特開 2025-16579 ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを使用してゲノム工学における特異性を改善する組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025016579

(43)【公開日】2025-02-04

(54)【発明の名称】ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを使用してゲノム工学における特異性を改善する組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20250128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250128BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/09 110

C12N9/22

C12N15/62 Z

C12N15/113 Z

【審査請求】有

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024188133

(22)【出願日】2024-10-25

(62)【分割の表示】P 2021102505の分割

【原出願日】2016-08-25

(31)【優先権主張番号】62/209,466

(32)【優先日】2015-08-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】507189666

【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100137626

【弁理士】

【氏名又は名称】田代 玄

(72)【発明者】

【氏名】ジョセフス エリック

(72)【発明者】

【氏名】コチャック デヴラン

(72)【発明者】

【氏名】マルスツァレク ピョートル

(72)【発明者】

【氏名】ガーズバック チャールズ エイ

(57)【要約】

【課題】最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法の提供。
【解決手段】本明細書で開示するのは、最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに、標的結合特異性の増大とオフターゲット結合の低下を有する前記最適化されたｇＲＮＡを設計および使用する方法である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法であって、
ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；
ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；
ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；
ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程であって、前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である、工程と；
ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程であって、ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される、工程と；ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；
ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、前記第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；
ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；
ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程と
を含む方法。

【請求項2】

最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法であって、
ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；
ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；
ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；
ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程であって、前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である、工程と；
ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程であって、ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される、工程と；ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；
ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、前記第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；
ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；
ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程と
を含む方法。

【請求項3】

前記異なるｇＲＮＡのさらなる侵入のエネルギー特性が、（Ｉ）ＤＮＡ－ＤＮＡ塩基対合を切断すること、（ＩＩ）ＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対を形成すること、（ＩＩＩ）侵入されていないガイドＲＮＡ内の異なる二次構造を破壊することまたは形成することから生じるエネルギー差、および（ＩＶ）プロトスペーサーと相補的である置き換えられたＤＮＡ鎖と、二次構造には含まれないいずれかの非対合ガイドＲＮＡヌクレオチドとの間の相互作用を形成することまたは破壊することのうちの少なくとも１つのエネルギー特性を決定することによって決定される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１のｇＲＮＡの、前記プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列への再アニーリングのエネルギー特性が、（Ｉ）ＤＮＡ－ＤＮＡ塩基対合を形成すること、（ＩＩ）ＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対を切断すること、（ＩＩＩ）新たに侵入されていないガイドＲＮＡ内の異なる二次構造を破壊することまたは形成することから生じるエネルギー差、および（ＩＶ）プロトスペーサーと相補的である置き換えられたＤＮＡ鎖と、二次構造には含まれないいずれかの非対合ガイドＲＮＡヌクレオチドとの間の相互作用を形成することまたは破壊することのうちの少なくとも１つのエネルギー特性を決定することによって決定される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

（Ｖ）ミスマッチにわたる塩基対合、（ＶＩ）Ｃａｓ９タンパク質との相互作用、および／または（ＶＩＩ）追加のヒューリスティクスであって、結合寿命、侵入の程度、侵入するガイドＲＮＡの安定性、またはＣａｓ９切断活性に対するｇＲＮＡ侵入の、他の算出される／シミュレーションされる特性に関する追加のヒューリスティクスのうちの少なくとも１つから、エネルギー的考察を決定することをさらに含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記完全長ｇＲＮＡが、約１５から２０個のヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項7】

Ｍが、１から２０である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項8】

Ｍが、４から１０である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ＲＮＡセグメントが、プロトスペーサー－ターゲティング配列を補完する２から１５個のヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項10】

Ｎが、１から２０である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項11】

Ｎが、３から１０である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＲＮＡセグメントおよび／またはプロトスペーサー－ターゲティング配列が、二次構造を提供する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項13】

前記二次構造が、前記プロトスペーサー－ターゲティング配列を、前記ＲＮＡセグメントと部分的にハイブリッド形成させることによって形成される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記二次構造が、前記最適化されたｇＲＮＡによるプロトスペーサー二重鎖またはオフターゲット二重鎖の侵入を妨害することによって、Ｃａｓ９によるＤＮＡ結合または切断を調節する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記二次構造が、前記ＲＮＡセグメントの全体または一部を、プロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントの５’末端のヌクレオチド、プロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントの中央のヌクレオチド、および／またはプロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントの３’末端のヌクレオチドにハイブリッド形成させることによって形成される、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記二次構造が、ヘアピンである、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

前記二次構造が、室温または３７℃で安定である、請求項１２に記載の方法。

【請求項18】

前記二次構造の全平衡自由エネルギーが、室温または３７℃で約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である、請求項１２に記載の方法。

【請求項19】

前記ＲＮＡセグメントが、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントの少なくとも２つのヌクレオチドとハイブリッド形成する、またはこれらのヌクレオチドと共に非標準塩基対を形成する、請求項１２に記載の方法。

【請求項20】

前記非標準塩基対が、ｒＵ－ｒＧである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記最適化されたｇＲＮＡが、細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と共に使用される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項22】

前記二次構造が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系内の最適化されたｇＲＮＡを保護して、細胞内での分解を予防する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項23】

１～２０個のヌクレオチドが、リンカー内でランダム化される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項24】

１～２０個のヌクレオチドが、ＲＮＡセグメント内でランダム化される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項25】

ステップ（ｇ）が、Ｘ回繰り返され、それによって、Ｘ個のｇＲＮＡが産生され、それぞれのＸ個のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）が繰り返され、ここで、Ｘは、０から２０である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項26】

前記侵入速度論および寿命が、動的モンテカルロ法またはＧｉｌｌｅｓｐｉｅアルゴリズムを使用して算出される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項27】

前記侵入速度論が、前記ガイドＲＮＡが、前記プロトスペーサー二重鎖に、前記プロトスペーサーが完全に侵入されるような完全な侵入まで侵入する速度、および／または、ｇＲＮＡに結合されたプロトスペーサーＤＮＡのセグメントが、その相補鎖から置き換えられ、そのＰＡＭ近位領域から、完全な侵入まで、ヌクレオチドごとにｇＲＮＡに結合するにつれて伸長する速度である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項28】

前記設計基準が、特異性、結合寿命の調節、および／または推定される切断特異性を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項29】

前記設計基準が、オンターゲット部位に対する完全長ｇＲＮＡの結合寿命以上の結合寿命、および／または、オフターゲット部位に対する完全長ｇＲＮＡの結合寿命以下の結合寿命を有する最適化されたｇＲＮＡを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記設計基準が、少なくとも３つのオフターゲット部位であって、最も近いオフターゲット部位であると予測される、またはオンターゲット部位に対する最も高い同一性を有すると予測されるオフターゲット部位に対する完全長ｇＲＮＡの結合寿命以下の結合寿命を有する最適化されたｇＲＮＡを含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記設計基準が、オフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡの寿命または切断速度以下であるオフターゲット部位での寿命または切断速度、および／または、完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡの予測されるオンターゲット活性率の１０％超である、予測されるオンターゲット活性率を含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記最適化されたｇＲＮＡが、ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ、次世代シーケンシング技術、またはＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを使用して、ステップｉ）において試験される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項33】

前記最適化されたｇＲＮＡが、オフターゲット部位での結合を最小にし、かつプロトスペーサー配列に結合させるように設計される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項34】

前記オフターゲット部位が、公知であるまたは予測されるオフターゲット部位である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項35】

前記完全長ｇＲＮＡが、哺乳類遺伝子を標的にする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項36】

前記標的遺伝子が、内在性標的遺伝子または導入遺伝子を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項37】

前記標的遺伝子が、疾患関連遺伝子を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項38】

前記標的遺伝子が、ＤＭＤ、ＥＭＸ１、またはＶＥＧＦＡ遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項39】

前記ＶＥＧＦＡ遺伝子が、ＶＥＧＦＡ１またはＶＥＧＦＡ３である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

請求項１または２に記載の方法によって産生された最適化されたｇＲＮＡ。

【請求項41】

前記ｇＲＮＡが、オンターゲット部位とオフターゲット部位とを、これらの部位間の最小熱力学的エネルギー差を用いて識別することができる、請求項４０に記載の最適化されたｇＲＮＡ。

【請求項42】

前記最適化されたｇＲＮＡが、プロトスペーサーへのストランド侵入を調節する、請求項４０に記載の最適化されたｇＲＮＡ。

【請求項43】

前記最適化されたｇＲＮＡが、配列番号１４９～３１５、３２１～３２３、および３２６～３２９のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の最適化されたｇＲＮＡ。

【請求項44】

請求項４０に記載の最適化されたｇＲＮＡをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項45】

請求項４４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項46】

請求項４４に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項４５に記載のベクターを含む細胞。

【請求項47】

請求項４４に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項４５に記載のベクター、または請求項４６に記載の細胞を含むキット。

【請求項48】

標的細胞または対象におけるエピゲノム編集の方法であって、細胞または対象を、有効量の請求項４０に記載の最適化されたｇＲＮＡ分子および融合タンパク質と接触させる工程を含み、前記融合タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む方法。

【請求項49】

標的細胞または対象における部位特異的ＤＮＡ切断の方法であって、細胞または対象を、有効量の請求項４０に記載の最適化されたｇＲＮＡ分子および融合タンパク質またはＣａｓ９タンパク質と接触させる工程を含み、前記融合タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む方法。

【請求項50】

細胞におけるゲノム編集の方法であって、前記細胞に、有効量の請求項４０に記載の最適化されたｇＲＮＡ分子および融合タンパク質を投与する工程を含み、前記融合タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む方法。

【請求項51】

前記ゲノム編集が、変異遺伝子を修正することまたは導入遺伝子を挿入することを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

変異遺伝子を修正することが、変異遺伝子を欠失させること、再編成させること、または置き換えることを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

変異遺伝子を修正することが、ヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合または相同組換え修復を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

細胞における遺伝子発現を調節する方法であって、前記細胞を、有効量の請求項４０に記載の最適化されたｇＲＮＡ分子および融合タンパク質と接触させる工程を含み、前記融合タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む方法。

【請求項55】

少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子発現が、前記少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子発現レベルが前記少なくとも１つの標的遺伝子についての正常な遺伝子発現レベルと比較して増大または低下される場合に調節される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記融合タンパク質が、ｄＣａｓ９ドメインおよび転写活性化因子を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

前記融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記融合タンパク質が、ｄＣａｓ９ドメインおよび転写抑制因子を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項59】

前記融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記融合タンパク質が、ｄＣａｓ９ドメインおよび部位特異的ヌクレアーゼを含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項61】

前記最適化されたｇＲＮＡが、ポリヌクレオチド配列によってコードされ、レンチウイルスベクターにパッケージングされる、請求項４８～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記レンチウイルスベクターが、前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記最適化されたｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターが、誘導性である、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記レンチウイルスベクターが、前記Ｃａｓ９タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項65】

前記少なくとも１つの標的遺伝子が、疾患関連遺伝子である、請求項４８～６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

前記標的細胞が、真核細胞である、請求項４８～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記標的細胞が、哺乳類細胞である、請求項４８～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

前記標的細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項４８～６７のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１５年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／２０９，４６６号明細書に対する優先権を主張する。

【0002】

政府の権利の陳述
本発明は、アメリカ国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって拠出された連邦政府助成金第ＭＣＢ１２４４２９７号および第ＣＢＥＴ１１５１０３５号、ならびにアメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって拠出された連邦政府助成金第Ｆ３２ＧＭ１１２５０２０１号、第Ｒ０１ＤＡ０３６８６５号、および第ＤＰ２ＯＤ００８５８６号に基づいて、政府支援の下で行われた。政府は、本発明に対する一定の権利を有する。

【0003】

本開示は、最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびに、標的結合特異性の増大とオフターゲット結合の低下を有する前記ｇＲＮＡを設計および使用する方法を対象とする。

【背景技術】

【0004】

ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、特にタンパク質Ｃａｓ９は、これが、一本鎖「ガイドＲＮＡ」分子によって、ほとんどあらゆる配列を有するＤＮＡを切断するように誘導することができるので、潜在的な「完璧なゲノム工学ツール」として称賛されている。この能力は、いくつかの新たに出現しつつある生物および医療用途のために近年利用され、非常に大きな興奮とその将来の使用の有望性がもたらされている。しかし、実際のゲノム工学は、オフターゲットＤＮＡが、意図せずに損傷および変異されるようにならないように、厳密なＤＮＡ配列を選択的に標的にしてこれを切断する能力の、極めて正確な制御を必要とする。

【0005】

Ｃａｓ９は、原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いた、短い回文配列リピート）のエンドヌクレアーゼ－侵入する外来ＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ関連の（Ｃａｓ）応答である。この応答中、Ｃａｓ９は、最初にＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）：トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）二重鎖によって結合され、次いで、ｃｒＲＮＡの可変の２０ｂｐセグメントと相補的な２０塩基対（ｂｐ）の「プロトスペーサー」部位を含有するＤＮＡを切断するように誘導される（図１Ａ）。一本鎖－ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と結合されて、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体は、プロトスペーサーの直後にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ、本明細書では「ＴＧＧ」）が続くという条件で、標的とされるＤＮＡ内の２０ｂｐの「プロトスペーサー」配列と結合する。結合後、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、プロトスペーサー内に二本鎖切断（三角形）を生じる。基本的に、Ｃａｓ９が標的にすることができる配列に対する唯一の制約は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合の「ＮＧＧ」などの短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、外来ＤＮＡ分子におけるプロトスペーサー部位のすぐ後に続かなければならないことである。結晶学的および生化学的実験の解析は、プロトスペーサー結合および切断における特異性が、最初にＣａｓ９タンパク質自体によるＰＡＭ部位の認識、続いて結合したＲＮＡ複合体によるストランド侵入、およびプロトスペーサーとの直接的ワトソン－クリック塩基対合を通して与えられることを示唆している（図１Ａ）。

【0006】

Ｃａｓ９が、ほとんどあらゆるＤＮＡ部位を標的にするために、一本鎖ＲＮＡヘアピンによってモジュール的に「プログラム」される能力は、近年、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系がいくつかの異種生物工学用途に再び充てられた後、非常に大きな興奮をもたらしてきた。特に、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖の必須成分と組み合わせられて単一の機能性分子となる、一本鎖－ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ヘアピンが設計されている。このｓｇＲＮＡを用いて、Ｃａｓ９は、著しく容易なゲノム工学のために、様々な生物に導入されて、インビボで標的とされる二本鎖切断を生じることができる。ヌクレアーゼ－ｎｕｌｌ Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、「ｄＣａｓ９」としても公知である）およびキメラｄＣａｓ９誘導体はまた、プロモーター部位でまたはプロモーター部位の近くで、インビボで、標的とされる結合を介する遺伝子発現を変更するために、また、標的とされるエピジェネティック修飾を導入するために使用されている。

【0007】

実際には、Ｃａｓ９によるオフターゲット結合および切断が、その潜在的使用に悪影響を及ぼす可能性があるので、問題である。Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９活性の特異性を改善するために、かなりの取り組みが行われている。第１に、最も幅広い取り組みは、ゲノム内に類似の他の配列を伴わない標的配列の賢明な選択によって大きく達成されるが、最近の調査では、これらの方法は、オフターゲット切断を予測する能力が不十分で実施されることが判明した。さらに、ＰＡＭまたはプロトスペーサー結合における特異性を調節または増大することが判明した点変異の導入を通して、タンパク質それ自体を直接的に操作することに対する取り組みが行われている。二本鎖ＤＮＡ切断を実施するのではなくＤＮＡの一本鎖に切れ目を入れるだけのＣａｓ９誘導体も、互いに二本鎖切断を生じるのに十分に近い複数の部位でオフターゲットに切れ目が入れられる可能性が極めて稀であるだろうという仮定の下で、一対で（「ペアードニッカーゼ」）使用される。最後に、より大きな特異性を実現することを目指して、ガイドＲＮＡバリアントそれ自体を産生するいくつかの研究が行われている。プロトスペーサー以降のさらなるヌクレオチドを補完するためにガイドＲＮＡへの５’－伸長部が付加される、以前の取り組みは、インビボでのＣａｓ９切断特異性の増大を示さなかった。それどころか、これは、生細胞内で消化されて、ほぼその標準の長さまで戻ってしまった（図１Ａ）。ゲノム工学における用途について、特に治療用途については、オフターゲットＤＮＡが損傷されない、また、不正な変異が起こらないように、遺伝子ターゲティングにおける極度の特異性が必要とされる。しかし、実際には、その潜在的使用に悪影響を及ぼす可能性がある、Ｃａｓ９によるオフターゲット結合および切断のいくつかの報告が存在している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、オフターゲット結合を減少させる、かつヌクレアーゼ特異性を増大させる必要性が、依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法を対象とする。この方法は、ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程と（前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である）；ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程と（ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される）；ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、この第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程とを含む。

【0010】

本発明は、最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法を対象とする。この方法は、ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程と（前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である）；ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程と（ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される）；ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、この第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程とを含む。

【0011】

本発明は、上に記載した方法によって産生される最適化されたｇＲＮＡを対象とする。

【0012】

本発明は、上に記載した最適化されたｇＲＮＡをコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とする。

【0013】

本発明は、上に記載した単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを対象とする。

【0014】

本発明は、上に記載した単離されたポリヌクレオチドまたは上に記載したベクターを含む細胞を対象とする。

【0015】

本発明は、上に記載した単離されたポリヌクレオチド、上に記載したベクター、または上に記載した細胞を含むキットを対象とする。

【0016】

本発明は、標的細胞または対象におけるエピゲノム編集の方法を対象とする。この方法は、細胞または対象を、有効量の上に記載した最適化されたｇＲＮＡ分子および融合タンパク質と接触させる工程を含み、前記融合タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む。

【0017】

本発明は、標的細胞または対象における部位特異的ＤＮＡ切断の方法を対象とする。この方法は、細胞または対象を、有効量の上に記載した最適化されたｇＲＮＡ分子および融合タンパク質またはＣａｓ９タンパク質と接触させる工程を含み、前記融合タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む。

【0018】

本発明は、細胞におけるゲノム編集の方法を対象とする。この方法は、細胞に、有効量の上に記載した最適化されたｇＲＮＡ分子および融合タンパク質を投与する工程を含み、前記融合タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む。

【0019】

本発明は、細胞における遺伝子発現を調節する方法を対象とする。この方法は、細胞を、有効量の上に記載した最適化されたｇＲＮＡおよび融合タンパク質と接触させる工程を含み、前記融合タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1A-1D】ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座由来の単一のストレプトアビジン標識されたＤＮＡ分子内のプロトスペーサー配列で結合したｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡの原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）像を示す（図１Ｂ）。一連の完全に相補的および部分的に相補的なプロトスペーサー配列を伴って設計された、ＡＡＶＳ１由来の（図１Ｃ）または遺伝子改変されたＤＮＡ基質（図１Ｄ）に沿った、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡによって占有された結合されたＤＮＡの割合を示す。縦軸は、それぞれの重要な特徴がそれぞれの基質上に位置する（２３ｂｐ）セグメントを表す。

【図2A-2B】ガイドＲＮＡバリアントによる結合親和性および特異性の調節を示す。図２Ａは、その５’末端から２ヌクレオチドが切り詰められた一本鎖ガイドＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ、紫色）に結合されたｄＣａｓ９の模式図を示す。図２Ｂは、５’末端伸長部を伴い、そのターゲティング領域のＰＡＭ遠位結合セグメントを有するヘアピンを形成する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｈｐ－ｇＲＮＡ、青色）に結合されたｄＣａｓ９の模式的な提案される機構を示す。

【図2C-2D】図２Ｃは、遺伝子改変されたＤＮＡ基質（図１Ｄ参照）に沿った、ｔｒｕ－ｇＲＮＡ（紫色、ｎ＝２５７）を伴うｄＣａｓ９についての単一部位結合親和性（Ｋ_A）を示す。破線は、比較のための、ｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡの単一部位親和性を示す。図２Ｄは、プロトスペーサーの最後の６個（ｈｐ６－ｇＲＮＡ、青色）または１０個（ｈｐ１０－ｇＲＮＡ、緑色）のＰＡＭ遠位ヌクレオチドと相補的なヌクレオチドとオーバーラップする５’－ヘアピンを有するガイドＲＮＡを伴うｄＣａｓ９についての単一部位結合親和性（Ｋ_A）を示す。

【図3A-3B】Ｃａｓ９が、プロトスペーサー配列にマッチしつつある部位に結合するにつれて、進行性の立体構造遷移を受けることを示す。図３Ａは、ＤＮＡ基質に沿った、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９によって占有された結合されたＤＮＡの割合を示し、色は、その構造に従って（アライメント後の平均２乗差によって（本文参照））クラスター化されたＣａｓ９／ｄＣａｓ９の集団を表す。Ｃａｓ９／Ｃａｓ９構造特性の部位特異的分析のために使用されたＤＮＡ上の異なる特徴は、非特異的配列（α；「２０ＭＭ」）、プロトスペーサー内に１０個のＰＡＭ遠位ミスマッチを含有する部位（β、「１０ＭＭ」）、プロトスペーサー内に５個のＰＡＭ遠位ミスマッチを含有する部位（γ、「５ＭＭ」）、または完全なプロトスペーサー部位（ｄＣａｓ９またはＣａｓ９についてそれぞれδまたはε；「０ＭＭ」）として標識した。図３Ｂは、各タンパク質が割り当てられるクラスターによって色分けされた、観察されたＣａｓ９／ｄＣａｓ９の高さに対する体積を示す。破線は、凝集体からなる可能性が高い領域（右上）またはストレプトアビジン標識を吸着した近くのＤＮＡ（左下）を線で示す。比較のために－ストレプトアビジン末端標識の平均高さ：０．９２ｎｍ±０．００６ｎｍ（ＳＥＭ）；ストレプトアビジン末端標識の平均体積：０．１１０^χ１０⁴ｎｍ³±０．００２^χ１０⁴ｎｍ³（ＳＥＭ）；ｎ＝１９４１。

【図3C-3D】主要なクラスターのアンサンブル平均を、図３Ｃに示し、これらが表すクラスター化された構造に従って色分けした。図３Ｄは、基質上の各特徴に結合した、ｓｇＲＮＡ（赤丸、Ｃａｓ９については赤色標識、およびｄＣａｓ９については青色標識）またはｔｒｕ－ｇＲＮＡ（紫色丸）を伴うＣａｓ９／ｄＣａｓ９の平均体積および高さを示す。ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９が、５ＭＭおよび１０ＭＭ部位の最初の３または８個のＰＡＭ遠位ミスマッチ（ここで、それぞれ、「３ＭＭ」および「８ＭＭ」と標識される）と相互作用すると予想されるに過ぎないことに留意されたい。平均体積および高さの標準誤差については、表２を参照のこと。ｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９／ｄＣａｓ９については、各特徴でのその構造特性は、統計的に異なる（δ－ε、α－ε：ｐ＜０．０５；α－β：ｐ＜０．００５；β－γ、γ－δ：ｐ＜＜０．０００５。ホテリングのＴ²検定）。

【図4A-4C】異なるガイドＲＮＡバリアントについての、安定的に結合されたＣａｓ９内の、Ｒループの安定性または侵入するガイドＲＮＡと共にプロトスペーサー二重鎖によって形成される構造の差を明らかにする、動的モンテカルロ（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ）（ＫＭＣ）実験を示す。図４Ａは、ＫＭＣ実験についてのガイドＲＮＡ（赤色）によるプロトスペーサー（緑色）のストランド侵入の模式図を示す。Ｒループは強調されている。侵入についての遷移速度（ｖ_f、速度について、ｍ→ｍ＋１、ここでは、ｍは、ストランド侵入の程度、すなわち、同等には、Ｒループの長さである）、または二重鎖再アニーリング（ｖ_r、速度について、ｍ→ｍ－１）は、最近接ＤＮＡ：ＤＮＡおよびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションエネルギーの関数である。詳細については、本文および補足の方法を参照されたい。図４Ｂは、Ｒループが、ＫＭＣ実験から得られるｓｇ－ＲＮＡ（赤色）またはｔｒｕ－ｇＲＮＡ（紫色）に対して、「平衡状態で」サイズｍのものである時間比を示す（シミュレーションは、それぞれｍ＝２０または１８で開始した）。シミュレーションは、ｔ≧１０，０００（任意単位）まで実行する。図４Ｃは、完全な侵入後の、ｓｇＲＮＡ（赤色）およびｔｒｕ－ｇＲＮＡ（紫色）についてのＲループ「揺らぎ（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）」の動的モンテカルロ時間経過を示す（シミュレーションは、それぞれｍ＝２０または１８で開始した）。アスタリスクは、シミュレーションの開始位置を強調する。（挿入図）Ｒループが≧１６ｂｐ長である、それぞれの寿命のヒストグラム。

【図4D】図４Ｄは、ＡＦＭ画像化および動的モンテカルロ（ＫＭＣ）実験（本文参照）の結果に基づく、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９特異性を支配している機構についての提案されるモデルを示す。Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９は、ＰＡＭに結合し、ガイドＲＮＡが、ＰＡＭ隣接プロトスペーサー二重鎖に侵入する。このストランド侵入中、ガイドＲＮＡは、プロトスペーサーの相補鎖を置き換えることになる。侵入と二重鎖の再アニーリングとの競合が、動的な（「揺らぎ」）Ｒループ構造をもたらす。プロトスペーサー－ガイドＲＮＡ相互作用の第１４～第１７部位の安定性は、第１９および第２０部位での結合によって劇的に増大し、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９の立体構造変化を促進し、Ｃａｓ９におけるＤＮＡ切断が容認される。

【図5A-5B】動的モンテカルロ（ＫＭＣ）実験が、ガイドＲＮＡ構造に応じて、ミスマッチ（ＭＭ）を横断する、また、プロトスペーサーに侵入する能力の差を明らかにすることを示す。図５Ａ～５Ｂは、ＫＭＣ実験から得られる侵入中のｓｇＲＮＡ（図５Ａ）またはｔｒｕ－ｇＲＮＡ（図５Ｂ）についての、Ｒループ長ｍの、時間による占有比を示す（ｍ＝１０で開始、アスタリスクによって強調）。白色のＸのものは、ミスマッチの位置を示す。シミュレーションは、ｔ≧１０，０００（任意単位）まで実行し、結果は、１００回の試験を平均する。

【図5C】図５Ｃは、ｓｇＲＮＡ（赤色）およびｔｒｕ－ｇＲＮＡ（紫色）についての、ｍ＝１４（矢印）での、ミスマッチ部位を有するストランド侵入（ｍ＝１０で開始する）についての代表的なＫＭＣ時間経過を示す。ｓｇＲＮＡは、ミスマッチを迂回した後、大いに安定的に侵入されるが、ｔｒｕ－ｇＲＮＡは、そのＲループの固有の不安定性の結果として、ミスマッチの後方で繰り返し再捕捉される（図４参照）。

【図6A-6B】ＰＡＭ遠位領域（≧第１０プロトスペーサー部位）内の単一のｒＧ・ｄＧ、ｒＣ・ｄＣ、ｒＡ・ｄＡ、およびｒＵ・ｄＴミスマッチを含有する標的部位での、実験による（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２７－８３２）切断頻度が、動的モンテカルロ実験から決定されるＲループの安定性と相関することを示す。図６Ａは、部位ｍで開始されるストランド侵入中の、Ｃａｓ９切断頻度と、部位ｍでのＲループの安定性（ガイドＲＮＡが、部位ｍでプロトスペーサーに結合したままである時間の比、本文参照）との間の相関のｌｏｇ₁₀（ｐ値）を示す。（ｉ）部位ｍ＝１０からｍ＝１４での安定性が、ガイドＲＮＡがミスマッチを横断する前にプロトスペーサーから剥がれ落ちることとなる確率と高度に逆相関する（図１５Ｂ）のに対して、（ｉｉ）部位ｍ＝１４からｍ＝１７は、切断活性を誘発する立体構造変化と関係がある（ＡＦＭ画像から）。色は、相関係数に対応する。図６Ｂは、実験による切断頻度が、推定されるガイドＲＮＡ－プロトスペーサー平衡状態の結合自由エネルギー（ΔＧ°３７）（左）と有意には相関しないが、ストランド侵入中の部位ｍ＝１４の安定性（右）とは相関することを示す。エラーバーは、部位ｍ＝１４での平均占有時間の標準誤差である。これらの動的モンテカルロ実験については、ｍａｘ（ｔ）＝１００（任意単位）である。カラーバーは、ミスマッチ（ＭＭ）部位の位置を示すために使用される。

【図7A-7C】ガイドＲＮＡの構造がＣａｓ９／ｄＣａｓ９特異性に影響を与える、提案される機構の概要を示す。図７Ａは、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）については、ＲＮＡ（これは、プロトスペーサーの第１８～第２０部位に結合する）の最初のわずか数個ヌクレオチドだけが、Ｒループ揺らぎおよびプロトスペーサーの第１４～第１７部位での結合を安定化し、切断を可能にするための活性な状態への効率的な立体構造遷移を可能にすることを示す。しかし、これらの塩基によって付与される、この安定性の増大は、ミスマッチ部位での一過性の安定化、および切断を可能にする立体構造変化を可能にする。多くの場合では、ミスマッチを横断して、Ｒループは、安定的に完全に侵入されたままである。図７Ｂは、最初のわずか数個（ここでは２個）のヌクレオチドだけが切り詰められたガイドＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）については、Ｒループ（かなりの不安定性を特徴とする）の安定性の低下が、活性な立体構造を維持する確率を低下させることを示す。プロトスペーサー内にミスマッチ部位が存在する場合、Ｒループの不安定性によって、ミスマッチの後方で迅速にかつ繰り返し「再捕捉」されて、この部位で大きく妨害されるようになることが確実になる。図７Ｃは、プロトスペーサーおよびプロトスペーサー以降の隣接部位を標的にするためのガイドＲＮＡの５’末端の「単純な」伸長部が、インビボで消化されて、ほぼｓｇＲＮＡの長さまで戻ってしまうことが判明した（図７Ａ）のに対して、「ＰＡＭ遠位」ターゲティングセグメントに対して相補的な５’－ヘアピンを有するガイドＲＮＡ（ｈｐ－ｇＲＮＡ）は、侵入前にＣａｓ９／ｄＣａｓ９の構造内で保護されたままであることが予想されることを示す。ｈｐ－ｇＲＮＡによるＰＡＭ部位との結合およびストランド侵入の開始後、完全なプロトスペーサーに結合されると、ヘアピンが開き、完全なストランド侵入が起こることができる。標的部位にＰＡＭ遠位ミスマッチが存在する場合、ヘアピンが閉じたままであることが、エネルギー的に、より好都合であり、ストランド侵入は妨害される。Ｃａｓ９－ｈｐ－ｇＲＮＡがＲＮＡを切断する能力は、まだ確認されないままである。

【図8A-8B】精製されたＣａｓ９（図８Ａ）およびｄＣａｓ９（図８Ｂ）生成物（公称分子量：１６０ｋＤａ）のＳＤＳゲル中の発現されたＣａｓ９およびｄＣａｓ９の純度を示す。溶離されたバンドは、生成物が約９５％純粋であることを示す。

【図9A-9C】ＤＮＡに結合されるＣａｓ９／ｄＣａｓ９の追加の画像を示す。Ａ）ＡＡＶｓ１プロトスペーサー配列に対する相同性を含有しない基質に対するｄＣａｓ９の結合分布（図１と比較されたい）（ｎ＝４４３）。重ね合わせられているのは、ＰＡＭ部位の累積分布（ＣＤＦ）（ＣＤＦ_PAM、黒色）、およびｄＣａｓ９によって結合された塩基のＣＤＦ（赤色、ＣＤＦ_Cas9）である。ストレプトアビジンタグ（ＤＮＡ選択のための基準）を伴うオーバーラップによって導入される人工産物、および露出した平滑末端へのＤＮＡの結合（非特異的結合の、予想される増大がもたらされる）を避けるために、比較は、各末端から１００塩基で開始する。Ｂ）タンパク質結合のＣＤＦと、ＰＡＭ部位のＣＤＦとの間の絶対値差分Ｄ_n。破線は、２つの分布の適合度についてのコルモゴロフ-スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ）基準である。Ｃ）ＭＡＴＬＡＢを使用して、Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣの確率が同じである１００，０００個のランダムに産生された配列からの、結合のＣＤＦを、ＰＡＭ分布のＣＤＦと比較した。垂直な赤線は、実験によるＳｕｐ（Ｄ_n）であり、実験によるｄＣａｓ９結合が、実験によるＰＡＭ分布と、産生された配列の７１．２０％よりもぴったりとマッチしたことを示す。

【図10A-10C】プロトスペーサー配列に対する相同性を含有しない「ナンセンス」基質に対する結合（＞３ｂｐ）を示す。（Ａ）ｄＣａｓ９単独の画像。（Ｂ）第１のピークに対してガウスフィット（Ｇａｕｓｓｉａｎ ｆｉｔ）を単独で用いて画像化されたｄＣａｓ９の体積（左）および高さ（右）のヒストグラム（ｎ＝４２３）。ガウスフィットから：平均高さは、１．７４６ｎｍ（９５％信頼度：１．６８９ｎｍ～１．８０２ｎｍ）、標準偏差０．４４１ｎｍであり、平均体積は、１３０２ｎｍ³（９５％信頼度：１２６６ｎｍ³－１３３７ｎｍ³）、標準偏差２５９．１ｎｍ³である（ここではｄＣａｓ９は、その結合チャネル内にＤＮＡを有しないので、その記録される体積が、ＡＦＭプローブに対する力学的抵抗性の低下が原因で、不自然に低いように見える可能性があることに留意されたい）。高さは、各タンパク質を囲む１０ピクセル領域の中央値に対して相対的に測定し、体積は、局所性のバックグラウンド高さの標準偏差の２倍を超える近接する特徴として記録した。（Ｃ）一価のストレプトアビジンで一端を標識されているＤＮＡに結合したｄＣａｓ９の追加の代表的な画像。

【図11A-11D】ＲＮＡに結合したｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ、およびタンパク質構造特性のプロセシングの例の代表的な図を示す。図１１Ａは、遺伝子改変されたＤＮＡに結合したｄＣａｓ９の代表的な広視野画像を示す。図１１Ｂは、囲み領域のクローズアップを示す。白色矢印は、一価のストレプトアビジンであり、赤色矢印は、ｄＣａｓ９タンパク質である。図１１Ｃ－１１Ｄは、原画像からの抽出の例（図１１Ｃ）およびＣａｓ９／ｄＣａｓ９構造の単離（図１１Ｄ）を示す。この抽出を、ＤＮＡに結合した単離されたそれぞれのタンパク質に対して繰り返し、次いで、その平均平方される形態的な差を最小にするために、平行移動、回転、および反転の繰り返しを通してして、対ごとに整列させた。これらの最小化された平均平方差から、距離行列を構成し、Ｌａｉｏ ａｎｄ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），３４４，１４９２－１４９６の方法に従って各タンパク質をクラスター化し、次いで、ＤＮＡ上のその部位に戻してクラスター化することによって、構造の集団をマッピングした（図２Ａ、図１０Ａ～１０Ｃ）。

【図12A】そのそれぞれの結合部位にマッピングされたＣａｓ９／ｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡの特性を示す。上段：すべての実験条件について、体積（左）、最大高さ（中央）、および（平均平方差によってクラスター化された、アライメント後の構造（右、本文参照）の積み上げヒストグラム。集団は、下の散布図と同様に、ビン化された体積、高さ、または構造クラスターに従って着色する。抽出したＣａｓ９／ｄＣａｓ９分子の結合分布（図１０Ａ－１０Ｃ）は、完全なデータセットの結合分布（図１Ｃ～１Ｄ、図８Ａ～８Ｂ）とぴったりとマッチし、これは、選択手順が不偏であり、選択されたタンパク質が、データセット全体の代表であることを示す。下段：（左）ビン化された体積によって色分けされたすべてのＣａｓ９／ｄＣａｓ９の最大高さ、（中央）最大高さ、および（右）構造クラスターに対する、体積の散布図。

【図12B】そのそれぞれの結合部位にマッピングされたＣａｓ９／ｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡの特性を示す。上段：すべての実験条件について、体積（左）、最大高さ（中央）、および（平均平方差によってクラスター化された、アライメント後の構造（右、本文参照）の積み上げヒストグラム。集団は、下の散布図と同様に、ビン化された体積、高さ、または構造クラスターに従って着色する。抽出したＣａｓ９／ｄＣａｓ９分子の結合分布（図１０Ａ－１０Ｃ）は、完全なデータセットの結合分布（図１Ｃ～１Ｄ、図８Ａ～８Ｂ）とぴったりとマッチし、これは、選択手順が不偏であり、選択されたタンパク質が、データセット全体の代表であることを示す。下段：（左）ビン化された体積によって色分けされたすべてのＣａｓ９／ｄＣａｓ９の最大高さ、（中央）最大高さ、および（右）構造クラスターに対する、体積の散布図。

【図13】そのそれぞれの結合部位にｔｒｕ－ｇＲＮＡおよびｈｐ－ｇＲＮＡを伴うＣａｓ９／ｄＣａｓ９の構造特性を示す。その構造に従ってクラスター化されたＣａｓ９／ｄＣａｓ９の集団を表す色（図３Ｃ参照）を伴う、遺伝子改変されたＤＮＡ基質に沿ってＣａｓ９／ｄＣａｓ９によって占有された、結合されたＤＮＡの比率。タンパク質構造は、（アライメント後の平均２乗差によって（本文参照））それが最もよく似ているｓｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９／Ｃａｓ９に従って分類した。参考のための、遺伝子改変されたＤＮＡ基質上の、完全なプロトスペーサー部位の位置：１４４～１６７ｂｐ；１０ＭＭ（８ＭＭ）部位の位置：４５２～４６５ｂｐ；５ＭＭ（３ＭＭ）部位の位置：５９２～６１０ｂｐ。ｓｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９／Ｃａｓ９で見られるのと同様の傾向が見られた：ｄＣａｓ９が、ミスマッチとマッチしつつある部位に結合するにつれて、最も大きい（黄色）群を用いてクラスター化される集団の比率が増大するが、この影響は、ｔｒｕ－ｇＲＮＡでは抑制され、完全なプロトスペーサー部位であっても、集団のかなりの比率が、より小さい（緑色および青色）集団を用いてクラスター化される。ｈｐ１０－ｇＲＮＡに関する影響は、特に顕著であり、オフターゲット部位に対する親和性が乏しいことが強調される。

【図14A-14C】ガイドＲＮＡによるＤＮＡプロトスペーサーのストランド侵入およびＰＡＭ遠位ミスマッチを有するプロトスペーサーに侵入したＲＮＡの推定される結合安定性のモデルを示す。図１４Ａは、ガイドＲＮＡによるＤＮＡプロトスペーサーのストランド侵入の模式的モデルを示す。図４Ａも参照のこと。ガイドＲＮＡは、ｍ＝１の時に解離されると想定される。図１４Ｂは、異なる数の近接するＰＡＭ遠位ミスマッチを有するプロトスペーサーについての、最初にｍ＝５まで侵入したガイドＲＮＡについての解離時間の算出された確率分布を示す。これらの解離時間の長さは、その部位でのｄＣａｓ９結合傾向の近似値とみなすことができる。アスタリスクは、ｍ＝５までの最初の侵入後、最初に完全には侵入できないガイドＲＮＡの集団についての解離時間を強調する。侵入したＲＮＡは、１５個のＰＡＭ遠位ミスマッチ（１５ＭＭ）を有するプロトスペーサー部位で高度に不安定であり、実験では本発明者らは、これらの部位に結合したＣａｓ９／ｄＣａｓ９をめったに観察することがない（図１Ｄ）。１０または５個のＰＡＭ遠位ミスマッチ（１０ＭＭおよび５ＭＭ）を有するプロトスペーサー部位での（解離前の）侵入したＲＮＡは、１５ＭＭ部位でのＲＮＡよりもかなり長く（２桁以内の差ではあるが）とどまることが推測され；本発明者らは、その結合傾向が、ＡＦＭ実験における完全なプロトスペーサー部位（０ＭＭ）とほぼ等しいまたはこれよりも低いことを発見している。その確率密度関数は、ｍ状態間の配列特異的遷移速度（ｖ_fおよびｖ_r、補足の方法を参照のこと）を使用する、記載されている通りの（Ｓａｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｎｎｅｌ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２ｎｄ ｅｄ．）Ｑマトリクス法を使用して算出した。図１４Ｃは、異なる数のＰＡＭ遠位ミスマッチを有するプロトスペーサーでのＲＮＡ－プロトスペーサー結合の推定される半減期の検討が、侵入したＲＮＡの安定性が類似であるおよそ３つの型が存在することを示唆することを示す：＞１１個のＰＡＭ遠位ミスマッチを有するもの（低安定性）；３から１１個のＰＡＭ遠位ミスマッチを有するもの（中程度の安定性）；および＜３個のＰＡＭ遠位ミスマッチを有するもの（高安定性）。これらの結果は、ＡＦＭを介して観察される遺伝子改変された基質上のｄＣａｓ９の分布と質的に類似である（図１Ｄ）。

【図15】ｓｇＲＮＡおよびｔｒｕ－ｇＲＮＡによるストランド侵入中にミスマッチ部位を横断、シミュレーションされる平均初到達時間を示す。ミスマッチ部位の異なる位置についての、ｓｇＲＮＡ（青色）およびｔｒｕ－ｇＲＮＡ（赤色）によるストランド侵入中にミスマッチ部位を横断、シミュレーションされる（動的モンテカルロ）平均初到達時間。エラーバーは、記録された初到達時間の標準偏差である。ボックス中のプロトスペーサーの配列（ＡＡＶＳ１部位）。

【図16A-16B】Ｃａｓ９切断頻度（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２７－８３２）と、動的モンテカルロから得られるＲループ安定性の測定値との間の相関を示す。図１６Ａは、Ｒループ部位の安定性（動的モンテカルロより、本文参照）と、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２７－８３２による実験の切断頻度との間の相関の、統計的検出力および強度が、シミュレーション長さの増大（最大（ｔ）＝１００から最大（ｔ）＝１０００、任意単位）に伴って低下することを示す。この結果は、ストランド侵入の速度論が、オフターゲット切断速度の重要な予測因子であり得ることを示唆する。図１６Ｂは、Ｒループがサイズｍのものである時間の比と、動的モンテカルロ試験が、侵入鎖がミスマッチを横断する前に解離することとなることを予測する確率との相関を示す。部位１０ないし１４～１５での結合は、ミスマッチを横断する前の解離の確率と、非常に強く逆相関し（約０．５～０．８５）、一方で、ＡＦＭ画像化実験から、本発明者らは、部位約≧１６での結合が、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９の立体構造変化と関係があることを発見する。

【図17】オンターゲット活性を比較する、ディープシークエンシングデータの概要を示す。

【図18】特異性増大を比較する、ディープシークエンシングデータの概要を示す。

【図19】プロトスペーサー１、ジストロフィンを示し；レーン１は、ＧＦＰ対照を示し；レーン２は、完全なｇＲＮＡを示し；レーン３は、Ｔｒｕ－ｇＲＮＡ １９ｎｔを示し；レーン４は、Ｔｒｕ－ｇＲＮＡ １８ｎｔを示し；レーン５は、Ｔｒｕ－ｇＲＮＡ １７ｎｔを示し；レーン６は、Ｔｒｕ－ｇＲＮＡ １６ｎｔを示し；レーン７は、Ｈｐ－ｇＲＮＡ ４ｂｐを示し；レーン８は、Ｈｐ－ｇＲＮＡ ５ｂｐを示し；レーン９は、Ｈｐ－ｇＲＮＡ ６ｂｐを示し；レーン１０は、Ｈｐ－ｇＲＮＡ ７ｂｐを示し；レーン１１は、Ｈｐ－ｇＲＮＡ ８ｂｐを示し；レーン１２は、Ｈｐ－ｇＲＮＡ ９ｂｐ、ヘアピン１（レーン１２、９ｎｔ ｈｐ）－ＧｔｇａｇｔａｇｇｔｔｃｇＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＣ（配列番号３３５）（ここで、ｔｇａｇｔａｇｇは、ヘアピンの部分であり、下線部は、ヘアピンループである）を示す。

【図20】プロトスペーサー１、ジストロフィン、内部ループを示す。

【図21A】ディープシークエンシング実験（ＮｕＰａｃｋソフトウェア一式を使用）のために使用された、ｈｐ－ｇＲＮＡのプロトスペーサー－ターゲティングセグメントの５’末端の、計算された二次構造を示す。色は、平衡状態の二次構造中に存在する各ヌクレオチドの確率である。

【図21B】ディープシークエンシング実験（ＮｕＰａｃｋソフトウェア一式を使用）のために使用された、ｈｐ－ｇＲＮＡのプロトスペーサー－ターゲティングセグメントの５’末端の、計算された二次構造を示す。色は、平衡状態の二次構造中に存在する各ヌクレオチドの確率である。

【図22】ジストロフィン、インデル率、（すべての部位）を示す。

【図23】ジストロフィン、オンターゲット／合計（オフターゲットｓ）を示す。

【図24】プロトスペーサー２、ＥＭＸ１を示し；レーン１は、ＧＦＰ対照を示し；レーン２は、完全なｇＲＮＡを示し；レーン３は、Ｔｒｕ－ｇＲＮＡを示し；レーン４は、１０ｂｐのｈｐ－ｇＲＮＡを示し；レーン５は、６ｂｐのｈｐ－ｇＲＮＡ、ヘアピン１を示す。転換－Ｓｕｒｖ＿ＯＴ１＝ＤＳ＿ＯＴ２；Ｓｕｒｖ＿ＯＴ５３＝ＤＳ＿ＯＴ３。

【図25A】プロトスペーサー２、ＥＭＸ１、ｔｒｕ－ｈｐｓ、内部ループを示す。

【図25B】プロトスペーサー２、ＥＭＸ１、ｔｒｕ－ｈｐｓ、内部ループを示す。

【図26A-26B】ヘアピン構造を示す。図２６Ａは、６ｂｐの５’－ヘアピンであるヘアピン１を示す。図２６Ｂは、１８ｎｔ（切り詰め型）ｇＲＮＡ上の５ｂｐの５’－ヘアピンであるヘアピン２を示す。

【図26C】ヘアピン構造を示す。図２６Ｃは、３ｂｐの５’－ヘアピンであるヘアピン３を示す。

【図27】ＥＭＸ１、インデル率（すべての部位）を示す。

【図28】ＥＭＸ１、インデル率（低率・オフターゲット）を示す。

【図29】ＥＭＸ１、オンターゲット／合計（オフターゲット）を示す

【図30】プロトスペーサー３、ＶＥＧＦＡ１を示す。レーン１は、ＧＦＰ対照を示し；レーン２は、完全なｇＲＮＡを示し；レーン３は、Ｔｒｕ－ｇＲＮＡを示し；レーン４は、１０ｂｐのｈｐ－ｇＲＮＡを示し；レーン５は、６ｂｐのｈｐ－ｇＲＮＡを示す。

【図31A】プロトスペーサー３、ＶＥＧＦＡ１：ｐａｍ近位ヘアピンを示す。レーン１は、ＧＦＰ対照を示し；レーン２は、完全なｇＲＮＡを示し；レーン３は、ｈｐ－ｇＲＮＡ１を示し；レーン４は、ｈｐ－ｇＲＮＡ２を示し；レーン５は、ｈｐ－ｇＲＮＡ３を示し；レーン６は、ｈｐ－ｇＲＮＡ４を示し；レーン７は、ｈｐ－ｇＲＮＡ５を示し；レーン８は、ｈｐ－ｇＲＮＡ６を示す。

【図31B】プロトスペーサー３、ＶＥＧＦＡ１：ｐａｍ近位ヘアピンを示す。レーン１は、ＧＦＰ対照を示し；レーン２は、完全なｇＲＮＡを示し；レーン３は、ｈｐ－ｇＲＮＡ１を示し；レーン４は、ｈｐ－ｇＲＮＡ２を示し；レーン５は、ｈｐ－ｇＲＮＡ３を示し；レーン６は、ｈｐ－ｇＲＮＡ４を示し；レーン７は、ｈｐ－ｇＲＮＡ５を示し；レーン８は、ｈｐ－ｇＲＮＡ６を示す。

【図32】プロトスペーサー３、ＶＥＧＦＡ１：ｐａｍ近位ヘアピンを示す。

【図33】プロトスペーサー３、ＶＥＧＦ１、内部ループを示す。レーン１は、対照を示し；レーン２は、完全を示し；レーン３は、２ｎｔ ｈｐを示し；レーン４は、３ｎｔ ｈｐ、ヘアピン５を示し；レーン５は、４ｎｔ ｈｐを示す。

【図34A-34B】ヘアピン１、２、および失敗した３についてのディープシークエンシング実験を示す。図２５Ａは、ヘアピン４－オンターゲット活性を維持しながらオフターゲット部位２を識別するために設計された、計算によって得られたヘアピンを示す。図２５Ｂは、ヘアピン５－４ｂｐの５’－ヘアピン（ｇＲＮＡは通常、重要な３’二次構造を有する）を示す。

【図35】ＶＥＧＦ１、インデル率、（すべての部位）を示す。

【図36】ＶＥＧＦ１、インデル率、（低率・オフターゲット）を示す。

【図37】ＶＥＧＦ１、オンターゲット／合計（オフターゲット）を示す。

【図38】プロトスペーサー４、ＶＥＧＦＡ３を示す。レーン１は、ＧＦＰ対照を示し；レーン２は、完全なｇＲＮＡを示し；レーン３は、Ｔｒｕ－ｇＲＮＡを示し；レーン４は、３ｂｐのｈｐ－ｇＲＮＡを示し；レーン５は、４ｂｐのｈｐ－ｇＲＮＡを示し；レーン６は、５ｂｐのｈｐ－ｇＲＮＡを示し；レーン７は、６ｂｐのｈｐ－ｇＲＮＡを示し、レーン８は、１０ｂｐのｈｐ－ｇＲＮＡを示す。

【図39A】ｇＲＮＡ４、ＶＥＧＦＡ３：ｐａｍ近位ヘアピンを示す。レーン１は、ＧＦＰ対照を示し；レーン２は、完全なｇＲＮＡを示し；レーン３は、ｈｐ－ｇＲＮＡ１を示し；レーン４は、ｈｐ－ｇＲＮＡ２を示し；レーン５は、ｈｐ－ｇＲＮＡ３を示し；レーン６は、ｈｐ－ｇＲＮＡ４を示し、レーン７は、ｈｐ－ｇＲＮＡ５を示し；レーン８は、ｈｐ－ｇＲＮＡ６を示す。

【図39B】ｇＲＮＡ４、ＶＥＧＦＡ３：ｐａｍ近位ヘアピンを示す。レーン１は、ＧＦＰ対照を示し；レーン２は、完全なｇＲＮＡを示し；レーン３は、ｈｐ－ｇＲＮＡ１を示し；レーン４は、ｈｐ－ｇＲＮＡ２を示し；レーン５は、ｈｐ－ｇＲＮＡ３を示し；レーン６は、ｈｐ－ｇＲＮＡ４を示し、レーン７は、ｈｐ－ｇＲＮＡ５を示し；レーン８は、ｈｐ－ｇＲＮＡ６を示す。

【図40A-40B】図４０Ａは、ヘアピンの１～４ｂｐヘアピンターゲティング３’－領域を示す。図４０Ｂは、Ｇ－Ｕゆらぎ対を有するヘアピンの２～４ｂｐヘアピンターゲティング３’－領域を示す。

【図40C】Ｇ－Ｕゆらぎ対（バリアント設計）を有するヘアピンの３～４ｂｐヘアピンターゲティング３’－領域を示す。

【図41】ＶＥＧＦ３、インデル率（すべての部位）を示す。

【図42】ＶＥＧＦ３、インデル率（低率・オフターゲット）を示す。

【図43】ＶＥＧＦ３、オンターゲット／合計（オフターゲット）を示す。

【図44A-44B】図４４Ａは、ＥＭＸ１遺伝子を標的にするように設計されたヘアピンを示す。図４４Ｂは、図４４ＡのヘアピンのＥＭＸ１－ｓｇ１配列を示す。

【図44C】特異性に対するプロトスペーサー長の低下およびヘアピン長の増大の効果を示す。

【図45A】ＤＮＡ／ＲＮＡ配列を示す。

【図45B】ＤＮＡ／ＲＮＡ配列を示す。

【図45C】ＤＮＡ／ＲＮＡ配列を示す。

【図45D】ＤＮＡ／ＲＮＡ配列を示す。

【図46】Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを説明する図を示す。

【図47】ミスマッチまたは切り詰め型ｃｒＲＮＡに対するＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１の耐性、およびミスマッチ塩基を単独で含有するｃｒＲＮＡを使用するＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１による内在性遺伝子改変を示す。Ｔ７Ｅ１アッセイによって決定される活性；エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．；ｎ＝３（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３４：８６９－８７５から引用）。

【図48】オフターゲット活性をなくすために完全長ｇＲＮＡの３’末端にヘアピンが付加される、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系と共に使用されたｈｐ－ｇＲＮＡについてのｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本明細書で開示するのは、部位特異的ＤＮＡターゲティングおよびエピゲノム遺伝子編集および／または転写調節、例えばＤＮＡ切断および遺伝子活性化または抑制のための組成物および方法である。本発明は、既存のバイオテクノロジー基礎構造に容易に組み込むことができ、かつ、正確なＤＮＡ配列を特異的に標的にする能力をずっと保ちつつオフターゲット活性の制御された低下をもたらす、ヘアピン構造（ｈｐｇＲＮＡ）を有する最適化されたガイドＲＮＡを設計および使用するためのモジュール的方法を対象とする。本明細書に記載した方法は、他の利用可能な方法よりも著しく優れた方法を実施するために、最適化されたｇＲＮＡを設計することに対する新規の手法を提供し、これは、特に、高度に改善された性能についてますます向上した他のタンパク質特異的な手段と組み合わせて使用することができる。

【0022】

開示された方法および最適化されたｇＲＮＡは、ＲＮＡガイド型ゲノム工学を実施するための既に整っている現在の方法論および基礎構造に容易に適用されるという大きな利点を有する。いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、またはＣｐｆ１は、細胞内で最適化されたｇＲＮＡの転写物をコードするベクターと共に、ウイルスベクターを使用して細胞に送達される。本発明は、現在の標準の手法によって容易に適合させることができる、最適化されたｇＲＮＡをコードするベクターに対する数個の追加のヌクレオチドしか必要としないであろう。切り詰め型ガイドＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）のように、最適化されたｇＲＮＡまたはｈｐｇＲＮＡは、特異性をさらに改善するために、例えばペアードニッカーゼ、またはエンドヌクレアーゼ自体の他の改変形と組み合わせて使用することができる。一連の実験は、インビトロで実施し、これは、本明細書に記載した方法を使用して産生した最適化されたｇＲＮＡの使用が、入手可能な最善のｇＲＮＡ選択肢と比較して、ＤＮＡ結合における特異性を増大させたことを示した（図２参照）。この最適化されたｇＲＮＡの使用は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼによるオフターゲット活性が生じる部位である傾向がある、数個のミスマッチＤＮＡ配列しか含有しない標的での活性をなくすまたはかなり弱める。この最適化されたｇＲＮＡはまた、ガイドＲＮＡに対する最善の公知の改善であってもオフターゲット活性を誘発することが公知である部位での、哺乳類細胞における切断活性の特異性を提供する。本発明は、ガイドＲＮＡの構造設計を技術的に変化させることによって、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、特にＣａｓ９によるオフターゲット活性を低下させるための、一般に適用可能な方法である。

【0023】

１．定義
用語「含む」、「含まれる」、「有すること」、「有する」、「することができる」、「含有する」、およびこれらの異形は、本明細書で使用する場合、追加の作用または構造可能性を排除しない、制約のない移り変わる語句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によって他に明確に指示しない限り、複数の指示内容が含まれる。本開示はまた、明確に説明してもしなくても、本明細書で提供される実施態様または要素を「含む」、「～からなる」、および「本質的に～からなる」、他の実施態様を意図する。

【0024】

本明細書の数値範囲の列挙については、それぞれその間にある数が、同じ程度の正確性で、明確に意図される。例えば、６～９の範囲については、６および９に加えて、数値７および８が意図され、範囲６．０～７．０については、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が、明確に意図される。

【0025】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本文書が、定義を含めて、優先されることとなる。好ましい方法および材料は、以下に記載するが、本明細書に記載したものと類似または等価な方法および材料を、本明細書の実施または試験において使用することができる。本明細書に言及したすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献の全体を、参照によって本明細書に組み込む。本明細書に開示した材料、方法、および実施例は、実例に過ぎず、限定的であることを意図されない。

【0026】

本明細書で互換的に使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ヒトおよびいくつかの他の霊長類の種を感染させる、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する、小さいウイルスを指す。ＡＡＶは、現在、疾患を引き起こすことが知られておらず、したがって、ウイルスは、非常に穏やかな免疫応答を引き起こす。

【0027】

本明細書で使用される「結合領域」は、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼによって認識および結合される、ヌクレアーゼ標的領域内の領域を指す。

【0028】

本明細書で使用される「クロマチン」は、ヒストンと結合した染色体ＤＮＡの組織化された複合体を指す。

【0029】

本明細書で互換的に使用される「Ｃｉｓ－調節エレメント」または「ＣＲＥ」は、近くの遺伝子の転写を調節するノンコーディングＤＮＡの領域を指す。ＣＲＥは、それが調節する遺伝子（１または複数）の近傍に見られる。ＣＲＥは、一般的に、転写因子に対する結合部位として機能することによって、遺伝子転写を調節する。ＣＲＥの例としては、プロモーター、エンハンサー、スーパーエンハンサー、サイレンサー、インスレーター、および遺伝子座制御領域が挙げられる。

【0030】

本明細書で互換的に使用される「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）」および「ＣＲＩＳＰＲ」は、配列決定された細菌のおよそ４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノム内に見られる複数の短いダイレクトリピートを含有する遺伝子座を指す。

【0031】

本明細書で使用される「コード配列」または「コードする核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される個人または哺乳類の細胞における発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結された開始および停止シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、コドン最適化することができる。

【0032】

本明細書で使用される「相補体」または「相補的」は、核酸が、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間に、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ（例えばＡ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を生じることができることを意味する。「相補性」は、互いに逆平行に整列させた時に各位置のヌクレオチド塩基が相補的となるような、２つの核酸配列間に共有される性質を指す。

【0033】

本明細書で使用される「修正すること」、「ゲノム編集すること」、および「修復すること」は、切り詰め型タンパク質をコードするまたはタンパク質をまったくコードしない変異遺伝子を、完全長の機能性または部分的に完全長の機能性タンパク質発現が得られるように変化させることを指す。変異遺伝子を修正することまたは修復することは、変異を有する遺伝子の領域を置き換えること、または変異遺伝子全体を、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）などの修復機構を用いて、変異を有しない遺伝子のコピーと置き換えることを含むことができる。変異遺伝子を修正することまたは修復することはまた、遺伝子内の二本鎖切断をもたらし、次いでこの遺伝子を非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して修復することによって、未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位、または異所性スプライス供与部位をもたらすフレームシフト変異を修復することを含むことができる。ＮＨＥＪは、修復中に少なくとも１つの塩基対を付加または欠失させることができ、これは、適切な読み枠を修復するおよび未成熟終止コドンを除去することができる。変異遺伝子を修正することまたは修復することはまた、異所性スプライス受容部位またはスプライスドナー配列を破壊することを含むことができる。変異遺伝子を修正することまたは修復することはまた、２つのヌクレアーゼ標的部位間のＤＮＡを除去することによって、適切な読み枠を修復するために、同じＤＮＡ鎖上での２種のヌクレアーゼの同時作用によって、非必須遺伝子セグメントを欠失させることと、ＮＨＥＪによってＤＮＡ切断を修復することとを含むことができる。

【0034】

本明細書で使用される「脱メチル化酵素」は、核酸、タンパク質（特にヒストン）、および他の分子から、メチル（ＣＨ３－）基を除去する酵素を指す。脱メチル化酵素は、エピジェネティック修飾機構において重要である。脱メチル化酵素タンパク質は、ＤＮＡおよびヒストン上で生じるメチル化レベルを制御することによって、ゲノムの転写調節を変更し、次に、生物内の特定の遺伝子座でのクロマチン状態を調節する。「ヒストン脱メチル化酵素」は、ヒストンからメチル基を除去するメチル化酵素を指す。様々な基質に対して作用する、また、細胞機能において様々な役割を果たす、いくつかのファミリーのヒストン脱メチル化酵素が存在する。Ｆｅ（ＩＩ）依存性リジン脱メチル化酵素は、ＪＭＪＣ脱メチル化酵素であり得る。ＪＭＪＣ脱メチル化酵素は、ＪｕｍｏｎｊｉＣ（ＪｍｊＣ）ドメインを含有するヒストン脱メチル化酵素である。ＪＭＪＣ脱メチル化酵素は、ヒストン脱メチル化酵素のＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５、またはＫＤＭ６ファミリーのメンバーであり得る。

【0035】

本明細書で互換的に使用される「ＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位」または「ＤＨＳ」は、転写因子およびクロマチンモディファイヤー（遠位標的遺伝子発現を調整するｐ３００が含まれる）に対するドッキング部位を指す。

【0036】

本明細書で互換的に使用される「ドナーＤＮＡ」、「ドナー鋳型」、および「修復鋳型」は、対象となる遺伝子の少なくとも一部分を含むする二本鎖ＤＮＡ断片または分子を指す。ドナーＤＮＡは、完全に機能性のタンパク質または部分的に機能性のタンパク質をコードすることができる。

【0037】

本明細書で使用される「内在性遺伝子」は、生物、組織、または細胞内に起源をもつ遺伝子を指す。内在性遺伝子は、その正常なゲノムおよびクロマチン状況であり、かつその細胞に対して異種ではない細胞に固有である。こうした細胞遺伝子には、例えば、動物遺伝子、植物遺伝子、細菌遺伝子、原生動物遺伝子、真菌遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、および葉緑体遺伝子が含まれる。本明細書で使用される「内在性標的遺伝子」は、最適化されたｇＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系によって標的とされる内在性遺伝子を指す。

【0038】

本明細書で使用される「エンハンサー」は、複数の活性化因子およびリプレッサー結合部位を含有する、ノンコーディングＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、長さが５０ｂｐから１５００ｂｐの範囲であり、近位、すなわちプロモーターに対して５’上流、調節される遺伝子のいずれかのイントロン内、または遠位、すなわちその遺伝子座から離れた隣接遺伝子のイントロンまたは遺伝子間領域内、または異なる染色体上の領域であり得る。１個を超えるエンハンサーが、プロモーターと相互作用することができる。同様に、エンハンサーは、連結に制限されずに２つ以上の遺伝子を調節することができ、隣接遺伝子を「スキップ」して、より離れた遺伝子を調節することができる。転写調節は、プロモーターが存在する染色体とは異なる染色体に位置するエレメントを伴うことができる。隣接遺伝子の近位エンハンサーまたはプロモーターは、より遠位のエレメントを動員するためのプラットフォームとして働くことができる。

【0039】

本明細書で互換的に使用される「デュシェンヌ型筋ジストロフィー」または「ＤＭＤ」は、筋変性および最終的に死をもたらす、劣性遺伝の致死的なＸ連鎖性障害を指す。ＤＭＤは、一般的な遺伝性の単一遺伝子性疾患であり、男性の３５００人に１人に発症する。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子のナンセンスまたはフレームシフト変異をもたらす、遺伝性変異または自然突然変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン変異の大多数は、ジストロフィン遺伝子において読み枠を破壊して早期翻訳終結を引き起こす、エクソンの欠失である。ＤＭＤ患者は、一般的に、小児期に自分自身の身体を支える能力を失い、１０代の間に次第に筋力が低下するようになり、２０代で死亡する。

【0040】

本明細書で使用される「ジストロフィン」は、筋線維の細胞骨格を細胞膜を通して周囲の細胞外基質に連結するタンパク質複合体の一部である、棒状の細胞質タンパク質を指す。ジストロフィンは、筋細胞の完全性および機能の調節を担う細胞膜のジストログリカン複合体に、構造安定性を提供する。本明細書で互換的に使用されるジストロフィン遺伝子または「ＤＭＤ遺伝子」は、遺伝子座Ｘｐ２１の２．２メガ塩基である。一次転写物は、約２，４００ｋｂであり、成熟したｍＲＮＡは、約１４ｋｂである。７９エクソンが、３５００超のアミノ酸であるタンパク質をコードする。

【0041】

本明細書で使用される「エクソン５１」は、ジストロフィン遺伝子の５１番目のエクソンを指す。エクソン５１は、ＤＭＤ患者では、フレーム破壊欠失に頻繁に隣接しており、オリゴヌクレオチドに基づくエクソンスキッピングについての臨床試験において標的とされている。エクソン５１スキッピング化合物エテプリルセンについての臨床試験は、最近、ベースラインと比較して平均４７％のジストロフィン陽性線維を伴う、４８週にわたる有意な機能性の利益を報告した。エクソン５１の変異は、ＮＨＥＪに基づくゲノム編集による永続的な修正に理想的に適している。

【0042】

本明細書で互換的に使用される「フレームシフト」または「フレームシフト変異」は、１つ以上のヌクレオチドの付加または欠失がｍＲＮＡ内のコドンの読み枠のずれをもたらす、遺伝子変異の種類を指す。読み枠のずれは、ミスセンス変異または未成熟終止コドンなどの、タンパク質翻訳でのアミノ酸配列の変更をもたらす可能性がある。

【0043】

本明細書で互換的に使用される「完全長ｇＲＮＡ」または「標準のｇＲＮＡ」は、長さが一般的に２０ヌクレオチドである「骨格」と、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントとを含むｇＲＮＡを指す。

【0044】

本明細書で使用される「機能性」および「完全に機能性」は、生物活性を有するタンパク質を説明する。「機能性遺伝子」は、機能性タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。

【0045】

本明細書で使用される「融合タンパク質」は、元々は別のタンパク質をコードしている２つ以上の遺伝子の連結を介して作製されたキメラタンパク質を指す。融合体遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性をもつ単一のポリペプチドをもたらす。

【0046】

本明細書で使用される「遺伝子コンストラクト」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列には、核酸分子が投与される個人の細胞における発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結された開始および停止シグナルが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「発現可能な形態」は、個人の細胞内に存在する場合にコード配列が発現されることとなるような、タンパク質をコードするコード配列に、作動可能に連結された必須の調節エレメントを含有する遺伝子コンストラクトを指す。

【0047】

本明細書で使用される「遺伝性疾患」は、ゲノム内の１つ以上の異常によって、部分的にまたは完全に、直接的にまたは間接的に引き起こされる疾患、特に、生まれつき存在する状態を指す。異常は、変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、限定はされないが、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性の障害、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、地中海貧血症、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病であり得る。

【0048】

本明細書で使用される「ゲノム」は、細胞または生物内に存在する遺伝子または遺伝材料の完全なセットを指す。ゲノムには、ＤＮＡ、またはＲＮＡウイルス中のＲＮＡが含まれる。ゲノムには、遺伝子、（コード領域）、非コードＤＮＡの両方、およびミトコンドリアおよび葉緑体のゲノムが含まれる。

【0049】

本明細書で互換的に使用される「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、「一本鎖ｇＲＮＡ」、および「ｓｇＲＮＡ」は、Ｃａｓ９－結合またはＣｐｆ１－結合のために必須の「骨格」配列と、改変されることとなるゲノム標的を定義するユーザー定義の「スペーサー」または「ターゲティング配列」（本明細書ではプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントとも呼ばれる）からなる、短い合成ＲＮＡを指す。本明細書で互換的に使用される「ｈｐｇＲＮＡ」、「ｈｐ－ｇＲＮＡ」、および「最適化されたｇＲＮＡ」は、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントの全体または一部と共に二次構造を形成することができる、５’末端または３’末端のいずれかに追加のヌクレオチドを有するｇＲＮＡを指す。

【0050】

「ヒストンアセチル化酵素」または「ＨＡＴ」は、本明細書で互換的に使用され、ヒストンタンパク質上の保存リジンアミノ酸を、アセチルＣｏＡからアセチル基を転移させることによってアセチル化して、ε－Ｎ－アセチルリジンを形成する酵素を指す。ＤＮＡは、ヒストンの周囲に巻き付けられ、アセチル基をヒストンに転移させることによって、遺伝子をオンオフさせることができる。一般に、ヒストンアセチル化は、転写活性化につながり、また、ユークロマチンと関係があるので、遺伝子発現を増大させる。ヒストンアセチル化酵素はまた、核内受容体および他の転写因子などの非ヒストンタンパク質をアセチル化して、遺伝子発現を促進することもできる。

【0051】

本明細書で互換的に使用される「ヒストン脱アセチル化酵素」または「ＨＤＡＣ」は、ヒストン上のε－Ｎ－アセチルリジンアミノ酸からアセチル基（Ｏ＝Ｃ－ＣＨ³）を除去して、ヒストンにＤＮＡを、よりきつく巻き付けさせる、あるクラスの酵素を指す。ＨＤＡＣは、その標的（これには非ヒストンタンパク質も含まれる）ではなくその機能を言うために、リジン脱アセチル化酵素（ＫＤＡＣ）とも呼ばれる。

【0052】

本明細書で互換的に使用される「ヒストンメチルトランスフェラーゼ」または「ＨＭＴ」は、１つ、２つ、または３つのメチル基の、ヒストンタンパク質のリジンおよびアルギニン残基への転移を触媒する、ヒストン修飾酵素（例えば、ヒストン－リジンＮ－メチルトランスフェラーゼおよびヒストン－アルギニンＮ－メチルトランスフェラーゼ）を指す。メチル基の付着は、ヒストンＨ３およびＨ４上の主に特定のリジンまたはアルギニン残基で起こる。

【0053】

本明細書で互換的に使用される「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」は、大抵は細胞周期のＧ２およびＳ期において、ＤＮＡの相同の断片が核内に存在する場合に、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復するための、細胞における機構を指す。ＨＤＲは、修復を誘導するためのドナーＤＮＡ鋳型を使用し、また、ゲノムに対する特定の配列変化（全遺伝子の標的とされる付加を含めて）を作り出すために使用することができる。ドナー鋳型が、部位特異的ヌクレアーゼと共に、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と共に提供される場合、細胞機構は、相同組換えによって切断を修復することとなり、これは、ＤＮＡ切断の存在下で、数桁増強される。相同のＤＮＡ断片が存在しない場合、代わりに非相同末端結合が起こり得る。

【0054】

本明細書で使用される「ゲノム」は、細胞または生物内に存在する遺伝子または遺伝材料の完全なセットを指す。ゲノムには、ＤＮＡ、またはＲＮＡウイルス中のＲＮＡが含まれる。ゲノムには、遺伝子、（コード領域）、非コードＤＮＡの両方、およびミトコンドリアおよび葉緑体のゲノムが含まれる。

【0055】

本明細書で使用される「ゲノム編集」は、遺伝子を変化させることを指す。ゲノム編集は、変異遺伝子を修正することまたは修復することを含むことができる。ゲノム編集は、変異遺伝子または正常遺伝子などの遺伝子をノックアウトすることを含むことができる。ゲノム編集は、対象となる遺伝子を変化させることによって、疾患を治療する、または筋肉修復を増強するために使用することができる。

【0056】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況で本明細書で使用される「同一な」または「同一性」は、これらの配列が、特定の領域にわたって同一である、特定の割合の残基を有することを意味する。その割合は、２つの配列を最適に整列させ、これらの２つの配列を特定の領域にわたって比較し、両方の配列において同一な残基が存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を出し、マッチ位置の数を、特定の領域における位置の総数で割り、結果に１００をかけて、配列同一性の割合を出すことによって算出することができる。２つの配列が異なる長さのものである、または整列によって１つ以上の粘着末端が生じて比較の特定の領域に単一の配列のみが含まれる場合、単一の配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は、等しいとみなすことができる。同一性は、手作業で、またはＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって実施することができる。

【0057】

本明細書で使用される「インスレーター」は、エンハンサーとプロモーターとの間の相互作用を阻止する、遺伝子境界エレメントを指す。エンハンサーとプロモーターとの間に存在することによって、インスレーターは、その後続の相互作用を阻害することができる。インスレーターは、エンハンサーが影響を与えることができる遺伝子のセットを決定することができる。インスレーターは、染色体上の２つの隣接遺伝子が非常に異なる転写パターンを有し、かつ一方の機構を誘発または抑制することが隣接遺伝子を阻害しない場合に必要とされる。インスレーターはまた、トポロジカル関連ドメイン（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）（ＴＡＤ）の境界でクラスター形成することが判明しており、また、ゲノムを「染色体近傍（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ）」－調節が存在するゲノム領域に分配する役割を有することができる。インスレーター活性は、主として、ＣＴＣＦを含めたタンパク質によって介在されるＤＮＡの３Ｄ構造によって生じると考えられる。インスレーターは、複数の機構を通して機能する可能性が高い。多くのエンハンサーは、転写活性化中にプロモーター領域と物理的にごく近い場所に置かれるＤＮＡループを形成する。インスレーターは、プロモーター－エンハンサーループが形成されるのを防止するＤＮＡループの形成を促進することができる。バリア・インスレーターは、発現抑制された遺伝子から活発に転写される遺伝子へのヘテロクロマチンの広がりを防止することができる。

【0058】

本明細書で使用される「侵入」は、プロトスペーサーに対して相補的であるＤＮＡ配列に結合するｇＲＮＡによるものなどの、標的遺伝子の標的領域内のプロトスペーサー領域でのＤＮＡ二重鎖の破壊を指す。

【0059】

本明細書で使用される「侵入速度論」は、侵入が進行する速度を指す。侵入速度論は、ガイドＲＮＡが二重鎖に、プロトスペーサーが完全に侵入されるような「完全な侵入」まで侵入する速度、または、ガイドＲＮＡに結合されたプロトスペーサーＤＮＡのセグメントが、その相補鎖から置き換えられ、そのＰＡＭ近位領域から、完全な侵入まで、ヌクレオチドごとにガイドＲＮＡに結合するにつれて伸長する速度を指すことができる。

【0060】

本明細書で使用される「寿命」は、ｇＲＮＡが標的遺伝子の標的領域内の領域に侵入されたままである期間を指す。

【0061】

本明細書で使用される「遺伝子座制御領域」は、遠位クロマチン部位での連鎖遺伝子の発現を増強する、広域ｃｉｓ－調節エレメントを指す。これは、コピー数に依存する方式で機能し、赤血球細胞におけるβ－グロビン遺伝子の選択的発現において見られるように、組織特異的である。遺伝子の発現レベルは、ＬＣＲおよび遺伝子近位エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、およびサイレンサーによって改変することができる。ＬＣＲは、クロマチン修飾、コアクチベーター、および転写複合体を動員することによって機能する。その配列は、多くの脊椎動物では保存され、特定の部位の保存は、機能における重要性を示唆する可能性がある。

【0062】

本明細書で互換的に使用される「ミスマッチの」または「ＭＭ」は、Ｇ／ＴまたはＡ／Ｃ対合を含むミスマッチ塩基を指す。ミスマッチは、通常、Ｇ２中の塩基の互変異性化が原因である。この損傷は、ミスマッチによってもたらされる変形を認識すること、鋳型および非鋳型鎖を決定すること、および間違って組み込まれた塩基を切除すること、およびこれを正しいヌクレオチドと置き換えることによって修復される。

【0063】

本明細書で使用される「調節する」は、活性のあらゆる変更、例えば、調節する、下方調節する、上方調節する、低下させる、阻害する、増大させる、減少させる、非活性化する、または活性化するなどを意味することができる。

【0064】

本明細書で互換的に使用される「変異遺伝子」または「変異した遺伝子」は、検出可能な変異を受けている遺伝子を指す。変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を与える、遺伝材料の喪失、獲得、または交換などの変化を受けている。本明細書で使用される「破壊された遺伝子」は、未成熟終止コドンをもたらす変異を有する、変異遺伝子を指す。破壊された遺伝子産物は、完全長の破壊されていない遺伝子産物と比較すると切り詰め型である。

【0065】

本明細書で使用される「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」は、相同の鋳型を必要とせずに、切断末端を直接的に連結することによって、ＤＮＡ内の二本鎖切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによる、鋳型に依存しないＤＮＡ末端の再連結は、ＤＮＡ切断点にランダムな微小挿入および微小欠失（インデル）を導入する、確率的な、誤りがちな修復プロセスである。この方法は、標的とされる遺伝子配列を意図的に破壊する、欠失させる、または読み枠を変更するために使用することができる。ＮＨＥＪは、一般的に、修復を誘導するための、マイクロホモロジーと呼ばれる短い相同のＤＮＡ配列を使用する。これらのマイクロホモロジーは、しばしば、二本鎖切断の末端の単鎖オーバーハング中に存在する。このオーバーハングが完璧に適合する場合、ＮＨＥＪは通常、切断を正確に修復し、一方で、ヌクレオチドの喪失をもたらす不正確な修復も起こり得るが、これは、オーバーハングが適合しない場合にははるかに一般的である。

【0066】

本明細書で使用される「正常遺伝子」は、遺伝材料の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていない遺伝子を指す。正常遺伝子は、正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。

【0067】

本明細書で使用される「ヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪ」は、ｃａｓ９などのヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断した後に開始されるＮＨＥＪを指す。

【0068】

本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合によって共に連結された、少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。単鎖の描写はまた、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、描写した単鎖の相補鎖も包含する。所与の核酸と同一の目的のために、核酸の多くのバリアントを使用することができる。したがって、核酸は実質的に同一な核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリッド形成することができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。

【0069】

核酸は、一本鎖または二本鎖であり得るし、二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含有することもできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここでは、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含めた塩基の組み合わせを含有することができる。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得ることができる。

【0070】

本明細書で使用される「オンターゲット部位」は、ｇＲＮＡが標的とすることが意図されるゲノム内の標的領域または配列を指す。理想的には、オンターゲット部位は、標的ＤＮＡ配列に対する完璧な相同性（１００％の同一性または相同性）を有し、ゲノム内の他の場所には相同性は存在しない。

【0071】

本明細書で使用される「オフターゲット部位」は、オンターゲット部位またはｇＲＮＡの標的領域に対する部分的な相同性または部分的な同一性を有するが、ｇＲＮＡが標的とするように意図または設計されていない、ゲノムの領域を指す。

【0072】

本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、遺伝子の発現が、遺伝子と空間的に連結されたプロモーターの制御下であることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置することができる。プロモーターと遺伝子との距離は、プロモーターが由来する遺伝子においてプロモーターが制御するプロモーターと遺伝子との距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で公知であるように、この距離のバリエーションは、プロモーター機能の喪失を伴わずに適応させることができる。

【0073】

本明細書で互換的に使用される「ｐ３００タンパク質」、「ＥＰ３００」、または「Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００」は、ＥＰ３００遺伝子によってコードされる、アデノウイルスＥ１Ａ関連細胞ｐ３００転写コアクチベータータンパク質を指す。ｐ３００は、広範な細胞過程に関与する、高度に保存されるアセチルトランスフェラーゼである。ｐ３００は、クロマチンリモデリングを介して転写を調節するヒストンアセチル化酵素として機能し、細胞増殖および細胞分化の過程と関与する。

【0074】

本明細書で使用される「部分的に機能性」は、変異遺伝子によってコードされ、かつ、機能性タンパク質よりも低い生物活性を有するが、非機能性タンパク質よりも高い生物活性を有する、タンパク質を説明する。

【0075】

本明細書で互換的に使用される「未成熟終止コドン」または「アウトオブフレーム終止コドン」は、野生型遺伝子には通常見られない位置での終止コドンをもたらす、ＤＮＡの配列内のナンセンス変異を指す。未成熟終止コドンは、完全長型のタンパク質と比較して切断されているまたは短いタンパク質をもたらす可能性がある。

【0076】

本明細書で使用される「初代細胞」は、生きている組織（例えば生検材料）から直接的に採取した細胞を指す。初代細胞は、インビトロで、成長のために樹立することができる。これらの細胞は、集団倍加をほとんど受けておらず、したがって、継代（腫瘍または人工的に不死化させた）細胞株と比較して、これらが由来する組織の主要な機能要素を、より良く表し、したがって、インビボ状態に対する、より典型的なモデルとなる。初代細胞は、マウスまたはヒトなどの様々な種から採取することができる。

【0077】

本明細書で互換的に使用される「プロトスペーサー配列」または「プロトスペーサーセグメント」は、ＣＲＩＳＰＲ細菌適応免疫系におけるＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼによって標的とされるＤＮＡ配列を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系では、一般的に、プロトスペーサー配列の後に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が続き；ＰＡＭは、５’末端にある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系では、ＰＡＭの後に、プロトスペーサー配列が続き；ＰＡＭは、３’末端にある。

【0078】

本明細書で互換的に使用される「プロトスペーサー－ターゲティング配列」または「プロトスペーサー－ターゲティングセグメント」は、プロトスペーサー配列に対応し、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の、プロトスペーサー配列へのターゲティングを容易に、ｇＲＮＡのヌクレオチド配列を指す。

【0079】

本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または促進することが可能である、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに促進するための、かつ／または、空間的発現および／または同じものの時間的発現を変更するための、１つ以上の特異的な転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる、またはゲノム中のいずれかの遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含むことができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含めた起源から得ることができる。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、または器官に対して、または発現が起こる発生段階に対して、または生理的ストレス、ホルモン、毒素、薬物、原体、金属イオン、または誘発物質などの外部刺激に応答して、遺伝子成分の発現を恒常的または変動的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。

【0080】

本明細書で使用される「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」は、ＣＲＩＳＰＲ細菌適応免疫系における、Ｃａｓ９によって標的とされるＤＮＡ配列の直後の、またはＣｐｆ１ヌクレアーゼによって標的とされるＤＮＡ配列の直前のＤＮＡ配列を指す。ＰＡＭは、侵入するウイルスまたはプラスミドの成分であるが、細菌ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の成分ではない。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１は、ＰＡＭ配列が、それぞれ後続または先行しない場合には、うまく標的ＤＮＡ配列と結合してこれを切断することはないであろう。ＰＡＭは、細菌自体を非自己ＤＮＡと識別し、それによって、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座がヌクレアーゼによって標的にされて破壊されるのを防止する、（細菌ゲノムには見られない）必須のターゲティング成分である。

【0081】

細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合の用語「組換え」は、これらの細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、またはこれらの細胞が、このように改変された細胞から得られることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然の（天然に存在する）型の細胞内には見られない遺伝子を発現するか、そうではなく正常もしくは異常に発現される、または低く発現されるもしくはまったく発現されない、天然の遺伝子の第２のコピーを発現する。

【0082】

本明細書で互換的に使用される「サイレンサー」または「リプレッサー」は、転写調節因子と結合し、遺伝子がタンパク質として発現されるのを防止することが可能なＤＮＡ配列を指す。サイレンサーは、その特定の遺伝子の転写に対する負の効果を誘発する、配列特異的なエレメントである。サイレンサーエレメントがＤＮＡ内で位置することができる場所はたくさんある。最も一般的な場所は、標的遺伝子の上流に見られ、ここでは、遺伝子の転写を抑制するのを助けることができる。この距離は、遺伝子のおよそ－２０ｂｐ上流から－２０００ｂｐ上流まで大きく変動し得る。ある種のサイレンサーは、遺伝子自体のイントロンまたはエクソン内に位置するプロモーターの下流に見られる可能性がある。サイレンサーはまた、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内にも見られている。ＤＮＡ内には、典型的なサイレンサーエレメントと非典型的な負調節エレメント（ＮＲＥ）である、２つの主なタイプのサイレンサーが存在する。典型的なサイレンサーにおいては、遺伝子は、大抵は基本転写因子（ＧＴＦ）アセンブリーを阻害することによって、サイレンサーエレメントによって能動的に抑制される。ＮＲＥは、通常、遺伝子の上流である他のエレメントを阻害することによって、遺伝子を受動的に抑制する。

【0083】

本明細書で使用される「骨格筋」は、体性神経系の制御下にあり、かつ腱として公知のコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の種類を指す。骨格筋は、時として口語的に「筋線維（ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒ）」と呼ばれる、筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）として公知の個々の成分、または「筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）」で構成されている。筋細胞は、筋形成として公知のプロセスにおいて、発達性の筋芽細胞（筋肉細胞をもたらす、ある種類の胚性前駆細胞）の融合体から形成される。これらの長い円柱形の多核細胞は、筋線維（ｍｙｏｆｉｂｅｒ）とも呼ばれる。

【0084】

本明細書で使用される「骨格筋状態」は、筋ジストロフィー、老化、筋変性、創傷治癒、および筋力低下または筋萎縮症などの、骨格筋に関連する状態を指す。

【0085】

本明細書で互換的に使用される「対象」および「患者」は、限定はされないが、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル）、およびヒト）を含めた、あらゆる脊椎動物を指す。いくつかの実施態様では、対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。

【0086】

本明細書で使用される「スーパーエンハンサー」は、細胞同一性に関与する、遺伝子の転写を駆動するために一連の転写因子タンパク質によって集団で結合される複数のエンハンサーを含む、哺乳類ゲノムの領域を指す。スーパーエンハンサーは、しばしば、細胞同一性を制御および定義するために重要な近くの遺伝子と特定され、細胞同一性を調節している主要な中心点を迅速に特定するために使用することができる。エンハンサーは、ある範囲の値を有するいくつかの定量化可能な形質を有し、これらの形質は、一般に、スーパーエンハンサーで上昇する。スーパーエンハンサーは、より高いレベルの転写調節タンパク質によって結合され、より高度に発現される遺伝子と関与する。スーパーエンハンサーと関与する遺伝子の発現は、攪乱に対して特に感受性であり、これは、細胞状態遷移を容易にする、または転写を標的にする小分子に対するスーパーエンハンサー関連遺伝子の感受性を説明することができる。

【0087】

本明細書で使用される「標的エンハンサー」は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系によって標的とされるエンハンサーを指す。標的エンハンサーは、標的領域内であり得る。

【0088】

本明細書で使用される「標的遺伝子」は、既知のまたは推定上の遺伝子産物をコードする、あらゆるヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子は、遺伝性疾患に関与する変異した遺伝子であり得る。

【0089】

本明細書で互換的に使用される「標的領域」、「標的配列」、「プロトスペーサー」、または「プロトスペーサー配列」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系が標的にする標的遺伝子の領域を指す。

【0090】

本明細書で使用される「転写領域」は、ＤＮＡ分子からの遺伝情報のメッセンジャーＲＮＡへの伝達をもたらす、メッセンジャーＲＮＡとして公知である単鎖ＲＮＡ分子に転写されるＤＮＡの領域を指す。転写中、ＲＮＡポリメラーゼは、３’から５’の方向に鋳型鎖を読み取り、５’から３’にＲＮＡを合成する。ｍＲＮＡ配列は、ＤＮＡ鎖に対して相補的である。

【0091】

本明細書で使用される「標的調節エレメント」は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系によって標的とされる調節エレメントを指す。標的調節エレメントは、標的領域内であり得る。

【0092】

本明細書で使用される「転写領域」は、ＤＮＡ分子からの遺伝情報のメッセンジャーＲＮＡへの伝達をもたらす、メッセンジャーＲＮＡとして公知である単鎖ＲＮＡ分子に転写されるＤＮＡの領域を指す。転写中、ＲＮＡポリメラーゼは、３’から５’の方向に鋳型鎖を読み取り、５’から３’にＲＮＡを合成する。ｍＲＮＡ配列は、ＤＮＡ鎖に対して相補的である。

【0093】

本明細書で互換的に使用される「転写開始点」または「ＴＳＳ」は、そこでＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ転写物の合成を開始する、転写されたＤＮＡ配列の最初のヌクレオチドを指す。

【0094】

本明細書で使用される「導入遺伝子」は、ある生物から単離されており、別の生物に導入される、遺伝子配列を含有する遺伝子または遺伝材料を指す。ＤＮＡのこの非天然セグメントは、トランスジェニック生物におけるＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を保持することもできるし、トランスジェニック生物の遺伝暗号の正常な機能を変えることもできる。導入遺伝子の導入は、生物の表現型を変化させる可能性を有する。

【0095】

本明細書で使用される「ｔｒｕ ｇＲＮＡ」は、その５’末端から一般的に２ヌクレオチド切り詰められたヌクレオチドを伴う完全長ガイドＲＮＡを指す。

【0096】

本明細書で使用される「トランス調節エレメント」は、そこから転写される遺伝子から離れた遺伝子の転写を調節する、ノンコーディングＤＮＡの領域を指す。トランス調節エレメントは、標的遺伝子と同じ又は異なる染色体上にあり得る。トランス調節エレメントの例としては、エンハンサー、スーパーエンハンサー、サイレンサー、インスレーター、および遺伝子座制御領域が挙げられる。

【0097】

核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参考ヌクレオチド配列の一部もしくは断片（参考ヌクレオチド配列と比較した場合に挿入または欠失を有するヌクレオチド配列が含まれる）；（ｉｉ）参考ヌクレオチド配列の相補体、もしくはその一部；（ｉｉｉ）参考核酸と実質的に同一である核酸、もしくはその相補体；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で参考核酸とハイブリッド形成する核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列を意味する。

【0098】

ペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する。バリアントは、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参考タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味することができる。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の性質（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の別のアミノ酸と置き換えることは、微小な変化を一般的に伴うものと当技術分野で認識されている。これらの微小な変化は、当技術分野で理解されている通り、アミノ酸の疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することによって、ある程度特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づいている。同様の疎水性指標のアミノ酸が置換されてもまだ、タンパク質機能を保持できることが、当技術分野で公知である。一態様では、±２の疎水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生体機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドという状況でのアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の算出を可能にする。互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸での置換を実施することができる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値はどちらも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この知見と一致して、生体機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の性質によって明らかにされる、アミノ酸、特にそのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解されよう。

【0099】

本明細書で使用される「ベクター」は、複製開始点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外のベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９および配列番号１４９～３１５、３２１～３２３、および３２６～３２９のいずれか１つの少なくとも１つの最適化されたｇＲＮＡヌクレオチド配列をコードすることができる。

【0100】

本明細書で別に定義されない限り、本開示に関して使用される科学および技術用語は、当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載した細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される、あらゆる学術用語、およびこれらの技術は、周知でありかつ当技術分野で普通に使用されるものである。用語の意味および範囲は、明確であるべきである；しかし、いずれかの潜在的あいまい性の場合には、本明細書で提供する定義が、あらゆる辞書または外部の定義よりも先行する。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数の用語には、複数形が含まれるものとし、複数の用語には、単数形が含まれるものとする。

【0101】

２．ＣＲＩＳＰＲ系
ＣＲＩＳＰＲ系は、ある形態の獲得免疫を提供する、侵入するファージおよびプラスミドに対する防御に関与する、微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ介在性の核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ノンコーディングＲＮＡエレメントとの組み合わせを含有し得る。スペーサーと呼ばれる、外来ＤＮＡの短い部分が、ゲノムのＣＲＩＳＰＲリピート間に組み込まれ、過去の曝露の「メモリー」として働く。Ｃａｓ９は、単一のガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）の３’末端との複合体を形成し、このタンパク質－ＲＮＡ対は、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端と、プロトスペーサーとして公知であるあらかじめ定義された２０ｂｐ ＤＮＡ配列との間の相補的塩基対合によって、そのゲノム上の標的を認識する。この複合体は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）内のコードされた領域を介して、病原体ＤＮＡの相同遺伝子座、すなわち、病原体ゲノム内のプロトスペーサー、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）（ＰＡＭ）に誘導される。ノンコーディングＣＲＩＳＰＲアレイは、ダイレクトリピート内で転写および切断されて、個々のスペーサー配列を含有する短いｃｒＲＮＡとなり、これが、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に誘導する。発現されるキメラｓｇＲＮＡの２０ｂｐ認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ゲノム上の新しい標的に誘導することができるようになる。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物におけるＲＮＡｉと同様の方式で外来性遺伝因子を認識および発現停止させるために使用される。

【0102】

３つのクラスのＣＲＩＳＰＲ系（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型エフェクター系）が公知である。ＩＩ型エフェクター系は、単一のエフェクター酵素、Ｃａｓ９を使用して、４つの連続的ステップで、標的ＤＮＡ二本鎖破壊を行って、ｄｓＤＮＡを切断する。複合体として作用する複数の異なるエフェクターを必要とするＩ型およびＩＩＩ型エフェクター系と比較して、ＩＩ型エフェクター系は、真核細胞などの代替状況において機能することができる。ＩＩ型エフェクター系は、長い前駆‐ｃｒＲＮＡ（これは、スペーサー含有ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される）、Ｃａｓ９タンパク質、およびｔｒａｃｒＲＮＡ（これは、前駆‐ｃｒＲＮＡプロセシングに関与する）からなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、前駆‐ｃｒＲＮＡのスペーサーを隔てている反復領域とハイブリッド形成し、したがって、内在性ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断を開始する。この切断に、Ｃａｓ９による各スペーサー内の第２の切断現象が続き、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９と結合されたままである成熟ｃｒＲＮＡが産生され、Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。

【0103】

化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の遺伝子改変された形態のＩＩ型エフェクター系は、ゲノム工学のために、ヒト細胞において機能することが示された。この系では、Ｃａｓ９タンパク質は、合成によって再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」、また、本明細書ではキメラｓｇＲＮＡと互換的に使用され、Ｃａｓ９について、一般に、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ およびｃｒＲＮＡプロセシングの必要性を不要にするｃｒＲＮＡ‐ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体である）によって、ゲノム上の標的部位に誘導された。

【0104】

Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ＤＮＡ二重鎖をほどき、ｃｒＲＮＡとの配列マッチングを探索して切断する。標的認識は、標的ＤＮＡ内の「プロトスペーサー」配列と、ｃｒＲＮＡ内の残存するスペーサー配列との間の相補性の検出時に発生する。Ｃａｓ９は、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）もプロトスペーサーの３’末端に存在する場合に、標的ＤＮＡの切断を媒介する。プロトスペーサーターゲティングについては、配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、すなわちＤＮＡ切断に必要とされるＣａｓ９ヌクレアーゼによって認識される短い配列の直後でなければならない。別のＩＩ型系は、異なるＰＡＭ要件を有する。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ系は、５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかである）としての、かつ、ヒト細胞におけるこの系の特異性を特徴付ける、このＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のためのＰＡＭ配列を有することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系の独自の能力は、２つ以上のｓｇＲＮＡを伴う単一のＣａｓ９タンパク質を同時発現させることによって、複数の異なるゲノム上遺伝子座を同時に標的にする、直接的な能力である。例えば、遺伝子改変された系において、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型系は、本来は「ＮＧＧ」配列（ここで、「Ｎ」は、いずれかのヌクレオチドであり得る）を使用することを好むが、「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列も受け入れられる（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２７－８３２）。同様に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は、通常、ＮＮＮＮＧＡＴＴという天然のＰＡＭを有するが、高度に縮重したＮＮＮＮＧＮＮＮ ＰＡＭを含めた様々なＰＡＭにわたって活性を有する（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６８１）。

【0105】

３．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系
本明細書で提供されるのは、標的遺伝子などの対象となる標的領域を特異的に切断すること、または標的遺伝子の遺伝子発現を活性化もしくは抑制することなどの、エピゲノム編集および転写調節における使用のためのＤＮＡターゲティングの改善を可能にするヘアピンｇＲＮＡ（本明細書では「ｈｐｇＲＮＡ」または「ｈｐ－ｇＲＮＡ」とも呼ばれる）などの最適化されたｇＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系である。この最適化されたｇＲＮＡは、オフターゲット位置での寿命を、オフターゲット部位でのいずれかの活性を最小にするように調節することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系のオフターゲット結合およびオフターゲット活性を減じつつ、標的結合特異性の増大を提供する。

【0106】

最適化されたｇＲＮＡは、第２のドメイン活性とは関係なく、これらの位置でのＣａｓ９寿命を調節する、および全体的な侵入速度論を調節することによって、Ｃａｓ９－融合タンパク質活性を調節することができる。さらに、プロトスペーサー－ターゲティングセグメントの５’末端での、プロトスペーサーに対するｇＲＮＡ結合はまた、Ｃａｓ９切断と関与する可能性がある。オフターゲット部位に対する結合の低下は、これらのオフターゲット部位での完全な侵入／切断の可能性を制限するであろう。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の遺伝子改変された形態のＩＩ型エフェクター系は、ゲノム工学のために、ヒト細胞において機能することが示された。この系では、Ｃａｓ９タンパク質は、合成によって再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」、また、本明細書ではキメラ一本鎖ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）と互換的に使用され、Ｃａｓ９については、一般に、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ およびｃｒＲＮＡプロセシングの必要性を不要にするｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体である）によって、ゲノム上の標的部位に誘導された。本明細書で提供するのは、ゲノム編集、および遺伝性疾患の治療における使用のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、遺伝性疾患、老化、組織再生、または創傷治癒に関与する遺伝子を含めた、あらゆる遺伝子を標的にするように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質と、下に記載する通りの少なくとも１つの最適化されたｇＲＮＡとを含むことができる。Ｃａｓ９融合タンパク質は、例えば、トランス活性化ドメインなどの、Ｃａｓ９にとって内在性であるものとは異なる活性を有するドメインを含むことができる。

【0107】

標的遺伝子は、フレームシフト変異またはナンセンス変異などの変異を有することができる。標的遺伝子が、未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位、または異所性スプライス供与部位をもたらす変異を有する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、これらの未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位、または異所性スプライス供与部位の上流または下流のヌクレオチド配列を認識および結合するように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に基づく系はまた、スプライス受容部および供与部を標的にして、未成熟終止コドンのスキッピングを誘発するまたは破壊された読み枠を修復することによって、正常な遺伝子スプライシングを破壊するために使用することもできる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、ゲノムのタンパク質－コード領域へのオフターゲット変化を媒介する可能性もしない可能性もある。

【0108】

ｉ．Ｃａｓ９
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質を含むことができる。Ｃａｓ９タンパク質は、核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、また、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされ、また、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に含まれる。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などの、あらゆる細菌または古細菌種由来であり得る。Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されるように変異させることができる。エンドヌクレアーゼ活性を有しない化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の不活性化されたＣａｓ９タンパク質（ｉＣａｓ９、「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる）は、最近、立体障害を介して遺伝子発現を抑制するために、ｇＲＮＡによって、細菌、酵母、およびヒト細胞における遺伝子に標的化されている。本明細書で使用する場合、「ｉＣａｓ９」および「ｄＣａｓ９」はどちらも、アミノ酸置換Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを有し、かつそのヌクレアーゼ活性が不活性化された、Ｃａｓ９タンパク質を指す。いくつかの実施態様では、ＮｍＣａｓ９などの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）由来の、不活性化されたＣａｓ９タンパク質を使用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、配列番号１のｉＣａｓ９を含むことができる。

【0109】

ｉｉ．Ｃａｓ９融合タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、ｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９タンパク質と、第２のドメインとの融合タンパク質を含むことができる。第２のドメインは、転写活性化ドメイン、例えばＶＰ６４ドメインまたはｐ３００ドメイン、転写抑制ドメイン、例えばＫＲＡＢドメイン、ヌクレアーゼドメイン、転写終結因子ドメイン、ヒストン修飾ドメイン、核酸会合ドメイン、アセチラーゼドメイン、脱アセチル化酵素ドメイン、メチル化酵素ドメイン、例えばＤＮＡメチル化酵素ドメイン、脱メチル化酵素ドメイン、リン酸化ドメイン、ユビキチン化ドメイン、またはＳＵＭＯ化ドメインを含むことができる。第２のドメインは、ＤＮＡメチル化またはクロマチンループ形成（ｌｏｏｐｉｎｇ）のモディファイヤーであり得る。

【0110】

いくつかの実施態様では、前記融合タンパク質は、ｄＣａｓ９ドメインと転写活性化因子とを含むことができる。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含むことができる。他の実施態様では、前記融合タンパク質は、ｄＣａｓ９ドメインと転写抑制因子とを含むことができる。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含むことができる。さらなる態様では、前記融合タンパク質は、ｄＣａｓ９ドメインと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性とは異なる部位特異的ヌクレアーゼとを含むことができる。

【0111】

前記融合タンパク質は、第１のポリペプチドドメインがＣａｓタンパク質を含み、第２のポリペプチドドメインがヌクレアーゼ活性を有しない、２つの異種ポリペプチドドメインを含むことができる。前記融合タンパク質は、上に記載した通りに、ヌクレアーゼ活性を有する第２のポリペプチドドメインと融合された、Ｃａｓ９タンパク質または変異したＣａｓ９タンパク質を含むことができる。この第２のポリペプチドドメインは、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性とは異なるヌクレアーゼ活性を有することができる。ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することが可能な酵素である。ヌクレアーゼは通常、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼにさらに分類されるが、いくつかの酵素は、どちらのカテゴリーにも属することができる。よく知られているヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼである。

【0112】

（１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、エピゲノム編集の例外的特異性を用いて調節エレメント機能を活性化することができる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、および標的遺伝子発現を増大または低下させるために標的とすることができる遺伝子座制御領域についてスクリーニングするために使用することができる。この技術は、ＥＮＣＯＤＥおよびＲｏａｄｍａｐ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓプロジェクトなどのゲノム研究を通じて特定された推定上の調節エレメントに機能を割り当てるために使用することができる。

【0113】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ＤＮＡメチル化を改変する、クロマチンループ形成させる、またはその標的部位でのヒストンＨ３リジン２７のアセチル化を触媒して、プロモーターならびに近位および遠位エンハンサーからの標的遺伝子の頑強な転写活性化をもたらすことによって、遺伝子発現を活性化することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、高度に特異的であり、わずか１つのガイドＲＮＡしか使用せずに、標的遺伝子に誘導することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ゲノム内の離れた位置のエンハンサーを標的にするすることによって、１つの遺伝子、または遺伝子のファミリーの発現を活性化することができる。

【0114】

（ａ）ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ｐ３００タンパク質、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ；ｐ３００の類似体）、ＧＣＮ５、もしくはＰＣＡＦ、またはこれらの断片などの、ヒストンアセチル化酵素タンパク質を含むことができる。プログラム可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく融合タンパク質を使用して、調節エレメントにおけるヒストンをアセチル化することは、標的遺伝子の発現を増大させるための有効な戦略である。ゲノム内のいずれかの部位に標的化させることができるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくヒストンアセチル化酵素は、遠位調節エレメントを活性化する独特の能力がある。ヒストンアセチル化酵素タンパク質は、ヒトｐ３００タンパク質またはその断片を含むことができる。ヒストンアセチル化酵素タンパク質は、野生型ヒトｐ３００タンパク質または変異ヒトｐ３００タンパク質、またはその断片を含むことができる。ヒストンアセチル化酵素タンパク質は、ヒトｐ３００タンパク質のコア・リジン－アセチルトランスフェラーゼドメイン、すなわち、ｐ３００ ＨＡＴ Ｃｏｒｅ（「ｐ３００ Ｃｏｒｅ」としても公知である）を含むことができる。

【0115】

（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９^{p300 Core}活性化系
ｐ３００タンパク質は、体全体にわたる組織における多くの遺伝子の活性を調節する。ｐ３００タンパク質は、細胞成長および分裂を調節する、また、細胞が成熟するのを促し、特殊化機能（分化させる）を担う、また、癌性腫瘍の成長を予防する役割を果たす。ｐ３００タンパク質は、転写因子を、細胞の核内で転写を行うタンパク質の複合体と連結させることによって、転写を活性化することができる。ｐ３００タンパク質はまた、クロマチンリモデリングを介して転写を調節するヒストンアセチル化酵素としても機能する。

【0116】

ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質は、標的とされる内在性遺伝子座でのアセチル化を合成的に操作し、近位および遠位エンハンサーによって調節される遺伝子の調節をもたらすための、強力かつ容易にプログラム可能な手段である。ｐ３００ Ｃｏｒｅは、ヒストンＨ３上のリジン２７をアセチル化し（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）、Ｈ３Ｋ２７ａｃ濃縮を提供することができる。ｐ３００の触媒コアドメインとｄＣａｓ９との融合体は、頑強なタンパク質発現にもかかわらず、下流遺伝子の、完全長ｐ３００タンパク質の直接的融合体よりも実質的に高いトランス活性化をもたらす可能性がある。ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質はまた、例えば、Ｎｍ－ｄＣａｓ９骨格の状況で、特に、遠位エンハンサー領域で（そこではｄＣａｓ９^VP64は、わずかな、あるとしても測定可能な下流転写活性しか呈さなかった）、ｄＣａｓ９^VP64と比較して増大したトランス活性化能力を示す可能性がある。さらに、ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、正確で確実なゲノムワイド転写特異性を呈する。ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、エピジェネティック修飾されたエンハンサーによって標的にされるプロモーターでの強力な転写活性化およびアセチル化の同時濃縮の能力があり得る。

【0117】

ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、プロモーターおよび／または特徴付けられたエンハンサーを標的にし、これと結合する単一のｇＲＮＡを介して、遺伝子発現を活性化することができる。この技術はまた、推定上のおよび既知の調節領域から遠位の遺伝子を人工的にトランス活性化する能力をもたらし、単一のプログラム可能なエフェクターと単一の標的部位の適用を介するトランス活性化を容易にする。これらの能力は、いくつかのプロモーターおよび／またはエンハンサーを同時に標的にするための多重化を可能にする。哺乳類起源のｐ３００は、免疫原性の可能性を最小限にすることによって、インビボ適用について、ウイルス由来のエフェクタードメインに対する利点を提供することができる。

【0118】

ｄＣａｓ９^{p300 Core}による遺伝子活性化は、標的遺伝子に対して高度に特異的である。いくつかの実施態様では、ｐ３００ Ｃｏｒｅは、配列番号２のアミノ酸１０４８～１６６４（すなわち、配列番号４）を含む。いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、配列番号２のｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質または配列番号５のＮｍ－ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質を含む。

【0119】

（２）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子抑制系
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、エピゲノム編集の例外的特異性を用いて調節エレメント機能を阻害することが可能な、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子抑制系であり得る。いくつかの実施態様では、ｄＣａｓ９ＫＲＡＢを含むものなどの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子抑制系は、標的とされる遺伝子座のエピジェネティック状態の高度に特異的なリモデリングによって、遠位エンハンサー活性を阻害することができる。

【0120】

（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９^KRAB遺伝子抑制系
ｄＣａｓ９^KRABリプレッサーは、遺伝子機能を研究するための、および薬物開発のための標的を発見するための、機能喪失スクリーニングにおいて使用することができる、高度に特異的なエピゲノム編集ツールである。ｄＣａｓ９^KRABは、ある特定のエンハンサーを標的にし、エンハンサーの標的遺伝子のみを発現抑制し、その部位に抑制的ヘテロクロマチン環境を作り出す、例外的特異性を有する。ｄＣａｓ９－^KRABは、近位または遠位調節エレメント、および対応する遺伝子標的を発現抑制することによって、内在性ゲノム状況内の新規の調節エレメントについてスクリーニングするために使用することができる。ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢリプレッサーの特異性は、これを内在性遺伝子を発現抑制するためのトランスクリプトーム規模の特異性のために使用することを可能にする。標的とされる遺伝子座での破壊のためのエピジェネティック機構としてはヒストンメチル化などがある。

【0121】

ＫＲＡＢドメイン、すなわち天然に存在するジンクフィンガー転写因子内の典型的なヘテロクロマチン形成モチーフは、ｄＣａｓ９と遺伝的に関連しており、ＲＮＡガイド型の合成リプレッサー、ｄＣａｓ９^KRABを作り出す。クルッペル関連ボックス（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｏｘ）（「ＫＲＡＢ」）は、ヘテロクロマチン形成因子：Ｋａｐ１、ＨＰ１、ＳＥＴＤＢ１、ＮｕＲＤを動員する。これは、Ｈ３Ｋ０トリメチル化、ヒストン脱アセチル化を誘発する。ＫＲＡＢに基づく合成リプレッサーは、単一遺伝子の発現を効率的に抑制することができ、癌遺伝子を抑制する、ウイルス複製を阻害する、およびドミナントネガティブ疾患を治療するために用いられている。

【0122】

４．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系
開示した最適化されたｇＲＮＡは、プレボテラおよびフランシセラ１（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）または（「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１」）系由来の「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）」と共に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系、すなわちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系と類似のＤＮＡ編集技術は、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）細菌において見られ、ウイルス由来の遺伝子損傷を防ぐ。Ｃｐｆ１は、１，３００アミノ酸のタンパク質を含有する、クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１遺伝子は、ウイルスＤＮＡを発見および切断するためにガイドＲＮＡを使用するエンドヌクレアーゼをコードする、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と関係がある。機能性のＣｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、ｃｒＲＮＡのみが必要とされるので、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９よりも小さく単純なエンドヌクレアーゼであり、より小さなｓｇＲＮＡ分子（Ｃａｓ９のヌクレオチド数のほぼ半分）を有する。最適化されたｇＲＮＡと共に使用することができるＣｐｆ１の例としては、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）およびラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌由来のＣｐｆ１が挙げられる。

【0123】

Ｃｐｆ１遺伝子座は、ＩＩ型系よりもＩおよびＩＩＩ型と類似している、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣａｓ４タンパク質をコードする。Ｃｐｆ１遺伝子座は、混合型α／βドメイン、ＲｕｖＣ－Ｉ、それに続いてヘリックス領域、ＲｕｖＣ－ＩＩ、およびジンクフィンガー様ドメインを含有する。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインと類似であるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有する。Ｃｐｆ１は、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Ｃｐｆ１のＮ末端は、Ｃａｓ９のαヘリックス認識ローブを有しない。Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓドメイン構造は、Ｃｐｆ１が、機能的に独特であり、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系に分類されることを示す。

【0124】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系は、Ｃｐｆ１酵素と、二重らせん上の正しい場所を発見しその場所に複合体を配置して標的ＤＮＡを切断するガイドＲＮＡからなる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系活性は、３つの段階：適合、ｃｒＲＮＡの形成、および干渉を有する。適合段階中、Ｃａｓ１およびＣａｓ２タンパク質は、ＤＮＡの小断片のＣＲＩＳＰＲアレイへの適合を容易にする。ｃｒＲＮＡの形成段階は、Ｃａｓタンパク質を誘導するための、成熟ｃｒＲＮＡを産生するｐｒｅ－ｃｒ－ＲＮＡのプロセシングを含む。干渉段階では、Ｃｐｆ１が、ｃｒＲＮＡに結合されて、標的ＤＮＡ配列を特定および切断するための二成分複合体が形成される。

【0125】

Ｃａｓ９によってＧリッチＰＡＭが標的とされるのに対して、Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ５’－ＹＴＮ－３’（ここで、「Ｙ」はピリミジンであり、「Ｎ」はあらゆる核酸塩基である）または５’－ＴＴＮ－３’の特定によって、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する。Ｃａｓ９によって標的とされるＰＡＭが、ガイドＲＮＡの３’側にあるのに対して、Ｃｐｆ１によって標的とされるＰＡＭは、ガイドＲＮＡの５’側にある。ＰＡＭの特定後、Ｃａｓ９の平滑末端切断とは対照的に、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドオーバーハングの粘着末端様ＤＮＡ二本鎖切断を導入し、それによって、遺伝子挿入の効率およびＮＨＥＪまたはＨＤＲ中の特異性を増強する。ヒトゲノムは、ＧリッチよりもＴリッチが多いので、ＴＴＮ ＰＡＭ部位は、ヒトゲノム工学にとって、ＧＧＮ ＰＡＭ部位よりも有用である。Ｃｐｆ１のためのｇＲＮＡのプロトスペーサー－ターゲティングセグメントが、その３’最末端にあるのに対して、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡは、その５’最末端にある。

【0126】

５．ｇＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、ある核酸配列を標的にする、本明細書に記載した通りの最適化されたｇＲＮＡなどの、少なくとも１種のｇＲＮＡを含むことができる。ｇＲＮＡは、標的領域または遺伝子への、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の特異的なターゲティングを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系についてはｇＲＮＡは、２種のノンコーディングＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合体である。ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、所望のＤＮＡ標的との相補的塩基対形成を介して、ターゲティング特異性を付与する２０ｂｐプロトスペーサーをコードする配列を交換することによって、任意の所望のＤＮＡ配列を標的にすることができる。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクター系に含まれる天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。この二重鎖は、例えば、４２ヌクレオチドのｃｒＲＮＡと７５ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含むことができ、Ｃａｓ９のためのガイドとして作用する。ｇＲＮＡは、標的遺伝子の標的領域を標的にし、これと結合することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系については、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡである。

【0127】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを含むことができ、ここでは、これらのｇＲＮＡは、異なるＤＮＡ配列を標的にする。これらの標的ＤＮＡ配列は、オーバーラップしていることが可能である。標的配列またはプロトスペーサーの後に、プロトスペーサーの３’末端のＰＡＭ配列が続く。別のＩＩ型系は、異なるＰＡＭ要件を有する。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型系は、「ＮＧＧ」配列を使用し、ここでは、「Ｎ」は、あらゆるヌクレオチドであり得る。

【0128】

６．最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法
本開示は、ヘアピンｇＲＮＡ（本明細書では「ｈｐｇＲＮＡ」または「ｈｐ－ｇＲＮＡ」とも呼ばれる）などの最適化されたｇＲＮＡを産生する方法を対象とする。最適化されたｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのヌクレオチド配列、および完全長ｇＲＮＡの５’末端または３’末端に付加されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、完全長ｇＲＮＡは、ＳｇＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎｅｒ、ＣＲＩＳＰＲ ＭｕｌｔｉＴａｒｇｅｔｅｒ、またはＳＳＦｉｎｄｅｒなどのプログラムを使用して設計することができる。完全長ｇＲＮＡの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系については５’末端、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系については３’末端に付加されたヌクレオチドは、完全長ｇＲＮＡのプロトスペーサー－ターゲティング配列内のヌクレオチドとハイブリッド形成するまたは部分的にハイブリッド形成することによって、二次構造を形成することができる。この二次構造は、ｇＲＮＡによるＤＮＡ二重鎖の侵入を妨害することによって、ＤＮＡ結合または切断を調節する。この二次構造は、相補的ＤＮＡ鎖を有するｇＲＮＡの結合エネルギーではなくｇＲＮＡの侵入速度論に影響を与える。下の実施例に記載する通り、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のガイドＲＮＡは、「ストランド侵入」として公知であるＣａｓ９促進型のプロセスを通してプロトスペーサーと結合し、そこでは、Ｃａｓ９タンパク質自体が、直接的相互作用を介してプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）にまず結合してこれを融解し、続いて、ｇＲＮＡの３’末端の、ＰＡＭ隣接ヌクレオチド（「シード（ｓｅｅｄ）」領域）との塩基対合が、ｇＲＮＡの３’から、プロトスペーサーとの５’末端塩基対合まで、ヌクレオチドごとに進行する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系でも類似の機構が使用される。

【0129】

完全長ｇＲＮＡの５’末端または３’末端に付加されたヌクレオチドは、熱力学的平衡でのプロトスペーサーへの接近を阻止するために、ガイドＲＮＡ（ヘアピン）のプロトスペーサー－ターゲティングセグメントとハイブリッド形成させるために単に付加されるわけではない。実施例に記載する通り、平衡熱力学的二次構造特性（ｇＲＮＡ二次構造の融解温度など）は、ガイドＲＮＡの特異性とすべて相関するわけではない。むしろ、切断の場合には、また、Ｃａｓ９結合についてのその後のコンピュータ研究では（細胞におけるＣｈＩＰ－Ｓｅｑを通して測定される通り（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２９１６；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９を参照のこと））、これらのおよび推定されるストランド侵入速度論と、オンおよびオフターゲット部位との平衡状態での結合について熱力学的に競うように設計されたヘアピンとは必然的に異なる、プロトスペーサーへのストランド侵入を調節するガイドＲＮＡの構造、設計、および機能との間に、有意かつ実質的な相関が存在する。例えば、平衡状態で安定であるように設計された二次構造エレメント（ステム内に内部ｒＧ－ｒＵゆらぎ対を含有するヘアピン様構造を形成するＲＮＡなど）は、ストランド侵入中に急速に不安定化され得る（例えば、ｒＧ－ｒＵゆらぎ対は、ステムの末端塩基対となるので、隣接するヌクレオチドがプロトスペーサーに侵入するにつれて、ＲＮＡ二次構造上の著しいエネルギー損失を被り、また、熱力学的平衡でのプロトスペーサーへの接近を単に阻止することによるものとは完全に別の機構によって、ストランド侵入および結合速度論を調節する）。平衡状態で安定であるが、ストランド侵入中に急速に不安定化される二次構造は、ｃｉｓ－ブロッキングまたは熱力学的競合では実質的に識別することができない、部位間の最小熱力学的エネルギー差（例えば、単一の内部ミスマッチの結果）を用いてオンターゲット部位とオフターゲット部位とを識別する方式で、本明細書に記載した方法を使用して設計することができる。オンターゲット部位の侵入が、Ｇ－Ｕゆらぎ対を含有するヘアピンを不安定化する場合、この部位は、侵入によって速度論的に識別される。例えば、下の実施例に記載するＶＥＧＦＡ１部位（標的部位がＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＣＣであり、オフターゲット部位２が

【化1】

である；下線部はミスマッチ）は、ストランド侵入について考慮する計算によって設計された二次構造を使用して、オフターゲット切断を、標準もしくは完全長ガイドＲＮＡまたは切り詰め型ガイドＲＮＡと比較して、それぞれ９３％および９８％低下させることができた。

【0130】

さらに、ガイドＲＮＡによるストランド侵入の開始を増強するために、「シード」領域内のｇＲＮＡのプロトスペーサー－ターゲティングセグメント上の「天然に存在する」二次構造を破壊するために、完全長ｇＲＮＡの５’末端または３’末端に、ヌクレオチドを付加することができる。したがって、ＤＮＡ結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）または切断を調節するために、プロトスペーサー－ターゲティング配列内のヌクレオチドと部分的にハイブリッド形成することによってストランド侵入を変更する二次構造を形成する、これらのヌクレオチドの付加は、異なるクラスのガイドＲＮＡ改変に相当する。

【0131】

最適化されたｇＲＮＡは、オフターゲット部位での結合を最小にし、かつプロトスペーサー配列に結合させるように設計される。いくつかの実施態様では、オフターゲット部位は、公知のまたは予測されるオフターゲット部位である。いくつかの実施態様では、前記方法は、対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程と（前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端と、ＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である）；侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程と（ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される）；第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、この第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程とを含む。

【0132】

いくつかの実施態様では、前記方法は、対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程と（前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である）；侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程と（ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される）；第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、この第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程とを含む。

【0133】

いくつかの実施態様では、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入のエネルギー特性が、（Ｉ）ＤＮＡ－ＤＮＡ塩基対合を切断すること、（ＩＩ）ＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対を形成すること、（ＩＩＩ）侵入されていないガイドＲＮＡ内の異なる二次構造を破壊することまたは形成することから生じるエネルギー差、および（ＩＶ）プロトスペーサーと相補的である置き換えられたＤＮＡ鎖と、二次構造には含まれないいずれかの非対合ガイドＲＮＡヌクレオチドとの間の相互作用を形成することまたは破壊することのうちの少なくとも１つのエネルギー特性を決定することによって決定される。いくつかの実施態様では、第１のｇＲＮＡの、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列への再アニーリングのエネルギー特性が、（Ｉ）ＤＮＡ－ＤＮＡ塩基対合を形成すること、（ＩＩ）ＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対を切断すること、（ＩＩＩ）新たに侵入されていないガイドＲＮＡ内の異なる二次構造を破壊することまたは形成することから生じるエネルギー差、および（ＩＶ）プロトスペーサーと相補的である置き換えられたＤＮＡ鎖と、二次構造には含まれないいずれかの非対合ガイドＲＮＡヌクレオチドとの間の相互作用を形成することまたは破壊することのうちの少なくとも１つのエネルギー特性を決定することによって決定される。いくつかの実施態様では、前記方法は、（Ｖ）ミスマッチにわたる塩基対合、（ＶＩ）Ｃａｓ９タンパク質との相互作用、および／または（ＶＩＩ）追加のヒューリスティクス（ここで、追加のヒューリスティクスは、結合寿命、侵入の程度、侵入するガイドＲＮＡの安定性、またはＣａｓ９切断活性に対するｇＲＮＡ侵入の、他の算出される／シミュレーションされる特性に関する）のうちの少なくとも１つから、エネルギー的考察を決定することをさらに含む。

【0134】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、様々な配列および長さの、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどのｇＲＮＡを使用することができる。いくつかの実施態様では、完全長ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列のポリヌクレオチド配列（すなわち、プロトスペーサー）に対応するプロトスペーサー－ターゲティングセグメントを含むことができる。いくつかの実施態様では、このプロトスペーサー－ターゲティングセグメントは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１１ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１３ヌクレオチド、少なくとも１４ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、少なくとも２２ヌクレオチド、少なくとも２３ヌクレオチド、少なくとも２４ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも３５ヌクレオチドを有することができる。前記ｇＲＮＡは、標的遺伝子の、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー領域、インスレーター領域、サイレンサー領域、プロモーター領域を有するＤＮＡループ形成に関与する領域、遺伝子スプライシング領域、または転写領域のうちの少なくとも１つを標的にすることができる。いくつかの実施態様では、前記完全長ｇＲＮＡは、約１５から２０ヌクレオチドを有するプロトスペーサー－ターゲティングセグメントを含む。

【0135】

いくつかの実施態様では、ＲＮＡセグメントは、２から２０ヌクレオチド、３から１０ヌクレオチド、または５から８ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列を補完する、２から２０ヌクレオチド、３から１０ヌクレオチド、または５から８ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、Ｍは、１から２０、１から１９、１から１８、１から１７、１から１６、１から１５、１から１４、１から１３、１から１２、１から１１、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、２から２０、２から１９、２から１８、２から１７、２から１６、２から１５、２から１４、２から１３、２から１２、２から１１、２から１０、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、３から２０、３から１９、３から１８、３から１７、３から１６、３から１５、３から１４、３から１３、３から１２、３から１１、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、４から２０、４から１９、４から１８、４から１７、４から１６、４から１５、４から１４、４から１３、４から１２、４から１１、４から１０、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から２０、５から１９、５から１８、５から１７、５から１６、５から１５、５から１４、５から１３、５から１２、５から１１、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から２０、６から１９、６から１８、６から１７、６から１６、６から１５、６から１４、６から１３、６から１２、６から１１、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から２０、７から１９、７から１８、７から１７、７から１６、７から１５、７から１４、７から１３、７から１２、７から１１、７から１０、７から９、７から８、８から２０、８から１９、８から１８、８から１７、８から１６、８から１５、８から１４、８から１３、８から１２、８から１１、８から１０、８から９、９から２０、９から１９、９から１８、９から１７、９から１６、９から１５、９から１４、９から１３、９から１２、９から１１、または９から１０である。例えば、Ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり得る。いくつかの実施態様では、ＲＮＡセグメントは、そのうちのいくつか、またはそのうちのすべてが、プロトスペーサー－ターゲティング配列を補完する、１から２０、１から１９、１から１８、１から１７、１から１６、１から１５、１から１４、１から１３、１から１２、１から１１、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、２から２０、２から１９、２から１８、２から１７、２から１６、２から１５、２から１４、２から１３、２から１２、２から１１、２から１０、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、３から２０、３から１９、３から１８、３から１７、３から１６、３から１５、３から１４、３から１３、３から１２、３から１１、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、４から２０、４から１９、４から１８、４から１７、４から１６、４から１５、４から１４、４から１３、４から１２、４から１１、４から１０、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から２０、５から１９、５から１８、５から１７、５から１６、５から１５、５から１４、５から１３、５から１２、５から１１、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から２０、６から１９、６から１８、６から１７、６から１６、６から１５、６から１４、６から１３、６から１２、６から１１、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から２０、７から１９、７から１８、７から１７、７から１６、７から１５、７から１４、７から１３、７から１２、７から１１、７から１０、７から９、７から８、８から２０、８から１９、８から１８、８から１７、８から１６、８から１５、８から１４、８から１３、８から１２、８から１１、８から１０、８から９、９から２０、９から１９、９から１８、９から１７、９から１６、９から１５、９から１４、９から１３、９から１２、９から１１、または９から１０ヌクレオチドを有することができる。いくつかの実施態様では、ＲＮＡセグメントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドを有することができる。

【0136】

いくつかの実施態様では、Ｎは、１から２０、１から１９、１から１８、１から１７、１から１６、１から１５、１から１４、１から１３、１から１２、１から１１、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、２から２０、２から１９、２から１８、２から１７、２から１６、２から１５、２から１４、２から１３、２から１２、２から１１、２から１０、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、３から２０、３から１９、３から１８、３から１７、３から１６、３から１５、３から１４、３から１３、３から１２、３から１１、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、４から２０、４から１９、４から１８、４から１７、４から１６、４から１５、４から１４、４から１３、４から１２、４から１１、４から１０、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から２０、５から１９、５から１８、５から１７、５から１６、５から１５、５から１４、５から１３、５から１２、５から１１、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から２０、６から１９、６から１８、６から１７、６から１６、６から１５、６から１４、６から１３、６から１２、６から１１、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から２０、７から１９、７から１８、７から１７、７から１６、７から１５、７から１４、７から１３、７から１２、７から１１、７から１０、７から９、７から８、８から２０、８から１９、８から１８、８から１７、８から１６、８から１５、８から１４、８から１３、８から１２、８から１１、８から１０、８から９、９から２０、９から１９、９から１８、９から１７、９から１６、９から１５、９から１４、９から１３、９から１２、９から１１、または９から１０である。例えば、Ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり得る。いくつかの実施態様では、リンカーは、は、１から２０ヌクレオチド、３から１０ヌクレオチド、または５から８ヌクレオチドを含む。例えば、リンカーは、そのうちのいくつか、またはそのうちのすべてが、プロトスペーサー－ターゲティング配列を補完する、１から２０、１から１９、１から１８、１から１７、１から１６、１から１５、１から１４、１から１３、１から１２、１から１１、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、２から２０、２から１９、２から１８、２から１７、２から１６、２から１５、２から１４、２から１３、２から１２、２から１１、２から１０、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、３から２０、３から１９、３から１８、３から１７、３から１６、３から１５、３から１４、３から１３、３から１２、３から１１、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、４から２０、４から１９、４から１８、４から１７、４から１６、４から１５、４から１４、４から１３、４から１２、４から１１、４から１０、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から２０、５から１９、５から１８、５から１７、５から１６、５から１５、５から１４、５から１３、５から１２、５から１１、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から２０、６から１９、６から１８、６から１７、６から１６、６から１５、６から１４、６から１３、６から１２、６から１１、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から２０、７から１９、７から１８、７から１７、７から１６、７から１５、７から１４、７から１３、７から１２、７から１１、７から１０、７から９、７から８、８から２０、８から１９、８から１８、８から１７、８から１６、８から１５、８から１４、８から１３、８から１２、８から１１、８から１０、８から９、９から２０、９から１９、９から１８、９から１７、９から１６、９から１５、９から１４、９から１３、９から１２、９から１１、または９から１０ヌクレオチドを有することができる。いくつかの実施態様では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドを有することができる。いくつかの実施態様では、リンカーには、テトラループなどの安定化リンカーが含まれ得る。テトラループの例としては、限定はされないが、ＡＮＹＡ、ＣＵＹＧ、ＧＮＲＡ、ＵＭＡＣ、およびＵＮＣＧが挙げられる。

【0137】

いくつかの実施態様では、ＲＮＡセグメントおよび／またはプロトスペーサー－ターゲティング配列は、二次構造を提供する。いくつかの実施態様では、前記二次構造は、プロトスペーサー－ターゲティング配列を、ＲＮＡセグメントと部分的にハイブリッド形成させることによって形成される。いくつかの実施態様では、前記二次構造は、最適化されたｇＲＮＡによるプロトスペーサー二重鎖またはオフターゲット二重鎖の侵入を妨害することによって、Ｃａｓ９によるＤＮＡ結合または切断を調節する。いくつかの実施態様では、前記二次構造が、ｇＲＮＡの５’末端をタンパク質内に安定的に維持し、Ｃａｓ９内の最適化されたｇＲＮＡを保護して分解を防止する。

【0138】

いくつかの実施態様では、前記二次構造は、ＲＮＡセグメントの全体または一部を、プロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントの５’末端のヌクレオチド、プロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントの中央のヌクレオチド、および／またはプロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントの３’末端のヌクレオチドにハイブリッド形成させることによって形成される。いくつかの実施態様では、ＲＮＡセグメントの近接セグメントが、プロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントにハイブリッド形成する。いくつかの実施態様では、ＲＮＡセグメントの非近接セグメントが、プロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントにハイブリッド形成する。いくつかの実施態様では、前記二次構造は、ヘアピンである。

【0139】

いくつかの実施態様では、前記二次構造は、室温または３７℃で安定である。いくつかの実施態様では、前記二次構造の全平衡自由エネルギーは、約４℃から約５０℃の温度、例えば室温または３７℃で、約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である。例えば、前記二次構造の全平衡自由エネルギーは、約４℃から約５０℃、約４℃から約４０℃、約４℃から約３７℃、約４℃から約３０℃、約４℃から約２５℃、約４℃から約２０℃、約４℃から約１０℃、約５℃から約５０℃、約５℃から約４０℃、約５℃から約３７℃、約５℃から約３０℃、約５℃から約２５℃、約５℃から約２０℃、約５℃から約１０℃、約１０℃から約５０℃、約１０℃から約４０℃、約１０℃から約３７℃、約１０℃から約３０℃、約１０℃から約２５℃、約１０℃から約２０℃、約２０℃から約５０℃、約２０℃から約４０℃、約２０℃から約３７℃、約２０℃から約３０℃、約２５℃から約５０℃、約２５℃から約４０℃、約２５℃から約３７℃、または約２５℃から約３０℃の温度で、約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、約５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、約４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、約３ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、約１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、または約０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であり得る。いくつかの実施態様では、ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントの少なくとも２つのヌクレオチドとハイブリッド形成する、またはこれらのヌクレオチドと共に非標準塩基対を形成する。いくつかの実施態様では、非標準塩基対は、ｒＵ－ｒＧである。

【0140】

いくつかの実施態様では、１から２０ヌクレオチドが、リンカー内でランダム化される。例えば、１から２０、１から１５、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、１から４、１から３、１から２、２から２０、２から１５、２から１０、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、２から４、３から２０、３から１５、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、３から４、４から２０、４から１５、４から１０、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から２０、５から１５、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から２０、６から１５、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から２０、７から１５、７から１０、７から９、７から８、８から２０、８から１５、８から１０、８から９、９から２０、９から１５、または９から１０、１０から２０、１０から１５、または１５から２０ヌクレオチドが、リンカー内でランダム化され得る。

【0141】

いくつかの実施態様では、１から２０ヌクレオチドが、ＲＮＡセグメント内でランダム化される。例えば、１から２０、１から１５、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、１から４、１から３、１から２、２から２０、２から１５、２から１０、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、２から４、３から２０、３から１５、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、３から４、４から２０、４から１５、４から１０、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から２０、５から１５、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から２０、６から１５、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から２０、７から１５、７から１０、７から９、７から８、８から２０、８から１５、８から１０、８から９、９から２０、９から１５、または９から１０、１０から２０、１０から１５、または１５から２０ヌクレオチドが、ＲＮＡセグメント内でランダム化され得る。

【0142】

いくつかの実施態様では、ステップ（ｇ）は、Ｘ回繰り返され、それによって、Ｘ個のｇＲＮＡが産生され、それぞれのＸ個のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）が繰り返され、ここでは、Ｘは、０から２０である。いくつかの実施態様では、Ｘは、１から２０、１から１９、１から１８、１から１７、１から１６、１から１５、１から１４、１から１３、１から１２、１から１１、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、２から２０、２から１９、２から１８、２から１７、２から１６、２から１５、２から１４、２から１３、２から１２、２から１１、２から１０、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、３から２０、３から１９、３から１８、３から１７、３から１６、３から１５、３から１４、３から１３、３から１２、３から１１、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、４から２０、４から１９、４から１８、４から１７、４から１６、４から１５、４から１４、４から１３、４から１２、４から１１、４から１０、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から２０、５から１９、５から１８、５から１７、５から１６、５から１５、５から１４、５から１３、５から１２、５から１１、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から２０、６から１９、６から１８、６から１７、６から１６、６から１５、６から１４、６から１３、６から１２、６から１１、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から２０、７から１９、７から１８、７から１７、７から１６、７から１５、７から１４、７から１３、７から１２、７から１１、７から１０、７から９、７から８、８から２０、８から１９、８から１８、８から１７、８から１６、８から１５、８から１４、８から１３、８から１２、８から１１、８から１０、８から９、９から２０、９から１９、９から１８、９から１７、９から１６、９から１５、９から１４、９から１３、９から１２、９から１１、または９から１０であり得る。例えば、Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり得る。

【0143】

いくつかの実施態様では、侵入速度論および寿命は、動的モンテカルロ法またはＧｉｌｌｅｓｐｉｅアルゴリズムを使用して算出される。いくつかの実施態様では、侵入速度論および寿命は、当業者に公知である、ストランド侵入をモデル化する微分方程式などの「決定論的」方法を使用して決定することができる。動的モンテカルロ（ＫＭＣ）法は、自然に発生する何らかのプロセスの時間発展をシミュレーションすることを目的とするモンテカルロ法コンピュータシミュレーションである。このプロセスは一般的に、状態間の既知の遷移速度を伴って起こるプロセスである。この既知の遷移速度は、ＫＭＣアルゴリズムへのインプットである。Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅアルゴリズム（Ｄｏｏｂ－Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅアルゴリズムとしても公知である）は、確率方程式の、統計的に妥当な軌跡（可能な解）をもたらす。Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅアルゴリズムは、ますます複雑化する系をシミュレーションするために使用することができる。このアルゴリズムは、反応物の数が概して数十分子（またはそれ以下）にもなる、細胞内の反応をシミュレーションするのに特に有用である。数学的には、これは、動的モンテカルロ方法の変形であり、動的モンテカルロ方法と類似している。Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅアルゴリズムは、あらゆる反応が明確にシミュレーションされるので、少数の反応物を伴う系の離散シミュレーションおよび確率的シミュレーションを可能にする。単一のＧｉｌｌｅｓｐｉｅシミュレーションに対応する軌跡は、マスター方程式の解である確率質量関数からの厳密な標本を表す。

【0144】

いくつかの実施態様では、設計基準は、特異性、結合寿命の調節、および／または推定される切断特異性であり得る。例えば、最適化されたｇＲＮＡは、オンターゲット部位での完全なｇＲＮＡの結合寿命以上の結合寿命、および／またはオフターゲット部位での完全なｇＲＮＡの結合寿命以下の結合寿命を有するように設計することができる。いくつかの実施態様では、最適化されたｇＲＮＡは、少なくとも３つのオフターゲット部位（ここで、これらのオフターゲット部位は、最も近いオフターゲット部位であると予測される、またはオンターゲット部位に対する最も高い同一性を有すると予測される）に対する完全長ｇＲＮＡの結合寿命以下の結合寿命を有するように選択される。いくつかの実施態様では、設計基準は、オフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡの寿命または切断速度以下であるオフターゲット部位での寿命または切断速度、および／または、完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡの予測されるオンターゲット活性率の１０％超である、予測されるオンターゲット活性率を含む。

【0145】

いくつかの実施態様では、最適化されたｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ活性を決定するためのミスマッチ感受性ヌクレアーゼを使用して、例えば、ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイもしくはＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）アッセイ、または次世代シーケンシング技術、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑもしくはＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを使用して、ステップｉ）で試験される。いくつかの実施態様では、最適化されたｇＲＮＡは、レポーターアッセイ（ここで、Ｃａｓ９－融合タンパク質活性が、ＧＦＰなどのレポータータンパク質の発現を変更させる）を使用して、ステップｉ）で試験される。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、オフターゲット切断を分析するために考案されているアッセイである。

【0146】

いくつかの実施態様では、標的領域は、ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｓｉｇｎ（Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）８：２２８１－２３０８）およびＣＣＴｏｐ（Ｓｔｅｍｍｅｒ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１５）１０：ｅ０１２４６３３）ツールなどのプログラムを使用して、ＰＡＭ配列に対する配列の近さに基づいて決定することができる。いくつかの実施態様では、標的部位は、プロモーター、ＤＮＡｓｅ Ｉ高感受性部位、トランスポザーゼ接近可能（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ－Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）クロマチン部位、ＤＮＡメチル化部位、転写因子結合部位、エピジェネティックマーク、発現定量的形質遺伝子座、および／または遺伝子関連解析におけるヒトの形質もしくは表現型に関連する領域を含むことができる。標的部位は、ＤＮａｓｅ－シークエンシング（ＤＮａｓｅ－ｓｅｑ）、ハイスループットシークエンシングを用いるトランスポザーゼ接近可能クロマチンについての分析（Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ－Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、ＣｈＩＰ－シークエンシング、自己転写活性のある調節領域シークエンシング（ｓｅｌｆ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｉｎｇ ａｃｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＳＴＡＲＲ－Ｓｅｑ）、単一分子リアルタイムシークエンシング（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＳＭＲＴ）、調節エレメントのホルムアルデヒド支援単離シークエンシング（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＦＡＩＲＥ－ｓｅｑ）、小球菌ヌクレアーゼシークエンシング（ＭＮａｓｅ－ｓｅｑ）、提示低下バイサルファイトシークエンシング（ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＲＲＢＳ－ｓｅｑ）、全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、メチル－結合ＤＮＡ免疫沈降（ＭＥＤＩＰ－ｓｅｑ）、または遺伝子関連解析によって決定することができる。いくつかの実施態様では、オフターゲット部位は、ＣａｓＯＴ（ＰＫＵ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｇｒｏｕｐ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＣＨＯＰＣＨＯＰ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ、（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌ（Ｔｈｅ Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ ａｎｄ ＭＩＴ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ ｆｉｎｄｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、ＣＲＩＳＰＲｆｉｎｄｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｐａｒｉｓ－Ｓｕｄ）、Ｅ－ＣＲＩＳＰ（ＤＫＦＺ Ｇｅｒｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌ（ＤＮＡ ２．０）、ＰＲＯＧＮＯＳ（Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｇｅｏｒｇｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＺｉＦｉＴ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）を使用して決定することができる。標的領域およびオフターゲット部位を決定するために使用することができるツールの例は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６１０９２５５号パンフレットに記載されている。

【0147】

７．標的遺伝子
本明細書に開示する通り、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、任意の標的遺伝子の発現を標的にし、これを切断するように設計することができる。例えば、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、標的遺伝子内の標的領域を標的にし、これと結合することができる。標的遺伝子は、細胞株における、内在性遺伝子、導入遺伝子、またはウイルス遺伝子であり得る。いくつかの実施態様では、標的遺伝子は、公知の遺伝子であり得る。いくつかの実施態様では、標的遺伝子は、未知の遺伝子である。ｇＲＮＡは、あらゆる核酸配列を標的にすることができる。核酸配列標的は、ＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、あらゆる遺伝子であり得る。例えば、ｇＲＮＡは、ＤＭＤ、ＥＭＸ１、またはＶＥＧＦＡなどの遺伝子を標的にすることができる。

【0148】

いくつかの態様では、標的遺伝子は、疾患関連遺伝子である。いくつかの実施態様では、標的細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施態様では、ゲノムには、ヒトゲノムが含まれる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子は、原核生物遺伝子または真核生物遺伝子、例えば哺乳類遺伝子であり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、ＤＭＤ（ジストロフィン遺伝子）、ＥＭＸ１、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ１ＲＮ、ＭＹＯＤ１、ＯＣＴ４、ＨＢＥ、ＨＢＧ、ＨＢＤ、ＨＢＢ、ＭＹＯＣＤ（ミオカルディン（Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ））、ＰＡＸ７（ペアードボックスタンパク質（Ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｐａｘ－７）、ＦＧＦ１（線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）－１）遺伝子、例えばＦＧＦ１Ａ、ＦＧＦ１Ｂ、およびＦＧＦ１Ｃなどの、哺乳類遺伝子を標的にすることができる。他の標的遺伝子としては、限定はされないが、Ａｔｆ３、Ａｘｕｄ１、Ｂｔｇ２、ｃ－Ｆｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ、Ｃｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ２、Ｅｄｎ１、Ｅｒｅｇ、Ｆｏｓ、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｉｅｒ２、Ｉｅｒ３、Ｉｆｒｄ１、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６、Ｉｒｆ１、Ｊｕｎｂ、Ｌｉｆ、Ｎｆｋｂｉａ、Ｎｆｋｂｉｚ、Ｐｔｇｓ２、Ｓｌｃ２５ａ２５、Ｓｑｓｔｍ１、Ｔｉｅｇ、Ｔｎｆ、Ｔｎｆａｉｐ３、Ｚｆｐ３６、Ｂｉｒｃ２、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ２０、Ｃｃｌ７、Ｃｅｂｐｄ、Ｃｈ２５ｈ、ＣＳＦ１、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｃｘｃｌ１０、Ｃｘｃｌ５、Ｇｃｈ、Ｉｃａｍ１、Ｉｆｉ４７、Ｉｆｎｇｒ２、Ｍｍｐ１０、Ｎｆｋｂｉｅ、Ｎｐａｌ１、ｐ２１、Ｒｅｌｂ、Ｒｉｐｋ２、Ｒｎｄ１、Ｓ１ｐｒ３、Ｓｔｘ１１、Ｔｇｔｐ、Ｔｌｒ２、Ｔｍｅｍ１４０、Ｔｎｆａｉｐ２、Ｔｎｆｒｓｆ６、Ｖｃａｍ１、１１１０００４Ｃ０５Ｒｉｋ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１０２９１）、Ａｂｃａ１、ＡＩ５６１８７１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＩ１４３９１５）、ＡＩ８８２０７４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢ７３０９１２）、Ａｒｔｓ１、ＡＷ０４９７６５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２６６４２．１）、Ｃ３、Ｃａｓｐ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ９、Ｃｄｓｎ、Ｅｎｐｐ２、Ｇｂｐ２、Ｈ２－Ｄ１、Ｈ２－Ｋ、Ｈ２－Ｌ、Ｉｆｉｔ１、Ｉｉ、Ｉｌ１３ｒａ１、Ｉｌ１ｒｌ１、Ｌｃｎ２、Ｌｈｆｐｌ２、ＬＯＣ６７７１６８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫ０１９３２５）、Ｍｍｐ１３、Ｍｍｐ３、Ｍｔ２、Ｎａｆ１、Ｐｐｉｃａｐ、Ｐｒｎｄ、Ｐｓｍｂ１０、Ｓａａ３、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｇ、Ｓｅｒｐｉｎｆ１、Ｓｏｄ３、Ｓｔａｔ１、Ｔａｐｂｐ、Ｕ９０９２６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２０５６２）、Ｕｂｄ、Ａ２ＡＲ（アデノシンＡ２Ａ受容体）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６とも呼ばれる）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１とも呼ばれる）、ＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）；ＣＤ２７２とも呼ばれる）、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）；ＣＤ１５２とも呼ばれる）、ＩＤＯ（インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ）ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体（Ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子－３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ－３））、ＰＤ－１（プログラム死１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １）（ＰＤ－１）受容体）、ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３）、およびＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（Ｖ－ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎが挙げられる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子は、ＤＭＤ（ジストロフィン）、ＥＭＸ１、またはＶＥＧＦＡ遺伝子である。

【0149】

８．ゲノム編集のための組成物
本発明は、ゲノム編集、ゲノム変更、または標的遺伝子の遺伝子発現の変更のための組成物を対象とする。この組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と共に、開示された方法によって産生された最適化されたｇＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、オンターゲット部位とオフターゲット部位とを、これらの部位間の最小熱力学的エネルギー差を用いて識別し、増大された特異性を提供することができる。いくつかの実施態様では、最適化されたｇＲＮＡは、プロトスペーサーへのストランド侵入を調節する。

【0150】

特異性の増大は、完全長または標準ｇＲＮＡの５’末端または３’末端に、これが、「ヘアピン」構造を形成するように、プロトスペーサーを標的にする完全長または標準ｇＲＮＡのセグメントに対して自己相補的である伸長部、例えばプロトスペーサー－ターゲティング配列を付加することによって達成される。図１Ｂおよび図２Ｂを参照のこと。ヘアピンは、プロトスペーサーのストランド侵入に対する速度論的バリアとして働くが、完全な標的部位のストランド侵入中は、ヘアピンは置き換えられ、完全な侵入が起こる可能性がある。

【0151】

図２Ｄに示す通り、ｄＣａｓ９による完全なプロトスペーサーへの結合は、優先的に起こり、これは、ヘアピンが、侵入中に実際に置き換えられることを強く示唆している。ヘアピンである開示された最適化されたｇＲＮＡは、標的と、ガイドＲＮＡのＰＡＭ遠位ターゲティング領域との間のミスマッチが存在する場合に侵入を阻害することによって、標的とされる部位に結合する際の特異性が増大されるように設計された。この場合には、ヘアピンにとっては、閉じたままであることが、エネルギー的に、より好都合であり、ヘアピンの存在は、融解およびこれらの部位からのＣａｓ９／ｄＣａｓ９の脱離を促進する可能性が高い。

【0152】

５’－ヘアピンまたは３’－ヘアピンを有する最適化されたｇＲＮＡ（ｈｐｇＲＮＡ）は、結合の際の特異性を、標準のガイドＲＮＡおよび利用可能な最良のガイドＲＮＡバリアント（実施例参照）の両方と比較して著しく増強し、ミスマッチを含有するプロトスペーサー部位での結合をなくすまたは著しく弱めた。ヘアピンの長さを増大させることは、ｄＣａｓ９結合の特異性を増大させた。最適化されたｇＲＮＡおよびｈｐｇＲＮＡは、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９またはＣｐｆ１結合の親和性および特異性を調整するために使用することができる。ヘアピンのサイズおよび構造に基づいて、ｈｐｇＲＮＡのヘアピンを、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９分子のＤＮＡ結合チャネル内に適合させ、分解から保護することができた。いくつかの実施態様では、ヘアピン長、ループ長、およびループ組成を、これらの特性の、より精細な制御を可能にするために変化させることができる。いくつかの実施態様では、前記ヘアピン長は、約１から約２０ヌクレオチドまたは約３から約１０ヌクレオチドであり得る。例えば、前記ヘアピン長は、１から２０、１から１９、１から１８、１から１７、１から１６、１から１５、１から１４、１から１３、１から１２、１から１１、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、２から２０、２から１９、２から１８、２から１７、２から１６、２から１５、２から１４、２から１３、２から１２、２から１１、２から１０、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、３から２０、３から１９、３から１８、３から１７、３から１６、３から１５、３から１４、３から１３、３から１２、３から１１、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、４から２０、４から１９、４から１８、４から１７、４から１６、４から１５、４から１４、４から１３、４から１２、４から１１、４から１０、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から２０、５から１９、５から１８、５から１７、５から１６、５から１５、５から１４、５から１３、５から１２、５から１１、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から２０、６から１９、６から１８、６から１７、６から１６、６から１５、６から１４、６から１３、６から１２、６から１１、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から２０、７から１９、７から１８、７から１７、７から１６、７から１５、７から１４、７から１３、７から１２、７から１１、７から１０、７から９、７から８、８から２０、８から１９、８から１８、８から１７、８から１６、８から１５、８から１４、８から１３、８から１２、８から１１、８から１０、８から９、９から２０、９から１９、９から１８、９から１７、９から１６、９から１５、９から１４、９から１３、９から１２、９から１１、または９から１０であり得る。例えば、前記ヘアピン長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、または約５から約８ヌクレオチドであり得る。

【0153】

いくつかの実施態様では、前記ループ長は、約１から約２０ヌクレオチド、約３から約１０ヌクレオチド、または約５から約８ヌクレオチドであり得る。例えば、前記ループ長は、１から２０、１から１９、１から１８、１から１７、１から１６、１から１５、１から１４、１から１３、１から１２、１から１１、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、２から２０、２から１９、２から１８、２から１７、２から１６、２から１５、２から１４、２から１３、２から１２、２から１１、２から１０、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、３から２０、３から１９、３から１８、３から１７、３から１６、３から１５、３から１４、３から１３、３から１２、３から１１、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、４から２０、４から１９、４から１８、４から１７、４から１６、４から１５、４から１４、４から１３、４から１２、４から１１、４から１０、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から２０、５から１９、５から１８、５から１７、５から１６、５から１５、５から１４、５から１３、５から１２、５から１１、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から２０、６から１９、６から１８、６から１７、６から１６、６から１５、６から１４、６から１３、６から１２、６から１１、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から２０、７から１９、７から１８、７から１７、７から１６、７から１５、７から１４、７から１３、７から１２、７から１１、７から１０、７から９、７から８、８から２０、８から１９、８から１８、８から１７、８から１６、８から１５、８から１４、８から１３、８から１２、８から１１、８から１０、８から９、９から２０、９から１９、９から１８、９から１７、９から１６、９から１５、９から１４、９から１３、９から１２、９から１１、または９から１０であり得る。いくつかの実施態様では、前記ループ長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、または約５から約８ヌクレオチドであり得る。

【0154】

いくつかの実施態様では、ループ組成は、約１から約２０ヌクレオチド、約３から約１０ヌクレオチド、または約５から約８ヌクレオチドであり得る。例えば、前記ループ組成は、１から２０、１から１９、１から１８、１から１７、１から１６、１から１５、１から１４、１から１３、１から１２、１から１１、１から１０、１から９、１から８、１から７、１から６、１から５、２から２０、２から１９、２から１８、２から１７、２から１６、２から１５、２から１４、２から１３、２から１２、２から１１、２から１０、２から９、２から８、２から７、２から６、２から５、３から２０、３から１９、３から１８、３から１７、３から１６、３から１５、３から１４、３から１３、３から１２、３から１１、３から１０、３から９、３から８、３から７、３から６、３から５、４から２０、４から１９、４から１８、４から１７、４から１６、４から１５、４から１４、４から１３、４から１２、４から１１、４から１０、４から９、４から８、４から７、４から６、４から５、５から２０、５から１９、５から１８、５から１７、５から１６、５から１５、５から１４、５から１３、５から１２、５から１１、５から１０、５から９、５から８、５から７、５から６、６から２０、６から１９、６から１８、６から１７、６から１６、６から１５、６から１４、６から１３、６から１２、６から１１、６から１０、６から９、６から８、６から７、７から２０、７から１９、７から１８、７から１７、７から１６、７から１５、７から１４、７から１３、７から１２、７から１１、７から１０、７から９、７から８、８から２０、８から１９、８から１８、８から１７、８から１６、８から１５、８から１４、８から１３、８から１２、８から１１、８から１０、８から９、９から２０、９から１９、９から１８、９から１７、９から１６、９から１５、９から１４、９から１３、９から１２、９から１１、または９から１０であり得る。いくつかの実施態様では、ループ組成は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０、または約５から約８ヌクレオチドであり得る。

【0155】

前記組成物は、ウイルスベクターと、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系とを含むことができる。いくつかの実施態様では、前記組成物は、改変されたＡＡＶベクターと、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系をコードするヌクレオチド配列とを含む。前記組成物は、ドナーＤＮＡまたは導入遺伝子をさらに含むことができる。これらの組成物は、ゲノム編集、ゲノム工学、および遺伝性疾患に関与する遺伝子の変異の影響の修正または低減において使用することができる。

【0156】

標的遺伝子は、細胞の分化に、または、遺伝子の活性化、抑制、もしくは破壊が所望される可能性がある、または欠失、フレームシフト変異、もしくはナンセンス変異などの変異を有する可能性がある、いずれかの他のプロセスに関与する可能性がある。標的遺伝子が、未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位、または異所性スプライス供与部位を引き起こす変異を有する場合、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、これらの未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位、または異所性スプライス供与部位の上流または下流のヌクレオチド配列を認識および結合するように設計することができる。本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系はまた、スプライス受容部および供与部を標的にして、未成熟終止コドンのスキッピングを誘発するまたは破壊された読み枠を修復することによって、正常な遺伝子スプライシングを破壊するために使用することもできる。本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、ゲノムのタンパク質－コード領域へのオフターゲット変化を媒介する可能性もしない可能性もある。

【0157】

いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、標的遺伝子の遺伝子発現を、遺伝子発現の対照レベルと比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１３０倍、少なくとも１４０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも１６０倍、少なくとも１７０倍、少なくとも１８０倍、少なくとも１９０倍、少なくとも２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１５００倍、少なくとも２０００倍、少なくとも２５００倍、少なくとも３０００倍、少なくとも３５００倍、少なくとも４０００倍、少なくとも４５００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７０００倍、少なくとも８０００倍、少なくとも９０００倍、少なくとも１００００倍、少なくとも１０００００倍、誘発または抑制する。標的遺伝子の遺伝子発現の対照レベルは、いずれのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系でも処理されていない細胞における標的遺伝子の遺伝子発現のレベルであり得る。

【0158】

ａ．改変されたレンチウイルスベクター
ゲノム編集、ゲノム変更、または標的遺伝子の遺伝子発現の変更のための組成物は、改変されたレンチウイルスベクターを含むことができる。この改変されたレンチウイルスベクターは、系をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、少なくとも１種のｓｇＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む。第１のポリヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結せることができる。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節性プロモーターであり得る。

【0159】

第２のポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの、少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする。例えば、第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１種のｇＲＮＡ、少なくとも２種のｇＲＮＡ、少なくとも３種のｇＲＮＡ、少なくとも４種のｇＲＮＡ、少なくとも５種のｇＲＮＡ、少なくとも６種のｇＲＮＡ、少なくとも７種のｇＲＮＡ、少なくとも８種のｇＲＮＡ、少なくとも９種のｇＲＮＡ、少なくとも１０種のｇＲＮＡ、少なくとも１１種のｇＲＮＡ、少なくとも１２種のｇＲＮＡ、少なくとも１３種のｇＲＮＡ、少なくとも１４種のｇＲＮＡ、少なくとも１５種のｇＲＮＡ、少なくとも１６種のｇＲＮＡ、少なくとも１７種のｇＲＮＡ、少なくとも１８種のｇＲＮＡ、少なくとも１９種のｇＲＮＡ、少なくとも２０種のｇＲＮＡ、少なくとも２５種のｇＲＮＡ、少なくとも３０種のｇＲＮＡ、少なくとも３５種のｇＲＮＡ、少なくとも４０種のｇＲＮＡ、少なくとも４５種のｇＲＮＡ、または少なくとも５０種のｇＲＮＡをコードすることができる。第２のポリヌクレオチド配列は、１種のｇＲＮＡから５０種のｇＲＮＡ、１種のｇＲＮＡから４５種のｇＲＮＡ、１種のｇＲＮＡから４０種のｇＲＮＡ、１種のｇＲＮＡから３５種のｇＲＮＡ、１種のｇＲＮＡから３０種のｇＲＮＡ、１種のｇＲＮＡから２５種の異なるｇＲＮＡ、１種のｇＲＮＡから２０種のｇＲＮＡ、１種のｇＲＮＡから１６種のｇＲＮＡ、１種のｇＲＮＡから８種の異なるｇＲＮＡ、４種の異なるｇＲＮＡから５０種の異なるｇＲＮＡ、４種の異なるｇＲＮＡから４５種の異なるｇＲＮＡ、４種の異なるｇＲＮＡから４０種の異なるｇＲＮＡ、４種の異なるｇＲＮＡから３５種の異なるｇＲＮＡ、４種の異なるｇＲＮＡから３０種の異なるｇＲＮＡ、４種の異なるｇＲＮＡから２５種の異なるｇＲＮＡ、４種の異なるｇＲＮＡから２０種の異なるｇＲＮＡ、４種の異なるｇＲＮＡから１６種の異なるｇＲＮＡ、４種の異なるｇＲＮＡから８種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡから５０種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡから４５種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡから４０種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡから３５種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡから３０種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡから２５種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡから２０種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡから１６種の異なるｇＲＮＡ、１６種の異なるｇＲＮＡから５０種の異なるｇＲＮＡ、１６種の異なるｇＲＮＡから４５種の異なるｇＲＮＡ、１６種の異なるｇＲＮＡから４０種の異なるｇＲＮＡ、１６種の異なるｇＲＮＡから３５種の異なるｇＲＮＡ、１６種の異なるｇＲＮＡから３０種の異なるｇＲＮＡ、１６種の異なるｇＲＮＡから２５種の異なるｇＲＮＡ、または１６種の異なるｇＲＮＡから２０種の異なるｇＲＮＡをコードすることができる。異なるｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれは、プロモーターに作動可能に連結され得る。異なるｇＲＮＡに作動可能に連結されるプロモーターは、同じプロモーターであり得る。異なるｇＲＮＡに作動可能に連結されるプロモーターは、異なるプロモーターであり得る。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または調節性プロモーターであり得る。少なくとも１種のｇＲＮＡは、標的遺伝子または遺伝子座と結合することができる。２種以上のｇＲＮＡが包含される場合、ｇＲＮＡのそれぞれが、１つの標的遺伝子座内の異なる標的領域と結合するか、ｇＲＮＡのそれぞれが、異なる遺伝子座内の異なる標的領域と結合する。

【0160】

ｂ．アデノ随伴ウイルスベクター
ＡＡＶは、様々なコンストラクト構造を使用して、前記組成物を細胞に送達するために使用することができる。例えば、ＡＡＶは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系および別のベクター上のｇＲＮＡ発現カセットを送達することができる。あるいは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）などの種由来の小さいＣａｓ９タンパク質が使用される場合、Ｃａｓ９と最大２個までのｇＲＮＡ発現カセットとの両方を、４．７ｋｂのパッケージング制限内の単一のＡＡＶベクター中で組み合わせることができる。

【0161】

組成物は、上に記載した通りに、改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。改変されたＡＡＶベクターは、哺乳類の細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を送達および発現させることが可能であり得る。例えば、改変されたＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－ＳＡＳＴＧベクターであり得る（Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：６３５－６４６）。改変されたＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を含めた１つ以上のいくつかのカプシド型に基づくことができる。改変されたＡＡＶベクターは、全身および局所送達によって骨格筋または心筋に効率的に形質導入する、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどの、代替の筋肉指向性のＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２シュードタイプに基づくものであり得る（Ｓｅｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１２：１３９－１５１）。

【0162】

９．標的細胞
本明細書に開示する通り、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどのｇＲＮＡを、任意の型の細胞を用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系と共に使用することができる。いくつかの実施態様では、細胞は、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、または動物細胞、例えば哺乳類細胞である。いくつかの実施態様では、これは、器官または動物微生物であり得る。いくつかの実施態様では、細胞は、限定はされないが、２９３－Ｔ細胞、３Ｔ３細胞、７２１細胞、９Ｌ細胞、Ａ２７８０細胞、Ａ２７８０ＡＤＲ細胞、Ａ２７８０ｃｉｓ細胞、Ａ１７２細胞、Ａ２０細胞、Ａ２５３細胞、Ａ４３１細胞、Ａ－５４９細胞、ＡＬＣ細胞、Ｂ１６細胞、Ｂ３５細胞、ＢＣＰ－１細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞、ｂＥｎｄ．３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＢＲ ２９３細胞、ＢｘＰＣ３細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃａｌ－２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＲ－Ｌ２３細胞、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ細胞、ＣＯＲ－Ｌ２３／５０１０細胞、ＣＯＲ－Ｌ２３／Ｒ２３細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＣＯＶ－４３４細胞、ＣＭＬ Ｔ１細胞、ＣＭＴ細胞、ＣＴ２６細胞、Ｄ１７細胞、ＤＨ８２細胞、ＤＵ１４５細胞、ＤｕＣａＰ細胞、ＥＬ４細胞、ＥＭ２細胞、ＥＭ３細胞、ＥＭＴ６／ＡＲ１細胞、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０細胞、ＦＭ３細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ６９細胞、ＨＢ５４細胞、ＨＢ５５細胞、ＨＣＡ２細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞、ＨＬ－６０細胞、ＨＭＥＣ細胞、ＨＴ－２９細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊ５５８Ｌ細胞、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２細胞、ＫＣＬ２２細胞、ＫＧ１細胞、ＫＹＯ１細胞、ＬＮＣａｐ細胞、Ｍａ－ＭｅＩ １、２、３…４８細胞、ＭＣ－３８細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＭＣＦ－１０Ａ細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５細胞、ＭＤＣＫ ＩＩ細胞、ＭＤＣＫ ＩＩ細胞、ＭＧ６３細胞、ＭＯＲ／０．２Ｒ細胞、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ ６細胞、ＭＲＣ５細胞、ＭＴＤ－１Ａ細胞、ＭｙＥｎｄ細胞、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ細胞、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０細胞、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０細胞、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４細胞、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＮＡＬＭ－１細胞、ＮＷ－１４５細胞、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞、Ｐｅｅｒ細胞、ＰＮＴ－１Ａ／ＰＮＴ ２細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＲＢＬ細胞、ＲｅｎＣａ細胞、ＲＩＮ－５Ｆ細胞、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９細胞、ＳｉＨａ細胞、ＳｋＢｒ３細胞、Ｔ２細胞、Ｔ－４７Ｄ細胞、Ｔ８４細胞、ＴＨＰ１細胞、Ｕ３７３細胞、Ｕ８７細胞、Ｕ９３７細胞、ＶＣａＰ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９細胞、ＷＴ－４９細胞、Ｘ６３細胞、ＹＡＣ－１細胞、ＹＡＲ細胞、ＧＭ１２８７８、Ｋ５６２、Ｈ１ヒト胚性幹細胞、ＨｅＬａ－Ｓ３、ＨｅｐＧ２、ＨＵＶＥＣ、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ、ＩＭＲ９０、Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＨＭＥＣまたはＬＨＣＭ、ＣＤ１４＋、ＣＤ２０＋、初代心臓または肝臓細胞、分化したＨ１細胞、８９８８Ｔ、Ａｄｕｌｔ＿ＣＤ４＿ｎａｉｖｅ、Ａｄｕｌｔ＿ＣＤ４＿Ｔｈ０、Ａｄｕｌｔ＿ＣＤ４＿Ｔｈ１、ＡＧ０４４４９、ＡＧ０４４５０、ＡＧ０９３０９、ＡＧ０９３１９、ＡＧ１０８０３、ＡｏＡＦ、ＡｏＳＭＣ、ＢＣ＿Ａｄｉｐｏｓｅ＿ＵＨＮ００００１、ＢＣ＿Ａｄｒｅｎａｌ＿Ｇｌａｎｄ＿Ｈ１２８０３Ｎ、ＢＣ＿Ｂｌａｄｄｅｒ＿０１－１１００２、ＢＣ＿Ｂｒａｉｎ＿Ｈ１１０５８Ｎ、ＢＣ＿Ｂｒｅａｓｔ＿０２－０３０１５、ＢＣ＿Ｃｏｌｏｎ＿０１－１１００２、ＢＣ＿Ｃｏｌｏｎ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ＿０１－１１００２、ＢＣ＿Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｊｅｊｕｎｕｍ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｋｉｄｎｅｙ＿０１－１１００２、ＢＣ＿Ｋｉｄｎｅｙ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｌｅｆｔ＿Ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ＿Ｎ４１、ＢＣ＿Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ＿ＵＨＮ００２０４、ＢＣ＿Ｌｉｖｅｒ＿０１－１１００２、ＢＣ＿Ｌｕｎｇ＿０１－１１００２、ＢＣ＿Ｌｕｎｇ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｐａｎｃｒｅａｓ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｐｅｎｉｓ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ＿Ｈ１２５２９Ｎ、ＢＣ＿Ｐｌａｃｅｎｔａ＿ＵＨＮ００１８９、ＢＣ＿Ｐｒｏｓｔａｔｅ＿Ｇｌａｎｄ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｒｅｃｔｕｍ＿Ｎ２９、ＢＣ＿Ｓｋｅｌｅｔａｌ＿Ｍｕｓｃｌｅ＿０１－１１００２、ＢＣ＿Ｓｋｅｌｅｔａｌ＿Ｍｕｓｃｌｅ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｓｋｉｎ＿０１－１１００２、ＢＣ＿Ｓｍａｌｌ＿Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ＿０１－１１００２、ＢＣ＿Ｓｐｌｅｅｎ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｓｔｏｍａｃｈ＿０１－１１００２、ＢＣ＿Ｓｔｏｍａｃｈ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｔｅｓｔｉｓ＿Ｎ３０、ＢＣ＿Ｕｔｅｒｕｓ＿ＢＮ０７６５、ＢＥ２＿Ｃ、ＢＧ０２ＥＳ、ＢＧ０２ＥＳ－ＥＢＤ、ＢＪ、ｂｏｎｅ＿ｍａｒｒｏｗ＿ＨＳ２７ａ、ｂｏｎｅ＿ｍａｒｒｏｗ＿ＨＳ５、ｂｏｎｅ＿ｍａｒｒｏｗ＿ＭＳＣ、Ｂｒｅａｓｔ＿ＯＣ、Ｃａｃｏ－２、ＣＤ２０＋＿ＲＯ０１７７８、ＣＤ２０＋＿ＲＯ０１７９４、ＣＤ３４＋＿Ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ、ＣＤ４＋＿Ｎａｉｖｅ＿Ｗｂ１１９７０６４０、ＣＤ４＋＿Ｎａｉｖｅ＿Ｗｂ７８４９５８２４、Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ＿ＯＣ、Ｃｅｒｅｂｒｕｍ＿ｆｒｏｎｔａｌ＿ＯＣ、Ｃｈｏｒｉｏｎ、ＣＬＬ、ＣＭＫ、Ｃｏｌｏ８２９、Ｃｏｌｏｎ＿ＢＣ、Ｃｏｌｏｎ＿ＯＣ、Ｃｏｒｄ＿ＣＤ４＿ｎａｉｖｅ、Ｃｏｒｄ＿ＣＤ４＿Ｔｈ０、Ｃｏｒｄ＿ＣＤ４＿Ｔｈ１、Ｄｅｃｉｄｕａ、Ｄｎｄ４１、ＥＣＣ－１、Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ＿ＯＣ、Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ＿ＢＣ、Ｆｉｂｒｏｂｌ、Ｆｉｂｒｏｂｌ＿ＧＭ０３３４８、ＦｉｂｒｏＰ、ＦｉｂｒｏＰ＿ＡＧ０８３９５、ＦｉｂｒｏＰ＿ＡＧ０８３９６、ＦｉｂｒｏＰ＿ＡＧ２０４４３、Ｆｒｏｎｔａｌ＿ｃｏｒｔｅｘ＿ＯＣ、ＧＣ＿Ｂ＿細胞、Ｇｌｉｏｂｌａ、ＧＭ０４５０３、ＧＭ０４５０４、ＧＭ０６９９０、ＧＭ０８７１４、ＧＭ１０２４８、ＧＭ１０２６６、ＧＭ１０８４７、ＧＭ１２８０１、ＧＭ１２８１２、ＧＭ１２８１３、ＧＭ１２８６４、ＧＭ１２８６５、ＧＭ１２８６６、ＧＭ１２８６７、ＧＭ１２８６８、ＧＭ１２８６９、ＧＭ１２８７０、ＧＭ１２８７１、ＧＭ１２８７２、ＧＭ１２８７３、ＧＭ１２８７４、ＧＭ１２８７５、ＧＭ１２８７８－ＸｉＭａｔ、ＧＭ１２８９１、ＧＭ１２８９２、ＧＭ１３９７６、ＧＭ１３９７７、ＧＭ１５５１０、ＧＭ１８５０５、ＧＭ１８５０７、ＧＭ１８５２６、ＧＭ１８９５１、ＧＭ１９０９９、ＧＭ１９１９３、ＧＭ１９２３８、ＧＭ１９２３９、ＧＭ１９２４０、ＧＭ２００００、
Ｈ０２８７、Ｈ１－ｎｅｕｒｏｎｓ、Ｈ７－ｈＥＳＣ、Ｈ９ＥＳ、Ｈ９ＥＳ－ＡＦＰ－、Ｈ９ＥＳ－ＡＦＰ＋、Ｈ９ＥＳ－ＣＭ、Ｈ９ＥＳ－Ｅ、Ｈ９ＥＳ－ＥＢ、Ｈ９ＥＳ－ＥＢＤ、ＨＡｃ、ＨＡＥｐｉＣ、ＨＡ－ｈ、ＨＡＬ、ＨＡｏＡＦ、ＨＡｏＡＦ＿６０９０１０１．１１、ＨＡｏＡＦ＿６１１１３０１．９、ＨＡｏＥＣ、ＨＡｏＥＣ＿７０７１７０６．１、ＨＡｏＥＣ＿８０６１１０２．１、ＨＡ－ｓｐ、ＨＢＭＥＣ、ＨＢＶＰ、ＨＢＶＳＭＣ、ＨＣＦ、ＨＣＦａａ、ＨＣＨ、ＨＣＨ＿００１１３０８．２Ｐ、ＨＣＨ＿８１００８０８．２、ＨＣＭ、ＨＣｏｎＦ、ＨＣＰＥｐｉＣ、ＨＣＴ－１１６、Ｈｅａｒｔ＿ＯＣ、Ｈｅａｒｔ＿ＳＴＬ００３、ＨＥＥｐｉＣ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－Ｔ－ＲＥｘ、肝細胞、ＨＦＤＰＣ、ＨＦＤＰＣ＿０１００５０３．２、ＨＦＤＰＣ＿０１０２７０３．３、ＨＦＦ、ＨＦＦ－Ｍｙｃ、ＨＦＬ１１Ｗ、ＨＦＬ２４Ｗ、ＨＧＦ、ＨＨＳＥＣ、ＨＩＰＥｐｉＣ、ＨＬ－６０、ＨＭＥｐＣ、ＨＭＥｐＣ＿６０２２８０１．３、ＨＭＦ、ｈＭＮＣ－ＣＢ、ｈＭＮＣ－ＣＢ＿８０７２８０２．６、ｈＭＮＣ－ＣＢ＿９１１１７０１．６、ｈＭＮＣ－ＰＢ、ｈＭＮＣ－ＰＢ＿００２２３３０．９、ｈＭＮＣ－ＰＢ＿００８２４３０．９、ｈＭＳＣ－ＡＴ、ｈＭＳＣ－ＡＴ＿０１０２６０４．１２、ｈＭＳＣ－ＡＴ＿９０６１６０１．１２、ｈＭＳＣ－ＢＭ、ｈＭＳＣ－ＢＭ＿００５０６０２．１１、ｈＭＳＣ－ＢＭ＿００５１１０５．１１、ｈＭＳＣ－ＵＣ、ｈＭＳＣ－ＵＣ＿００５２５０１．７、ｈＭＳＣ－ＵＣ＿００８１１０１．７、ＨＭＶＥＣ－ｄＡｄ、ＨＭＶＥＣ－ｄＢｌ－Ａｄ、ＨＭＶＥＣ－ｄＢｌ－Ｎｅｏ、ＨＭＶＥＣ－ｄＬｙ－Ａｄ、ＨＭＶＥＣ－ｄＬｙ－Ｎｅｏ、ＨＭＶＥＣ－ｄＮｅｏ、ＨＭＶＥＣ－ＬＢｌ、ＨＭＶＥＣ－ＬＬｙ、ＨＮＰＣＥｐｉＣ、ＨＯＢ、ＨＯＢ＿００９０２０２．１、ＨＯＢ＿００９１３０１、ＨＰＡＥＣ、ＨＰＡＥｐｉＣ、ＨＰＡＦ、ＨＰＣ－ＰＬ、ＨＰＣ－ＰＬ＿００３２６０１．１３、ＨＰＣ－ＰＬ＿０１０１５０４．１３、ＨＰＤＥ６－Ｅ６Ｅ７、ＨＰｄＬＦ、ＨＰＦ、ＨＰＩＥｐＣ、ＨＰＩＥｐＣ＿９０１２８０１．２、ＨＰＩＥｐＣ＿９０４１５０３．２、ＨＲＣＥｐｉＣ、ＨＲＥ、ＨＲＧＥＣ、ＨＲＰＥｐｉＣ、ＨＳａＶＥＣ、ＨＳａＶＥＣ＿００２２２０２．１６、ＨＳａＶＥＣ＿９１００１０１．１５、ＨＳＭＭ、ＨＳＭＭ＿ｅｍｂ、ＨＳＭＭ＿ＦＳＨＤ、ＨＳＭＭｔｕｂｅ、ＨＳＭＭｔｕｂｅ＿ｅｍｂ、ＨＳＭＭｔｕｂｅ＿ＦＳＨＤ、ＨＴ－１０８０、ＨＴＲ８ｓｖｎ、Ｈｕｈ－７、Ｈｕｈ－７．５、ＨＶＭＦ、ＨＶＭＦ＿６０９１２０３．３、ＨＶＭＦ＿６１００４０１．３、ＨＷＰ、ＨＷＰ＿００９２２０５、ＨＷＰ＿８１２０２０１．５、ｉＰＳ、ｉＰＳ＿ＣＷＲＵ１、ｉＰＳ＿ｈＦｉｂ２＿ｉＰＳ４、ｉＰＳ＿ｈＦｉｂ２＿ｉＰＳ５、ｉＰＳ＿ＮＩＨｉ１１、ｉＰＳ＿ＮＩＨｉ７、Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋｉｄｎｅｙ＿ＢＣ、Ｋｉｄｎｅｙ＿ＯＣ、ＬＨＣＮ－Ｍ２、ＬＨＳＲ、Ｌｉｖｅｒ＿ＯＣ、Ｌｉｖｅｒ＿ＳＴＬ００４、Ｌｉｖｅｒ＿ＳＴＬ０１１、ＬＮＣａＰ、Ｌｏｕｃｙ、Ｌｕｎｇ＿ＢＣ、Ｌｕｎｇ＿ＯＣ、リンパ芽球様細胞株、Ｍ０５９Ｊ、ＭＣＦ１０Ａ－Ｅｒ－Ｓｒｃ、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｍｅｄｕｌｌｏ、Ｍｅｄｕｌｌｏ＿Ｄ３４１、Ｍｅｌ＿２１８３、Ｍｅｌａｎｏ、Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ－ＣＤ１４＋、Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ－ＣＤ１４＋＿ＲＯ０１７４６、Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ－ＣＤ１４＋＿ＲＯ０１８２６、ＭＲＴ＿Ａ２０４、ＭＲＴ＿Ｇ４０１、ＭＲＴ＿ＴＴＣ５４９、Ｍｙｏｍｅｔｒ、ナイーブＢ細胞、ＮＢ４、ＮＨ－Ａ、ＮＨＢＥ、ＮＨＢＥ＿ＲＡ、ＮＨＤＦ、ＮＨＤＦ＿００６０８０１．３、ＮＨＤＦ＿７０７１７０１．２、ＮＨＤＦ－Ａｄ、ＮＨＤＦ－ｎｅｏ、ＮＨＥＫ、ＮＨＥＭ．ｆ＿Ｍ２、ＮＨＥＭ．ｆ＿Ｍ２＿５０７１３０２．２、ＮＨＥＭ．ｆ＿Ｍ２＿６０２２００１、ＮＨＥＭ＿Ｍ２、ＮＨＥＭ＿Ｍ２＿７０１１００１．２、ＮＨＥＭ＿Ｍ２＿７０１２３０３、ＮＨＬＦ、ＮＴ２－Ｄ１、Ｏｌｆ＿ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ、Ｏｓｔｅｏｂｌ、ｏｖｃａｒ－３、ＰＡＮＣ－１、Ｐａｎｃｒｅａｓ＿ＯＣ、ＰａｎＩｓｌｅｔＤ、ＰａｎＩｓｌｅｔｓ、ＰＢＤＥ、ＰＢＤＥＦｅｔａｌ、ＰＢＭＣ、ＰＦＳＫ－１、ｐＨＴＥ、Ｐｏｎｓ＿ＯＣ、ＰｒＥＣ、ＰｒｏｇＦｉｂ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ＿ＯＣ、Ｐｓｏａｓ＿ｍｕｓｃｌｅ＿ＯＣ、Ｒａｊｉ、ＲＣＣ＿７８６０、ＲＰＭＩ－７９５１、ＲＰＴＥＣ、ＲＷＰＥ１、ＳＡＥＣ、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ、Ｓｋｅｌｅｔａｌ＿Ｍｕｓｃｌｅ＿ＢＣ、ＳｋＭＣ、ＳＫＭＣ、ＳｋＭＣ＿８１２１９０２．１７、ＳｋＭＣ＿９０１１３０２、ＳＫ－Ｎ－ＭＣ、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ＿ＲＡ、Ｓｍａｌｌ＿ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ＿ＯＣ、Ｓｐｌｅｅｎ＿ＯＣ、Ｓｔｅｌｌａｔｅ、Ｓｔｏｍａｃｈ＿ＢＣ、Ｔ細胞ＣＤ４＋、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ９８Ｇ、ＴＢＥＣ、Ｔｈ１、Ｔｈ１＿Ｗｂ３３６７６９８４、Ｔｈ１＿Ｗｂ５４５５３２０４、Ｔｈ１７、Ｔｈ２、Ｔｈ２＿Ｗｂ３３６７６９８４、Ｔｈ２＿Ｗｂ５４５５３２０４、Ｔｒｅｇ＿Ｗｂ７８４９５８２４、Ｔｒｅｇ＿Ｗｂ８３３１９４３２、Ｕ２ＯＳ、Ｕ８７、ＵＣＨ－１、Ｕｒｏｔｈｅｌｉａ、ＷＥＲＩ－Ｒｂ－１、およびＷＩ－３８を含めた、あらゆる細胞型または細胞株であり得る。いくつかの実施態様では、標的細胞は、初代細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔｓ細胞、ＳＫＢＲ３細胞、Ａ４３１細胞、Ｋ５６２細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＨｅｐＧ２細胞、またはＫ－Ｒａｓ依存性およびＫ－Ｒａｓ非依存性細胞群などの、あらゆる細胞であり得る。

【0163】

１０．エピゲノム編集の方法
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を用いる、標的細胞または対象におけるエピゲノム編集の方法に関する。前記方法は、標的遺伝子を活性化または抑制するために使用することができる。前記方法は、細胞または対象を、本明細書に記載した通りの有効量の最適化されたｇＲＮＡ分子、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、前記最適化されたｇＲＮＡは、ポリヌクレオチド配列によってコードされ、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。いくつかの実施態様では、前記レンチウイルスベクターは、ｓｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。いくつかの実施態様では、最適化されたｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性である。

【0164】

１１．部位特異的ＤＮＡ切断の方法
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を用いる、標的細胞または対象における部位特異的ＤＮＡ切断の方法に関する。前記方法は、細胞または対象を、本明細書に記載した通りの有効量の最適化されたｇＲＮＡ分子、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、前記最適化されたｇＲＮＡは、ポリヌクレオチド配列によってコードされ、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。いくつかの実施態様では、前記レンチウイルスベクターは、ｓｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。いくつかの実施態様では、最適化されたｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性である。

【0165】

細胞または試料に投与されるｇＲＮＡの数は、少なくとも１種のｇＲＮＡ、少なくとも２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも７種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも９種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１１種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１３種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１４種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１７種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４５種の異なるｇＲＮＡ、または少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡであり得る。細胞に投与されるｇＲＮＡの数は、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも４５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも４０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも３５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも２５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも１６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも１２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１種のｇＲＮＡから少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種のｇＲＮＡから少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡから少なくとも４５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡから少なくとも４０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡから少なくとも３５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡから少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡから少なくとも２５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡから少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡから少なくとも１６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡから少なくとも１２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡから少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡから少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡから少なくとも４５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡから少なくとも４０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡから少なくとも３５種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡから少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡから少なくとも２５種の異なるｇＲＮＡ、８種の異なるｇＲＮＡから少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡから少なくとも１６種の異なるｇＲＮＡ、または８種の異なるｇＲＮＡから少なくとも１２種の異なるｇＲＮＡであり得る。

【0166】

ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、それに続くＰＡＭ配列を含むことができる。ｇＲＮＡは、相補的ポリヌクレオチド配列の５’末端に「Ｇ」を含むことができる。ｇＲＮＡは、少なくとも１０塩基対、少なくとも１１塩基対、少なくとも１２塩基対、少なくとも１３塩基対、少なくとも１４塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも１６塩基対、少なくとも１７塩基対、少なくとも１８塩基対、少なくとも１９塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２１塩基対、少なくとも２２塩基対、少なくとも２３塩基対、少なくとも２４塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対、または少なくとも３５塩基対の、標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、それに続くＰＡＭ配列を含むことができる。ＰＡＭ配列は、「ＮＧＧ」であり得、ここでは、「Ｎ」は、あらゆるヌクレオチドであり得る。ｇＲＮＡは、標的遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、または転写領域のうちの少なくとも１つを標的にすることができる。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、配列番号１３～１４８、３１６、３１７、または３２０のうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を有する核酸配列を標的にする。ｇＲＮＡは、配列番号１４９～３１５、３２１～３２３、または３２６～３２９のうちの少なくとも１つの核酸配列を含むことができる。

【0167】

１２．変異遺伝子を修正するおよび対象を治療する方法
本開示はまた、対象における変異遺伝子を修正する方法を対象とする。この方法は、上に記載した通りの組成物を、対象の細胞に投与することを含む。本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を細胞に送達するための組成物の使用は、修復鋳型またはドナーＤＮＡ（これらは、遺伝子全体、または変異を含有する領域を置き換えることができる）と共に、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質の発現を修復することができる。本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、標的とされるゲノム遺伝子座に部位特異的二本鎖切断を導入するために使用することができる。部位特異的二本鎖切断は、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系が、標的ＤＮＡ配列に結合し、それによって標的ＤＮＡの切断が可能になる場合にもたらされる。このＤＮＡ切断は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激し、可能性のある２つの修復経路：相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路のうちの１つをもたらすことができる。

【0168】

本開示は、読み枠を効率的に修正し、かつ遺伝性疾患に関与する機能性タンパク質の発現を修復することができる、修復鋳型を伴わない、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を用いるゲノム編集を対象とする。本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴う、開示されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、相同組換え修復またはヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に基づく修正手法（これらは、相同組換えまたは選択に基づく遺伝子修正を適用できない可能性がある、増殖が制限された初代細胞株における効率的な修正を可能にする）を使用することを含むことができる。この戦略は、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴う、活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の迅速かつ頑強なアセンブリーを、フレームシフト、未成熟終止コドン、異所性スプライス供与部位、または異所性スプライス受容部位をもたらす非必須コード領域の変異によって引き起こされる遺伝性疾患の治療のための効率的な遺伝子編集方法と統合する。

【0169】

ａ．ヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合
内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、鋳型なしのＮＨＥＪ介在性ＤＮＡ修復によるものであり得る。標的遺伝子ＲＮＡを標的にする一過性の方法と対照的に、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを伴う、一過的に発現されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系による、ゲノムにおける標的遺伝子読み枠の修正は、それぞれの改変された細胞、およびすべてのその後代によって、永続的に修復された標的遺伝子発現をもたらすことができる。

【0170】

ヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪ遺伝子修正は、変異した標的遺伝子を修正し、ＨＤＲ経路に勝る、いくつかの潜在的利点を提供することができる。例えば、ＮＨＥＪは、非特異的挿入変異をもたらす可能性があるドナー鋳型を必要としない。ＨＤＲと対照的に、ＮＨＥＪは、細胞周期のすべての期において効率的に作動するので、循環と、有糸分裂後の細胞（筋線維など）との両方において効率的に利用することができる。これは、オリゴヌクレオチドに基づくエクソンスキッピング、または終止コドンの薬物によって強いられるリードスルーに代わる、頑強な永続的な遺伝子修復を提供し、理論上はわずか１つの薬物治療しか必要としない可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系、並びにメガヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを含めた他の遺伝子改変されたヌクレアーゼを使用する、ＮＨＥＪに基づく遺伝子修正は、本明細書に記載したプラスミド電気穿孔手法に加えて、細胞および遺伝子に基づく療法のための他の既存のエクスビボおよびインビボプラットフォームと組み合わせることができる。例えば、ｍＲＮＡに基づく遺伝子導入による、または、精製された細胞透過性タンパク質としてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の送達は、挿入変異のいかなる可能性も回避するであろうＤＮＡフリーのゲノム編集手法を可能にすることができる。

【0171】

ｂ．相同組換え修復
内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、相同組換え修復を含むことができる。上に記載した通りの方法は、細胞にドナー鋳型を投与することをさらに含む。ドナー鋳型は、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、ドナー鋳型は、小型化されたジストロフィンコンストラクト（ミニジストロフィン（「ｍｉｎｉｄｙｓ」）と呼ばれる）、変異ジストロフィン遺伝子を修復するための完全に機能性のジストロフィンコンストラクト、または相同組換え修復後に変異ジストロフィン遺伝子の修復をもたらすジストロフィン遺伝子の断片を含むことができる。

【0172】

１３．ゲノム編集の方法
本開示はまた、修復鋳型またはドナーＤＮＡ（これらは、遺伝子全体、または変異を含有する領域を置き換えることができる）を用いる、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質の発現を修復するための、上に記載したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を用いるゲノム編集を対象とする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、標的とされるゲノム遺伝子座に部位特異的二本鎖切断を導入するために使用することができる。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系が、ｇＲＮＡを使用して標的ＤＮＡ配列に結合し、それによって標的ＤＮＡの切断が可能になる場合にもたらされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、その高速の成功裡かつ効率的な遺伝子改変のおかげで、ゲノム編集の進歩という利点を有する。このＤＮＡ切断は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激し、可能性のある２つの修復経路：相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路のうちの１つをもたらすことができる。

【0173】

本開示は、読み枠を効率的に修正し、かつ遺伝性疾患に関与する機能性タンパク質の発現を修復することができる、修復鋳型を伴わない、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を用いるゲノム編集を対象とする。開示されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系および方法は、相同組換え修復またはヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に基づく修正手法（これらは、相同組換えまたは選択に基づく遺伝子修正を適用できない可能性がある、増殖が制限された初代細胞株における効率的な修正を可能にする）を使用することを含むことができる。この戦略は、活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の迅速かつ頑強なアセンブリーを、フレームシフト、未成熟終止コドン、異所性スプライス供与部位、または異所性スプライス受容部位をもたらす非必須コード領域の変異によって引き起こされる遺伝性疾患の治療のための効率的な遺伝子編集方法と統合する。

【0174】

本開示は、細胞における変異遺伝子を修正し、ＤＭＤなどの遺伝性疾患を患う対象を治療する方法を提供する。この方法は、上に記載した通りに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードするポリヌクレオチドまたはベクター、または前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の組成物を、細胞または対象に投与することを含むことができる。この方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を投与すること、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、第２のドメインを含有するＣａｓ９融合タンパク質、前記Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、またはＣａｓ９融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および／または少なくとも１種のｇＲＮＡ（ここで、ｇＲＮＡは、異なるＤＮＡ配列を標的にする）を投与することを含むことができる。これらの標的ＤＮＡ配列は、オーバーラップしていることが可能である。細胞に投与されるｇＲＮＡの数は、上に記載した通りの、少なくとも１種のｇＲＮＡ、少なくとも２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも７種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも９種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、または少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡは、配列番号１４９～３１５、３２１～３２３、または３２６～３２９のうちの少なくとも１つの核酸配列を含むことができる。この方法は、相同組換え修復または非相同末端結合を含むことができる。

【0175】

１４．コンストラクトおよびプラスミド
前記組成物は、上に記載した通り、本明細書に開示する通りのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、およびＣａｓ９融合タンパク質などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする核酸、および／または本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡのうちの少なくとも１つを含むことができる。前記組成物は、上に記載した通り、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡと共に、改変されたＡＡＶベクターをコードする遺伝子コンストラクトと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする核酸配列を含むことができる。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡと共に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする核酸を含むことができる。前記組成物は、上に記載した通り、本明細書に開示する通りの改変されたレンチウイルスベクターをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、Ｃａｓ９－融合タンパク質をコードする核酸と、少なくとも１種のｓｇＲＮＡとを含むことができる。遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として、細胞内に存在することができる。遺伝子コンストラクトは、線状ミニ染色体（セントロメアを含めて）、テロメア、またはプラスミドもしくはコスミドであり得る。

【0176】

遺伝子コンストラクトはまた、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めた、組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、細胞内で生存する弱毒化した生きている微生物または組換え微生物ベクター中の遺伝材料の一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含むことができる。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。

【0177】

核酸配列は、遺伝子コンストラクト（これはベクターであり得る）を構成することができる。ベクターは、哺乳類の細胞において、Ｃａｓ９－融合タンパク質などの融合タンパク質を発現する能力があり得る。ベクターは、組換えであり得る。ベクターは、Ｃａｓ９－融合タンパク質をコードする異種の核酸を含むことができる。ベクターは、プラスミドであり得る。ベクターは、細胞に、Ｃａｓ９－融合タンパク質をコードする核酸を導入するのに有用であり得、ここでは、形質転換された宿主細胞は、Ｃａｓ９－融合タンパク質系の発現が起こる条件下で培養および維持される。

【0178】

コード配列は、安定性および高レベルの発現のために最適化することができる。ある場合では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を低下させるように選択される。

【0179】

ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする異種の核酸を含むことができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系コード配列の上流であり得る開始コドン、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系コード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含むことができる。開始および停止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系コード配列と共に、フレーム内であり得る。ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニ―ウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的なプロモーターなどの組織特異的プロモーターであり得る。こうしたプロモーターの例は、その内容全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号明細書に記載されている。

【0180】

ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の下流であり得るポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであり得る。

【0181】

ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、またはＣａｓ９融合タンパク質コード配列、または本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどのｓｇＲＮＡの、上流のエンハンサーを含むことができる。エンハンサーは、ＤＮＡ発現のために必須であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、またはＥＢＶに由来するものなどであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参照によって完全に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号明細書、米国特許第５，９６２，４２８号明細書、および国際公開第９４／０１６７３７号パンフレットに記載されている。ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持するために、哺乳類の複製開始点を含むことができ、細胞において、ベクターの複数のコピーを産生することができる。ベクターはまた、調節配列を含むことができ、調節配列は、ベクターが投与される哺乳類またはヒト細胞における遺伝子発現のために十分に適合させることができる。ベクターはまた、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択可能マーカーを含むことができる。

【0182】

ベクターは、常用の技術、および容易に入手可能な出発材料によってタンパク質を産生するための、発現ベクターまたは系であり得る（参照によって完全に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。いくつかの実施態様では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする核酸配列（Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、またはＣａｓ９融合タンパク質をコードする核酸配列を含めて）、および配列番号１４９～３１５、３２１～３２３、または３２６～３２９のうちの少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。

【0183】

１５．医薬組成物
前記組成物は、医薬組成物中であり得る。この医薬組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系のタンパク質成分、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、またはＣａｓ９融合タンパク質をコードする、約１ｎｇから約１０ｍｇのＤＮＡを含むことができる。この医薬組成物は、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡと共に、改変されたＡＡＶベクターの、約１ｎｇから約１０ｍｇのＤＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。この医薬組成物は、改変されたレンチウイルスベクターの、約１ｎｇから約１０ｍｇのＤＮＡを含むことができる。本発明による医薬組成物は、使用される投与方式に従って製剤化される。医薬組成物が、注射用医薬組成物である場合、これは、無菌、パイロジェンフリー、かつ粒子状物質フリーである。等張性製剤が使用されることが好ましい。一般に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施態様では、血管収縮剤が、製剤に添加される。

【0184】

前記組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含むことができる。薬学的に許容し得る賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能性分子であり得る。薬学的に許容し得る賦形剤は、遺伝子導入促進剤（これには界面活性剤が含まれ得る）、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリルリピドＡを含めて）、ムラミルペプチド、キノン類似体、ベシクル、例えばスクアレンおよびスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知の遺伝子導入促進剤であり得る。

【0185】

遺伝子導入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて）、または脂質である。遺伝子導入促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ－Ｌ－グルタミン酸は、ゲノム編集のための組成物中に、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。遺伝子導入促進剤はまた、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリルリピドＡを含めて）、ムラミルペプチド、キノン類似体、およびベシクル、例えばスクアレンおよびスクアレンを含むことができ、また、遺伝子コンストラクトと共に、ヒアルロン酸も使用、投与することができる。いくつかの実施態様では、前記組成物をコードするＤＮＡベクターはまた、遺伝子導入促進剤、例えば脂質、リポソーム（レシチンリポソーム、または、当技術分野で公知の他のリポソームを含めて）、ＤＮＡ－リポソーム混合物としてのもの（例えば国際公開第０９３２４６４０号パンフレット参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の公知の遺伝子導入促進剤を含むことができる。好ましくは、遺伝子導入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて）、または脂質である。

【0186】

１６．コンストラクトおよびプラスミド
前記組成物は、上に記載した通り、本明細書に開示する通りのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。プラスミドまたは発現ベクターなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする核酸、および／または本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡを含むことができる。前記組成物は、上に記載した通り、改変されたレンチウイルスベクターをコードする遺伝子コンストラクトと、本明細書に開示する通りのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする核酸配列を含むことができる。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする核酸を含むことができる。前記組成物は、上に記載した通り、改変されたレンチウイルスベクターをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする核酸と、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｓｇＲＮＡとを含むことができる遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として、細胞内に存在することができる。遺伝子コンストラクトは、線状ミニ染色体（セントロメアを含めて）、テロメア、またはプラスミドもしくはコスミドであり得る。

【0187】

遺伝子コンストラクトはまた、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めた、組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、細胞内で生存する弱毒化した生きている微生物または組換え微生物ベクター中の遺伝材料の一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含むことができる。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。

【0188】

核酸配列は、遺伝子コンストラクト（これはベクターであり得る）を構成することができる。ベクターは、哺乳類の細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系などの融合タンパク質を発現する能力があり得る。ベクターは、組換えであり得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系などの融合タンパク質をコードする異種の核酸を含むことができる。ベクターは、プラスミドであり得る。ベクターは、細胞に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする核酸を導入するのに有用であり得、ここでは、転換された宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の発現が起こる条件下で培養および維持される。

【0189】

コード配列は、安定性および高レベルの発現のために最適化することができる。ある場合では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を低下させるように選択される。

【0190】

ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする異種の核酸を含むことができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系コード配列の上流であり得る開始コドン、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系コード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含むことができる。開始および停止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系コード配列と共に、フレーム内であり得る。ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系は、時空間における動的な制御を可能にするために、光誘導性または化学誘導性制御下であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニ―ウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。プロモーターは、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的なプロモーターなどの組織特異的プロモーターであり得る。こうしたプロモーターの例は、その内容全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号明細書に記載されている。

【0191】

ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の下流であり得るポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであり得る。

【0192】

ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系、および／または本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどのｓｇＲＮＡの、上流のエンハンサーを含むことができる。エンハンサーは、ＤＮＡ発現のために必須であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、またはＥＢＶに由来するものなどであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参照によって完全に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号明細書、米国特許第５，９６２，４２８号明細書、および国際公開第９４／０１６７３７号パンフレットに記載されている。ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持するために、哺乳類の複製開始点を含むことができ、細胞において、ベクターの複数のコピーを産生することができる。ベクターはまた、調節配列を含むことができ、調節配列は、ベクターが投与される哺乳類またはヒト細胞における遺伝子発現のために十分に適合させることができる。ベクターはまた、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択可能マーカーを含むことができる。

【0193】

ベクターは、常用の技術、および容易に入手可能な出発材料によってタンパク質を産生するための、発現ベクターまたは系であり得る（参照によって完全に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。いくつかの実施態様では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする核酸配列、および本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。

【0194】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどのｇＲＮＡは、ポリヌクレオチド配列によってコードされ、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。いくつかの実施態様では、レンチウイルスベクターは、発現カセットを含む。発現カセットは、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性である。

【0195】

ｉ．アデノ随伴ウイルスベクター
組成物は、上に記載した通りに、改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。改変されたＡＡＶベクターは、増進された心筋および骨格筋組織指向性を有することができる。改変されたＡＡＶベクターは、哺乳類の細胞において、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡなどの少なくとも１種のｇＲＮＡと共に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を送達および発現させることが可能であり得る。例えば、改変されたＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－ＳＡＳＴＧベクターであり得る（Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：６３５－６４６）。改変されたＡＡＶベクターは、ヌクレアーゼを、骨格筋および心筋にインビボで送達することができる。改変されたＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を含めた１つ以上のいくつかのカプシド型に基づくことができる。改変されたＡＡＶベクターは、全身および局所送達によって骨格筋または心筋に効率的に形質導入する、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどの、代替の筋肉指向性のＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２シュードタイプに基づくものであり得る（Ｓｅｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１２：１３９－１５１）。

【0196】

１７．送達の方法
本明細書で提供されるのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の遺伝子コンストラクトおよび／またはタンパク質を提供するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡとを送達するための方法である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡとの送達は、細胞において発現され、かつ細胞の表面に送達される、１つ以上の核酸分子としての、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と、本明細書に記載した最適化されたｇＲＮＡとの遺伝子導入または電気穿孔であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系タンパク質を、細胞に送達することができる。これらの核酸分子は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌまたはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ装置または他の電気穿孔装置を使用して電気穿孔することができる。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水（製品＃Ｄ８５３７）（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）、またはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）を含めた、いくつかの様々な緩衝液を使用することができる。遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃａｍｉｎｅ ２０００などの遺伝子導入試薬を含むことができる。

【0197】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系タンパク質をコードするベクターは、インビボ電気穿孔を伴うまたは伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、リポソーム介在、ナノ粒子促進、および／または組換えベクターによって、組織または対象中の改変された標的細胞に送達することができる。組換えベクターは、任意のウイルス型によって送達することができる。ウイルス型は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および／または組換えアデノ随伴ウイルスであり得る。

【0198】

標的遺伝子の遺伝子発現を誘発するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系タンパク質をコードするヌクレオチドを、細胞に導入することができる。例えば、標的遺伝子に誘導されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を、哺乳類細胞に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系の細胞への送達時に、また、ベクターの哺乳類の細胞への送達時に、遺伝子導入細胞ｓは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を発現することとなる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系を、哺乳類に投与して、哺乳類における標的遺伝子の遺伝子発現を誘発または調節することができる。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、ウシ科動物（ｂｏｖｉｄ）、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。

【0199】

核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、任意の公知の方法を使用して、核酸（例えば発現コンストラクト）を細胞に導入することができる。適切な方法としては、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、遺伝子導入、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性の遺伝子導入、ＤＥＡＥ－デキストラン介在性の遺伝子導入、リポソーム介在性の遺伝子導入、パーティクル・ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子介在性の核酸送達などが挙げられる。いくつかの実施態様では、組成物は、ｍＲＮＡ送達およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体送達によって送達することができる。

【0200】

１８．投与の経路
組成物は、経口的、非経口的、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所的、吸入を介して、頬側投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはこれらの組み合わせを含めた、様々な経路によって、対象に投与することができる。獣医学的使用については、組成物は、通常の獣医学診療に従って、適切に許容される製剤として投与することができる。獣医師は、ある特定の動物にとって最も適した投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎｓ）」、または他の物理的方法、例えば電気穿孔（「ＥＰ」）、「水力学的方法」、または超音波によって投与することができる。

【0201】

組成物は、インビボ電気穿孔を伴うまたは伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、リポソーム介在、ナノ粒子促進、組換えベクター、例えば組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めたいくつかの技術によって、哺乳類に送達することができる。組成物は、骨格筋または心筋に注射することができる。例えば、組成物は、前脛骨筋に注射することができる。

【0202】

１９．キット
本明細書で提供されるのは、部位特異的ＤＮＡ結合に使用することができるキットである。キットは、上に記載した通りの組成物、および前記組成物を使用するための説明書を含む。キットに含まれる説明書は、包装材料に貼り付けることもできるし、パッケージ挿入物として含めることもできる。説明書は、一般的に、書面のまたは印刷された素材であるが、これに限定されない。こうした説明書を保管する、また、これらをエンドユーザーに伝えることが可能なあらゆる媒体が、本開示によって企図される。こうした媒体としては、限定はされないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。

【0203】

前記組成物は、上に記載した通りに、改変されたレンチウイルスベクターと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系をコードするヌクレオチド配列と、最適化されたｇＲＮＡとを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系は、上に記載した通りに、調節領域の特定の調節領域と特異的に結合および標的にするためのキットに含めることができる。

【実施例0204】

２０．実施例
先述のことは、例示の目的のために与えられ、かつ本発明の範囲を制限しない、次の実施例を参照することによって、より良く理解することができる。

【0205】

実施例１
材料および方法
材料。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液は、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。Ｌ－グルタミン酸一カリウム塩一水和物、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および塩化マグネシウムは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，ＬＬＣから入手した。

【0206】

Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドのクローニング；ヒト染色体１９のＡＡＶＳ１遺伝子座を標的にするＣａｓ９、ｄＣａｓ９、およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを、標準の技術を使用してクローン化し、発現させ、精製した。画像化のために使用したＤＮＡ基質－（ｉ）ヒト染色体１９のＡＡＶＳ１遺伝子座のセグメント由来の１１９８ｂｐの基質；（ｉｉ）一連の６つの完全な、部分的な、またはミスマッチの標的部位を含有する「遺伝子改変された」９８９ｂｐのＤＮＡ基質；および（ｉｉｉ）プロトスペーサー（＞３ｂｐ）との相同性を含有しない１０７８ｂｐの「ナンセンス」基質－も、標準の技術を使用して産生した。野生型Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９をコードするプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した（プラスミド３９３１２およびプラスミド４７１０６）。細菌におけるＣａｓ９およびｄＣａｓ９の発現のためのプラスミドを、Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してクローン化した。簡単に言うと、ＰＣＲを使用して、Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９遺伝子を増幅し、隣接するａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２部位を付加した。ＢＰ組換えを実施して、これらの遺伝子をシャトルベクターに導入し、その後、ＬＰ組換えを実施して、これらの遺伝子をｐＤｅｓｔ１７に導入し、Ｎ末端ヘキサ－ヒスチジンタグ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を付加した。キメラｓｇＲＮＡおよびｓｇＲＮＡバリアントをコードするプラスミド（下に記載する）を、以前に記載されている通りにクローン化した（Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ，１０，９７３－９７６）。

【0207】

Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９の発現および精製。Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９をコードするプラスミドを、標準の技術に従って、ＳｏｌｕＢＬ２１コンピテント細胞（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）に形質転換した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）。単一のコロニーを使用して、２５ｍＬの発端培養物（ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）を播種した。２５ｍＬの発端培養物を、一晩成長させ、１Ｌ培養物を播種するために使用した。播種した１Ｌの培養物を、２５℃で５時間成長させ、その後、温度を１６℃まで下げ、０．１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘発した。誘発した培養物を、１６℃でさらに１２時間成長させた。細胞を、４０００×ｇの遠心分離によって収集し、長期保管のために－８０℃で保管した。

【0208】

細胞ペレットを、３０ｍＬのＬｙｓｉｓ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０％ｖ／ｖグリセロール、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－１０００、および１ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁した。この細胞懸濁液を、５分間の３０％デューティーサイクルでの超音波処理によって溶解した。次いで、この懸濁液を、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。次いで、上清を取り、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と共に、穏やかな撹拌下で３０分間インキュベートした。次いで、この樹脂を、カラムに充填し、洗浄緩衝液（３５ｍＭイミジゾール（ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０％ｖ／ｖ グリセロール）で洗浄し、溶離緩衝液（１２０ｍＭイミジゾール（ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０％ ｖ／ｖ グリセロール）で溶離した。次いで、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３０ｋ遠心濾過器を使用して、溶媒を保管緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０％ｖ／ｖグリセロール）に交換した。次いで、試料を分割し、－８０℃で凍結した。精製されたＣａｓ９およびｄＣａｓ９の代表的なポリアクリルアミドＳＤＳゲルを、図Ｓ１に示す。これは、およそ＞９５％純度を示している。

【0209】

ｓｇＲＮＡおよびガイドＲＮＡバリアントの発現および精製。ガイドＲＮＡは、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してインビトロで転写させた。Ｔ７プロモーターを有するＤＮＡ鋳型は、ガイドＲＮＡプラスミドからＰＣＲを介して産生し、反応は、製造業者の説明書に従って設定した。その５’末端から２ヌクレオチドが切り詰められたガイドＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）、およびヘアピン（ｈｐ－ｇＲＮＡ）を形成する５’伸長部を伴うものに対するＴ７鋳型は、標準のｇＲＮＡプラスミドのＰＣＲによって産生した。次いで、標準の技術を使用するフェノール－クロロホルム抽出を使用して、ＲＮＡを精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。

【0210】

ＤＮＡ基質の産生。ゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株から抽出および精製した。次いで、ＰＣＲを使用して、ＡＡＶＳ１遺伝子座を増幅した。ＡＡＶＳ１由来の１１９８ｂｐの基質を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からのプライマー：５’－＼Ｂｔ＼－ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＣＧＣＡＣ－３’および５’－ＧＡＧＣＴＣＴＡＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧ－３’（ここで、＼Ｂｔ＼は、５’末端でのプライマーのビオチン標識を表す）を使用して、ゲノムＤＮＡから、ダイレクトＰＣＲを介して構築した。一連のＰＡＭおよび完全または部分的なプロトスペーサー部位を含有する「遺伝子改変された」ＤＮＡ基質を、それぞれが一端にＥｃｏＲＩ制限部位を含有する２つのｇＢｌｏｃｋ断片として注文した。基質を、消化し、共に連結させ、次いで、プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＤＴ）：５’－＼Ｂｔ＼－ＣＡＴＧＡＣＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣ－３’および５’－ＣＧＡＣＧＡＴＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣ－３’を用いるＰＣＲを介して濃縮した。プロトスペーサーとの相同性（３ｂｐ超）を示す部位を含有しない「ナンセンス」基質を構築するために：一連の制限部位を含有する６９０ｂｐのＤＮＡコンストラクトを合成し（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃ．）、このコンストラクトに、ラムダＤＮＡ由来の追加の長さのＤＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をサブクローン化した；次いで、１０７８ｂｐの基質を、プライマー（ＩＤＴ）：５’－＼Ｂｔ＼－ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧ－３’および５’－ＣＡＧＣＧＴＣＣＣＣＧＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＴ－３’を使用してＰＣＲ増幅した。すべてのＤＮＡを、ゲル精製し、作業用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭグルタミン酸カリウム、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および０．４ｍＭ ＤＴＴ）で２５ｎＭに希釈し、４０×の過剰な単量体ストレプトアビジンと共に１０分間インキュベートし（Ｈｏｗａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３，２６７－２７３）、その後Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９と共にインキュベートした。

【0211】

精製されたＣａｓ９およびｄＣａｓ９のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲルを、図８Ａ～８Ｂに示す。これは、およそ＞９５％純度を示している。

【0212】

原子間力顕微鏡観察。原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）を、ＲＴＳＥＰ（Ｂｒｕｋｅｒ）プローブを用いるＢｒｕｋｅｒ（ｎｅｅ Ｖｅｅｃｏ）Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ Ｖ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅを使用して、大気中で実施した（公称ばね定数４０Ｎ／ｍ、共振周波数３００ｋＨｚ）。実験の前に、タンパク質とガイドＲＮＡを、１：１．５の比で、１０分間混合した。タンパク質とＤＮＡは、作業用緩衝液の溶液中で、室温で少なくとも１０分間（最大３５分）混合し、（以前に記載された通りに（２４））調製された３－アミノプロピルシロキサンで処理されている新しく切断した雲母（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）上に８秒間沈着させ、超純水（＞１７ＭΩ）ですすぎ、風乾した。タンパク質を、簡単に遠心分離し、その後、ＤＮＡと共にインキュベートした。標準のｓｇＲＮＡを使用した場合、各実験条件について少なくとも４つ、他のガイドＲＮＡバリアントを用いる実験について少なくとも２つの調製物を画像化した。一般に、画像は、各試料について１－１．５ライン／秒で、２．７５平方ミクロンの面積に対して１０２４×１０２４または５．５平方ミクロンの面積に対して２０４８×２０４８のピクセル解像度で得られた。各実験条件について、数千（約２５００～６０００）のＤＮＡ分子の画像を解像した。

【0213】

サブピクセル（Ｓｕｂ－Ｐｉｘｅｌ）分解能を用いるＤＮＡ追跡および精細化。得られたＡＦＭ画像を、走査型プローブ顕微鏡のためのオープンソースの画像分析ソフトウェアＧｗｙｄｄｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｇｗｙｄｄｉｏｎ．ｎｅｔ／）を使用して平滑化および平準化（平面的な（ｐｌａｎｅ－ｗｉｓｅ）、線による、三次多項式による平準化）し、次いで、ＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）にエクスポートした。各ＤＮＡ分子を含有する１５１×１５１ピクセル（４０５ｎｍ×４０５ｎｍ）領域を、凝集または他のＤＮＡ分子との重なりがないことを確実にするために、明確に識別できるストレプトアビジン標識、少なくとも１つの結合したＣａｓ９／ｄＣａｓ９分子の存在、およびはっきりとした端から端までの経路について、目視によって選別した。ＤＮＡの輪郭を手でトレースし、ストレプトアビジンおよびＣａｓ９／ｄＣａｓ９の推定される境界に印を付けた。次いで、このトレースを、Ｗｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１３７－１４１に基づく方法を使用して、アルゴリズムによって精細化した。ストレプトアビジンの強調された中心（ｘ₁）から開始し、バックボーンの次のエレメントの位置（ｘ₂）を、ストレプトアビジンの推定される境界を越える手でトレースした最も近い点に向かって２．５ｎｍ進むことによって推定する。ＤＮＡの画像の２倍の線形補間に対して、ｘ₂での（ｘ₁－ｘ₂）線分に垂直に、１１ピクセルの線を引く。ｘ₂を、最大組織分布的高さを有する法線上の位置に再配置し、次いで、新しい（ｘ₁－ｘ₂）線上のｘ₁から２．５ｎｍに調整する。ｘ₃の位置…次いで、ｘ_nを、手でトレースした最も近い点を使用して反復的に推定して、次のバックボーン位置についての最初の推測をもたらし、次いで、前述の通りに修正し、点ｘ_nが、トレースされたＤＮＡ分子の端から２．５ｎｍ未満になるまで修正プロセスを継続する。精細化したトレースが、ｘｉでＣａｓ９／ｄＣａｓ９分子の推定される境界に入ったら、その代わりに、ＤＮＡの位置を、ｘ_iから２．５ｎｍに位置する、３次エルミート（Ｈｅｒｍｉｔｅ）スプライン上の点（点ｘ_i-1、ｘ_i、ｘ_j、およびｘ_j+1を使用する。ここでは、ｘ_jは、推定されるＣａｓ９／ｄＣａｓ９境界を越える手描きでトレースした第１の点である）と推定する。

【0214】

トレースの完了時に、輪郭に沿ったＤＮＡの高さ（局所的領域のピクセル高さ中央値に対して）を抽出する。ストレプトアビジンおよびＣａｓ９／ｄＣａｓ９の推定される境界は、これが（μ_d＋σ_d）を超える近接領域に拡大するまで、元々推定されたものの周囲に反復的に拡大または縮小された。ここでは、μ_dおよびσ_dは、結合されたタンパク質の推定される位置を超える、また、推定値が収束する、トレースされたＤＮＡの高さの平均および標準偏差である。

【0215】

ＤＮＡの見かけの長さをゆがめる可能性があるあらゆる機器ヒステリシスについて考慮するために、ＤＮＡの長さを規準化し、その予想された長さ（公知の数の塩基対と仮定、塩基対あたり０．３３ｎｍ）の２０％であると元々測定されたＤＮＡ分子のみ、さらなる分析のために使用した（ＡＡＶＳ１基質について－トレース数：８０４；公称長さ：１１９８ｂｐ、記録された平均長さ：１２８３ｂｐ、標準偏差：１５４ｂｐ；遺伝子改変された基質について－トレース数：１５２０、公称長さ：９８６ｂｐ、記録された平均長さ：１０７１ｂｐ、標準偏差：１２４ｂｐ；「ナンセンス」基質について－トレース数：６１６、公称長さ：１０７８ｂｐ、記録された平均長さ：１２１７ｂｐ、標準偏差：１３５ｂｐ）。このステップによって、本発明者らが、例えば、同一線上と思われる２つのＤＮＡ分子、断片化されている可能性があるＤＮＡ、またはＣａｓ９によって切断されている、および分離されている可能性があるＤＮＡ（これは稀であった、本文参照）を、不適切に分析することが防止される。

【0216】

図１Ｃ～１Ｄ、図２Ｃ～２Ｄ、および図９の結合ヒストグラムは、それぞれの結合されたタンパク質の、そのタンパク質によってオーバーラップされた塩基（最近隣内挿法）に対する相対的位置をマッピングし、各部位に結合したタンパク質の総数を合計することによって作成した（単一のＣａｓ９／ｄＣａｓ９が、複数の（ｋ）部位と接触するものと解釈することができた場合、結合ヒストグラムにおいて、各接触領域を、１／ｋによって重み付けした）。結合ヒストグラムにおけるピークを、経験的ガウスｅｘｐ（－（（ｘ－μ）／ｗ）²）に適合させた（ここで、μは平均ピーク位置であり、ｗはピーク幅パラメータ（ｗ＝√２σ、標準偏差σを用いる）である（ＭＡＴＬＡＢを使用））。

【0217】

ｄＣａｓ９の見かけの解離定数の決定。異なるガイドＲＮＡバリアントを伴うｄＣａｓ９の見かけの解離定数を、以前に記載されている通りに決定した（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３，４３２２-４３３４）。簡単に言うと、ｄＣａｓ９－ガイドＲＮＡ（［ｄＣａｓ９］₀）およびＤＮＡ分子（［ＤＮＡ］₀）の既知の溶液濃度で、結合されたタンパク質（タンパク質Θ_dCas9によって結合されたＤＮＡの比率）を伴うおよび伴わない「遺伝子改変された」ＤＮＡ分子のそれぞれの数を計数した。結合されたタンパク質（上記参照）を伴うＤＮＡを追跡した後、ＤＮＡ分子ごとに結合したタンパク質の平均数（ｎ_dCas9）を決定した。総解離定数は、Ｋ_d,DNA＝［ＤＮＡ］［ｄＣａｓ９］／［ＤＮＡ・ｄＣａｓ９］＝（１－Θ_dCas9）（［ｄＣａｓ９］₀－ｎ_dCas9［ＤＮＡ］₀）／（Θ_dCas9）として算出した。

【0218】

プロトスペーサー特異的解離定数Ｋ_{d,プロトスペーサー}を、部位特異的結合定数Ｋ_a,ss＝Ｋ_d,ss ^-1（結合されたｄＣａｓ９ Θ_dCas9,ssを伴うＤＮＡ上の各部位の比率を使用）がそうであるように、その代わりとしてΘ_{dCas9,プロトスペーサー}、すなわちそのそれぞれの結合ヒストグラムにおけるガウスフィットの１ピーク幅（すなわち、表１参照）内に結合されたｄＣａｓ９を伴うＤＮＡの比率）を使用して、同様に算出した。

【0219】

タンパク質アライメントおよびクラスタリング。単離され、単一位置でＤＮＡと接触するに過ぎないように見えるＣａｓ９およびｄＣａｓ９タンパク質の画像を、抽出した。これらの特徴を、１３４ｎｍ×１３４ｎｍのバウンディングボックス内に完全に収まる、（μ_d＋２σ_d）を超える特徴を有するものとして選択し（ここで、μ_dおよびσ_dは、タンパク質が結合したＤＮＡ高さの平均および標準偏差である）；このステップは、大きい外因性のノイズを有する画像から、集合からの凝集した／密集したＣａｓ９／ｄＣａｓ９ならびにそのタンパク質のほとんどを除去する効果を本質的に有していた。４倍の最近隣内挿法の後、（μ_d＋σ_d）を超える組織分布的高さを有するタンパク質の特徴を、その組織分布的高さ間の平均平方される差を最小にするために、平行移動、回転、および反転の繰り返しによって、それぞれ整列した。距離行列を、これらの最小化された平均平方差から構成し、次いで、標準のｓｇＲＮＡを有するタンパク質を、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＬａｉｏ（２７）の方法を使用して、この基準に従ってクラスター化した；ガイドＲＮＡバリアントを有するタンパク質は、標準のｓｇＲＮＡを伴う最も近いＣａｓ９／ｄＣａｓ９構造に従ってクラスター化した。アンサンブル平均構造を、Ｐｅｎｃｚｅｋ、Ｒａｄｅｒｍａｃｈｅｒ、およびＦｒａｎｋ（２８）の方法に従って、個々のクラスターの各メンバーにわたって、参照のないアライメントを実施することによって抽出した。ＤＮＡ上での各特徴（プロトスペーサー部位など）でのＣａｓ９／ｄＣａｓ９集団の特性を、結合ヒストグラムに対するガウス分布フィットの１ピーク幅内に結合されたタンパク質を使用して決定した（すなわち、表１を参照のこと）。

【0220】

ガイドＲＮＡストランド侵入およびＲループ「揺らぎ」の動的モンテカルロ（ＫＭＣ）。プロトスペーサー部位でのガイドＲＮＡによるストランド侵入をシミュレートするための動的モンテカルロ（ＫＭＣ）実験を、ＭＡＴＬＡＢにおいて実行される、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ型（連続時間、離散状態）（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ（１９７６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｈｙｓｉｃｓ，２２，４０３－４３４）アルゴリズムを使用して実施した。ストランド侵入は、相対的最近傍依存性ＤＮＡ：ＤＮＡおよびＲＮＡ：ＤＮＡ結合自由エネルギーによって決定される位置依存性電位における１次元ランダムウォークとしてモデル化される。例えば、図４Ａを参照のこと。すなわち、ガイドＲＮＡは、プロトスペーサー部位ｍまで（ｓｇＲＮＡについては１≧ｍ≧２０、および切り詰め型ｓｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）については１≧ｍ≧１８）プロトスペーサーと塩基対形成され、最初に、フォワード速度（さらなるガイドＲＮＡ侵入の速度）ｖ_fが、ｅｘｐ（－（ΔＧ°（ｍ＋１）_RNA:DNA－ΔＧ°（ｍ＋１）_DNA:DNA）／２ＲＴ）である対称性の近似値を使用して推定される。ここでは、Ｒは、ボルツマン定数であり、Ｔは、温度であり（ここで、パラメータセットと一致する３７℃を使用した）、ΔＧ°（ｍ＋１）_RNA:DNAは、ＲＮＡと、部位ｍ＋１でのプロトスペーサーとの間の塩基対合の自由エネルギーであり、ΔＧ°（ｍ＋１）_DNA:DNAは、プロトスペーサーと、その相補的ＤＮＡ鎖との間の塩基対合の自由エネルギーである。（詳細釣り合いを満たすために、１／２という補正の語が含められる）。ｓｇＲＮＡまたはｔｒｕ－ｇＲＮＡについての状態ｍ＝２０または１８でのｖ_fは、０に設定した。リバース速度（プロトスペーサーとその相補的ＤＮＡ鎖との間の再ハイブリダイゼーションの速度）ｖ_rは、ｅｘｐ（－（ΔＧ°（ｍ）_DNA:DNA－ΔＧ°（ｍ）_RNA:DNA）／２ＲＴ）と比例するように、同様に算出され；状態ｍ＝１である場合、シミュレーションは停止される（ガイドＲＮＡ－プロトスペーサー解離を意味する）。アルゴリズムの各反復について、時間ｔ＝０（任意時間単位）で開始し、ｍに依存する速度が決定され、０と１の間の一様分布から、２つの乱数ｒ₁およびｒ₂がもたらされる。ｔは、Δｔ＝ｌｏｇ（ｒ₁）／（ｖ_f＋ｖ_r）によって前進させる。状態ｍは、ｒ₂≧ｖｆ／（ｖ_f＋ｖ_r）の場合、ｍ＋１に増加させ、そうでなければｍ－１に減少させる。Ｒループ揺らぎの「平衡状態」測定については、ｍは、ｍ＝２０（または、ｔｒｕ－ｇＲＮＡの場合には１８）で開始し、このアルゴリズムをｔ≧１０，０００まで反復した。「侵入」速度論の動力学の測定（ミスマッチ塩基対の存在下など）については、ｍは、ｍ＝１０で開始した（ｔ＝１０００まで）。

【0221】

自由エネルギーパラメータは、３７℃の１Ｍ ＮａＣｌでの実験による文献から得られる。配列依存性ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション自由エネルギーΔＧ°（ｘ）_DNA:DNAは、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，３５５５－３５６２から得られ；配列依存性ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション自由エネルギーΔＧ°（ｘ）_RNA:DNAは、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１１２１１－１１２１６から得られ；導入された点ミスマッチｒＧ・ｄＧ、ｒＣ・ｄＣ、ｒＡ・ｄＡ、およびｒＵ・ｄＴの場合のΔＧ°（ｘ）_RNA:DNA値は、Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９，１８９４－１９０２から得られた（わずかに高濃度の塩条件下）。使用されるプロトスペーサーの配列は、「ＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＧＴＧＧＣＣＣＣ」（配列番号３３６）、すなわちＡＦＭ実験と同様のＡＡＶＳ１標的部位であり；プロトスペーサー相補的ＤＮＡの配列は、「ＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴ」（配列番号３３７）であり、ガイドＲＮＡの配列は、ｓｇＲＮＡについての「ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ」（配列番号３３８）、または切り詰め型ＲＮＡについての「ＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＵ」（配列番号３３９）である。

【0222】

ＫＭＣから得られるＲループ安定性と実験によるＣａｓ９切断速度との間の相関。ガイドＲＮＡ－プロトスペーサー相互作用とインビボでのＣａｓ９切断速度との間の相関を解析するために、ガイドＲＮＡ、およびＨｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２７－８３２による標的とされるＤＮＡの配列と、その実験によって決定されたＣａｓ９による切断頻度の最尤推定値（ＭＬＥ）を抽出した。ガイドＲＮＡ、およびｒＧ・ｄＧ、ｒＣ・ｄＣ、ｒＡ・ｄＡ、およびｒＵ・ｄＴ型の単一ヌクレオチドＰＡＭ遠位（ＰＡＭ部位から≧１０ｂｐ以遠）ミスマッチを伴うＨｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２７－８３２による標的とされるＤＮＡの配列と、その部位での実験によって決定されたＣａｓ９による切断頻度の最尤推定値（ＭＬＥ）を（ｎ＝１３６）、ＫＭＣスクリプトにインポートした。ｍ＝１０で開始されたストランド侵入のシミュレーションを、各配列について１０００回繰り返して（ｔ＝１００まで）、時間の比の平均ｍ≧１６を得て、経験的切断速度と相関させた。ＭＬＥ切断頻度と共に、平均占有比率を、１００，０００回の並べ替えを介してブートストラップ処理し、次いで相関係数およびｐ値を再計算することによって有意性を決定した。ガイドＲＮＡ－プロトスペーサー結合自由エネルギーを、上に挙げたパラメータセットを使用して最近傍エネルギーを総和することによって推定し、－３．１ｋｃａｌ ｍｏｌ^-1の開始係数で補正した。

【0223】

ｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ構造特性との比較のためのｄＣａｓ９－ｔｒｕ－ｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ｈｐ－ｇＲＮＡデータ。実験を通して、タンパク質の高さおよび体積測定値を比較する場合、ＡＦＭ画像化条件は、人工産物を導入しないように、概ね一貫性を保つべきである。これは、一般に、例えば、遺伝子改変されたＤＮＡ分子上の異なる部位に結合したｄＣａｓ９の高さおよび体積を比較する場合には、問題を呈さないが、異なるガイドＲＮＡまたはＤＮＡ基質を使用する場合にｄＣａｓ９／Ｃａｓ９の構造特性を比較する場合には、課題を呈する。対照として、追跡されるＤＮＡ分子の末端を標識するために使用されるストレプトアビジンタンパク質の高さおよび体積を使用した。これは、異なる実験のための、すべての実験条件を通して、不変のままであるべきである。ｓｇＲＮＡを用いる実験については、ストレプトアビジンの平均高さは、０．１ｎｍ未満だけ異なり（平均差：０．０８７ｎｍ；差の標準偏差：０．０５２ｎｍ）、その平均体積（１０９８ｎｍ³）は、１５ｎｍ³未満だけ異なっていた（平均差：１４．４６１ｎｍ³；差の標準偏差：１０．４１９ｎｍ³）。しかし、ｔｒｕ－ｇＲＮＡおよびｈｐ－ｇＲＮＡを用いる実験の平均高さおよび体積は、ｓｇＲＮＡを用いるものと、それぞれ最大０．１４ｎｍおよび２２５ｎｍ³異なっていた。これらの実験の結果を直接的に比較するために、遺伝子改変されたＤＮＡ上の、ｔｒｕ－ｇＲＮＡおよびｈｐ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９の高さを、ｓｇＲＮＡを伴うものに対する、その平均高さの差によってシフトさせ、体積は、平均体積の差の割合によって調整した。

【0224】

実施例２
原子間力顕微鏡観察は、高分解能で、遺伝子改変されたＤＮＡ基質に沿って、特異的および非特異的にＣａｓ９／ｄＣａｓ９結合を捉える
結晶学的および生化学的実験の解析は、プロトスペーサー結合および切断における特異性が、最初にＣａｓ９自体によるＰＡＭ部位の認識、続いて結合したＲＮＡ複合体によるストランド侵入、およびプロトスペーサーとの直接的ワトソン－クリック塩基対合を通して与えられることを示唆している（図１Ａ）が、完全な機構的実像は、まだ明らかになっていない。単一分子分解能を用いて、プロトスペーサーおよびオフターゲット部位に結合する相対的傾向を直接的に探るために、ヒト染色体１９のＡＡＶＳ１遺伝子座を標的にする５０ｎＭ Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡまたはｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体を、以下の３つのＤＮＡ基質のうちの１つ（２．５ｎＭ）とのインキュベーション後に、大気中でＡＦＭによって画像化した。

【0225】

（ｉ）ＰＡＭ（ここでは「ＴＧＧ」）の後に完全な標的部位を含有する、ＡＡＶＳ１遺伝子座の１１９８ｂｐセグメント（図１Ｃ）。

【0226】

（ｉｉ）それぞれがおよそ１５０ｂｐで区切られる一連の６つの完全な、部分的な、またはミスマッチの標的部位を含有する、９８９ｂｐの遺伝子改変されたＤＮＡ基質（図１Ｄ）。これらの部位でのミスマッチは、プロトスペーサーの「シード」（ＰＡＭ近位、およそ１２ｂｐ）領域と「非シード」（ＰＡＭ－遠位）領域との両方に及ぶ可能性がある。この遺伝子改変された基質におけるＰＡＭ部位だけは、これらの明確に設計された位置にあった。

【0227】

（ｉｉｉ）標的配列との相同性（３ｂｐ配列超）を有しない１０７８ｂｐの「ナンセンス」ＤＮＡ（図９Ａ～９Ｃ）。

【0228】

図１Ｃは、ｄＣａｓ９とＣａｓ９が、ＡＡＶＳ１基質に対するほぼ同一の結合分布を示すことを示す（それぞれ、ｎ＝４０４およびｎ＝２５０）。図１Ｄは、遺伝子改変された基質（ｎ＝５３６）に対して、ｄＣａｓ９は、ミスマッチ（ＭＭ）部位を有しない完全なプロトスペーサー（ピーク１、以後完全な部位または「０ＭＭ」部位と称する）に、また、親和性は低下するが、ＰＡＭ部位に対して遠位の５個または１０個のミスマッチ塩基を有する部位（それぞれ、ストレプトアビジン標識からの第３および第４の特徴、以後「５ＭＭ」または「１０ＭＭ」部位と称する）に結合する傾向が最も高いことを示す。より大きな数のミスマッチを含有する部位（第２および第５の特徴）、または２つのＰＡＭ近位ミスマッチヌクレオチドを有する部位（第６の特徴）は、有意に低い割合で結合される。（以下）各基質におけるＰＡＭ（「ＴＧＧ」）部位の分布。

【0229】

構造的に、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、それぞれがヌクレアーゼドメインを含有する２つのローブ（ｌｏｂｅ）様の半分におおよそ分けられる、およそ１０ｎｍ×１０ｎｍ×５ｎｍ（結晶構造より）の、１６０ｋＤａの単量体タンパク質である。Ｘ線構造と一致して、ＡＦＭを介して画像化されたｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡは、大きい卵構造のように見え（図１０Ａ～１０Ｃ）、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９をＤＮＡとインキュベーションした後に、ＤＮＡに沿って結合したこれらの構造が観察され、それぞれＣａｓ９またはｄＣａｓ９に割り当てられる（図１Ｂ、図１０Ａ～１０Ｃ、および図１１Ａ～１１Ｄ）。Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９によって結合された部位の配列をはっきりと決定するために、ＡＦＭ画像化の前に、ビオチン標識されたＤＮＡ分子を、一価のストレプトアビジンタグで一端を標識した。結合されたＣａｓ９またはｄＣａｓ９タンパク質を伴う、観察されたＤＮＡ分子を、さらなる分析のために選択し、Ｗｉｇｇｉｎｓら（２５）のプロトコルから適合させた、改変されたプロトコルに従って、サブピクセル分解能で追跡し、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９によって結合された部位を、抽出した（詳細については補足の方法を参照のこと）。

【0230】

この方法は、著しく頑強であると判明した（表１）：Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９によって結合されたＤＮＡ上では、隣接ＰＡＭを伴うプロトスペーサー部位の位置（予想される２３ｂｐ内、図１Ｃ～Ｄ）を厳密に中心とするタンパク質の特異な濃縮が観察され、鋭いピークとして現れる。標的部位を含有しないＤＮＡ基質には、こうした明らかなピークは観察されない（図９Ａ～９Ｃ）。ピーク幅の標準偏差は、３６～６０ｂｐの範囲であり、これは、およそ１０００ｂｐのピーク幅標準偏差σをもたらす単一分子蛍光を使用する結合実験と比較すると有意な改善である。７８．１ｂｐ±３７．９ｂｐをカバーするＤＮＡ上の平均の見かけのＣａｓ９／ｄＣａｓ９「フットプリント」；生化学的および結晶学的方法によって決定されるＤＮＡ上のＣａｓ９の約２０ｂｐフットプリントを超える、見かけのフットプリントのこの広幅化は、ＡＦＭチップの幅を用いる畳み込みを画像化した十分に確立された結果である。従来、Ｃａｓ９が、シングルターンオーバーのエンドヌクレアーゼとしての推定上のＤＮＡ切断後に、延長された期間（＞１０分）、標的とされるＤＮＡに結合されたままであり、かつ強力な化学処理無しでは切断鎖から外すことができないことが、インビトロで観察されていた。結合されたＣａｓ９と共に観察されるＤＮＡ分子のほとんどは、完全長のＡＡＶＳ１由来の基質として現れ、切断かつ分離されている基質は、ほんの少し（約５％）の割合である。これらのＤＮＡ分子を追跡した後、Ｃａｓ９は、ｄＣａｓ９とほぼ同一の分布で、これらの「完全長」基質に結合したことが観察された（コルモゴロフ-スミルノフ両側検定、有意水準５％）（図１Ｃ）。

【0231】

【表1】

【0232】

遺伝子改変された基質に沿った異なる位置に結合したｄＣａｓ９の占有を検討することによって、ｄＣａｓ９の、様々なミスマッチのおよび部分的な標的部位に対する相対的な結合傾向を決定することができた（図１Ｄ、表１）。ｄＣａｓ９と全ＤＮＡ基質との間の総解離定数は、２．７０ｎＭ（±１．５８ｎＭ、９５％信頼度、表２）と推定された。特に、（結合ヒストグラムにおける１ピーク幅内の）基質に位置する完全な（完璧にマッチした）プロトスペーサーの部位での、ｄＣａｓ９解離定数は、４４．６７ｎＭ（±１．０４ｎＭ、９５％信頼度）と推定された。以前の電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）は、短いＤＮＡ分子（約５０ｂｐ）上のプロトスペーサー部位に対するｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ結合を、０．５ｎＭから２ｎＭと推定していた。観察されるプロトスペーサー部位での解離定数の増大は、遺伝子改変されたＤＮＡ基質上の複数のオフターゲット部位の存在と関連付けることができるが、ＡＦＭによって決定される解離定数は、従来のアッセイによって決定される解離定数よりも、ほぼ１桁大きいことが典型的である（２６）。この差はしばしば、ＥＭＳＡでは考慮されない、タンパク質と、より短いＤＮＡの平滑末端との非特異的相互作用に起因する。

【0233】

【表2】

【0234】

遺伝子改変された基質に対しては、ｄＣａｓ９は、遠位ミスマッチに対して比較的に耐性であり（完全な標的部位に対して５０～６０％の結合傾向を示す、図１Ｄおよび表１）、５および１０個の遠位ミスマッチ（ＭＭ）を含有する標的部位に対する同じ見かけの親和性（信頼度内）を有する。しかし、２個のＰＡＭ隣接ミスマッチしか含有しないプロトスペーサー部位に対する結合は、１５またはそれどころか２０個の（ＰＡＭ部位単独）遠位ミスマッチを伴う部位に対するのと類似の傾向を伴って生じ（完璧な標的に対しておよそ５～１０％の結合傾向、ほぼバックグラウンド結合シグナルのもの）、知見は、以前の生化学的研究と一致する。遺伝子改変された基質上には、プロトスペーサー部位に隣接する以外のＰＡＭ部位は存在しないが、ＡＡＶＳ１由来の基質上には、ＰＡＭ部位が特に豊富である、ＡＡＶＳ１標的の近くの、Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９結合が増強された、特異な「ショルダーピーク」が存在する。「ナンセンス」基質、および標的部位から離れたＡＡＶＳ１由来の基質のセグメント上では、ｄＣａｓ９のわずかな濃縮が、ＰＡＭ部位の分布をしっかりと反映し（コルモゴロフ-スミルノフ両側検定、有意水準５％）、「ナンセンス」基質上のｄＣａｓ９分布が、同じｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、およびｄＧ分布をもつ１００，０００個のランダムに産生された配列の７１．２０％よりも、実験によるＰＡＭ分布をしっかりと反映した（図９Ａ～９Ｃ）。「ナンセンス」基質（１０７９ｂｐ内に８７９個のＰＡＭ部位を有する）に沿うｄＣａｓ９結合は、ＰＡＭ部位分布と、とても良く対応するので、これは、実際のｄＣａｓ９－ＰＡＭ相互作用の測定値と解釈された。「非特異的」基質に沿うｄＣａｓ９結合についての平均の単一部位解離定数は、およそ８６７ｎＭ（標準偏差±２０９ｎＭ）と推定された。これは、プロトスペーサー相同性を有しないＤＮＡ上のｄＣａｓ９結合の解離定数の推定値と理解することができる。

【0235】

実施例３
その５’末端に２ヌクレオチドの切り詰めを有するｓｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）は、インビトロでｄＣａｓ９の結合特異性を増大しない
Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡのガイド（プロトスペーサー－ターゲティング）セグメントの最大４個のヌクレオチドが、その５’末端から切り詰められた場合でも、依然として切断活性を示すことが判明し、Ｆｕら（２１）は、最近、これらの（最適には２～３個のヌクレオチドの）５’－切り詰めを有するｓｇＲＮＡの使用が、実際に、インビボでのＣａｓ９切断フィデリティーの数桁の増大をもたらすことができることを示した。これらの切り詰め型ｓｇＲＮＡ（「ｔｒｕ－ｇＲＮＡ」と呼ばれる、図２Ａ）を使用するミスマッチ部位（ＭＭ）に対する感受性の増大が、ガイドＲＮＡとプロトスペーサー部位との間の、その結合エネルギーの低下の結果であることが示唆された。これは、ｓｇＲＮＡ上の追加の５’－ヌクレオチドによって付与される結合エネルギーが、あらゆるミスマッチヌクレオチドを埋め合わせ、Ｃａｓ９を不正確な部位で安定化させることが可能であるのに対して、ｔｒｕ－ｇＲＮＡは、ミスマッチが存在する場合、ＤＮＡ上で比較的に安定性が低いであろうということを暗示する。

【0236】

この提案された機構の試験として、以前に使用されたｓｇＲＮＡに対して２ヌクレオチドの５’－切り詰めを有するｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９を画像化した。ｄＣａｓ９－ｔｒｕ－ｇＲＮＡ複合体を、一連の完全なおよび部分的なプロトスペーサー部位を含有する遺伝子改変された基質と共にインキュベートした。この場合もやはり、ちょうど完全なプロトスペーサー部位での特異なピークが見られた（図２Ｃおよび表１）が、この部位に完全なｓｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９と比較した見かけの結合定数は、かなり低下する（すなわち、解離定数は増大する、表２参照）。しかし、完全なプロトスペーサー部位での結合に対して、ＰＡＭ遠位ミスマッチを有するプロトスペーサー部位にｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９によるオフターゲット結合は、ｓｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９と比較した場合に、実際に増大する（図２Ｃおよび表１）。ｓｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９と同様、ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓは、ほぼ等しい傾向を伴って、１０個または５個のＰＡＭ遠位ミスマッチ部位を有するプロトスペーサーに結合する（ｔｒｕ－ｇＲＮＡが、それぞれ、これらの部位の最初の８または３個のミスマッチと相互作用すると予想されるに過ぎないことに留意されたい）。これらの結果は、ｔｒｕ－ｇＲＮＡを使用する切断フィデリティーの増大が、必ずしも、オフターゲット部位での結合傾向の相対的低下、またはミスマッチの存在下での相対的安定性の低下によって付与されるわけではないことを示唆する。むしろ、約４～５×１０⁶Ｍ未満の結合定数の低下が、切断活性をインビボで効率的になくす場合、いくらかの「閾値」効果が存在する可能性があるので、これらの結果および以下に与えるさらなる結果は、ｔｒｕ－ｇＲＮＡによって示される特異性の増大が、切断機構それ自体における識別によって影響を受ける可能性があることを示唆する。さらに、これらの知見は、ｔｒｕ－ｇＲＮＡは、活性なＣａｓ９の切断における特異性を改善することはできるが、インビボでｄＣａｓ９（またはキメラ誘導体）を使用する用途について、その結合活性における特異性を改善することはできないことを示唆するであろう。

【0237】

さらに、以前の報告は、そのプロトスペーサー－ターゲティングセグメント内に（最適には２～３個のヌクレオチドの）５’－切り詰めを有するｔｒｕ－ｇＲＮＡが、インビボでのＣａｓ９切断フィデリティーの数桁の増大をもたらすことができることを示しており（図２Ａ）、実施例に示されるこれらの結果は、切り詰め型ｇＲＮＡが、ｄＣａｓ９結合における特異性を増大しないことを示す（図２Ｃ）。図２Ｃは、完全なプロトスペーサー（部位ｉ）、ならびに５個および１０個のＰＡＭ遠位ミスマッチを有するプロトスペーサー部位（それぞれ、部位ｉｉおよびｉｉｉ）を含有するＤＮＡ分子に対する、ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９（ｔｒｕｇＲＮＡ、紫色線）の結合親和性と比較した、標準のｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９（破線）の結合親和性を示す。図２Ｃは、標準のガイドＲＮＡが、これらの（ミスマッチを含有する）オフターゲット部位に結合するかなりの能力を保持すること、また、ｔｒｕｇＲＮＡが、プロトスペーサーのＰＡＭ遠位末端に５ １０ヌクレオチドのミスマッチを含有する部位での結合特異性の相対的増強を示さないことを示す。ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９の結合分布は、ちょうど、１０個のＰＡＭ遠位ミスマッチおよび５個のＰＡＭ遠位ミスマッチを有するプロトスペーサー部位での、その親和性における特異なピークを示し、これは、このｄＣａｓ９が、完全なｓｇＲＮＡと比較して増大された結合特異性を有しないことを実証する（表１参照）。結合ヒストグラムにおける「ピーク」は、これらのオフターゲット部位での特異的な安定な結合を示すものである。事実上、ｄＣａｓ９－ｔｒｕｇＲＮＡによるオフターゲット部位での結合は、標準のガイドＲＮＡと比較して、プロトスペーサーへの結合に対して、実際に増大する。この無差別な結合は、ｄＣａｓ９およびキメラｄＣａｓ９誘導体に対するその有用性を制限する可能性がある。これはまた、この系について報告されるオフターゲット切断（これは、標準のガイドＲＮＡと比較して改善されながら、いくつかのオフターゲット部位で依然として顕著であった）を反映する可能性がある。比較のために、本発明者らは、ミスマッチを有するこれらの部位でのｈｐｇＲＮＡの非特異的結合を見つけ出した（図２Ｄ）。ｈｐｇＲＮＡは、プロトスペーサーに対する相同性を有しないＤＮＡに非特異的に結合するのとほぼ同じ親和性で、これらの部位に結合し、観察されるオフターゲット結合親和性の最大値は、ｔｒｕ－ｇＲＮＡに対して約２２％低下した。さらに、Ｃａｓ９結合チャネルの狭い幾何学的形状に基づいて、本発明者らは、ミスマッチプロトスペーサーでの開かれていないヘアピンの存在が、切断を実施するために必要であるＣａｓ９の立体構造変化を阻害することができることを予想する（図１Ｂ）。

【0238】

このオフターゲット活性を特徴付けるために、また、プロトスペーサー標的配列の賢明な選択；ｓｇＲＮＡ構造の最適化、例えばｓｇＲＮＡ内の最初の２個の５’－ヌクレオチドの切り詰めによるもの；および「二重ニッキング（ｄｕａｌ－ｎｉｃｋｉｎｇ）」Ｃａｓ９酵素の使用を通してＣａｓ９／ｄＣａｓ９の特異性を改善するために、かなりの取り組みが行われているが、Ｃａｓ９の構造生物学に関するＲＮＡガイド型の切断の厳密な機構の明確な理解が、医学および生物学におけるその現れつつある用途のためにフィデリティーが増大したＣａｓ９誘導体およびガイドＲＮＡを開発するために不可欠であろう。

【0239】

この目標に従って、ここで、本発明者らは、個々の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９タンパク質（これらは、様々なｓｇＲＮＡバリアントとのインキュベーション後に、遺伝子改変されたＤＮＡ基質に沿う標的に結合させる）を解明するために、原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）を使用する。この技術により、本発明者らが、個々のＣａｓ９／ｄＣａｓ９タンパク質の結合部位と構造との両方を、同時に、直接的に解明し、単一分子分解能を用いて、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９特異性に関する豊富な機構的情報を提供することが可能になる。従来の生化学的研究と一致して、本発明者らは、ｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９／ｄＣａｓ９によるかなりの結合が、標的配列内に最大１０対のミスマッチ塩基対を含有する部位で起こることを見いだす。しかし、その５’末端から２ヌクレオチドが切断されたガイドＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の使用は、インビボでのＣａｓ９によるオフターゲット変異誘発の最大５０００倍の低下をもたらすことが以前に示されているので、本発明者らは、ミスマッチ標的に結合するｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９についての、インビトロでの標準のｓｇＲＮＡと類似の特異性を見いだす。ガイドＲＮＡの標的結合領域と部分的にオーバーラップするｓｇＲＮＡの５’末端へのヘアピンの付加は、ＤＮＡへの全体的な結合傾向の低下という代償を払って、ｄＣａｓ９特異性を増大させることが見いだされる。本発明者らの結果は、ミスマッチがＰＡＭから１０ｂｐよりも大きく離れて位置する場合、ガイドＲＮＡ－ＤＮＡ結合の全体的な安定性は、Ｃａｓ９切断における特異性を必ずしも決定しないことを示す。

【0240】

実施例４
「ＰＡＭ遠位」－ターゲティングセグメントに相補的な５’－ヘアピンを伴うガイドＲＮＡ（ｈｐ－ｇＲＮＡ）は、完全な結合傾向、およびミスマッチプロトスペーサーを有するＤＮＡに結合したｄＣａｓ９のプロフィールをインビトロで調節する
ｄＣａｓ９特異性は、ｓｇＲＮＡの５’末端を、ｓｇＲＮＡの「ＰＡＭ遠位」ターゲティング（または「非シード」）セグメントをオーバーラップするヘアピン構造を形成するように延長することによって増大させることができる（図２Ｂ）。ＰＡＭ部位が結合され、ガイドＲＮＡによるＤＮＡのストランド侵入が開始した後、完全なプロトスペーサーに結合されると、ヘアピンが開き、完全なストランド侵入が起こることができる。標的部位にＰＡＭ遠位ミスマッチが存在する場合、ヘアピンが閉じたままであることが、エネルギー的に、より好都合であり、ストランド侵入は妨害される。近年、ストランド侵入によって駆動される「動的ＤＮＡ回路」のために、類似の空間配置が使用されている。それらの系では、ヘアピンは、侵入に対する速度論的バリアとして働き、オリゴヌクレオチド侵入速度は、ミスマッチを有する標的による侵入の試みの場合よりも数桁減速される。ここではヘアピンは、完全な標的部位の侵入中は置き換えられる可能性があるが、標的と、ガイドＲＮＡの非シードターゲティング領域との間のミスマッチが存在した場合には、侵入を阻害することができる（図２Ｂ）。この場合には、ヘアピンにとっては、閉じたままであることが、エネルギー的に、より好都合である。プロトスペーサー以降のさらなるヌクレオチドを補完するためにｓｇＲＮＡへの５’－伸長部が付加された、以前の取り組みに対して、これらのガイドＲＮＡは、インビボでのＣａｓ９切断特異性の増大を示さなかった。それどころか、これは、生細胞内で消化されて、ほぼその標準の長さまで戻ってしまった。ヘアピンのサイズおよび構造に基づいて、ヘアピンを、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９分子のＤＮＡ結合チャネル内に適合させ、分解から保護することができる。

【0241】

プロトスペーサーの最後の６個（ｈｐ６－ｇＲＮＡ）または１０個の（ｈｐ１０－ｇＲＮＡ）ＰＡＭｄｉｓｔａｌ部位に相補的なヌクレオチドをオーバーラップする５’－ヘアピンを有するｓｇＲＮＡ（ｈｐ－ｇＲＮＡ）を産生した。遺伝子改変されたＤＮＡ基質上のｄＣａｓ９－ｈｐ－ｇＲＮＡの観察された結合位置をマッピングすることによって（図２Ｄ）、ちょうどプロトスペーサー部位での、鋭いピークが観察された（ＰＡＭおよびプロトスペーサーは、部位１４４～１６７に位置し、結合ピークは、ｄＣａｓ９－ｈｐ６－ｇＲＮＡについては部位１５４．０（９５％信頼度：１５３．３～１５４．８）に、ｄＣａｓ９－ｈｐ１０－ｇＲＮＡについては１５８．３（９５％信頼度：１５７．６～１５８．９）に位置していた）。５個および１０個の遠位ミスマッチを有する部位での特異的ピークは、有意に平滑化され、ｄＣａｓ９およびｈｐ１０－ｇＲＮＡは、オフターゲット部位に対する実質的に低下した親和性を示す（ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９に対して２２％低下）。完全なプロトスペーサー部位での親和性のピークは、ヘアピンが、完全な侵入時に確かに開くことを暗示する。ｈｐ６－ｇＲＮＡについてはｎ＝２４３、また、ｈｐ１０－ｇＲＮＡについてはｎ＝２１２。ｈｐ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９は、標的部位に対する親和性では、ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うものと類似の低下を示すが、ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９とは対照的に、ｈｐ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９は、強い特異的結合を別の方法で示すであろう）オフターゲット部位でのいずれの鋭い結合ピークも呈さない。ｈｐ６－ｇＲＮＡでは、５個または１０個のミスマッチＰＡＭ遠位部位を有するプロトスペーサーの部位の周囲に、結合の濃縮が存在していた。これらは、ｓｇＲＮＡおよびｔｒｕ－ｇＲＮＡで観察された鋭い結合ピークを欠くので、これらの濃縮が、特異的な結合を示すものである可能性は低く、むしろ、ｄＣａｓ９が、表面への吸着時にこれらの部位から解離されたことを示す可能性がある。これは、ｈｐ６－ｇＲＮＡの場合には、そのオフターゲット部位での非常に弱い結合を示すであろう。

【0242】

ｈｐ１０－ｇＲＮＡの場合、基質上のどこか他の場所でのこれらのミスマッチ部位への結合は、ほぼ非特異的結合のレベルであり、観察されるオフターゲット結合親和性の最大値の、ｔｒｕ－ｇＲＮＡに対する２２％の低下が示される（観察される結合定数の最大値の３．１８×１０⁶Ｍから２．４８×１０⁶Ｍまでの低下、図２Ｄ）。ｈｐ１０－ｇＲＮＡの特異性のこの増大はまた、プロトスペーサー部位に対するｈｐ６－ｇＲＮＡと同様の結合解離定数、ただし全（特異的＋非特異的）遺伝子改変された基質相対物に対する総解離定数の有意な増大にも反映される（表２）。

【0243】

ちょうど完全なプロトスペーサー部位での特異な濃縮は、完全なプロトスペーサー部位の侵入時に、ｈｐ－ｇＲＮＡ内のヘアピンが、実際に開いていることを示唆する。何故なら、プロトスペーサーのＰＡＭ遠位部位と結合するヌクレオチドが、ヘアピン内で別に捕捉されるであろうからである。結合特異性の改善のための推定される機構は、ＰＡＭ遠位ミスマッチを有するプロトスペーサー部位で開かれていない場合に、ヘアピンの存在が、これらのオフターゲット部位からのガイドＲＮＡの融解を促進することである。これらの結果は、ｈｐ－ｇＲＮＡを、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９結合の親和性および特異性を調整するために使用することができ、また、ヘアピン長、ループ長、およびループ組成のさらなる操作が、これらの特性の、より精細な制御を可能にすることができることを示唆する。

【0244】

実施例５
Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９は、プロトスペーサー配列にマッチしつつあるＤＮＡ部位に結合するにつれて、進行性の構造遷移を受ける
ネガティブ染色・透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して、ｄＣａｓ９の構造が、ｓｇＲＮＡの結合時に、凝縮および回転して、その２つのローブ間の推定上のＤＮＡ結合チャネルを開くことが観察された。ｄＣａｓ９は、ＰＡＭおよびプロトスペーサー配列を含有するＤＮＡとの結合後、拡大された立体構造への第２の構造的再配向を受ける。この第２の遷移の役割は、ｓｇＲＮＡによるストランド侵入に関連する、または、２つの分離したＤＮＡ鎖を有する２つの主なＣａｓ９ヌクレアーゼ部位を整列させることが示唆された。しかし、これらの研究は、完全にマッチしたプロトスペーサー配列を含有するＤＮＡの有無にかかわらず実施されただけであり、部分的にマッチしたプロトスペーサー部位でのこれらの立体構造間の遷移を検討することで、オフターゲット結合および切断の機構への洞察を提供することができる。したがって、相対的結合傾向を決定することに加えて、ＡＦＭ画像化を使用して、Ｃａｓ９およびｄＣａｓ９による（これらは、プロトスペーサーに対する様々な相補性の部位で、ＤＮＡに結合するので）これらの推定上の立体構造遷移を捉えた。本発明者らは、ＤＮＡ上で孤立しているように見える、ｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９およびｄＣａｓ９タンパク質（ｎ＝８３９）の、体積および最大組織分布的高さを抽出し、これらの値をＤＮＡ上のそのそれぞれの結合部位にマッピングした（図３、図１１Ａ～１１Ｄ、および図１２Ａ～１２Ｂ）。この結合部位分布は、完全なデータセットの分布とほぼ同一であり、これは、この選択が不偏かつ代表的であったことを示す。これらのタンパク質のそれぞれの記録された画像を抽出し（図１１Ｃ～１１Ｄ）、回転、反転、および平行移動の繰り返しによって、対ごとに整列させた。タンパク質構造を、その対ごとの平均平方される形態的な差に従ってクラスター化した（図１２Ａ～１２Ｂおよび表３）。この技術の顕著な利点は、これが、ＤＮＡと共に表面上に共に局在するあらゆる一価のストレプトアビジンまたはあらゆる凝集したＣａｓ９／ｄＣａｓ９タンパク質を、それぞれＣａｓ９／ｄＣａｓ９分子に割り当てられるものとは別に自然状態でクラスター化し、ＤＮＡ上のこれらのタンパク質の構造特性の不偏性の分析を可能にすることである。推定上のストレプトアビジン分子または凝集したタンパク質のいずれかによる結合部位の分布の分析は、これらが、どちらも稀であり、ＤＮＡに沿って均一に分布しているので、結合部位分布の分析を邪魔しなかったことを明らかにする（図１２Ａ～１２Ｂ）。

【0245】

「ナンセンス」ＤＮＡ基質上など、標的に対する相同性を含有しない部位では、ｓｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９分子は、主に小さく卵形であった（図３Ｃ（ｉｉｉ）、および表３）。しかし、ｄＣａｓ９タンパク質が、次第に相補的標的配列に結合するにつれて（図３（α～δ））、その高さおよび体積は、非特異的結合と比較して著しく増大し（図３Ｄおよび１２Ａ～１２Ｂ、表２）、プロトスペーサー配列で最大サイズに到達する。この増大はまた、より平らな卵形の立体構造を伴ってクラスター形成している構造（図３Ｃ（ｉｉ）およびＣ３（ｉｉｉ）、青色および緑色）から、中心の大きな膨らみを有するわずかに丸みを帯びた構造を伴って次第にクラスター形成するもの（図３Ｃ（ｉ）、黄色）への、ｄＣａｓ９の集団のシフト（図３Ａ、および１２Ａ～１２Ｂ、表２）に伴う。この後者の観察される立体構造は、ＴＥＭによって以前に、またサイズ排除クロマトグラフィーによって最近観察された、拡大された立体構造である可能性が高く、おそらく、活性状態（ここで、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインは、切断が最も効率的に起こることができるように、ＤＮＡの周囲に適切に配置される）である。

【0246】

触媒的に活性なＣａｓ９は、また、プロトスペーサー配列に結合すると、サイズの有意な増大を受ける（図３（ε））；しかし、ｄＣａｓ９に対して、小さいが統計的に有意な、サイズの低下が存在し、完全なプロトスペーサー部位でのＣａｓ９の立体構造は、より平らな（緑色）構造を伴ってクラスター形成する傾向にある。本発明者らは、ＤＮＡが画像化の時点で切断されているかどうかを同時に観察しないので、これが、ＤＮＡ切断後の別の立体構造変化を表すかどうか、またはＣａｓ９とｄＣａｓ９との間の変異の差の結果であるかどうかは不明瞭である；しかし、結合およびストランド侵入は、律速段階であると、以前に決定されているので、Ｃａｓ９内のＤＮＡは、これらの測定中に切断される可能性が高い。

【0247】

【表3-1】

【表3-2】

【0248】

実施例６
ガイドＲＮＡと、プロトスペーサー部位の第１６位またはその近くの標的ＤＮＡとの間の相互作用は、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９立体構造変化を安定化させる
ＡＦＭ画像化により、ｄＣａｓ９／Ｃａｓ９が、最大１０個の遠位ミスマッチを有するプロトスペーサー部位と結合する有意な傾向を保持するが、プロトスペーサーに対して相補性を増しつつあるＤＮＡ部位への結合が、ｄＣａｓ９／Ｃａｓ９タンパク質の集団の、活性な立体構造であるように見えるものへのシフトの増大を駆動することが、直接的に明らかになる。注目すべきことに、本発明者らは、オフターゲット部位と、ｈｐ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９に対する完璧にマッチした部位との間にも、構造の類似のシフトを見いだす（表２および図１３）。相補的ＰＡＭ遠位配列の存在は、ＤＮＡ上のＣａｓ９の安定性の増大と関連することが公知である。プロトスペーサーに対するＰＡＭ遠位相補性を（１０～２０部位に）増大させた単鎖ＤＮＡへのＣａｓ９結合が、タンパク質サイズの変化の増大をもたらすことも、最近判明した。これはまた、さらに、ニッキング挙動から完全な切断までのＣａｓ９活性の遷移と関連していた。ここでは、本発明者らは、二本鎖ＤＮＡ部位に結合したＣａｓ９／ｄＣａｓ９の体積を直接的に決定することができる。二本鎖ＤＮＡ上の個々のＣａｓ９／ｄＣａｓ９タンパク質の構造特性の分析により、「立体構造ゲーティング」機構と一致する、マッチしつつある標的配列を有する安定した立体構造遷移が明らかになる。ここでは、これらの遠位部位とのｓｇＲＮＡ塩基対合も、活性な立体構造を安定化し、その結果、効率的な切断が起こることができるが、多数の遠位ミスマッチを有する部位への結合は、平衡状態を活性な構造からシフトさせる（すなわち、図４Ｄを参照のこと）。

【0249】

これらの線に沿って、本発明者らは、この効果が、ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９について、その中でタンパク質がクラスター化する構造集団間でのより小さいシフトを伴って（図１３）、劇的に弱められる（図３Ｄおよび表３）ことを見いだす。さらに、本発明者らは、非特異的に結合されるｄＣａｓ９－ｔｒｕ－ｇＲＮＡの高さ－体積特性と、完全または部分的なプロトスペーサー部位で結合されるものとの間に統計的有意差を見いだす（ｐ＜０．０５；ホテリングのＴ²検定）ので、プロトスペーサーとマッチしつつある部位（１０ＭＭ、５ＭＭ、および完全なプロトスペーサー部位）では、その構造特性は、統計的に識別可能ではない（図３Ｄおよび表３）。近年、プロトスペーサーの最初の１０ｂｐの侵入が、Ｃａｓ９の立体構造変化を開始するのに対し、ガイドＲＮＡによるプロトスペーサーの完全な侵入は、完全な活性状態へのさらなるシフトを駆動するのを助けることが主張された。したがって、本発明者らは、（ｓｇＲＮＡを伴うものに対して）ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９について、マッチしつつあるプロトスペーサー部位では、立体構造変化の観察される抑制が、ＰＡＭ遠位部位でのこれらのガイドＲＮＡの安定性の低下の結果であることを仮定した。

【0250】

これらの部位でのｓｇＲＮＡおよびｔｒｕ－ｇＲＮＡの相対的安定性を調べるために、本発明者らは、ストランド侵入中および侵入後の、Ｒループの動的構造－すなわち、そのセグメントの相補的ＤＮＡの単鎖ループを露出している、近接ＤＮＡのセグメントに結合された、侵入するガイドＲＮＡによって形成される構造（図４Ａ）－の動的モンテカルロ（ＫＭＣ）研究を実施した。さらに詳細については、補足の方法を参照されたい。簡単に言うと、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ型アルゴリズムを使用して、本発明者らは、侵入の間の逐次的な、ヌクレオチドごとの競合としての、プロトスペーサー部位ｍまで結合したガイドＲＮＡのストランド侵入（プロトスペーサーとその相補的ＤＮＡ鎖との間の塩基対合の切断、次いで、プロトスペーサー－ガイドＲＮＡ塩基対での置き換え）、および侵入および再アニーリングの配列依存性の速度、それぞれｖ_fおよびｖ_rを用いる再アニーリング（リバース）をモデル化した（図４Ａ）。最初に、本発明者らは、ｅｘｐ（－（ΔＧ°（ｍ＋１）_RNA:DNA－ΔＧ°（ｍ＋１）_DNA:DNA）／２ＲＴ）と比例する、状態ｍからｍ＋１までの遷移速度ｖ_fを概算する。ここでは、ΔＧ°（ｍ＋１）_RNA:DNAは、ＲＮＡと、部位ｍ＋１でのプロトスペーサーとの間の塩基対合の自由エネルギーであり、ΔＧ°（ｍ＋１）_DNA:DNAは、プロトスペーサーと、ｍ＋１でのその相補的ＤＮＡ鎖との間の塩基対合の自由エネルギーである（Ｒは、理想気体定数であり、Ｔは、温度であり、詳細釣り合いを満たすために、１／２という語が追加される）。ｖ_rは、ｅｘｐ（－（ΔＧ°（ｍ）_DNA:DNA－ΔＧ°（ｍ）_RNA:DNA）／２ＲＴ）と比例するように、同様に推定される。このタイプの遷移速度は、ヌクレオチド塩基対合および安定性のコンピュータ研究のために、以前に使用されており、ここでは、これにより、本発明者らが、配列依存性の方式で、Ｒループの一般的な動力学を捉えることが可能になる。

【0251】

一般に、ＲＮＡ：ＤＮＡ塩基対は、ＤＮＡ：ＤＮＡ塩基対よりもエネルギー的に強く、平衡状態で、本発明者らは、ＫＭＣ軌跡から、ガイドＲＮＡが、予想通り、プロトスペーサーに安定的に結合されることを見いだす（図４Ｃ）。しかし、ｓｇＲＮＡは、かなり安定であり、ほとんど完全に侵入されたままである － ９５％のシミュレーションされる時間経過中、鎖は、第１９までのプロトスペーサー部位に侵入されたままである（図４Ｂ） － ので、ｔｒｕ－ｇＲＮＡは、ＰＡＭ遠位部位でのプロトスペーサー再アニーリングの有意な増減を示す（図４Ｂおよび４Ｃ）。ｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡとｄＣａｓ９－ｔｒｕ－ｇＲＮＡとの間の唯一の違いが、ガイドＲＮＡからの２個の５’－ヌクレオチドの単純な切り詰めであるので、また、本発明者らは、５個のＰＡＭ遠位ミスマッチを含有する部位でのｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡによる立体構造変化の阻害を見いだすので、これらの結果は、十分に活性な状態への立体構造変化が、ガイドＲＮＡと、プロトスペーサーの第１６部位の近くのプロトスペーサーとの間の相互作用によって安定化され、これは、この領域におけるｔｒｕ－ｇＲＮＡの不安定性によって破壊されることを示唆する。実際、ＫＭＣ実験は、完全な侵入と、第１６部位まで戻るＤＮＡの再アニーリングとの間の平均寿命は、ｓｇＲＮＡをｔｒｕ－ｇＲＮＡで置き換える場合に２桁低下することを示す（図４Ｃ挿入図）。この結果は、２または３ヌクレオチド（ｎｔ）の切り詰めを有するｔｒｕ－ｇＲＮＡバリアントを伴うＣａｓ９活性が、配列構成に応じて調節されたのに対して、試験されたすべての場合における切断は、４ｎｔ切り詰めによって約９０％～１００％劇的に低下し、５ｎｔ切り詰め後にはなくなったという以前の発見と一致する、タンパク質活性化状態への立体構造変化は、プロトスペーサーの第１６位置またはその近くのこれらの相互作用によって安定化される。この発見は、第１４～第１７プロトスペーサー位置でのｇＲＮＡ安定性（これは、以下に記載した追加のＫＭＣ実験から推定され、実験によるインビボでのオフターゲット切断（以下参照）と相関する）によって裏付けられるが、プロトスペーサー部位１８～２０でのガイドＲＮＡの安定性は存在しない。

【0252】

実施例７
ガイドＲＮＡ－プロトスペーサーＲループの増減は、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９によるミスマッチ耐性の機構、また、ｔｒｕ－ｇＲＮＡによる切断の特異性増大の機構を示唆する
Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９が、プロトスペーサー中のミスマッチを許容することができるまたはミスマッチに対して敏感になる機構を調べるために、本発明者らは、１個または２個のＰＡＭ遠位（ＰＡＭから≧１０ｂｐ以遠）ミスマッチが導入される、ＡＡＶＳ１プロトスペーサー部位を使用する一連のＫＭＣ実験を実施した（図５）。Ｃａｓ９は、一般に、ＰＡＭ近位ミスマッチよりもＰＡＭ遠位ミスマッチに耐性である。しかし、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２７－８３２は、配列構成、ミスマッチの種類、およびミスマッチの部位に依存する、ＰＡＭ遠位ミスマッチを含有するプロトスペーサーでの推定されるＣａｓ９切断速度の著しいかつ変動する違いを明らかにした。本発明者らは、本発明者らのＡＦＭおよび以前のＫＭＣ実験に基づいて、切断速度の違いが、同様に、プロトスペーサーの第１６部位の近くのガイドＲＮＡの異なる安定性の結果であり得ることを仮定した。これらのシミュレーションについては、本発明者らは、そのための配列構成依存性の熱力学的データが、本発明者らのＫＭＣモデルにとって最も完璧かつ適切である、分離したｒＧ・ｄＧ、ｒＣ・ｄＣ、ｒＡ・ｄＡ、およびｒＵ・ｄＴミスマッチをもたらすであろうプロトスペーサー－ガイドＲＮＡ対を有する配列を検討しただけであった。これらのミスマッチ塩基対の効果は、ｓｇＲＮＡとプロトスペーサーとの間の全体の結合エネルギーを劇的に低下させると予想されていない（表４）；例えば、単一のｒＧ・ｄＧ、ｒＣ・ｄＣ、ｒＡ・ｄＡ、およびｒＵ・ｄＴミスマッチは、ＲＮＡ：ＤＮＡ融解温度を平均で１．７℃低下させる。むしろ、その効果は、ミスマッチでの鎖置換を妨害することによって、実際は熱力学的ではなく速度論的であると予想される。したがって、本発明者らは、ストランド侵入中に起こっているであろうものなどの、第１０プロトスペーサー部位から進行する（最初のＲループ長ｍ＝１０）動的モンテカルロ実験を開始した。

【0253】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表4-6】

【0254】

次いで、ＰＡＭ遠位ミスマッチの存在下でのストランド侵入の速度論を調べるために、ＫＭＣ実験を実施した。すべての場合（それぞれ１０００回の試験）において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチが存在する（すなわち、完全に融解することが観察されない）場合であっても、かなり安定的に結合されたままであり、これらの部位を素早く迂回して完全な侵入を完了することが可能であることが多い（図５Ｃおよび図１４Ａ～１４Ｃ）が、全ストランド侵入の平均初到達時間は、ミスマッチ部位の位置に依存して、かなり変動する（図１４Ａ～１４Ｃ）。ｓｇＲＮＡは、複数のミスマッチの存在下でも完全に侵入されたままであることが可能であることが多いので、Ｒループは、侵入中、かなり安定である（図５Ａ）。これらの結果は、ミスマッチ標的上のｄＣａｓ９／Ｃａｓ９結合および切断の以前のインビトロ研究の結果と質的に似ている。しかし、ｔｒｕ－ｇＲＮＡ（図５Ｂ）の場合、Ｒループは、ミスマッチ部位の後方で、しばしば捕捉される。ミスマッチを越える平均初到達時間は、ｓｇＲＮＡとｔｒｕ－ｇＲＮＡの両方について同様である（図１４Ａ～１４Ｃ）が、ＫＭＣについての時間経過を調べると、ｔｒｕ－ｇＲＮＡについてのＲループの固有の不安定性が原因で、ｔｒｕ－ｇＲＮＡは、しばしば、ミスマッチの後方で素早く「再捕捉」されることが明らかになる（図５Ｃ）。ｓｇＲＮＡについては、この再捕捉は、かなり頻度が低い。したがって、ＡＦＭ画像化と組み合わせると、ＫＭＣ実験の結果は、ｔｒｕ－ｇＲＮＡ特異性増大の原因が、結合中の識別にあるのではなく、むしろそのＲループの不安定性にあり、その結果、ｔｒｕ－ｇＲＮＡが、ミスマッチの後方で、これを最初に迂回した後にも繰り返し捕捉されるようになり、Ｃａｓ９が活性な立体構造をとる可能性が低くなることを示唆する（図４Ｄ）。ｓｇＲＮＡについては、ミスマッチがいったん迂回されると、比較的わずかな攪乱しか伴わずに完全に侵入されたままであることができ、これは、ミスマッチ耐性の機構を示唆する。

【0255】

実施例８
プロトスペーサーの第１４～第１７位置とのガイドＲＮＡ相互作用の安定性が、実験によるオフターゲットＣａｓ９切断速度と相関するのに対して、全体のガイドＲＮＡ－プロトスペーサー結合エネルギーは相関しない
プロトスペーサーの第１６位置またはその近くのＲループの安定性－これはＣａｓ９の立体構造変化と関連するＡＦＭ研究に含まれた－が、インビボでＣａｓ９活性と関係があるかどうかを確認するために、本発明者らは、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２７－８３２によって使用される配列に関するＲループ安定性の動的モンテカルロ（ＫＭＣ）分析を実施した。Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２７－８３２のデータセットは、Ｃａｓ９による切断特異性を調べるために実施された、ガイドＲＮＡに対する、様々な点変異を含有する１５個の異なるプロトスペーサー標的での切断頻度の測定で構成されていた。このデータセットは、ＰＡＭ遠位領域内に、ｒＧ・ｄＧ、ｒＣ・ｄＣ、ｒＡ・ｄＡ、およびｒＵ・ｄＴ型の単一の分離したミスマッチを有する、１３６個のプロトスペーサー－ガイドＲＮＡ対を含有しており（表４）、これを、本発明者らは、Ｒループサイズｍ＝１０で開始して侵入をシミュレーションするＫＭＣ方法を使用して調べた。このセット由来の単一のミスマッチ部位の包含は、言及した通り、その全体のガイドＲＮＡ－プロトスペーサー結合自由エネルギーの大きさを、完璧にマッチした標的に対して平均で約６％しか低下させなかったが、その由来が明らかではない、これらのガイドＲＮＡ－プロトスペーサー対について観察される広範な分布のＣａｓ９切断頻度が存在していた。

【0256】

ＲＮＡがプロトスペーサーの各部位に安定的に結合された時間の比の平均を、１０００回の試験を通じて各ガイドＲＮＡについて決定し、次いで、これを、Ｃａｓ９の切断活性の最大推定値と相関させた（表４、図６、および図１５）。第１６プロトスペーサー位置でのガイドＲＮＡ安定性と、報告されたオフターゲット切断活性との間に、中程度（０．４３３）ではあるが統計的に有意な（ｐ＜１×１０^-6）相関が見られた。注目すべきことに、切断速度と予測されるＤＮＡ：ＲＮＡ結合エネルギー単独との間には、統計的に有意な相関は見られなかった（０．０７８６；ｐ＝０．３６３１）（図６Ａおよび６Ｂ）。第１６位置でのＲループ安定性に加えて、第１７プロトスペーサー部位の安定性と、報告された切断についての、有意な相関も見られる（表５）が、これは、部位≧第１８部位については当てはまらなかった（図６）。ここに示した動的モンテカルロモデルは、ストランド侵入の比較的単純なモデルに基づいているので、これらの結果は、プロトスペーサーの第１６～第１７部位の安定性、したがって本発明者らが観察した付随する立体構造変化が、インビボでのＣａｓ９切断活性と関係があることをさらに示唆する（図４Ｄ）。

【0257】

【表5】

【0258】

本発明者らは、ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９とｓｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９との観察される構造の違いにより、本発明者らの分析のほとんどを、プロトスペーサーの第１６～第１８ヌクレオチドとの相互作用に限定した。しかし、本発明者らは、第１４および第１５プロトスペーサー部位の切断と安定性との間の相関（図６）の、強度の増大および統計学的有意性も観察し、第１４部位での相関が、最も有意性が高かった。Ｒループは、動的な構造であるので（図４Ｄ）、これらの部位との相互作用が、ＤＮＡ切断の原因であると考えられる重要なものである可能性がある。ガイドＲＮＡの４または５ヌクレオチドの切り詰めは、ｔｒｕ－ｇＲＮＡが、第１６～第１７部位でＲループを不安定化させるのとほぼ同様の様式で、第１４または第１５位置でＲループを十分に不安定化させることによって、切断活性をなくす可能性がある。しかし、本発明者らのモデルでは、第１６部位がｓｇＲＮＡによって結合される時はいつも、第１４および第１５部位は必然的に侵入されるので、これらの位置は、さらに情報価値がある可能性が高い。何故なら、これらはまた、ミスマッチ部位を迂回する前の二重鎖からのｓｇＲＮＡ解離（図６Ａｉおよび図１６Ｂ）、すなわち、切断を生じ損なうこととなる別の機構の確率と、より強く逆相関するからである。今のところ、ストランド侵入を、切断を容認すると考えられる観察される立体構造変化と直接的に関連付ける、結晶学的根拠は存在しない。しかし、ここで示すＡＦＭ実験によって提供される根拠、および動的モンテカルロシミュレーションの結果に基づいて、本発明者らは、侵入中のプロトスペーサーの第１４～第１７部位でのガイドｇＲＮＡの安定性が、この立体構造変化、最終的にはＣａｓ９切断の特異性にとって重要であると結論付ける。

【0259】

さらに、ストランド侵入とＤＮＡ再アニーリングとを競合させる動的な構造としてのＲループは、オフターゲット切断およびミスマッチ耐性の機構を理解するのに有用であり得る。切断速度と予測されるＤＮＡ－ＲＮＡ結合エネルギー単独（図６Ｂ）との間に、統計的に有意な相関は見られず、これは、オフターゲット部位でのＣａｓ９活性を決定しようとしている場合、ストランド侵入の速度論が考慮され得ることを示唆していた。ガイドＲＮＡから４または５ヌクレオチドが切り詰められる場合、切断はなくなるが、Ｃａｓ９は、依然として、最大６個までの遠位ミスマッチ部位を有するＤＮＡを切断することが可能である。これらのＰＡＭ遠位部位での一過性の非特異的相互作用は、切断に不可欠な立体構造シフトを十分に安定化することが可能である。本発明者らは、完全なプロトスペーサー（黄色、図３Ｃ（ｉ））での構造と類似の構造を有する、部分的なプロトスペーサー部位でのｄＣａｓ９－ｓｇＲＮＡの少数集団を確認するので、この集団は、一過的に安定化された活性な立体構造中のＣａｓ９の分画を表すことができる。したがって、この集団は、オフターゲット切断の原因であり得る。

【0260】

Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９結合特異性は、ＰＡＭ近位領域との相互作用によって大方決定されるが、ＤＮＡ切断特異性は、活性化された構造（これは、プロトスペーサーの第１４～第１７ｂｐ 領域でのガイドＲＮＡ相互作用によって安定化される）への立体構造変化によって支配される可能性が高い（図４Ｄ）。動的モンテカルロ実験は、ガイドＲＮＡのストランド侵入中に形成されたＲループが、ガイドＲＮＡが、安定的に結合されたままである場合であっても、かなりの動的構造であり得ることを明らかにしている。これは、ｔｒｕ－ｇＲＮＡの特異性改善のための機構、およびミスマッチ部位周囲の重要な領域でのガイドＲＮＡ－プロトスペーサーの一過性の安定性を介するオフターゲット切断の起源を示唆している。Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９特異性に対する、ｓｇＲＮＡバリアントのそれぞれの影響についての提案される機構を、図７にまとめて示す。

【0261】

ＡＦＭを使用して、ｈｐ－ｇＲＮＡが、相同の（ｈｏｍｅｏｌｏｇｏｕｓ）標的での特異的な結合を有意に弱めるまたはなくすことが判明した。ｈｐ－ｇＲＮＡは、生物学および医学におけるその潜在的用途において、ｄＣａｓ９結合親和性および特異性を調節するのに有益であり得る。具体的には、Ｃａｓ９結合チャネルの狭い幾何学的形状に基づいて、ミスマッチプロトスペーサーでの開かれていないヘアピンの存在が、Ｃａｓ９による活性状態への立体構造変化を阻害することができる。結合時のｈｐ－ｇＲＮＡにおけるヘアピンの開口はまた、例えば、特定の部位に結合する時にのみ動的なＤＮＡ／ＲＮＡ構造を形成するための、インビボでの結合依存性シグナルとしても使用することができるであろう。

【0262】

初期のガイドＲＮＡ切り詰め研究は、１６ヌクレオチドのガイド配列のみが切断のために必要とされ、かつさらなるヌクレオチド（＞１８）がインビボでの切断特異性を改善しない場合に、天然のＣａｓ９系が、どのような理由で２０ｂｐのプロトスペーサー部位を標的にするｃｒＲＮＡを用いるのかという問題を提起した。これらの結果は、第１９および第２０プロトスペーサー部位に結合する「特別な」５’－ヌクレオチドの存在が、プロトスペーサーの重要な第１４～第１７部位でのこの一過性の再アニーリングを緩衝し、活性状態への効率的な立体構造変化、およびその後の切断を起こさせることを示唆する。ＡＦＭおよびＫＭＣ実験の結果は、これらの部位でのガイドＲＮＡの安定性が、完全な侵入時に、Ｃａｓ９の平衡状態構造を活性な立体構造にシフトさせる（図４Ａ）のに対して、「切り詰め型」ガイドＲＮＡに対するＲループの不安定性が、平衡状態を活性状態にシフトさせる力を低下させることを示唆する。ｔｒｕ－ｇＲＮＡを伴うＣａｓ９に対するｓｇＲＮＡを伴うＣａｓ９の無差別な活性はまた、侵入するファージのＤＮＡが、切断を避けるために、Ｃａｓ９によって標的とされる部位で急速な点変異を受けることから、原核生物における侵入ＤＮＡに対する適応免疫の薬剤としてのその役割における進化上の利点を保持するであろう。

【0263】

インビボでのＣａｓ９／ｄＣａｓ９用途のためのガイドＲＮＡ配列の設計は、ゲノム内の類似の配列を有する複数の部位を標的にすることを避けることに第一に焦点を合わせている。しかし、オフターゲット切断を探索する最近の研究では、オフターゲット活性を予測するための現在の方法が、大いに非効率であることが判明した。侵入中のＲループの安定性は、ガイドＲＮＡ－プロトスペーサー結合エネルギー単独またはミスマッチの位置よりも著しく良く、オフターゲット切断速度と相関する（ガイドＲＮＡ設計において使用される別の重要な基準、表３）。侵入の開始後の、より短い時間でのＲループの安定性は、ＫＭＣ実験における長期安定性（図１６Ａ）よりもはるかに良く、実験による切断速度と相関し、これは、ストランド侵入の速度論が、オフターゲット活性予測における因子であることを示唆する。

【0264】

実施例９
インビボ試験
ｄＣａｓ９結合特異性を調べるために、最適化されたｇＲＮＡ活性を、生細胞において試験した。ヒトゲノムにおける４つの標的位置（プロトスペーサー）のそれぞれに対して、いくつかのヘアピンｇＲＮＡ（ｈｐ－ｇＲＮＡ）を設計した（図１７および１８）。１つは、ジストロフィン遺伝子（図１９～２３）内であり、もう１つは、ＥＭＸ１遺伝子（図２４～２９および４４）内であり、２つの標的は、ＶＥＧＦＡ１（図３０～３７）およびＶＥＧＦＡ３（図３８～４３）と標識されたＶＥＧＦＡ遺伝子内であった。すべての実験は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で行った。

【0265】

Ｃａｓ９のプロトスペーサーに対する結合および切断活性を調節するために、追加のヌクレオチド（ｎｔ）を、完全なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、全長２０ｎｔ）の５’末端に付加して、５’－プロトスペーサー－ターゲティングヌクレオチド、またはプロトスペーサー－ターゲティング領域の中央または３’末端のヌクレオチドとハイブリッド形成することによってヘアピンおよび二次構造を形成するように設計した。

【0266】

ＶＥＧＦＡ１－ターゲティングｈｐ－ｇＲＮＡの、ある二次構造を、完全なプロトスペーサーへの結合を可能にしつつ既知のオフターゲット部位での結合を妨げるように、本明細書に記載した方法を使用して、計算によって設計した（図４４Ａ～４４Ｃ）。オンターゲット部位での完全なｇＲＮＡの結合寿命以上の結合寿命、および上位３つのオフターゲット部位での完全なｇＲＮＡの結合寿命以下の結合寿命を有するように、ｈｐ－ｇＲＮＡを選択した。他の５’－構造を、ｈｐ－ｇＲＮＡの二次構造のエネルギー特性を調節するためにｄＧ－ｒＵゆらぎ対を含むように設計するか、それ自体がＣａｓ９活性のより高い特異性を促進することが示されている切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ、＜２０ｎｔ）の末端に付加した。

【0267】

細胞研究。ディープシークエンシング分析については、２９３Ｔ細胞に、Ｃａｓ９および対象となるｇＲＮＡを発現するプラスミドを導入した。この細胞を、４日間インキュベートし、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡがその最大活性を発揮できるようにした。次いで、細胞を収集し、そのゲノムＤＮＡを精製した。文献中で非常に良く特徴付けられている（すなわち、そのオンターゲットおよびオフターゲット部位が公知である）ｇＲＮＡを使用した。

【0268】

Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。ディープシークエンシングと比較して、ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイは、スループットが少なく、かつ感度が低い。しかし、ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイは、データ分析が速く、またそれほど技術的ではなく、ゲル画像が提供される。したがって、ｓｕｒｖｅｙｏｒは、最初の工程として行われ、最良の条件を、ディープシークエンシングを用いて３連で分析した。ディープシークエンシングとＳｕｒｖｅｙｏｒは両方とも、Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡによって引き起こされる変異事象を定量化するための方法である。

【0269】

Ｓｕｒｖｅｙｏｒに関する細胞研究は、上に記載したのと同じであった。ゲノムＤＮＡを精製した後、プライマーを、標的とされる部位を増幅するように設計した。この実験では、２００ｋ細胞のプールを使用し、ＤＮＡ修復が確率論的であることから、これらは１つ１つ、異なる変異を有していた。２００ｋ細胞にわたる部位を増幅して、不均一のＰＣＲ産物を産生した：各細胞の確率論的（すなわち、ランダムな、誤りがちな）Ｃａｓ９切断部位の修復が原因で、あるアンプリコンは欠失を有し、あるものは挿入を有し、あるものは野生型および非改変であった。

【0270】

この不均一ＰＣＲプールを、加熱および修復させ、場合によっては、異なる鎖を互いにアニールさせた：野生型ＤＮＡ鎖が、挿入を有するＤＮＡに結合すること可能性もあるし、挿入が、欠失に結合する可能性もある。これが起こる場合、小さい「バブル」が形成され、この構造はＤＮＡヘテロ二重鎖と呼ばれる（図４６参照）。

【0271】

ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼを使用して、これらのヘテロ二重鎖を、これらを消化および切断することによって検出した。ＤＮＡ切断は、その後、Ｃａｓ９の変異活性の代わりとなるものであった。ＰＣＲプールを、ゲル上で分離し、これらの消化されたバンドの強度を使用して、Ｃａｓ９活性の割合を定量化した。

【0272】

ディープシークエンシング。プライマーを設計して、これらの公知の標的／オフターゲットを増幅した。このＰＣＲには、ハイフィデリティーポリメラーゼを使用した。これらのプライマー上には、バーコード化およびＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉ－Ｓｅｑプラットフォームに装填できるように、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターも存在していた。ヘアピンの＃、標的の＃、オフターゲットの＃、シークエンシング被覆度などは、図面および図面の簡単な説明に記載する。分析に使用される試料を通して、優れた被覆度が得られた。リード／試料の平均数は、２０，０００であった。最も少ない＃のリードを有するする試料は、１，７００であった。非常に少数の標的は、十分に整列されたリードを産生せず、分析には含めなかった。

【0273】

得られたシークエンシングデータを、ディープシークエンシングリードを公知のオフターゲットまたはオンターゲット位置の特定の部位と整列するＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏソフトウェア（Ｐｉｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１６）３４（７）：６９５－６９７））を使用して分析した。このソフトウェアの結果を、社内のスクリプト（ここで、ディープシークエンシングリードの、ヒトゲノムとのグローバルアライメントが実施される）と比較すると、非常に良く相関していた。変異率を、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏを使用して定量化し、得られたデータを、各標的遺伝子について、示されたヒストグラムに示した。

【0274】

設計は、標準のｇＲＮＡを使用して標的とされることが公知である標的部位およびオフターゲット部位での、ＨＥＫ細胞におけるＣａｓ９およびｈｐ－ｇＲＮＡ発現後のインデルについて試験するために、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して最初に試験した（表６参照）。これらの部位での活性を、標準のｇＲＮＡおよび切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）と比較した。これらを、ＰＣＲ処理されたゲノムＤＮＡのＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼによる切断を示すゲルとして下に示す。ここでは、切断は、Ｃａｓ９による変異誘発を示す。

【0275】

【表6】

【0276】

最も有望なｈｐ－ｇＲＮＡ設計を、次世代シーケンシングを使用する追加の定量分析のために選択して、ＨＥＫ細胞におけるオンおよびオフターゲット部位でのＣａｓ９活性を評価した。特異性は、オンターゲットヒット／合計（オフターゲットヒット）と定義された。

【0277】

Ｃａｓ９活性は、一般に、ｈｐ－ｇＲＮＡを使用する場合、等しいか、わずかに低下するが、ディープシークエンシング実験のために選択された各ｈｐ－ｇＲＮＡは、完全なｇＲＮＡよりも増強した特異性を示し、大抵の場合、特異性に関してはｔｒｕ－ｇＲＮＡ以上であった。

【0278】

ある場合では、ｈｐ－ｇＲＮＡヘアピンターゲティングＥＭＸ１は、（ｇＲＮＡに対して≒１００倍の改善を有するｔｒｕ－ｇＲＮＡに対して）完全なｇＲＮＡに対して特異性の＞６０００倍の改善を示した。社内のアルゴリズムを使用する計算によって設計された二次構造を有するＶＥＧＦＡ１ターゲティングｈｐ－ｇＲＮＡは、特異性に関してｔｒｕ－ｇＲＮＡ活性よりも大きく性能が優れていた（ｇＲＮＡよりも３倍の改善に対して１８倍）。これらのｈｐ－ｇＲＮＡを、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と共に試験した。図４４Ａ～４４Ｃは、オンターゲット活性を示す、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｏｕｓ）からのＣａｓ９を用いるＥＭＸ１－ターゲティングｈｐ－ｇＲＮＡのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを示し、かなりのオフターゲット活性を示すｔｒｕ－ｇＲＮＡとは対照的に、オフターゲット活性は検出可能ではなかった

【0279】

実施例１０
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系のためのｈｐ－ｇＲＮＡ
実験は、ＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらのＮａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１６）３４：８６９－８７４の結果を再現するように設計した。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらは、完全長ｇＲＮＡを使用して、異なる位置に標的部位と共にミスマッチを有するｇＲＮＡを使用することによって、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）Ｃｐｆ１が、ＰＡＭ遠位部位に加えて、８～９ヌクレオチドにミスマッチを有するオフターゲット部位での切断を受けやすいことを示した（図４７）。この実施例では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１と共に使用されるヘアピンガイドＲＮＡは、本発明の方法を使用して、上に記載した通りに設計および試験した。

【0280】

追加の二次構造エレメントを伴うおよび伴わないＣｐｆ１のオフターゲット活性を試験するために、ＤＮＭＴ１遺伝子

【化2】

を、Ｃｐｆ１による切断のための標的とした。「オフターゲット活性」は、第９位にミスマッチヌクレオチドを有するガイドＲＮＡ、例えば、完全長ガイドＲＮＡ（２０ヌクレオチド長）を使用する

【化3】

、または切り詰め型ｇＲＮＡ（１７ヌクレオチド長）

【化4】

を使用することによって試験した。Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡの３’末端に、９ヌクレオチド長の二次構造エレメントを付加し、ガイドＲＮＡ周囲のミスマッチヌクレオチドのセグメントとハイブリッド形成させた。この場合、「リンカー」エレメントは、４つの３’－ｎｔのプロトスペーサーターゲティングセグメント、すなわち、

【化5】

および

【化6】

から構成されていた。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイは、これらの追加の３’－エレメントの包含が、完全または切り詰め型ｇＲＮＡによって示されるＤＮＭＴ１部位でのオフターゲット活性を低下またはなくすことを示す。

【0281】

ＰＡＭ遠位４ヌクレオチドがループとして働く「内部」ヘアピン設計を用いて、ｈｐ－ｇＲＮＡを設計した。ヘアピンは、ｇＲＮＡの３’末端に付加された。表７は、この領域を隔てる配列内のスペースを有するｈｐ－ｇＲＮＡの配列を示す。ミスマッチは、小文字で示す。

【0282】

これらのｈｐ－ｇＲＮＡのＳｕｒｖｅｙｏｒ結果を、図４８に示し、これは、３’末端へのヘアピンの付加が、オフターゲット活性をなくしたことを示す。レーン１は、対照を示し；レーン２は、第９位のミスマッチヌクレオチドを含有する完全長ｇＲＮＡを示し；レーン３は、第９位のミスマッチヌクレオチドと追加の３’－ヘアピン構造とを含有する完全長ｇＲＮＡを示し；レーン４は、第９位のミスマッチヌクレオチドを含有する切り詰め型ｇＲＮＡを示し；レーン５は、第９位のミスマッチヌクレオチドと追加の３’－ヘアピン構造とを含有する切り詰め型ｇＲＮＡを示す。使用したＳｕｒｖｅｙｏｒプライマーをまた、表７に示す。

【0283】

Ｃｐｆ１は、通常のガイドＲＮＡを使用する場合、ヌクレオチド８～１０でのミスマッチを許容し、そのオフターゲット部位でＤＮＡを切断する（図４７）。図４８に示す通り、Ｃｐｆ１ ｈｐ－ｇＲＮＡは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒにおいて示されるオフターゲット活性をなくすことができたのに対して、切り詰め型ｇＲＮＡはできなかった。

【0284】

【表7】

【0285】

前述の詳細な説明および付随する実施例は、単に実例に過ぎず、本発明の範囲への制限と受け取るべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ定義されることが理解されよう。

【0286】

開示された実施態様に対する様々な変更および改変は、当業者には明らかであろう。限定はされないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または使用の方法に関するものを含めた、こうした変更および改変を、その趣旨および範囲から逸脱せずに行うことができる。

【0287】

完全性の理由から、本発明の種々の態様を、次の番号付けした条項で提示する：

【0288】

第１項．最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法であって、ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程と（前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の５’末端と、ＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である）；ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程と（ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される）；ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよび第１のｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、この第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程とを含む方法。

【0289】

第２項．最適化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を産生する方法であって、ａ）対象となる標的領域を特定する工程であって、前記対象となる標的領域はプロトスペーサー配列を含む、工程と；ｂ）対象となる標的領域を標的にする完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を決定する工程であって、前記完全長ｇＲＮＡはプロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントを含む、工程と；ｃ）完全長ｇＲＮＡに対する少なくとも１つ以上のオフターゲット部位を決定する工程と；ｄ）第１のｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列を産生する工程と（前記第１のｇＲＮＡは完全長ｇＲＮＡおよびＲＮＡセグメントのポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントのヌクレオチドセグメントと相補的である、Ｍヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡセグメントは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端であり、前記第１のｇＲＮＡは、完全長ｇＲＮＡのポリヌクレオチド配列の３’末端とＲＮＡセグメントとの間のリンカーを任意選択により含み、前記リンカーは、Ｎヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列に侵入して、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、プロトスペーサー－二重鎖を形成することが可能であり、前記第１のｇＲＮＡは、オフターゲット部位に侵入して、オフターゲット部位と相補的であるＤＮＡ配列と結合して、オフターゲット二重鎖を形成することが可能である）；ｅ）侵入速度論、および第１のｇＲＮＡがプロトスペーサーおよびオフターゲット部位二重鎖内に侵入されたままである寿命を、推定値を算出するまたは計算によってシミュレートする工程と（ここで、侵入の動力学は、異なるｇＲＮＡのさらなる侵入と、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列に対する第１のｇＲＮＡの再アニーリングとの間のエネルギー差を決定することによって、ヌクレオチドごとに推定される）；ｆ）第１のｇＲＮＡのプロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での推定寿命を、プロトスペーサーおよび／またはオフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡ（ｔｒｕ－ｇＲＮＡ）の推定寿命と比較する工程と；ｇ）リンカー内の０からＮヌクレオチドおよびのｇＲＮＡ内の０からＭヌクレオチドをランダム化し、第２のｇＲＮＡを産生し、この第２のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）を繰り返す工程と；ｈ）設計基準を満たすｇＲＮＡ配列に基づいて、最適化されたｇＲＮＡを特定する工程と；ｉ）最適化されたｇＲＮＡをインビボで試験して、結合の特異性を決定する工程とを含む方法。

【0290】

第３項．前記異なるｇＲＮＡのさらなる侵入のエネルギー特性が、（Ｉ）ＤＮＡ－ＤＮＡ塩基対合を切断すること、（ＩＩ）ＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対を形成すること、（ＩＩＩ）侵入されていないガイドＲＮＡ内の異なる二次構造を破壊することまたは形成することから生じるエネルギー差、および（ＩＶ）プロトスペーサーと相補的である置き換えられたＤＮＡ鎖と、二次構造には含まれないいずれかの非対合ガイドＲＮＡヌクレオチドとの間の相互作用を形成することまたは破壊することのうちの少なくとも１つのエネルギー特性を決定することによって決定される、第１または２項に記載の方法。

【0291】

第４項．前記第１のｇＲＮＡの、プロトスペーサー配列と相補的であるＤＮＡ配列への再アニーリングのエネルギー特性が、（Ｉ）ＤＮＡ－ＤＮＡ塩基対合を形成すること、（ＩＩ）ＲＮＡ－ＤＮＡ塩基対を切断すること、（ＩＩＩ）新たに侵入されていないガイドＲＮＡ内の異なる二次構造を破壊することまたは形成することから生じるエネルギー差、および（ＩＶ）プロトスペーサーと相補的である置き換えられたＤＮＡ鎖と、二次構造には含まれないいずれかの非対合ガイドＲＮＡヌクレオチドとの間の相互作用を形成することまたは破壊することのうちの少なくとも１つのエネルギー特性を決定することによって決定される、第１～３項のいずれか１項に記載の方法。

【0292】

第５項．（Ｖ）ミスマッチにわたる塩基対合、（ＶＩ）Ｃａｓ９タンパク質との相互作用、および／または（ＶＩＩ）追加のヒューリスティクス（ここで、追加のヒューリスティクスは、結合寿命、侵入の程度、侵入するガイドＲＮＡの安定性、またはＣａｓ９切断活性に対するｇＲＮＡ侵入の、他の算出される／シミュレーションされる特性に関する）のうちの少なくとも１つから、エネルギー的考察を決定することをさらに含む、第３または４項に記載の方法。

【0293】

第６項．前記完全長ｇＲＮＡが、約１５から２０個のヌクレオチドを含む、第１～５項のいずれか１項に記載の方法。

【0294】

第７項．Ｍが、１から２０である、第１～５項のいずれか１項に記載の方法。

【0295】

第８項．Ｍが、４から１０である、第７項に記載の方法。

【0296】

第９項．前記ＲＮＡセグメントが、プロトスペーサー－ターゲティング配列を補完する２から１５個のヌクレオチドを含む、第１～８項のいずれか１項に記載の方法。

【0297】

第１０項．Ｎが、１から２０である、第１～９項のいずれか１項に記載の方法。

【0298】

第１１項．Ｎが、３から１０である、第１０項に記載の方法。

【0299】

第１２項．前記ＲＮＡセグメントおよび／またはプロトスペーサー－ターゲティング配列が、二次構造を提供する、第１～１１項のいずれか１項に記載の方法。

【0300】

第１３項．前記二次構造が、前記プロトスペーサー－ターゲティング配列を、前記ＲＮＡセグメントと部分的にハイブリッド形成させることによって形成される、第１２項に記載の方法。

【0301】

第１４項．前記二次構造が、前記最適化されたｇＲＮＡによるプロトスペーサー二重鎖またはオフターゲット二重鎖の侵入を妨害することによって、Ｃａｓ９によるＤＮＡ結合または切断を調節する、第１３項に記載の方法。

【0302】

第１５項．前記二次構造が、前記ＲＮＡセグメントの全体または一部を、プロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントの５’末端のヌクレオチド、プロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントの中央のヌクレオチド、および／またはプロトスペーサー－ターゲティング配列もしくはセグメントの３’末端のヌクレオチドにハイブリッド形成させることによって形成される、第１２～１４項のいずれか１項に記載の方法。

【0303】

第１６項．前記二次構造が、ヘアピンである、第１２～１５項のいずれか１項に記載の方法。

【0304】

第１７項．前記二次構造が、室温または３７℃で安定である、第１２～１６項のいずれか１項に記載の方法。

【0305】

第１８項．前記二次構造の全平衡自由エネルギーが、室温または３７℃で約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である、第１２～１７項のいずれか１項に記載の方法。

【0306】

第１９項．前記ＲＮＡセグメントが、プロトスペーサー－ターゲティング配列またはセグメントの少なくとも２つのヌクレオチドとハイブリッド形成する、またはこれらのヌクレオチドと共に非標準塩基対を形成する、第１～１８項のいずれか１項に記載の方法。

【0307】

第２０項．前記非標準塩基対が、ｒＵ－ｒＧである、第１９項に記載の方法。

【0308】

第２１項．前記最適化されたｇＲＮＡが、細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と共に使用される、第１～２０項のいずれか１項に記載の方法。

【0309】

第２２項．前記二次構造が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系内の最適化されたｇＲＮＡを保護して、細胞内での分解を予防する、第１～２１項のいずれか１項に記載の方法。

【0310】

第２３項．１～２０個のヌクレオチドが、リンカー内でランダム化される、第１～２２項のいずれか１項に記載の方法。

【0311】

第２４項．１～２０個のヌクレオチドが、ＲＮＡセグメント内でランダム化される、第１～２３項のいずれか１項に記載の方法。

【0312】

第２５項．ステップ（ｇ）が、Ｘ回繰り返され、それによって、Ｘ個のｇＲＮＡが産生され、それぞれのＸ個のｇＲＮＡを用いてステップ（ｅ）が繰り返される（ここで、Ｘは、０から２０である）、第１～２４項のいずれか１項に記載の方法。

【0313】

第２６項．前記侵入速度論および寿命が、動的モンテカルロ法またはＧｉｌｌｅｓｐｉｅアルゴリズムを使用して算出される、第１～２５項のいずれか１項に記載の方法。

【0314】

第２７項．前記侵入速度論が、前記ガイドＲＮＡが、前記プロトスペーサー二重鎖に、前記プロトスペーサーが完全に侵入されるような完全な侵入まで侵入する速度、および／またはｇＲＮＡに結合されたプロトスペーサーＤＮＡのセグメントが、その相補鎖から置き換えられ、そのＰＡＭ近位領域から、完全な侵入まで、ヌクレオチドごとにｇＲＮＡに結合するにつれて伸長する速度である、第１～２６項のいずれか１項に記載の方法。

【0315】

第２８項．前記設計基準が、特異性、結合寿命の調節、および／または推定される切断特異性を含む、第１～２７項のいずれか１項に記載の方法。

【0316】

第２９項．前記設計基準が、オンターゲット部位に対する完全長ｇＲＮＡの結合寿命以上の結合寿命、および／またはオフターゲット部位に対する完全長ｇＲＮＡの結合寿命以下の結合寿命を有する最適化されたｇＲＮＡを含む、第２８項に記載の方法。

【0317】

第３０項．前記設計基準が、少なくとも３つのオフターゲット部位（ここで、これらのオフターゲット部位は、最も近いオフターゲット部位であると予測される、またはオンターゲット部位に対する最も高い同一性を有すると予測される）に対する完全長ｇＲＮＡの結合寿命以下の結合寿命を有する最適化されたｇＲＮＡを含む、第２９項に記載の方法。

【0318】

第３１項．前記設計基準が、オフターゲット部位での完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡの寿命または切断速度以下であるオフターゲット部位での寿命または切断速度、および／または、完全長ｇＲＮＡまたは切り詰め型ｇＲＮＡの予測されるオンターゲット活性率の１０％超である、予測されるオンターゲット活性率を含む、第２８項に記載の方法。

【0319】

第３２項．前記最適化されたｇＲＮＡが、ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ、次世代シーケンシング技術、またはＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを使用して、ステップｉ）において試験される、第１～３１項のいずれか１項に記載の方法。

【0320】

第３３項．前記最適化されたｇＲＮＡが、オフターゲット部位での結合を最小にし、かつプロトスペーサー配列に結合させるように設計される、第１～３２項のいずれか１項に記載の方法。

【0321】

第３４項．前記オフターゲット部位が、公知であるまたは予測されるオフターゲット部位である、第１～３３項のいずれか１項に記載の方法。

【0322】

第３５項．前記完全長ｇＲＮＡが、哺乳類遺伝子を標的にする、第１～３４項のいずれか１項に記載の方法。

【0323】

第３６項．前記標的遺伝子が、内在性標的遺伝子または導入遺伝子を含む、第１～３５項のいずれか１項に記載の方法。

【0324】

第３７項．前記標的遺伝子が、疾患関連遺伝子を含む、第１～３６項のいずれか１項に記載の方法。

【0325】

第３８項．前記標的遺伝子が、ＤＭＤ、ＥＭＸ１、またはＶＥＧＦＡ遺伝子である、第１～３７項のいずれか１項に記載の方法。

【0326】

第３９項．前記ＶＥＧＦＡ遺伝子が、ＶＥＧＦＡ１またはＶＥＧＦＡ３である、
第３８項に記載の方法。

【0327】

第４０項．第１～３９項のいずれか１項に記載の方法によって産生された最適化されたｇＲＮＡ。

【0328】

第４１項．前記ｇＲＮＡが、オンターゲット部位とオフターゲット部位とを、これらの部位間の最小熱力学的エネルギー差を用いて識別することができる、第４０項の最適化されたｇＲＮＡ。

【0329】

第４２項．前記最適化されたｇＲＮＡが、プロトスペーサーへのストランド侵入を調節する、第４０または４１項の最適化されたｇＲＮＡ。

【0330】

第４３項．前記最適化されたｇＲＮＡが、配列番号１４９～３１５、３２１～３２３、および３２６～３２９のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、第４０～４２項のいずれか１項に記載の最適化されたｇＲＮＡ。

【0331】

第４４項．第４０～４３項のいずれか１項に記載の最適化されたｇＲＮＡをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【0332】

第４５項．第４４項の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【0333】

第４６項．第４４項の単離されたポリヌクレオチドまたは第４５項のベクターを含む細胞。

【0334】

第４７項．第４４項の単離されたポリヌクレオチド、第４５項のベクター、または第４６項の細胞を含むキット。

【0335】

第４８項．標的細胞または対象におけるエピゲノム編集の方法であって、細胞または対象を、有効量の第４０～４３項のいずれか１項に記載の最適化されたｇＲＮＡ分子または第４４項の単離されたポリヌクレオチドおよび融合タンパク質と接触させることを含み、前記融合タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む方法。

【0336】

第４９項．標的細胞または対象における部位特異的ＤＮＡ切断の方法であって、細胞または対象を、有効量の第４０～４３項のいずれか１項に記載の最適化されたｇＲＮＡ分子または第４４項の単離されたポリヌクレオチドおよび融合タンパク質またはＣａｓ９タンパク質と接触させることを含み、前記融合タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む方法。

【0337】

第５０項．細胞におけるゲノム編集の方法であって、前記細胞に、有効量の第４０～４３項のいずれか１項に記載の最適化されたｇＲＮＡ分子または第４４項の単離されたポリヌクレオチドおよび融合タンパク質を投与することを含み、前記融合タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む方法。

【0338】

第５１項．前記ゲノム編集が、変異遺伝子を修正することまたは導入遺伝子を挿入することを含む、第５０項に記載の方法。

【0339】

第５２項．変異遺伝子を修正することが、変異遺伝子を欠失させること、再編成させること、または置き換えることを含む、第５１項に記載の方法。

【0340】

第５３項．変異遺伝子を修正することが、ヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合または相同組換え修復を含む、第５１または５２項のいずれか１項に記載の方法。

【0341】

第５４項．細胞における遺伝子発現を調節する方法であって、前記細胞を、有効量の第４０～４３項のいずれか１項に記載の最適化されたｇＲＮＡ分子または第４４項の単離されたポリヌクレオチドおよび融合タンパク質と接触させることを含み、前記融合タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む方法。

【0342】

第５５項．少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子発現が、前記少なくとも１つの標的遺伝子の遺伝子発現レベルが前記少なくとも１つの標的遺伝子についての正常な遺伝子発現レベルと比較して増大または低下される場合に調節される、第５４項に記載の方法。

【0343】

第５６項．前記融合タンパク質が、ｄＣａｓ９ドメインおよび転写活性化因子を含む、第５４または５５項に記載の方法。

【0344】

第５７項．前記融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、第５６項に記載の方法。

【0345】

第５８項．前記融合タンパク質が、ｄＣａｓ９ドメインおよび転写抑制因子を含む、第５４または５５項に記載の方法。

【0346】

第５９項．前記融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、第５８項に記載の方法。

【0347】

第６０項．前記融合タンパク質が、ｄＣａｓ９ドメインおよび部位特異的ヌクレアーゼを含む、第５４または５５項に記載の方法。

【0348】

第６１項．前記最適化されたｇＲＮＡが、ポリヌクレオチド配列によってコードされ、レンチウイルスベクターにパッケージングされる、第４８～６０項のいずれか１項に記載の方法。

【0349】

第６２項．前記レンチウイルスベクターが、前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、第６１項に記載の方法。

【0350】

第６３項．前記最適化されたｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターが、誘導性である、第６２項に記載の方法。

【0351】

第６４項．前記レンチウイルスベクターが、前記Ｃａｓ９タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、第６１～６３項のいずれか１項に記載の方法。

【0352】

第６５項．前記少なくとも１つの標的遺伝子が、疾患関連遺伝子である、第４８～６４項のいずれか１項に記載の方法。

【0353】

第６６項．前記標的細胞が、真核細胞である、第４８～６５項のいずれか１項に記載の方法。

【0354】

第６７項．前記標的細胞が、哺乳類細胞である、第４８～６６項のいずれか１項に記載の方法。

【0355】

前記標的細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、第４８～６７項のいずれか１項に記載の方法。

【0356】

付表－配列
化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａを伴う）（配列番号１）

【化7】

ｄＣａｓ９^{p300 Core}：（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド６１３５７）アミノ酸配列；３Ｘ「Ｆｌａｇ」エピトープ、核局在配列、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ）、ｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクター、「ＨＡ」エピトープ（配列番号２）

【化8】

ｄＣａｓ９^KRAB（配列番号３）

【化9】

Ｎｍ－ｄＣａｓ９^{p300 Core}：（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド６１３６５）アミノ酸配列；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ、Ｄ５８７Ａ、Ｈ５８８Ａ、Ｎ６１１Ａ）、核局在配列、ｐ３００ Ｃｏｒｅ エフェクター、「ＨＡ」エピトープ（配列番号５）

【化10】

【図1A-1D】

【図2A-2B】

【図2C-2D】

【図3A-3B】

【図3C-3D】

【図4A-4C】

【図4D】

【図5A-5B】

【図5C】

【図6A-6B】

【図7A-7C】

【図8A-8B】

【図9A-9C】

【図10A-10C】

【図11A-11D】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14A-14C】

【図15】

【図16A-16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図26A-26B】

【図26C】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31A】

【図31B】

【図32】

【図33】

【図34A-34B】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39A】

【図39B】

【図40A-40B】

【図40C】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44A-44B】

【図44C】

【図45A】

【図45B】

【図45C】

【図45D】

【図46】

【図47】

【図48】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-11-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

配列番号３２６～３２９から選択される配列によりコードされるヌクレオチド配列を含む、ｇＲＮＡ。

【請求項2】

前記ｇＲＮＡが、細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく系と共に使用される、請求項１に記載のｇＲＮＡ。

【請求項3】

請求項１に記載のｇＲＮＡをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項4】

請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項5】

請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のベクターを含む細胞。

【請求項6】

請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項４に記載のベクター、または請求項５に記載の細胞を含むキット。

【請求項7】

標的細胞におけるエピゲノム編集または遺伝子発現調節のための組成物であって、有効量の請求項１に記載のｇＲＮＡ分子および融合タンパク質を含み、前記融合タンパク質が、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはＣｐｆ１を含む第１のポリペプチドドメインと、転写活性化活性、転写抑制活性、ヌクレアーゼ活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、ＤＮＡメチル化酵素活性、および直接的または間接的ＤＮＡ脱メチル化酵素活性からなる群から選択される活性を有する第２のポリペプチドドメインを含む組成物。

【請求項8】

前記融合タンパク質が、ｄＣａｓ９ドメインおよび転写活性化因子、ｄＣａｓ９ドメインおよび転写抑制因子、あるいは、ｄＣａｓ９ドメインおよび部位特異的ヌクレアーゼを含む、請求項７に記載の組成物。

【外国語明細書】