特開 2025-155369 マイコプラズマ・ジェニタリウム検出用の塩基配列及びその関連技術

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025155369

(43)【公開日】2025-10-14

(54)【発明の名称】マイコプラズマ・ジェニタリウム検出用の塩基配列及びその関連技術

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20251006BHJP

   C12Q 1/689 20180101ALI20251006BHJP

   C12Q 1/6874 20180101ALI20251006BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20251006BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12Q1/689 Z

C12Q1/6874 Z

C12Q1/686 Z

【審査請求】有

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024059173

(22)【出願日】2024-04-01

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

３．ノニデット

(71)【出願人】

【識別番号】598034720

【氏名又は名称】株式会社ミズホメディー

(71)【出願人】

【識別番号】591222245

【氏名又は名称】国立感染症研究所長

(74)【代理人】

【識別番号】100097179

【弁理士】

【氏名又は名称】平野 一幸

(72)【発明者】

【氏名】石橋 直人

(72)【発明者】

【氏名】小松 眞也

(72)【発明者】

【氏名】森 健

(72)【発明者】

【氏名】志牟田 健

(72)【発明者】

【氏名】大西 真

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ06

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】      （修正有）

【課題】他のマイコプラズマ属とは反応性を示せず、マイコプラズマ・ジェニタリウムの野生型・変異型を問わず網羅的に検出できる検出用の塩基配列を提供する。
【解決手段】マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０９６位～２１１９位の塩基配列であり、その中で連続する少なくとも２０塩基を含む塩基配列もしくはこの塩基配列と相補的な塩基配列を、第１のプライマーとして使用する。
【選択図】図１１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０９６位～２１１９位の塩基配列であって、連続する少なくとも２０塩基を含む塩基配列もしくは前記塩基配列と相補的な塩基配列。

【請求項2】

請求項１記載の塩基配列を第１のプライマーとして使用するマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法。

【請求項3】

さらに、マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０２７位～２０５０位の塩基配列であって、連続する少なくとも２０塩基を含む塩基配列もしくは前記塩基配列と相補的な塩基配列を第２のプライマーとして使用する請求項２記載のマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法。

【請求項4】

さらに、マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０５４位～２０７８位の塩基配列もしくは前記塩基配列と相補的な塩基配列を標識プローブとして使用する請求項３記載のマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法。

【請求項5】

前記標識プローブは、標的とハイブリダイズすると消光する蛍光消光色素で標識されている請求項４記載のマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法。

【請求項6】

ＰＣＲの検出温度条件が、第１の温度と、前記第１の温度とは異なる第２の温度とを用いて設定され、マイコプラズマ・ジェニタリウムを検出し、且つ、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中のマクロライド耐性変異の有無を検出する請求項５記載のマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法。

【請求項7】

前記第１の温度が５０～５８℃の範囲で設定され、前記第２の温度が６６～７０℃の範囲で設定される請求項６記載のマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法。

【請求項8】

請求項１記載の塩基配列からなる第１のプライマーと、請求項３記載の塩基配列からなる第２のプライマーと、請求項４記載の塩基配列からなる標識プローブとを使用して、マイコプラズマ・ジェニタリウムを検出しマクロライド耐性を識別するための試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）を特異的に検出するための塩基配列及びその関連技術、特に、マイコプラズマ・ジェニタリウムのマクロライドの検出方法及びマクロライド耐性の判別方法並びに試薬に関する。

【背景技術】

【0002】

性感染症は性的な接触によって感染する病気である。感染しても無症状の場合があり、知らない間に他人に感染させてしまうことがある。代表的な性感染症原因菌としては、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、マイコプラズマ・ジェニタリウムがあり、その混合感染も頻繁に確認されている。これら性感染症原因菌のうち、マイコプラズマ・ジェニタリウムは、女性では無症状感染が多い一方、男性では有症状の割合が高く、尿道炎全体の６０～７０％にあたる非淋菌性尿道炎のうち、１４～１６％がマイコプラズマ・ジェニタリウム尿道炎と報告されている。

【0003】

性感染症の治療には、静菌作用又は殺菌作用を示す物質である抗菌薬が広く用いられている。抗菌薬には、マクロライド系、テトラサイクリン系、ニューキノロン系等の種類があり、それぞれ作用機序が異なり標的とするターゲットも異なる。ただし、各抗菌薬の標的となるターゲットに一塩基変異や欠損が生じた場合に、これらの抗菌薬が作用できず効果が得られないことがある。

【0004】

マイコプラズマ・ジェニタリウム感染症についても、抗菌薬の効果が得られ難い、クラミジア感染症と同じ抗菌薬での治療困難例が増加している。その中でもわが国ではマクロライド系抗菌薬の耐性の割合が高く、４０％以上と考えられている。マクロライド系抗菌薬に対して耐性を持つマイコプラズマ・ジェニタリウムの変異株は、その２３Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列の２０５８位および２０５９位（Ｅ．ｃｏｌｉ ｎｕｍｂｅｒｒｉｎｇで定められる位置）に一塩基変異を有することによって耐性を示すことが報告されている（非特許文献１参照。）。

【0005】

マイコプラズマ・ジェニタリウムのマクロライド系抗菌薬に対する耐性を識別する方法として、以下の２つ方法が報告されている。
（１）マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の特定の塩基配列をシークエンス用プライマーに用いたシークエンス解析による方法（非特許文献２）
（２）マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の特定の塩基配列を標識プローブとして用いた融解曲線分析による方法（特許文献１（特開２０２３－１３０６６３号公報）及び特許文献２（特表２０２３－５３４４５７号公報）参照。）

【0006】

非特許文献２記載の方法では、核酸精製後にシークエンス解析を実施するため、精製の操作が煩雑であり、迅速性に欠け、解析を行うためには専用の大型装置が必要になるという問題がある。

【0007】

特許文献１、２には、マクロライド系抗菌薬に対する耐性識別が可能であることが記載されている。しかし、マイコプラズマ属の２３Ｓ ｒＲＮＡの配列は、保存性が高く、特異性に問題がある。特に、肺炎マイコプラズマの原因菌であるマイコプラズマ・ニューモニエの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列との相同性が高い。マイコプラズマ・ジェニタリウムは尿道炎や子宮頚管炎を引き起こす代表的な性感染症の原因菌であるが、咽頭中にも存在する。咽頭ぬぐい液を試料とした場合、マイコプラズマ・ジェニタリウムの確定診断をするためには、他のマイコプラズマ属との交差性がないプライマーの塩基配列の設計が求められる。

【0008】

また、マイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法として、ＭｇＰａ接着オペロン内のｍｇｐＢ遺伝子の部分反復（ＭｇＰａｒ）を標的遺伝子とする方法が報告されている（特許文献３（特許第７１４１４８８号公報）参照。）

【0009】

特許文献３に記載の方法は標的遺伝子を複数含むことによって高感度化を実現しているものの、マクロライド系抗菌薬に対する耐性識別を実施できないという問題点がある。

【特許文献1】特開２０２３－１３０６６３号公報

【特許文献2】特表２０２３－５３４４５７号公報

【特許文献3】特許第７１４１４８８号公報

【非特許文献1】Ｋａｉｔｌｉｎ Ａ． Ｔａｇｇ ｅｔ ａｌ．， Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ ａｎｄ Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｊｕｌｙ ２０１３ Ｖｏｌｕｍｅ ５１ Ｎｕｍｂｅｒ ７

【非特許文献2】Ｒｙｏｉｃｈｉ Ｈａｍａｓｕｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＰａｒＣ ａｎｄ ＧｙｒＡ ｏｆ ｍｏｘｉｆｌｏｘａｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ．， ＰＬＯＳ ＯＮＥ １３（６）：ｅ０１９８３５５

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

他のマイコプラズマ属とは反応性を示せず、マイコプラズマ・ジェニタリウムの野生型・変異型を問わず網羅的に検出できる特異性の高い方法の開発が求められている。さらに、薬剤耐性の観点から、野生型及び変異型の両方を検出できるだけでなく、マイコプラズマ・ジェニタリウムのマクロライド系抗菌薬に対する耐性の有無についても、簡便、迅速、高感度に検出する方法が望まれている。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、鋭意検討した結果、特定の塩基配列を有する第１のプライマーを用いることで、マイコプラズマ・ジェニタリウムを特異的に検出できることを見出した。さらに特定の塩基配列を有する第２のプライマーおよび標識プローブを用いることでマイコプラズマ・ジェニタリウムの野生型及び変異型の両方を検出できるだけでなく、マイコプラズマ・ジェニタリウムのマクロライド系抗菌薬の耐性の有無についても特異的、簡便、高感度、迅速に検出することができることを見出した。

【0012】

第１の本発明は、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０９６位～２１１９位の塩基配列であって、連続する少なくとも２０塩基を含む塩基配列もしくはこの塩基配列と相補的な塩基配列からなる第１のプライマーを提供する。これによると、他のマイコプラズマ属とは反応性を示さない、マイコプラズマ・ジェニタリウムを特異的に検出する方法ならびにその試薬を提供することができる。

【0013】

第２の本発明は、第１の発明に加え、マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０２７位～２０５０位の塩基配列であって、連続する少なくとも２０塩基を含む塩基配列もしくはこの塩基配列と相補的な塩基配列を第２のプライマーとして使用する。これによると、高感度にマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法ならびにその試薬を提供することができる。

【0014】

第３の本発明は、マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０５４位～２０７８位の塩基配列もしくはこの塩基配列と相補的な塩基配列を標識プローブとして使用する。これによると、マイコプラズマ・ジェニタリウムのマクロライド系抗菌薬に対する耐性の有無についても識別できる方法ならびにその試薬を提供できる。

【発明の効果】

【0015】

本発明により、マイコプラズマ・ジェニタリウムを特異的、簡便、高感度、迅速に検出できることができる。また、本発明の第１のプライマーに加えて、特定の塩基配列を有する第２のプライマーおよび標識プローブを用いることで、マイコプラズマ・ジェニタリウムの野生型及び変異型の両方を検出できるだけでなく、マイコプラズマ・ジェニタリウムのマクロライド系抗菌薬の耐性の有無についても特異的、簡便、高感度、迅速に検出することができる。

【発明を実施するための最良の形態】

【0016】

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ａ～Ｂ」と記載されていれば、「Ａ以上、Ｂ以下」を示す。

【0017】

また、本明細書では、第１のプライマーや第２のプライマーを単に「プライマー」という場合があり、標識プローブを単に「プローブ」という場合があり、これらを総称して「オリゴヌクレオチド」ともいう場合がある。また、第１のプライマーと第２のプライマーのセットを単に「プライマーセット」という場合がある。

【0018】

また、本明細書では、マクロライド系抗菌薬に対する耐性を持つマイコプラズマ・ジェニタリウムを単に「耐性型」や「変異型」という場合がある。

【0019】

１つの実施形態において、本発明は、特定の塩基配列を有する第１のプライマーを使用することで、マイコプラズマ・ジェニタリウムを特異的に検出する方法を提供する。この方法により、マイコプラズマ・ジェニタリウムを特異的、簡便、高感度、迅速に検出することができる。加えて、特定の塩基配列を有する第２のプライマーおよび標識プローブを使用し、ＰＣＲの検出温度を２温度に設定することで、マイコプラズマ・ジェニタリウムの検出のみならず、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列におけるマクロライド耐性に関連する変異の有無も判定することができる。

【0020】

［マイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法］
１つの実施形態において、検体試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法は、後述の第１のプライマーを用いる方法であることが好ましい。当該方法は、検体試料中のマイコプラズマ・ジェニタリウムの有無を判定する方法であってもよい。
また、当該方法は、検体試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ジェニタリウムを定量する方法であってもよい。
加えて、後述の標識プローブを用いることで、ＰＣＲ法（ＲＴ－ＰＣＲ法）において、検体試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ジェニタリウムを、野生型及び変異型のどちらであっても高感度に検出することができる。
さらにＰＣＲの検出温度を２温度に設定することで、検体試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ジェニタリウムを野生型及び変異型のいずれかを判別して検出することができる。

【0021】

特定の実施形態では、検体試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法は、少なくとも以下の工程（１）及び（２）：
（１）マイコプラズマ・ジェニタリウムを含み得る検体試料を採取する工程、
（２）工程（１）の検体試料を、特定の塩基配列を有するプライマーセットを用いて、マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の一部または全部を鋳型とする核酸増幅反応に供する工程、さらに、増幅反応中で生成された核酸増幅産物を、リアルタイムに特定の塩基配列を有する標識プローブを用いて検出する工程、
を含むことが好ましい。

【0022】

［工程（１）］
工程（１）の検体試料は、マイコプラズマ・ジェニタリウムを含む可能性のあるものであれば特に限定されない。検体試料の例としては、例えば血液、血液培養液、子宮頚管擦過物、膣擦過物、尿道擦過物、尿、咽頭ぬぐい液、後鼻腔ぬぐい液、喀痰、唾液、口腔内擦過物などがあげられるが、これらに限定されない。マイコプラズマ・ジェニタリウムが性感染症の主要な原因菌という観点から、子宮頚管擦過物、尿、尿道擦過物、咽頭ぬぐい液を用いることが好ましい。生体試料の種類に応じて、特に制限はされないが、希釈、懸濁、遠心、酵素処理、濾過、加熱処理、酸処理、アルカリ処理などの前処理もしくは核酸抽出を行ってもよい。

【0023】

検体試料の採取方法、調製方法などは、特に制限されず、検体試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。

【0024】

核酸抽出の方法は、特に制限されないが、検体の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。核酸抽出には、例えば、各メーカーから販売されているキット等を使用してもよい。また、自動抽出精製装置を用いて核酸抽出を行ってもよい。

【0025】

特定の好ましい実施形態において、検体試料は、従来の核酸増幅反応において通常は必須と考えられていた核酸精製工程を省略したものであってもよい。核酸精製を行う場合、専用試薬が必要であることに加えて、作業が煩雑で手間と時間がかかるという問題点がある。

【0026】

核酸精製工程を省略した検体試料を用いる場合、検体試料の採取から遺伝子検査結果を得られるまでの時間を短縮でき、例えばこれまで１日かかっていた作業時間が２時間以内に短縮可能となる。このように、核酸精製工程を経ていない検体試料を用いて本発明の方法を行う場合、核酸精製の手間が省ける分、簡便かつ短時間でマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出することができる。

【0027】

［工程（２）］
１つの実施形態において、工程（２）の核酸増幅反応は、核酸増幅法（（１又は複数のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと）により実施することが好ましい。核酸増幅法は、数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野においても広く用いられている。

【0028】

そのような核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法などがあげられる。これらの技術はすでに当該技術分野において確立されており、目的に合わせて方法を選択することができる。核酸増幅法は、ＰＣＲ法（ＲＴ－ＰＣＲ法を含む）が好ましいが、これに限定されない。

【0029】

以降、工程（２）で行われるＰＣＲ反応およびＰＣＲ反応に用いるオリゴヌクレオチド（第１のプライマー・第２のプライマー・標識プローブ）並びに検出試薬について詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0030】

［ＰＣＲ反応］
ＰＣＲ反応（ＲＴ－ＰＣＲ反応を含む）は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応である。ＰＣＲ反応は、通常、（ｉ）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（ｉｉ）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことを含む。

【0031】

なお、反応の高速化という観点では、上記（ｉｉ）と（ｉｉｉ）とを一体化した反応条件であることが好ましい。また、ＲＴ反応を含む場合は、（ｉ）の前に逆転写反応が実施される。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、そのいずれもが本発明に用いられ得る。

【0032】

ＰＣＲ反応の条件は、反応が進行する限り特に限定されない。例えば、最初の工程（ｉ）を９０～１００℃で１～１８０秒程度行ってもよく、２回目以降の工程（ｉ）を９０～１００℃で１～２０秒行ってもよく、工程（ｉｉ、ｉｉｉ）を５０～７５℃で１～２０秒程度行ってもよい。工程（ｉ）～（ｉｉｉ）までのサイクルは３０～７０回繰り返すことが好ましい。ここで繰り返し行うサイクルの温度及び時間は１サイクル毎に変化させてもよい。

【0033】

好ましい実施形態において、工程（ｉｉ、ｉｉｉ）の第１の温度（５０～５８℃）と第２の温度（６６～７０℃）との２温度で設定することが好ましい。２温度に設定することで、後述するマイコプラズマ・ジェニタリウムの野生型及び変異型の両方を検出並びに識別することが可能となる。

【0034】

［プライマー］
一般的にプライマーのＴｍ値は、５５～６５℃が好ましく、６０～６５℃がさらに好ましいことが知られている。プライマーの長さは１８～３０塩基が好ましく、１８～２５塩基がさらに好ましいことが知られている。

【0035】

［第１のプライマー］
図１１は、本発明の第１のプライマー配列の一覧図である。本発明の第１のプライマーは、マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０９６位～２１１９位の連続する少なくとも２０塩基を含む塩基配列もしくはこの塩基配列と相補的な塩基配列である。

【0036】

好ましい実施形態において、本発明の第１のプライマーの具体例としては、配列番号１～３（図１１参照。）のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列が挙げられる。

【0037】

［第２のプライマー］
図１２は、本発明の第２のプライマー配列の一覧図である。本発明の第２のプライマーは、マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０２７位～２０５０位の連続する少なくとも２０塩基を含む塩基配列もしくはこの塩基配列と相補的な塩基配列である。

【0038】

好ましい実施形態において、本発明の第２のプライマーの具体例としては、配列番号１１～１５（図１２参照。）のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列が挙げられる。さらに好ましくは、配列番号１１～１３のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列が挙げられる。

【0039】

［標識プローブ］
図１３は、本発明の標識プローブ配列の一覧図である。本発明の標識プローブは、マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列２０５４位～２０７８位からなる塩基配列もしくはこの塩基配列と相補的な塩基配列であることが好ましい。

【0040】

また、後述するグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識したプローブとする場合には、当該色素で標識される少なくとも１つの末端塩基がシトシンであることが好ましい。標識プローブの長さとしては、１５～３０塩基であれば特に限定されない。

【0041】

好ましい実施形態において、本発明の標識プローブの具体例としては、配列番号１６（図１３参照。）で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列が挙げられる。

【0042】

上記の標識プローブは、５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。標識プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光又は蛍光を生じるように標識されていることが好ましく、更には、消光を生じるように標識されていることがより好ましい。

【0043】

蛍光色素としては、特に標的の核酸増幅産物とハイブリダイズして複合体を形成することにより蛍光を生じる蛍光物質又は消光を生じる蛍光物質のいずれであってもよいが、好ましくは標的の核酸増幅産物とハイブリダイズした際に消光を生じる蛍光物質であり、特に好ましくは、標的の核酸増幅産物とハイブリダイズにおいてグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素であると良い。具体的には、フルオロセイン及びその誘導体（例えば、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ローダミン及びその誘導体（例えば、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ））、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体（例えば、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ））からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素が挙げられるが、これらに限定されない。

【0044】

特定の好ましい実施形態では、蛍光消光色素で標識されている末端塩基がシトシンであるプローブがより好ましい。このようなプローブは標的の核酸増幅産物にハイブリダイズした際に、核酸増幅産物中のグアニン塩基と塩基対を形成して相互作用することで消光できるため、非常に簡便に反応液の蛍光強度の変化を測定することができる。

【0045】

このように本発明の標識プローブを用いることで、マイコプラズマ・ジェニタリウムの野生型及び変異型の両方を検出できる。更に好ましい実施形態では、検出されたマイコプラズマ・ジェニタリウムが野生型及び変異型のいずれであるかを判別して検出することができる。

【0046】

［マイコプラズマ・ジェニタリウムを検出するための試薬］
本発明は、マイコプラズマ・ジェニタリウムの検出を行う試薬およびマクロライド耐性を識別するための試薬を提供する。試薬には、前述で説明した本発明の第１のプライマー・第２のプライマー・標識プローブに加えて、核酸増幅反応、及び検出に必要な成分を少なくとも含むことが好ましい。

【0047】

当該必要な成分は、それぞれ公知のものを用いることができる。例えば、本発明の試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、及びマグネシウム塩もしくはマンガン塩等の無機塩類を少なくとも含むことが好ましい。各成分の濃度は適宜調整できるが、例えば、第１のプライマー・第２のプライマーの濃度は、０．０１～５μＭが好ましく、０．０５～２μＭがより好ましい。標識プローブの濃度は、０．０１～０．５０μＭ が好ましく、０．０２～０．１０μＭがより好ましい。ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、０．１～５Ｕ／Ｔｅｓｔであることが好ましい。ｄＮＴＰｓの濃度は、０．０２～１ｍＭが好ましく、０．１～０．５ｍＭがより好ましい。マグネシウム塩もしくはマンガン塩等の無機塩類の濃度は、０．１～１０ｍＭが好ましく、１～５ｍＭがより好ましい。

【0048】

さらに、非特異増幅の抑制や反応促進を目的として、本発明の試薬は、当該技術分野で知られる添加物等を含んでいてもよい。非特異増幅の抑制を目的とする添加物としては、例えば、公知の抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体等が挙げられる。反応促進を目的とする添加物としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ベタイン、トレハロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、ノニデットＰ４０等が挙げられる。

【0049】

また、偽陰性の判定を容易にするために、本発明の試薬は、当該分野で公知のインターナルコントロールを含むことも好ましい。本発明では、これらの添加物を１種類単独で又は２種類以上組み合わせて使用してもよい。

【0050】

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。ここで、図１は、本発明の実施例１における温度変化を示すグラフ、図２は、図１の一部拡大図である。図２に示すように、温度の頂部（熱変性温度）と底部（プライマーのアニーリング及びプライマーの伸長温度）とにおいて、それぞれ蛍光測光が行われる。

【0051】

（実施例１～３、比較例１～７）
特異性の確認

【0052】

＜材料及び方法＞
実施例１～３、比較例１～７におけるＰＣＲ法に用いたオリゴヌクレオチドは、（表１）に示す通りである。

【0053】

【表1】

【0054】

実施例１～３、比較例１～７におけるＰＣＲ法に用いた第１のプライマーの融解温度（Ｔｍ値）、および鎖長は、（表２）に示す通りである。なお、プライマーのＴｍ値の計算はＮｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法を用いて行う。

【0055】

【表2】

【0056】

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ＰＣＲ反応液組成は、（表３）に示す通りの要領で調製する。

【0057】

【表3】

【0058】

＜ＰＣＲ反応条件＞
ＰＣＲおよび蛍光測定には、株式会社ミズホメディーより発売されている全自動遺伝子解析装置Ｓｍａｒｔ Ｇｅｎｅ（日本国登録商標）を使用する。蛍光測定時の励起波長と蛍光波長は中心波長５２５ｎｍに設定する。なお、蛍光測定時の励起波長と蛍光波長を中心波長５２５ｎｍに近しい条件で設定・使用できる汎用ＰＣＲ装置でも測定は可能である。汎用ＰＣＲ装置としては、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標） ｎａｎｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）等が挙げられる。ＰＣＲ反応条件は、（表４）に示す通りである。

【0059】

【表4】

【0060】

＜核酸試料＞
実施例１～３、比較例１～７のＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。

【0061】

ＡＴＣＣより購入したマイコプラズマ・ニューモニエ（ＦＨ株、ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５５３１）のＤＮＡ精製品を使用する。なお、ＤＮＡ精製にはＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用する。

【0062】

＜データ解析方法＞
ＱＰｒｏｂｅを用いたデータ解析方法は、特許第４７２４３８０号に記載されている方法を参考に、得られた生データに対して補正演算値処理を行う。

【0063】

増幅反応の全てのサイクルについて、式１による演算を行う。
ｆ［ｎ］＝ｆｈｙｂ．［ｎ］／ｆｄｅｎ．［ｎ］・・・（式１）
ここで、
ｆｎ：（式１）により算出されたｎサイクルにおける蛍光強度値
ｆｈｙｂ．［ｎ］：ｎサイクル目の伸長及び検出ステップの蛍光強度値
ｆｄｅｎ．［ｎ］：ｎサイクル目の変性ステップの蛍光強度値
次に、増幅反応の全てのサイクルについて、次の（式２）で演算を行う。
Ｆ［ｎ］＝ｆ［ｎ］／ｆ［２２］・・・（式２）
ここで、
Ｆ［ｎ］：２２サイクル目の（式１）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値
増幅反応の最終サイクルのＦ［ｎ］の値であるＦ［４６］を、マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定に用いる。

【0064】

＜マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定＞
マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定は、測定試料のＦ［４６］の値と判定閾値を比較して、［測定試料のＦ［４６］＜判定閾値］となる場合に陽性と、そうでない場合陰性と判定する。判定閾値として、マイコプラズマ・ジェニタリウムを含まない陰性試料のＦ［４６］の平均値－標準偏差の５倍（以下、平均－５ＳＤ）の値、即ち、「０．９９１０」を使用する。

【0065】

＜判定方法のフローチャート＞
図３は、本発明の実施例１による判定方法を示すフローチャートである。

【0066】

図４は、本発明の実施例１による相対蛍光値の変化を示すグラフである。図４に示すように、実施例１では、最終サイクルの相対蛍光値（Ｆ［４６］）が判定閾値を下回らず、マイコプラズマ・ジェニタリウム陰性と判定される。（表５）は、マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定結果および最終サイクルの相対蛍光値（Ｆ［４６］）を示すが、実施例１～３では、相対蛍光値（Ｆ［４６］）が判定閾値を下回らず、マイコプラズマ・ジェニタリウム陰性と判定される。

【0067】

図５は、比較例１による相対値の変化を示すグラフである。（表５）は、マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定結果および最終サイクルの相対蛍光値（Ｆ［４６］）を示す。図５に示すように、比較例１～７では、相対蛍光値（Ｆ［４６］）が判定閾値を下回り、マイコプラズマ・ジェニタリウム陽性と判定される。

【0068】

【表5】

【0069】

（結果）
（表５）から明らかなように、マイコプラズマ・ニューモニエのＤＮＡ精製品を核酸試料とした場合、実施例１～３で示した第１のプライマー（マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ＲＮＡ遺伝子配列の２０９６位～２１１９位の塩基配列もしくはこの塩基配列と相補的な塩基配列であって、連続する少なくとも２０塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いる第１のプライマー）を用いた条件では、標識プローブの消光が確認されなかった。このことにより、実施例１～３に用いた第１のプライマーが、マイコプラズマ・ジェニタリウムに対する特異性が高いことが示される。
一方、比較例１～７における第１のプライマーを用いた条件では、明らかな標識プローブの消光が確認される。このことにより、比較例１～７に用いた第１のプライマーがマイコプラズマ・ニューモニエとの交差反応性を示すことを、つまりマイコプラズマ・ジェニタリウムとの特異性が低いことが示される。
実施例１～３に用いた第１のプライマーで最もＴｍ値が低い配列番号２では、Ｔｍ値が５７．０℃で、鎖長が２０塩基となっている。仮に配列番号２の３’末端を１塩基削った塩基配列のＴｍ値は５５．２℃、２塩基削った塩基配列のＴｍ値は５２．８℃となり、好ましい範囲の下限域もしくは下限を下回るため、第１のプライマーの長さは、２０塩基を含むことが好ましいと考えられる。
（実施例４～６、比較例８～９）
野生型マイコプラズマ・ジェニタリウムの検出感度の確認
＜材料及び方法＞
実施例４～６、比較例８～９におけるＰＣＲ法に用いたオリゴヌクレオチドは、（表６）に示す通りである。

【0070】

【表6】

【0071】

実施例４～６、比較例８～９におけるＰＣＲ法に用いた第２のプライマーの融解温度（Ｔｍ値）、および鎖長は（表７）に示す通りである。なお、プライマーのＴｍ値の計算はＮｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法を用いて行う。

【0072】

【表7】

【0073】

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ＰＣＲ反応液組成は、実施例１と同様の要領で調製する。

【0074】

＜ＰＣＲ反応条件＞
ＰＣＲ反応条件は、実施例１と同様である。

【0075】

＜核酸試料＞
実施例４～６、比較例８～９のＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。

【0076】

（野生型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡ）
マイコプラズマ・ジェニタリウム由来のリボソームＲＮＡである２３Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子断片を人工合成後、転写反応にて作製された人工合成ＲＮＡである。

【0077】

前記人工合成ＲＮＡは２３Ｓ ｒＲＮＡの２０５８位、２０５９位を含む配列であり、Ｇ３７株由来の配列を使用する。Ｇ３７株はマクロライド感受性株である。

【0078】

（核酸試料の調製）
上記の人工合成ＲＮＡの長さは、３８０ｎｔである。

【0079】

人工合成ＲＮＡの長さと溶液の濃度（μｇ／μＬ）から１μＬ当たりのコピー数を計算した後、必要に応じて、ＴＥ緩衝溶液を用いて希釈する。

【0080】

＜データ解析方法＞
データ解析方法は、実施例１と同様に実施する。

【0081】

＜マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定＞
マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定方法は、実施例１と同様の要領で実施する。

【0082】

実施例４～６、比較例８～９のマイコプラズマ・ジェニタリウムの判定結果および最終サイクルの相対蛍光値（Ｆ［４６］）を（表８）に示す。

【0083】

ＲＮＡ量が８００コピー／Ｔｅｓｔで実施した場合、実施例４～６、比較例８～９のいずれも相対蛍光値（Ｆ［４６］）が判定閾値を下回り、マイコプラズマ・ジェニタリウム陽性と判定される。

【0084】

ＲＮＡ量が２００コピー／Ｔｅｓｔで実施した場合、実施例４～６、比較例８は相対蛍光値（Ｆ［４６］）が判定閾値を下回り、マイコプラズマ・ジェニタリウム陽性と判定されるが、比較例９は相対蛍光値（Ｆ［４６］）が判定閾値を下回らず、マイコプラズマ・ジェニタリウム陰性と判定される。また、比較例８はマイコプラズマ・ジェニタリウム陽性と判定されるが、相対蛍光値（Ｆ［４６］）は実施例４～６と比較して大きいことが確認される。

【0085】

【表8】

【0086】

（結果）
（表８）から明らかなように、野生型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡを核酸試料とした場合、いずれも良好な結果が示されている。その中でも、実施例４～６で示した第２のプライマー（マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０２７～２０５０位の塩基配列もしくはこの塩基配列と相補的な塩基配列であって、連続する少なくとも２０塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いた第２のプライマー）を用いた条件が、高感度であることが確認されている。これは増幅産物が短くなったこと、もしくは、プライマーのＴｍ値が最適化されたことにより、ＰＣＲ効率が改善したことが要因と考えられる。なお、実施例４～６に用いた第２のプライマーで最もＴｍ値が低い配列番号１３は、Ｔｍ値が５９．５℃であり、鎖長が２０塩基となっている。一方で、比較例９で用いた配列番号１５のＴｍ値は５７．２℃で、鎖長が１８塩基となり、好ましいＴｍ値および鎖長の範囲の下限域であるため、第２のプライマーの長さは、２０塩基を含むことが好ましいと考えられる。
（実施例７～９、比較例１０～１１）
変異型マイコプラズマ・ジェニタリウムの検出感度の確認
＜材料及び方法＞
実施例７～９、比較例１０～１１におけるＰＣＲ法に用いたオリゴヌクレオチドは、（表９）に示す通りである。

【0087】

【表9】

【0088】

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ＰＣＲ反応液組成は、実施例１と同様の要領で調製する。

【0089】

＜ＰＣＲ反応条件＞
ＰＣＲ反応条件は、実施例１と同様である。

【0090】

＜核酸試料＞
実施例７～９、比較例１０～１１のＰＣＲ法に用いた核酸試料を以下に示す。

【0091】

（変異型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡ）
マイコプラズマ・ジェニタリウム由来のリボソームＲＮＡである２３Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子断片を人工合成後、転写反応にて作製された人工合成ＲＮＡである。

【0092】

人工合成ＲＮＡは２３Ｓ ｒＲＮＡの２０５８位、２０５９位を含む配列であり、Ｍ６３２０株由来の配列を使用する。Ｍ６３２０株はマクロライド耐性株である。

【0093】

（核酸試料の調製）
上記の人工合成ＲＮＡの長さは、３８０ｎｔである。

【0094】

人工合成ＲＮＡの長さと溶液の濃度（μｇ／μＬ）から１μＬ当たりのコピー数を計算した後、必要に応じて、ＴＥ緩衝溶液を用いて希釈する。

【0095】

＜データ解析方法＞
データ解析方法は、実施例１と同様である。

【0096】

＜マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定＞
マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定方法は、実施例１と同様である。

【0097】

実施例７～９、比較例１０～１１のマイコプラズマ・ジェニタリウムの判定結果および最終サイクルの相対蛍光値（Ｆ［４６］）を（表１０）に示す。

【0098】

ＲＮＡ量が８００コピー／Ｔｅｓｔで実施した場合、実施例７～９、比較例１０～１１のいずれも相対蛍光値（Ｆ［４６］）が判定閾値を下回り、マイコプラズマ・ジェニタリウム陽性と判定される。

【0099】

ＲＮＡ量が２００コピー／Ｔｅｓｔで実施した場合、実施例７～９、比較例１１は相対蛍光値（Ｆ［４６］）が判定閾値を下回り、マイコプラズマ・ジェニタリウム陽性と判定されるが、比較例１０は相対蛍光値（Ｆ［４６］）が判定閾値を下回らず、マイコプラズマ・ジェニタリウム陰性と判定される。また、比較例１０はマイコプラズマ・ジェニタリウム陽性と判定されるが、相対蛍光値（Ｆ［４６］）は実施例７～９と比較して大きいことが確認される。

【0100】

【表10】

【0101】

（結果）
（表１０）から明らかなように、変異型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡを核酸試料とした場合、いずれも良好な結果が示されている。その中でも、実施例７～９で示した第２のプライマー（マイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の２０２７～２０５０位の塩基配列もしくはこの塩基配列と相補的な塩基配列であって、連続する少なくとも２０塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いた第２のプライマー）を用いた条件が、最も高感度であることが確認されている。これは増幅産物が短くなったこと、もしくは、プライマーのＴｍ値が最適化されたことにより、ＰＣＲ効率が改善したことが要因と考えられる。なお、実施例７～９に用いた第２のプライマーで最もＴｍ値が低い配列番号１３は、Ｔｍ値が５９．５℃であり、鎖長が２０塩基となっている。一方で、比較例１１で用いた配列番号１５のＴｍ値は５７．２℃で、鎖長が１８塩基となり、好ましいＴｍ値および鎖長の範囲の下限域であるため、第２のプライマーの長さは、２０塩基を含むことが好ましいと考えられる。
（実施例１０～１６、比較例１２）
マクロライド耐性変異識別の確認
ここで、図６は、本発明の実施例１０における温度変化を示すグラフ、図７は、図６の一部拡大図である。
＜材料及び方法＞
実施例１０～１６、比較例１２におけるＰＣＲ法に用いたオリゴヌクレオチドは、（表１１）に示す通りである。

【0102】

【表11】

【0103】

＜ＰＣＲ反応液組成＞
ＰＣＲ反応液組成は、実施例１と同様の要領で調製する。

【0104】

＜ＰＣＲ反応条件＞
ＰＣＲおよび蛍光測定には株式会社ミズホメディーより発売されている全自動遺伝子解析装置Ｓｍａｒｔ Ｇｅｎｅ（日本国登録商標）を使用する。蛍光測定時の励起波長と蛍光波長は中心波長５２５ｎｍに設定する。なお、蛍光測定時の励起波長と蛍光波長を中心波長５２５ｎｍに近しい条件で設定・使用できる汎用ＰＣＲ装置でも測定は可能である。汎用ＰＣＲ装置としては、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標） ｎａｎｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）等が挙げられる。ＰＣＲ反応条件を（表１２）に示す。なお、ステップ１とステップ２は交互に１サイクルずつ実施し、Ａ・Ｂに該当する温度を（表１３）および（表１４）に示す。

【0105】

【表12】

【0106】

【表13】

【0107】

【表14】

【0108】

＜核酸試料＞
核酸試料は、実施例４および７と同様に、野生型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡおよび変異型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡを使用する。
＜データ解析方法＞
ＱＰｒｏｂｅを用いたデータ解析方法は、特許第７２２１４９１号に記載されている方法を参考に、得られた生データに対して補正演算値処理を行う。

【0109】

増幅反応の全てのサイクルについて、次の（式３）及び（式３’）による演算を行う。
ｆ１［ｎ］＝ｆｈｙｂ．１［ｎ］／ｆｄｅｎ．１［ｎ］・・・（式３）
ｆ２［ｎ］＝ｆｈｙｂ．２［ｎ］／ｆｄｅｎ．２［ｎ］・・・（式３’）
ここで、
ｆ１［ｎ］：（式３）により算出されたｎサイクル目のステップ１における蛍光強度値。
ｆｈｙｂ．１［ｎ］：ｎサイクル目のステップ１の伸長及び検出ステップにおける蛍光強度値。
ｆｄｅｎ．１［ｎ］：ｎサイクル目のステップ１の変性ステップにおける蛍光強度値。
ｆ２［ｎ］：（式３’）により算出されたｎサイクル目のステップ２における蛍光強度値。
ｆｈｙｂ．２［ｎ］：ｎサイクル目のステップ２の伸長及び検出ステップにおける蛍光強度値。
ｆｄｅｎ．２［ｎ］：ｎサイクル目のステップ２の変性ステップにおける蛍光強度値
さらに、以下の式による演算を行う。
Ｆ１［ｎ］＝ｆ１［ｎ］／ｆ１［１２］・・・（式４）
Ｆ２［ｎ］＝ｆ２［ｎ］／ｆ２［１２］・・・（式４’）
Ｆｒ’［ｎ］＝（ａ－Ｆ２［ｎ］）／（ａ－Ｆ１［ｎ］）・・・（式５）
ここで、
ｆ１［１２］：標的核酸が増幅される前の蛍光強度が安定した１２サイクル目の蛍光強度値であり、ステップ１の蛍光強度値の変化の基準として用いる。
ｆ２［１２］：標的核酸が増幅される前の蛍光強度が安定した１２サイクル目の蛍光強度値であり、ステップ２の蛍光強度値の変化の基準として用いる。
Ｆ１［ｎ］：１２サイクル目の（式４）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値。
Ｆ２［ｎ］：１２サイクル目の（式４’）により得られた蛍光強度値を１とした時のｎサイクル目の相対値。
ａ：Ｆｒ’が０以下にならないような定数である
Ｆｒ’［ｎ］：変異検出のための演算値

【0110】

＜マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定＞
マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定は、測定試料のＦ［２３］の値と判定閾値を比較して、［測定試料のＦ［２３］＜判定閾値］と成る場合に陽性と、そうでない場合陰性と判定する。判定閾値はマイコプラズマ・ジェニタリウムを含まない陰性試料のＦ［２３］の平均値－標準偏差の５倍（以下、平均－５ＳＤ）の値、即ち、「０．９９１０」を使用する。

【0111】

＜変異識別の判定＞
変異識別の判定は、測定試料のＦｒ’［２３］の値と判定閾値を比較して、［測定試料のＦｒ’［２３］＜判定閾値］の場合変異ありと、［測定試料のＦｒ’［２３］＞判定閾値］の場合変異なし判定する。判定閾値は「０．２０００」を使用する。なお、（式５）の定数ａを「１．００」として演算を行う。

【0112】

＜判定方法のフローチャート＞
図８は、本発明の実施例１０による判定方法を示すフローチャートである。

【0113】

（表１５）は、（表１３）で示した検出温度で測定した、実施例１０～１２及び比較例１２による、マイコプラズマ・ジェニタリウムの判定結果、相対蛍光値（Ｆ［２３］）および変異判定の演算値（Ｆｒ’［２３］）を示す。

【0114】

実施例１０～１２のいずれも、野生型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡを測定した場合はＦｒ’［２３］が判定閾値を下回らず、変異なしと、変異型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡを測定した場合はＦｒ’［２３］が判定閾値を下回り、変異ありと判定される。

【0115】

比較例１２では、野生型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡを測定した場合はＦｒ’［２３］が判定閾値を下回らず、変異なしと正しく判定されるが、変異型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡを測定した場合はＦｒ’［２３］が判定閾値を下回らず、変異なしと誤判定される。

【0116】

【表15】

【0117】

（結果）
（表１５）から明らかなように、ステップ２の検出温度Ｂが６６℃の場合において、ステップ１の検出温度Ａが５０～５８℃の場合、正しく変異の識別判定ができることが確認された。

【0118】

（表１６）は、（表１４）で示した検出温度で測定した実施例１３～１６のマイコプラズマ・ジェニタリウムの判定結果、相対蛍光値（Ｆ［２３］）および変異判定の演算値（Ｆｒ’［２３］）を示す。

【0119】

実施例１３～１６のいずれも、野生型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡを測定した場合はＦｒ’［２３］が判定閾値を下回らず、変異なしと、変異型マイコプラズマ・ジェニタリウムの人工合成ＲＮＡを測定した場合はＦｒ’［２３］が判定閾値を下回り、変異ありと判定される。

【0120】

【表16】

【0121】

（結果）
図９は、（表１６）の野生型人工合成ＲＮＡの各サイクルの相対蛍光値並びに演算値を示すグラフであり、図１０は、（表１６）の変異型人工合成ＲＮＡの各サイクルの相対蛍光値及び演算値を示すグラフである。野生型マイコプラズマ・ジェニタリウム人工合成ＲＮＡでは、最終サイクルの相対蛍光値（Ｆ［２３］）が判定閾値を下回り、かつ変異を判定する演算値（Ｆｒ’［２３］）が判定閾値よりも高値であったため、マイコプラズマ・ジェニタリウム陽性・変異なしと判定された。一方、変異型マイコプラズマ・ジェニタリウム人工合成ＲＮＡでは、最終サイクルの相対蛍光値（Ｆ［２３］）が判定閾値を下回り、かつ変異を判定する演算値（Ｆｒ’［２３］）が判定閾値よりも低値であったため、マイコプラズマ・ジェニタリウム陽性・変異ありと判定される。

【0122】

（表１６）から明らかなように、ステップ２の検出温度Ｂが７０℃の場合において、ステップ１の検出温度Ａが５０～６０℃の場合、正しく変異の識別判定ができることが確認された。（表１５）及び（表１６）から明らかなように、ステップ１の検出温度Ａが５０～５８℃でかつ、ステップ２の検出温度Ｂが６６～７０℃の場合、マイコプラズマ・ジェニタリウムを検出できるだけでなく、変異の識別判定もできていることが理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【0123】

【図1】図１は、本発明の実施例１における温度変化を示すグラフ。

【図2】図２は、図１の一部拡大図。

【図3】図３は、本発明の実施例１における判定方法を示すフローチャート。

【図4】図４は、マイコプラズマ・ジェニタリウム陰性判定の代表例として実施例１の増幅曲線（Ｆ［ｎ］）を示すグラフ。

【図5】図５は、マイコプラズマ・ジェニタリウム陽性判定の代表例として比較例１の増幅曲線（Ｆ［ｎ］）を示すグラフ。

【図6】図６は、本発明の実施例１０の温度変化を示すグラフ。

【図7】図７は、図６の一部拡大図。

【図8】図８は、本発明の実施例１０における判定方法を示すフローチャート。

【図9】図９は、（表１６）の野生型人工合成ＲＮＡの各値を示すグラフ。

【図10】図１０は、（表１６）の変異型人工合成ＲＮＡの各値を示すグラフ。

【図11】図１１は、本発明の第１のプライマー配列の一覧図。

【図12】図１２は、本発明の第２のプライマー配列の一覧図。

【図13】図１３は、本発明の標識プローブ配列の一覧図。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】