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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025015309
(43)【公開日】2025-01-30
(54)【発明の名称】ウイルス凝集剤、ウイルス阻害剤及びウイルスの除去方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/437 20060101AFI20250123BHJP
A61K 31/375 20060101ALI20250123BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20250123BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20250123BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20250123BHJP
C12Q 1/22 20060101ALI20250123BHJP
A01P 1/00 20060101ALI20250123BHJP
A01N 43/90 20060101ALI20250123BHJP
A01N 43/08 20060101ALI20250123BHJP
A01N 37/44 20060101ALI20250123BHJP
A01N 25/00 20060101ALI20250123BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20250123BHJP
A23L 33/00 20160101ALN20250123BHJP
【ＦＩ】
A61K31/437
A61K31/375
A61K47/18
A61K47/22
A61P31/12
C12Q1/22 ZNA
A01P1/00
A01N43/90 103
A01N43/90 104
A01N43/08 H
A01N37/44
A01N25/00 101
C12Q1/686 Z
A23L33/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023118638
(22)【出願日】2023-07-20
(71)【出願人】
【識別番号】000004466
【氏名又は名称】三菱瓦斯化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】モハマドイシャク ヌルシャフィカ
(72)【発明者】
【氏名】池本 一人
【テーマコード（参考）】
4B018
4B063
4C076
4C086
4H011
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB02
4B018LB05
4B018LB06
4B018LB07
4B018LB08
4B018LB09
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
4B018LE04
4B018LE05
4B018MD07
4B018ME14
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR41
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS28
4B063QX02
4C076BB01
4C076CC35
4C076DD51
4C076DD59
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB05
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA05
4C086MA52
4C086NA05
4C086ZB33
4H011AA04
4H011BA06
4H011BB09
4H011BC06
4H011BC08
4H011DF04
(57)【要約】
【課題】一般的なフィルターでウイルスを除去することを可能にするウイルス凝集剤及びウイルスの除去方法、並びにＰＱＱ単独使用に比べてウイルス阻害率が高められたウイルス阻害剤を提供する。
【解決手段】ピロロキノリンキノン等を含むウイルス凝集剤、ピロロキノリンキノン等とアスコルビン酸等とを含むウイルス阻害剤、及びウイルスを含む溶液にピロロキノリンキノン等を添加する第１の工程を含むウイルスの除去方法。
【選択図】図３
【解決手段】ピロロキノリンキノン等を含むウイルス凝集剤、ピロロキノリンキノン等とアスコルビン酸等とを含むウイルス阻害剤、及びウイルスを含む溶液にピロロキノリンキノン等を添加する第１の工程を含むウイルスの除去方法。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩を含む、ウイルス凝集剤。
【請求項2】
アスコルビン酸及び／又はその塩をさらに含む、請求項１に記載のウイルス凝集剤。
【請求項3】
酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸をさらに含む、請求項２に記載のウイルス凝集剤。
【請求項4】
前記酸性アミノ酸を含み、前記酸性アミノ酸としてグルタミン酸を含む、請求項３に記載のウイルス凝集剤。
【請求項5】
前記中性アミノ酸を含み、前記中性アミノ酸としてグリシンを含む、請求項３に記載のウイルス凝集剤。
【請求項6】
前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量の質量比が、１：[１～１００]である、請求項２に記載のウイルス凝集剤。
【請求項7】
前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量：前記１つ以上のアミノ酸の合計含量の質量比が、１：[１～１００]：[１～１００]である、請求項３に記載のウイルス凝集剤。
【請求項8】
前記ウイルスが、コロナウイルスである、請求項１～７のいずれか１項に記載のウイルス凝集剤。
【請求項9】
ウイルス除去用前処理剤として用いられる、請求項１～７のいずれか１項に記載のウイルス凝集剤。
【請求項10】
ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩と、アスコルビン酸及び／又はその塩とを含む、ウイルス阻害剤。
【請求項11】
酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸をさらに含む、請求項１０に記載のウイルス阻害剤。
【請求項12】
前記酸性アミノ酸を含み、前記酸性アミノ酸としてグルタミン酸を含む、請求項１１に記載のウイルス阻害剤。
【請求項13】
前記中性アミノ酸を含み、前記中性アミノ酸としてグリシンを含む、請求項１１に記載のウイルス阻害剤。
【請求項14】
前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量の質量比が、１：[１～１００]である、請求項１０に記載のウイルス阻害剤。
【請求項15】
前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量：前記１つ以上のアミノ酸の合計含量の質量比が、１：[１～１００]：[１～１００]である、請求項１１に記載のウイルス阻害剤。
【請求項16】
前記ウイルスが、コロナウイルスである、請求項１０～１５のいずれか１項に記載のウイルス阻害剤。
【請求項17】
ウイルスを含む溶液に、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩を添加する第１の工程を含むウイルスの除去方法。
【請求項18】
前記第１の工程後に、前記溶液を０．１～２マイクロメートルの細孔径のフィルターでろ過するろ過工程をさらに含む、請求項１７に記載のウイルスの除去方法。
【請求項19】
前記ろ過工程前に、前記溶液に、アスコルビン酸及び／又はその塩を添加する第２の工程を含む、請求項１８に記載のウイルスの除去方法。
【請求項20】
前記ろ過工程前に、前記溶液に、酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸を添加する第３の工程を含む、請求項１９に記載のウイルスの除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウイルス凝集剤、ウイルス阻害剤及びウイルスの除去方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルス等のウイルスは、ヒトに限らず、ネコ、イヌ、ウマ等の動物にも感染することが知られている。例えば、ヒトに感染するコロナウイルスは現在までに７種類が確認されており、ネコ等に感染するコロナウイルスも確認されている。
【0003】
これらのウイルスは、その大きさが２０～１００ｎｍ前後であるため、バクテリアでは可能な「一般的なフィルターを使用したろ過滅菌」をすることができないことから、ろ過性病原体と呼ばれることがある。
【0004】
したがって、これらのウイルスの除去方法や抗ウイルス剤を開発することが求められている。
【0005】
ウイルスの除去方法としては、ウイルス粒子よりも小さな細孔を有するフィルターを使用してウイルスを除去する方法が報告されている（特許文献１，２参照）。また、ウイルス捕捉能又はウイルス吸着能を有する基材を含むウイルス除去用フィルターも提案されている（特許文献３，４参照）。
【0006】
一方、抗ウイルス剤としては、ピロロキノリンキノン（以下ＰＱＱということがある）にウイルスの逆転写酵素に対する阻害活性があることが報告されている（特許文献５参照）。また、ＰＱＱがコロナウイルスで生じる炎症を抑制する可能性が報告されている（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開平７－２２９８２７号公報
【特許文献2】国際公開第２０１６／０３１８３４号
【特許文献3】特開平１１－５００６号公報
【特許文献4】特表２００３－５０５２２７号公報
【特許文献5】特開平１－２８３２２１号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Alberto Boretti , PQQ Supplementation and SARS-CoV-2 Spike Protein-Induced Heart Inflammation, Nat Prod Commun. 2022 Mar 8;17(3):1934578X221080929. doi: 10.1177/1934578X221080929.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかしながら、ウイルス粒子より小さな細孔を有するフィルターは、特殊で容易に入手できない。また、ウイルス捕捉能やウイルス除去能を有する基材を含むフィルターも、特殊で容易に入手できない。これらのフィルターは、特殊で一般的でないために非常に高額である欠点がある。
【0010】
また、特許文献５に記載されるＰＱＱの抗ウイルス剤は、その阻害活性が十分でない。
【0011】
また、ＰＱＱを使用するウイルスの除去方法については知られていない。
【0012】
したがって、比較的安価で入手しやすい０．１から２マイクロメートルの細孔径を有する一般的なフィルターでウイルスを除去できる方法が求められている。また、その際に有害でなく安価な物質で達成可能であることが求められている。
【0013】
また、ウイルス阻害活性が十分でないＰＱＱについて、その活性を高めることができる組成物が求められている。
【0014】
本発明の目的は、一般的なフィルターでウイルスを除去することを可能にするウイルス凝集剤及びウイルスの除去方法、並びにＰＱＱ単独使用に比べてウイルス阻害率が高められたウイルス阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明は、上記目的を達成するために、下記のウイルス凝集剤、ウイルス阻害剤及びウイルスの除去方法を提供する。
【0016】
［１］ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩を含む、ウイルス凝集剤。
［２］アスコルビン酸及び／又はその塩をさらに含む、前記［１］に記載のウイルス凝集剤。
［３］酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸をさらに含む、前記［２］に記載のウイルス凝集剤。
［４］前記酸性アミノ酸を含み、前記酸性アミノ酸としてグルタミン酸を含む、前記［３］に記載のウイルス凝集剤。
［５］前記中性アミノ酸を含み、前記中性アミノ酸としてグリシンを含む、前記［３］に記載のウイルス凝集剤。
［６］前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量の質量比が、１：[１～１００]である、前記［２］に記載のウイルス凝集剤。
［７］前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量：前記１つ以上のアミノ酸の合計含量の質量比が、１：[１～１００]：[１～１００]である、前記［３］に記載のウイルス凝集剤。
［８］前記ウイルスが、コロナウイルスである、前記［１］～［７］のいずれか１つに記載のウイルス凝集剤。
［９］ウイルス除去用前処理剤として用いられる、前記［１］～［７］のいずれか１つに記載のウイルス凝集剤。
［１０］ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩と、アスコルビン酸及び／又はその塩とを含む、ウイルス阻害剤。
［１１］酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸をさらに含む、前記［１０］に記載のウイルス阻害剤。
［１２］前記酸性アミノ酸を含み、前記酸性アミノ酸としてグルタミン酸を含む、前記［１１］に記載のウイルス阻害剤。
［１３］前記中性アミノ酸を含み、前記中性アミノ酸としてグリシンを含む、前記［１１］に記載のウイルス阻害剤。
［１４］前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量の質量比が、１：[１～１０]０である、前記［１０］に記載のウイルス阻害剤。
［１５］前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量：前記１つ以上のアミノ酸の合計含量の質量比が、１：[１～１００]：[１～１００]である、前記［１１］に記載のウイルス阻害剤。
［１６］前記ウイルスが、コロナウイルスである、前記［１０］～［１５］のいずれか１つに記載のウイルス阻害剤。
［１７］ウイルスを含む溶液に、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩を添加する第１の工程を含むウイルスの除去方法。
［１８］前記第１の工程後に、前記溶液を０．１～２マイクロメートルの細孔径のフィルターでろ過するろ過工程をさらに含む、前記［１７］に記載のウイルスの除去方法。
［１９］前記ろ過工程前に、前記溶液に、アスコルビン酸及び／又はその塩を添加する第２の工程を含む、前記［１８］に記載のウイルスの除去方法。
［２０］前記ろ過工程前に、前記溶液に、酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸を添加する第３の工程を含む、前記［１９］に記載のウイルスの除去方法。
［２］アスコルビン酸及び／又はその塩をさらに含む、前記［１］に記載のウイルス凝集剤。
［３］酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸をさらに含む、前記［２］に記載のウイルス凝集剤。
［４］前記酸性アミノ酸を含み、前記酸性アミノ酸としてグルタミン酸を含む、前記［３］に記載のウイルス凝集剤。
［５］前記中性アミノ酸を含み、前記中性アミノ酸としてグリシンを含む、前記［３］に記載のウイルス凝集剤。
［６］前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量の質量比が、１：[１～１００]である、前記［２］に記載のウイルス凝集剤。
［７］前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量：前記１つ以上のアミノ酸の合計含量の質量比が、１：[１～１００]：[１～１００]である、前記［３］に記載のウイルス凝集剤。
［８］前記ウイルスが、コロナウイルスである、前記［１］～［７］のいずれか１つに記載のウイルス凝集剤。
［９］ウイルス除去用前処理剤として用いられる、前記［１］～［７］のいずれか１つに記載のウイルス凝集剤。
［１０］ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩と、アスコルビン酸及び／又はその塩とを含む、ウイルス阻害剤。
［１１］酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸をさらに含む、前記［１０］に記載のウイルス阻害剤。
［１２］前記酸性アミノ酸を含み、前記酸性アミノ酸としてグルタミン酸を含む、前記［１１］に記載のウイルス阻害剤。
［１３］前記中性アミノ酸を含み、前記中性アミノ酸としてグリシンを含む、前記［１１］に記載のウイルス阻害剤。
［１４］前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量の質量比が、１：[１～１０]０である、前記［１０］に記載のウイルス阻害剤。
［１５］前記ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：前記アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量：前記１つ以上のアミノ酸の合計含量の質量比が、１：[１～１００]：[１～１００]である、前記［１１］に記載のウイルス阻害剤。
［１６］前記ウイルスが、コロナウイルスである、前記［１０］～［１５］のいずれか１つに記載のウイルス阻害剤。
［１７］ウイルスを含む溶液に、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩を添加する第１の工程を含むウイルスの除去方法。
［１８］前記第１の工程後に、前記溶液を０．１～２マイクロメートルの細孔径のフィルターでろ過するろ過工程をさらに含む、前記［１７］に記載のウイルスの除去方法。
［１９］前記ろ過工程前に、前記溶液に、アスコルビン酸及び／又はその塩を添加する第２の工程を含む、前記［１８］に記載のウイルスの除去方法。
［２０］前記ろ過工程前に、前記溶液に、酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸を添加する第３の工程を含む、前記［１９］に記載のウイルスの除去方法。
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、一般的なフィルターでウイルスを除去することを可能にするウイルス凝集剤及びウイルスの除去方法、並びにＰＱＱ単独使用に比べてウイルス阻害率が高められたウイルス阻害剤を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
【0020】
〔ウイルス凝集剤〕
本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という）に係るウイルス凝集剤は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、その誘導体及び／又はそれらの塩を含む。
本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という）に係るウイルス凝集剤は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、その誘導体及び／又はそれらの塩を含む。
【0021】
本実施形態に係るウイルス凝集剤は、ウイルス粒子を凝集させるウイルス凝集作用を有する。ここで、ウイルス凝集作用を有するとは、ウイルス含有液中のウイルス粒子の一部又は全部を凝集させる作用を有していればよい。当該ウイルス凝集作用により、一般的な細孔径（０．１～２μｍ）を有するフィルターを用いたろ過でウイルス含有液からウイルスの一部又は全部を除去し、その濾液中のウイルスを減少させることができる。好ましい実施形態によれば、例えば後述する実施例で行なったウイルス凝集試験でろ過によりウイルスを３％以上減少させることができ、より好ましい実施形態によればろ過によりウイルスを５％以上減少させることができ、さらに好ましい実施形態によればろ過によりウイルスを７％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、又は５５％以上減少させることができる。
【0022】
凝集対象のウイルスは特に限定されない。ウイルスの中でもコロナウイルスが凝集対象として好ましい。コロナウイルスとしては、ヒトに感染するコロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９の原因ウイルスを含む）のほか、動物に感染するコロナウイルス、例えば猫コロナウイルスなどが凝集対象として好適である。風邪のような比較的軽度の呼吸器疾患の原因となるウイルスは、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63及びHCoV-HKU1の４種類が知られており、また、重度の呼吸器疾患の原因となるウイルスは、SARS-CoV（SARSの原因ウイルス）、MERS-CoV（MERSの原因ウイルス）およびSARS-CoV-2（COVID-19の原因ウイルス）の３種類が知られており、これらのウイルスも凝集対象である。
【0023】
本実施形態において用いられるＰＱＱとは、下記式（Ｉ）に記載される化学構造を有する化合物である。
【化1】
【0024】
ＰＱＱは、誘導体の形態で用いてもよい。ＰＱＱの誘導体は、ＰＱＱを例えば、エステル化、アシル化、又はシリル化することで得ることができる。特に、ＰＱＱをエステル化したＰＱＱエステル体が好ましく、例えば、ＰＱＱをトリメチルエステル化したトリメチルエステルＰＱＱ（下記式（ＩＩ））やＰＱＱをジメチルエステル化したジメチルエステルＰＱＱが好ましいものとして挙げられる。さらにトリエチルエステルＰＱＱ、トリプロピルＰＱＱ、トリブチルＰＱＱも好ましいものとして挙げられる。
【化2】
【0025】
ＰＱＱの誘導体としては、ＰＱＱをアミノ酸、例えばグリシンと反応させて得られるイミダゾピロロキノリン（ＩＰＱ）（下記式（ＩＩＩ））も好ましいものとして挙げられる。
【化3】
【0026】
ＰＱＱ及びその誘導体は、塩の形態で用いてもよい。ＰＱＱ及びその誘導体の塩は、上記式中のカルボキシル基のうちの１～３つがアルカリ金属イオン等と塩を形成したものである。ＰＱＱ及びその誘導体の塩としては、特に制限されないが、例えば、アンモニウム塩、ナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属塩が好ましい。特にナトリウム塩が好適であり、モノナトリウム塩、ジナトリウム塩、トリナトリウム塩を使用でき、特にジナトリウム塩であるピロロキノリンキノン二ナトリウム塩が入手しやすく食品登録されているため使用しやすい。
ＰＱＱのジナトリウム塩は下記式（ＩＶ）で示される。好ましくは、下記式（Ｖ）のジナトリウム塩である。
ＰＱＱのジナトリウム塩は下記式（ＩＶ）で示される。好ましくは、下記式（Ｖ）のジナトリウム塩である。
【化4】
【化5】
【0027】
ＰＱＱ、その誘導体及びそれらの塩は、溶媒和物の形態で用いてもよい。溶媒和物としては、例えば、水和物が挙げられ、好ましくは１～３水和物であり、より好ましくは３水和物である。また、結晶溶媒を含む溶媒和物であってもよい。
【0028】
ＰＱＱは通常、上記式（Ｉ）に示される酸化型で提供されるが、酸化型ＰＱＱは容易に還元して還元型ＰＱＱを生成する。そのため、ＰＱＱは還元型であってもよく、還元型ＰＱＱがウイルス凝集剤としては酸化型ＰＱＱよりも好ましい。よって還元型ＰＱＱ、その誘導体及びそれらの塩も使用できる。還元型ＰＱＱは下記式（ＶＩ）で示される。
【化6】
【0029】
以下、単に「ＰＱＱ」と記載する場合、特段明示されない限り、ＰＱＱ（酸化型及び還元型）、その誘導体、それらの塩、及びそれらの溶媒和物を包含するものとする。
【0030】
ＰＱＱは、有機合成又は発酵により製造可能であり、本発明では特に限定されない。有機合成及び発酵による製造方法はいずれも、公知の製造方法により実施できる。市販されているものを使用することもできる。
【0031】
ＰＱＱは、機能性食品分野で多くの生理的機能が報告され、安全性も確認されているため、本実施形態に係るウイルス凝集剤は、細胞毒性が無く、ヒト等の動物に対して十分な安全性を有しているといえる。
【0032】
本実施形態に係るウイルス凝集剤は、アスコルビン酸及び／又はその塩をさらに含むことが好ましい。ＰＱＱに加えて、アスコルビン酸及び／又はその塩をさらに含むことにより、ウイルス凝集作用を高めることができる。すなわち、一般的な細孔径（０．１～２μｍ）を有するフィルターを用いたろ過によりウイルス含有液からウイルスを除去できる割合を高め、その濾液中のウイルスを減少させる割合を高めることができる。
【0033】
アスコルビン酸塩としては、例えばアスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウムなどが好適であり、アスコルビン酸ナトリウムがより好適である。食品で使用するグレードが好ましい。
【0034】
アスコルビン酸及び／又はその塩は、ウイルス含有液に添加前に、ＰＱＱと混合してウイルス凝集剤としてもよいし、ＰＱＱとアスコルビン酸及び／又はその塩とをそれぞれウイルス含有液に添加した後に液中で混合してウイルス凝集剤としてもよい。したがって、本実施形態に係るウイルス凝集剤には、ＰＱＱとアスコルビン酸及び／又はその塩とが混合された組成物の状態の実施形態のみならず、それぞれが単品としてセットで製造販売されるようなキット製品としての実施形態も包含される。
【0035】
本実施形態に係るウイルス凝集剤は、酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸をさらに含むことが好ましい。ＰＱＱに加えて、当該アミノ酸をさらに含むことにより、ウイルス凝集作用を高めることができる。すなわち、一般的な細孔径（０．１～２μｍ）を有するフィルターを用いたろ過によりウイルス含有液からウイルスを除去できる割合を高め、その濾液中のウイルスを減少させる割合を高めることができる。上記アミノ酸は、アスコルビン酸及び／又はその塩との併用がより好ましい。
【0036】
アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン（スレオニン）、バリン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、グリシン、アラニンを好適に使用できる。好ましくは、酸性アミノ酸である。具体的にはアスパラギン酸、グルタミン酸である。より好ましくは、グルタミン酸である。中性アミノ酸を含有することも好ましく、特にグリシンを含むことが好ましい。リジン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性アミノ酸を含有することもできるが、含有しないことが好ましい。
【0037】
アミノ酸の塩は特に限定されないが、例えば、カルボキシル基等の酸性基に対しては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン等の有機アミンとの塩が挙げられる。アミノ基等の塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩が挙げられる。
【0038】
上記アミノ酸は、ウイルス含有液に添加前に、ＰＱＱやアスコルビン酸及び／又はその塩と混合してウイルス凝集剤としてもよいし、ＰＱＱ、アスコルビン酸及び／又はその塩、上記アミノ酸をそれぞれウイルス含有液に添加した後に液中で混合してウイルス凝集剤としてもよい。したがって、本実施形態に係るウイルス凝集剤には、ＰＱＱ、アスコルビン酸及び／又はその塩、及び上記アミノ酸が混合された組成物の状態の実施形態のみならず、それぞれが単品としてセットで製造販売されるようなキット製品としての実施形態も包含される。
【0039】
本実施形態に係るウイルス凝集剤は、ＰＱＱをウイルス凝集作用の有効量、含有していればよく、その含有量は限定されるものではない。例えば、ウイルス含有液に添加後のＰＱＱ濃度が０．１μＭ～５００μＭとなるような含有量であればよい。好ましくは、同濃度が５～１００μＭとなるような含有量である。
【0040】
アスコルビン酸及び／又はその塩のウイルス凝集剤中の含有量は、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量の質量比が、１：[１～１００]となるような含有量であることが好ましい。当該質量比は、より好ましくは１：[１～２０]であり、さらに好ましくは１：[２～１０]である。
【0041】
アミノ酸のウイルス凝集剤中の含有量は、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量：上記１つ以上のアミノ酸の合計含量の質量比が、１：[１～１００]：[１～１００]となるような含有量であることが好ましい。当該質量比は、より好ましくは１：[１～２０]：[１～２０]であり、さらに好ましくは１：[２～１０]：[２～１０]である。
【0042】
本実施形態に係るウイルス凝集剤は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、から選ばれる１以上をさらに含むことが好ましい。ＰＱＱに加えて、塩化カルシウム等をさらに含むことにより、ウイルス凝集作用を高めることができる。すなわち、一般的な細孔径（０．１～２μｍ）を有するフィルターを用いたろ過によりウイルス含有液からウイルスを除去できる割合を高め、その濾液中のウイルスを減少させる割合を高めることができる。
【0043】
本実施形態に係るウイルス凝集剤は、ウイルス除去工程の前工程において、例えば次に説明するウイルスの除去方法の第１の工程において、ウイルスの除去を次工程以降で可能にするための前処理（具体的にはウイルス粒子の凝集化）を行なうウイルス除去用前処理剤として用いることができる。
【0044】
〔ウイルスの除去方法〕
本実施形態に係るウイルスの除去方法は、ウイルスを含む溶液に、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩を添加する第１の工程を含む。添加後、これらを混合することにより、ウイルス粒子の一部又は全部を凝集させることができる。
本実施形態に係るウイルスの除去方法は、ウイルスを含む溶液に、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩を添加する第１の工程を含む。添加後、これらを混合することにより、ウイルス粒子の一部又は全部を凝集させることができる。
【0045】
本実施形態に係るウイルスの除去方法は、上記第１の工程後に、ＰＱＱが添加されたウイルスを含む溶液を０．１～２μｍの細孔径のフィルターでろ過するろ過工程をさらに含むことが好ましい。フィルターの細孔径は０．１～１．５μｍが好ましく、０．１～１μｍがより好ましく、０．１～０．５μｍがさらに好ましい。一般的なフィルターとして０．２μｍ～０．５μｍが安価で使用しやすい。フィルターの材料は目的に合わせて選択できる。セラミック、高分子で作られたものどちらでもよい。好ましくはＰＴＦＥ(ポリテトラフルオロエチレン)、ＰＶＤＦ(ポリフッ化ビニリデン)、ＰＥＳ(ポリエーテルスルホン)、ナイロン、セルロース混合エステル、ポリプロピレン、セルロースが使用しやすく好ましい。
【0046】
ろ過は、ポンプ、シリンジどちらでも使用できる。フィルターの耐圧やサイズに合わせて使用できる。
【0047】
ろ過工程により、液中からウイルスの一部又は全部が除去される。凝集したウイルスを除去する手段は、上記ろ過に限られず、公知の除去手段を用いることができる。例えば、より細かい細孔径のフィルターを用いたろ過を行なってもよい。
【0048】
本実施形態に係るウイルスの除去方法は、上記ろ過工程前に、ウイルスを含む溶液に、アスコルビン酸及び／又はその塩を添加する第２の工程を含むことが好ましい。第２の工程は、第１の工程の前又は後に行ってもよいし、第１の工程と同時に行ってもよい。第１の工程と同時に行なう場合には、アスコルビン酸及び／又はその塩をＰＱＱと事前に混合しておいて同時に添加してもよいし、別々に同時に添加してもよい。
【0049】
本実施形態に係るウイルスの除去方法は、上記ろ過工程前に、ウイルスを含む溶液に、酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸を添加する第３の工程を含むことが好ましい。第３の工程は、第１の工程の前又は後に行ってもよいし、第１の工程と同時に行ってもよい。また、第３の工程は、第２の工程の前又は後に行ってもよいし、第２の工程と同時に行ってもよい。第１の工程及び／又は第２の工程と同時に行なう場合には、上記アミノ酸をＰＱＱ、及び／又はアスコルビン酸等と事前に混合しておいて同時に添加してもよいし、別々に同時に添加してもよい。
【0050】
ＰＱＱ、アスコルビン酸及び／又はその塩、及び上記アミノ酸は、ウイルスを含む溶液への添加時において粉末、溶液のどちらでもよい。添加時のウイルスを含む溶液のｐＨは弱酸性から弱塩基性が使用できる。ｐＨを強酸性又は強塩基性にすると、飲料や医薬品の製造に適さなくなる。好ましくは、ｐＨ２．５～８．５である。添加時のウイルスを含む溶液の温度は特に制限されないが、０℃～４５℃が好ましい。０℃以下では凍結して有効性を示さない。また、４５℃以上では熱殺菌された状態となるためウイルスの除去に有効性が見いだせない。さらに医薬品では変質して好ましくない。
【0051】
添加混合時間は、目的に合わせて適宜決定できる。１分から７２時間程度ウイルスと接触させることで有効性を示すことができる。好ましくは５分から６時間である。
【0052】
各用語の定義や、各成分の含有量や含有比率などについては、ウイルス凝集剤で説明したのと同様である。
【0053】
〔ウイルス阻害剤〕
本実施形態に係るウイルス阻害剤は、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩と、アスコルビン酸及び／又はその塩とを含む。ウイルス、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩、アスコルビン酸及び／又はその塩といった各用語の定義については、ウイルス凝集剤で説明したのと同様である。
本実施形態に係るウイルス阻害剤は、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩と、アスコルビン酸及び／又はその塩とを含む。ウイルス、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩、アスコルビン酸及び／又はその塩といった各用語の定義については、ウイルス凝集剤で説明したのと同様である。
【0054】
本実施形態に係るウイルス阻害剤は、ウイルスの活性を阻害する作用を有しており、ＰＱＱ単独使用の場合に比べて、ＰＱＱ同濃度比較でウイルス活性阻害効果を高めることができる。好ましい実施形態によれば、例えば後述する実施例で行なったプラークアッセイでＰＱＱ単独使用（比較例）の場合に比べて、ＰＱＱ同濃度比較でウイルス阻害率を１．２倍以上、より好ましくは１．３倍以上、さらに好ましくは１．４倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上高めることができる。
【0055】
本実施形態に係るウイルス阻害剤は、酸性アミノ酸、中性アミノ酸及びそれらの塩から選ばれる１つ以上のアミノ酸をさらに含むことが好ましい。ＰＱＱに加えて、当該アミノ酸をさらに含むことにより、ウイルス活性阻害作用を高めることができる。
【0056】
アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン（スレオニン）、バリン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、グリシン、アラニンを好適に使用できる。好ましくは、酸性アミノ酸である。具体的にはアスパラギン酸、グルタミン酸である。より好ましくは、グルタミン酸である。中性アミノ酸を含有することも好ましく、特にグリシンを含むことが好ましい。リジン、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性アミノ酸を含有することもできるが、含有しないことが好ましい。
【0057】
アミノ酸の塩は特に限定されないが、例えば、カルボキシル基等の酸性基に対しては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン等の有機アミンとの塩が挙げられる。アミノ基等の塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩が挙げられる。
【0058】
上記アミノ酸は、ウイルス含有液に添加前に、ＰＱＱやアスコルビン酸及び／又はその塩と混合してウイルス阻害剤としてもよいし、ＰＱＱ、アスコルビン酸及び／又はその塩、上記アミノ酸をそれぞれウイルス含有液に添加した後に液中で混合してウイルス阻害剤としてもよい。したがって、本実施形態に係るウイルス阻害剤には、ＰＱＱ、アスコルビン酸及び／又はその塩、及び上記アミノ酸が混合された組成物の状態の実施形態のみならず、それぞれが単品としてセットで製造販売されるようなキット製品としての実施形態も包含される。
【0059】
本実施形態に係るウイルス阻害剤は、ＰＱＱを有効量、含有していればよく、その含有量は限定されるものではない。ＰＱＱの有効量は、摂取対象の年齢、性別、体重、投与経路、症状の重篤度、その用途、動物種別等によって、適宜、決めることができる。例えば、ＰＱＱジナトリウム３水和物換算で１～５０質量％含有することが好ましく、１０～５０質量％含有することがより好ましく、２０～５０質量％含有することがさらに好ましい。
【0060】
アスコルビン酸及び／又はその塩のウイルス阻害剤中の含有量は、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量の質量比が、１：[１～１００]となるような含有量であることが好ましい。当該質量比は、より好ましくは１：[１～２０]であり、さらに好ましくは１：[２～１０]である。
【0061】
アミノ酸のウイルス阻害剤中の含有量は、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又はそれらの塩の合計含量：アスコルビン酸及び／又はその塩の合計含量：上記１つ以上のアミノ酸の合計含量の質量比が、１：[１～１００]：[１～１００]となるような含有量であることが好ましい。当該質量比は、より好ましくは１：[１～２０]：[１～２０]であり、さらに好ましくは１：[２～１０]：[２～１０]である。
【0062】
本実施形態に係るウイルス阻害剤の投与方法は、経口に限らず、経皮、注射によっても可能であるが、経口投与が好ましい。経口投与の場合、粉末剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル錠、口腔内崩壊錠（ＯＤ錠）、ドリンク剤が好ましい。また、口腔内でのウイルス増殖を抑えるために、うがい薬としても提供可能である。また、食品と混合して使用することができる。ＰＱＱはすでに安全性が確認された機能性食品であり、経口的に容易に摂取できるため、服薬コンプライアンスを実施することが容易である利点を有している。
【0063】
本実施形態に係るウイルス阻害剤は、経口摂取する場合、ＰＱＱ量で１日当たりピロロキノリンキノンジナトリウム換算で１～５０ｍｇになるようにするのがよい。５～４０ｍｇであることがより好ましく、１０～３０ｍｇであることがさらに好ましい。１日当たりの投与回数は、１回でもよいし、複数回でもよい。
【0064】
本実施形態に係るウイルス阻害剤は、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、食品として使用可能な物がよい。目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されないが、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶剤、安定化剤、溶解補助剤、酸化防止剤、着色剤、着香剤、甘味剤等の添加剤が挙げられる。
【0065】
賦形剤としては、特に制限されないが、例えば、糖類（白糖、乳糖、ブドウ糖、マンニトール等）、デンプン（コーンスターチ等）、結晶セルロース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。
【0066】
結合剤としては、特に制限されないが、例えば、α化デンプン、ゼラチン、トラガントガム、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。
【0067】
滑沢剤としては、特に制限されないが、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。
【0068】
崩壊剤としては、特に制限されないが、例えば、デンプン、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、寒天、クエン酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリンなどが挙げられる。
【0069】
溶剤としては、特に制限されないが、例えば、水、エタノール、グリセロール、生理食塩水、食用油等（大豆油、魚油、ミツロウ、ラード、中鎖脂肪酸トリグリセリド）などが挙げられる。
【0070】
安定化剤としては、特に制限されないが、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エチル、プロピレングルコールなどが挙げられる。
【0071】
溶解補助剤としては、特に制限されないが、例えば、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸などが挙げられる。
【0072】
酸化防止剤としては、特に制限されないが、例えば、アスコルビン酸、トコフェロール、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸などが挙げられる。
【0073】
着色剤、着香剤、及び甘味剤としては、医薬及び食品分野において通常添加することが許容されているものがそれぞれ挙げられる。
【0074】
本実施形態に係るウイルス阻害剤の適用対象は、主に哺乳動物である。適当な哺乳動物としては、例えば、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、乳牛、ウマ、ロバ、ブタ）、実験室実験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、コンパニオン・アニマル（例えば、ネコ、イヌ）及び捕らわれの野生動物（例えば、キツネ、シカ、ディンゴ）を挙げることができる。好ましくは、ヒト、猫である。
【0075】
本実施形態に係るウイルス阻害剤は、固形、半固形又は液体の飲食品に含有させて使用できる。具体的には、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、特定保健用食品、病者用食品、高齢者用食品、レトルト食品が挙げられる。より具体的な食品としては、例えば、菓子（クッキー、グミ、ゼリー等）、パン類、ご飯類、魚肉加工品、畜肉加工品、麺類、スープ類、ソース類、惣菜等、飲料（乳飲料、乳酸菌飲料、清涼飲料、野菜飲料、粉末飲料、スポーツ飲料、栄養飲料等）が挙げられる。また、ヒト用の食品に限らず、ペット食品や家畜飼料などとしても提供可能である。
【実施例0076】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【0077】
＜実験材料＞
ＰＱＱは、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩（三菱ガス化学製のＢｉｏＰＱＱ（製品名、登録商標））を使用した。このＢｉｏＰＱＱは三水和物である。ウイルスは、ネココロナウイルスの一種である、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より入手したネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV：WSU 79-1146株）を使用した。ウイルスストック液の作製及びアッセイには、ＪＣＲＢより購入したネコ腎臓由来細胞であるＣＲＦＫ細胞を使用した。また、その他の化合物や試薬については、特に断りのない限り富士フィルム和光純薬株式会社製の製品を使用した。以下は文献に従って合成した。還元型ＰＱＱ（ＲＰＱＱ）は、ＰＱＱをＶＣ（アスコルビン酸）により還元することにより製造した（Acta Crystallogr B Struct Sci Cryst Eng Mater. 2017 Jun 1;73(Pt 3):489-497.）。イミダゾロピロロキノリン（ＩＰＱ）は、好気条件下でＰＱＱとグリシンとを反応させることにより生成した（J Am Chem Soc 1995, 117 (11), 3278-3279.）。ＰＱＱトリメチルエステル（ＰＱＱ－ＴＭＥ）は、硫酸ジメチルによるＰＱＱメチル化によって合成した（Eur J Biochem 1980, 108 (1), 187-192.）。
ＰＱＱは、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩（三菱ガス化学製のＢｉｏＰＱＱ（製品名、登録商標））を使用した。このＢｉｏＰＱＱは三水和物である。ウイルスは、ネココロナウイルスの一種である、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より入手したネコ伝染性腹膜炎ウイルス（FIPV：WSU 79-1146株）を使用した。ウイルスストック液の作製及びアッセイには、ＪＣＲＢより購入したネコ腎臓由来細胞であるＣＲＦＫ細胞を使用した。また、その他の化合物や試薬については、特に断りのない限り富士フィルム和光純薬株式会社製の製品を使用した。以下は文献に従って合成した。還元型ＰＱＱ（ＲＰＱＱ）は、ＰＱＱをＶＣ（アスコルビン酸）により還元することにより製造した（Acta Crystallogr B Struct Sci Cryst Eng Mater. 2017 Jun 1;73(Pt 3):489-497.）。イミダゾロピロロキノリン（ＩＰＱ）は、好気条件下でＰＱＱとグリシンとを反応させることにより生成した（J Am Chem Soc 1995, 117 (11), 3278-3279.）。ＰＱＱトリメチルエステル（ＰＱＱ－ＴＭＥ）は、硫酸ジメチルによるＰＱＱメチル化によって合成した（Eur J Biochem 1980, 108 (1), 187-192.）。
【0078】
＜細胞培養及び実験用ウイルスストック液の作製＞
（１）細胞培養
培養液は、Ｅ－ＭＥＭ(WAKO)５００ｍＬに牛胎児血清(Biowest)５０ｍＬ及びペニシリンストレプトマイシンX100(WAKO)５ｍＬを添加し、混合したものを使用した。このＥ－ＭＥＭ培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ2環境下でＣＲＦＫ細胞を培養した。
（１）細胞培養
培養液は、Ｅ－ＭＥＭ(WAKO)５００ｍＬに牛胎児血清(Biowest)５０ｍＬ及びペニシリンストレプトマイシンX100(WAKO)５ｍＬを添加し、混合したものを使用した。このＥ－ＭＥＭ培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ2環境下でＣＲＦＫ細胞を培養した。
【0079】
（２）実験用ウイルスストック液の作製
ビオラモ カルチャーボトル１７５ｃｍ2に上記Ｅ－ＭＥＭ培養液を２５ｍＬ入れ、そこへＣＲＦＫ細胞（８０×１０5 cell/bottle）を植えた。一晩培養後、培養液２５ｍＬを入れ替えた。FIPV：WSU 79-1146株のウイルスストック液１ｍＬを培養液に加えた。３日間培養後、ボトルを－６０℃の冷凍庫に入れて培養液を凍らせた。２４時間後、ボトルを冷凍庫から取り出して培養液を解凍し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）して沈殿物を除いた。沈殿物を除いた培養液を０．２２μｍフィルターでろ過し、実験用ウイルスストック液を作製した。使用時までウイルスストック液を－６０℃で保存した。このウイルスストック液のプラークフォーミングユニットは、２×１０5PFU／ｍＬであった。
ビオラモ カルチャーボトル１７５ｃｍ2に上記Ｅ－ＭＥＭ培養液を２５ｍＬ入れ、そこへＣＲＦＫ細胞（８０×１０5 cell/bottle）を植えた。一晩培養後、培養液２５ｍＬを入れ替えた。FIPV：WSU 79-1146株のウイルスストック液１ｍＬを培養液に加えた。３日間培養後、ボトルを－６０℃の冷凍庫に入れて培養液を凍らせた。２４時間後、ボトルを冷凍庫から取り出して培養液を解凍し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）して沈殿物を除いた。沈殿物を除いた培養液を０．２２μｍフィルターでろ過し、実験用ウイルスストック液を作製した。使用時までウイルスストック液を－６０℃で保存した。このウイルスストック液のプラークフォーミングユニットは、２×１０5PFU／ｍＬであった。
【0080】
＜ウイルス除去量の測定方法＞
フィルターによるウイルス除去量を測定した。
ウイルスと本発明のウイルス凝集剤（ＰＱＱ又はＰＱＱ＋各種被験物質）とを混合したのち、混合液をフィルターろ過し、通過した濾液中のウイルスＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲ測定によって定量した。ウイルスからのＲＮＡ抽出はCell Amp direct RNA prep kit (Takara Bio)を使用した。
One Step (Takara Bio)を使用し、ＲＴ－ｑＰＣＲ反応でＲＮＡ量を定量した。
（ＰＣＲ条件）
ＰＣＲ条件は以下のとおりである。
パターン１（逆転写反応）：４２℃で５分、９５℃で１０秒
パターン２（ＰＣＲ反応）：Cycles ４０、９５℃で５秒、６０℃で３０秒
プライマーは以下の配列のものを用いた。
フィルターによるウイルス除去量を測定した。
ウイルスと本発明のウイルス凝集剤（ＰＱＱ又はＰＱＱ＋各種被験物質）とを混合したのち、混合液をフィルターろ過し、通過した濾液中のウイルスＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲ測定によって定量した。ウイルスからのＲＮＡ抽出はCell Amp direct RNA prep kit (Takara Bio)を使用した。
One Step (Takara Bio)を使用し、ＲＴ－ｑＰＣＲ反応でＲＮＡ量を定量した。
（ＰＣＲ条件）
ＰＣＲ条件は以下のとおりである。
パターン１（逆転写反応）：４２℃で５分、９５℃で１０秒
パターン２（ＰＣＲ反応）：Cycles ４０、９５℃で５秒、６０℃で３０秒
プライマーは以下の配列のものを用いた。
【0081】
【表1】
【0082】
＜ウイルス凝集試験＞
【0083】
（比較例１：コントロール）
作製した実験用ウイルスストック液をＰＢＳ緩衝液で希釈した溶液（２×１０4PFU／ｍＬ）を１ｍＬシリンジとメンブレンディスクフィルター（細孔径０．２０μｍのセルロースアセテート製フィルター：ADVANTEC DISMIC-13CP）を使用してフィルターろ過した。この濾液についてリアルタイムＰＣＲで測定したウイルスＲＮＡ量を１００％とした。この時のウイルスＲＮＡ減少量（以下、ウイルス減少量ということがある）を０とした。
作製した実験用ウイルスストック液をＰＢＳ緩衝液で希釈した溶液（２×１０4PFU／ｍＬ）を１ｍＬシリンジとメンブレンディスクフィルター（細孔径０．２０μｍのセルロースアセテート製フィルター：ADVANTEC DISMIC-13CP）を使用してフィルターろ過した。この濾液についてリアルタイムＰＣＲで測定したウイルスＲＮＡ量を１００％とした。この時のウイルスＲＮＡ減少量（以下、ウイルス減少量ということがある）を０とした。
【0084】
（実施例１）
作製した実験用ウイルスストック液とＰＱＱをＰＢＳ緩衝液を使用して調合した。最終的にウイルス濃度は２×１０4PFU／ｍＬ、ＰＱＱ濃度は８０μg／ｍＬになるように実験を行った。比較例１と同様に、フィルターろ過及びリアルタイムＰＣＲ測定を行った。ウイルス減少量は１０％であった。結果を表２に示す。
作製した実験用ウイルスストック液とＰＱＱをＰＢＳ緩衝液を使用して調合した。最終的にウイルス濃度は２×１０4PFU／ｍＬ、ＰＱＱ濃度は８０μg／ｍＬになるように実験を行った。比較例１と同様に、フィルターろ過及びリアルタイムＰＣＲ測定を行った。ウイルス減少量は１０％であった。結果を表２に示す。
【0085】
（実施例２～７）
実施例１と同様に実験用ウイルスストック液とＰＱＱ及び各種被験物質（表２記載のアスコルビン酸、各種アミノ酸など）を、ＰＢＳ緩衝液を使用して調合した。ウイルス濃度は２×１０4PFU／ｍＬ、ＰＱＱ濃度は８０μｇ/ｍＬ、各種添加剤濃度は４００μｇ/ｍＬとなるように実験を行った。各種試験溶液を３７℃で１時間、インキュベートした。その後、試験溶液を１ｍＬシリンジとメンブレンディスクフィルター（細孔径０．２０μｍのセルロースアセテート製フィルター：ADVANTEC DISMIC-13CP）を使用してろ過し、凝集したウイルス粒子を除去した。濾液中のウイルスを定量化した。
ウイルスＲＮＡの相対比率は、次の計算によって求めた。
ウイルスＲＮＡ(相対比率)＝２＾（－（コントロールのＣｔ値－各サンプルのＣｔ値））
これより、ウイルス減少量を１００×｛１－ウイルスＲＮＡ（相対比率）｝により算出した。結果を表２に示す。
実施例１と同様に実験用ウイルスストック液とＰＱＱ及び各種被験物質（表２記載のアスコルビン酸、各種アミノ酸など）を、ＰＢＳ緩衝液を使用して調合した。ウイルス濃度は２×１０4PFU／ｍＬ、ＰＱＱ濃度は８０μｇ/ｍＬ、各種添加剤濃度は４００μｇ/ｍＬとなるように実験を行った。各種試験溶液を３７℃で１時間、インキュベートした。その後、試験溶液を１ｍＬシリンジとメンブレンディスクフィルター（細孔径０．２０μｍのセルロースアセテート製フィルター：ADVANTEC DISMIC-13CP）を使用してろ過し、凝集したウイルス粒子を除去した。濾液中のウイルスを定量化した。
ウイルスＲＮＡの相対比率は、次の計算によって求めた。
ウイルスＲＮＡ(相対比率)＝２＾（－（コントロールのＣｔ値－各サンプルのＣｔ値））
これより、ウイルス減少量を１００×｛１－ウイルスＲＮＡ（相対比率）｝により算出した。結果を表２に示す。
【0086】
【表2】
【0087】
表２から、ＰＱＱはウイルス減少効果、すなわち、一般的なフィルターを用いたろ過によるウイルス除去効果を有していることが分かる。ウイルス減少効果は、アスコルビン酸や塩化カルシウムなどとの併用により向上した。特に、ＰＱＱとアスコルビン酸及び酸性アミノ酸との併用（実施例５及び６）により、そのウイルス減少効果が飛躍的に向上した。
【0088】
上記のことから、フィルターの細孔を通過する大きさのウイルス粒子がＰＱＱにより凝集してフィルターの細孔を通過できなくなったと考えられる。このことを粒子径測定により確認した。
【0089】
＜粒子径分布の確認＞
（１）実験準備
ウイルス濃縮（５０ｍＬから１．５ｍＬへ３３倍濃縮）を以下の通り行なった。
ＣＲＦＫ細胞を１７５ｃｍ2ボトル２本にコンフルエントになるように３７℃、５％ＣＯ2環境下で培養した。培地を抜き、培地２５ｍＬとウイルスストック液８００μＬをボトルに入れた。３日間、培養した。ボトルを－８０℃で凍結後、室温で培地を解凍した。０．４５μｍフィルターでろ過して５０ｍＬウイルス溶液（２×１０5PFU／ｍＬ）を得た。この５０ｍＬウイルス溶液を４本の限外ろ過膜CFU100Kに入れた。３０００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離した。ウイルス濃縮液４ｍＬを得た。これにＰＢＳ緩衝液１６ｍＬを加え、２本の限外ろ過膜CFU100Kに入れた。３０００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離した。ウイルス濃縮液２ｍＬを得た。これにＰＢＳ緩衝液８ｍＬを加え、１本の限外ろ過膜CFU100Kに入れた。３０００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離した。ウイルス濃縮液１．５ｍＬを得た。２００μＬずつ分注した。この溶液を粒子径測定に使用した。
（１）実験準備
ウイルス濃縮（５０ｍＬから１．５ｍＬへ３３倍濃縮）を以下の通り行なった。
ＣＲＦＫ細胞を１７５ｃｍ2ボトル２本にコンフルエントになるように３７℃、５％ＣＯ2環境下で培養した。培地を抜き、培地２５ｍＬとウイルスストック液８００μＬをボトルに入れた。３日間、培養した。ボトルを－８０℃で凍結後、室温で培地を解凍した。０．４５μｍフィルターでろ過して５０ｍＬウイルス溶液（２×１０5PFU／ｍＬ）を得た。この５０ｍＬウイルス溶液を４本の限外ろ過膜CFU100Kに入れた。３０００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離した。ウイルス濃縮液４ｍＬを得た。これにＰＢＳ緩衝液１６ｍＬを加え、２本の限外ろ過膜CFU100Kに入れた。３０００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離した。ウイルス濃縮液２ｍＬを得た。これにＰＢＳ緩衝液８ｍＬを加え、１本の限外ろ過膜CFU100Kに入れた。３０００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離した。ウイルス濃縮液１．５ｍＬを得た。２００μＬずつ分注した。この溶液を粒子径測定に使用した。
【0090】
（２）粒子径の測定
各サンプルは１％グルタルアルデヒド＋１％ホルムアルデヒド溶液で固定化及び不活化した。Horiba Nano Particle analyzer (SZ-100)を使用し、リン酸バッファー（ｐＨ７．４、GIBCO）で１００倍希釈して、各サンプルの粒子径を計測した。結果を表３及び図１～３に示す。これより、ウイルス粒子はＰＱＱで処理することで凝集し、巨大化したことが分かる。
各サンプルは１％グルタルアルデヒド＋１％ホルムアルデヒド溶液で固定化及び不活化した。Horiba Nano Particle analyzer (SZ-100)を使用し、リン酸バッファー（ｐＨ７．４、GIBCO）で１００倍希釈して、各サンプルの粒子径を計測した。結果を表３及び図１～３に示す。これより、ウイルス粒子はＰＱＱで処理することで凝集し、巨大化したことが分かる。
【0091】
【表3】
【0092】
＜還元型ＰＱＱ及びＰＱＱ誘導体によるウイルス凝集作用の確認＞
本試験では還元型ＰＱＱ、及びＰＱＱ誘導体であるイミダゾピロロキノリン（ＩＰＱ）とトリメチルエステルＰＱＱを使用した。
ＰＱＱ誘導体化はＤＭＳＯで５０ｍＭになるように溶かしてＰＢＳ緩衝液で１００μＭになるように希釈した。また、アスコルビン酸（ＶＣ）とグルタミン酸を添加する場合はそれぞれ０．８μｇ／μＬになるように調整した。前述したウイルス凝集試験を同様にして実施した。結果を表４に示す。
これより、酸化型ＰＱＱよりも還元型ＰＱＱやトリメチルエステルＰＱＱの方がウイルス減少効果、すなわち、ウイルス凝集作用が高いことが確認された。
本試験では還元型ＰＱＱ、及びＰＱＱ誘導体であるイミダゾピロロキノリン（ＩＰＱ）とトリメチルエステルＰＱＱを使用した。
ＰＱＱ誘導体化はＤＭＳＯで５０ｍＭになるように溶かしてＰＢＳ緩衝液で１００μＭになるように希釈した。また、アスコルビン酸（ＶＣ）とグルタミン酸を添加する場合はそれぞれ０．８μｇ／μＬになるように調整した。前述したウイルス凝集試験を同様にして実施した。結果を表４に示す。
これより、酸化型ＰＱＱよりも還元型ＰＱＱやトリメチルエステルＰＱＱの方がウイルス減少効果、すなわち、ウイルス凝集作用が高いことが確認された。
【0093】
【表4】
【0094】
＜プラークアッセイ＞
（使用培地）
培地１：Ｅ－ＭＥＭ(WAKO)５００ｍLに牛胎児血清(Biowest)５０ｍL及びペニシリンストレプトマイシンX100(WAKO)５ｍＬを混合した培養液
培地２：カルボキシメチルセルロース１％入り培地１
（使用培地）
培地１：Ｅ－ＭＥＭ(WAKO)５００ｍLに牛胎児血清(Biowest)５０ｍL及びペニシリンストレプトマイシンX100(WAKO)５ｍＬを混合した培養液
培地２：カルボキシメチルセルロース１％入り培地１
【0095】
（プラークアッセイ（その１））
ＣＲＦＫ細胞を２×１０5cell/wellになるように２４wellプレートに培地１を１ｍＬ入れ、一晩培養した。実験用ウイルスストック液（ウイルス量１００PFU）と表５記載の最終濃度になる量の各種ウイルス阻害剤の培地（比較例３は培地のみ）とを使って混合液２００μＬを作り、３７℃で１時間処理した。この混合液を培地を抜いた細胞に１時間接触させた。ここへ培地２を１ｍＬ入れた。３日後、培地を抜いてパラホルムアルデヒド１０％ＰＢＳに１時間処理して固定した。液を抜き、水洗浄した。クリスタルバイオレットで染色した。プラーク数を数えてウイルスの阻害率を計測した。結果を表５に示す。プラークは容器一面に増殖した細胞にウイルス感染によって細胞が破壊されてできる穴を意味する。この数はウイルス数と一致する。
ＣＲＦＫ細胞を２×１０5cell/wellになるように２４wellプレートに培地１を１ｍＬ入れ、一晩培養した。実験用ウイルスストック液（ウイルス量１００PFU）と表５記載の最終濃度になる量の各種ウイルス阻害剤の培地（比較例３は培地のみ）とを使って混合液２００μＬを作り、３７℃で１時間処理した。この混合液を培地を抜いた細胞に１時間接触させた。ここへ培地２を１ｍＬ入れた。３日後、培地を抜いてパラホルムアルデヒド１０％ＰＢＳに１時間処理して固定した。液を抜き、水洗浄した。クリスタルバイオレットで染色した。プラーク数を数えてウイルスの阻害率を計測した。結果を表５に示す。プラークは容器一面に増殖した細胞にウイルス感染によって細胞が破壊されてできる穴を意味する。この数はウイルス数と一致する。
【0096】
（プラークアッセイ（その２））
ＣＲＦＫ細胞を２×１０5cell/wellになるように２４wellプレートに培地１を１ｍＬ入れ、一晩培養した。実験用ウイルスストック液（ウイルス量１００PFU）と表６記載の最終濃度になる量の各種ウイルス阻害剤の培地（比較例６は培地）を使って混合液２００μＬを作り、３７℃で１時間処理した。この混合液を培地を抜いた細胞に１時間接触させた。その後、液を抜き、培地で洗浄した。ここへ培地２を１ｍＬ入れた。３日後、培地を抜いてパラホルムアルデヒド１０％ＰＢＳに１時間処理して固定した。液を抜き、水洗浄した。クリスタルバイオレットで染色した。プラーク数を数えてウイルスの阻害率を計測した。結果を表６に示す。
ＣＲＦＫ細胞を２×１０5cell/wellになるように２４wellプレートに培地１を１ｍＬ入れ、一晩培養した。実験用ウイルスストック液（ウイルス量１００PFU）と表６記載の最終濃度になる量の各種ウイルス阻害剤の培地（比較例６は培地）を使って混合液２００μＬを作り、３７℃で１時間処理した。この混合液を培地を抜いた細胞に１時間接触させた。その後、液を抜き、培地で洗浄した。ここへ培地２を１ｍＬ入れた。３日後、培地を抜いてパラホルムアルデヒド１０％ＰＢＳに１時間処理して固定した。液を抜き、水洗浄した。クリスタルバイオレットで染色した。プラーク数を数えてウイルスの阻害率を計測した。結果を表６に示す。
【0097】
【表5】
【0098】
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】