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▶ サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025015587
(43)【公開日】2025-01-30
(54)【発明の名称】ＡＡＶカプシドタンパク質を分析する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20250123BHJP
B01J 20/287 20060101ALI20250123BHJP
B01J 20/281 20060101ALI20250123BHJP
G01N 30/26 20060101ALI20250123BHJP
G01N 30/54 20060101ALI20250123BHJP
G01N 30/34 20060101ALI20250123BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20250123BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20250123BHJP
G01N 30/72 20060101ALI20250123BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20250123BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20250123BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20250123BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20250123BHJP
C12N 15/35 20060101ALN20250123BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01 ZNA
B01J20/287
B01J20/281 G
G01N30/26 A
G01N30/54 A
G01N30/34 E
G01N33/543 585
G01N33/48 A
G01N30/72 C
G01N27/62 V
G01N27/62 X
C12Q1/70
C12Q1/37
C12N7/00
C12N7/01
C12N15/35
【審査請求】有
【請求項の数】53
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024197431
(22)【出願日】2024-11-12
(62)【分割の表示】P 2022539170の分割
【原出願日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】62/956,681
(32)【優先日】2020-01-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/073,188
(32)【優先日】2020-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/119,909
(32)【優先日】2020-12-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】501237039
【氏名又は名称】サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】クナル ダウド
(72)【発明者】
【氏名】ジュ リー
(72)【発明者】
【氏名】ウディタ デアルウィス
(57)【要約】
【課題】液体クロマトグラフィー、質量分析、および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法を用いて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰＳカプシドタンパク質を特徴解析する方法を提供すること。
【解決手段】本方法は概して、（ａ）ＡＡＶ粒子を液体クロマトグラフィーに供して変性し、次いで、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰＳカプシドタンパク質を分離すること、および（ｂ）工程（ａ）で産生された分離ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰＳカプシドタンパク質をＵＶおよび質量分析に供して、ＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰＳカプシドタンパク質の比および質量を決定する工程を含む。別の態様では、本開示は、翻訳後修飾を含むＡＡＶ組成物を提供する。本開示はまた、液体クロマトグラフィー質量分析を用いて、ＡＡＶ組成物の純度を特性解析する方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本方法は概して、（ａ）ＡＡＶ粒子を液体クロマトグラフィーに供して変性し、次いで、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰＳカプシドタンパク質を分離すること、および（ｂ）工程（ａ）で産生された分離ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰＳカプシドタンパク質をＵＶおよび質量分析に供して、ＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰＳカプシドタンパク質の比および質量を決定する工程を含む。別の態様では、本開示は、翻訳後修飾を含むＡＡＶ組成物を提供する。本開示はまた、液体クロマトグラフィー質量分析を用いて、ＡＡＶ組成物の純度を特性解析する方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に脱アミド化を含むＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ組成物。
【請求項2】
ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうちの一つまたは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＣＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に酸化を含むＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ組成物。
【請求項3】
ＡＡＶ組成物中の宿主細胞タンパク質を特性解析する方法であって、
前記組成物からウイルスカプシドタンパク質を免疫沈降することと、
残留宿主細胞タンパク質を消化することと、
前記消化されたタンパク質を、液体クロマトグラフィー四重極飛行時間質量分析法（ＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳ）を用いて分析して、宿主細胞タンパク質を同定することと、を含む方法。
前記組成物からウイルスカプシドタンパク質を免疫沈降することと、
残留宿主細胞タンパク質を消化することと、
前記消化されたタンパク質を、液体クロマトグラフィー四重極飛行時間質量分析法（ＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳ）を用いて分析して、宿主細胞タンパク質を同定することと、を含む方法。
【請求項4】
前記免疫沈降が、ＡＡＶ組成物を、抗ＡＡＶ ＶＰ１抗体、抗ＡＡＶ ＶＰ２抗体、抗ＡＡＶ ＶＰ３抗体、またはそれらの組合せと共にインキュベートすることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記消化された宿主細胞タンパク質を反復ＭＳ／ＭＳにより分析することをさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項6】
前記消化が溶液中で行われる、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記消化が、約６０℃から約８０℃の温度で実施される急速な消化を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記温度が約７０℃である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＡＡＶ組成物を、既知の量の少なくとも一つの既知のタンパク質標品でスパイクすることをさらに含む、請求項３～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記少なくとも一つの既知のタンパク質標品が、ヒトまたはウシのタンパク質標品である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記少なくとも一つのタンパク質標品と比較して、前記消化された宿主細胞タンパク質の量を定量化することをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
前記液体クロマトグラフィーが、逆相液体クロマトグラフィーである、請求項３～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記逆相液体クロマトグラフィーが、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、またはＣ４カラムを用いて実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記液体クロマトグラフィーが、Ｃ８カラムを用いて実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記カラムが、約１．２～３．５μｍの粒子を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
前記カラムが、約１．７μｍまたは約１．８μｍの粒子を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記カラムが、約５０ｍｍから約３００ｍｍの長さであり、約１ｍｍから約４．６ｍｍの内径を有する、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記カラムが、約１５０ｍｍの長さであり、約２．１ｍｍの内径を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記液体クロマトグラフィーが、約４０℃から約５０℃で実施される、請求項３～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記液体クロマトグラフィーが、約４５℃で実施される、請求項３～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記液体クロマトグラフィーが、ギ酸を含む第一の移動相を含む、請求項３～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記第一の移動相が、体積で約０．０５％から約０．１５％のギ酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記第一の移動相が、体積で約０．１％のギ酸を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項24】
前記液体クロマトグラフィーが、アセトニトリルと水との混合物中にギ酸を含む第二の移動相を含む、請求項３～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記第二の移動相が、体積で約０．０５％から約０．１５％のギ酸を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記第二の移動相が、体積で約０．１％のギ酸を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
前記第二の移動相が、体積で約８０～９５％のアセトニトリルを含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記第二の移動相が、体積で約９０％のアセトニトリルおよび体積で１０％の水を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記液体クロマトグラフィーにおいて、前記第一の移動相と前記第二の移動相との組合せに比較して、前記第二の移動相のパーセンテージが経時的に増加される、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記第二の移動相のパーセンテージが、約２％から約５０％に増加される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記第二の移動相のパーセンテージが、約１２０分間にわたって体積で約２％から約５０％に増加される、請求項３０に記載の方法。。
【請求項32】
前記第二の移動相のパーセンテージが、その後、体積で１００％に約５分間で増加される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記第二の移動相のパーセンテージが、その後、体積で１００％で約３分間維持される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記第二の移動相のパーセンテージが、その後、体積で約２％に約２分間で減少される、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記質量分析が、約１２５～３５０Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される、請求項３～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記質量分析が、約１３５Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される、請求項３～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記質量分析が、約３～６ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される、請求項３～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記質量分析が、約４ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される、請求項３～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
アミノ酸修飾を有する亜集団を含有するカプシドタンパク質の不均一な群を含み、前記アミノ酸修飾が翻訳後修飾である、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
【請求項40】
前記修飾が、脱アミド化または酸化である、請求項３９に記載のｒＡＡＶ。
【請求項41】
質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって測定された際に、前記不均一な群が、ＡＡＶ．ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に、脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含む、請求項３９または４０に記載のｒＡＡＶ。
【請求項42】
前記不均一な群が、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ５７で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１５％未満含む、請求項４１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項43】
前記不均一な基が、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ５７で脱アミド化されたカプシドタンパク質を１５％未満含む、請求項４１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項44】
前記不均一な基が、ＡＡＶ．ｒｈ７４のＮ２５４および／またはＮ２５５で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満含む、請求項４１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項45】
前記不均一な群が、Ｎ２６３で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％未満含む、請求項４１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項46】
質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって測定された際に、前記不均一な群が、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうち一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＣＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に、酸化メチオニンを含む、
請求項３９または４０に記載のｒＡＡＶ。
請求項３９または４０に記載のｒＡＡＶ。
【請求項47】
前記不均一な群が、Ｍ４３７で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む、請求項４６に記載のｒＡＡＶ。
【請求項48】
前記不均一な群が、Ｍ４７３で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む、請求項４６に記載のｒＡＡＶ。
【請求項49】
前記不均一な群が、Ｍ５２６で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または３％未満含む、請求項４６に記載のｒＡＡＶ。
【請求項50】
前記不均一な群が、Ｍ５４４で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または２％未満含む、請求項４６に記載のｒＡＡＶ。
【請求項51】
前記不均一な群が、Ｍ５６０で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または２％未満含む、請求項４６に記載のｒＡＡＶ。
【請求項52】
前記不均一な群が、Ｍ６３７で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む、請求項４６に記載のｒＡＡＶ。
【請求項53】
前記不均一な群が、配列番号１～５のいずれか一つのペプチド配列、または他のＡＡＶ血清型のその同等のペプチド配列内に、脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月３日出願の米国仮特許出願第６２／９５６，６８１号、２０２０年９月１日出願の米国仮特許出願第６３／０７３，１８８号、および２０２０年１２月１日出願の米国仮特許出願第６３／１１９，９０９号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の優先権を主張するものであり、これらのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１月３日出願の米国仮特許出願第６２／９５６，６８１号、２０２０年９月１日出願の米国仮特許出願第６３／０７３，１８８号、および２０２０年１２月１日出願の米国仮特許出願第６３／１１９，９０９号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の優先権を主張するものであり、これらのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を用いてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質、ならびにＡＡＶ組成物の純度を特性解析する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は急速に、遺伝子治療を送達するための最も広く用いられる媒体の一つとなりつつある。広範な標的組織の形質導入の効率性の高さとともに優れた安全性プロファイルにより、ＡＡＶは、遺伝子治療に最も広く使用されるプラットフォームとされてきた。ＡＡＶは、パルボウイルス科に属する小さなウイルスである。ウイルスは、約４．７キロベースの線状の一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する、非エンベロープ型の二十面体カプシドからなる。ＡＡＶは一般的に、適切な宿主細胞で組換えにより発現される。しかし、組換えＡＡＶは、宿主細胞溶解物由来のタンパク質によって汚染されることがある。
【0004】
ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質の混合物を含むが、これらのタンパク質は、選択的スプライシングおよび翻訳によって単一のウイルスＣａｐ遺伝子から産生され、自己組織化してカプシドを形成する。ＡＡＶカプシドタンパク質は、ウイルスの感染性、組織指向性、および効力に重要な役割を果たし、カプシドタンパク質の質量および比を完全に特性解析する能力は、遺伝子治療用のＡＡＶの商業製造のためにますます重要となりつつある。
【0005】
具体的には、ＶＰの化学量論が、ウイルスベクターの感染性に極めて重要である。例えば、ＶＰ１／ＶＰ２比のバランスがとれていなかった場合であっても、高レベルのＶＰ３カプシドは、形質導入効率の不良および効力の低下と負の関係があった。（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｖｏｌｕｍｅ ２５、ｐａｇｅｓ ４１５－４２４（２０１８））。製造で得た構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の比は、広い範囲、例えば１：１：５から１：１：２０で変動し得ることから（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ．，２６（１）：７３－８８（２００８））、三つのカプシドタンパク質間の比の正確な測定は、ＡＡＶベクターの品質管理において重要である。しかし、現在の方法では、カプシドタンパク質の質量の測定を試みたものの、各ＶＰの化学量論を決定することができなかった（ＷＯ２０１８／０３５０５９）。そのため、ＡＡＶカプシドタンパク質の比および修飾と、ｒＡＡＶ組成物の純度とをより正確に特性解析するための堅牢な方法が、遺伝子治療業界で求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を用いて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を特性解析する方法を提供する。本明細書に開示される方法は、ＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比、ならびに／またはＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち一つまたは複数の質量を決定するために使用される。
【0007】
一部の態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比を決定する方法を提供する。本方法は、ＡＡＶ粒子を約７０℃から約９０℃で液体クロマトグラフィーに供するステップを含み、ここでは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の質量および比は、質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって決定される。一部の態様では、カプシドタンパク質の個々の質量は、質量分析によって測定される。一部の態様では、ＡＡＶ粒子上のカプシドは、液体クロマトグラフィーのカラム内でＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質のそれぞれに変性される。一部の態様では、カプシドタンパク質は、液体クロマトグラフィーによって分離される。
【0008】
一部の態様では、本方法は、質量分析を用いて、ＡＡＶ粒子中のＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち一つまたは複数の質量を決定することをさらに含む。
【0009】
一部の態様では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の相対量は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の紫外線（ＵＶ）クロマトグラムを分析することによって決定される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは逆相液体クロマトグラフィーである。一部の態様では、ＡＡＶ粒子はＡＡＶｒｈ７４である。
【0010】
一部の態様では、クロマトグラフィーは、水中にトリフルオロ酢酸を含む第一の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリルと水との混合物中にトリフルオロ酢酸を含む第二の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーにおいて、第一の移動相と第二の移動相との組合せにおける第二の移動相のパーセンテージは、経時的に増加する。
【0011】
一部の態様では、質量分析は、約１２５～３５０Ｖのフラグメンター電圧を含む。
【0012】
脱アミド化は、タンパク質の活性および安定性に著しい影響を与えることが知られている、タンパク質に観察される一般的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）の一つである。脱アミド化は通常、アスパラギンのアミド側鎖の加水分解によって引き起こされ、アスパラギン酸とイソアスパラギン酸との混合物を形成する。一部の態様では、脱アミド化は、ウラシルへのシトシンの加水分解反応であり、その過程でアンモニアを放出する。これは重亜硫酸塩の使用を通してインビトロで起こり得、重亜硫酸塩は、シトシンを脱アミノ化するが５－メチルシトシンを脱アミノ化しない。一部の態様では、５－メチルシトシンの脱アミノ化は、チミンおよびアンモニアをもたらす。一部の態様では、グルタミン残基はまた、脱アミド化を受けてグルタミン酸とイソグルタミン酸との混合物を形成するが、グルタミン残基は、アスパラギンと比較して脱アミド化に対する感受性が有意に低い。一部の態様では、グアニンの脱アミノ化は、キサンチンの形成をもたらす。一部の態様では、アデニンの脱アミド化は、ヒポキサンチンの形成をもたらす。カプシドタンパク質の脱アミド化は、ＡＡＶ製剤の安定性および活性に影響を与える可能性がある。
【0013】
本開示の一部の態様では、質量分析が、脱アミド化などの翻訳後修飾を研究するために用いられる。一部の態様では、タンパク質は、グアニジンおよび尿素などの試薬を用いて変性させることができる。変性タンパク質は、１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはＴｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＥＣＰ）を用いて還元され、ジスルフィド結合を破壊する。次いで、還元ジスルフィド結合は、ヨードアセトアミドを用いてアルキル化される。変性およびアルキル化の工程は、確実にタンパク質が展開されてそれゆえにプロテアーゼに完全にアクセス可能となるようにするために実施される。次いで、変性および還元されたタンパク質を、トリプシンなどのいくつかのプロテアーゼのうちの一つを用いて消化する。消化されたペプチドは、ＲＰ－ＨＰＬＣを用いてＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ上で分離される。次いで、分離されたペプチドが、質量分析計、典型的にはＱ－ＴｏＦまたはＯｒｂｉｔｒａｐ上で、そのｍ／ｚ比を用いて検出される。適切なソフトウェアおよびデータベースを用いて、ペプチドが特定される。脱アミド化は、ペプチドの理論値と比較して、およそ１Ｄａの増加として特定される。
【0014】
一部の態様では、本方法は、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち少なくとも一つの翻訳後修飾を決定することをさらに含む。一部の態様では、本方法は、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち少なくとも一つの翻訳後のリン酸化またはアセチル化をさらに含む。
【0015】
本開示はまた、ＡＡＶ組成物中の宿主細胞タンパク質を特性解析する方法を提供し、本方法は、上記組成物からウイルスカプシドタンパク質を免疫沈降すること、残留宿主細胞タンパク質を消化すること、および消化されたタンパク質を液体クロマトグラフィー四重極飛行時間質量分析法（ＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳ）で分析して宿主細胞タンパク質を特定することを含む。
【0016】
一部の態様では、免疫沈降は、ＡＡＶ組成物を、抗ＡＡＶ ＶＰ１抗体、抗ＡＡＶ ＶＰ２抗体、抗ＡＡＶ ＶＰ３抗体、またはそれらの組合せと共にインキュベートすることを含む。
【0017】
一部の態様では、本方法は、消化された宿主細胞タンパク質を反復ＭＳ／ＭＳで分析することをさらに含む。
【0018】
一部の態様では、消化は溶液中で行われる。一部の態様では、消化は、約６０℃から約８０℃の温度で実施される。一部の態様では、消化は、約７０℃で実施される。
【0019】
一部の態様では、本方法は、既知の量の少なくとも一つの既知のタンパク質標品でＡＡＶ組成物をスパイクすることをさらに含む。一部の態様では、少なくとも一つの既知のタンパク質標品は、ヒトまたはウシのタンパク質標品である。一部の態様では、本方法は、少なくとも一つのタンパク質標品と比較して、消化された宿主細胞タンパク質の量を定量化することをさらに含む。
【0020】
一部の態様では、液体クロマトグラフィーは逆相液体クロマトグラフィーである。一部の態様では、逆相液体クロマトグラフィーは、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、またはＣ４カラムを用いて実施される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、Ｃ８カラムを用いて実施される。一部の態様では、カラムは、約１．２～３．５μｍの粒子を含む。一部の態様では、カラムは、約１．７μｍまたは約１．８μｍの粒子を含む。一部の態様では、カラムは、約５０ｍｍから約３００ｍｍの長さであり、約１ｍｍから約４．６ｍｍの内径を有する。一部の態様では、カラムは約１５０ｍｍの長さであり、約２．１ｍｍの内径を有する。
【0021】
一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約４０℃から約５０℃で実施される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約４５℃で実施される。
【0022】
一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、ギ酸を含む第一の移動相を含む。一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．０５％から約０．１５％のギ酸を含む。一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．１％のギ酸を含む。
【0023】
一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、アセトニトリルと水との混合物中のギ酸を含む第二の移動相を含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．０５％から約０．１５％のギ酸を含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．１％のギ酸を含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約８０～９５％のアセトニトリルを含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約９０％のアセトニトリルと、体積で約１０％の水とを含む。
【0024】
一部の態様では、液体クロマトグラフィーにおいて、第一の移動相と第二の移動相との組合せに比較して、第二の移動相のパーセンテージは経時的に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約２％から約５０％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約１２０分間にわたって体積で約２％から約５０％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、その後、約２５分間にわたって体積で１００％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、その後、体積で１００％で約１分間維持される。一部の態様では、第二の移動相は、その後、約４分間にわたって体積で約２％に低減される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、その後、約５分間にわたって体積で１００％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、その後、体積で１００％で約３分間維持される。一部の態様では、第二の移動相は、その後、約２分間にわたって体積で約２％に低減される。
【0025】
一部の態様では、質量分析は、約１２５～３５０Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される。一部の態様では、質量分析は、約１３５Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される。一部の態様では、質量分析は、約３～６ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される。一部の態様では、質量分析は、約４ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される。
【0026】
本開示の一部の態様は、アミノ酸改変を有する亜集団を含有する不均一なカプシドタンパク質群を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を対象とする。一部の態様では、修飾は脱アミド化または酸化である。
【0027】
一部の態様では、質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって測定された際に、上記不均一な群は、ＡＡＶ．ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に、脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含む。別の実施形態では、上記不均一な群は、配列番号１～５のいずれか一つのペプチド配列、または他のＡＡＶ血清型のその同等のペプチド配列内に、脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含む。
【0028】
一部の態様では、上記不均一な群は、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ５７で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満含む。一部の態様では、上記不均一な群は、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ５７で脱アミド化されたカプシドタンパク質を１５％未満含む。一部の態様では、上記不均一な群は、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ２５４および／またはＮ２５５で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満含む。一部の態様では、上記不均一な群は、Ｎ２６３で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満含む。
【0029】
一部の態様では、質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって測定された際に、上記不均一な群は、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうち一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＣＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に、酸化メチオニンを含む。一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ４３７で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む。一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ４７３で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む。一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ５２６で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または３％未満含む。一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ５４４で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または２％未満含む。一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ５６０で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または２％未満含む。一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ６３７で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む。
【0030】
当業者は、本明細書に記載された発明が、具体的に記載されたもの以外の変形および改変の対象となることを認識するものとなる。本明細書に記載される発明は、そのような変形および改変のすべてを含むことが理解されよう。本発明はまた、個別にまたは集合的に、本明細書に言及または標示されるすべてのそのようなステップ、特徴、組成物、および化合物、ならびにこれらのステップまたは特徴のうちの任意の二つ以上の任意のおよびすべての組合せを含む。
（項目１）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を特性解析する方法であって、
前記ＡＡＶ粒子を、約７０℃から約９０℃の液体クロマトグラフィーに供することを含み、
前記ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比が、質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって決定される、方法。
（項目２）
ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の個々の質量が、前記質量分析によって決定される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比が、前記ＶＰ１、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の紫外線クロマトグラム（ＵＶ）を比較することによって決定される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記液体クロマトグラフィーが、逆相液体クロマトグラフィーである、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記逆相液体クロマトグラフィーが、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、またはＣ４カラムを用いて実施される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記液体クロマトグラフィーが、Ｃ８カラムを用いて実施される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記カラムが、約１．２～３．５μｍの粒子を含む、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
前記カラムが、約１．７μｍまたは約１．８μｍの粒子を含む、項目５～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記カラムが、約５０ｍｍから約３００ｍｍの長さであり、約１ｍｍから約４．６ｍｍの内径を有する、項目５～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記クロマトグラフィーカラムが、約１００ｍｍの長さであり、約２．１ｍｍの内径を有する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＡＡＶ粒子が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４のものであるか、または任意の天然、組換え、または合成のＡＡＶ粒子である、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ＡＡＶが血清型ＡＡＶｒｈ７４のものである、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記液体クロマトグラフィーが、約７５℃から約８５℃で実施される、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記液体クロマトグラフィーが約８０℃で実施される、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記液体クロマトグラフィーが、トリフルオロ酢酸を含む第一の移動相を含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記第一の移動相が、体積で約０．０５から約０．１５％のトリフルオロ酢酸を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第一の移動相が、体積で約０．１％のトリフルオロ酢酸を含む、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
前記液体クロマトグラフィーが、アセトニトリルと水との前記混合物中にトリフルオロ酢酸を含む第二の移動相を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記第二の移動相が、体積で約０．０５から約０．１５％のトリフルオロ酢酸を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記第二の移動相が、体積で約０．１％のトリフルオロ酢酸を含む、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記第二の移動相が、体積で約８０～９５％のアセトニトリルを含む、項目１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記第二の移動相が、体積で約９０％のアセトニトリルおよび１０％の水を含む、項目１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記液体クロマトグラフィーにおいて、前記第一の移動相と前記第二の移動相との組合せに比較して、前記第二の移動相のパーセンテージが経時的に増加される、項目１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記第二の移動相のパーセンテージが、体積によって約１０％から約４０％に、次いで約４０％から約４５％に増加される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記第二の移動相のパーセンテージが、約３分間にわたって体積で約１０％から約４０％に、次いで約３０分間にわたって約４０％から約４５％に増加される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記第二の移動相のパーセンテージが、前記第一の移動相と前記第二の移動相との前記組合せにおいて、その後、約１分間にわたって体積で１００％に増加される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第二の移動相のパーセンテージが、前記第一の移動相と前記第二の移動相との前記組合せにおいて、その後、約１分間にわたって体積で１０％に低減される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記質量分析が、約１２５～３５０Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記質量分析が、約１７５Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記質量分析が、約３～６ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される、項目１～２
９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記質量分析が、約５ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される、項目１～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記特性解析が、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち少なくとも一つの翻訳後修飾を決定することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記翻訳後修飾が、アミノ酸の欠落、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化、脱アミド化、酸化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、および硫酸化のうちの一つまたは複数を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記翻訳後修飾が、Ｎ末端メチオニンの欠落、脱アミド化、トレオニンの欠落、リン酸化、およびアセチル化のうちの一つまたは複数を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
表２に挙げられた勾配プログラムを用いて実施される、項目１～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記特性解析が、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを含む緩衝液を用いる、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
前記緩衝液がアセトニトリルを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記緩衝液がメチオニンを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記緩衝液が、５ｍＭから５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５％～２０％のアセトニトリル、および１ｍＭから５０ｍＭのメチオニンを含む、項目３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記緩衝液が、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５％～１０％のアセトニトリル、および１０ｍＭのメチオニンを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌがｐＨ７．５である、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記翻訳後修飾が、ＡＡＶ８のＮ２６３、Ｎ５１４、Ｎ５７、Ｎ５０２、Ｎ２５４、およびＮ９４のうちの一つまたは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、もしくはＡＡＶｒｈ７４におけるその同等の残基に脱アミド化を含む、項目３２に記載の方法。
（項目４３）
前記翻訳後修飾が、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つまたは複数に脱アミド化を含む、項目３２に記載の方法。
（項目４４）
前記翻訳後修飾が、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうちの一つまたは複数での酸化を含む、項目３２に記載の方法。
（項目４５）
ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に脱アミド化を含むＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ組成物。
（項目４６）
ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうちの一つまたは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＣＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に酸化を含むＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ組成物。
（項目４７）
ＡＡＶ組成物中の宿主細胞タンパク質を特性解析する方法であって、
前記組成物からウイルスカプシドタンパク質を免疫沈降することと、
残留宿主細胞タンパク質を消化することと、
前記消化されたタンパク質を、液体クロマトグラフィー四重極飛行時間質量分析法（ＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳ）を用いて分析して、宿主細胞タンパク質を同定することと、を含む方法。
（項目４８）
前記免疫沈降が、ＡＡＶ組成物を、抗ＡＡＶ ＶＰ１抗体、抗ＡＡＶ ＶＰ２抗体、抗ＡＡＶ ＶＰ３抗体、またはそれらの組合せと共にインキュベートすることを含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記消化された宿主細胞タンパク質を反復ＭＳ／ＭＳにより分析することをさらに含む、項目４７または４８に記載の方法。
（項目５０）
前記消化が溶液中で行われる、項目４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記消化が、約６０℃から約８０℃の温度で実施される急速な消化を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記温度が約７０℃である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ＡＡＶ組成物を、既知の量の少なくとも一つの既知のタンパク質標品でスパイクすることをさらに含む、項目４７～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記少なくとも一つの既知のタンパク質標品が、ヒトまたはウシのタンパク質標品である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記少なくとも一つのタンパク質標品と比較して、前記消化された宿主細胞タンパク質の量を定量化することをさらに含む、項目５３または５４に記載の方法。
（項目５６）
前記液体クロマトグラフィーが、逆相液体クロマトグラフィーである、項目４７～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記逆相液体クロマトグラフィーが、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、またはＣ４カラムを用いて実施される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記液体クロマトグラフィーが、Ｃ８カラムを用いて実施される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記カラムが、約１．２～３．５μｍの粒子を含む、項目５７または５８に記載の方法。
（項目６０）
前記カラムが、約１．７μｍまたは約１．８μｍの粒子を含む、項目５７～５９のい
ずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記カラムが、約５０ｍｍから約３００ｍｍの長さであり、約１ｍｍから約４．６ｍｍの内径を有する、項目５７～６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記カラムが、約１５０ｍｍの長さであり、約２．１ｍｍの内径を有する、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記液体クロマトグラフィーが、約４０℃から約５０℃で実施される、項目４７～６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記液体クロマトグラフィーが、約４５℃で実施される、項目４７～６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記液体クロマトグラフィーが、ギ酸を含む第一の移動相を含む、項目４７～６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記第一の移動相が、体積で約０．０５％から約０．１５％のギ酸を含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記第一の移動相が、体積で約０．１％のギ酸を含む、項目６５または６６に記載の方法。
（項目６８）
前記液体クロマトグラフィーが、アセトニトリルと水との混合物中にギ酸を含む第二の移動相を含む、項目４７～６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記第二の移動相が、体積で約０．０５％から約０．１５％のギ酸を含む、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記第二の移動相が、体積で約０．１％のギ酸を含む、項目６８または６９に記載の方法。
（項目７１）
前記第二の移動相が、体積で約８０～９５％のアセトニトリルを含む、項目６８～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記第二の移動相が、体積で約９０％のアセトニトリルおよび体積で１０％の水を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記液体クロマトグラフィーにおいて、前記第一の移動相と前記第二の移動相との組合せに比較して、前記第二の移動相のパーセンテージが経時的に増加される、項目６８～７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記第二の移動相のパーセンテージが、約２％から約５０％に増加される、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記第二の移動相のパーセンテージが、約１２０分間にわたって体積で約２％から約５０％に増加される、項目７４に記載の方法。。
（項目７６）
前記第二の移動相のパーセンテージが、その後、体積で１００％に約５分間で増加される、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記第二の移動相のパーセンテージが、その後、体積で１００％で約３分間維持される、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記第二の移動相のパーセンテージが、その後、体積で約２％に約２分間で減少される、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記質量分析が、約１２５～３５０Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される、項目４７～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記質量分析が、約１３５Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される、項目４７～７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記質量分析が、約３～６ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される、項目４７～８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記質量分析が、約４ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される、項目４７～８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
アミノ酸修飾を有する亜集団を含有するカプシドタンパク質の不均一な群を含み、前記アミノ酸修飾が翻訳後修飾である、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
（項目８４）
前記修飾が、脱アミド化または酸化である、項目８３に記載のｒＡＡＶ。
（項目８５）
質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって測定された際に、前記不均一な群が、ＡＡＶ．ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に、脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含む、項目８３または８４に記載のｒＡＡＶ。
（項目８６）
前記不均一な群が、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ５７で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１５％未満含む、項目８５に記載のｒＡＡＶ。
（項目８７）
前記不均一な基が、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ５７で脱アミド化されたカプシドタンパク質を１５％未満含む、項目８５に記載のｒＡＡＶ。
（項目８８）
前記不均一な基が、ＡＡＶ．ｒｈ７４のＮ２５４および／またはＮ２５５で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満含む、項目８５に記載のｒＡＡＶ。
（項目８９）
前記不均一な群が、Ｎ２６３で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％未満含む、項目８５に記載のｒＡＡＶ。
（項目９０）
質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって測定された際に、前記不均一な群が、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうち一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＣＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に、酸化メチオニンを含む、
項目８３または８４に記載のｒＡＡＶ。
（項目９１）
前記不均一な群が、Ｍ４３７で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９２）
前記不均一な群が、Ｍ４７３で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９３）
前記不均一な群が、Ｍ５２６で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または３％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９４）
前記不均一な群が、Ｍ５４４で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または２％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９５）
前記不均一な群が、Ｍ５６０で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または２％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９６）
前記不均一な群が、Ｍ６３７で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９７）
前記不均一な群が、配列番号１～５のいずれか一つのペプチド配列、または他のＡＡＶ血清型のその同等のペプチド配列内に、脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含む、項目８３～８５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
（項目１）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を特性解析する方法であって、
前記ＡＡＶ粒子を、約７０℃から約９０℃の液体クロマトグラフィーに供することを含み、
前記ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比が、質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって決定される、方法。
（項目２）
ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の個々の質量が、前記質量分析によって決定される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比が、前記ＶＰ１、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の紫外線クロマトグラム（ＵＶ）を比較することによって決定される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記液体クロマトグラフィーが、逆相液体クロマトグラフィーである、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記逆相液体クロマトグラフィーが、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、またはＣ４カラムを用いて実施される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記液体クロマトグラフィーが、Ｃ８カラムを用いて実施される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記カラムが、約１．２～３．５μｍの粒子を含む、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
前記カラムが、約１．７μｍまたは約１．８μｍの粒子を含む、項目５～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記カラムが、約５０ｍｍから約３００ｍｍの長さであり、約１ｍｍから約４．６ｍｍの内径を有する、項目５～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記クロマトグラフィーカラムが、約１００ｍｍの長さであり、約２．１ｍｍの内径を有する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＡＡＶ粒子が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４のものであるか、または任意の天然、組換え、または合成のＡＡＶ粒子である、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ＡＡＶが血清型ＡＡＶｒｈ７４のものである、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記液体クロマトグラフィーが、約７５℃から約８５℃で実施される、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記液体クロマトグラフィーが約８０℃で実施される、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記液体クロマトグラフィーが、トリフルオロ酢酸を含む第一の移動相を含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記第一の移動相が、体積で約０．０５から約０．１５％のトリフルオロ酢酸を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第一の移動相が、体積で約０．１％のトリフルオロ酢酸を含む、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
前記液体クロマトグラフィーが、アセトニトリルと水との前記混合物中にトリフルオロ酢酸を含む第二の移動相を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記第二の移動相が、体積で約０．０５から約０．１５％のトリフルオロ酢酸を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記第二の移動相が、体積で約０．１％のトリフルオロ酢酸を含む、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２１）
前記第二の移動相が、体積で約８０～９５％のアセトニトリルを含む、項目１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記第二の移動相が、体積で約９０％のアセトニトリルおよび１０％の水を含む、項目１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記液体クロマトグラフィーにおいて、前記第一の移動相と前記第二の移動相との組合せに比較して、前記第二の移動相のパーセンテージが経時的に増加される、項目１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記第二の移動相のパーセンテージが、体積によって約１０％から約４０％に、次いで約４０％から約４５％に増加される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記第二の移動相のパーセンテージが、約３分間にわたって体積で約１０％から約４０％に、次いで約３０分間にわたって約４０％から約４５％に増加される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記第二の移動相のパーセンテージが、前記第一の移動相と前記第二の移動相との前記組合せにおいて、その後、約１分間にわたって体積で１００％に増加される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第二の移動相のパーセンテージが、前記第一の移動相と前記第二の移動相との前記組合せにおいて、その後、約１分間にわたって体積で１０％に低減される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記質量分析が、約１２５～３５０Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記質量分析が、約１７５Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記質量分析が、約３～６ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される、項目１～２
９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記質量分析が、約５ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される、項目１～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記特性解析が、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち少なくとも一つの翻訳後修飾を決定することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記翻訳後修飾が、アミノ酸の欠落、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化、脱アミド化、酸化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、および硫酸化のうちの一つまたは複数を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記翻訳後修飾が、Ｎ末端メチオニンの欠落、脱アミド化、トレオニンの欠落、リン酸化、およびアセチル化のうちの一つまたは複数を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
表２に挙げられた勾配プログラムを用いて実施される、項目１～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記特性解析が、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを含む緩衝液を用いる、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
前記緩衝液がアセトニトリルを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記緩衝液がメチオニンを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記緩衝液が、５ｍＭから５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５％～２０％のアセトニトリル、および１ｍＭから５０ｍＭのメチオニンを含む、項目３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記緩衝液が、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５％～１０％のアセトニトリル、および１０ｍＭのメチオニンを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌがｐＨ７．５である、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記翻訳後修飾が、ＡＡＶ８のＮ２６３、Ｎ５１４、Ｎ５７、Ｎ５０２、Ｎ２５４、およびＮ９４のうちの一つまたは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、もしくはＡＡＶｒｈ７４におけるその同等の残基に脱アミド化を含む、項目３２に記載の方法。
（項目４３）
前記翻訳後修飾が、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つまたは複数に脱アミド化を含む、項目３２に記載の方法。
（項目４４）
前記翻訳後修飾が、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうちの一つまたは複数での酸化を含む、項目３２に記載の方法。
（項目４５）
ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に脱アミド化を含むＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ組成物。
（項目４６）
ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうちの一つまたは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＣＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に酸化を含むＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ組成物。
（項目４７）
ＡＡＶ組成物中の宿主細胞タンパク質を特性解析する方法であって、
前記組成物からウイルスカプシドタンパク質を免疫沈降することと、
残留宿主細胞タンパク質を消化することと、
前記消化されたタンパク質を、液体クロマトグラフィー四重極飛行時間質量分析法（ＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳ）を用いて分析して、宿主細胞タンパク質を同定することと、を含む方法。
（項目４８）
前記免疫沈降が、ＡＡＶ組成物を、抗ＡＡＶ ＶＰ１抗体、抗ＡＡＶ ＶＰ２抗体、抗ＡＡＶ ＶＰ３抗体、またはそれらの組合せと共にインキュベートすることを含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記消化された宿主細胞タンパク質を反復ＭＳ／ＭＳにより分析することをさらに含む、項目４７または４８に記載の方法。
（項目５０）
前記消化が溶液中で行われる、項目４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記消化が、約６０℃から約８０℃の温度で実施される急速な消化を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記温度が約７０℃である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ＡＡＶ組成物を、既知の量の少なくとも一つの既知のタンパク質標品でスパイクすることをさらに含む、項目４７～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記少なくとも一つの既知のタンパク質標品が、ヒトまたはウシのタンパク質標品である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記少なくとも一つのタンパク質標品と比較して、前記消化された宿主細胞タンパク質の量を定量化することをさらに含む、項目５３または５４に記載の方法。
（項目５６）
前記液体クロマトグラフィーが、逆相液体クロマトグラフィーである、項目４７～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記逆相液体クロマトグラフィーが、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、またはＣ４カラムを用いて実施される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記液体クロマトグラフィーが、Ｃ８カラムを用いて実施される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記カラムが、約１．２～３．５μｍの粒子を含む、項目５７または５８に記載の方法。
（項目６０）
前記カラムが、約１．７μｍまたは約１．８μｍの粒子を含む、項目５７～５９のい
ずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記カラムが、約５０ｍｍから約３００ｍｍの長さであり、約１ｍｍから約４．６ｍｍの内径を有する、項目５７～６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記カラムが、約１５０ｍｍの長さであり、約２．１ｍｍの内径を有する、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記液体クロマトグラフィーが、約４０℃から約５０℃で実施される、項目４７～６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記液体クロマトグラフィーが、約４５℃で実施される、項目４７～６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記液体クロマトグラフィーが、ギ酸を含む第一の移動相を含む、項目４７～６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記第一の移動相が、体積で約０．０５％から約０．１５％のギ酸を含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記第一の移動相が、体積で約０．１％のギ酸を含む、項目６５または６６に記載の方法。
（項目６８）
前記液体クロマトグラフィーが、アセトニトリルと水との混合物中にギ酸を含む第二の移動相を含む、項目４７～６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記第二の移動相が、体積で約０．０５％から約０．１５％のギ酸を含む、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記第二の移動相が、体積で約０．１％のギ酸を含む、項目６８または６９に記載の方法。
（項目７１）
前記第二の移動相が、体積で約８０～９５％のアセトニトリルを含む、項目６８～７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記第二の移動相が、体積で約９０％のアセトニトリルおよび体積で１０％の水を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記液体クロマトグラフィーにおいて、前記第一の移動相と前記第二の移動相との組合せに比較して、前記第二の移動相のパーセンテージが経時的に増加される、項目６８～７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記第二の移動相のパーセンテージが、約２％から約５０％に増加される、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記第二の移動相のパーセンテージが、約１２０分間にわたって体積で約２％から約５０％に増加される、項目７４に記載の方法。。
（項目７６）
前記第二の移動相のパーセンテージが、その後、体積で１００％に約５分間で増加される、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記第二の移動相のパーセンテージが、その後、体積で１００％で約３分間維持される、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記第二の移動相のパーセンテージが、その後、体積で約２％に約２分間で減少される、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記質量分析が、約１２５～３５０Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される、項目４７～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記質量分析が、約１３５Ｖのフラグメンター電圧を用いて実施される、項目４７～７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記質量分析が、約３～６ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される、項目４７～８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記質量分析が、約４ｋＶのキャピラリー電圧を用いて実施される、項目４７～８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
アミノ酸修飾を有する亜集団を含有するカプシドタンパク質の不均一な群を含み、前記アミノ酸修飾が翻訳後修飾である、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
（項目８４）
前記修飾が、脱アミド化または酸化である、項目８３に記載のｒＡＡＶ。
（項目８５）
質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって測定された際に、前記不均一な群が、ＡＡＶ．ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に、脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含む、項目８３または８４に記載のｒＡＡＶ。
（項目８６）
前記不均一な群が、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ５７で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１５％未満含む、項目８５に記載のｒＡＡＶ。
（項目８７）
前記不均一な基が、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ５７で脱アミド化されたカプシドタンパク質を１５％未満含む、項目８５に記載のｒＡＡＶ。
（項目８８）
前記不均一な基が、ＡＡＶ．ｒｈ７４のＮ２５４および／またはＮ２５５で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満含む、項目８５に記載のｒＡＡＶ。
（項目８９）
前記不均一な群が、Ｎ２６３で脱アミド化されたカプシドタンパク質を７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％未満含む、項目８５に記載のｒＡＡＶ。
（項目９０）
質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって測定された際に、前記不均一な群が、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうち一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＣＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、またはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に、酸化メチオニンを含む、
項目８３または８４に記載のｒＡＡＶ。
（項目９１）
前記不均一な群が、Ｍ４３７で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９２）
前記不均一な群が、Ｍ４７３で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９３）
前記不均一な群が、Ｍ５２６で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または３％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９４）
前記不均一な群が、Ｍ５４４で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または２％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９５）
前記不均一な群が、Ｍ５６０で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または２％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９６）
前記不均一な群が、Ｍ６３７で酸化されたカプシドタンパク質を３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満含む、項目９０に記載のｒＡＡＶ。
（項目９７）
前記不均一な群が、配列番号１～５のいずれか一つのペプチド配列、または他のＡＡＶ血清型のその同等のペプチド配列内に、脱アミド化アスパラギン（Ｎ）を含む、項目８３～８５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【図面の簡単な説明】
【0031】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、本発明の態様をさらに説明するために含まれる。
【0032】
【0033】
【0034】
【図3-1】図３は、ＶＰ１（図３Ａ）、ＶＰ２（図３Ｂ）、およびＶＰ３（図３Ｃ）カプシドタンパク質のそれぞれのデコンボリューションされたＭＳスペクトルを示し、これらは三つすべてのカプシドタンパク質の無傷の質量と、カプシドタンパク質の翻訳後修飾の検出とを確定するものである。
【図3-2】同上。
【0035】
【0036】
【0037】
【発明を実施するための形態】
【0038】
液体クロマトグラフィー、質量分析、または紫外線（ＵＶ）可視分光法を用いて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を特徴解析する方法が提供される。一部の態様では、ＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比、ならびに／またはＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち一つまたは複数の質量を決定するための方法が提供される。本開示はまた、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法を用いて、ｒＡＡＶ組成物の純度を特性解析する方法を提供する。
定義
定義
【0039】
便宜上、本発明をさらに説明する前に、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここにまとめる。これらの定義は、当業者によって本開示の残りの部分を考慮して読み取られ理解されるべきである。別段の定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書全体を通して使用される用語は、特定の例において別途限定されない限り、以下のように定義される．
【0040】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、冠詞の文法的な対象のうちの一つまたは一つ以上（すなわち、少なくとも一つ）を指すために使用される。
【0041】
本明細書に用いられる際に、「約」は、デバイス、値を決定するために採用される方法、または試験対象間に存在する変動に固有の誤差変動を値が含むことを標示するために使用される。一部の態様では、「約」は、所与の値または範囲の５％から１０％超（例えば、最大５％から１０％超）および５％から１０％未満（例えば、最小５％から１０％未満）の偏差が、挙げられた値または範囲の意図された意味の内に留まっていることを標示する。
【0042】
用語「ＡＡＶ」または「アデノ随伴ウイルス」とは、パルボウイルス属のウイルス内のディペンドパルボウイルスを指す。本明細書において、ＡＡＶとは、野生型ウイルス、または天然の野生型ウイルスに由来するＡＡＶ、例えば、天然のｃａｐ遺伝子によりコードされるカプシドタンパク質に由来するカプシド内にパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶ、および／もしくは非天然のカプシドｃａｐ遺伝子によりコードされるカプシドタンパク質に由来するカプシド内にパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶ、例えばＡＡＶｒｈ．７４を指し得る。
【0043】
ＡＡＶは、任意の血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．１０、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはそのバリアントおよび誘導体であり得る。一部の態様では、ｒＡＡＶは血清型ＡＡＶｒｈ．７４のものである。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されており、その全体が参照により組み込まれる。他の種類のｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも考慮される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。
Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。
【0044】
本明細書で使用される際に、用語「ＡＡＶ粒子」、「ＡＡＶベクター」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」、または「ＡＡＶベクター粒子」は、ＡＡＶカプシドおよびカプシド化ＡＡＶゲノムから構成されるウイルス粒子を指すために用いられる。ＡＡＶ粒子は、一部の態様では、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子など、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む。ＡＡＶベクター粒子の産生は、一部の態様では、ＡＡＶベクターの産生を含み、それはＡＡＶベクター粒子内にそのようなベクターが含有される場合である。
【0045】
例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質被覆に会合する線状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子。ＡＡＶビリオンは、一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶまたは自己相補性（ＳＣ）ＡＡＶのどちらかであり得る。一部の態様では、どちらかの相補的なセンス鎖、例えば「センス」鎖または「アンチセンス」鎖の一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、ＡＡＶビリオン内にパッケージングすることができ、両鎖は感染性が等しい。
【0046】
用語「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、両側にＡＡＶ ＩＴＲの位置する目的の異種ヌクレオチド配列を被包する、ＡＡＶタンパク質殻から構成される感染性の複製欠損ウイルスとして本明細書に定義される。ｒＡＡＶは、一部の態様では、ＡＡＶベクターと、ＡＡＶヘルパー機能と、アクセサリー機能とが中に導入された適切な宿主細胞で産生される。このようにして、宿主細胞は、ＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含有）をその後の遺伝子送達のために感染性組換えビリオン粒子内にパッケージングするために必要な、ＡＡＶポリペプチドをコードすることができる。
【0047】
本明細書で用いられる際に、用語「カプシドタンパク質」とは、ウイルスの被覆または殻を形成するタンパク質を指す。用語「ＡＡＶカプシドタンパク質」とは、合計６０個のサブユニットから構成されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の被覆を形成するタンパク質を指し、各サブユニットはアミノ酸配列、例えば、ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、ＶＰ２、またはＶＰ３である。
【0048】
本明細書に用いられる際に、用語「液体クロマトグラフィー（ＬＣ）」とは、混合物中の成分を分離、同定、および定量するために用いられる手法を指す。カラム液体クロマトグラフィーでは、液体移動相がカラムを通過し、移動相の成分が固体固定相と相互作用する。移動相の組成を分離ラン中に変更して、目的の化合物の相互作用の強度を変えることができる。移動相がカラムを通って流れるにつれて、典型的には、経時的にカラムから溶出される化合物の濃度をモニターして溶出曲線またはクロマトグラムを生成しながら、溶離液を画分に収集する。
【0049】
本明細書で用いられる際に、用語「固定相」とは、カラムに固定されたままの物質を指す。最も一般的に用いられる固定相カラムは、炭素鎖結合シリカ、フェニル結合シリカ、およびシアノ結合シリカである。一部の態様では、固定相は、Ｃ４、Ｃ８、またはＣ１８などの特定の長さの疎水性アルキル鎖を含みうる。一部の態様では、逆相クロマトグラフィーは、Ｃ８逆相クロマトグラフィー（例えば、Ｃ８固定相を利用する逆相クロマトグラフィー）である。
【0050】
本明細書で用いられる際に、用語「移動相」とは、カラムから化合物を溶出するために使用される水、溶媒、または水と溶媒との混合物を指す。最も一般的な移動相溶媒としては、以下に限定されないが、アセトニトリル、メタノール、テトラヒドロフラン、エタノール、またはイソプロピルアルコールが挙げられる。一部の態様では、二つの移動相が用いられる。例えば、第一の移動相と第二の移動相とをｉｎ ｓｉｔｕで混合して、カラムから物質を溶出するために用いる溶媒を得ることができる。一部の態様では、第二の移動相と第一の移動相との体積比は、溶出ステップの間に増加する勾配にある。
【0051】
本明細書で用いられる際に、用語「質量分析」または「ＭＳ」とは、イオンの質量対電荷（ｍ／ｚ）比を測定し、単純および複雑な混合物中の分子を同定および定量化する分析手法を指す。ＭＳ技術には、一般的に、（１）化合物をイオン化して荷電化合物を形成すること、および（２）荷電化合物の質量対電荷比を検出して分子量を計算することが含まれる。化合物は、任意の適切な手段によってイオン化されて検出され得る。「質量分析計」は一般的に、イオン化装置、質量分析器、およびイオン検出器を含む。一般的には、一つまたは複数の目的の分子がイオン化され、その後、イオンが質量分析装置に導入され、装置内では、磁界と電界との組合せにより、イオンは、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路を辿る。一部の質量分析の方法では、イオンは、例えば飛行時間（ＴＯＦ）、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴分光計、四重極またはイオントラップを用いて互いに分離され、次いで、イオン検出器を用いて検出され得る。
【0052】
本明細書で使用される際に、用語「紫外線可視分光法」、「紫外線可視分光光度法」、「ＵＶ－Ｖｉｓ」、または「ＵＶ／Ｖｉｓ」とは、液体および固体の光学特性（透過率、反射率、および吸光度）を決定するために用いられる吸収分光法または反射率分光法を指す。一部の態様では、紫外線可視分光法を用いて、ＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質を特性解析する。
【0053】
本明細書で用いられる際に、用語「総イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）」とは、同じスキャンに属するすべての質量スペクトルピークの強度を合計することによって生成されるクロマトグラムの型を指す。
【0054】
本明細書で用いられる際に、用語「ＡＡＶｒｈ７４」とは、ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質またはそのバリアントを有するＡＡＶ粒子を指す。例示的なＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１カプシドタンパク質配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，９０９，１４２号の配列番号４に記載されている。ＡＡＶｒｈ７４のＶＰ１カプシドタンパク質のバリアントの例も、米国特許第９，９０９，１４２号に記載されている。
【0055】
本明細書で用いられる際に、ＶＰタンパク質の「亜集団」という用語は、別段に指定のない限り、共通して少なくとも一つの画定された特徴を有し、参照グループの少なくとも一つのグループメンバーからすべてのメンバーには満たない、ＶＰタンパク質のグループを指す。例えば、別段に指定のない限り、ＶＰｌタンパク質の「亜集団」は、アセンブリされたＡＡＶカプシド中の少なくとも一つのＶＰｌタンパク質からすべてに満たないＶＰ１タンパク質であり得る。ＶＰ３タンパク質の「亜集団」は、別段に指定のない限り、アセンブリされたＡＡＶカプシド中の一つのＶＰ３タンパク質からすべてに満たないＶＰ３タンパク質であり得る。例えば、ＶＰｌタンパク質は、アセンブリされてＡＡＶカプシド中のＶＰタンパク質の亜集団である場合があり、ＶＰ２タンパク質は、ＶＰタンパク質の別の亜集団である場合があり、ＶＰ３は、ＶＰタンパク質のさらに別の亜集団である。別の例では、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質は、異なる修飾、例えば、少なくとも一つ、二つ、三つ、または四つの高度に脱アミド化されたアスパラギンを、例えば、アスパラギン－グリシン対に有する亜集団を含有することがある。
ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の特性解析
ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の特性解析
【0056】
一部の態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を特性解析する方法を提供し、この方法は、ＡＡＶ粒子を約７０℃から約９０℃の液体クロマトグラフィーに供することを含み、ここでＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の質量および比は、質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって決定される。一部の態様では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の質量および比は、質量分析法および紫外線（ＵＶ）可視分光法によって決定される。一部の態様では、ＡＡＶ粒子上のカプシドは、液体クロマトグラフィーのカラム内でＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質のそれぞれに変性される。一部の態様では、カプシドタンパク質は、液体クロマトグラフィーによって分離される。
一部の態様では、本方法は、（ａ）ＡＡＶ粒子を液体クロマトグラフィーに供してＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を分離すること、および（ｂ）工程（ａ）で生じた分離済みのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を質量分析および／または紫外線可視分光法に供して、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の相対量を決定し、それによって、ＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比を決定することを含む。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約７０℃から約９０℃で実施される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約７０℃、７４℃、７６℃、７８℃、８０℃、８２℃、８４℃、８６℃、８８℃、または９０℃で実施される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約８０℃で実施される。
一部の態様では、本方法は、（ａ）ＡＡＶ粒子を液体クロマトグラフィーに供してＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を分離すること、および（ｂ）工程（ａ）で生じた分離済みのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を質量分析および／または紫外線可視分光法に供して、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の相対量を決定し、それによって、ＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比を決定することを含む。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約７０℃から約９０℃で実施される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約７０℃、７４℃、７６℃、７８℃、８０℃、８２℃、８４℃、８６℃、８８℃、または９０℃で実施される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約８０℃で実施される。
【0057】
一部の態様では、本方法は、ＡＡＶ粒子のＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち一つまたは複数の質量を決定することをさらに含む。
【0058】
一部の態様では、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の相対量は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の総イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を比較することによって決定される。
【0059】
一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは逆相液体クロマトグラフィーである。
【0060】
一部の態様では、逆相クロマトグラフィーは、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、またはＣ４カラムを用いて実施される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、Ｃ８カラムを用いて実施される。
【0061】
一部の態様では、逆相液体クロマトグラフィーの固定相は、約５０～３００ｍｍの長さであり、約１～４．６ｍｍの内径を有するクロマトグラフィーカラム内に含まれる。一部の態様では、カラムはＢＥＨカラムである。一部の態様では、カラムは、１ｍｍ、２．１ｍｍ、３ｍｍ、または４．６ｍｍの内径を有する。一部の態様では、カラムは５０ｍｍ、７５ｍｍ、１００ｍｍ、１５０ｍｍ、または３００ｍｍの長さを有する。一部の態様では、カラムサイズは、１ｍｍ×５０ｍｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、３ｍｍ×５０ｍｍ、４．６ｍｍ×５０ｍｍ、１ｍｍ×７５ｍｍ、２．１ｍｍ×７５ｍｍ、３ｍｍ×７５ｍｍ、４．６ｍｍ×７５ｍｍ、１ｍｍ×１００ｍｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、３ｍｍ×１００ｍｍ、４．６ｍｍ×１００ｍｍ、１ｍｍ×１５０ｍｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、３ｍｍ×１５０ｍｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、１ｍｍ×３００ｍｍ、２．１ｍｍ×３００ｍｍ、３ｍｍ×３００ｍｍ、または４．６ｍｍ×３００ｍｍである。一部の態様では、カラムサイズは、１．６×５０ｍｍ、１．６×６０ｍｍ、１．６×７０ｍｍ、１．６×８０ｍｍ、１．６×９０ｍｍ、１．６×１００ｍｍ、１．６×１１０ｍｍ、１．６×１２０ｍｍ、１．６×１３０ｍｍ、１．６×１４０ｍｍ、１．６×１５０ｍｍ、１．７×５０ｍｍ、１．７×６０、１．７×７０ｍｍ、１．７×８０ｍｍ、１．７×９０ｍｍ、１．７×１００ｍｍ、１．７×１１０ｍｍ、１．７×１２０ｍｍ、１．７×１３０ｍｍ、１．７×１４０ｍｍ、１．７×１５０ｍｍ、１．８×５０ｍｍ、１．８×６０、１．８×７０ｍｍ、１．８×８０ｍｍ、１．８×９０ｍｍ、１．８×１００ｍｍ、１．８×１１０ｍｍ、１．８×１２０ｍｍ、１．８×１３０ｍｍ、１．８×１４０ｍｍ、１．８×１５０ｍｍ、１．９×５０ｍｍ、１．９×６０ｍｍ、１．９×７０ｍｍ、１．９×８０ｍｍ、１．９×９０ｍｍ、１．９×１００ｍｍ、１．９×１１０ｍｍ、１．９×１２０ｍｍ、１．９×１３０ｍｍ、１．９×１４０ｍｍ、１．９×１５０ｍｍ、２．０×５０ｍｍ、２．０×６０ｍｍ、２．０×７０ｍｍ、２．０×８０ｍｍ、２．０×９０ｍｍ、２．０×１００ｍｍ、２．０×１１０ｍｍ、２．０×１２０ｍｍ、２．０×１３０ｍｍ、２．０×１４０ｍｍ、２．０×１５０ｍｍ、２．１×５０ｍｍ、２．１×６０ｍｍ、２．１×７０ｍｍ、２．１×８０ｍｍ、２．１×９０ｍｍ、２．１×１００ｍｍ、２．１×１１０ｍｍ、２．１×１２０ｍｍ、２．１×１３０ｍｍ、２．１×１４０ｍｍ、２．１×１５０ｍｍ、２．２×５０ｍｍ、２．２×６０ｍｍ、２．２×７０ｍｍ、２．２×８０ｍｍ、２．２×９０ｍｍ、２．２×１００ｍｍ、２．２×１１０ｍｍ、２．２×１２０ｍｍ、２．２×１３０ｍｍ、２．２×１４０ｍｍ、２．２×１５０ｍｍ、２．３×５０ｍｍ、２．３×６０ｍｍ、２．３×７０ｍｍ、２．３×８０ｍｍ、２．３×９０ｍｍ、２．３×１００ｍｍ、２．３×１１０ｍｍ、２．３×１２０ｍｍ、２．３×１３０ｍｍ、２．３×１４０ｍｍ、２．３×１５０ｍｍ、２．４×５０ｍｍ、２．４×６０ｍｍ、２．４×７０ｍｍ、２．４×８０ｍｍ、２．４×９０ｍｍ、２．４×１００ｍｍ、２．４×１１０ｍｍ、２．４×１２０ｍｍ、２．４×１３０ｍｍ、２．４×１４０ｍｍ、２．４×１５０ｍｍ、２．５×５０ｍｍ、２．５×６０、２．５×７０ｍｍ、２．５×８０ｍｍ、２．５×９０ｍｍ、２．５×１００ｍｍ、２．５×１１０ｍｍ、２．５×１２０ｍｍ、２．５×１３０ｍｍ、２．５×１４０ｍｍ、２．５×１５０ｍｍ、２．６×５０ｍｍ、２．６×６０ｍｍ、２．６×７０ｍｍ、２．６×８０ｍｍ、２．６×９０ｍｍ、２．６×１００ｍｍ、２．６×１１０ｍｍ、２．６×１２０ｍｍ、２．６×１３０ｍｍ、２．６×１４０ｍｍ、または２．６×１５０ｍｍである。一部の態様では、逆相液体クロマトグラフィーの固定相は、約１００ｍｍの長さであり、約２．１ｍｍの内径を有するクロマトグラフィーカラム内に含まれる。
【0062】
一部の態様では、逆相液体クロマトグラフィーの固定相は、約１．２μｍ～２．５μｍの間のサイズの粒子を含む。別の態様では、逆相液体クロマトグラフィーの固定相は、約１．７μｍ、１．８μｍ、または２．１μｍのサイズの粒子を含む。一部の態様では、粒子サイズは、約１．２μｍ、１．３μｍ、１．４μｍ、１．５μｍ、１．６μｍ、１．７μｍ、１．８μｍ、１．９μｍ、２．０μｍ、２．１μｍ、２．２μｍ、２．３μｍ、２．４μｍ、または２．５μｍである。一部の態様では、逆相液体クロマトグラフィーの固定相は、約１．７μｍの粒子から構成される。
【0063】
一部の態様では、クロマトグラフィーは、水中にフッ素置換酢酸を含む第一の移動相を使用する。フッ素置換酢酸としては、モノフルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、およびトリフルオロ酢酸が挙げられる。一部の態様では、クロマトグラフィーは、水中にトリフルオロ酢酸を含む第一の移動相を使用する。
【0064】
一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．０５から約０．１５％のフッ素置換酢酸を含む。一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％、または０．２％のフッ素置換酢酸を含む。一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．０５％または０．１％のフッ素置換酢酸を含む。一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．１％のフッ素置換酢酸を含む。一部の態様では、フッ素置換酢酸はトリフルオロ酢酸である。一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．１％のトリフルオロ酢酸を含む。
【0065】
一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にフッ素置換酢酸を含む第二の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にトリフルオロ酢酸を含む第二の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリルと水との混合物中にフッ素置換酢酸を含む第二の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリルと水との混合物中にトリフルオロ酢酸を含む第二の移動相を使用する。
【0066】
一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．０５～０．２％のフッ素置換酢酸を含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．０５～０．１５％のフッ素置換酢酸を含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％、または０．２％のフッ素置換酢酸を含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．０５％または０．１％のフッ素置換酢酸を含む。一部の態様では、第二の移動相は、約０．１％のフッ素置換酢酸を含む。一部の態様では、フッ素置換酢酸はトリフルオロ酢酸である。一部の態様では、第二の移動相は、約０．１％のトリフルオロ酢酸を含む。
【0067】
一部の態様では、第二の移動相は、体積で約７５～９５％のアセトニトリルを含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のアセトニトリルを含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約９０％のアセトニトリルと１０％の水とを含む。
【0068】
一部の態様では、クロマトグラフィーにおいて、第一の移動相と第二の移動相との組合せにおける第二の移動相のパーセンテージは、経時的に増加する。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、体積で約１０％から約４０％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、体積で約１０％から約４５％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、体積で約１０％から約１００％増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約３０～４０分間で約１０％から約４５％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約３５分間で約１０％から約４５％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約３０～５０分間で体積で約１０％から約１００％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約３６分間で体積で約１０％から約１００％に増加される。
【0069】
一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約５～１０分間で体積で約１０％から約４０％に、約２５～３５分間で約４０％から約４５％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約０．５～２分間で約４５％から約１００％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約０．５～２分間で約１００％から約１０％に低減される。
【0070】
一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約６分間で体積で約１０％から約４０％に、約２９分間で約４０％から約４５％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約１分間で約４５％から約１００％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約１分間で約１００％から約１０％に低減される。
【0071】
一部の態様では、液体クロマトグラフィーは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは超高圧液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）である。
【0072】
一部の態様では、質量分析は、任意のイオン化モード、具体的には生体分子の分析に適したモードを用いてもよく、そのようなものとしては、以下に限定されないが、直接注入質量分析、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）－ＭＳ、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）－ＭＳ、リアルタイムでの直接分析（ＤＡＲＴ）－ＭＳ、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）－ＭＳ、電子衝撃（Ｅｌ）または化学イオン化（ＣＩ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）－ＭＳ、および大気圧イオン化－エレクトロスプレー（ＡＰＩ－ＥＳ）が挙げられる。一部の態様では、質量分析は、ＡＰＩ－ＥＳイオン化モードを用いる。
【0073】
一部の態様では、質量分析は、４００～１６０００ｍ／ｚの範囲にわたってシグナルをスキャンする。一部の態様では、質量分析は、７００～１３７００ｍ／ｚの範囲にわたってシグナルをスキャンする。
【0074】
一部の態様では、質量分析のスキャンタイプは、正極性である。一部の態様では、質量分析のデータ取得時間は、約１０～３５分である。一部の態様では、質量分析のデータ取得時間は、約１７～２８分である。
【0075】
一部の態様では、質量分析のノズル電圧は約４００～６００Ｖである。一部の態様では、質量分析のノズル電圧は約５００Ｖである。一部の態様では、質量分析のスキマー電圧は約６０～７０Ｖである。一部の態様では、質量分析のスキマー電圧は約６５Ｖである。一部の態様では、ノズル電圧とスキマー電圧との差は約４００～４５０Ｖである。一部の態様では、ノズル電圧とスキマー電圧との差は約４３５Ｖである。
【0076】
一部の態様では、質量分析の乾燥ガス温度は約２００～３５０℃である。一部の態様では、質量分析の乾燥ガス温度は約３００℃である。一部の態様では、質量分析の乾燥ガス流量は約５～１３Ｌ／分である。一部の態様では、質量分析の乾燥ガス流量は約１３Ｌ／分である。
【0077】
一部の態様では、質量分析は、約３～６ｋＶのキャピラリー電圧を用いる。一部の態様では、質量分析は、約３、４、５、または６ｋＶのキャピラリー電圧を用いる。一部の態様では、質量分析は、約５ｋＶのキャピラリー電圧を用いる。
【0078】
一部の態様では、質量分析は、約１２５～３５０Ｖのフラグメンター電圧を用いる。一部の態様では、質量分析は、約１２５Ｖ、１３０Ｖ、１３５Ｖ、１４５Ｖ、１５５Ｖ、１６０Ｖ、１６５Ｖ、１７５Ｖ、１８５Ｖ、１９０Ｖ、１９５Ｖ、２００Ｖ、２０５Ｖ、２１０Ｖ、２１５Ｖ、２２０Ｖ、２２５Ｖ、２３０Ｖ、２３５Ｖ、２４０Ｖ、２４５Ｖ、２５０Ｖ、２５５Ｖ、２６０Ｖ、２６５Ｖ、２７０Ｖ、２７５Ｖ、２８０Ｖ、２８５Ｖ、２９０Ｖ、２９５Ｖ、３００Ｖ、３０５Ｖ、３１０Ｖ、３１５Ｖ、３２０Ｖ、３２５Ｖ、３３０Ｖ、３３５Ｖ、３４０Ｖ、３４５Ｖ、または３５０Ｖのフラグメンター電圧を用いる。一部の態様では、質量分析は、約１７５Ｖのフラグメンター電圧を用いる。
【0079】
一部の態様では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、または任意の天然、組換え、もしくは合成のＡＡＶ粒子である。一部の態様では、ＡＡＶ粒子は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子である。一部の態様では、ＡＡＶ粒子はＡＡＶｒｈ７４である。
【0080】
一部の上述の態様では、本開示は、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち少なくとも一つの翻訳後修飾を決定することをさらに含む。一部の態様では、本開示は、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち少なくとも一つの翻訳後のグリコシル化、シアリル化、アセチル化、アミノ酸の欠落、アミド化、リン酸化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、および／または硫酸化を決定することをさらに含む。翻訳後修飾は、Ｎ末端メチオニンの欠落、トレオニンの欠落、リン酸化、およびアセチル化のうちの一つまたは複数を含む。
【0081】
一部の態様では、本開示は、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質におけるＮ末端メチオニンの除去を決定することを含む。一部の態様では、本開示は、ＶＰ１またはＶＰ３カプシドタンパク質におけるＮ末端メチオニンの除去を決定することを含む。一部の態様では、本開示は、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質におけるＮ末端メチオニンの除去後のＮ末端アセチル化を決定することを含む。一部の態様では、本開示は、ＶＰ１またはＶＰ３カプシドタンパク質におけるＮ末端メチオニンの除去後のＮ末端アセチル化を決定することを含む。
【0082】
一部の態様では、本開示は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比、ならびに／またはＡＡＶ粒子中のＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち一つもしくは複数の質量に部分的に少なくとも基づいて、ＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質を特性解析する方法を提供する。
【0083】
一部の態様では、本開示は、ＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比、ならびに／またはＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のうち一つもしくは複数の質量に部分的に少なくとも基づいてＡＡＶ粒子の血清型を決定する方法を提供し、ここでは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比、ならびにＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の一つまたは複数の質量は、本明細書に開示される方法によって決定される。
【0084】
質量分析法は、タンパク質の特性解析のための分析手法である。一部の態様では、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法によって、三つすべてのカプシドタンパク質の無傷の質量と共に、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の比を特性解析するための方法が提供される。一部の態様では、ＡＡＶｒｈ７４カプシドを、オンカラムで個々のカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３に変性する。変性を、カラムコンパートメントを８０℃に加熱することによって達成する（３、４）。次に、移動相のイオン対剤としてトリフルオロ酢酸を活用して、カプシドタンパク質を、ウォーターズＢＥＨ Ｃ８カラムでベースライン分離する（５）。変性したタンパク質を、まずＵＶで分析しカプシド比を得て、次に質量分析計で個々のタンパク質の無傷の質量を得る。
【0085】
脱アミド化は、アスパラギン残基のイソアスパラギン酸とアスパラギン酸との混合物への変換をもたらす、一般的な翻訳後修飾である。グルタミン残基の脱アミド化も起こるが、はるかに遅い速度で起こる。酸化もまた、様々なフリーラジカルおよび活性酸素種とのタンパク質の反応の結果である、一般的な翻訳後修飾である。メチオニン酸化が最も一般的であるが、システインおよびトリプトファンなどのいくつかの他のアミノ酸残基の酸化も観察されている。脱アミド化／酸化はまた、製造および貯蔵中に起こるタンパク質の一般的な分解経路である。脱アミド化は、タンパク質の活性および安定性に影響を与えることがある。酸化は、タンパク質の立体構造変化を引き起こし、それゆえにタンパク質の活性および安定性に影響を与えることがある。酸化はまた、タンパク質の免疫原性に影響を与えることがある。そのため、タンパク質の極めて重要な品質特性（ＣＱＡ）を、翻訳後修飾について慎重にモニタリングする必要がある。
【0086】
重炭酸アンモニウムを用いた現行の方法は、疑似シグナルを生成するか、またはＡＡＶカプシドタンパク質中の脱アミド化を過大評価するものであった（表７）。そこで、本開示は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用いてカプシドタンパク質上の翻訳後修飾をより正確に測定する方法を提供する。一部の態様では、ＬＣ ＭＳ法は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを含む緩衝液を使用する。一部の態様では、緩衝液はアセトニトリルを含む。一部の態様では、緩衝液はメチオニンを含む。一部の態様では、緩衝液は、５ｍＭから５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５％～２０％のアセトニトリル、および１ｍＭから５０ｍＭのメチオニンを含む。一部の態様では、緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５％～１０％のアセトニトリル、および１０ｍＭのメチオニンを含む。
【0087】
一部の態様では、翻訳後修飾は、ＡＡＶ８のＮ２６３、Ｎ５１４、Ｎ５７、Ｎ５０２、Ｎ２５４、およびＮ９４のうちの一つまたは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、もしくはＡＡＶｒｈ７４におけるその同等の残基に、脱アミド化を含む。一部の態様では、翻訳後修飾は、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つまたは複数に、脱アミド化を含む。一部の態様では、翻訳後修飾は、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうちの一つまたは複数に、酸化を含む。
ＡＡＶ組成物
ＡＡＶ組成物
【0088】
本開示の一部の態様は、アミノ酸改変を有する亜集団を含有する不均一なカプシドタンパク質群を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を対象とする。一部の態様では、修飾は、脱アミド化、アセチル化、異性化、リン酸化、または酸化であり得る。一部の態様では、修飾は脱アミド化または酸化である。
【0089】
一部の態様では、ｒＡＡＶカプシドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つから少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基を有するＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３の亜集団を含有し得るが、そのうち少なくとも約１％から約１０％、少なくとも約１０％から約２５％、少なくとも約２５％から約５０％、少なくとも約５０％から約７０％、少なくとも約７０％から約１００％、少なくとも約７５％から約１００％、少なくとも約８０％から約１００％、または少なくとも約９０％から約１００％が、ＶＰタンパク質のコードされたアミノ酸配列と比較して脱アミド化されている。 一部の態様では、これらの大部分はＮ残基であり得る。一部の態様では、Ｑ残基は脱アミド化され得る。
【0090】
一部の態様では、本開示は、質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって測定された際に、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＮ５７、Ｎ２５５、Ｎ２５６、およびＮ２６３のうちの一つもしくは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に脱アミド化を含む、ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ組成物を提供する。一部の態様では、脱アミド化は、本明細書に開示される方法のいずれかによって測定される。
【0091】
一部の態様では、上記不均一な群は、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ５７で脱アミド化されたカプシドタンパク質を約８０％未満、約７８％未満、約７６％未満、約７４％未満、約７２％未満、約７０％未満、約６８％未満、約６６％未満、約６４％未満、約６２％未満、約６０％未満、約５８％未満、約５６％未満、約５４％未満、約５２％未満、約５０％未満、約４８％未満、約４６％未満、約４４％未満、約４２％未満、約４０％未満、約３８％未満、約３６％未満、約３４％未満、約３２％未満、約３０％未満、約２８％未満、約２６％未満、約２４％未満、約２２％未満、約２０％未満、約１８％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、または約１０％未満含む。
【0092】
一部の態様では、上記不均一な群は、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ５７で脱アミド化されたカプシドタンパク質を約２５％未満、約２４％未満、約２３％未満、約２２％未満、約２１％未満、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、または約１０％未満含む。
【0093】
一部の態様では、上記不均一な群は、ＡＡＶ．ｒｈ７４カプシドのＮ２５４および／またはＮ２５５で脱アミド化されたカプシドタンパク質を約８０％未満、約７８％未満、約７６％未満、約７４％未満、約７２％未満、約７０％未満、約６８％未満、約６６％未満、約６４％未満、約６２％未満、約６０％未満、約５８％未満、約５６％未満、約５４％未満、約５２％未満、約５０％未満、約４８％未満、約４６％未満、約４４％未満、約４２％未満、約４０％未満、約３８％未満、約３６％未満、約３４％未満、約３２％未満、約３０％未満、約２８％未満、約２６％未満、約２４％未満、約２２％未満、約２０％未満、約１８％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、または約１０％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満含む。
【0094】
一部の態様では、上記不均一な群は、Ｎ２６３で脱アミド化されたカプシドタンパク質を約８０％未満、約７８％未満、約７６％未満、約７４％未満、約７２％未満、約７０％未満、約６８％未満、約６６％未満、約６４％未満、約６２％未満、約６０％未満、約５８％未満、約５６％未満、約５４％未満、約５２％未満、約５０％未満、約４８％未満、約４６％未満、約４４％未満、約４２％未満、約４０％未満、約３８％未満、約３６％未満、約３４％未満、約３２％未満、約３０％未満、約２８％未満、約２６％未満、約２４％未満、約２２％未満、約２０％未満、約１８％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、または約１０％未満含む。
【0095】
一部の態様では、ＡＡＶ組成物は、質量分析および／または紫外線（ＵＶ）可視分光法によって測定された際に、ＡＡＶ．Ｒｈ７４のＭ４３７、Ｍ４７３、Ｍ５２６、Ｍ５４４、Ｍ５６０、およびＭ６３７のうちの一つまたは複数、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、もしくはＡＡＶｒｈ１０の同等の残基に酸化を含む、ＡＡＶカプシドを含む。一部の態様では、脱アミド化は、本明細書に開示される方法のいずれかによって測定される。
【0096】
一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ４３７で酸化されたカプシドタンパク質を約４０％未満、約４８％未満、約４６％未満、約４４％未満、約４２％未満、約４０％未満、約３８％未満、約３６％未満、約３４％未満、約３２％未満、約３０％未満、約２８％未満、約２６％未満、約２４％未満、約２２％未満、約２０％未満、約１８％未満、約１６％未満、約１４％未満、約１２％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、または０．５％未満含む。
【0097】
一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ４７３で酸化されたカプシドタンパク質を約４０％未満、約４８％未満、約４６％未満、約４４％未満、約４２％未満、約４０％未満、約３８％未満、約３６％未満、約３４％未満、約３２％未満、約３０％未満、約２８％未満、約２６％未満、約２４％未満、約２２％未満、約２０％未満、約１８％未満、約１６％未満、約１４％未満、約１２％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、または０．５％未満含む。
【0098】
一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ５２６で酸化されたカプシドタンパク質を約４０％未満、約４８％未満、約４６％未満、約４４％未満、約４２％未満、約４０％未満、約３８％未満、約３６％未満、約３４％未満、約３２％未満、約３０％未満、約２８％未満、約２６％未満、約２４％未満、約２２％未満、約２０％未満、約１８％未満、約１６％未満、約１４％未満、約１２％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、または０．５％未満含む。
【0099】
一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ５４４で酸化されたカプシドタンパク質を約４０％未満、約４８％未満、約４６％未満、約４４％未満、約４２％未満、約４０％未満、約３８％未満、約３６％未満、約３４％未満、約３２％未満、約３０％未満、約２８％未満、約２６％未満、約２４％未満、約２２％未満、約２０％未満、約１８％未満、約１６％未満、約１４％未満、約１２％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、または０．５％未満含む。
【0100】
一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ５６０で酸化されたカプシドタンパク質を約４０％未満、約４８％未満、約４６％未満、約４４％未満、約４２％未満、約４０％未満、約３８％未満、約３６％未満、約３４％未満、約３２％未満、約３０％未満、約２８％未満、約２６％未満、約２４％未満、約２２％未満、約２０％未満、約１８％未満、約１６％未満、約１４％未満、約１２％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、または０．５％未満含む。
【0101】
一部の態様では、上記不均一な群は、Ｍ６３７で酸化されたカプシドタンパク質を約４０％未満、約４８％未満、約４６％未満、約４４％未満、約４２％未満、約４０％未満、約３８％未満、約３６％未満、約３４％未満、約３２％未満、約３０％未満、約２８％未満、約２６％未満、約２４％未満、約２２％未満、約２０％未満、約１８％未満、約１６％未満、約１４％未満、約１２％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、または０．５％未満含む。
ＡＡＶ組成物中の宿主細胞タンパク質の特性解析
ＡＡＶ組成物中の宿主細胞タンパク質の特性解析
【0102】
一部の態様では、本開示は、ＡＡＶベースの遺伝子治療医薬品などのＡＡＶ組成物中の宿主細胞タンパク質を特性解析する方法を提供する。一部の態様では、ＡＡＶ組成物における宿主細胞タンパク質を特性解析する方法は、組成物からウイルスカプシドタンパク質を免疫沈降すること、残留宿主細胞タンパク質を消化すること、および消化されたタンパク質を液体クロマトグラフィー四重極飛行時間質量分析法（ＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳ）で分析して、宿主細胞タンパク質を同定することを含む。本明細書で用いられる際に、用語「残留宿主細胞タンパク質」または「残留タンパク質」とは、免疫沈降後に溶液中に残っているタンパク質を意味する。一部の態様では、本方法は、消化された宿主細胞タンパク質を反復ＭＳ／ＭＳで分析することをさらに含む。
【0103】
一部の態様では、免疫沈降は、ＡＡＶ組成物をＶＰ抗体と共にインキュベートすることを含む。一部の態様では、ＶＰ抗体は、抗ＡＡＶ ＶＰ１抗体、抗ＡＡＶ ＶＰ２抗体、抗ＡＡＶ ＶＰ３抗体、またはそれらの組合せを含む。一部の態様では、抗体は、アメリカンリサーチプロダクツ社から得られる抗アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３（カタログ番号：０３－６１０５８）とすることができる。
【0104】
一部の態様では、残留宿主細胞タンパク質は溶液中で消化される。一部の態様では、消化は急速な消化である。一部の態様では、急速な消化は、約６０℃から約８０℃で実施される。一部の態様では、急速な消化は、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃、または約８０℃で実施される。一部の態様では、急速な消化は約７０℃で実施される。
【0105】
一部の態様では、ＡＡＶ組成物は、既知の量の少なくとも一つの既知のタンパク質標品によりスパイクされる。一部の態様では、少なくとも一つの既知のタンパク質標品は、ヒトまたはウシのタンパク質標品である。一部の態様では、本方法は、少なくとも一つの既知のタンパク質標品と比較して、残留宿主細胞タンパク質の量を定量化することをさらに含む。
【0106】
一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーである。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは逆相液体クロマトグラフィーである。
【0107】
一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約３５℃から約５５℃で実施される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、または約５５℃、で実施される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、約４５℃で実施される。
【0108】
一部の態様では、逆相クロマトグラフィーは、Ｃ１８カラム、Ｃ８カラム、またはＣ４カラムを用いて実施される。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは、Ｃ８カラムを用いて実施される。
【0109】
一部の態様では、逆相液体クロマトグラフィーの固定相は、約５０～３００ｍｍの長さであり、約１～４．６ｍｍの内径を有するクロマトグラフィーカラム内に含まれる。一部の態様では、カラムはＢＥＨカラムである。一部の態様では、カラムは、１ｍｍ、２．１ｍｍ、３ｍｍ、または４．６ｍｍの内径を有する。一部の態様では、カラムは５０ｍｍ、７５ｍｍ、１００ｍｍ、１５０ｍｍ、または３００ｍｍの長さを有する。一部の態様では、カラムサイズは、１ｍｍ×５０ｍｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、３ｍｍ×５０ｍｍ、４．６ｍｍ×５０ｍｍ、１ｍｍ×７５ｍｍ、２．１ｍｍ×７５ｍｍ、３ｍｍ×７５ｍｍ、４．６ｍｍ×７５ｍｍ、１ｍｍ×１００ｍｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、３ｍｍ×１００ｍｍ、４．６ｍｍ×１００ｍｍ、１ｍｍ×１５０ｍｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、３ｍｍ×１５０ｍｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、１ｍｍ×３００ｍｍ、２．１ｍｍ×３００ｍｍ、３ｍｍ×３００ｍｍ、または４．６ｍｍ×３００ｍｍである。一部の態様では、カラムサイズは、１．６×５０ｍｍ、１．６×６０ｍｍ、１．６×７０ｍｍ、１．６×８０ｍｍ、１．６×９０ｍｍ、１．６×１００ｍｍ、１．６×１１０ｍｍ、１．６×１２０ｍｍ、１．６×１３０ｍｍ、１．６×１４０ｍｍ、１．６×１５０ｍｍ、１．７×５０ｍｍ、１．７×６０、１．７×７０ｍｍ、１．７×８０ｍｍ、１．７×９０ｍｍ、１．７×１００ｍｍ、１．７×１１０ｍｍ、１．７×１２０ｍｍ、１．７×１３０ｍｍ、１．７×１４０ｍｍ、１．７×１５０ｍｍ、１．８×５０ｍｍ、１．８×６０、１．８×７０ｍｍ、１．８×８０ｍｍ、１．８×９０ｍｍ、１．８×１００ｍｍ、１．８×１１０ｍｍ、１．８×１２０ｍｍ、１．８×１３０ｍｍ、１．８×１４０ｍｍ、１．８×１５０ｍｍ、１．９×５０ｍｍ、１．９×６０ｍｍ、１．９×７０ｍｍ、１．９×８０ｍｍ、１．９×９０ｍｍ、１．９×１００ｍｍ、１．９×１１０ｍｍ、１．９×１２０ｍｍ、１．９×１３０ｍｍ、１．９×１４０ｍｍ、１．９×１５０ｍｍ、２．０×５０ｍｍ、２．０×６０ｍｍ、２．０×７０ｍｍ、２．０×８０ｍｍ、２．０×９０ｍｍ、２．０×１００ｍｍ、２．０×１１０ｍｍ、２．０×１２０ｍｍ、２．０×１３０ｍｍ、２．０×１４０ｍｍ、２．０×１５０ｍｍ、２．１×５０ｍｍ、２．１×６０ｍｍ、２．１×７０ｍｍ、２．１×８０ｍｍ、２．１×９０ｍｍ、２．１×１００ｍｍ、２．１×１１０ｍｍ、２．１×１２０ｍｍ、２．１×１３０ｍｍ、２．１×１４０ｍｍ、２．１×１５０ｍｍ、２．２×５０ｍｍ、２．２×６０ｍｍ、２．２×７０ｍｍ、２．２×８０ｍｍ、２．２×９０ｍｍ、２．２×１００ｍｍ、２．２×１１０ｍｍ、２．２×１２０ｍｍ、２．２×１３０ｍｍ、２．２×１４０ｍｍ、２．２×１５０ｍｍ、２．３×５０ｍｍ、２．３×６０ｍｍ、２．３×７０ｍｍ、２．３×８０ｍｍ、２．３×９０ｍｍ、２．３×１００ｍｍ、２．３×１１０ｍｍ、２．３×１２０ｍｍ、２．３×１３０ｍｍ、２．３×１４０ｍｍ、２．３×１５０ｍｍ、２．４×５０ｍｍ、２．４×６０ｍｍ、２．４×７０ｍｍ、２．４×８０ｍｍ、２．４×９０ｍｍ、２．４×１００ｍｍ、２．４×１１０ｍｍ、２．４×１２０ｍｍ、２．４×１３０ｍｍ、２．４×１４０ｍｍ、２．４×１５０ｍｍ、２．５×５０ｍｍ、２．５×６０、２．５×７０ｍｍ、２．５×８０ｍｍ、２．５×９０ｍｍ、２．５×１００ｍｍ、２．５×１１０ｍｍ、２．５×１２０ｍｍ、２．５×１３０ｍｍ、２．５×１４０ｍｍ、２．５×１５０ｍｍ、２．６×５０ｍｍ、２．６×６０ｍｍ、２．６×７０ｍｍ、２．６×８０ｍｍ、２．６×９０ｍｍ、２．６×１００ｍｍ、２．６×１１０ｍｍ、２．６×１２０ｍｍ、２．６×１３０ｍｍ、２．６×１４０ｍｍ、または２．６×１５０ｍｍである。一部の態様では、逆相液体クロマトグラフィーの固定相は、約１５０ｍｍの長さであり、約２．１ｍｍの内径を有するクロマトグラフィーカラム内に含まれる。
【0110】
一部の態様では、逆相液体クロマトグラフィーの固定相は、約１．２μｍ～２．５μｍの間のサイズの粒子を含む。一部の態様では、逆相液体クロマトグラフィーの固定相は、約１．７μｍ、１．８μｍ、または２．１μｍのサイズの粒子を含む。一部の態様では、粒子サイズは、約１．２μｍ、１．３μｍ、１．４μｍ、１．５μｍ、１．６μｍ、１．７μｍ、１．８μｍ、１．９μｍ、２．０μｍ、２．１μｍ、２．２μｍ、２．３μｍ、２．４μｍ、または２．５μｍである。一部の態様では、逆相液体クロマトグラフィーの固定相は、約１．７μｍの粒子から構成される。
【0111】
一部の態様では、クロマトグラフィーは、水中にフッ素置換酢酸を含む第一の移動相を使用する。フッ素置換酢酸としては、モノフルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、およびトリフルオロ酢酸が挙げられる。一部の態様では、クロマトグラフィーは、水中にトリフルオロ酢酸を含む第一の移動相を使用する。
【0112】
一部の態様では、クロマトグラフィーは、ギ酸を含む第一の移動相を使用する。
【0113】
一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．０５から約０．１５％のギ酸を含む。一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％、または０．２％のギ酸を含む。一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．０５％または０．１％のギ酸を含む。一部の態様では、第一の移動相は、体積で約０．１％のギ酸を含む。
【0114】
一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にフッ素置換酢酸を含む第二の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にトリフルオロ酢酸を含む第二の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリルと水との混合物中にフッ素置換酢酸を含む第二の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリルと水との混合物中にトリフルオロ酢酸を含む第二の移動相を使用する。
【0115】
一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリル中にギ酸を含む第二の移動相を使用する。一部の態様では、クロマトグラフィーは、アセトニトリルと水との混合物中にギ酸を含む第二の移動相を使用する。
【0116】
一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．０５～０．２％のギ酸を含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．０５～０．１５％のギ酸を含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％、または０．２％のギ酸を含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．０５％または０．１％のギ酸を含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約０．１％のギ酸を含む。
【0117】
一部の態様では、第二の移動相は、体積で約７５～９５％のアセトニトリルを含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％のアセトニトリルを含む。一部の態様では、第二の移動相は、体積で約９０％のアセトニトリルと約１０％の水とを含む。
【0118】
一部の態様では、クロマトグラフィーにおいて、第一の移動相と第二の移動相との組合せにおける第二の移動相のパーセンテージは、経時的に増加する。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、体積で約２％から約５０％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、体積で約５０％から約１００％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約１１０～１３０分間で約２％から約５０％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約１２０分間で約２％から約５０％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約２０～３０分間で体積で約５０％から約１００％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約２５分間で体積で約５０％から約１００％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、その後、約５分間にわたって体積で１００％に増加される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、その後、体積で１００％で約３分間維持される。一部の態様では、第二の移動相は、その後、約２分間にわたって体積で約２％に低減される。
【0119】
一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、体積で約１００％で約０．５～１．５分間維持される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、体積で約１００％で約１分間維持される。
【0120】
一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約１～１０分間で約１００％から約２％に低減される。一部の態様では、第二の移動相のパーセンテージは、約４分間で約１００％から約２％に低減される。
【0121】
一部の態様では、液体クロマトグラフィーは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。一部の態様では、液体クロマトグラフィーは超高圧液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）である。
【0122】
一部の態様では、質量分析は、任意のイオン化モード、具体的には生体分子の分析に適したモードを用いてもよく、そのようなものとしては、以下に限定されないが、直接注入質量分析、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）－ＭＳ、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）－ＭＳ、リアルタイムでの直接分析（ＤＡＲＴ）－ＭＳ、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）－ＭＳ、電子衝撃（Ｅｌ）または化学イオン化（ＣＩ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）－ＭＳ、および大気圧イオン化－エレクトロスプレー（ＡＰＩ－ＥＳ）が挙げられる。一部の態様では、質量分析は、ＡＰＩ－ＥＳイオン化モードを用いる。
【0123】
一部の態様では、質量分析は、４０～５０００ｍ／ｚの範囲にわたってシグナルをスキャンする。一部の態様では、質量分析は、５０～３０００ｍ／ｚの範囲にわたってシグナルをスキャンする。一部の態様では、質量分析は、３００～３０００ｍ／ｚの範囲にわたってシグナルをスキャンする。
【0124】
一部の態様では、質量分析のスキャンタイプは、正極性である。一部の態様では、質量分析のデータ取得時間は、約１～１３０分である。一部の態様では、質量分析のデータ取得時間は、約２～１２０分である。
【0125】
一部の態様では、質量分析のノズル電圧は約４００～６００Ｖである。一部の態様では、質量分析のノズル電圧は約５００Ｖである。一部の態様では、質量分析のスキマー電圧は約６０～７０Ｖである。一部の態様では、質量分析のスキマー電圧は約６５Ｖである。一部の態様では、ノズル電圧とスキマー電圧との差は約４００～４５０Ｖである。一部の態様では、ノズル電圧とスキマー電圧との差は約４３５Ｖである。
【0126】
一部の態様では、質量分析の乾燥ガス温度は約２００～３７５℃である。一部の態様では、質量分析の乾燥ガス温度は約３２５℃である。一部の態様では、質量分析の乾燥ガス流量は約５～１３Ｌ／分である。一部の態様では、質量分析の乾燥ガス流量は約１２Ｌ／分である。
【0127】
一部の態様では、質量分析は、約３～６ｋＶのキャピラリー電圧を用いる。一部の態様では、質量分析は、約３、４、５、または６ｋＶのキャピラリー電圧を用いる。一部の態様では、質量分析は、約５ｋＶのキャピラリー電圧を用いる。
【0128】
一部の態様では、質量分析は、約１２５～３５０Ｖのフラグメンター電圧を用いる。一部の態様では、質量分析は、約１２５Ｖ、１３０Ｖ、１３５Ｖ、１４５Ｖ、１５５Ｖ、１６０Ｖ、１６５Ｖ、１７５Ｖ、１８５Ｖ、１９０Ｖ、１９５Ｖ、２００Ｖ、２０５Ｖ、２１０Ｖ、２１５Ｖ、２２０Ｖ、２２５Ｖ、２３０Ｖ、２３５Ｖ、２４０Ｖ、２４５Ｖ、２５０Ｖ、２５５Ｖ、２６０Ｖ、２６５Ｖ、２７０Ｖ、２７５Ｖ、２８０Ｖ、２８５Ｖ、２９０Ｖ、２９５Ｖ、３００Ｖ、３０５Ｖ、３１０Ｖ、３１５Ｖ、３２０Ｖ、３２５Ｖ、３３０Ｖ、３３５Ｖ、３４０Ｖ、３４５Ｖ、または３５０Ｖのフラグメンター電圧を用いる。一部の態様では、質量分析は、約１３５Ｖのフラグメンター電圧を用いる。
【0129】
主題はその特定の態様を参照してかなり詳細に説明されてきたが、他の態様は可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲は、その中に含まれる特定の態様の説明に限定されるべきではない。
【実施例0130】
これより本開示を実施例と共に説明するが、本開示の作業を説明することを意図しており、本開示の範囲に関するいかなる制約も制限することを意図するものではない。別段の定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、本開示の方法および組成物の実践において使用することができるが、例示的な方法、デバイス、および材料を本明細書に記載する。
【0131】
実施例１：方法および機器全般
【0132】
１．１ 試薬
【0133】
ＬＣＭＳ水、アセトニトリル、およびトリフルオロ酢酸をフィッシャーサイエンティフィック社から入手し、重炭酸アンモニウムをシグマアルドリッチ社から入手した。表１は、液体クロマトグラフィーおよび溶液の調製に用いられる試薬を示す。
【0134】
【表1-1】
【表1-2】
【0135】
１．２ 機器
【0136】
以下の装置を用いて、本明細書に開示される実施例を実施した。
ａ） ウォーターズＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８カラム、２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ；部品番号１８６００２８７８
ｂ） ピアース界面活性剤除去スピンカラム、０．５ｍＬ；カタログ番号８７７７７
ｃ） 適切な分析用天秤
ｄ） 自動ピペット
ｅ） クラスＡ容積測定ガラス製品
ｆ） ＨＰＬＣバイアルとキャップ
ｇ） スパチュラと秤量ボート
ｈ） アジレント１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣシステム
ｉ） アジレント６５４５ＸＴ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ四重極飛行時間質量分析計（Ｑ－ＴｏＦ）
ａ） ウォーターズＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８カラム、２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ；部品番号１８６００２８７８
ｂ） ピアース界面活性剤除去スピンカラム、０．５ｍＬ；カタログ番号８７７７７
ｃ） 適切な分析用天秤
ｄ） 自動ピペット
ｅ） クラスＡ容積測定ガラス製品
ｆ） ＨＰＬＣバイアルとキャップ
ｇ） スパチュラと秤量ボート
ｈ） アジレント１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣシステム
ｉ） アジレント６５４５ＸＴ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ四重極飛行時間質量分析計（Ｑ－ＴｏＦ）
【0137】
実施例２：溶液の調製
【0138】
２．１ １００ｍＭ重炭酸アンモニウム の調製
【0139】
０．３９５±０．０１グラムの重炭酸アンモニウムを、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ（登録商標）チューブに秤量した。メスシリンダーを用いて、５０ｍＬのＬＣＭＳ水をチューブに移し、ボルテックスミキサーを用いて重炭酸アンモニウムを完全に溶解して、１００ｍＭの重炭酸アンモニウム溶液を得た。溶液は、２～８℃で１カ月間安定である。
【0140】
２．２ 第一の移動相の調製（水中の０．１％トリフルオロ酢酸）
【0141】
メスシリンダーを用いて、１ＬのＬＣＭＳ水を１Ｌのボトルに移した。ピペットを用いて、１０００μＬのトリフルオロ酢酸をボトルに移した。トリフルオロ酢酸と水とを５分間よく混合し、第一の移動相を得た。第一の移動相は、周囲温度で最長１カ月間安定である。
【0142】
２．３ 第二の移動相の調製（９０％アセトニトリルおよび１０％の水中の０．１％トリフルオロ酢酸）
【0143】
９００ｍＬのアセトニトリルを１Ｌのメスシリンダーに加えた。ＬＣＭＳ水を１Ｌのメスシリンダーに加えて、１Ｌの溶液とした。溶液を１Ｌボトルに移した。ピペットを用いて、１０００μＬのトリフルオロ酢酸をボトルに移した。トリフルオロ酢酸と溶液とを５分間よく混合して、第二の移動相を得た。第二の移動相は、周囲温度で最長１カ月間安定である。
【0144】
実施例３：試料の調製
【0145】
スピンカラムの底部の封止を除去し、スピンカラムのキャップを緩めた。カラムを２ｍＬの採取チューブに配し、１５００×ｇで１分間遠心分離した。固定角ローターを用いる際には、圧縮樹脂を上向きに傾斜させてカラムの側面に目印を付けた。次いで、以後のすべてのステップで、この目印を外側に向けてカラムを遠心分離器に配した。
【0146】
４００μＬの１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液をカラムに加え、カラムを１５００×ｇで１分間遠心分離した。このステップをさらに２回繰り返し、各ステップの後、フロースルーを廃棄した。カラムを新しい２ｍＬの採取チューブに配した。５μｇの試料を圧縮樹脂床の上部にゆっくりとアプライし、室温で２分間インキュベートした。カラムを１５００×ｇで２分間遠心分離し、ポリマーを含まない試料を収集した。次いで、試料体積を、１００ｍＭの重炭酸アンモニウムにより最大１００μＬに調製した後、ＨＰＬＣバイアルに移した。
【0147】
実施例４：ＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の特性解析
【0148】
本実施例は、ＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比、ならびにＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の質量を決定する方法を説明する。ここでは、ＡＡＶ粒子を変性させ、液体クロマトグラフィーでＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質に分離した。分離されたＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質を、まずＵＶに供してＡＡＶ粒子中のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の比を決定し、次いで質量分析に供してＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質のそれぞれの質量を得た。
【0149】
４．１ ＬＣ動作条件
【0150】
ＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の分離を、ＡＣＱＵＩＴＹ
ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ １．７μｍ、２．ｌ×ｌ００ｍｍ、Ｃ８分析カラム（部品番号 １８６００２８７８）を用いたＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）システム上で実施した。使用した移動相は：
第一の移動相（Ａ）：水中の０．１％トリフルオロ酢酸；および
第二の移動相（Ｂ）：９０％のアセトニトリルおよび１０％の水中の０．１％のトリフルオロ酢酸。
ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ １．７μｍ、２．ｌ×ｌ００ｍｍ、Ｃ８分析カラム（部品番号 １８６００２８７８）を用いたＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）システム上で実施した。使用した移動相は：
第一の移動相（Ａ）：水中の０．１％トリフルオロ酢酸；および
第二の移動相（Ｂ）：９０％のアセトニトリルおよび１０％の水中の０．１％のトリフルオロ酢酸。
【0151】
カラム温度を約８０℃に維持し、移動相Ｂを０．４ｍＬ／分の流量で１０％から４０％におよび４０％から４５％に増加させて使用し、続いて１００％の移動相Ｂで１分間フラッシングし、開始移動相組成物（１０％の移動相Ｂ）でさらに５分間再平衡化することによって、分離を達成した。
【0152】
ＬＣの動作条件を表２に挙げる。
【表2-1】
【表2-2】
【0153】
４．２ 質量分析計（ＭＳ）の動作条件
【0154】
アジレント６５４５ＸＴ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ四重極飛行時間質量分析計（Ｑ－ＴｏＦ）を用いて、ｍ／ｚ値７００～１３７００ｍ／ｚの範囲のサーベイスキャンにおけるＡＰＩ－ＥＳイオン化を用いて質量分析を実施した。キャピラリー電圧、ノズル電圧、フラグメンター電圧、およびスキマー電圧は、それぞれ５ｋＶ、５００Ｖ、１７５Ｖ、および６５Ｖに設定した。乾燥ガス温度および乾燥ガス流量を、それぞれ３００℃および１３Ｌ／分に設定した。
【0155】
質量分析計の動作条件を表３に挙げる。
【表3】
【0156】
４．３ 分析と結果
【0157】
カプシドタンパク質を、まず、カラムコンパートメントを８０℃に加熱することによって変性した。次いで、三つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を、ウォーターズＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８カラム（部品番号１８６００２８７８）を用いることによってベースライン分離し、水中の０．１％トリフルオロ酢酸を含む第一の移動相と、アセトニトリルおよび水の混合物中の０．１％トリフルオロ酢酸を含む第二の移動相との組合せにより溶出し、その際に、第二の移動相のパーセンテージを経時的に増加させた。移動相におけるイオン対剤として０．１％トリフルオロ酢酸を使用することは、ベースライン分解能を補助する。
【0158】
液体クロマトグラフィーにて分離されたＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をまずＵＶに供して相対量を決定し、次いで質量分析に供してＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の質量を決定した。図１および表４に示すように、ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３の１：１：１０付近の化学量論が、ＵＶクロマトグラムのベースライン積分によって得られた。
【表4】
【0159】
次いで、三つのカプシドタンパク質のピークを、表５に挙げられたパラメータを用いてデコンボリューションした。総イオンクロマトグラムおよび三つすべてのピークのデコンボリューションされたスペクトルを、図２および図３Ａ～３Ｃに示す。ＶＰ１のピーク（理論質量８１５８７Ｄａ）下で検出された三つの主要な質量は、８１４９６Ｄａ、８１５７８Ｄａ、および８１６５８Ｄａであった。８１４９６Ｄａのピークは、Ｎ末端メチオニンの欠落および単一のアセチル化修飾を有するＶＰ１タンパク質を表す。＋８０Ｄａの質量シフトを有する他の二つのピークは、リン酸化を表す。ＶＰ２ピークのデコンボリューション（理論質量６６３８１Ｄａ）は、以下二つの主要な質量を示した：６６２８２Ｄａおよび６６３６０Ｄａ。６６２８２Ｄａのピークは、トレオニンの欠落したＶＰ２タンパク質を表し、６６３６０Ｄａのピークは、＋８０の質量シフトを有する単一のリン酸化に合致する。ＶＰ３のピーク（理論質量５９７５０Ｄａ）は、５９６６２Ｄａの単一の主要な質量を示し、これは、Ｎ末端メチオニン欠落および単一のアセチル化を有するＶＰ３タンパク質の質量に合致する。
【表5】
【0160】
【0161】
実施例５：ＬＣＭＳを用いたＡＡＶｒｈ７４の脱アミド化の特性解析
【0162】
カプシドタンパク質中の広範な脱アミド化は、質量分析によって決定することができ、この質量分析により、カプシドタンパク質中の脱アミド化の部位、およびこれらの部位での脱アミド化のレベルも決定することができる。ＡＡＶカプシドの脱アミド化を測定するために、カプシドタンパク質を変性させ、２Ｍのグアニジン塩酸塩および１０ｍＭのＤＴＴの存在下で、９０℃で１０分間還元した。試料を室温に冷却した後、３０ｍＭのヨードアセトアミドをアルキル化のために添加し、室温で３０分間、暗所でインキュベートした。次いで、１ｍＬのＤＴＴの添加によってアルキル化をクエンチした。２０ｍＭの重炭酸アンモニウムを試料に加えて、グアニジン塩酸塩を２００ｍＭに希釈した。次いで、試料を、１：２０の酵素：タンパク質比でトリプシンを用いて消化し、３７℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベーションした後、トリフルオロ酢酸に終濃度０．５％まで添加することによって消化をクエンチし、試料を、ＮａｎｏＦｌｅｘソースを用いてＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに結合されたＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム上で分析した。
【0163】
表７は、同定された主要な脱アミド化部位と、これらの部位での脱アミド化のレベル（すなわち、脱アミド化のパーセンテージ）を示す。表７のＡＡＶ８のデータは、従前の刊行物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２６ Ｎｏ １２，Ｐａｇｅｓ ２８４８－２９６２（２０１８））から開示されている。
【表7-1】
【表7-2】
【0164】
二つの緩衝液（重炭酸アンモニウムおよびＴｒｉｓ－ＨＣｌ）を別々に用いて、ＡＡＶ．ｒｈ７４の脱アミド化状態を測定した。
【0165】
重炭酸アンモニウムについては、１００ｍＭの重炭酸アンモニウムへの緩衝液交換を行うことによって、試料を変性させた。変性した試料を、１０ｍＭのＤＴＴの添加によって還元し、３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、試料中、ヨードアセトアミドを終濃度３０ｍＭまで添加することによって、アルキル化を実施した。次いで、変性、還元、およびアルキル化された試料を、１０ｋＤａのアミコンウルトラフィルターを用いて１００ｍＭの重炭酸アンモニウムに戻し交換した。次いで、トリプシンを用いて試料を消化し、３７℃で一晩インキュベートした。重炭酸アンモニウム中で消化を行ったこの試料調製物を用いて、表７にみられるようにＡＡＶｒｈ７４に対し同様のレベルの脱アミド化を得た。
【0166】
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌについては、６０μｇの試料のアリコートを、アミコン１０Ｋ遠心フィルターを用いて４Ｍグアニジンおよび２００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５に緩衝液交換して、試料マトリックスを除去し、タンパク質を濃縮した。グアニジン濃度を６Ｍに調整し、ＤＴＴ（１０ｍＭ）を６０μｇのアリコートに加えた。反応混合物を、５６℃で４５分間インキュベートし、次いで室温に冷却した。ヨードアセトアミド（３０ｍＭ）を加え、室温で６０分間、暗所でインキュベートした。次いで、Ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．５）を加えて、グアニジンＨＣｌ濃度を０．６Ｍに希釈した。トリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ（６０μｇ）を、６０μｇの還元およびアルキル化した試料（酵素：タンパク質比約１：１（ｗ：ｗ））に加えた。消化の際にメチオニンを１０ｍＭまで加えて、人為的な酸化を最小限にした。消化を３７℃で一晩（１７時間）行った。次に、ＴＦＡ（１％）を添加してからＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【0167】
表７に示すように、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを緩衝液とすると、脱アミド化状態は、重炭酸アンモニウムを用いたものに比較して有意に低かった。
【0168】
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを用いた方法をさらに最適化するために、図４のフローチャートに従って、８つの別々のＡＡＶカプシド試料を測定した。試料をまず、６Ｍのグアニジン塩酸塩、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５への緩衝液交換を行うことによって変性させた。次いで、ＤＴＴを終濃度１０ｍＭまで添加することによって試料を還元し、３７℃で４５分間インキュベートした。ヨードアセトアミドを終濃度３０ｍＭまで加えることによってアルキル化を行い、室温で１時間、暗所でインキュベートした。１０ｋＤａのアミコンウルトラフィルターを用いて、試料を２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５に再び緩衝液交換した。次いで、アセトニトリルを終濃度１０％まで試料に加え、メチオニンも終濃度１０ｍＭまで加えた。トリプシンを用いて、試料を３７℃で一晩消化した。次いで、ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて、ペプチドをアジレント１２９０ Ｕ－ＨＰＬＣ上で分離する。次に、アジレント６５４５ＸＴ ＱＴｏＦを用いて、分離されたペプチドを検出し、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒおよびＢｉｏｃｏｎｆｉｒｍソフトウェアを用いて脱アミド化分析を実施する。脱アミド化の状態を図５に示し、酸化の状態を図６に示す。存在する５２個のアスパラギン残基のうち、４８残基に脱アミド化は観察されなかった（ＶＰ１の総アスパラギン残基：５６）。存在する３９個のグルタミン残基のうち、３９残基すべてに脱アミド化は観察されなかった（ＶＰ１の総グルタミン残基：４８）。Ｏ１８標識水を用いて、Ｎ５７での少数の脱アミド化は、試料調製に関連するアーチファクトであることが示された。残りの５つのメチオニン残基には、酸化は検出されなかった（ＶＰ１の総メチオニン残基：１１）。検出された１４個のトリプトファン残基のうち、１４残基すべてに酸化は観察されなかった（ＶＰ１の総トリプトファン残基：１５）。
【0169】
重炭酸アンモニウムの消化は、経時的にｐＨが増加するため、脱アミド化アーチファクトを著しく増加させる可能性がある。したがって、観察されたより高いレベルの脱アミド化は、試料調製中に生成される脱アミド化アーチファクトであった可能性がある。脱アミド化レベルを確認するために、Ｔｒｉｓ ＨＣｌベースの消化をＳａｒｅｐｔａでセットアップした。２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５を緩衝液として用いた。脱アミド化アーチファクトを低減することが知られていることから、１０％のアセトニトリルを消化溶液に加えた。また、酸化アーチファクトを低減するために、１０ｍＭのメチオニンを消化溶液に添加した。
【0170】
したがって、本開示の方法は、脱アミド化、酸化、または他の翻訳後修飾をＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液により測定する際により正確である。
【0171】
実施例６：ＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳを用いた宿主細胞タンパク質の特性解析
【0172】
ｒＡＡＶベースの遺伝子治療医薬品の純度を、ＡＡＶ組成物に残存する宿主細胞タンパク質をＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳにより特性解析することによって分析した。
【0173】
６．１ 試料の調製
【0174】
ＡＡＶｒｈ７４試料に、既知量のインビトロジェンのヒトチオレドキシン１（ＨＴＩ）タンパク質標品（カタログ番号ＬＦ－Ｐ０００１）およびシグマのウシ炭酸脱水酵素ＩＩ（ＢＣＡＩＩ）タンパク質標品（カタログ番号Ｃ７７４９）を添加した。ヒトチオレドキシン１（ＨＴＩ）およびウシ炭酸脱水酵素ＩＩ（ＢＣＡＩＩ）は、見出されたヒトＨＣＰおよびウシＨＣＰをそれぞれ定量するためのスパイキングタンパク質標品として選択した。免疫枯渇プロセスのため、１００μＬの０．０５ｍｇ／ｍＬの抗アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３抗体および１００μＬの試料溶液を、２０μＬの０．０５ｍｇ／ｍＬのＢＣＡＩＩおよび１０μＬの０．１ｍｇ／ｍＬのＨＴＩと共に、ピアースＭＳ適合磁気ＩＰキットの２７０μＬのＩＰ－ＭＳ細胞溶解緩衝液に、ピペットにより注入する。次いで、アメリカンリサーチプロダクツ社から得た抗アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３（カタログ番号０３－６１０５）およびピアースＭＳ適合磁気ＩＰキット（カタログ番号９０４０９）を用いて、ＡＡＶカプシドタンパク質を試料から免疫沈降した。次いで、試料をピアース界面活性剤除去スピンカラム（カタログ番号８７７７７）に通した。
【0175】
次いで、試料をプロメガ急速消化緩衝液（カタログ番号ＶＡ１０６０）に緩衝液交換した。試料を還元し、アルキル化し、７０℃で６０～１８０分間、急速消化トリプシンにより消化した。
【0176】
６．２ ＬＣの動作条件
【0177】
消化された残留宿主細胞タンパク質の分離を、ウォーターズＡｃｑｕｉｔｙペプチドＢＥＨ Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍカラムを用いて、アジレント１２９０ ＨＰＬＣシステム上で行った。用いる移動相は以下の通りである：
【0178】
第一の移動相（Ａ）：水中の０．１％のギ酸；および
【0179】
第二の移動相（Ｂ）：９０％のアセトニトリルおよび１０％の水中の０．１％のギ酸。
【0180】
カラム温度を約４５℃に維持し、移動相Ｂを流速０．３ｍＬ／分で２％から５０％におよび５０％から１００％に増加させて使用し、続いて１００％の移動相Ｂで３分間フラッシングし、開始移動相組成物（２％の移動相Ｂ）でさらに５分間再平衡化させることによって、分離を達成した。
【0181】
ＬＣの動作条件を表８に挙げる。
６．３ 質量分析計（ＭＳ）の動作条件
【表8】
【0182】
アジレント６５４５ＸＴ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ四重極飛行時間質量分析計（Ｑ－ＴｏＦ）を用いて、ｍ／ｚ値５０～３０００ｍ／ｚの範囲のサーベイスキャンにおけるＡＰＩ－ＥＳイオン化を使用して質量分析を実施した。キャピラリー電圧、ノズル電圧、フラグメンター電圧、およびスキマー電圧は、それぞれ４ｋＶ、５００Ｖ、１３５Ｖ、および６５Ｖに設定した。乾燥ガス温度および乾燥ガス流量を、それぞれ３２５℃および１２Ｌ／分に設定した。
【0183】
質量分析計の動作条件を表９に挙げる。
【表9-1】
【表9-2】
【0184】
６．４ 分析および結果
【0185】
実施例６．３で生成されたデータを、プロテインメトリックスから得られたＢｙｏｓソフトウェアによって処理して、あるＵｎｉｐｒｏｔタンパク質データベースに対して検索した。各残留タンパク質の同一性および相対量を、スパイクされたタンパク質標品の量の量に対して計算した。ＨＣＰ分析では、３ロットのＡＡＶウイルス粒子について、ＭＳによって同定された宿主細胞タンパク質がごくわずか（ウシタンパク質は二つだがヒトタンパク質はなし）であったことが標示された（表１０）。タンパク質の濃度は、ｎｇ／ｍＬのオーダー、またはスパイクされたタンパク質標品に基づくｐｐｍレベルである。
【表10】
【0186】
以下の参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
１．Ｂｕｌｌｅｒ ＲＭ，Ｒｏｓｅ ＪＡ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ＫＢ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２５：１９７８，Ｐａｇｅｓ ３３１－３３８．
２．Ｊｏｈｎｓｏｎ ＦＢ，Ｏｚｅｒ ＨＬ，Ｈｏｇｇａｎ ＭＤ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８：１９７１，Ｐａｇｅｓ ７７６－７７０．
３．Ｄ．Ｗ．Ｂａｕｅｒ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ａｎｄ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｇｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１５，９２８８－９８．
４．Ｖａｍｓｅｅｄｈａｒ Ｒａｙａｐｒｏｌｕ．ｅｔ．ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１３，１３１５０－６０．
５．Ｘｉａｏｙｉｎｇ Ｊｉｎ ｅｔ．ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３８ Ｎｕｍｂｅｒ ５ ２０１７，２５５－２６７．
１．Ｂｕｌｌｅｒ ＲＭ，Ｒｏｓｅ ＪＡ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ＫＢ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２５：１９７８，Ｐａｇｅｓ ３３１－３３８．
２．Ｊｏｈｎｓｏｎ ＦＢ，Ｏｚｅｒ ＨＬ，Ｈｏｇｇａｎ ＭＤ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８：１９７１，Ｐａｇｅｓ ７７６－７７０．
３．Ｄ．Ｗ．Ｂａｕｅｒ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ａｎｄ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｇｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１５，９２８８－９８．
４．Ｖａｍｓｅｅｄｈａｒ Ｒａｙａｐｒｏｌｕ．ｅｔ．ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０１３，１３１５０－６０．
５．Ｘｉａｏｙｉｎｇ Ｊｉｎ ｅｔ．ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３８ Ｎｕｍｂｅｒ ５ ２０１７，２５５－２６７．
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【外国語明細書】