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▶ ディディピー スペシャリティ エレクトロニック マテリアルズ ユーエス インコーポレーテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025015551
(43)【公開日】2025-01-30
(54)【発明の名称】固体表面上でバイオフィルムを視覚化及び定量化する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20250123BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024187268
(22)【出願日】2024-10-24
(62)【分割の表示】P 2021542111の分割
【原出願日】2020-01-23
(31)【優先権主張番号】19382058.6
(32)【優先日】2019-01-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】519415100
【氏名又は名称】ディディピー スペシャルティ エレクトロニック マテリアルズ ユーエス，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100128495
【弁理士】
【氏名又は名称】出野 知
(72)【発明者】
【氏名】マッソンズ、ジェラルド
(72)【発明者】
【氏名】ジラベルト オリオル、ギエム
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア モリナ、ヴェロニカ
(57)【要約】
【課題】固体表面上でバイオフィルムを視覚化する方法を提供する。
【解決手段】この方法は、
（ａ）水性媒体と接触しており、且つ固体表面の少なくとも一部分が潜在的にバイオフィルムによって被覆されている固体表面を提供するステップと、
（ｂ）水平位置で固体表面を維持し、そして固体表面を炭素粒子の水性分散体で被覆するステップと、
（ｃ）過剰量の炭素粒子の水性分散体を表面から流すために、水平位置から少なくとも５の角度で固体表面を傾けるステップと、
（ｄ）炭素粒子の水性分散体によって被覆されていない領域の有無を決定することによって、固体表面上に存在する任意のバイオフィルムを検出するステップと
を含む。
【選択図】なし
【解決手段】この方法は、
（ａ）水性媒体と接触しており、且つ固体表面の少なくとも一部分が潜在的にバイオフィルムによって被覆されている固体表面を提供するステップと、
（ｂ）水平位置で固体表面を維持し、そして固体表面を炭素粒子の水性分散体で被覆するステップと、
（ｃ）過剰量の炭素粒子の水性分散体を表面から流すために、水平位置から少なくとも５の角度で固体表面を傾けるステップと、
（ｄ）炭素粒子の水性分散体によって被覆されていない領域の有無を決定することによって、固体表面上に存在する任意のバイオフィルムを検出するステップと
を含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
固体表面上でバイオフィルムを視覚化する方法であって、
（ａ）水性媒体と接触しており、且つ固体表面の少なくとも一部分が潜在的にバイオフィルムによって被覆されている固体表面を提供するステップと、
（ｂ）水平位置で前記固体表面を維持し、前記固体表面を炭素粒子の水性分散体で被覆するステップと、
（ｃ）過剰量の炭素粒子の水性分散体を前記表面から流すために、水平位置から少なくとも５°の角度で前記固体表面を傾けるステップと、
（ｄ）炭素粒子の水性分散体によって被覆されていない領域の有無を決定することによって、前記固体表面上に存在する任意のバイオフィルムを検出するステップと
を含む、方法。
（ａ）水性媒体と接触しており、且つ固体表面の少なくとも一部分が潜在的にバイオフィルムによって被覆されている固体表面を提供するステップと、
（ｂ）水平位置で前記固体表面を維持し、前記固体表面を炭素粒子の水性分散体で被覆するステップと、
（ｃ）過剰量の炭素粒子の水性分散体を前記表面から流すために、水平位置から少なくとも５°の角度で前記固体表面を傾けるステップと、
（ｄ）炭素粒子の水性分散体によって被覆されていない領域の有無を決定することによって、前記固体表面上に存在する任意のバイオフィルムを検出するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
前記固体表面がポリマー表面である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記炭素粒子の水性分散体が墨汁である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
炭素粒子の水性分散体を含むバイオフィルムの写真イメージを得ることによって、前記バイオフィルムが検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記写真イメージをデジタル的に処理し、１ビットイメージが作成される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記固体表面が、水平から少なくとも２０°の角度で傾けられる、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記炭素粒子の水性分散体が、少なくとも０．１ｍＬ／ｃｍ２の量で前記表面に添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記炭素粒子の水性分散体が、０．５～１０重量％の炭素含有量を有する、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、固体表面、特にポリマー表面上でバイオフィルムを視覚化及び定量化する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
逆浸透（ＲＯ）及びナノ濾過（ＮＦ）膜要素におけるバイオフィルム成長（生物付着）は、依然としてＲＯ／ＮＦ市場の鍵となる課題の１つのままである。細菌が産生したバイオフィルムによる妨害は、ＲＯモジュール全体での圧力低下の増加を引き起こす可能性があり、そして液圧不均衡及びモジュールへの損傷の可能性を導くおそれがある。さらに、バイオフィルムは、膜輸送特性に影響を及ぼす可能性があり、流動を低下させる、膜間圧（ＴＭＰ）低下を生じる可能性がある。これらの影響のそれぞれが、操作エネルギーを増加させるが、膜性能を回復するために、頻繁なクリーニング（ＣＩＰ）も導く。典型的な方法は、バイオフィルムを染料で着色することを必要とする。これは不可逆であり得、また膜に有害であり得る。例えばＮ．Ｓｒｅｅｄｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ，２０１８，４２５：１２－２１は、膜を染色するためにクリスタルバイオレットを使用する方法を報告する。本発明は、バイオフィルム構造又は膜に永久的な影響を及ぼすことなく、バイオフィルム構造の強化された視覚化及び定量化のためのツールを提供することを目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本発明は、固体表面上でバイオフィルムを視覚化する方法である。この方法は、
（ａ）水性媒体と接触しており、且つ固体表面の少なくとも一部分が潜在的にバイオフィルムによって被覆されている固体表面を提供するステップと、
（ｂ）水平位置で固体表面を維持し、そして固体表面を炭素粒子の水性分散体で被覆するステップと、
（ｃ）過剰量の炭素粒子の水性分散体を表面から流すために、水平位置から少なくとも５°の角度で固体表面を傾けるステップと、
（ｄ）炭素粒子の水性分散体によって被覆されていない領域の有無を決定することによって、固体表面上に存在する任意のバイオフィルムを検出するステップと
を含む。
（ａ）水性媒体と接触しており、且つ固体表面の少なくとも一部分が潜在的にバイオフィルムによって被覆されている固体表面を提供するステップと、
（ｂ）水平位置で固体表面を維持し、そして固体表面を炭素粒子の水性分散体で被覆するステップと、
（ｃ）過剰量の炭素粒子の水性分散体を表面から流すために、水平位置から少なくとも５°の角度で固体表面を傾けるステップと、
（ｄ）炭素粒子の水性分散体によって被覆されていない領域の有無を決定することによって、固体表面上に存在する任意のバイオフィルムを検出するステップと
を含む。
【発明を実施するための形態】
【0004】
特に明記されない限り、全ての百分率は重量百分率（重量％）であり、そして全ての温度は℃である。特に明記されない限り、平均は算術平均である。実施例における全ての操作は、特に明記されない限り、室温（１８～２５℃）で実行された。好ましくは、本発明の方法は、３℃～４５℃、好ましくは１０℃～３５℃の範囲で実行される。
【0005】
好ましくは、炭素粒子の水性分散体は「墨汁（インディアインク）」である。これは炭素粒子の水性分散体であり、この名称で製品が販売されている。好ましくは、炭素粒子は、２ミクロン以下、好ましくは１ミクロン以下、好ましくは０．７ミクロン以下の算術平均直径を有する。好ましくは、粒子は、少なくとも０．０１ミクロン、好ましくは少なくとも０．０５ミクロン、好ましくは少なくとも０．１ミクロンの算術平均直径を有する。上限及び下限は組み合わせ可能である。好ましくは、水性分散体の炭素含有量は、０．５～１０重量％、好ましくは１～９重量％、好ましくは２～８重量％である。水性分散体は、少量の他の物質、例えば、バインダー、界面活性剤等を含有してもよい。
【0006】
好ましくは、固体表面は、ポリマー表面、好ましくは、膜、例えば、逆浸透、ナノ濾過又は過剰濾過膜である。好ましくは、ポリマー表面を形成するポリマーは、ポリアミド（例えば、ｍ－フェニレンジアミン又はピペラジン及びトリメソイルクロリドの重合単位を含む）、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート）又はポリオレフィン、好ましくはポリアミドである。
【0007】
好ましくは、水性分散体は、水平位置で固体表面に適用され、次いで、過剰量のインクを除去するために表面を傾ける。好ましくは、少量のインクを、水平位置にあるポリマー表面の一隅に配置する。好ましくは、表面に添加されるインクの量は、表面の面積に基づき、少なくとも０．１ｍＬ／ｃｍ２、好ましくは少なくとも０．１１ｍＬ／ｃｍ２、好ましくは少なくとも０．１２ｍＬ／ｃｍ２、好ましくは少なくとも０．１３ｍＬ／ｃｍ２である。必要量よりも多い量は、それを傾けた時に単に表面から流れるため、インクの最大量は重要でない。典型的に０．２ｍＬ／ｃｍ２以下が必要とされる。好ましくは、使用時に液体が表面上を流れる方向でインクが流れるように、表面を傾ける。好ましくは、表面を、水平から少なくとも２０°、好ましくは少なくとも３０°、好ましくは８０°以下、好ましくは６０°以下、好ましくは５０°以下、好ましくは４０°以下の角度で傾ける。好ましくは、表面を、２～４０秒間、好ましくは少なくとも５秒間、好ましくは少なくとも１０秒間、好ましくは３０秒間以下、好ましくは２０秒間以下、傾ける。好ましくは、バイオフィルムを有する表面の面積は、視覚的観察から、好ましくはデジタル写真及びデジタルイメージ処理を用いて、計算によって決定される。
【0008】
好ましくは、表面バイオフィルム定量化のためのイメージ処理は、以下：
（ａ）好ましくは、イメージ処理ソフトウェアを用いて、デジタルイメージを処理するステップと、
（ｂ）好ましくは、色チャネルをＲＧＢ空間に分割することによって、次いで、好ましくは、緑色層を選択し、そしてそれを８ビットグレイスケールに変換することによって、イメージを８ビットグレイスケールに変換するステップと、
（ｃ）好ましくは、黒色閾値を２５５から、（１０周期の単純移動平均で）色範囲あたりの画素数の一次導関数が０以下である色範囲まで調整することによって、イメージを１ビットに変換するステップと、
（ｄ）バイオフィルム画素（白画素）を１ビット空間の全画素数（ＰＴ）に対して分割することによって、バイオフィルム表面被覆百分率が算出されるステップと
を含む。
（ａ）好ましくは、イメージ処理ソフトウェアを用いて、デジタルイメージを処理するステップと、
（ｂ）好ましくは、色チャネルをＲＧＢ空間に分割することによって、次いで、好ましくは、緑色層を選択し、そしてそれを８ビットグレイスケールに変換することによって、イメージを８ビットグレイスケールに変換するステップと、
（ｃ）好ましくは、黒色閾値を２５５から、（１０周期の単純移動平均で）色範囲あたりの画素数の一次導関数が０以下である色範囲まで調整することによって、イメージを１ビットに変換するステップと、
（ｄ）バイオフィルム画素（白画素）を１ビット空間の全画素数（ＰＴ）に対して分割することによって、バイオフィルム表面被覆百分率が算出されるステップと
を含む。
【0009】
好ましくは、透明且つ明るい点として現れる生物付着が存在する面積の対比及び視覚化を強化するために、膜を下から照明する。好ましくは、試験されるポリマー表面は、少なくとも１００ルクス、好ましくは少なくとも３００ルクス、好ましくは４０００ルクス以下、好ましくは３０００ルク以下の平均明度を有する。
【実施例0010】
染色された試料の巨視的視覚的試験のために、０．６３倍～４倍の倍率を有するＬｅｉｃａ ＭＳ５ステレオ顕微鏡を使用し、試料の現実的な視覚化を可能にした。この機器は、２つの対物レンズ及び接眼レンズを用いて、２つの別個の光路を使用する。結果は、試料の３次元視覚化を生じるわずかに異なる視野角である。対象の下に電球を有することによって、透過光照明も可能である。照明は、生物付着が存在する面積の対比及び視覚化を強化するために使用される。カメラで捕獲される試料の面積は、ステレオ顕微鏡で使用される倍率レベル次第で、７．６～５１０．７ｍｍ２で変動可能である。イメージ取得のための１２メガピクセルデジタルカメラを使用して得られる写真の解像度は約１０μｍであると推定され、これはＬｅｉｃａ ＭＳ５ステレオ顕微鏡の回折限界と一致する。この技術は、１ビットイメージ上での、背景（黒色）からの画素からのバイオフィルム（白色）に相当する画素の分離に基づく。
【0011】
（ａ）この方法を確認するために使用される生物付着試料は、生物付着を受けているＲＯクーポンから得た。ＲＯクーポンからの４ｃｍ×４ｃｍの湿潤試料をペトリ皿中、水平に配置した。両面テープを使用して、ペトリ皿に膜試料を一緒に保持した。２ｍＬのＰＥＬＩＫＡＮ Ｂｌａｃｋ Ｆｏｕｎｔインディアドローイングインク（Ｐｅｌｉｋａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（算術平均粒径：０．４ミクロン）を、濾過された原水と接触させた膜の側面に配置した。
（ｂ）インクを注いだ後、過剰量のインクを除去するために、１０秒間、水平から３０°で試料を移した。
（ｃ）ステレオ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＭＳ５）を用いて、生物付着試料を視覚化した。使用されたステレオ顕微鏡の倍率は、５００ルクスの光度で２倍であった。
（ｄ）１２．１メガピクセルデジタルカメラ（Ｃａｎｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｘｕｓ ２００ ＩＳ）を使用してデジタル写真を得、そしてＩｍａｇｅＪ（商標）１．５１ソフトウェアを使用して処理した。
（ｅ）色をＲＧＢチャネルに分割した。次いで緑色層を選択し、８ビットグレイスケールに変換した。
（ｆ）黒色閾値を１１０に調整することによって、イメージを１ビット写真へと変換した。これによって、バイオフィルム被覆を視覚化することができるイメージが作成された。このイメージは１２，０００，０００画素から２，１５１，５０２白色画素を含有し、１８％のバイオフィルム表面被覆を表していた。
（ｂ）インクを注いだ後、過剰量のインクを除去するために、１０秒間、水平から３０°で試料を移した。
（ｃ）ステレオ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＭＳ５）を用いて、生物付着試料を視覚化した。使用されたステレオ顕微鏡の倍率は、５００ルクスの光度で２倍であった。
（ｄ）１２．１メガピクセルデジタルカメラ（Ｃａｎｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｘｕｓ ２００ ＩＳ）を使用してデジタル写真を得、そしてＩｍａｇｅＪ（商標）１．５１ソフトウェアを使用して処理した。
（ｅ）色をＲＧＢチャネルに分割した。次いで緑色層を選択し、８ビットグレイスケールに変換した。
（ｆ）黒色閾値を１１０に調整することによって、イメージを１ビット写真へと変換した。これによって、バイオフィルム被覆を視覚化することができるイメージが作成された。このイメージは１２，０００，０００画素から２，１５１，５０２白色画素を含有し、１８％のバイオフィルム表面被覆を表していた。
【手続補正書】
【提出日】2024-11-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0011】
（ａ）この方法を確認するために使用される生物付着試料は、生物付着を受けているＲＯクーポンから得た。ＲＯクーポンからの４ｃｍ×４ｃｍの湿潤試料をペトリ皿中、水平に配置した。両面テープを使用して、ペトリ皿に膜試料を一緒に保持した。２ｍＬのＰＥＬＩＫＡＮ Ｂｌａｃｋ Ｆｏｕｎｔインディアドローイングインク（Ｐｅｌｉｋａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（算術平均粒径：０．４ミクロン）を、濾過された原水と接触させた膜の側面に配置した。
（ｂ）インクを注いだ後、過剰量のインクを除去するために、１０秒間、水平から３０°で試料を移した。
（ｃ）ステレオ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＭＳ５）を用いて、生物付着試料を視覚化した。使用されたステレオ顕微鏡の倍率は、５００ルクスの光度で２倍であった。
（ｄ）１２．１メガピクセルデジタルカメラ（Ｃａｎｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｘｕｓ ２００ ＩＳ）を使用してデジタル写真を得、そしてＩｍａｇｅＪ（商標）１．５１ソフトウェアを使用して処理した。
（ｅ）色をＲＧＢチャネルに分割した。次いで緑色層を選択し、８ビットグレイスケールに変換した。
（ｆ）黒色閾値を１１０に調整することによって、イメージを１ビット写真へと変換した。これによって、バイオフィルム被覆を視覚化することができるイメージが作成された。このイメージは１２，０００，０００画素から２，１５１，５０２白色画素を含有し、１８％のバイオフィルム表面被覆を表していた。以下、本発明の態様を列挙する。
（態様１）
固体表面上でバイオフィルムを視覚化する方法であって、
（ａ）水性媒体と接触しており、且つ固体表面の少なくとも一部分が潜在的にバイオフィルムによって被覆されている固体表面を提供するステップと、
（ｂ）水平位置で前記固体表面を維持し、前記固体表面を炭素粒子の水性分散体で被覆するステップと、
（ｃ）過剰量の炭素粒子の水性分散体を前記表面から流すために、水平位置から少なくとも５°の角度で前記固体表面を傾けるステップと、
（ｄ）炭素粒子の水性分散体によって被覆されていない領域の有無を決定することによって、前記固体表面上に存在する任意のバイオフィルムを検出するステップと
を含む、方法。
（態様２）
前記固体表面がポリマー表面である、態様１に記載の方法。
（態様３）
前記炭素粒子の水性分散体が墨汁である、態様２に記載の方法。
（態様４）
炭素粒子の水性分散体を含むバイオフィルムの写真イメージを得ることによって、前記バイオフィルムが検出される、態様３に記載の方法。
（態様５）
前記写真イメージをデジタル的に処理し、１ビットイメージが作成される、態様４に記載の方法。
（態様６）
前記固体表面が、水平から少なくとも２０°の角度で傾けられる、態様５に記載の方法。
（態様７）
前記炭素粒子の水性分散体が、少なくとも０．１ｍＬ／ｃｍ ２ の量で前記表面に添加される、態様６に記載の方法。
（態様８）
前記炭素粒子の水性分散体が、０．５～１０重量％の炭素含有量を有する、態様７に記載の方法。
（ｂ）インクを注いだ後、過剰量のインクを除去するために、１０秒間、水平から３０°で試料を移した。
（ｃ）ステレオ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＭＳ５）を用いて、生物付着試料を視覚化した。使用されたステレオ顕微鏡の倍率は、５００ルクスの光度で２倍であった。
（ｄ）１２．１メガピクセルデジタルカメラ（Ｃａｎｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｘｕｓ ２００ ＩＳ）を使用してデジタル写真を得、そしてＩｍａｇｅＪ（商標）１．５１ソフトウェアを使用して処理した。
（ｅ）色をＲＧＢチャネルに分割した。次いで緑色層を選択し、８ビットグレイスケールに変換した。
（ｆ）黒色閾値を１１０に調整することによって、イメージを１ビット写真へと変換した。これによって、バイオフィルム被覆を視覚化することができるイメージが作成された。このイメージは１２，０００，０００画素から２，１５１，５０２白色画素を含有し、１８％のバイオフィルム表面被覆を表していた。以下、本発明の態様を列挙する。
（態様１）
固体表面上でバイオフィルムを視覚化する方法であって、
（ａ）水性媒体と接触しており、且つ固体表面の少なくとも一部分が潜在的にバイオフィルムによって被覆されている固体表面を提供するステップと、
（ｂ）水平位置で前記固体表面を維持し、前記固体表面を炭素粒子の水性分散体で被覆するステップと、
（ｃ）過剰量の炭素粒子の水性分散体を前記表面から流すために、水平位置から少なくとも５°の角度で前記固体表面を傾けるステップと、
（ｄ）炭素粒子の水性分散体によって被覆されていない領域の有無を決定することによって、前記固体表面上に存在する任意のバイオフィルムを検出するステップと
を含む、方法。
（態様２）
前記固体表面がポリマー表面である、態様１に記載の方法。
（態様３）
前記炭素粒子の水性分散体が墨汁である、態様２に記載の方法。
（態様４）
炭素粒子の水性分散体を含むバイオフィルムの写真イメージを得ることによって、前記バイオフィルムが検出される、態様３に記載の方法。
（態様５）
前記写真イメージをデジタル的に処理し、１ビットイメージが作成される、態様４に記載の方法。
（態様６）
前記固体表面が、水平から少なくとも２０°の角度で傾けられる、態様５に記載の方法。
（態様７）
前記炭素粒子の水性分散体が、少なくとも０．１ｍＬ／ｃｍ ２ の量で前記表面に添加される、態様６に記載の方法。
（態様８）
前記炭素粒子の水性分散体が、０．５～１０重量％の炭素含有量を有する、態様７に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
固体表面上でバイオフィルムを視覚化する方法であって、
（ａ）水性媒体と接触しており、且つ固体表面の少なくとも一部分が潜在的にバイオフィルムによって被覆されている固体表面を提供するステップと、
（ｂ）水平位置で前記固体表面を維持し、前記固体表面を炭素粒子の水性分散体で被覆するステップと、
（ｃ）過剰量の炭素粒子の水性分散体を前記表面から流すために、水平位置から少なくとも５°の角度で前記固体表面を傾けるステップと、
（ｄ）炭素粒子の水性分散体によって被覆されていない領域の有無を決定することによって、前記固体表面上に存在する任意のバイオフィルムを検出するステップと
を含む、方法。
（ａ）水性媒体と接触しており、且つ固体表面の少なくとも一部分が潜在的にバイオフィルムによって被覆されている固体表面を提供するステップと、
（ｂ）水平位置で前記固体表面を維持し、前記固体表面を炭素粒子の水性分散体で被覆するステップと、
（ｃ）過剰量の炭素粒子の水性分散体を前記表面から流すために、水平位置から少なくとも５°の角度で前記固体表面を傾けるステップと、
（ｄ）炭素粒子の水性分散体によって被覆されていない領域の有無を決定することによって、前記固体表面上に存在する任意のバイオフィルムを検出するステップと
を含む、方法。
【外国語明細書】