ酸は、Ｃ末端の第１級アミドとしてアミド化される。
【化13】
【0275】
配列番号５７；グルカゴン受容体アゴニスト
Ｙ－Ａｉｂ－ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ－Ａｉｂ－ＫＫＡＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＥ）２－ＣＯ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ２Ｈ）ＥＦＶＥＷＬＬＥＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２
Ｙ－Ａｉｂ－ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ－Ａｉｂ－ＫＫＡＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γＥ）２－ＣＯ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ２Ｈ）ＥＦＶＥＷＬＬＥＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２
【0276】
配列番号５８；カニクイザルＬＥＰＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓ
ＦＮＬＳＹＰＩＴＰＷＲＦＫＬＳＣＭＰＰＮＳＴＹＤＹＦＬＬＰＡＧＬＳＫＮＴＳＮＬＮＧＨＹＥＴＡＶＥＦＮＳＳＤＴＨＦＳＮＬＳＫＴＴＦＨＣＣＦＲＳＥＱＤＲＮＣＳＬＣＡＤＮＩＥＧＫＴＦＶＳＴＶＮＳＳＶＦＱＱＭＧＡＮＷＮＩＱＣＷＬＫＧＤＬＫＬＦＩＣＹＶＥＳＬＦＫＮＰＦＫＮＹＫＨＫＶＨＬＬＹＶＬＰＥＶＬＥＤＳＰＬＶＰＱＫＧＳＦＱＭＶＨＣＮＣＳＶＨＥＲＣＥＣＬＶＰＶＰＴＡＫＬＮＤＴＬＬＭＣＬＫＩＴＳＧＧＶＩＦＱＳＰＬＭＳＶＱＰＩＮＭＶＫＰＤＰＰＬＧＬＲＭＥＩＴＤＤＧＮＬＫＩＳＷＳＳＰＰＬＶＰＦＰＬＱＹＥＶＫＹＳＥＮＳＴＴＶＩＲＥＡＤＫＩＶＳＡＴＳＬＬＶＤＧＩＬＰＧＳＳＹＥＶＱＶＲＧＫＲＬＤＧＰＧＩＷＳＤＷＳＴＰＨＶＦＴＴＱＤＶＩＹＦＰＰＫＩＬＴＳＶＧＳＮＶＳＦＨＣＩＹＫＮＥＮＫＩＶＳＳＫＫＩＶＷＷＭＮＬＡＥＫＩＰＱＳＱＹＤＶＶＳＤＨＶＳＫＶＴＦＦＮＬＮＥＴＫＰＲＧＫＦＴＹＤＡＶＹＣＣＮＥＨＥＣＨＨＲＹＡＥＬＹＶＩＤＶＮＩＮＩＳＣＥＴＤＧＨＬＴＫＭＴＣＲＷＳＴＮＴＩＱＳＬＡＧＳＴＬＱＬＲＹＲＲＳＳＬＹＣＦＤＩＰＳＩＨＰＩＳＫＰＫＤＣＹＬＱＳＤＧＦＹＥＣＶＦＱＰＩＦＬＬＳＧＹＴＭＷＩＲＩＮＨＰＬＧＳＬＤＳＰＰＴＣＶＬＰＤＳＶＶＫＰＬＰＰＳＳＶＫＡＥＩＩＫＮＩＧＬＬＫＩＳＷＥＫＰＶＦＰＥＮＮＬＱＦＱＩＲＹＧＬＳＧＫＥＩＱＷＫＭＹＤＶＹＤＡＫＳＫＳＶＳＬＰＶＰＤＦＣＡＶＹＡＶＱＶＲＣＫＲＳＤＧＬＧＬＷＳＮＷＳＮＰＡＹＴＶＶＭＤＩＫＶＰＭＲＧＰＥＦＷＲＩＩＮＧＤＴＭＫＫＥＫＮＶＴＬＬＷＫＰＬＭＫＮＤＳＬＣＳＶＱＲＹＶＩＮＨＨＴＳＣＮＧＴＷＳＥＤＶＧＮＨＴＫＦＴＦＬＷＴＥＱＡＨＴＶＴＶＬＡＩＮＳＩＧＡＳＶＡＮＦＮＬＴＦＳＷＰＭＳＫＶＮＩＶＱＳＬＳＡＹＰＬＮＳＳＣＶＩＬＳＷＩＬＳＰＳＤＹＫＬＭＹＦＩＩＥＷＫＮＬＮＥＤＧＥＩＫＷＬＲＩＳＳＳＶＫＫＹＹＩＨＤＨＦＩＰＩＥＫＹＱＦＳＬＹＰＩＦＭＥＧＶＧＫＰＫＩＩＮＳＦＴＱＤＮＴＥＫＨＱＮＤＧＨＨＨＨＨＨ
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【0277】
配列番号５９；イヌＬＥＰＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓ
ＦＮＬＡＹＰＩＴＰＷＲＦＫＬＳＣＭＰＰＮＴＴＹＤＦＬＬＰＡＧＩＳＲＮＴＳＮＬＮＥＨＹＥＡＶＶＥＡＫＬＮＳＳＳＴＹＩＳＮＬＳＳＫＴＴＦＨＣＣＦＷＳＫＥＤＫＮＣＳＶＨＡＤＮＭＥＧＫＡＦＶＳＴＶＳＳＬＶＦＱＱＩＧＡＮＷＮＩＱＣＷＭＫＥＤＬＫＬＦＩＣＹＭＥＳＬＦＫＮＰＦＫＴＹＤＬＫＶＨＬＬＹＶＬＰＥＶＬＥＥＳＰＰＶＰＱＫＧＧＦＱＩＶＰＣＮＣＳＶＨＤＳＣＥＣＨＶＰＶＰＴＡＥＬＮＨＴＬＬＭＹＬＫＩＴＬＧＧＩＮＦＱＳＰＬＭＳＶＫＰＩＮＶＶＫＰＤＰＰＬＧＬＨＭＥＩＴＤＴＧＮＬＫＩＳＷＳＳＰＴＬＶＰＦＱＬＱＹＱＶＲＹＳＥＮＳＳＴＮＶＲＫＡＮＥＩＶＳＡＴＳＬＬＩＤＳＶＬＰＧＳＳＹＥＶＱＶＲＧＫＫＬＤＧＰＧＩＷＧＤＷＳＴＰＬＩＦＩＴＱＤＶＩＹＦＰＰＫＩＬＴＳＶＧＳＮＶＳＦＨＣＩＹＫＳＥＮＫＩＶＳＳＫＫＩＶＷＷＬＮＬＡＥＫＩＰＱＳＱＹＮＭＶＧＤＲＶＳＫＶＴＦＰＮＬＮＡＴＫＰＲＧＫＦＴＹＤＡＶＹＣＣＫＥＱＥＣＨＨＲＹＡＥＬＹＶＩＤＶＮＩＮＩＳＣＥＴＤＧＹＬＴＫＭＴＣＲＷＳＴＮＡＩＱＳＬＥＧＳＴＬＱＬＲＹＨＲＳＳＬＹＣＳＤＶＰＳＩＨＰＩＳＥＰＫＤＣＨＬＲＲＤＧＦＹＥＣＩＦＱＰＩＦＬＬＳＧＹＴＭＷＩＫＩＮＨＳＬＧＳＬＤＳＳＰＴＣＶＶＰＤＳＶＶＫＰＬＰＰＳＳＶＫＡＥＩＴＶＫＩＧＬＬＫＩＳＷＥＫＰＶＦＰＥＮＮＬＫＦＱＩＲＹＧＬＮＧＫＥＶＱＷＫＩＹＥＶＹＤＴＫＬＫＳＴＳＬＰＶＰＤＬＣＡＶＹＡＶＱＶＲＣＫＲＬＤＧＬＧＹＷＳＮＷＳＴＰＡＹＴＶＶＴＤＶＫＶＰＴＲＧＰＥＦＷＲＭＩＤＥＤＴＳＲＫＥＲＮＶＴＬＬＷＫＰＬＭＫＮＤＳＬＣＳＶＲＫＹＶＶＫＨＨＴＳＲＮＧＴＷＳＥＤＶＧＮＨＴＫＦＴＦＬＷＴＥＱＡＨＳＶＴＶＬＡＶＮＳＩＧＡＳＳＶＮＦＮＬＴＦＳＷＰＭＳＫＶＮＴＶＱＳＬＳＡＹＰＬＮＳＴＣＶＬＬＳＷＴＬＴＰＳＤＹＹＬＴＹＦＩＴＥＷＫＩＬＮＥＤＳＥＩＫＷＬＲＩＰＰＳＶＫＫＹＹＩＨＤＨＦＩＰＩＥＫＹＱＦＳＬＹＰＶＦＭＥＧＶＧＫＰＫＴＩＮＳＦＴＱＤＤＩＥＫＨＱＮＤＨＨＨＨＨＨ
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【0278】
配列番号６０；ラットＬＥＰＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓ
ＬＮＬＡＹＰＴＳＰＷＲＦＫＬＦＣＡＰＰＳＴＴＤＤＳＦＬＳＰＡＧＶＰＮＮＴＳＳＬＫＧＡＳＥＡＬＶＥＡＫＦＮＳＴＧＩＹＶＳＥＬＳＫＴＩＦＨＣＣＦＧＮＥＱＧＱＮＣＳＡＬＴＧＮＴＥＧＫＴＬＡＳＶＶＫＰＬＶＦＲＱＬＧＶＮＷＤＩＥＣＷＭＫＧＤＬＴＬＦＩＣＨＭＥＰＬＬＫＮＰＦＫＮＹＤＳＫＶＨＬＬＹＤＬＰＥＶＩＤＤＬＰＬＰＰＬＫＤＳＦＱＴＶＱＣＮＣＳＶＲＥＣＥＣＨＶＰＶＰＲＡＫＶＮＹＡＬＬＭＹＬＥＩＴＳＡＧＶＳＦＱＳＰＬＭＳＬＱＰＭＬＶＶＫＰＤＰＰＬＧＬＲＭＥＶＴＤＤＧＮＬＫＩＳＷＤＳＱＴＫＡＰＦＰＬＱＹＱＶＫＹＬＥＮＳＴＩＶＲＥＡＡＥＩＶＳＤＴＳＬＬＶＤＳＶＬＰＧＳＳＹＥＶＱＶＲＳＫＲＬＤＧＳＧＶＷＳＤＷＳＬＰＱＬＦＴＴＱＤＶＭＹＦＰＰＫＩＬＴＳＶＧＳＮＡＳＦＣＣＩＹＫＮＥＮＱＴＩＳＳＫＱＩＶＷＷＭＮＬＡＥＫＩＰＥＴＱＹＮＴＶＳＤＨＩＳＫＶＴＦＳＮＬＫＡＴＲＰＲＧＫＦＴＹＤＡＶＹＣＣＮＥＱＡＣＨＨＲＹＡＥＬＹＶＩＤＶＮＩＮＩＳＣＥＴＤＧＹＬＴＫＭＴＣＲＷＳＰＳＴＩＱＳＬＶＧＳＴＶＱＬＲＹＨＲＲＳＬＹＣＰＤＮＰＳＩＲＰＴＳＥＬＫＮＣＶＬＱＴＤＧＦＹＥＣＶＦＱＰＩＦＬＬＳＧＹＴＭＷＩＲＩＮＨＳＬＧＳＬＤＳＰＰＴＣＶＬＰＤＳＶＶＫＰＬＰＰＳＮＶＫＡＥＩＴＩＮＴＧＬＬＫＶＳＷＥＫＰＶＦＰＥＮＮＬＱＦＱＩＲＹＧＬＮＧＫＥＩＱＷＫＴＨＥＶＦＤＡＫＳＫＳＡＳＬＰＶＳＤＬＣＡＶＹＶＶＱＶＲＣＲＲＬＤＧＬＧＹＷＳＮＷＳＳＰＡＹＴＬＶＭＤＶＫＶＰＭＲＧＰＥＦＷＲＩＭＤＧＤＩＴＫＫＥＲＮＶＴＬＬＷＫＰＬＭＫＮＤＳＬＣＳＶＲＲＹＶＶＫＨＲＴＡＨＮＧＴＷＳＱＤＶＧＮＱＴＮＬＴＦＬＷＡＥＳＡＨＴＶＴＶＬＡＩＮＳＩＧＡＳＬＶＮＦＮＬＴＦＳＷＰＭＳＫＶＮＡＶＱＳＬＳＡＹＰＬＳＳＳＣＶＩＬＳＷＴＬＳＰＮＤＹＳＬＬＹＬＶＩＥＷＫＮＬＮＤＤＤＧＭＫＷＬＲＩＰＳＮＶＮＫＹＹＩＨＤＮＦＩＰＩＥＫＹＱＦＳＬＹＰＶＦＭＥＧＶＧＫＰＫＩＩＮＧＦＴＫＤＤＩＡＫＱＱＮＤＡＧＡＡＡＨＨＨＨＨＨ
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【0279】
配列番号６１；マウスＬＥＰＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓ
ＬＮＬＡＹＰＩＳＰＷＫＦＫＬＦＣＧＰＰＮＴＴＤＤＳＦＬＳＰＡＧＡＰＮＮＡＳＡＬＫＧＡＳＥＡＩＶＥＡＫＦＮＳＳＧＩＹＶＰＥＬＳＫＴＶＦＨＣＣＦＧＮＥＱＧＱＮＣＳＡＬＴＤＮＴＥＧＫＴＬＡＳＶＶＫＡＳＶＦＲＱＬＧＶＮＷＤＩＥＣＷＭＫＧＤＬＴＬＦＩＣＨＭＥＰＬＰＫＮＰＦＫＮＹＤＳＫＶＨＬＬＹＤＬＰＥＶＩＤＤＳＰＬＰＰＬＫＤＳＦＱＴＶＱＣＮＣＳＬＲＧＣＥＣＨＶＰＶＰＲＡＫＬＮＹＡＬＬＭＹＬＥＩＴＳＡＧＶＳＦＱＳＰＬＭＳＬＱＰＭＬＶＶＫＰＤＰＰＬＧＬＨＭＥＶＴＤＤＧＮＬＫＩＳＷＤＳＱＴＭＡＰＦＰＬＱＹＱＶＫＹＬＥＮＳＴＩＶＲＥＡＡＥＩＶＳＡＴＳＬＬＶＤＳＶＬＰＧＳＳＹＥＶＱＶＲＳＫＲＬＤＧＳＧＶＷＳＤＷＳＳＰＱＶＦＴＴＱＤＶＶＹＦＰＰＫＩＬＴＳＶＧＳＮＡＳＦＨＣＩＹＫＮＥＮＱＩＩＳＳＫＱＩＶＷＷＲＮＬＡＥＫＩＰＥＩＱＹＳＩＶＳＤＲＶＳＫＶＴＦＳＮＬＫＡＴＲＰＲＧＫＦＴＹＤＡＶＹＣＣＮＥＱＡＣＨＨＲＹＡＥＬＹＶＩＤＶＮＩＮＩＳＣＥＴＤＧＹＬＴＫＭＴＣＲＷＳＰＳＴＩＱＳＬＶＧＳＴＶＱＬＲＹＨＲＲＳＬＹＣＰＤＳＰＳＩＨＰＴＳＥＰＫＮＣＶＬＱＲＤＧＦＹＥＣＶＦＱＰＩＦＬＬＳＧＹＴＭＷＩＲＩＮＨＳＬＧＳＬＤＳＰＰＴＣＶＬＰＤＳＶＶＫＰＬＰＰＳＮＶＫＡＥＩＴＶＮＴＧＬＬＫＶＳＷＥＫＰＶＦＰＥＮＮＬＱＦＱＩＲＹＧＬＳＧＫＥＩＱＷＫＴＨＥＶＦＤＡＫＳＫＳＡＳＬＬＶＳＤＬＣＡＶＹＶＶＱＶＲＣＲＲＬＤＧＬＧＹＷＳＮＷＳＳＰＡＹＴＬＶＭＤＶＫＶＰＭＲＧＰＥＦＷＲＫＭＤＧＤＶＴＫＫＥＲＮＶＴＬＬＷＫＰＬＴＫＮＤＳＬＣＳＶＲＲＹＶＶＫＨＲＴＡＨＮＧＴＷＳＥＤＶＧＮＲＴＮＬＴＦＬＷＴＥＰＡＨＴＶＴＶＬＡＶＮＳＬＧＡＳＬＶＮＦＮＬＴＦＳＷＰＭＳＫＶＳＡＶＥＳＬＳＡＹＰＬＳＳＳＣＶＩＬＳＷＴＬＳＰＤＤＹＳＬＬＹＬＶＩＥＷＫＩＬＮＥＤＤＧＭＫＷＬＲＩＰＳＮＶＫＫＦＹＩＨＤＮＦＩＰＩＥＫＹＱＦＳＬＹＰＶＦＭＥＧＶＧＫＰＫＩＩＮＧＦＴＫＤＡＩＤＫＱＱＮＤＡＧＡＡＡＨＨＨＨＨＨＳＧＳ
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【外国語明細書】