特開 2025-16389 ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節システム及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025016389

(43)【公開日】2025-01-31

(54)【発明の名称】ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節システム及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20250124BHJP

   C12N 15/70 20060101ALI20250124BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250124BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20250124BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/70 Z ZNA

C12N1/21

C12N15/70 Z

C12N15/31

【審査請求】有

【請求項の数】23

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024116299

(22)【出願日】2024-07-19

(31)【優先権主張番号】10-2023-0095429

(32)【優先日】2023-07-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(71)【出願人】

【識別番号】514266091

【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティチュート オブ ケミカル テクノロジー

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】イ、ジュ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ミ リ

(72)【発明者】

【氏名】ノ、ミョン ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】ムン、ス ヨン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA60

(57)【要約】

【課題】本発明は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミドを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミド、前記プラスミドで形質転換された組換え菌株、その製造方法、標的遺伝子調節システム、及び標的遺伝子発現調節方法に関し、本発明によるプラスミド、組換え菌株及び発現調節システムは、標的遺伝子の発現を同時・多重調節するシステムを構築することにより、高付加価値物質の生産を向上させることができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミド。

【請求項2】

前記ＣＲＰ誘導体は、ＣＲＰ_ＡＲ１、ＣＲＰ_ＡＲ３、ＣＲＰ_ＡＲ２３又はＣＲＰ_{ＡＲ１２３}である、請求項１に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。

【請求項3】

前記ＣＲＰ誘導体はＣＲＰ_{ＡＲ１２３}である、請求項２に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。

【請求項4】

前記ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}は、配列番号５からなる野生型ＣＲＰ_ＷＴからＣ末端のＤＮＡ結合モチーフが除去され、ＡＲ１、ＡＲ２及びＡＲ３ドメインを含み、１番目～１８０番目のアミノ酸で構成されるものである、請求項３に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。

【請求項5】

前記ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}誘導体は、配列番号６の配列を含む、請求項３に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。

【請求項6】

前記ｄｘＣａｓ９は、配列番号１の配列を含む、請求項１に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。

【請求項7】

前記発現調節は、標的遺伝子の発現強化又は発現抑制を行うものである、請求項１に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。

【請求項8】

前記ｄｘＣａｓ９は、配列番号２のアミノ酸配列を含むリンカーが結合されたものである、請求項１に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。

【請求項9】

前記プラスミドは、標的遺伝子配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。

【請求項10】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号２３～２５の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項９に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載のプラスミドで形質転換された組換え菌株。

【請求項12】

前記菌株は、遺伝子発現を調節することを特徴とする、請求項１１に記載の組換え菌株。

【請求項13】

前記菌株は、単一又は多重標的遺伝子発現を強化又は抑制するものである、請求項１１に記載の組換え菌株。

【請求項14】

前記菌株はエシェリキア属（Escherichia genus）である、請求項１１に記載の組換え菌株。

【請求項15】

前記菌株はエシェリキア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１１に記載の組換え菌株。

【請求項16】

ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用システム。

【請求項17】

ｉ）ｄｘＣａｓ９タンパク質とＣＲＰタンパク質を結合したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムを作製するステップと、
ｉｉ）前述したように作製したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムに蛍光レポータープラスミドをクローニングするステップと、
ｉｉｉ）前記ｉｉ）ステップで作製したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムにガイドＲＮＡをさらにクローニングするステップと、
ｉｖ）前記ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ－ｇＲＮＡを菌株に形質転換するステップとを含む、標的遺伝子発現を調節する組換え菌株の製造方法。

【請求項18】

前記ガイドＲＮＡは標的遺伝子を含む、請求項１７に記載の組換え菌株の製造方法。

【請求項19】

前記ｄｘＣａｓ９は、配列番号２のアミノ酸配列を含むリンカーが結合されたものである、請求項１７に記載の組換え菌株の製造方法。

【請求項20】

前記菌株はエシェリキア属（Escherichia genus）である、請求項１７に記載の組換え菌株の製造方法。

【請求項21】

前記菌株はエシェリキア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１７に記載の組換え菌株の製造方法。

【請求項22】

前記蛍光レポーターは、ルシフェラーゼ（Luciferase）、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein: GFP）、増強緑色蛍光タンパク質（enhanced Green Fluorescent Protein: eGFP）、ｍプラム（mPlum）、ｍチェリー（mCherry）、ｔｄトマト（tdTomato）、ｍストロベリー（mStrawberry）、Ｊ－レッド（J-Red）、Ｄｓレッド（DsRed）、ｍオレンジ（mOrange）、ｍＫＯ、ｍシトリン（mCitrine）、ビーナス（Venus）、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（enhanced yellow fluorescent protein: EYFP）、エメラルド（Emerald）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（cyan fluorescent protein: CFP）、セルリアン（Cerulean）、Ｔ－サファイア（T-Sapphire）、アルカリホスファターゼからなる群から選択されるものである、請求項１７に記載の組換え菌株の製造方法。

【請求項23】

ｄｘＣａｓ９にＣＲＰ誘導体を適用するステップを含むことを特徴とする標的遺伝子発現調節方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミド、前記プラスミドで形質転換された組換え菌株、その製造方法、標的遺伝子調節システム、及び標的遺伝子発現調節方法に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、バイオ産業においては、高付加価値産物を生産するために、産業微生物を代謝工学的に操作し、野生型が生産できない産物を効率的に生産する技術が広く用いられている。それらの技術の核心は、ターゲット物質を効率的かつ経済的に生産することにある。それに用いられる代謝工学的方法としては、プラスミド又はゲノム上に異型遺伝子を挿入する技術や、特定遺伝子の突然変異を起こす技術が挙げられる。特に、近年、ＣＲＩＳＰＲを用いて、標的遺伝子の挿入や突然変異を迅速に行う技術が脚光を浴びている。

【0003】

ＣＲＩＳＰＲ技術は、大腸菌の内在遺伝子又は外部遺伝子を同時、多重に標的とする可能性を有するので、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子発現調節システムの開発は、大腸菌による高付加価値物質の生産を向上させることのできる合成生物学ツールとしての潜在力が大きい。しかし、現在まで、真核生物においてＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子発現調節ツールが開発された事例はあるが、大腸菌において遺伝子発現活性／抑制を同時に行う調節システムについては相対的に報告が少ない現状である。

【0004】

こうした背景の下、本発明者らは、大腸菌において同時に多重遺伝子を標的とし、転写活性／抑制の機能を備えた新たなＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子発現調節システムを開発し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444

【非特許文献2】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277

【非特許文献3】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453

【非特許文献4】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)

【非特許文献5】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)

【非特許文献6】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994

【非特許文献7】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073

【非特許文献8】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482

【非特許文献9】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)

【非特許文献10】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745

【非特許文献11】Cheng dong et al., 2018, Nature Communications, 9:2489

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミドを提供することを目的とする。

【0007】

また、本発明は、前記プラスミドで形質転換された組換え菌株を提供することを目的とする。

【0008】

さらに、本発明は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用システムを提供することを目的とする。

【0009】

さらに、本発明は、ｉ）ｄｘＣａｓ９タンパク質とＣＲＰタンパク質を結合したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムを作製するステップと、ｉｉ）前述したように作製したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムに蛍光レポータープラスミドをクローニングするステップと、ｉｉｉ）前記ｉｉ）ステップで作製したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムにガイドＲＮＡをさらにクローニングするステップと、ｉｖ）前記ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ－ｇＲＮＡを菌株に形質転換するステップとを含む、標的遺伝子発現を調節する組換え菌株の製造方法を提供することを目的とする。

【0010】

さらに、本発明は、ｄｘＣａｓ９にＣＲＰ誘導体を適用するステップを含むことを特徴とする標的遺伝子発現調節方法を提供することを目的とする。

【0011】

さらに、本発明は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含むプラスミドの標的遺伝子発現調節用途を提供することを目的とする。

【0012】

さらに、本発明は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含むシステムの標的遺伝子発現調節用途を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

以下、これらを具体的に説明する。なお、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。

【0014】

また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本発明に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本発明に含まれることが意図されている。

【0015】

本発明の一態様は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミドを提供する。

【発明の効果】

【0016】

本発明によるプラスミド、組換え菌株及び発現調節システムは、標的遺伝子の発現を同時・多重調節するシステムを構築することにより、高付加価値物質の生産を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子発現調節システムのプラスミド、及びシステム性能検証のためのＧＦＰ蛍光発現プラスミドの設計図である。

【図2】ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子発現調節システムの標的遺伝子発現強化／抑制調節過程を示す模式図である。

【図3】ｐＭＷ７－Ｐ_{Ｊ２３１１７}－ＧＦＰのプラスミドのマップを示す図である。

【図4】ｐＭＷ７－Ｐ_{Ｊ２３１１９}－ＧＦＰのプラスミドのマップを示す図である。

【図5】ｐＭＷ７－Ｐ_{Ｊ２３１１７}－ＧＦＰ－Ｐ_{Ｊ２３１１９}－ｍＣｈｅｒｒｙのプラスミドのマップを示す図である。

【図6】蛍光プラスミド（標的遺伝子）上のｇＲＮＡ標的位置を示す図である。

【図7】ｇＲＮＡ発現のためのクローニング設計図である。

【図8】ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}－ｇＲＮＡ（Ａ）のプラスミドのマップを示す図である。

【図9】ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}－ｇＲＮＡ（Ｒ１）のプラスミドのマップを示す図である。

【図10】ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}－ｇＲＮＡ（Ａ／Ｒ２）のプラスミドのマップを示す図である。

【図11】ｄｘＣａｓ９－結合ＣＲＰ誘導体の標的遺伝子転写活性効率を比較したグラフである。

【図12】ｄｘＣａｓ９－結合ＣＲＰ誘導体の標的遺伝子転写抑制効率を比較したグラフである。

【図13】ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}のＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子同時発現強化／抑制調節の模式図、及びｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}システムの多重標的可能性検証結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明における「ｄＣａｓ９（dead Cas9）」とは、配列特異的認識／結合は可能であるが、核酸分解活性が不活性化されているので、標的とするＤＮＡを切断することなく、遺伝子発現を調節することのできるタンパク質を意味する。前記ｄＣａｓ９は、標的とする遺伝子配列中のＮＧＧ配列で構成されるＰＡＭ配列を認識／結合することにより、ターゲット遺伝子発現を調節することができる。

【0019】

本発明における「ｄｘＣａｓ９」とは、ｄＣａｓ９がターゲット遺伝子配列上の標的位置を選定するには標的部位の末端にＮＧＧ配列が存在しなければならないという限界を有するので、突然変異を起こさせて広い範囲のＰＡＭ配列（ＮＧ，ＮＮＧ，ＧＡＡ，ＧＡＴ，ＣＡＡ）における特異的認識効率を高くした進化型変異Ｃａｓ９であって、ＰＡＭ互換性を向上させたタンパク質を意味する。

【0020】

本発明において、ｄｘＣａｓ９は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むが、これに限定されるものではない。

【0021】

本発明において、前記ｄｘＣａｓ９は、配列番号２のアミノ酸配列を含むリンカー（linker）が結合されたものであるが、これに限定されるものではない。

【0022】

本発明において、前記ｄｘＣａｓ９とＣＲＰ又はＣＲＰ誘導体は、リンカーにより互いに連結されたものであってもよい。

【0023】

前記リンカーをコードする塩基配列は、十分な長さでなければならない。具体的には、本発明のリンカーをコードする塩基配列は、２０ｂｐ以上の長さ、例えば３０又は４０ｂｐ以上の長さを有するものである。また、前記リンカーをコードする塩基配列は、線形ベクターと少なくとも約８０％の相同性を有し、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するものであってもよい。

【0024】

本発明において、前記リンカーは、結合タンパク質が構造的柔軟性を有するように、小さく単純な構造のグリシンとアラニンのアミノ酸で構成されるＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むが、これに限定されるものではない。

【0025】

本発明における「ＣＲＰ（cAMP Receptor Protein）」とは、ｃＡＭＰ受容体タンパク質であって、バクテリアにおいて約１００個以上の遺伝子転写を促進又は抑制する転写調節タンパク質を意味する。ＣＲＰのＤＮＡ結合は、ＲＮＡポリメラーゼをもたらしてターゲット遺伝子の転写活性を促進する。ＣＲＰは、構造的にＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのα－ｓｕｂｕｎｉｔに結合して遺伝子転写を活性化するＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３（Activating region）で構成されている。ＣＲＰは、カタボライト遺伝子活性化タンパク質（catabolite gene activator protein, CAP）ともいう。本発明において、ＣＲＰは、ｄｘＣａｓ９のエフェクトドメインとして用いられるが、これに限定されるものではない。

【0026】

本発明における「誘導体」とは、野生型タンパク質において特定ドメインの除去、付加及び／又は置換により新たな組み合わせに派生した類似タンパク質を意味する。特に、前記アミノ酸又は化学残基の除去、付加及び／又は置換により生体内安定性、保存性又は活性が向上したものであってもよく、他成分との結合部位を含むなどの別途の機能の追加により標的タンパク質としての有利な特性が向上したもの又は新たに追加されたものであってもよい。本発明において、「ＣＲＰ誘導体」は、ＣＲＰ野生型において特定アミノ酸配列が除去されたか、欠失したものであり、具体的には、Ｃ末端のＤＮＡ結合モチーフが除去されたか、ＡＲ１、ＡＲ２及び／又はＡＲ３を含むものであるが、これらに限定されるものではない。

【0027】

本発明において、ＣＲＰ誘導体は、ＣＲＰ_ＡＲ１、ＣＲＰ_ＡＲ３、ＣＲＰ_ＡＲ２３又はＣＲＰ_{ＡＲ１２３}であり、より具体的にはＣＲＰ_{ＡＲ１２３}であるが、これらに限定されるものではない。前記ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}は、配列番号５の配列からなる野生型ＣＲＰｗｔからＣ末端のＤＮＡ結合モチーフが除去され、ＡＲ１、ＡＲ２及びＡＲ３ドメインを含み、１番目～１８０番目のアミノ酸で構成されるものであり、具体的には配列番号６の配列を含むものであるが、これらに限定されるものではない。

【0028】

本発明における「標的遺伝子」とは、タンパク質融合体の導入により発現レベルを調節しようとする標的の遺伝子を意味する。本発明において、標的遺伝子は、単一遺伝子又は多重遺伝子であり、具体的にはｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ又は－ＣＲＰ誘導体で構成される遺伝子であるが、これらに限定されるものではない。本発明の「標的遺伝子」は、「ターゲット遺伝子」と混用される。

【0029】

本発明における「標的遺伝子発現調節」とは、標的遺伝子の発現レベルを強化又は増加させるか、発現レベルを抑制又は減少させるものを意味することもあり、同時に標的遺伝子の発現強化及び抑制を行う二重機能が可能な調節システムを意味することもある。本発明において、発現調節は、発現制御と混用される。

【0030】

本発明の一実施例によれば、単一標的遺伝子発現強化効果を確認したところ、ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}誘導体発現菌株において、対照菌株に比べて、ＧＦＰ発現量が約４倍以上に増加し（図１１）、発現抑制効果実験においては、対照菌株に比べて、ＧＦＰ発現量が約８４％以上減少することが確認された（図１２）。

【0031】

それだけでなく、多重遺伝子発現強化及び抑制効果を確認したところ、ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}は、ＧＦＰ発現量が対照菌株の約１３倍以上に増加し、ｍＣｈｅｒｒｙ発現量が約９３％以上減少することが確認された（図１３）。

【0032】

本発明における「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」とは、ターゲット領域のＤＮＡ塩基配列を含むことにより標的遺伝子に特異的に結合し、ｄｘＣａｓ９を当該標的地点に誘導する機能のＲＮＡを意味する。

【0033】

通常、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、すなわちｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（trans-activating crRNA）を構成要素として含む二重ＲＮＡ（dual RNA）であるか、又は標的ＤＮＡ内の配列と全部もしくは一部が相補的な配列を含む第１部位と、ＲＮＡガイドヌクレアーゼと相互作用する配列を含む第２部位とを含む形態である。一例として、前記ガイドＲＮＡをＣｐｆ１に適用する場合、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡであってもよい。他の例として、Ｃａｓ９に適用する場合は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを構成要素として含む二重ＲＮＡの形態であってもよく、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分が融合された形態である一本鎖ガイドＲＮＡ（single-chain guide RNA; sgRNA）の形態であってもよい。

【0034】

本発明において、ｇＲＮＡは、配列番号２３～２５の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つのｇＲＮＡであるが、これに限定されるものではない。

【0035】

本発明において、特定配列を有する（having）という表現には、特定配列で表される配列を含むことや、前記配列から実質的に構成される（consisting essentially of）ことや、前記配列からなる（consisting of）ことが含まれる。なお、本発明において、ガイド領域の配列を配列番号２３～２５の塩基配列からなる群から選択される１つと表したが、標的ＤＮＡ配列と相補的に結合する能力を有するものであれば、前記ガイド領域の一部に改変、例えば付加、欠失、置換などが行われた配列も本発明におけるガイド配列に含まれる。

【0036】

本発明における「プラスミド」とは、細菌の細胞質内に存在し、複製可能な遺伝子、染色体外遺伝子の総称を意味する。本発明のプラスミドは、標的遺伝子配列を含む１つ以上のｇＲＮＡを含むものであり、具体的には配列番号２３～２５の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つのｇＲＮＡを発現させるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0037】

本発明にＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、遺伝子又はタンパク質が特定配列番号の塩基配列又はアミノ酸配列を有すると記載されていても、当該配列番号の塩基配列又はアミノ酸配列からなるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、遺伝子又はタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加された配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、遺伝子又はタンパク質であっても本発明に用いられることは言うまでもない。

【0038】

また、特定配列番号で表される塩基配列又はアミノ酸配列のＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、遺伝子又はタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、特定配列番号で表される塩基配列又はアミノ酸配列と８０％以上の相同性（homology）又は同一性（identity）を有する配列も本発明に含まれるが、これに限定されるものではない。具体的には、特定配列番号の塩基配列又はアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性又は同一性を有するものや、相当する効能又は活性を示し、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加された配列も本発明に含まれることは言うまでもない。

【0039】

本発明における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が互いに関連する程度を意味し、百分率で表される。

【0040】

相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。

【0041】

保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。

【0042】

任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。

【0043】

ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献３などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。よって、本発明における「相同性」又は「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示すものである。

【0044】

本発明における「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本発明には、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。

【0045】

本発明の他の態様は、前記プラスミドで形質転換された組換え菌株を提供する。

【0046】

本発明における前記組換え菌株は、遺伝子発現を調節することを特徴とし、前記菌株は、単一又は多重標的遺伝子発現を強化又は弱化するものであるが、これらに限定されるものではない。

【0047】

前記「プラスミド」、「標的遺伝子」については前述した通りである。

【0048】

本発明における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0049】

また、本発明における「作動可能に連結」されたものとは、本発明の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。

【0050】

本発明のベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0051】

本発明における「組換え菌株」とは、目的とする組換えタンパク質を発現及び生産できるように、前記組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現ベクターの形態又は染色体に挿入される形態で導入された菌株を意味する。具体的には、本発明において、組換え菌株は、ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ又はｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ誘導体を用いて菌株の単一標的遺伝子だけでなく、多重遺伝子を強化及び／又は抑制した菌株であるが、これに限定されるものではない。

【0052】

本発明において、前記菌株は、エシェリキア（Escherichia）属であり、具体的にはエシェリキア・コリ（大腸菌，Escherichia coli）であるが、これらに限定されるものではない。

【0053】

本発明のさらに他の態様は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用システムを提供する。

【0054】

前記「ｄｘＣａｓ９」、「ＣＲＰ誘導体」、「標的遺伝子」、「発現調節」については前述した通りである。

【0055】

本発明における標的遺伝子発現調節用システムとは、単一標的遺伝子の発現を強化又は抑制するシステムや、多重遺伝子において、一部の遺伝子は強化し、他の一部の遺伝子は抑制調節するシステムを意味し、すなわち多重遺伝子に対する発現強化及び抑制を同時に行うことのできるシステムを意味するが、これに限定されるものではない。

【0056】

本発明の一実施例においては、標的遺伝子ｇＲＮＡ（Ａ）のＧＦＰ蛍光発現が対照群に比べて増加することが確認され、標的遺伝子ｇＲＮＡ（Ｒ２）のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光発現は対照群に比べて減少することが確認されたので、本発明のシステムは、多重遺伝子において、一部の遺伝子は発現を強化し、他の一部の遺伝子は抑制することが確認され、遺伝子の発現強化及び抑制調節が同時に可能であることが分かった（図１３）。

【0057】

本発明は、単一又は多重遺伝子の転写活性及び抑制機能が行える標的遺伝子発現調節システムを開発したことに技術的意義がある。

【0058】

本発明のさらに他の態様は、ｉ）ｄｘＣａｓ９タンパク質とＣＲＰタンパク質を結合したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムを作製するステップと、ｉｉ）前述したように作製したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムに蛍光レポータープラスミドをクローニングするステップと、ｉｉｉ）前記ｉｉ）ステップで作製したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムにガイドＲＮＡをさらにクローニングするステップと、ｉｖ）前記ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ－ｇＲＮＡを菌株に形質転換するステップとを含む、標的遺伝子発現を調節する組換え菌株の製造方法を提供する。

【0059】

本発明において、前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子を含むものであってもよい。

【0060】

本発明において、前記ｄｘＣａｓ９は、配列番号２のアミノ酸配列を含むリンカーが結合されたものであるが、これに限定されるものではない。

【0061】

本発明において、前記菌株は、エシェリキア属であり、具体的にはエシェリキア・コリであるが、これに限定されるものではない。

【0062】

前記「ｄｘＣａｓ９」、「ＣＲＰ」、「システム」、「ガイドＲＮＡ」、「形質転換」、「組換え菌株」については前述した通りである。

【0063】

本発明において、蛍光レポーターは、ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムの性能検証のためのものであってもよい。前記蛍光レポーターは、例えばルシフェラーゼ（Luciferase）、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein: GFP）、増強緑色蛍光タンパク質（enhanced Green Fluorescent Protein: eGFP）、ｍプラム（mPlum）、ｍチェリー（mCherry）、ｔｄトマト（tdTomato）、ｍストロベリー（mStrawberry）、Ｊ－レッド（J-Red）、Ｄｓレッド（DsRed）、ｍオレンジ（mOrange）、ｍＫＯ、ｍシトリン（mCitrine）、ビーナス（Venus）、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（enhanced yellow fluorescent protein: EYFP）、エメラルド（Emerald）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（cyan fluorescent protein: CFP）、セルリアン（Cerulean）、Ｔ－サファイア（T-Sapphire）又はアルカリホスファターゼであり、具体的にはＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙであるが、これらに限定されるものではない。

【0064】

本発明のさらに他の態様は、ｄｘＣａｓ９にＣＲＰ誘導体を適用するステップを含むことを特徴とする標的遺伝子発現調節方法を提供する。

【0065】

前記「ｄｘＣａｓ９」、「ＣＲＰ」、「標的遺伝子」、「発現調節」については前述した通りである。

【0066】

以下、実施例及び実験例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。

【0067】

実験例１．ＣＲＩＳＰＲベース遺伝子発現調節ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}システムの構築
実験例１－１．ｐｄｘＣａｓ９－ｌｉｎｋｅｒの作製
ｄｘＣａｓ９の過剰発現は細胞毒性を引き起こすことがあるので、ｐＡＲ－ｍｌａｃＩ［ｒｈａＰＢＡＤ，ｐ１５Ａ ｏｒｉ，ＣｍＲ］ベクターにｄｘＣａｓ９の遺伝子を挿入し、精巧な発現調節を行うことのできるＬ－ラムノース誘導性プロモーターシステム（L-Rhamnose inducible system）を導入した。

【0068】

具体的には、ｄｘＣａｓ９（配列番号１）及びｌｉｎｋｅｒ（配列番号２）から構成されるｄｘＣａｓ９－ｌｉｎｋｅｒを作製するために、ｄｘＣａｓ９（３．７）－ＶＰＲ（Addgene plasmid #108383）プラスミドを鋳型とし、配列番号３及び４のプライマーを用いて、ｄｘＣａｓ９－ｌｉｎｋｅｒ ＤＮＡをＰＣＲで増幅した。この実験に用いたプライマー配列を表１に示す。

【0069】

【表1】

【0070】

次に、ＮｄｅＩ及びＳｐｅＩ制限酵素で切断したｐＡＲ－ｍｌａｃＩベクターと、ｄｘＣａｓ９－ｌｉｎｋｅｒ ＰＣＲ産物の相同組換えにより、ｐｄｘＣａｓ９－ｌｉｎｋｅｒプラスミドを作製し、前述したように作製した組換えプラスミドを熱ショックによりＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α菌株に形質転換し、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（chloramphenicol）抗生剤を含む固体ＬＢ培地で培養し、その後前記プライマー（配列番号３，４）を用いて、組換えプラスミドが挿入された細胞をＰＣＲにより選択した。その後、前述したように選択した細胞からプラスミドを抽出し、最終的に組換えpｄｘＣａｓ９－ｌｉｎｋｅｒプラスミドを得た。

【0071】

実験例１－２．ｄｘＣａｓ９とＣＲＰ（ＷＴ及び誘導体）の結合タンパク質発現プラスミドの作製
ＣＲＰは、構造的にＲＮＡポリメラーゼ（RNA polymerase）のα－ｓｕｂｕｎｉｔに結合して遺伝子転写を活性化するＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３（Activating region）から構成されており、Ｃ末端に存在するＤＮＡ結合モチーフを介してＣＲＰのレギュロン遺伝子に結合する。このようなＣＲＰのドメインのうち、ｄｘＣａｓ９に結合してエフェクター（effector）として機能し、最大の効果を発揮するドメインを選択するために、大腸菌のＷＴ（Wild type, ＣＲＰ_ＷＴ, 配列番号５）ＣＲＰと４種のＣＲＰ誘導体であるＣＲＰ_{ＡＲ１２３}（配列番号６）、ＣＲＰ_ＡＲ２３（配列番号７）、ＣＲＰ_ＡＲ１（配列番号８）及びＣＲＰ_ＡＲ３（配列番号９）をエフェクタードメイン（Effector domain）として選択し、遺伝子発現調節効果を確認した。

【0072】

具体的には、ＣＲＰ_ＷＴは、計２１０個のアミノ酸で構成される４５ｋＤａの野生型転写調節因子であり、Ｎ末端にＲＮＡポリメラーゼのα－ｓｕｂｕｎｉｔに結合するａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎであるＡＲ２（２０、２２、９７、１０２番目の残基）、ＡＲ３（５３～５６、５９番目の残基）が存在し、Ｃ末端にＡＲ１（１５７～１６５番目の残基）と、ＣＲＰのレギュロン遺伝子を認識及び結合するＤＮＡ結合モチーフ（１８２～１９４）が存在し、前記Ｎ末端とＣ末端は、短いｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ（１３６～１３９）により連結されている。また、ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}は、前述した野生型ＣＲＰ_ＷＴからＣ末端のＤＮＡ結合モチーフが除去され、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ（ＡＲ１，ＡＲ２，ＡＲ３）ドメインを全て含み、１番目のアミノ酸から１８０番目のアミノ酸までの計１８０個のアミノ酸で構成されている。さらに、ＣＲＰ_ＡＲ２３は、野生型ＣＲＰ_ＷＴからＣ末端が全て除去され、Ｎ末端のＡＲ２、ＡＲ３ドメインと、ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎとを含み、１番目のアミノ酸から１３９番目のアミノ酸までの計１３９個のアミノ酸で構成されており、ＣＲＰ_ＡＲ１は、野生型ＣＲＰのＣ末端のＡＲ１ドメインのみ含み、１３６番目のアミノ酸から１８０番目のアミノ酸までの計４５個のアミノ酸で構成されている。最後に、ＣＲＰ_ＡＲ３は、野生型ＣＲＰ_ＷＴのＮ末端のＡＲ３のみ含み、２８番目のアミノ酸から９２番目のアミノ酸までの計６０個のアミノ酸で構成されている。これらを選択して、次のように実験を行った。

【0073】

実験例１－１．で作製したｐｄｘＣａｓ９－ｌｉｎｋｅｒプラスミドにＷＴ ＣＲＰ及びＣＲＰ誘導体をそれぞれ挿入するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＤＥ３）のゲノムを鋳型とし、ＣＲＰの各ドメインを部分的に発現するようにプライマーを設計した。ＣＲＰ_ＷＴは配列番号１０と１３、ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}は配列番号１０と１４、ＣＲＰ_ＡＲ２３は配列番号１０と１５、ＣＲＰ_ＡＲ１は配列番号１１と１４、ＣＲＰ_ＡＲ３は配列番号１２と１６のプライマーをそれぞれ用いてＰＣＲを行い、その後各ＰＣＲ産物を得た。実験に用いたプライマー配列を表２に示す。

【0074】

【表2】

【0075】

次に、ＮｇｏＭＩＶ制限酵素で処理したｄｘＣａｓ９－ｌｉｎｋｅｒプラスミドと、増幅したＣＲＰ誘導体（ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}，ＣＲＰ_ＡＲ２３，ＣＲＰ_ＡＲ１，ＣＲＰ_ＡＲ３）ＰＣＲ産物の各相同組換え反応により、ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_ＷＴ、ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}、ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_ＡＲ２３、ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_ＡＲ１、ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_ＡＲ３の組換えプラスミドを作製した。次に、実験例１－１．の方法と同様に組換え反応物を形質転換し、その後組換えプラスミドＷＴ ＣＲＰ及び各ＣＲＰ誘導体ＰＣＲ産物を増幅する際に用いた各プライマー（配列番号１０～１６）を用いて、組換えプラスミドを選択した。

【0076】

実験例２．ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}システム検証のための蛍光レポータープラスミドの作製
ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムの転写調節（強化／抑制）性能を試験及び検証するために（図１及び図２）、発現量の測定が容易なＧＦＰ蛍光遺伝子とｍＣｈｅｒｒｙ蛍光遺伝子をレポーター遺伝子として選定した。

【0077】

まず、転写強化の有無を検証するためには、ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰが標的遺伝子のｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｉｏｎを認識及び結合しなければならないので、ＮＧＧ配列を内包するＰＡＭ－ｒｉｃｈ ｕｐｓｔｒｅａｍである１７０ｂｐの遺伝子配列Ｊ１（非特許文献１１）、Ｐ_{Ｊ２３１１９}又はＰ_{Ｊ２３１１７}、ＲＢＳが連結された配列を遺伝子合成により得た。前述したように得られた合成遺伝子をＰＣＲ反応の鋳型とし、Ｊ１－Ｐ_{Ｊ２３１１９}－ＲＢＳは配列番号１７と１８のプライマー、Ｊ１－Ｐ_{Ｊ２３１１７}－ＲＢＳは配列番号１９と２０のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＮｄｅＩ制限酵素で切断したｐＭＷ７－ＧＦＰプラスミドと、前述したように得られた各ＰＣＲ産物の相同組換えを行い、合成プロモーターによりＧＦＰの発現強度を人為的に調節したｐＭＷ７－Ｐ_{Ｊ２３１１７}－ＧＦＰ（弱いＧＦＰ発現）とｐＭＷ７－Ｐ_{Ｊ２３１１９}－ＧＦＰ（強いＧＦＰ発現）組換えプラスミドを作製した（図３及び図４）。

【0078】

また、一細胞においてｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムの多重遺伝子転写強化及び抑制の同時調節が行われるか否かを検証するために、合成プロモーターにより蛍光遺伝子の発現強度を人為的に調節し、持続的に弱いＧＦＰ発現と強いｍＣｈｅｒｒｙ発現を誘導するｐＭＷ７－Ｐ_{Ｊ２３１１７}－ＧＦＰ－Ｐ_{Ｊ２３１１９}－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを作製した。配列番号２１と２２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅したＰ_{Ｊ２３１１９}－ｍＣｈｅｒｒｙのＰＣＲ産物と、ＡａｔＩＩの制限酵素で切断したｐＭＷ７－Ｐ_{Ｊ２３１１７}－ＧＦＰプラスミドの相同組換えを行い、ｐＭＷ７－Ｐ_{Ｊ２３１１７}－ＧＦＰ－Ｐ_{Ｊ２３１１９}－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを作製した（図５）。配列番号２１と２２のプライマーを用いて、Ｐ_{Ｊ２３１１９}－ｍＣｈｅｒｒｙが挿入されたプラスミドをＰＣＲにより選択した。

【0079】

蛍光レポータープラスミドの作製に用いたプライマー配列を表４に示す。

【0080】

【表4】

【0081】

実験例３．蛍光遺伝子発現強化及び抑制のための標的位置の選択及びｇＲＮＡの作製
ｄｘＣａｓ９が実施例２．で作製した蛍光レポータープラスミドの蛍光遺伝子を認識及び結合するように、遺伝子上のｇＲＮＡ標的位置を選択し、実験例１－２．で作製した各ｐｄｘＣａｓ９－ｌｉｎｋｅｒ－ＣＲＰ（又はＣＲＰ誘導体）プラスミドにさらなるｇＲＮＡ発現のためのクローニングを行った。

【0082】

具体的には、ｇＲＮＡは標的とする遺伝子の配列を含み、ｇＲＮＡが標的遺伝子に結合する位置に応じて遺伝子の転写強化又は抑制反応が決定されるので、ＰＡＭ（５’－ＮＧＧ－３’）配列に隣接し、転写開始点からそれぞれ－１９１ｂｐに位置するＧＦＰ発現強化のためのｇＲＮＡ（Ａ）（配列番号２３）、＋６６ｂｐに位置するＧＦＰ発現抑制のためのｇＲＮＡ（Ｒ１）（配列番号２４）の結合位置を選定し、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の転写開始点から＋２８ｂｐに位置するｍＣｈｅｒｒｙ発現抑制のためのｇＲＮＡ（Ｒ２）（配列番号２５）の標的位置を選定した（図６）。それに用いたｇＲＮＡ配列情報を表５に示す。

【0083】

【表5】

【0084】

次に、ｇＲＮＡは標的遺伝子と相補的な結合を行う２０ｂｐの配列と共に、共通してｄｘＣａｓ９に結合する４２ｂｐのヘアピン構造を有するｄｘＣａｓ９ ｈａｎｄｌｅ配列と、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）菌株に由来する４０ｂｐのｔｅｒｍｉｎａｔｏｒとから構成されるｓｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄが連結された構造を有して発現、作用するので、全てのｇＲＮＡに持続的に強い発現強度を示すＰ_{Ｊ２３１１９}プロモーターを導入して過剰発現を誘導した（図７）。

【0085】

各ｇＲＮＡを発現するためのｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ－ｇＲＮＡプラスミドを作製するために、まずｇＲＮＡ（Ａ）、ｇＲＮＡ（Ｒ１）、ｇＲＮＡ（Ｒ２）を増幅するｐｇＲＮＡ－ｂａｃｔｅｒｉａ（Addgene #44251）を鋳型とし、ｇＲＮＡ（Ａ）は配列番号２６と２７のプライマー組み合わせ、配列番号２８と３３のプライマー組み合わせ、ｇＲＮＡ（Ｒ１）は配列番号２６と２９のプライマー組み合わせ、配列番号３０と３３のプライマー組み合わせ、ｇＲＮＡ（Ｒ２）は配列番号２６と３１のプライマー組み合わせ、配列番号３２と３３のプライマー組み合わせによりＰＣＲを行い、それぞれ２種のＰＣＲ産物を得た。前述したように得られた２種のＰＣＲ産物の重複配列に基づいてｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを行い、標的遺伝子配列を含むｇＲＮＡ（Ａ）、ｇＲＮＡ（Ｒ１）、ｇＲＮＡ（Ｒ２）のＰＣＲ産物を得た。次に、実験例１－２．で作製したｐｄＣａｓ９－ＣＲＰ（又はＣＲＰ誘導体）プラスミドをＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で切断した線形ＤＮＡと、ｇＲＮＡ（Ａ）、ｇＲＮＡ（Ｒ１）ＰＣＲ産物の相同組換え反応により、組換えｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ（又はＣＲＰ誘導体）－ｇＲＮＡ（Ａ）プラスミド（図８，配列番号３４）、ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ（又はＣＲＰ誘導体）－ｇＲＮＡ（Ｒ１）プラスミド（図９，配列番号３５）を作製した。組換え反応物を形質転換して組換えプラスミドを選択する過程は実験例１－１．の方法と同様に行い、組換えプラスミドは配列番号２６と３３のプライマーによりＰＣＲを行って選択した。前記ＮｏｔＩの制限酵素で切断した線形ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ－ｇＲＮＡ（Ａ）プラスミドと、ｇＲＮＡ（Ｒ２）のＰＣＲ産物の相同組換え反応により、ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ－ｇＲＮＡ（Ａ）にさらにｇＲＮＡ（Ｒ２）を挿入した組換えプラスミドを作製した。その後、前述したように作製したプラスミドをＮｏｔＩ及びＮｃｏＩ制限酵素で切断してアガロースゲル電気泳動を行い、ｇＲＮＡ（Ｒ２）のサイズに相当するＤＮＡバンドが検出されたプラスミドを選択してｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ－ｇＲＮＡ（Ａ／Ｒ２）プラスミド（図１０，配列番号３６）を得た。

【0086】

この実験に用いたプライマー配列を表６に示す。

【0087】

【表6】

【0088】

【表7】

【実施例0089】

ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムの遺伝子発現強化／抑制調節の検証
実施例１－１．ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰの単一標的遺伝子発現強化効果の確認及びＣＲＰ誘導体の選定
実験例３．で構築した組換えｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ（又はＣＲＰ誘導体）－ｇＲＮＡ（Ａ）プラスミドと、実験例２．で構築したＧＦＰレポータープラスミドを共に大腸菌ＭＧ１６５５菌株に熱ショック方法により形質転換し、その後２５μｇ／ｍｌのｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌと、１００μｇ／ｍｌのａｍｐｉｃｉｌｌｉｎとを含む固体ＬＢ培地で培養し、形質転換された菌株を選択した。次に、１ｍＭのＬ－Ｒｈａｍｎｏｓｅを含む液体ＬＢ培地で前述したように選択した菌株を培養し、２４時間培養した細胞を共焦点蛍光顕微鏡で撮影し、その後個別の細胞のＧＦＰ発現量を蛍光強度で測定した（図１１）。

【0090】

その結果、図１１に示すように、ｄｘＣａｓ９と非標的ｇＲＮＡを発現する対照菌株（control）において、相対的に低いレベルのＧＦＰ蛍光強度で発現することが観察され、ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}誘導体発現菌株において、対照菌株に比べてＧＦＰ蛍光発現量が約４倍以上に増加することが確認され、他のＣＲＰ誘導体発現菌株に比べて最も優れた蛍光発現であることが確認された。

【0091】

よって、ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}誘導体がｄｘＣａｓ９のエフェクターとして最大の転写強化効果を有することが確認され、ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}誘導体はタンパク質構造上、ＲＮＡポリメラーゼに結合するａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎであるＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３を全て含むので、優れた転写強化調節活性を示すＣＲＰ_{ＡＲ１２３}誘導体を最も適したＣＲＰ誘導体として選定し、実験を行った。

【0092】

実施例１－２．ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰの単一標的遺伝子発現抑制効果の確認及びＣＲＰ誘導体の選定
ｄｘＣａｓ９タンパク質は標的遺伝子のプロモーター及びＯＲＦ位置に結合するとＲＮＡポリメラーゼのアクセスを阻害することにより高い効率で転写を抑制するので、ｄｘＣａｓ９とＣＲＰ（又はＣＲＰ誘導体）の融合における、ＣＲＰ（又はＣＲＰ誘導体）によるｄｘＣａｓ９自体の遺伝子転写抑制効果に対する影響及びｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムの標的遺伝子発現抑制効率を確認するために実験を行った。

【0093】

具体的には、実験例３．で構築した各組換えｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ（又はＣＲＰ誘導体）－ｇＲＮＡ（Ｒ１）プラスミドと、実験例２．で構築したＧＦＰレポータープラスミドを共に大腸菌ＭＧ１６５５菌株に熱ショックにより形質転換し、その後２５μｇ／ｍｌのｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌと、１００μｇ／ｍｌのａｍｐｉｃｉｌｌｉｎとを含む固体ＬＢ培地で培養し、形質転換された菌株を選択した。次に、１ｍＭのＬ－Ｒｈａｍｎｏｓｅを含む液体ＬＢ培地で前述したように選択した菌株を培養し、２４時間培養した細胞を共焦点蛍光顕微鏡で撮影し、その後個別の細胞のＧＦＰ発現量を蛍光強度で測定した（図１２）。

【0094】

その結果、図１２に示すように、ＣＲＰ（又はＣＲＰ誘導体）が融合されていないｄｘＣａｓ９とｇＲＮＡ（Ｒ１）を同時に発現する菌株は、ｄｘＣａｓ９と非標的ｇＲＮＡを発現する対照菌株（control）に比べて、ＧＦＰ蛍光値が約７５％以上減少し、ｄｘＣａｓ９自体の遺伝子が転写抑制効果を有することが確認された。特に、本発明のｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}誘導体発現菌株においては、ＧＦＰ発現が約８４％以上阻害されることが確認された。

【0095】

よって、ＣＲＰ誘導体の融合によるｄｘＣａｓ９の転写阻害効果が検証されたので、実施例１－１．及び１－２．の遺伝子発現強化及び抑制実験により、ＣＲＰ誘導体のうち、ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}が転写強化活性において優れるだけでなく、抑制活性においても最も高い活性を示し、最終的にｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}が新たな遺伝子発現調節システムとなることが確認された。

【実施例0096】

ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}の多重遺伝子発現同時強化及び抑制調節の検証
実施例１－１．及び１－２．で選定したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}システムを用いて、多重遺伝子に対する同時発現強化及び抑制調節効果を確認するための発現システムを作製した。

【0097】

具体的には、実験例２．及び３．で構築したｐＭＷ７－Ｐ_{Ｊ２３１１７}－ＧＦＰ－Ｐ_{Ｊ２３１１９}－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドと、ｐｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}－ｇＲＮＡ（Ａ／Ｒ２）のプラスミドを実施例１．と同様に大腸菌ＭＧ１６５５に共発現及び選択した。次に、選択した大腸菌細胞を１ｍＭのＬ－Ｒｈａｍｎｏｓｅと、２５μｇ／ｍｌのｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌと、１００μｇ／ｍｌのａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ抗生剤とを含む液体ＬＢ培地で２４時間培養した。その後、培養した細胞を収穫し、前記細胞を１Ｘ ＰＢＳ（ｐＨ８．０）に懸濁し、９６ウェルプレートに２００μＬずつ分注した。次に、マイクロプレートでＧＦＰ（４８８／５０９ｎｍ）とｍＣｈｅｒｒｙ（５８７／６１０ｎｍ）の蛍光を検出できる波長帯の光を用いて蛍光強度を測定した（図１３）。

【0098】

ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}とｇＲＮＡ（Ａ）、ｇＲＮＡ（Ｒ２）の同時発現菌株の蛍光強度を観測した結果、図１３に示すように、ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}とｇＲＮＡ（Ａ）の複合体によりＧＦＰ蛍光発現が対照菌株の約１２．６倍以上に増加し、ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}とｇＲＮＡ（Ｒ２）の複合体によりｍＣｈｅｒｒｙ発現が対照菌株に比べて約９３％減少した。

【0099】

よって、ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}システムがｇＲＮＡの配列と相補的な結合を行う標的遺伝子に特異的な発現を調節することが分かり、本発明のｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ_{ＡＲ１２３}システムを用いると、細胞の多重遺伝子をそれぞれ標的とし、多重遺伝子に対する発現強化及び抑制調節を同時に行えることが確認された。

【0100】

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれる変更又は変形された形態が全て含まれるものと解釈すべきである。

【0101】

【表8-1】

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