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特開2025-16518クラミドモナス・アシドフィラの抽出物、それを調製するための方法ならびにそれを含んでなる化粧用組成物および皮膚用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025016518
(43)【公開日】2025-02-04
(54)【発明の名称】クラミドモナス・アシドフィラの抽出物、それを調製するための方法ならびにそれを含んでなる化粧用組成物および皮膚用組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 4/08 20060101AFI20250128BHJP
C07K 14/405 20060101ALI20250128BHJP
C07K 1/12 20060101ALI20250128BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20250128BHJP
A61K 36/05 20060101ALI20250128BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20250128BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250128BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20250128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250128BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20250128BHJP
A61K 38/01 20060101ALI20250128BHJP
【ＦＩ】
C07K4/08
C07K14/405
C07K1/12
C07K1/14
A61K36/05
A61P17/00
A61P29/00
A61P37/08
A61P43/00 105
A61P9/00
A61K38/01
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024179399
(22)【出願日】2024-10-11
(62)【分割の表示】P 2021537795の分割
【原出願日】2019-12-30
(31)【優先権主張番号】1874321
(32)【優先日】2018-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(71)【出願人】
【識別番号】503028525
【氏名又は名称】ラボラトワール エクスパンシアンス
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】ソフィー、ルクレール－ビアンフェ
(72)【発明者】
【氏名】ステファニー、ブレディフ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】化粧用または皮膚用組成物としての、微小藻類クラミドモナス・アシドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）のペプチド抽出物、およびそれを調製するための方法を提供する。
【解決手段】微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの抽出物、およびそれを調製するための方法であって、抽出物の総重量に対して表されるパーセンテージとして少なくとも２０重量％のペプチドを含んでなる、少なくとも１つの酵素加水分解工程を含んでなる調製方法により得られる微小藻類クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの抽出物、およびそれを調製するための方法であって、抽出物の総重量に対して表されるパーセンテージとして少なくとも２０重量％のペプチドを含んでなる、少なくとも１つの酵素加水分解工程を含んでなる調製方法により得られる微小藻類クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抽出物の総重量に対して表されるパーセンテージとして少なくとも２０重量％のペプチドを含んでなる少なくとも１つの酵素加水分解工程を含んでなる調製方法により得られる微小藻類クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物。
【請求項2】
抽出物の総重量に対して表されるパーセンテージとして２０重量％～９０重量％、有利には２０重量％～７５重量％、一般に３０重量％～７０重量％のペプチドを含んでなる、請求項１に記載の抽出物。
【請求項3】
前記ペプチドが３５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する、請求項１または２に記載の抽出物。
【請求項4】
少なくとも８０重量％のペプチドが１０００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項5】
少なくとも３０重量％、有利には少なくとも３５重量％のペプチドが５００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項6】
少なくとも１つの酵素加水分解工程を含んでなる、クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物を調製するための方法。
【請求項7】
前記酵素加水分解が少なくとも１種類のプロテアーゼ、有利には少なくとも１種類のアルカリ性プロテアーゼの存在下で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
少なくとも以下の工程：
ａ）微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの水相分散；
ｂ）工程ａ）で得られた水相分散の、有利には少なくとも１種類のプロテアーゼの存在下での酵素加水分解、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物の熱処理、および
ｄ）工程ｃ）の終了時のペプチド抽出物の回収
を含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
ａ）微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの水相分散；
ｂ）工程ａ）で得られた水相分散の、有利には少なくとも１種類のプロテアーゼの存在下での酵素加水分解、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物の熱処理、および
ｄ）工程ｃ）の終了時のペプチド抽出物の回収
を含んでなる、請求項６または７に記載の方法。
【請求項9】
工程ｃ）とｄ）の間に配置される付加的濾過または遠心分離工程と、場合によりその後に限外濾過、ダイアフィルトレーション、またはナノフィルトレーションを含んでなる、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
工程ｃ）とｄ）の間、または付加的濾過もしくは遠心分離工程の後に行われる１５ｋＤａの限外濾過の工程をさらに含んでなる、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
１５ｋＤａの限外濾過工程の後に行われる、１００ダルトン～３００ダルトンのカットオフを有するナノフィルトレーション工程をさらに含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
有効成分としての、少なくとも１つの酵素加水分解工程を含んでなる調製方法により得られる微小藻類クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物と好適な賦形剤とを含んでなる組成物。
【請求項13】
前記抽出物が請求項１～５のいずれか一項に記載されるように定義されるか、または請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
組成物の総重量に基づき乾燥抽出物として表される０．００１重量％～１０重量％、有利には０．０１重量％～５重量％の前記クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物を含んでなる、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項15】
皮膚および／もしくは粘膜および／もしくは皮膚付属器の障害もしくは病態、有利には、皮膚、未成熟の、通常の、もしくは成熟／老化した皮膚付属器および／もしくは粘膜のバリアもしくは恒常性のアレルギー性、炎症性、刺激性の反応もしくは病態もしくは障害、ならびに／または
血管障害、特に、発赤もしくはクペロース、ならびに／または
脂肪組織の変性
の予防および／または治療において使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の抽出物または請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法により得ることができる抽出物または請求項１２～１４のいずれか一項に記載の組成物。
血管障害、特に、発赤もしくはクペロース、ならびに／または
脂肪組織の変性
の予防および／または治療において使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の抽出物または請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法により得ることができる抽出物または請求項１２～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
皮膚および／または皮膚付属器および／または粘膜の状態および／または外観の改善において使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の抽出物または請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法により得ることができる抽出物または請求項１２～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微小藻類クラミドモナス・アシドフィラ(Chlamydomonas acidophila)のペプチド抽出物およびこのような抽出物を含んでなる化粧用、皮膚用または医薬組成物に関する。本発明はまた、クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物を抽出するための方法、および前記方法により得ることができる抽出物にも関する。本発明はまた、皮膚、粘膜もしくは皮膚付属器の障害もしくは病態の予防もしくは治療において使用するため、血管障害の予防もしくは治療において使用するため、または脂肪組織の変性の予防もしくは治療において使用するための組成物またはこのような抽出物にも関する。最後に、本発明はまた、皮膚、粘膜または皮膚付属器の、それらの状態または外観を改善することを目的とする美容ケアのための方法であって、そのような組成物またはそのような抽出物を投与することからなる方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
微小藻類
微小藻類は、光合成を行い、従って、高等植物と同様に、リン、硝酸塩などの他の栄養素に加えて、空気からのＣＯ２を代謝において使用することができる単細胞の真核生物である。微小藻類は、地球上に定着した最初の種の１つであった。約３００００種が記載されているが、もっと多いと考えられる。微小藻類は、世界中の淡水、汽水および塩水中に天然状態で見られる。
微小藻類は、光合成を行い、従って、高等植物と同様に、リン、硝酸塩などの他の栄養素に加えて、空気からのＣＯ２を代謝において使用することができる単細胞の真核生物である。微小藻類は、地球上に定着した最初の種の１つであった。約３００００種が記載されているが、もっと多いと考えられる。微小藻類は、世界中の淡水、汽水および塩水中に天然状態で見られる。
【0003】
微小藻類は、光リアクターなどの光、ｐＨおよび栄養素が制御された環境で、当業者に公知の方法に従って培養することができ、多くの生産物がある。微小藻類は、高等生物と同様に、タンパク質、炭水化物および脂質を合成することができる。一部の脂質は、特定の生物学的特性を有する複合脂肪酸または色素（キサントフィル）など、独特のものである。これらの脂質は生物燃料の生産の可能性に関して注目の的となり、バイオリアクターでのそれらの生産が拡がっている。他の生産物は多様であり、魚の餌（アクアリウムおよび養殖）、食品およびヒトの健康（ヘマトコッカス藻(Haematococcus pluvialis)から抽出されるアスタキサンチンであるスピルリナタンパク質）および化粧品工業におけるいくつかの生産物がある。
【0004】
従来技術－クラミドモナス・アシドフィラ
緑藻綱(Chlorophyceae)（クラミドモナス科(Chlamydomonadaceae)）のクラミドモナス・アシドフィラは、強酸性水（ｐＨ２．３～３．４）で増殖し、重金属を含む環境に適応している緑色の淡水微小藻類である。特に、クラミドモナス・アシドフィラは、アルゼンチンの火山湖で初めて特定され、採種された。クラミドモナス・アシドフィラは、金属をキレート化することができる特定の構造であるフィトケラチン、およびカロテノイド（β－カロテン、ルテイン）が豊富であるとされている。その培養および発達条件に関する（極限ｐＨおよび重金属に対する耐性）に関する公表を除いて、その組成および使用に関するものはほとんどない。その「近縁の」コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)は、遺伝学などの種々の化学分野でモデル生物として使用されている。
緑藻綱(Chlorophyceae)（クラミドモナス科(Chlamydomonadaceae)）のクラミドモナス・アシドフィラは、強酸性水（ｐＨ２．３～３．４）で増殖し、重金属を含む環境に適応している緑色の淡水微小藻類である。特に、クラミドモナス・アシドフィラは、アルゼンチンの火山湖で初めて特定され、採種された。クラミドモナス・アシドフィラは、金属をキレート化することができる特定の構造であるフィトケラチン、およびカロテノイド（β－カロテン、ルテイン）が豊富であるとされている。その培養および発達条件に関する（極限ｐＨおよび重金属に対する耐性）に関する公表を除いて、その組成および使用に関するものはほとんどない。その「近縁の」コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)は、遺伝学などの種々の化学分野でモデル生物として使用されている。
【発明の開示】
【0005】
本出願者は、微小藻類クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物は、これまでには記載されたことがなかった化粧的、薬理学的および皮膚科的特性を示すことを発見した。特に、このようなクラミドモナス・アシドフィラ抽出物がそれ自体、それらの特定の特性のために使用されるのは初めてのことである。
【0006】
本発明は、微小藻類クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物に関する。
【0007】
本発明に関して、「ペプチド抽出物」は、主としてペプチドを含んでなる抽出物を意味する。
【0008】
本発明に関して、「ペプチド」は、ペプチド結合によって相互に連結されたアミノ酸のポリマーを意味する。ペプチドは、特に、２００～１００００ダルトン（Ｄａ）の分子量を特徴とする。
【0009】
有利には、本発明によるクラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、抽出物の総重量に対して表されるパーセンテージとして少なくとも２０重量％のペプチドを含んでなる。特に、本発明による抽出物は、抽出物の総重量に対して表されるパーセンテージとして２０重量％～９０重量％、有利には２０重量％～７５重量％、より有利には３０重量％～７０重量％、一般に６５重量％のペプチドを含んでなる。
【0010】
有利には、本発明によるクラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、タンパク質、特に、残留天然タンパク質を実質的に含まない。他のものの中でもこれはアレルギー性反応を回避し、本発明による抽出物の溶解度およびバイオアベイラビリティを改善する。
【0011】
本発明に関して、「タンパク質」は、１以上のポリペプチド鎖から形成される生体高分子を意味する。これらの鎖のそれぞれは、ペプチド結合により相互連結されたアミノ酸残基の配列からなる。タンパク質は、特に、１００００ダルトン（Ｄａ）より大きい分子量を特徴とする。
【0012】
有利には、本発明によるクラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、遊離アミノ酸を実質的に含まない。遊離アミノ酸は、２００Ｄａ未満の分子量を有する。
【0013】
本発明によるクラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物において、ペプチドは有利には３５００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する。有利には、これらのペプチドは、抽出物中に元々存在するアミノ酸に基づく化合物の総てを包含する。
【0014】
有利には、本発明による抽出物において、少なくとも８０％、より有利には少なくとも９０％のペプチドが１０００Ｄａ未満の分子量を有する。
【0015】
有利には、本発明による抽出物において、少なくとも３０％のペプチド、より有利には少なくとも３５％、より有利には少なくとも４０％のペプチドは、５００Ｄａ未満の分子量を有する。
【0016】
ペプチドの分子量分布は、総ペプチド濃度のパーセンテージとして表される。
【0017】
本発明に関して、クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物は、有利には、素加水分解により、より有利には、少なくとも１種類のプロテアーゼの存在下で得られる。本発明による抽出物は、より有利には、本明細書の以下に記載される方法により得ることができる。
【0018】
本発明はまた、少なくとも１つの酵素加水分解工程を含んでなる、微小藻類クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物を調製するための方法にも関する。この工程は、有利には、当業者に公知の最適なｐＨおよび温度条件下で、特に、使用する酵素に関する最適なｐＨおよび温度条件下で行われる。
【0019】
有利には、前記酵素加水分解工程は、少なくとも１種類のプロテアーゼの存在下で行われる。前記プロテアーゼは有利には、アルカリ性プロテアーゼまたは酸性プロテアーゼであり得、有利には、アルカリ性プロテアーゼである。
【0020】
有利には、本発明によれば、クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物を調製するための方法は、少なくとも以下の工程を含んでなる：
ａ）微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの水相分散；
ｂ）工程ａ）で得られた水相分散の酵素加水分解、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物の熱処理、および
ｄ）工程ｃ）の終了時のペプチド抽出物の回収。
ａ）微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの水相分散；
ｂ）工程ａ）で得られた水相分散の酵素加水分解、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物の熱処理、および
ｄ）工程ｃ）の終了時のペプチド抽出物の回収。
【0021】
工程ａ）において、水相は、有利には水である。さらに、水性分散物中の微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの含量は、有利には、０．１％～２０％、より有利には１％～１０％の、微小藻類の乾燥抽出物当量を含んでなる。
【0022】
酵素処理（工程ｂ）は有利には、少なくとも１種類のプロテアーゼを、有利には、当業者に公知の最適なｐＨおよび温度条件下、例えば、３．０～９．０に含まれるｐＨ、一般に、２０℃～９０℃に含まれる温度で行われる。特に、酵素処理は、アルカリ性または酸性プロテアーゼ、有利には、アルカリ性プロテアーゼの添加を含んでなる。
【0023】
本発明による方法野酵素加水分解工程は、それがペプチドを得るためにクラミドモナス・アシドフィラ中に存在する天然タンパク質を「変換（transform）」または「切断（cut）」することから、極めて重要である。
【0024】
本発明に関して、酵素加水分解工程の後に有利には、酵素を変性させるための熱処理工程が行われる。この熱処置工程は有利には、４０℃より高い温度、一般に、８０℃～１００℃で行われる。
【0025】
工程ｄ）において、ペプチド抽出物は有利には、工程ｃ）の終了時に、有利には、撹拌しながら、有利には、３．０～９．０に含まれるｐＨおよび２０℃～９０℃に含まれる温度での分散物の抽出により回収される。
【0026】
有利には、この方法は、工程ｃ）とｄ）の間に配置される付加的濾過または遠心分離工程と、場合によりその後に限外濾過、ダイアフィルトレーション、またはナノフィルトレーションを含んでなる。
【0027】
濾過または遠心分離工程と、場合により、その後の膜限外濾過またはダイアフィルトレーションは、残留タンパク質を除去するために使用される。ナノフィルトレーション工程は、例えば、無機塩または遊離アミノ酸を除去するために使用される。
【0028】
本発明による方法は、有利には、工程ｃ）とｄ）の間に行われる１５ｋＤａ、有利には１０～１５ｋＤａでの限外濾過工程を含んでなり、これは潜在的アレルゲン性残留タンパク質を除去するために使用される。
【0029】
有利には、本発明による方法は、限外濾過工程後にアミノ酸または無機塩の一部を除去するために、例えば、１００ダルトン～３００ダルトン、有利には１３０～３００ダルトン、一般に２００ダルトン～３００ダルトンに含まれるカットオフ閾値でのナノフィルトレーション工程をさらに含んでなる。有利には、前記ナノフィルトレーション工程は、２００Ｄａの膜で行われる。
【0030】
得られる水性加水分解物、すなわち、本発明によるペプチド抽出物は、グリセロールまたは１，３－プロパンジオールのようなグリコールなどの溶媒を、安定化に好適な種々の割合で加えることによって物理的および微生物学的に安定化させることができる。有利には、グリセロールは単独で存在するか、または水もしくはグリコールと組み合わせて、有利にはペプチド抽出物および溶媒の総重量に対して４０重量％～９５重量％、優先的には５０重量％～９０重量％に含まれる割合で存在する。同様に、グリコール、優先的には１，３－プロパンジオールは、有利には、単独で存在するか、または水もしくはグリセロールと組み合わせて、有利にはペプチド抽出物および溶媒の総重量に対して４０重量％～９５重量％、優先的には５０重量％～９０重量％に含まれる割合で存在する。よって、本発明はさらに、本発明によるクラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物、物理的および微生物的安定化作用のために有効な量のグリセロール、グリコールおよびそれらの混合物から選択される溶媒、ならびに場合により水を含んでなる組成物に関する。物理的および微生物的安定化作用のための有効な量は上記の通りである。
【0031】
ペプチド抽出物を、当業者に公知の方法により、例えば、マルトデキストリンまたはアカシア繊維（ＣＮＩ社からのファイバーガム（Ｒ））などの担体の存在下または不在下で安定化させることができる別法も存在する。担体含量は一般に、液体状の抽出物において得られる乾物のパーセンテージに対して０％～８０％の範囲の担体比率に応じて異なる。抽出物は噴霧、凍結乾燥または当業者に公知のいずれの方法によって乾燥させてもよく、優先的には、微粉を得るために凍結乾燥により乾燥させる。微粉は有利には、３０％～７０重量％の抽出物乾物を含んでなり、１００％とするための残部が凍結乾燥担体である。より有利には、微粉は、５０％の抽出物由来乾物および５０％の凍結乾燥担体を含んでなり、前記凍結乾燥担体は好ましくは、マルトデキストリンまたはアカシア繊維タイプである。
【0032】
優先的には、例として、ペプチド抽出物は、以下の方法に従って得ることができる：
ａ）微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの、約１０％乾燥抽出物相当の微小藻類含量での水への溶解；
ｂ）アルカリ性プロテアーゼ（Ｌｙｖｅｎ社からのアルカラーゼ）による酵素加水分解；
ｃ）酵素を変性させるための熱処理；
ｃ’）潜在的アレルゲン性残留タンパク質を除去するための１５ｋＤａ膜での遠心分離、限外濾過およびダイアフィルトレーション；
ｃ”）例えば、無機塩または遊離アミノ酸を除去するための２００Ｄａ膜ナノフィルトレーション；および
ｄ）工程ｃ”）の終了時に得られたペプチド抽出物の回収。
ａ）微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの、約１０％乾燥抽出物相当の微小藻類含量での水への溶解；
ｂ）アルカリ性プロテアーゼ（Ｌｙｖｅｎ社からのアルカラーゼ）による酵素加水分解；
ｃ）酵素を変性させるための熱処理；
ｃ’）潜在的アレルゲン性残留タンパク質を除去するための１５ｋＤａ膜での遠心分離、限外濾過およびダイアフィルトレーション；
ｃ”）例えば、無機塩または遊離アミノ酸を除去するための２００Ｄａ膜ナノフィルトレーション；および
ｄ）工程ｃ”）の終了時に得られたペプチド抽出物の回収。
【0033】
本発明による方法に関して、原料として使用するクラミドモナス・アシドフィラ微小藻類は、開放環境、例えば、「水路」（養殖用に使用されるオーバルトラック型タンク）での培養から得ることもできるし、または閉鎖環境のフォトバイオリアクターでの培養から得ることもできる。有利には、原料として使用される前記微小藻類は、フォトバイオリアクター、特に、撹拌タンクフォトバイオリアクターでの培養から得られる。より有利には、原料として使用される前記微小藻類は、例えば、Ｍｉｃｒｏｐｈｙｔ社により開発され、特に、特許出願ＦＲ２９４３６８５および国際出願ＷＯ２０１１／０５８２６７に記載されているものなどの水平管状波換気(horizontal tubular wave-ventilated)撹拌タンクフォトバイオリアクターでの培養から得られる。
【0034】
本発明はまた、上記に述べた方法により得ることができるクラミドモナス・アシドフィラ抽出物にも関する。このような抽出物は、上記で定義された詳細を満たす。
【0035】
本発明はまた、有効成分としてクラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物および必要であれば好適な賦形剤を含んでなる化粧用、皮膚用または医薬組成物にも関する。
【0036】
有利には、本発明による組成物において、クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物は上記で定義された通りであり、または上述の方法により得ることができる。よって、前記抽出物は有利には、本発明による抽出物それ自体に関するまたは本発明による方法により得ることができる抽出物に関する上記の段落に定義される。
【0037】
前記組成物は、有利には、外用局所投与、膣投与または口腔投与するために処方される。
【0038】
有利には、本発明による組成物は、抽出物、組成物の総重量に基づき乾燥抽出物として表される０．００１重量％～１０重量％、有利には０．０１重量％～５重量％の前記クラミドモナス・アシドフィラペプチド抽出物を含んでなる。
【0039】
本発明による組成物は、１以上の他の有効成分をさらに含んでなり得る。
【0040】
第１の選択肢によれば、様々な調製物は局所投与に好適であり、特に、クリーム、エマルション、ミルク、軟膏、ローション、オイル、水溶液またはヒドロアルコール溶液またはグリコール酸溶液、粉末、パッチ、スプレー、シャンプー、つや出し剤または他のいずれかの外用製品が含まれ、以下の選択肢によれば、様々な調製物には、特に、インティメート衛生ケア、口腔ケア、例えば、歯磨き剤、口腔溶液、歯肉用ゲルが含まれる。
【0041】
その性質（化粧用、医薬用または皮膚用）によって、本発明による組成物は、少なくとも１種類の化粧上、医薬上または皮膚科上許容可能な賦形剤をさらに含んでなり得る。特に、本発明による組成物は、面活性剤、増粘剤、保存剤、香料、色素、化学または無機フィルター、保湿剤、温泉水などから選択される少なくとも１種類の化粧上、医薬上または皮膚科上許容可能な、当業者に公知のアジュバントをさらに含んでなり得る。当業者ならば、一般知識を用いて本発明による組成物の処方をどのように適合させればよいかを知っている。
【0042】
本発明による組成物の最適用量およびガレヌス形態は、例えば、患者または動物の年齢または体重、その健康状態の重篤度、処置に対する忍容性、見られる副作用、および皮膚のタイプなどの、患者または動物に適合した薬理学的、皮膚科的または化粧的処置の確立を全般的に考慮した基準に従って決定することができる。
【0043】
本発明はまた、
皮膚および／または粘膜（例えば、歯肉、歯周組織、生殖器粘膜）および／または皮膚付属器（例えば、毛および爪）の障害または病態；
血管障害；および
脂肪組織の変性
の予防および／または治療において使用するための、本発明による抽出物、または本発明による方法により得ることができる抽出物、または本発明による組成物にも関する。
皮膚および／または粘膜（例えば、歯肉、歯周組織、生殖器粘膜）および／または皮膚付属器（例えば、毛および爪）の障害または病態；
血管障害；および
脂肪組織の変性
の予防および／または治療において使用するための、本発明による抽出物、または本発明による方法により得ることができる抽出物、または本発明による組成物にも関する。
【0044】
本発明はまた、
皮膚および／または粘膜（例えば、歯肉、歯周組織、生殖器粘膜）および／または皮膚付属器（例えば、毛および爪）の障害または病態；
血管障害；および
脂肪組織の変性
の予防および／または治療において使用するための化粧品、医薬または皮膚用組成物の製造のための、本発明による抽出物、または本発明による方法により得ることができる抽出物、または本発明による組成物の使用にも関する。
皮膚および／または粘膜（例えば、歯肉、歯周組織、生殖器粘膜）および／または皮膚付属器（例えば、毛および爪）の障害または病態；
血管障害；および
脂肪組織の変性
の予防および／または治療において使用するための化粧品、医薬または皮膚用組成物の製造のための、本発明による抽出物、または本発明による方法により得ることができる抽出物、または本発明による組成物の使用にも関する。
【0045】
本発明はさらに、
皮膚および／または粘膜（例えば、歯肉、歯周組織、生殖器粘膜）および／または皮膚付属器（例えば、毛および爪）の障害または病態；
血管障害；および
脂肪組織の変性
を予防および／または治療するための方法であって、
有効量の本発明による抽出物、または本発明による方法により得ることができる抽出物、または本発明による組成物を、それを必要とする対照に投与すること、特に、局所投与することを含んでなる方法にも関する。
皮膚および／または粘膜（例えば、歯肉、歯周組織、生殖器粘膜）および／または皮膚付属器（例えば、毛および爪）の障害または病態；
血管障害；および
脂肪組織の変性
を予防および／または治療するための方法であって、
有効量の本発明による抽出物、または本発明による方法により得ることができる抽出物、または本発明による組成物を、それを必要とする対照に投与すること、特に、局所投与することを含んでなる方法にも関する。
【0046】
特に、本発明による抽出物、または本発明による方法により得ることができる抽出物、または本発明による組成物は、皮膚、未成熟の、通常の、または成熟／老化した皮膚付属器（毛および爪）および／または粘膜（歯肉、歯周組織、生殖器粘膜）のバリアまたは恒常性のアレルギー性、炎症性、刺激性の反応または病態または障害の予防および／または治療が意図される。
【0047】
有利には、本発明による組成物または抽出物は、
座瘡、酒さまたはエリスロクペロース(erythrocouperosis)、乾癬、血管障害、おむつかぶれ、アトピー性皮膚炎、湿疹、接触性皮膚炎、刺激性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎（乳痂）、乾癬、敏感肌、反応性肌、乾燥肌（乾燥症）、脱水肌、発赤を有する皮膚、皮膚紅斑、老化または光老化皮膚、光増感皮膚、色素沈着皮膚（肝斑、炎症後色素沈着など）、脱色皮膚（白斑）、セルライトを有する皮膚、たるんだ皮膚、皮膚線条を有する皮膚、痂皮、荒れた皮膚、刺し傷、特に乳房の亀裂、火傷、あらゆる種類の光線による炎症、化学的、物理的（例えば、妊婦のストレス）、細菌性、真菌性またはウイルス性、寄生虫（シラミ、疥癬、白癬、ダニ、皮膚糸状菌）性または放射線性因子による、または自然免疫（抗微生物ペプチド）または獲得（細胞性、体液性、サイトカイン）免疫の欠如による刺激作用などの皮膚の、ならびに／あるいは
歯肉炎（新生児の敏感歯肉、衛生問題、喫煙もしくはその他による）、歯周病を呈することがある歯肉および歯周組織、または外部もしくは内部男性または女性生殖器領域の刺激作用を呈することがある生殖器粘膜などの粘膜、ならびに／あるいは
特に、アンドロゲン性、急性、限局性、瘢痕性、先天性または乳児後頭脱毛症（または円形脱毛症）、円形脱毛症、化学療法／放射線療法関連脱毛症または休止期脱毛症、アナゲン脱毛、ピラージストロフィー(pilar dystrophy)、抜毛癖、白癬または脂性または乾燥ふけ症などの頭皮の障害を呈する、未成熟の、通常のまたは成熟した爪（もろい虚弱な爪）および毛髪（脱毛症、ふけ症、多毛症、脂漏性皮膚炎、毛包炎）などの皮膚付属器の、反応、障害または病態の予防および／または治療のために使用可能である。
座瘡、酒さまたはエリスロクペロース(erythrocouperosis)、乾癬、血管障害、おむつかぶれ、アトピー性皮膚炎、湿疹、接触性皮膚炎、刺激性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎（乳痂）、乾癬、敏感肌、反応性肌、乾燥肌（乾燥症）、脱水肌、発赤を有する皮膚、皮膚紅斑、老化または光老化皮膚、光増感皮膚、色素沈着皮膚（肝斑、炎症後色素沈着など）、脱色皮膚（白斑）、セルライトを有する皮膚、たるんだ皮膚、皮膚線条を有する皮膚、痂皮、荒れた皮膚、刺し傷、特に乳房の亀裂、火傷、あらゆる種類の光線による炎症、化学的、物理的（例えば、妊婦のストレス）、細菌性、真菌性またはウイルス性、寄生虫（シラミ、疥癬、白癬、ダニ、皮膚糸状菌）性または放射線性因子による、または自然免疫（抗微生物ペプチド）または獲得（細胞性、体液性、サイトカイン）免疫の欠如による刺激作用などの皮膚の、ならびに／あるいは
歯肉炎（新生児の敏感歯肉、衛生問題、喫煙もしくはその他による）、歯周病を呈することがある歯肉および歯周組織、または外部もしくは内部男性または女性生殖器領域の刺激作用を呈することがある生殖器粘膜などの粘膜、ならびに／あるいは
特に、アンドロゲン性、急性、限局性、瘢痕性、先天性または乳児後頭脱毛症（または円形脱毛症）、円形脱毛症、化学療法／放射線療法関連脱毛症または休止期脱毛症、アナゲン脱毛、ピラージストロフィー(pilar dystrophy)、抜毛癖、白癬または脂性または乾燥ふけ症などの頭皮の障害を呈する、未成熟の、通常のまたは成熟した爪（もろい虚弱な爪）および毛髪（脱毛症、ふけ症、多毛症、脂漏性皮膚炎、毛包炎）などの皮膚付属器の、反応、障害または病態の予防および／または治療のために使用可能である。
【0048】
本発明はまた、皮膚および／または皮膚付属器および／または粘膜の、それらの状態または外観を改善することを目的とする美容ケアのための方法であって、本発明による抽出物、または本発明による方法により得ることができる抽出物、または本発明による組成物を投与することからなる方法にも関する。
【0049】
特に、この美容ケア法は、皮膚を堅牢にし、有利には、皮膚および／または皮膚付属器および／または粘膜上の局所的経路によって「オレンジピール」効果を軽減する。
【0050】
特に、本発明は、皮膚の弾力性もしくは堅牢性に、特に、しわ伸ばし剤または抗しわ剤として作用するため、敏感肌に作用するため、または汚染に対して作用するための、皮膚および／または皮膚付属器の美容ケアのための方法であって、皮膚および／または皮膚付属器に本発明による組成物または抽出物を塗布することからなる方法に関する。
【0051】
特に、本発明は、皮膚および／または皮膚付属器、それらのバリアおよび脱水に関する美容ケアのための方法であって、皮膚および／または皮膚付属器に本発明による組成物または抽出物を塗布することからなる方法に関する。
【0052】
本発明は、老化を防ぐ目的の美容的肌ケア法であって、皮膚に本発明による組成物または抽出物を塗布することからなる方法に関する。
【0053】
本発明による組成物または抽出物はまた、血管障害、特に、発赤およびクペロースの予防および／または治療においても有利に使用することができる。
【0054】
本発明による組成物または抽出物はまた、脂肪組織の変性の予防および／または治療おいても有利に使用することができる。脂肪組織の変性は、特に、セルライトまたは「オレンジピール」効果である。本発明による組成物は皮膚を堅牢にする。
【0055】
本発明は、以下の実施例により非限定的に説明することができる。
【図面の簡単な説明】
【0056】
【実施例0057】
実施例１： 本発明による抽出物
ペプチド抽出物は、以下の方法に従って得られる：
ａ）微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの、約１０％乾物での水への溶解；
ｂ）アルカリ性プロテアーゼ（Ｌｙｖｅｎ社からのアルカラーゼ）による加水分解；
ｃ）酵素を変性させるための、８０℃～１００℃に含まれる温度での熱処理；
ｃ’）潜在的アレルゲン性残留タンパク質を除去するための１５ｋＤａ膜での遠心分離、限外濾過およびダイアフィルトレーション；
ｃ”）無機塩または遊離アミノ酸または単糖類を除去するための２００Ｄａ膜ナノフィルトレーション；
ｄ）ペプチド抽出物の回収；
ｅ）グリセロール／１，３－プロパンジオール混合物中での安定化。
ペプチド抽出物は、以下の方法に従って得られる：
ａ）微小藻類クラミドモナス・アシドフィラの、約１０％乾物での水への溶解；
ｂ）アルカリ性プロテアーゼ（Ｌｙｖｅｎ社からのアルカラーゼ）による加水分解；
ｃ）酵素を変性させるための、８０℃～１００℃に含まれる温度での熱処理；
ｃ’）潜在的アレルゲン性残留タンパク質を除去するための１５ｋＤａ膜での遠心分離、限外濾過およびダイアフィルトレーション；
ｃ”）無機塩または遊離アミノ酸または単糖類を除去するための２００Ｄａ膜ナノフィルトレーション；
ｄ）ペプチド抽出物の回収；
ｅ）グリセロール／１，３－プロパンジオール混合物中での安定化。
【0058】
このようにして得られた液体ペプチド抽出物は、以下の特徴を有する：
１－物理化学的分析（％／総乾物）
乾燥抽出物（２時間、１０５℃、換気オーブン）： １．２％
ｐＨ： ５．１
α－アミノ窒素（ＯＰＡ、ロイシン等価物）： ２９％
ペプチド（Ｋｊｅｌｄａｈｌ、Ｎ×６．２５）： ７０％
総灰分： ４％
２－ペプチド分子量分布のプロファイル
５００Ｄａ未満： ４０％
５００～１０００Ｄａ： ５５％
１０００～３５００Ｄａ： ４％
３５００Ｄａより大きい： １％
１－物理化学的分析（％／総乾物）
乾燥抽出物（２時間、１０５℃、換気オーブン）： １．２％
ｐＨ： ５．１
α－アミノ窒素（ＯＰＡ、ロイシン等価物）： ２９％
ペプチド（Ｋｊｅｌｄａｈｌ、Ｎ×６．２５）： ７０％
総灰分： ４％
２－ペプチド分子量分布のプロファイル
５００Ｄａ未満： ４０％
５００～１０００Ｄａ： ５５％
１０００～３５００Ｄａ： ４％
３５００Ｄａより大きい： １％
【0059】
実施例２： 本発明による抽出物の生物活性の試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
実施例１で得られたクラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物の生物活性は、以下に記載するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで実証された。
実施例１で得られたクラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物の生物活性は、以下に記載するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで実証された。
【0060】
これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、
皮膚バリア（特に、脂質関門）の強化；
ヒアルロン酸合成、ＮＭＦ生産およびオスモライト輸送経路を介した皮膚保水；
非特異的ストレスまたは大気汚染に関連するものに対する抗酸化および抗炎症防御；
抗老化効果、特に、皮膚基質の恒常性の保護によるもの；
アレルギー機序
に対するＣＡＰ抽出物の可能性を示した。
皮膚バリア（特に、脂質関門）の強化；
ヒアルロン酸合成、ＮＭＦ生産およびオスモライト輸送経路を介した皮膚保水；
非特異的ストレスまたは大気汚染に関連するものに対する抗酸化および抗炎症防御；
抗老化効果、特に、皮膚基質の恒常性の保護によるもの；
アレルギー機序
に対するＣＡＰ抽出物の可能性を示した。
【0061】
Ｉ．皮膚線維芽細胞およびメラニン化した再構築表皮に対する活性の予備スクリーニング クラミドモナス・アシドフィラ抽出物の潜在的生物活性を、皮膚線維芽細胞およびメラニン化した再構築表皮に対する遺伝子発現調節試験により検討した。よって、皮膚および化粧品生理学において主な対象となる９６の遺伝子の発現を、線維芽細胞およびメラニン化した再構築表皮に対するＰＣＲアレイによって調べた。
【0062】
ａ．材料および方法：
クラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物０．０５％乾物を、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）またはメラニン化した再構築ヒト表皮の培養培地に加えた。
クラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物０．０５％乾物を、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）またはメラニン化した再構築ヒト表皮の培養培地に加えた。
【0063】
６時間または２４時間のインキュベーションの後に、選択されたマーカーの発現を定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎマイクロ流体カード）により評価した。対照と比較した検討マーカーの発現の変化を相対量（ＲＱ、ＲＱ＞１：増加、ＲＱ＜１：減少）として表した。
【0064】
ｂ．結果：
再構築表皮の遺伝子発現に対するＣＡＰ抽出物の効果を示す最も有意な結果を以下の表１に示す。
再構築表皮の遺伝子発現に対するＣＡＰ抽出物の効果を示す最も有意な結果を以下の表１に示す。
【0065】
【表1】
【0066】
これらの結果は、クラミドモナス・アシドフィラ抽出物が、特定のマーカーの遺伝子発現を変化させることによって、下記の活性において特に注目され得ることを示す傾向がある。
【0067】
脂質合成および表皮バリア機能のリモデリング：
酵素グルコシルセラミダーゼまたはβ－グルコセレブロシダーゼをコードするＧＢＡ／ＧＢＡＰ１遺伝子は、ＣＡＰ処理の６時間後に過剰発現する。
ＲＡＢ１１Ａは、ケラチノサイト内のラメラ体の生合成に関与するＧＴＰアーゼ（Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１１Ａ）をコードする。このことは、表皮バリアの恒常性におけるＲＡＢ１１Ａの重要性を強調する。
酵素グルコシルセラミダーゼまたはβ－グルコセレブロシダーゼをコードするＧＢＡ／ＧＢＡＰ１遺伝子は、ＣＡＰ処理の６時間後に過剰発現する。
ＲＡＢ１１Ａは、ケラチノサイト内のラメラ体の生合成に関与するＧＴＰアーゼ（Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１１Ａ）をコードする。このことは、表皮バリアの恒常性におけるＲＡＢ１１Ａの重要性を強調する。
【0068】
ヒアルロン酸生合成および表皮保水：
ヒアルロナンシンターゼ－２および－３（ＨＡＳ２およびＨＡＳ３）は、ヒアルロン酸（ＨＡ）の合成を担う酵素である。表皮の有棘層および顆粒層におけるＳＬＣ６Ａ６の段階的発現は、乾燥環境において表皮において必要な保水を維持する。
ＰＡＤＩ１、ＢＬＭＨおよびＣＡＳＰ１４遺伝子は、天然保湿因子（ＮＭＦ）の生産に関与する酵素をコードする。
ヒアルロナンシンターゼ－２および－３（ＨＡＳ２およびＨＡＳ３）は、ヒアルロン酸（ＨＡ）の合成を担う酵素である。表皮の有棘層および顆粒層におけるＳＬＣ６Ａ６の段階的発現は、乾燥環境において表皮において必要な保水を維持する。
ＰＡＤＩ１、ＢＬＭＨおよびＣＡＳＰ１４遺伝子は、天然保湿因子（ＮＭＦ）の生産に関与する酵素をコードする。
【0069】
以下の表２は、線維芽細胞における遺伝子発現に対するＣＡＰ抽出物の最も有意な結果を示す。
【0070】
【表2】
【0071】
これらの結果は、以下の領域におけるＣＡＰ抽出物の潜在的活性を示す。
【0072】
皮膚の抗老化：
真皮の線維芽細胞によって産生される３種類のヒアルロナンシンターゼＨＡＳ１、ＨＡＳ２（５．７６ ０．００８）およびＨＡＳ３は、ヒアルロン酸（ＨＡ）の生合成を担っている。
さらに、皮膚老化は線維芽細胞増殖の低下に関連することが示された。増殖因子Ｋｉ－６７の発現の低下は年齢に関連して見られる[Ma et al. 2011 Br. J. Dermatol, 164(3), pp. 479-482]。ＣＡＰ活性剤は、２４時間の処理の後にＭＫＩ６７の発現を増強し、これはその抗老化効果を強化する細胞増殖の潜在的増大を証明する。
皮膚におけるラミンＢ１（ＬＭＮＢ１）の発現は年齢とともに低下することが示されている。
真皮の線維芽細胞によって産生される３種類のヒアルロナンシンターゼＨＡＳ１、ＨＡＳ２（５．７６ ０．００８）およびＨＡＳ３は、ヒアルロン酸（ＨＡ）の生合成を担っている。
さらに、皮膚老化は線維芽細胞増殖の低下に関連することが示された。増殖因子Ｋｉ－６７の発現の低下は年齢に関連して見られる[Ma et al. 2011 Br. J. Dermatol, 164(3), pp. 479-482]。ＣＡＰ活性剤は、２４時間の処理の後にＭＫＩ６７の発現を増強し、これはその抗老化効果を強化する細胞増殖の潜在的増大を証明する。
皮膚におけるラミンＢ１（ＬＭＮＢ１）の発現は年齢とともに低下することが示されている。
【0073】
抗酸化防御：
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１）は、転写因子Ｎｒｆ－２の制御下にあるサイトゾルフラボタンパク質である。ＮＱＯ１は、減少により、キノンからのヒドロキノンの形成を促進し、ラジカル種の生産を防ぐ。
ＨＳＰ７０タンパク質（ＨＳＰＡ１Ａ遺伝子によりコードされる）は、変性タンパク質の凝集を阻害し、それらの再生（再折りたたみ）を促進し、アポトーシス機構の必須のメディエーターを制御するシャペロン分子（熱ショックタンパク質７０）である。
チオレドキシン系は、主要な抗酸化防御系の１つである。チオレドキシンレダクターゼ、の３つのアイソフォームの中で、ＣＡＰ抽出物により調節されるＴＸＮＲＤ１遺伝子によりコードされるアイソフォーム１は最もよく研究されている。
チオレドキシン系の他、ペルオキシレドキシン／スルフィレドキシン系も存在する。ペルオキシレドキシンの中で、ペルオキシレドキシン－６（ＰＲＤＸ６）は、２４時間の処理の後にＣＡＰ抽出物により過剰発現される。これは、過酸化物の存在に対する活性剤の解毒作用を示す。
最後に、ＣＡＰ抽出物は、特定のカルボニルを検知して中和し、従って、それらが細胞および細胞成分を攻撃しないようにするＧＬＯ系の一部であるＧＬＯ１遺伝子を刺激する。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１）は、転写因子Ｎｒｆ－２の制御下にあるサイトゾルフラボタンパク質である。ＮＱＯ１は、減少により、キノンからのヒドロキノンの形成を促進し、ラジカル種の生産を防ぐ。
ＨＳＰ７０タンパク質（ＨＳＰＡ１Ａ遺伝子によりコードされる）は、変性タンパク質の凝集を阻害し、それらの再生（再折りたたみ）を促進し、アポトーシス機構の必須のメディエーターを制御するシャペロン分子（熱ショックタンパク質７０）である。
チオレドキシン系は、主要な抗酸化防御系の１つである。チオレドキシンレダクターゼ、の３つのアイソフォームの中で、ＣＡＰ抽出物により調節されるＴＸＮＲＤ１遺伝子によりコードされるアイソフォーム１は最もよく研究されている。
チオレドキシン系の他、ペルオキシレドキシン／スルフィレドキシン系も存在する。ペルオキシレドキシンの中で、ペルオキシレドキシン－６（ＰＲＤＸ６）は、２４時間の処理の後にＣＡＰ抽出物により過剰発現される。これは、過酸化物の存在に対する活性剤の解毒作用を示す。
最後に、ＣＡＰ抽出物は、特定のカルボニルを検知して中和し、従って、それらが細胞および細胞成分を攻撃しないようにするＧＬＯ系の一部であるＧＬＯ１遺伝子を刺激する。
【0074】
皮膚基質の恒常性：
ＣＡＰ抽出物は、プロテアソームのβ１サブユニットをコードする遺伝子であるＰＳＭＢ１の発現を刺激する。このプロテアソームは、細胞機能を変化させ得る傷害受けたまたは奇形のタンパク質を除去することによって、タンパク質の恒常性の維持に主要な役割を果たす。
ＬＯＸＬ２の遺伝子発現も増強され、この遺伝子は、エラスチンおよびコラーゲン繊維のアセンブリに関与する酵素であるリシルオキシダーゼファミリーの一部である。
ＣＡＰ抽出物は、プロテアソームのβ１サブユニットをコードする遺伝子であるＰＳＭＢ１の発現を刺激する。このプロテアソームは、細胞機能を変化させ得る傷害受けたまたは奇形のタンパク質を除去することによって、タンパク質の恒常性の維持に主要な役割を果たす。
ＬＯＸＬ２の遺伝子発現も増強され、この遺伝子は、エラスチンおよびコラーゲン繊維のアセンブリに関与する酵素であるリシルオキシダーゼファミリーの一部である。
【0075】
ＩＩ．抗炎症作用
Ａ．ＰＭＡ化学ストレスに対する抗炎症活性
ａ．導入：
炎症性応答は、環境の攻撃に対する身体の正常な、即時かつ一過性の応答である。
Ａ．ＰＭＡ化学ストレスに対する抗炎症活性
ａ．導入：
炎症性応答は、環境の攻撃に対する身体の正常な、即時かつ一過性の応答である。
【0076】
しかしながら、特定の病理学的または生理学的状態において、この炎症反応は増悪することがあり、適切に制御されなければ、組織損傷に至り得る。
【0077】
皮膚において、ケラチノサイトは、環境の攻撃に応答した炎症反応の誘発に関与する最初の細胞の１つである。
【0078】
その後、「攻撃を受けた」ケラチノサイトは、
免疫系が関与する反応のカスケードを誘発する一次サイトカイン（ＩＬ１α、ＩＬ１βまたはＴＮＦα）または二次サイトカイン（ＩＬ８）、
プロスタノイドファミリーのメンバーであるプロスタグランジン（ＰＧＥ）。ＰＧＥ２およびその他のＰＧＥの合成に至るプロスタグランジン合成経路は、炎症性刺激により誘発される。
免疫系が関与する反応のカスケードを誘発する一次サイトカイン（ＩＬ１α、ＩＬ１βまたはＴＮＦα）または二次サイトカイン（ＩＬ８）、
プロスタノイドファミリーのメンバーであるプロスタグランジン（ＰＧＥ）。ＰＧＥ２およびその他のＰＧＥの合成に至るプロスタグランジン合成経路は、炎症性刺激により誘発される。
【0079】
本発明によるクラミドモナス・アシドフィラ抽出物の抗炎症活性は、ＰＭＡ（ホルボール１２－ミリスチン酸１３－酢酸）処理によりケラチノサイトに誘発される炎症モデルで評価した。サイトカインＴＮＦαおよびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の放出を分析した。
【0080】
ｂ．材料および方法：
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、実施例１に従い、０．０００１％～０．０５％乾物に含まれる濃度のクラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物で、または抗炎症性参照分子デキサメタゾン０．１μＭまたはインドメタシン０．１μＭ（これら２つの参照はそれぞれサイトカインおよびプロスタグランジンの抗炎症参照として用いる）で２４時間、前処理した。
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、実施例１に従い、０．０００１％～０．０５％乾物に含まれる濃度のクラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物で、または抗炎症性参照分子デキサメタゾン０．１μＭまたはインドメタシン０．１μＭ（これら２つの参照はそれぞれサイトカインおよびプロスタグランジンの抗炎症参照として用いる）で２４時間、前処理した。
【0081】
次に、ＰＭＡ１０μｇ／ｍＬを一晩添加することにより炎症を誘発した。
【0082】
その後、細胞培養上清においてＴＮＦαおよびＰＧＥ２アッセイを行った。
【0083】
結果の有意性を一元配置ＡＮＯＶＡとその後のテューキーの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアバージョン５．０２、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア、サンディエゴ カリフォルニア州 ＵＳＡ）により確認した。
【0084】
ｃ．結果：
１０μｇ／ｍｌのＰＭＡは、ケラチノサイト上清においてＴＮＦαの放出を有意に増加させ、従って、炎症を誘発しなかった。２４時間前処理としての０．１μＭのデキサメタゾンおよび０．１μＭのインドメタシンはＴＮＦα放出を低下させ、これはそれらの抗炎症効果を示し、本試験の妥当性が確認される。
１０μｇ／ｍｌのＰＭＡは、ケラチノサイト上清においてＴＮＦαの放出を有意に増加させ、従って、炎症を誘発しなかった。２４時間前処理としての０．１μＭのデキサメタゾンおよび０．１μＭのインドメタシンはＴＮＦα放出を低下させ、これはそれらの抗炎症効果を示し、本試験の妥当性が確認される。
【0085】
種々の濃度での２４時間前処理としてのクラミドモナス・アシドフィラ抽出物はＴＮＦα放出を有意に低下させ、従って、ＰＭＡに対する抗炎症作用を示した。
【0086】
【表3】
【0087】
１０μｇ／ｍｌのＰＭＡは、ケラチノサイト上清においてＰＧＥ２の放出を有意に増加させ、従って、ＰＭＡは炎症を誘発した。２４時間前処理としての０．１μＭのインドメタシンおよびデキサメタゾンは、ＰＧＥ２の放出を有意に低下させた。よって、これらの２つの参照の抗炎症効果は十分に妥当性が確認された。
【0088】
両濃度での２４時間前処理としてのクラミドモナス・アシドフィラ抽出物はＰＧＥ２の放出を有意に低下させ、従って、ＰＭＡに対する抗炎症作用を示した。
【0089】
【表4】
【0090】
ｄ．結論：
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物の抗炎症効果は、炎症条件下でのＴＮＦαおよびプロスタグランジンＥ２の放出に対するその作用によって実証された。
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物の抗炎症効果は、炎症条件下でのＴＮＦαおよびプロスタグランジンＥ２の放出に対するその作用によって実証された。
【0091】
Ｂ．ニッケルストレスに対する抗炎症活性
ａ．導入
ニッケルは、集団におけるアレルギー性接触皮膚炎の主要な原因であり、世界の有病率はおよそ８．６％である。以下に記載する試験の目的は、ニッケルにより刺激されたケラチノサイトによるＩＬ８の放出に対するＣＡＰ抽出物の効果を評価することである。
ａ．導入
ニッケルは、集団におけるアレルギー性接触皮膚炎の主要な原因であり、世界の有病率はおよそ８．６％である。以下に記載する試験の目的は、ニッケルにより刺激されたケラチノサイトによるＩＬ８の放出に対するＣＡＰ抽出物の効果を評価することである。
【0092】
ｂ．材料および方法
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、０．０１％および０．０５％乾物のＣＡＰ抽出物で、または抗炎症参照分子デキサメタゾン１μＭで２４時間前処理した。次に、このケラチノサイトを１０μＭのニッケル：ＮｉＳＯ４で２４時間処理した。インキュベーションの終了時に、これらの細胞により産生されたＩＬ８の量を上清におけるＥＬＩＳＡによって評価した。
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、０．０１％および０．０５％乾物のＣＡＰ抽出物で、または抗炎症参照分子デキサメタゾン１μＭで２４時間前処理した。次に、このケラチノサイトを１０μＭのニッケル：ＮｉＳＯ４で２４時間処理した。インキュベーションの終了時に、これらの細胞により産生されたＩＬ８の量を上清におけるＥＬＩＳＡによって評価した。
【0093】
アッセイされたＩＬ８の濃度を、ＢＣアッセイにより評価した総細胞内タンパク質の量に対して正規化した。
【0094】
結果の有意性をスチューデントのｔ検定により統計学的に分析した。
【0095】
ｃ．結果
ＣＡＰ抽出物は、ケラチノサイトにおいてニッケルストレスにより誘発されるＩＬ８の放出の有意な低下を誘導する。
ＣＡＰ抽出物は、ケラチノサイトにおいてニッケルストレスにより誘発されるＩＬ８の放出の有意な低下を誘導する。
【0096】
【表5】
【0097】
ｄ．結論
クラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物は、ニッケルにより誘発された炎症ストレスに関して、主要なサイトカインＩＬ８の放出を阻害する。従って、この抽出物は、ニッケルに関連する接触性アレルギーまたは皮膚過敏症に関して注目される。
クラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物は、ニッケルにより誘発された炎症ストレスに関して、主要なサイトカインＩＬ８の放出を阻害する。従って、この抽出物は、ニッケルに関連する接触性アレルギーまたは皮膚過敏症に関して注目される。
【0098】
Ｃ．カドミウムストレスに対する抗炎症活性
ａ．導入
本試験の目的は、ヒトケラチノサイトにおける、カドミウムに代表される重金属ストレスに対するクラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物の抗炎症活性を評価することである。
ａ．導入
本試験の目的は、ヒトケラチノサイトにおける、カドミウムに代表される重金属ストレスに対するクラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物の抗炎症活性を評価することである。
【0099】
ｂ．材料および方法
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、０．００１％および０．０１％乾物のＣＡＰ抽出物で、または抗炎症参照分子インドメタシン０．１μＭで２４時間前処理した。次に、ケラチノサイトを１００μＭのカドミウム：ＣｄＣｌ２で４８時間処理した。インキュベーションの終了時、これらの細胞により産生されたＰＧＥ２の量を上清におけるＥＬＩＳＡによって評価した。
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、０．００１％および０．０１％乾物のＣＡＰ抽出物で、または抗炎症参照分子インドメタシン０．１μＭで２４時間前処理した。次に、ケラチノサイトを１００μＭのカドミウム：ＣｄＣｌ２で４８時間処理した。インキュベーションの終了時、これらの細胞により産生されたＰＧＥ２の量を上清におけるＥＬＩＳＡによって評価した。
【0100】
アッセイされたＰＧＥ２の濃度を、ＢＣアッセイにより評価した総細胞内タンパク質の量に対して正規化した。
【0101】
ｃ．結果
ＣＡＰ抽出物は、ケラチノサイトにおいてカドミウムストレスにより誘発されるＰＧＥ２の放出の低下を誘導する。
ＣＡＰ抽出物は、ケラチノサイトにおいてカドミウムストレスにより誘発されるＰＧＥ２の放出の低下を誘導する。
【0102】
【表6】
【0103】
ｄ．結論
クラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物は、カドミウムストレスにより誘発されるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生を阻害する。よって、この抽出物は、例えば、環境汚染に関して、重金属ストレスから皮膚の保護を提供する。
クラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物は、カドミウムストレスにより誘発されるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生を阻害する。よって、この抽出物は、例えば、環境汚染に関して、重金属ストレスから皮膚の保護を提供する。
【0104】
Ｄ．ＳＤＳストレスに対する抗炎症活性
ａ．導入
クラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物の抗炎症活性を、再構築表皮に対するドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理により誘発される炎症モデルで評価した。
ａ．導入
クラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物の抗炎症活性を、再構築表皮に対するドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理により誘発される炎症モデルで評価した。
【0105】
ｂ．材料および方法
再構築ヒト表皮（ＲＨＥ）を、０．０１％および０．０５％乾物のＣＡＰの存在下で２４時間プレインキュベートした。次に、０．０２５％のＳＤＳを表皮の表面に塗布し、ＣＡＰ抽出物の存在下で再び、２４時間インキュベートした。
再構築ヒト表皮（ＲＨＥ）を、０．０１％および０．０５％乾物のＣＡＰの存在下で２４時間プレインキュベートした。次に、０．０２５％のＳＤＳを表皮の表面に塗布し、ＣＡＰ抽出物の存在下で再び、２４時間インキュベートした。
【0106】
インキュベーションの終了時に、サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を、上清におけるＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【0107】
炎症およびバリアマーカーの遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより評価した。
【0108】
結果の有意性を一元配置ＡＮＯＶＡとその後のテューキーの検定により統計学的に分析した。
【0109】
ｃ．結果
再構築表皮のＳＤＳ処理は、遺伝子レベル（ｑＲＴ－ＰＣＲ、表８）およびタンパク質レベル（ＥＬＩＳＡ、表７）でＴＮＦα発現の増強を誘導する。この炎症誘発効果はまた、ケラチン１（ＫＲＴ１）の発現の低下も伴い（表８）、表皮バリア機能の障害を証明する。
再構築表皮のＳＤＳ処理は、遺伝子レベル（ｑＲＴ－ＰＣＲ、表８）およびタンパク質レベル（ＥＬＩＳＡ、表７）でＴＮＦα発現の増強を誘導する。この炎症誘発効果はまた、ケラチン１（ＫＲＴ１）の発現の低下も伴い（表８）、表皮バリア機能の障害を証明する。
【0110】
これらの条件下、ＣＡＰ抽出物は、有意に、ＴＮＦαの過剰産生を阻害し、ケラチン－１の発現を増強した。
【0111】
【表7】
【0112】
【表8】
【0113】
ｄ．結論
これらの結果により、クラミドモナス・アシドフィラ抽出物の抗炎症能が確認され、外的ストレスからのバリアを保護するその能力を示す。
これらの結果により、クラミドモナス・アシドフィラ抽出物の抗炎症能が確認され、外的ストレスからのバリアを保護するその能力を示す。
【0114】
ＩＩＩ．抗酸化作用
ａ．導入
抗酸化防御の刺激において能力を示した実施例１のクラミドモナス・アシドフィラ抽出物で行った遺伝子発現スクリーニング；酸化ストレスから細胞を保護する能力は、Ｈ２Ｏ２により誘発される酸化ストレスに曝されたケラチノサイトにおける反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生を測定することによって評価した。
ａ．導入
抗酸化防御の刺激において能力を示した実施例１のクラミドモナス・アシドフィラ抽出物で行った遺伝子発現スクリーニング；酸化ストレスから細胞を保護する能力は、Ｈ２Ｏ２により誘発される酸化ストレスに曝されたケラチノサイトにおける反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生を測定することによって評価した。
【0115】
活性剤の抗酸化作用の評価は、培養ケラチノサイトにＤＣＦＨ－ＤＡ（２’，７’－ジクロロフルオレシン二酢酸）を組み込むことによって行う。この分子は、非酸化状態では非蛍光のマーカーである。酸化条件（ここでは、Ｈ２Ｏ２ストレス）下では、ＤＣＦＨ－ＤＡは分解されて、蛍光を発する分子であるＤＣＦとなる。測定される蛍光は、Ｈ２Ｏ２および／または抽出物の存在下で細胞により産生された反応性酸素種の量に比例する。
【0116】
ｂ．材料および方法
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、０．０００１％乾物のＣＡＰ抽出物、１０μＭのケルセチンまたは５００μＭのビタミンＣ（これらの２つの分子は、抗酸化剤参照として用いられる）の存在下で２４時間プレインキュベートした。
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、０．０００１％乾物のＣＡＰ抽出物、１０μＭのケルセチンまたは５００μＭのビタミンＣ（これらの２つの分子は、抗酸化剤参照として用いられる）の存在下で２４時間プレインキュベートした。
【0117】
次に、これらの細胞を０．５ｍＭのＤＣＦＨ－ＤＡの存在下で１時間処理した。
【0118】
酸化は１００μＭのＨ２Ｏ２を２０分間加えることにより誘導される。試験品による２回目の処理をＨ２Ｏ２ストレスと同時に行う（前処理と同じ濃度）。
【0119】
最後に、ＲＯＳ量に相当する蛍光密度（ＤＦＵ）の測定を、マイクロプレートリーダーを用いて行う。
【0120】
結果の有意性を一元配置ＡＮＯＶＡとその後のテューキーの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアバージョン５．０２、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア、サンディエゴ カリフォルニア州 ＵＳＡ）により確認した。
【0121】
ｃ．結果
Ｈ２Ｏ２処理後にＲＯＳ産生の増加が見られ、このモデルの妥当性が確認される。ケルセチンおよびビタミンＣは、Ｈ２Ｏ２処理後のＲＯＳ産生を有意に低下させた。これらの２つの参照の抗酸化作用はこのモデルで妥当性が十分に確認された。
Ｈ２Ｏ２処理後にＲＯＳ産生の増加が見られ、このモデルの妥当性が確認される。ケルセチンおよびビタミンＣは、Ｈ２Ｏ２処理後のＲＯＳ産生を有意に低下させた。これらの２つの参照の抗酸化作用はこのモデルで妥当性が十分に確認された。
【0122】
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、Ｈ２Ｏ２ストレスにより誘導されたＲＯＳの産生を有意に低下させた。
【0123】
【表9】
【0124】
ｄ．結論：
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、Ｈ２Ｏ２により誘導されるストレスに対して抗酸化作用を示した。
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、Ｈ２Ｏ２により誘導されるストレスに対して抗酸化作用を示した。
【0125】
ＩＶ． バリアおよび保水に対する活性
ａ．導入
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物に対して行われ、上記に示した遺伝子発現スクリーニングは、バリアおよび保水に関与する遺伝子マーカーの発現の刺激に対して潜在的効果を示した。本発明者らはケラチノサイトに対するこの効果を確認しようとした。
ａ．導入
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物に対して行われ、上記に示した遺伝子発現スクリーニングは、バリアおよび保水に関与する遺伝子マーカーの発現の刺激に対して潜在的効果を示した。本発明者らはケラチノサイトに対するこの効果を確認しようとした。
【0126】
ｂ．材料および方法
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、０．００１％乾物のＣＡＰ抽出物の存在下で、４８時間インキュベートした。
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、０．００１％乾物のＣＡＰ抽出物の存在下で、４８時間インキュベートした。
【0127】
バリア機能および保水マーカーの遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより評価した。
【0128】
結果を一元配置ＡＮＯＶＡとその後のダネット検定により統計学的に分析した。
【0129】
ｃ．結果
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、それぞれ、表皮脂質およびヒアルロン酸の合成に関与するマーカーＧＢＡ（β－グルコセレブロシダーゼ）およびＨＡＳ３（ヒアルロナンシンターゼ－３）の遺伝子発現を刺激した。これらの結果は、表皮透過性バリアおよび保水の強化の効果を支持して、ゲノム発現スクリーニングに関して得られた傾向が確認される。
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、それぞれ、表皮脂質およびヒアルロン酸の合成に関与するマーカーＧＢＡ（β－グルコセレブロシダーゼ）およびＨＡＳ３（ヒアルロナンシンターゼ－３）の遺伝子発現を刺激した。これらの結果は、表皮透過性バリアおよび保水の強化の効果を支持して、ゲノム発現スクリーニングに関して得られた傾向が確認される。
【0130】
さらに、クラミドモナス・アシドフィラ抽出物はまた、それぞれＴＡＵＴ（タウリン膜輸送体チャネル）およびＳＭＩＴ（ミオイノシトール輸送体チャネル）をコードするマーカーＳＬＣ６Ａ６およびＳＬＣ５Ａ３の発現も刺激した。
【0131】
これらの２つの遺伝子はオスモライト輸送体をコードし、従って、皮膚保水の維持および外的ストレスからの細胞の保護に関与する。
【0132】
最後に、抽出物は、フィラグリン（ＦＬＧ）およびＰＡＤＩ１（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ）、天然保湿因子（ＮＭＦ）要素の合成に関与するタンパク質および酵素の遺伝子発現に増加を誘導した。
【0133】
【表10】
【0134】
ｄ．結論
これらの結果は、クラミドモナス・アシドフィラの抽出物が皮膚バリアおよび皮膚保水の維持の強化に能力を有することを示す。
これらの結果は、クラミドモナス・アシドフィラの抽出物が皮膚バリアおよび皮膚保水の維持の強化に能力を有することを示す。
【0135】
Ｖ． アレルギー機序におけるクラミドモナス・アシドフィラ抽出物の効果の評価
Ａ．導入
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物の潜在的抗アレルギー効果を、
後期「アトピー性皮膚炎」型表現型（慢性炎症）を模倣するＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－４＋ＩＬ－１３＋ＩＬ－２２＋ＴＮＦ－α）の混合物により刺激した正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）における炎症誘発性ケモカイン遺伝子発現、
ｆＭＬＰにより誘導されるヒト好塩基球の活性化。この活性化は、特定のキットおよびフローサイトメトリー分析を用い、ＣＣＲ３マーカーの発現により同定される好塩基球の全集団において、活性化された好塩基球細胞（ＣＤ６３）の特異的マーカー定量することによって測定した。並行して、陽性対照として抗ＦＣεＲＩ抗体による活性化を行った。
Ａ．導入
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物の潜在的抗アレルギー効果を、
後期「アトピー性皮膚炎」型表現型（慢性炎症）を模倣するＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－４＋ＩＬ－１３＋ＩＬ－２２＋ＴＮＦ－α）の混合物により刺激した正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）における炎症誘発性ケモカイン遺伝子発現、
ｆＭＬＰにより誘導されるヒト好塩基球の活性化。この活性化は、特定のキットおよびフローサイトメトリー分析を用い、ＣＣＲ３マーカーの発現により同定される好塩基球の全集団において、活性化された好塩基球細胞（ＣＤ６３）の特異的マーカー定量することによって測定した。並行して、陽性対照として抗ＦＣεＲＩ抗体による活性化を行った。
【0136】
Ｂ． ＴＨ２ストレス後の化学遊走因子の阻害
ａ．材料および方法
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、０．０１％乾物（ＤＭ）のＣＡＰ抽出物または１０μＭの参照ＪＡＫ阻害剤Ｉの存在下で２４時間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、細胞をＣＡＰ抽出物または参照品で再処理した後、細胞をＴｈ２サイトカインカクテル（１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ４＋ＩＬ１３＋ＩＬ２２＋ＴＮＦα）で２４時間刺激した。
ａ．材料および方法
正常ヒト表皮ケラチノサイトを、０．０１％乾物（ＤＭ）のＣＡＰ抽出物または１０μＭの参照ＪＡＫ阻害剤Ｉの存在下で２４時間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、細胞をＣＡＰ抽出物または参照品で再処理した後、細胞をＴｈ２サイトカインカクテル（１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ４＋ＩＬ１３＋ＩＬ２２＋ＴＮＦα）で２４時間刺激した。
【0137】
インキュベーションの終了時に、対象とするマーカーの遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより評価した。
【0138】
ｂ．結果
Ｔｈ２ストレスに曝されたケラチノサイトにおいて、クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、皮膚の炎症応答およびアレルギー応答の増幅に関与するケモカインをコードするＣＣＬ５（Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド５またはＲＡＮＴＥＳ）およびＣＣＬ２７（Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド２７）の遺伝子発現を阻害した。
Ｔｈ２ストレスに曝されたケラチノサイトにおいて、クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、皮膚の炎症応答およびアレルギー応答の増幅に関与するケモカインをコードするＣＣＬ５（Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド５またはＲＡＮＴＥＳ）およびＣＣＬ２７（Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド２７）の遺伝子発現を阻害した。
【0139】
【表11】
【0140】
ｃ．結論
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、ケラチノサイトにおいてＴｈ２ストレスにより誘導された炎症を、化学遊走因子ＣＣＬ５およびＣＣＬ２７の遺伝子発現を阻害することによって調整する。
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、ケラチノサイトにおいてＴｈ２ストレスにより誘導された炎症を、化学遊走因子ＣＣＬ５およびＣＣＬ２７の遺伝子発現を阻害することによって調整する。
【0141】
Ｃ．好塩基球活性化の阻害
ａ．材料および方法
好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）は、Ｆｌｏｗ ＣＡＳＴ（登録商標）キット（ＢＵＨＬＭＡＮＮ、アイテムコードＦＫＣＣＲ）を用いて行った。
ａ．材料および方法
好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）は、Ｆｌｏｗ ＣＡＳＴ（登録商標）キット（ＢＵＨＬＭＡＮＮ、アイテムコードＦＫＣＣＲ）を用いて行った。
【0142】
全血を０．０３３％および０．１％乾物（ＤＭ）のＣＡＰ抽出物または参照品（３０μＭのＳＢ２０２１９０；または１０ｍＭのクロモグリク酸塩）の存在下で１５分間プレインキュベートした。
【0143】
次に、刺激剤１μＭのｆＭＬＰを加え、血液をモノクローナル抗体（抗ＣＤ６３－ＦＩＴＣおよび抗ＣＣＲ３－ＰＥ）の混合物を含有する標識バッファーの存在下でさらに１５分間インキュベートした。
【0144】
次に、好塩基球（ＣＣＲ３＋）および活性化好塩基球（ＣＣＲ３＋／ＣＤ６３＋）の総集団を計数するためにフローサイトメトリー分析を行った。
【0145】
ｂ．結果
ｆＭＬＰペプチドによる刺激は、好塩基球の極めて明瞭な活性化をもたらした（４０．１％活性化細胞、または４５２７％刺激）。
ｆＭＬＰペプチドによる刺激は、好塩基球の極めて明瞭な活性化をもたらした（４０．１％活性化細胞、または４５２７％刺激）。
【0146】
本試験において、２種類の潜在的対照化合物をｆＭＬＰの存在下で試験した：
ｐ３８ＭＡＰキナーゼの阻害剤ＳＢ２０２１９０；このキナーゼの活性化は、脱顆粒をもたらす好塩基球の活性化機序において不可欠である；
作用機序が原形質膜の安定化を含む既知の抗アレルギー剤であるクロモグリク酸、ここで、それはＣａ＋＋の細胞内浸透を阻害し、このイオンは肥満細胞の脱顆粒に不可欠である。
ｐ３８ＭＡＰキナーゼの阻害剤ＳＢ２０２１９０；このキナーゼの活性化は、脱顆粒をもたらす好塩基球の活性化機序において不可欠である；
作用機序が原形質膜の安定化を含む既知の抗アレルギー剤であるクロモグリク酸、ここで、それはＣａ＋＋の細胞内浸透を阻害し、このイオンは肥満細胞の脱顆粒に不可欠である。
【0147】
３０μＭで試験したＳＢ２０２１９０と１０ｍＭで試験したクロモグリク酸塩は両方とも、ｆＭＬＰにより誘導された好塩基球の活性化に有意な阻害効果を示した（それぞれ２６％および４６％阻害）。
【0148】
この試験の実験条件下で、０．０３３％および０．１％で試験したＣＡＰ抽出物は、ｆＭＬＰにより誘導される好塩基球の活性化に明瞭な濃度依存的阻害効果を示した（それぞれ２２％および３９％阻害）。
【0149】
【表12】
【0150】
ｃ．結論
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、好塩基球の活性化を阻害する。
クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、好塩基球の活性化を阻害する。
【0151】
Ｄ．結論
一方で、Ｔｈ２ストレスに曝されたケラチノサイトにおける化学遊走性サイトカインの遺伝子発現を阻害し、他方で、好塩基球の活性化を阻害することにより、クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、アレルギー性応答の誘発に関与するプロセスの調整に寄与する可能性がある。
一方で、Ｔｈ２ストレスに曝されたケラチノサイトにおける化学遊走性サイトカインの遺伝子発現を阻害し、他方で、好塩基球の活性化を阻害することにより、クラミドモナス・アシドフィラ抽出物は、アレルギー性応答の誘発に関与するプロセスの調整に寄与する可能性がある。
【0152】
実施例３： 本発明による抽出物の臨床試験
実施例１で得られたクラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物の生物活性を、以下に記載するような臨床試験によって実証した。
実施例１で得られたクラミドモナス・アシドフィラ（ＣＡＰ）抽出物の生物活性を、以下に記載するような臨床試験によって実証した。
【0153】
これらの結果は総て、「ＣＡＰ」活性剤の有意な効果を示す：
保護効果；
バリア効果；
保湿効果；および
抗炎症性／抗発赤効果。
保護効果；
バリア効果；
保湿効果；および
抗炎症性／抗発赤効果。
【0154】
これらの臨床試験は、
敏感肌；
発赤；
炎症；および
アレルギー
の予防または治療のためのＣＡＰ抽出物の能力を強調した。
敏感肌；
発赤；
炎症；および
アレルギー
の予防または治療のためのＣＡＰ抽出物の能力を強調した。
【0155】
Ａ． 臨床結果の概要
化学的紅斑試験
ＣＡＰ活性剤（３％活性成分）は以下のパラメーターに対して有意な有効性示した：
０．１％ニコチン酸メチル溶液の塗布２０分後の最大紅斑の強度
化学的紅斑試験
ＣＡＰ活性剤（３％活性成分）は以下のパラメーターに対して有意な有効性示した：
０．１％ニコチン酸メチル溶液の塗布２０分後の最大紅斑の強度
【0156】
ＴｉＶｉにより測定される血流強度は、無処置領域に比べて活性剤で処置した領域において有意に低い。
【0157】
分光比色法によって測定される発赤は、無処置領域に比べて活性剤で処置した領域において有意に低い。
【0158】
最大強度紅斑の３０分後の紅斑の変化
ＴｉＶｉにより測定される血流強度の低下は、無処置領域に比べて活性剤で処置した領域において有意に高い。
ＴｉＶｉにより測定される血流強度の低下は、無処置領域に比べて活性剤で処置した領域において有意に高い。
【0159】
分光比色法により測定される発赤の低減は、無処置領域に比べて活性剤で処置した領域において有意に高い。
【0160】
敏感肌試験
ＣＡＰ活性剤（３％活性成分）は以下のパラメーターに対して有意な有効性示した：
機器測定
ＣＡＰ活性剤（３％活性成分）は以下のパラメーターに対して有意な有効性示した：
機器測定
【0161】
活性剤は：
塗布２８日後に経皮水損失を有意に低減する。
塗布２８日後に発赤を有意に低減する。
塗布２８日後に有意に保水を増加させる。
塗布２８日後に経皮水損失を有意に低減する。
塗布２８日後に発赤を有意に低減する。
塗布２８日後に有意に保水を増加させる。
【0162】
生化学的評価
活性剤は、
塗布２８日後にＮＭＦの量を有意に増加させる。
塗布２８日後にプラセボ領域に見られるセラミドの減少を有意に補償する。
塗布２８日後にＩＬ１ＲＡの量を有意に低減する。
塗布２８日後にＩＬ１αの量を有意に低減する。
塗布２８日後にＩＬ１ＲＡ／ＩＬ１α比を有意に低下させる。
塗布２８日後にＩＬ８の量を有意に低減する。
活性剤は、
塗布２８日後にＮＭＦの量を有意に増加させる。
塗布２８日後にプラセボ領域に見られるセラミドの減少を有意に補償する。
塗布２８日後にＩＬ１ＲＡの量を有意に低減する。
塗布２８日後にＩＬ１αの量を有意に低減する。
塗布２８日後にＩＬ１ＲＡ／ＩＬ１α比を有意に低下させる。
塗布２８日後にＩＬ８の量を有意に低減する。
【0163】
Ｂ． ＴｉＶｉによる血流の評価および分光比色法による色の評価によるプラセボに対する活性剤の保護／抗発赤／抗炎症有効性の評価
研究デザイン：
二重盲検試験。
無作為化、活性剤対プラセボ比較試験。
研究デザイン：
二重盲検試験。
無作為化、活性剤対プラセボ比較試験。
【0164】
集団：
本試験では１９名の被験者を分析した。１９名の被験者には２か所の定義された領域に活性剤およびプラセボを塗布した。無処理領域もまた定義した。
本試験では１９名の被験者を分析した。１９名の被験者には２か所の定義された領域に活性剤およびプラセボを塗布した。無処理領域もまた定義した。
【0165】
本試験に動員した個人は、以下の通り：
１８～６０歳、平均年齢３８±３歳、最低１８歳、最高６０歳の健康な女性
白色人種、フォトタイプＩ～ＩＩＩの皮膚を使用。
１８～６０歳、平均年齢３８±３歳、最低１８歳、最高６０歳の健康な女性
白色人種、フォトタイプＩ～ＩＩＩの皮膚を使用。
【0166】
試験の使用および実施の方法
被験者自身による自宅での１日２回（朝と晩）、Ｄ－１４～Ｄ０ｔ０の１４日間、前腕の各定義領域への塗布。１４日後、被験者は臨床施設に戻った。次ぎに、基礎Ｄ０ｔ０測定を行う。製品の最終塗布を行う。次に、０．１％ニコチン酸メチル溶液を用いて各領域に化学的紅斑を誘発させる。次に、紅斑の誘発後、Ｄ０ｔ２０で示される２０分後（最大強度）およびＤ０ｔ５０で示される５０分後（最大紅斑の３０分後）に各領域の測定を行う。
被験者自身による自宅での１日２回（朝と晩）、Ｄ－１４～Ｄ０ｔ０の１４日間、前腕の各定義領域への塗布。１４日後、被験者は臨床施設に戻った。次ぎに、基礎Ｄ０ｔ０測定を行う。製品の最終塗布を行う。次に、０．１％ニコチン酸メチル溶液を用いて各領域に化学的紅斑を誘発させる。次に、紅斑の誘発後、Ｄ０ｔ２０で示される２０分後（最大強度）およびＤ０ｔ５０で示される５０分後（最大紅斑の３０分後）に各領域の測定を行う。
【0167】
評価されるパラメーターについてそれぞれ２つのパラメーターを分析する：
紅斑の外観に対する各製品の予防効果を反映するＤ０ｔ２０～Ｄ０ｔ０の変動。
紅斑の変化に対する各製品の予防効果を反映するＤ０ｔ５０～Ｄ０ｔ２０の変動。
紅斑の外観に対する各製品の予防効果を反映するＤ０ｔ２０～Ｄ０ｔ０の変動。
紅斑の変化に対する各製品の予防効果を反映するＤ０ｔ５０～Ｄ０ｔ２０の変動。
【0168】
ＴＩＶＩによる血流の評価
ＴｉＶｉ ７００により使用される方法は、緑色光は血管細胞に強く吸収されるが、赤色光はあまり吸収されないことに基づく。偏光源を使用することで、この方法は正反射率だけでなく皮膚組織により反射される光を考慮しない。この装置は、各画素が皮膚の血液細胞の密度を表す強度マップを作成する。
ＴｉＶｉ ７００により使用される方法は、緑色光は血管細胞に強く吸収されるが、赤色光はあまり吸収されないことに基づく。偏光源を使用することで、この方法は正反射率だけでなく皮膚組織により反射される光を考慮しない。この装置は、各画素が皮膚の血液細胞の密度を表す強度マップを作成する。
【0169】
→皮膚の血液細胞の密度の強度の低下は抗炎症効果を表す。
【0170】
結果： 紅斑の外観に対する予防効果
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃのグラフは、ＴｉＶｉにより測定されたニコチン酸メチル塗布２０分後の紅斑強度に対する活性剤、プラセボ、および無処置領域間の比較対を表す。
横座標のパラメーターは、血流強度（赤血球密度）を表す。正確な数値は以下の表１３Ａおよび１３Ｂにある（表１３ＡおよびＢ：測定の平均および標準偏差 被験者の％は正の効果を示す。％差およびｐ値（有意性の正確な値）。
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃのグラフは、ＴｉＶｉにより測定されたニコチン酸メチル塗布２０分後の紅斑強度に対する活性剤、プラセボ、および無処置領域間の比較対を表す。
横座標のパラメーターは、血流強度（赤血球密度）を表す。正確な数値は以下の表１３Ａおよび１３Ｂにある（表１３ＡおよびＢ：測定の平均および標準偏差 被験者の％は正の効果を示す。％差およびｐ値（有意性の正確な値）。
【0171】
図２のグラフは、血流値の変化の推移を示す。
【0172】
→結果は、活性剤は、無処置領域に比べて形成される紅斑の強度を有意に低減することを示す。プラセボ領域に対する紅斑の強度は、処置領域と異ならなかった。活性領域の紅斑の強度は、プラセボに比べて有意に低い。
【0173】
【表13】
【0174】
【表14】
【0175】
Ｃ． テヴァメーターによる経皮水分損失評価、コルネオメトリーによる保水評価、スワブ採取による生化学的特性評価によるプラセボに対する活性剤の有効性評価
研究デザイン：
二重盲検試験
活性剤対プラセボ、無作為化、半顔比較試験
研究デザイン：
二重盲検試験
活性剤対プラセボ、無作為化、半顔比較試験
【0176】
集団：
保水、経皮水分損失、色および質問事項の測定に関して、分析に３６名の被験者を含んだ。
保水、経皮水分損失、色および質問事項の測定に関して、分析に３６名の被験者を含んだ。
【0177】
生化学分析に関して、分析に１０名の被験者を含んだ。
【0178】
本試験に動員した被験者は、以下の通り：
１８歳以上、平均年齢５１±３歳、最低２１歳、最高６８歳の健康な女性
白色人種、フォトタイプＩ～ＩＶの皮膚を使用
顔面に敏感肌を有する（被験者の皮膚は以下の３つのストレス：環境、化学的または機械的のうち少なくとも２つに反応していなければならない）
１８歳以上、平均年齢５１±３歳、最低２１歳、最高６８歳の健康な女性
白色人種、フォトタイプＩ～ＩＶの皮膚を使用
顔面に敏感肌を有する（被験者の皮膚は以下の３つのストレス：環境、化学的または機械的のうち少なくとも２つに反応していなければならない）
【0179】
使用方法および試験法：
Ｄ０：
・選択および除外基準の確認
・３０分間の馴化
・各半顔の測定領域の画定
・機器測定および生体サンプル
Ｄ０～Ｄ２８：
・活性剤およびプラセボを１日２回半顔に塗布（朝と晩）
Ｄ２８：
・３０分間の馴化
・機器測定および生体サンプル
Ｄ０：
・選択および除外基準の確認
・３０分間の馴化
・各半顔の測定領域の画定
・機器測定および生体サンプル
Ｄ０～Ｄ２８：
・活性剤およびプラセボを１日２回半顔に塗布（朝と晩）
Ｄ２８：
・３０分間の馴化
・機器測定および生体サンプル
【0180】
経皮水分損失評価
皮膚バリアは蒸発によって水分損失を調節する。このバリアが傷害を受けると、経皮水分損失が増す。逆に、バリアの強化は経皮水分損失の減少に相当する。
皮膚バリアは蒸発によって水分損失を調節する。このバリアが傷害を受けると、経皮水分損失が増す。逆に、バリアの強化は経皮水分損失の減少に相当する。
【0181】
経皮水分損失は、テヴァメーターＴＭ ３００によって測定した。この原理は、その開口部の一方を皮膚に適用して、２か所の異なる高さに配置された２つのセンサーによりチューブ内の温度および相対湿度を測定することである。その後、フィックの法則を用いて経皮水分損失を決定する。
【0182】
Ｄ０およびＤ２８のＴＥＷＬ測定に関して得られた結果を表１４に示す。変化のグラフを図３に示す。
【0183】
【表15】
【0184】
得られた結果は、ＴＥＷＬは活性剤とプラセボとで、Ｄ０とＤ２８の間に有意に低下することを示す。活性剤で見られたＤ０とＤ２８の間の変化をプラセボで得られた変化と比較すると、活性剤を支持して統計的に有意である。
【0185】
保水評価
皮膚保水の測定をＣＭ ８２５コルネオメーターにより行った。この装置は、皮膚の表在層（深さ１０～２０μＭ）の保水の測定を可能とする容量測定の原理に基づく。
皮膚保水の測定をＣＭ ８２５コルネオメーターにより行った。この装置は、皮膚の表在層（深さ１０～２０μＭ）の保水の測定を可能とする容量測定の原理に基づく。
【0186】
Ｄ０およびＤ２８に保水に関して得られた結果を表１５に示す。変化のグラフを図４に示す。
【0187】
得られた結果は、活性剤を用いた場合にはＤ０とＤ２８の間に保水が有意に増すが、これはプラセボでは異なることを示す。活性剤で見られたＤ０とＤ２８の間の変化とプラセボで見られた変化を比較すると、活性剤を支持して統計的に有意である。
【0188】
【表16】
【0189】
生化学的評価
以下の生化学的評価を行った：
スワブサンプルから：
・ＵＶ検出と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＵＶ）による天然保湿因子（ＮＭＦ）。ＮＭＦの量は、ウロカニン酸（ＵＣＡ）、ピロリドンカルボン酸（ＰＣＡ）およびセリンを含む。ＮＭＦ含量は、皮膚の保水状態に関する情報を提供する。
・質量分析検出と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）によるセラミド。
セラミドの量は、［Ｓ］、［ＤＳ］および［Ｐ］塩基を有するセラミドを含む。セラミド含量は、皮膚バリアの状態に関する情報を提供する。
・サイトカインの定量（ＥＬＩＳＡによる）による炎症状態
ＩＬ１ＲＡ
ＩＬ１α
ＩＬ８
Ｄ－Ｓｑｕａｍｅｓサンプルから：
・ナイルレッド／インボルクリン染色
以下の生化学的評価を行った：
スワブサンプルから：
・ＵＶ検出と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＵＶ）による天然保湿因子（ＮＭＦ）。ＮＭＦの量は、ウロカニン酸（ＵＣＡ）、ピロリドンカルボン酸（ＰＣＡ）およびセリンを含む。ＮＭＦ含量は、皮膚の保水状態に関する情報を提供する。
・質量分析検出と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）によるセラミド。
セラミドの量は、［Ｓ］、［ＤＳ］および［Ｐ］塩基を有するセラミドを含む。セラミド含量は、皮膚バリアの状態に関する情報を提供する。
・サイトカインの定量（ＥＬＩＳＡによる）による炎症状態
ＩＬ１ＲＡ
ＩＬ１α
ＩＬ８
Ｄ－Ｓｑｕａｍｅｓサンプルから：
・ナイルレッド／インボルクリン染色
【0190】
ＮＭＦ
Ｄ０およびＤ２８にＮＭＦに関して得られた結果を表１６に示す。変化のグラフを図５に示す。
Ｄ０およびＤ２８にＮＭＦに関して得られた結果を表１６に示す。変化のグラフを図５に示す。
【0191】
得られた結果は、活性剤を用いた場合にはＤ０とＤ２８の間にＮＭＦの量が有意に増すものの、プラセボはこの量を有意に低下させることを示す。活性剤で見られたＤ０とＤ２８の間の変化をプラセボで見られた変化と比較すると、活性剤を支持して統計的に有意である。
【0192】
【表17】
【0193】
セラミド
Ｄ０およびＤ２８においてセラミドに関して得られた結果を表１７に示す。変化のグラフを図６に示す。
Ｄ０およびＤ２８においてセラミドに関して得られた結果を表１７に示す。変化のグラフを図６に示す。
【0194】
得られた結果は、プラセボを用いた場合にセラミド量は低下し、活性剤がこの低下を補償する（プラセボおよび活性剤のＤ０とＤ２８の間の変化は有意でない）ことを示す。活性剤を用いた場合に見られるＤ０とＤ２８の間の変化を、プラセボを用いた場合に見られる変化と比較すると、活性剤を支持して統計的に有意である。
【0195】
【表18】
【0196】
ＩＬ１ＲＡ
Ｄ０およびＤ２８においてＩＬ１ＲＡに関して得られた結果を表１８に示す。変化のグラフを図７に示す。
Ｄ０およびＤ２８においてＩＬ１ＲＡに関して得られた結果を表１８に示す。変化のグラフを図７に示す。
【0197】
得られた結果は、活性剤およびプラセボを用いた場合、Ｄ０とＤ２８の間にＩＬ１ＲＡ量が有意に低下することを示す。活性剤を用いた場合に見られるＤ０とＤ２８の間の変化を、プラセボを用いた場合に見られる変化と比較すると、活性剤を支持して統計的に有意である。
【0198】
【表19】
【0199】
ナイルレッド／インボルクリン比
Ｄ０およびＤ２８においてナイルレッド／インボルクリン比に関して得られた結果を表１９に示す。変化のグラフを図８に示す。
Ｄ０およびＤ２８においてナイルレッド／インボルクリン比に関して得られた結果を表１９に示す。変化のグラフを図８に示す。
【0200】
得られた結果は、活性剤を用いた場合およびプラセボで、Ｄ０とＤ２８の間でナイルレッド／インボルクリン比は有意に変わらないことを示す。活性剤を用いた場合に見られるＤ０とＤ２８の間の変化を、プラセボを用いた場合に見られる変化と比較すると、活性剤を支持して統計的に有意である。
【0201】
【表20】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【手続補正書】
【提出日】2024-11-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抽出物の総重量に対して表されるパーセンテージとして少なくとも２０重量％のペプチドを含んでなる少なくとも１つの酵素加水分解工程を含んでなる調製方法により得られる微小藻類クラミドモナス・アシドフィラのペプチド抽出物。
【外国語明細書】