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特開2025-16812免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025016812
(43)【公開日】2025-02-05
(54)【発明の名称】免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20250129BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20250129BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20250129BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20250129BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20250129BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250129BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20250129BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250129BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250129BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20250129BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20250129BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20250129BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17
A61P17/02 ZNA
A61P37/02
A61P37/06
A61P37/08
A61P29/00
A61K45/00
A61K48/00
C12N15/12
C07K14/705
C07K7/06
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】25
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021204371
(22)【出願日】2021-12-16
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517001077
【氏名又は名称】レグセル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100118371
【弁理士】
【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】大崎 一直
(72)【発明者】
【氏名】坂口 志文
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ08
4B063QQ61
4B063QQ79
4B063QR41
4B063QR48
4B063QR77
4C084AA02
4C084AA13
4C084AA17
4C084BA44
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZB021
4C084ZB022
4C084ZB071
4C084ZB072
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB131
4C084ZB132
4C084ZB332
4C084ZB352
4C084ZC751
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045EA22
4H045EA50
4H045EA54
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】 安全な免疫制御法を提供すること。
【解決手段】 創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
【選択図】 なし
【解決手段】 創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
【請求項2】
前記ＣＴＬＡ－４が分泌型ＣＴＬＡ－４、及び膜型ＣＴＬＡ－４からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＣＴＬＡ－４が分泌型ＣＴＬＡ－４を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
局所的に投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
全身投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４と抗生物質とを含む組み合わせ物。
【請求項8】
疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
【請求項9】
前記機能的等価物が、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、及び該タンパク質またはペプチドの二量体または多量体を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質を含む、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
局所的に投与される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
全身投与される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、請求項８～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
【請求項15】
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、炎症を伴う免疫系疾患を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患および／もしくはアレルギー、あるいはそれらに関連する疾患、障害または症状を含む、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、アレルギーに関連する疾患、障害または症状を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、及び該タンパク質またはペプチドの二量体または多量体を含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項20】
前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質を含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項21】
局所的に投与される、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項22】
全身投与される、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項23】
抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項24】
創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、
細胞を候補物質と接触させる工程と、
該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
を含む、方法。
細胞を候補物質と接触させる工程と、
該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
を含む、方法。
【請求項25】
免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、
細胞を候補物質と接触させる工程と、
該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
を含む、方法。
細胞を候補物質と接触させる工程と、
該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）は、免疫系において重要な負の制御分子である。恒常的なＣＴＬＡ－４の高発現は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の特徴である。Ｔｒｅｇが有害な免疫応答を抑制し、免疫恒常性を維持するためにはＣＴＬＡ－４が必要である。また活性化エフェクターＴ細胞もＣＴＬＡ－４を発現し、免疫応答が過剰にならないようフィードバック機構が働いている。
【0003】
ＣＴＬＡ－４には、共刺激分子であるＣＤ８０／８６に結合できる２つのスプライシングバリアントが存在することが知られ、１つは、エクソン３によってコードされる膜貫通ドメインを有し、細胞膜中に係留されるｍＣＴＬＡ－４である。もう１つは、分泌のためにエクソン３を持たないｓＣＴＬＡ－４である。しかしながら、ＣＴＬＡ－４に関するほとんどの研究では免疫恒常性における各ＣＴＬＡ－４バリアントの役割を区別していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明者らは、生体内における分泌型ＣＴＬＡ－４の作用の発見に基づき、ＣＴＬＡ－４やそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物が、免疫制御に関連することを見出した。
【0005】
ＣＴＬＡ－４、特に分泌型ＣＴＬＡ－４を用いることで、炎症下でＭ２型マクロファージを誘導することができ、創傷治癒などを促進することができる。またＭ２型マクロファージは免疫を負に制御するサイトカインや分子を発現し、炎症を抑え、さらには組織の修復およびリモデリングを達成し得る。
【0006】
したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
（項目２）
前記ＣＴＬＡ－４が分泌型ＣＴＬＡ－４、及び膜型ＣＴＬＡ－４からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目１に記載の医薬組成物。
（項目３）
前記ＣＴＬＡ－４が分泌型ＣＴＬＡ－４を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４）
局所的に投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目５）
全身投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目６）
抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目７）
創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４と抗生物質とを含む組み合わせ物。
（項目Ｄ１）
疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
（項目Ｄ２）
前記機能的等価物が、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、及び該タンパク質またはペプチドの二量体または多量体を含む、上記項目に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ３）
前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ４）
局所的に投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ５）
全身投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ６）
抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１）
免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
（項目Ａ２）
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、炎症を伴う免疫系疾患を含む、上記項目に記載の医薬組成物。
（項目Ａ３）
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患および／もしくはアレルギー、あるいはそれらに関連する疾患、障害または症状を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ４）
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ５）
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、アレルギーに関連する疾患、障害または症状を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ６）
前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、及び該タンパク質またはペプチドの二量体または多量体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ７）
前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ８）
局所的に投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ９）
全身投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１０）
抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｂ１）
創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、
細胞を候補物質と接触させる工程と、
該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
を含む、方法。
（項目Ｃ１）
免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、
細胞を候補物質と接触させる工程と、
該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
を含む、方法。
（項目１）
創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
（項目２）
前記ＣＴＬＡ－４が分泌型ＣＴＬＡ－４、及び膜型ＣＴＬＡ－４からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目１に記載の医薬組成物。
（項目３）
前記ＣＴＬＡ－４が分泌型ＣＴＬＡ－４を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４）
局所的に投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目５）
全身投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目６）
抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目７）
創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４と抗生物質とを含む組み合わせ物。
（項目Ｄ１）
疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
（項目Ｄ２）
前記機能的等価物が、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、及び該タンパク質またはペプチドの二量体または多量体を含む、上記項目に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ３）
前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ４）
局所的に投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ５）
全身投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｄ６）
抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１）
免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物。
（項目Ａ２）
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、炎症を伴う免疫系疾患を含む、上記項目に記載の医薬組成物。
（項目Ａ３）
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患および／もしくはアレルギー、あるいはそれらに関連する疾患、障害または症状を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ４）
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ５）
前記免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、アレルギーに関連する疾患、障害または症状を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ６）
前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、及び該タンパク質またはペプチドの二量体または多量体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ７）
前記機能的等価物は、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ８）
局所的に投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ９）
全身投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１０）
抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ｂ１）
創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、
細胞を候補物質と接触させる工程と、
該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
を含む、方法。
（項目Ｃ１）
免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、
細胞を候補物質と接触させる工程と、
該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、
該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程と
を含む、方法。
【0007】
本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【0008】
なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【発明の効果】
【0009】
本開示は、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物を提供することができる。本開示の医薬組成物は、免疫制御に関わるため、免疫系の異常に関連する疾患の治療とともに、自己免疫疾患などで破壊された組織の修復やリモデリングも期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1A】８週齢野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスのナイーブもしくはエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡ発現。
【図1B】ヒトエフェクターＴｒｅｇにおけるｓＣＴＬＡ－４の増加。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋細胞（ナイーブＴｒｅｇ）、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ２５ｈｉｇｈ＋細胞（エフェクターＴｒｅｇ：ＣＤ２５ｈｉｇｈの＜１％）およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ２５ｉｎｔ＋細胞（Ｆｏｘｐ３＋非Ｔｒｅｇ）におけるヒトｓＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡ発現を測定した。
【図1C】ＯＶＡ／ＣＦＡで免疫したＤＥＲＥＧ ＤＯ１１．１０マウスから免疫後０、７、１４および２１日目に単離したＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）細胞におけるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡ発現。
【図1D】慢性創傷マウスから単離したＴｒｅｇにおけるｓＣＴＬＡ－４の増加。群飼中の喧嘩により偶発的に負傷したＤＥＲＥＧ雄マウスの体表リンパ節から単離したＦｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡ発現を測定した。
【図1E】Ｓ＋Ｍ－マウスにおけるＣＴＬＡ－４遺伝子座の模式図。エクソン３の前側のスプライシングアクセプター部位（８６ｂｐ）を欠失させたベクターを設計した。ＥＳ細胞にエレクトロポレーションを行って相同組換えを誘導し、キメラマウスを作製した後、そのマウスをＦＬＰ１リコンビナーゼ遺伝子を有するＦＬＰｅＲマウスと交配させ、ｎｅｏカセットを欠失させた。その子孫がＳ＋Ｍ－ノックインマウスである。ｓＣＴＬＡ－４（Ｓ）＋ｍＣＴＬＡ－４（Ｍ）＋野生型マウス、Ｓ＋Ｍ－マウスおよびＳ－Ｍ－マウスのＣＴＬＡ－４遺伝子座の模式図も示した。
【図1F】ＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで４時間刺激した後のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ－４およびＦｏｘｐ３の共染色。
【図1G】Ｓ＋Ｍ－マウスにおける血中循環ＣＴＬＡ－４タンパク質の増加。
【図1H】Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＴＬＡ＿４ ｍＲＮＡではｅｘｏｎ３がスキップされる。３週齢マウスの脾臓細胞およびリンパ球におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のｓＣＴＬＡ－４（ｅｘｏｎ２－４ジャンクションを挟んだプライマーを用いた）およびｍＣＴＬＡ－４（ｅｘｏｎ３－４またはｅｘｏｎ２－３ジャンクションを挟んだプライマーを用いた）のＲＮＡ発現を測定した。
【図1I】３週齢の雄Ｓ＋Ｍ＋マウス、Ｓ＋Ｍ－マウスおよびＳ－Ｍ－マウス、ならびにそれらのマウスの体重。
【図1J】Ｓ＋Ｍ－マウスおよびＳ－Ｍ－マウスの脾臓およびリンパ節の肥大。
【図1K】抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ抗体（抗核抗体）の血清中濃度。
【図1L】抗胃壁細胞ＩｇＧ抗体の血清中濃度。
【図1M】Ｓ＋Ｍ－マウス、Ｓ－Ｍ－マウス、Ｓ－Ｍ＋マウスおよびＳ＋Ｍ＋マウスの生存曲線。Ｓ＋Ｍ－マウスとＳ－Ｍ－マウスとの間の統計的有意性をログランク検定によって得た（Ｐ＜０．０００１）。
【図2A】脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１ｃ＋細胞、Ｂ２２０＋細胞におけるＣＤ８０＋サブセットもしくはＣＤ８６＋サブセットの割合。
【図2B】単離した脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＩＬ－４、ＩＬ－６およびＩＬ－１０のｍＲＮＡ発現。
【図2C】Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋腹腔マクロファージを２４時間培養した上清中のＩＬ－１０濃度。
【図2D】ＩＬ－１０の血清中濃度。
【図2E】Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋腹腔マクロファージのＲＮＡ－ｓｅｑ。全転写物解析による多次元スケーリングプロット（ＰＣｏＡ）を示した。
【図2F】生物学的プロセスに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析（１）。図に示したマウスから単離したＭφ群比較において最も濃縮されたＧＯタームの上位セットを示す。
【図2G】生物学的プロセスに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析（２）。図に示したマウスから単離したＭφ群比較において最も濃縮されたＧＯタームの上位セットを示す。
【図2H】生物学的プロセスに関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析（３）。図に示したマウスから単離したＭφ群比較において最も濃縮されたＧＯタームの上位セットを示す。
【図2I】野生型Ｓ＋Ｍ＋マウス腹腔マクロファージの遺伝子発現量を基準としたＳ＋Ｍ－マウスおよびＳ－Ｍ－マウスの腹腔マクロファージの遺伝子発現量比（Ｌｏｇ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）のヒートマップ。Ｓ＋Ｍ－対Ｓ－Ｍ－で、有意差Ｐ＜０．００１の発現変化を示す遺伝子リストを示した。
【図2J】腹腔マクロファージにおけるＭ１／Ｍ２関連遺伝子の相対的なＦＰＫＭ値を、色分けしたマトリックスによって示す。
【図2K】マクロファージにおいてＩＬ－４およびＩＬ－１３によって誘導される典型的な遺伝子の発現比較。
【図3A】ＩＬ－５およびＩＬ－４の血清中濃度。
【図3B】ＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激したＦｏｘｐ３－ＣＤ４＋血球中のＩＬ－５産生細胞の割合。
【図3C】ＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激したＦｏｘｐ３－ＣＤ４＋血球中のＩＬ－４産生細胞の割合。
【図3D】ＣＤ４５＋血球中の好酸球の割合。
【図3E】脾臓に浸潤した好酸球のＳｉｇｌｅｃ－Ｆ発現。
【図3F】脾臓から単離した好酸球におけるＩＬ－４のｍＲＮＡ発現。
【図3G】エオタキシン（ＣＣＬ１１）およびＣＣＬ２２の血清中濃度。
【図3H】腹腔マクロファージにおけるＣＣＬ２４発現レベル。
【図3I】Ｓ＋Ｍ－マウスの肺胞マクロファージにおけるＣＤ２０６発現の増加。
【図3J】ＩＬ－４およびＩＬ－１０で２４時間培養したＳ－Ｍ－マウスの脾臓マクロファージのＣＤ８０ ＭＦＩおよびＣＤ２０６ ＭＦＩ。
【図3K】Ｓ＋Ｍ－マウスでは、血清ＩＬ－３３は増加していなかった。
【図3L】Ｓ＋Ｍ－マウスでは、血清ＴＳＬＰは増加していなかった。
【図3M】Ｓ＋Ｍ－マウスの血液において、自然リンパ球（ＩＬＣ）は増加していなかった。
【図3N】Ｓ＋Ｍ－マウスの腸間膜において、自然リンパ球（ＩＬＣ）は増加していなかった。
【図3O】Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ４５＋血球において、好塩基球およびｃ－Ｋｉｔ＋細胞は増加していなかった。
【図4A】ＣＤ８０／８６ブロッキング抗体の存在下におけるＴｈ２およびＴｈ１の分化。抗ＣＤ８０ ｍＡｂおよび抗ＣＤ８６ ｍＡｂを用いて、ナイーブＴ細胞を抗ＣＤ３ ｍＡｂおよびＴ細胞枯渇脾臓細胞（主に抗原提示細胞）でＴｈ２条件もしくはＴｈ１条件で３日間刺激した後、ＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激し、Ｔｈ２もしくはＴｈ１の分化の割合を調べた。
【図4B】Ｔｈ２またはＴｈ１の分化の割合を、ＣＤ８０またはＣＤ８６をブロックしない条件を１００％として算出した。
【図4C】ｓＣＴＬＡ－４組換えタンパク質の存在下におけるＴｈ２およびＴｈ１の分化。ｓＣＴＬＡ－４ ＷＴ（野生型）、ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ（変異型）またはＣＴＬＡ－４ Ｉｇを用いて、ナイーブＴ細胞を抗ＣＤ３ ｍＡｂおよびＴ細胞枯渇脾臓細胞（主に抗原提示細胞）で３日間刺激した後、ＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激し、Ｔｈ２もしくはＴｈ１の分化の割合を調べた。
【図4D】Ｔｈ２細胞またはＴｈ１細胞の分化の割合を、ＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ（陰性対照）を用いた条件を１００％として算出した。
【図4E】ｓＣＴＬＡ－４ ＷＴおよびＣＴＬＡ－４ ＩｇによるＴｈ１分化に対する抑制効果の用量反応曲線。Ｔｈ１の分化の割合を、ＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ（陰性対照）を用いた条件を１００％として算出した。ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａと比較して、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。
【図4F】ｓＣＴＬＡ－４ ＷＴおよびＣＴＬＡ－４ ＩｇによるＴｈ２分化に対する抑制効果の用量反応曲線。Ｔｈ２の分化の割合を、ＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ（陰性対照）を用いた条件を１００％として算出した。ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａと比較して、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。
【図4G】ｓＣＴＬＡ－４ ＷＴ（５μｇ／ｍＬ）、ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ（５μｇ／ｍＬ）、ＣＴＬＡ－４ Ｉｇ（５μｇ／ｍＬ）またはＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍＬ）で２４時間培養した後のＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＤ２０６、Ａｒｇ１およびｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現。
【図5A】図に示す各リンパ節由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡ発現。
【図5B】Ｓ＋Ｍ－マウス、Ｓ－Ｍ－マウスおよびＳ＋Ｍ＋マウスの大腸。
【図5C】大腸の長さ。
【図5D】大腸のヘマトキシリン・エオジン染色。
【図5E】腸間膜リンパ節のＦｏｘｐ３－ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生細胞およびＩＬ－１７Ａ産生細胞。
【図5F】大腸から単離したＣＤ４５＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ－Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージにおけるＣＤ２０６、Ｆｉｚｚ１、ｉＮＯＳおよびＩＬ－６のｍＲＮＡ発現。
【図5G】ｓＣＴＬＡ－４による大腸炎の抑制。６週齢の複合免疫不全マウス（Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ）に、ＣＤ４５．１コンジェニックマウスから単離したＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈナイーブＴ細胞を単独（黒丸）または３週齢のＤＥＲＥＧ Ｓ＋Ｍ－（白丸）、ＤＥＲＥＧ Ｓ－Ｍ－（白三角形）もしくはＤＥＲＥＧ Ｓ＋Ｍ＋マウス（白四角形）から単離したＦｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）ＣＤ４＋Ｔｒｅｇとともに静脈内投与した。細胞養子移入の日（Ｄａｙ０）の体重を１００％として算出した。
【図5I】大腸炎を組織学的にスコア化した。データにはクラスカル・ウォリス検定およびＤｕｎｎの多重比較検定を適用した。
【図5J】ｓＣＴＬＡ－４による腫瘍免疫の抑制。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、野生型ｓＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４ ＷＴ）、Ｙ１３９Ａ変異体ｓＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ）またはＣＴＬＡ－４ Ｉｇを産生するＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下投与した。腫瘍の長辺と短辺を１日おきに測定した。腫瘍の面積を、２つの直径を用いて算出した。濃い太字で示した線は、点線で示した個々の腫瘍（ｎ数は凡例に示してある）の平均増殖曲線を示す。ｓＣＴＬＡ－４ ＷＴ Ｂ１６Ｆ１０とｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ Ｂ１６Ｆ１０との間の統計的有意性を、接種後６日目、８日目、１１日目、１３日目および１５日目において示した（＊はＰ＜０．０００５を示す）。
【図5K】ｓＣＴＬＡ－４による腫瘍免疫の抑制はＴ細胞への作用である。ヌードマウスに、野生型ｓＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４ ＷＴ）、Ｙ１３９Ａ変異体ｓＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ）またはＣＴＬＡ－４ Ｉｇを産生するＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下投与した。腫瘍の長辺と短辺を１日おきに測定した。腫瘍の面積を、２つの直径を用いて算出した。濃い太字で示した線は、点線で示した個々の腫瘍（ｎ＝５）の平均増殖曲線を示す。
【図5L】接種後１２日目の腫瘍の細胞抽出物中のＩＦＮγの濃度。データにはクラスカル・ウォリス検定およびその後のＤｕｎｎの検定を適用した。
【図5M】ｓＣＴＬＡ－４による腫瘍Ｍ２マクロファージ分化の促進。接種後１２日目のＢ１６Ｆ１０黒色腫浸潤マクロファージにおけるＣＤ２０６発現。
【図6A】Ｓ－Ｍ＋マウスにおける大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）ＣＴＬＡ－４遺伝子座の模式図。ＢＡＣベクター（ＲＰ２３－１４６Ｊ１７）を改変し、ｅｘｏｎ３とｅｘｏｎ４の間のイントロンを欠失させた。ＢＡＣトランスジェニックマウスをＳ－Ｍ－マウスと交配させ、Ｓ－Ｍ＋マウスを作製した。
【図6B】Ｓ－Ｍ＋マウスおよびＳ＋Ｍ＋マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ－４およびＦｏｘｐ３の共染色。
【図6C】６週齢Ｓ－Ｍ＋マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞においてｓＣＴＬＡ－４は発現していないが、ｍＣＴＬＡ－４は発現する。
【図6D】８、１６および２４週齢マウスの脾臓（Ｓｐ）またはリンパ節（Ｌｎ）のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの共染色。代表的なフローサイトメトリーのデータは、２４週齢マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【図6E】２４週齢マウスの脾臓またはリンパ節のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌの共染色。
【図6F】３０週齢雌Ｓ－Ｍ＋マウスおよび野生型対照（Ｓ＋Ｍ＋）マウス。
【図6G】脾臓および末梢リンパ節の代表的な画像。
【図6H】脾臓（Ｓｐ）、腸間膜または体表リンパ節（Ｌｎ）における細胞総数。
【図6I】Ｓ－Ｍ＋マウスおよび対照（Ｓ＋Ｍ＋）マウスの脂肪組織（それぞれｎ＝１０）および肺（それぞれｎ＝６）のヘマトキシリン・エオジン染色の代表切片。
【図6J】抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ抗体（抗核抗体）、抗胃壁細胞ＩｇＧ抗体、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αの血清中濃度。データにはマン・ホイットニー検定を適用した。
【図6K】ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋腹腔マクロファージにおけるｉＮＯＳ（Ｎｏｓ２）およびＩＬ－６のｍＲＮＡ発現。
【図6L】脾臓、腸間膜リンパ節、または体表リンパ節のＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激後、ＩＦＮγおよびＥｏｍｅｓを共染色した。
【図6M】脾臓、腸間膜リンパ節、または体表リンパ節のＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＭＡ／イオノマイシン／モネンシンで５時間刺激後、ＩＦＮγおよびＩＬ－１７Ａを共染色した。
【図6N】ｓＣＴＬＡ－４は創傷治癒に重要な役割を果たす。６ｍｍの生検パンチを用いて１２週齢のＳ－Ｍ＋マウスおよびＳ＋Ｍ＋マウスの背部の皮膚に１匹あたり２箇所創傷した（それぞれｎ＝８のマウスを用いた）。創傷後１日目（ｄ１）、３日目（ｄ３）、５日目（ｄ５）の各マウス背部の２箇所の創傷面積（ｍｍ２）の平均値を画像から測定した。
【図6O】ｓＣＴＬＡ－４は創傷後の再上皮化プロセスに重要な役割を果たす。５日目（ｄ５）の創傷皮膚切片においてＫ１４＋表皮基底角化細胞（緑色）とＤＡＰＩ（青色）を免疫蛍光染色で可視化した。創傷治癒において傷端から創傷下に遊走したＫ１４＋表皮角化細胞が増殖し傷をふさいだ長さ（Ｅｐｉ ｔｏｎｇｕｅ ｌｅｎｇｔｈ）によって、再上皮化を定量した。矢印は、再上皮化の徴候をまだ示していない時点（１日目）の傷端を示す。
【図6P】３０週齢マウスを用いた創傷治癒の外部観察。６ｍｍの生検パンチを用いて３０週齢のＳ－Ｍ＋マウス（自己免疫の病態を示す）およびＳ＋Ｍ＋マウスの背部の皮膚に１匹あたり２箇所創傷した（それぞれｎ＝８）。創傷後１日目（ｄ１）、３日目（ｄ３）、５日目（ｄ５）の各マウス背部の２箇所の創傷面積（ｍｍ２）の平均値を画像から測定した。
【図6Q】３０週齢マウスを用いた再上皮化プロセスの定量。５日目（ｄ５）の創傷皮膚切片においてＫ１４＋表皮基底角化細胞（緑色）とＤＡＰＩ（青色）を免疫蛍光染色で可視化し、Ｅｐｉ ｔｏｎｇｕｅ ｌｅｎｇｔｈによって再上皮化を定量した。矢印は、再上皮化の徴候をまだ示していない時点（１日目）の傷端を示す。
【図7A】３０週齢マウスにおけるＩｇＥの血清中濃度。データにはマン・ホイットニー検定を適用した。
【図7B】Ｓ－Ｍ＋マウスのパイエル板および腸間膜リンパ節において、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ：Ｂｃｌ－６＋ＣＸＣＲ５＋Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｂ２２０－（図７Ｂ）、もしくはＰＤ－１＋ＣＸＣＲ５＋Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｂ２２０－）が増加していた（図７Ｃ）。
【図7C】Ｓ－Ｍ＋マウスのパイエル板および腸間膜リンパ節において、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ：Ｂｃｌ－６＋ＣＸＣＲ５＋Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｂ２２０－（図７Ｂ）、もしくはＰＤ－１＋ＣＸＣＲ５＋Ｆｏｘｐ３－ＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｂ２２０－）が増加していた（図７Ｃ）。
【図7D】ｓＣＴＬＡ－４は、健康なマウスにおいてアレルギー病態の進行を抑制する。肺におけるＯＶＡ誘発性喘息実験は図に示したスキームで行った。まだ自己免疫病態を示していない健康な８週齢のＳ－Ｍ＋においてアレルギー反応性ＧＡＴＡ３＋Ｔｈ２の有意な増加が見られた。
【図7E】自己免疫病態を示していない健康な８週齢のＳ－Ｍ＋においてアレルギー反応性ＧＡＴＡ３＋Ｔｈ２の有意な増加が見られた。
【図7F】肺ＣＤ１１ｃ－Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ－ＣＤ２４＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ＋好酸球の割合。
【図7H】ＣＤ２０６の発現を蛍光強度の中央値で定量した。
【図7I】ＣＤ７１の発現を蛍光強度の中央値で定量した。
【図7J】ｓＣＴＬＡ－４はアレルギーによる組織へのリンパ球の浸潤を抑制する。肺組織のヘマトキシリン・エオジン染色を示した。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【0012】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【0013】
本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。したがって、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
【0014】
本明細書において、アミノ酸残基は以下の略号で表される。
ＡｌａまたはＡ：アラニン
ＡｒｇまたはＲ：アルギニン
ＡｓｎまたはＮ：アスパラギン
ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸
ＣｙｓまたはＣ：システイン
ＧｌｎまたはＱ：グルタミン
ＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸
ＧｌｙまたはＧ：グリシン
ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン
ＩｌｅまたはＩ：イソロイシン
ＬｅｕまたはＬ：ロイシン
ＬｙｓまたはＫ：リジン
ＭｅｔまたはＭ：メチオニン
ＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニン
ＰｒｏまたはＰ：プロリン
ＳｅｒまたはＳ：セリン
ＴｈｒまたはＴ：スレオニン
ＴｒｐまたはＷ：トリプトファン
ＴｙｒまたはＹ：チロシン
ＶａｌまたはＶ：バリン
ＡｌａまたはＡ：アラニン
ＡｒｇまたはＲ：アルギニン
ＡｓｎまたはＮ：アスパラギン
ＡｓｐまたはＤ：アスパラギン酸
ＣｙｓまたはＣ：システイン
ＧｌｎまたはＱ：グルタミン
ＧｌｕまたはＥ：グルタミン酸
ＧｌｙまたはＧ：グリシン
ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン
ＩｌｅまたはＩ：イソロイシン
ＬｅｕまたはＬ：ロイシン
ＬｙｓまたはＫ：リジン
ＭｅｔまたはＭ：メチオニン
ＰｈｅまたはＦ：フェニルアラニン
ＰｒｏまたはＰ：プロリン
ＳｅｒまたはＳ：セリン
ＴｈｒまたはＴ：スレオニン
ＴｒｐまたはＷ：トリプトファン
ＴｙｒまたはＹ：チロシン
ＶａｌまたはＶ：バリン
【0015】
本明細書において、「ＣＴＬＡ－４」とは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４を指す。ＣＴＬＡ－４ヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本分野において周知である。例示的なヒトＣＴＬＡ－４アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ４２８０３やＣＣＤＳ２３６２（ＩＤ：ＣＣＤＳ４２８０３はヒト分泌型ＣＴＬＡ－４を、ＩＤ：ＣＣＤＳ２３６２はヒト膜型ＣＴＬＡ－４をそれぞれ表し、一般に単にＣＴＬＡ－４と称する場合には膜型を指す）に記載され、例示的なマウスＣＴＬＡ－４アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ６９８９３やＣＣＤＳ１４９９３（ＩＤ：ＣＣＤＳ６９８９３はマウス分泌型ＣＴＬＡ－４を、ＩＤ：ＣＣＤＳ１４９９３はマウス膜型ＣＴＬＡ－４をそれぞれ表す）に記載されている。
【0016】
本明細書において、「膜型ＣＴＬＡ－４」とは、ＣＴＬＡ－４のスプライシングバリアントの1つであり、エクソン１～４を有し、エクソン３によってコードされる膜貫通ドメインによって細胞膜中に係留されるＣＴＬＡ－４をいう。
【0017】
本明細書において、「分泌型ＣＴＬＡ－４」とは、ＣＴＬＡ－４のスプライシングバリアントの1つであり、エクソン１、２、４が連結され、翻訳されたものをいう。分泌型ＣＴＬＡ－４は、エクソン３によってコードされる膜貫通ドメインを欠損しているため、細胞外に分泌される。
【0018】
本明細書において「創傷」とは、擦過傷、裂傷、切創、挫傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、熱傷、炎症、細胞壊死等、何らかの要因によって組織表面が欠損した状態を示す。前記組織には、例えば、皮膚や粘膜が含まれる。また、前記皮膚には、表皮、真皮、及び皮下組織が含まれる。前記粘膜には、上皮（若しくは、粘膜上皮）、粘膜固有層、及び粘膜下層が含まれる。
【0019】
本明細書において「創傷を伴う疾患、障害もしくは症状」とは、創傷そのものや、創傷に関連して生じる任意の疾患、障害もしくは症状を指す。したがって、「創傷を伴う疾患、障害もしくは症状」には、擦過傷、裂傷、切創、挫傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、熱傷、炎症、細胞壊死などの創傷や、限局性強皮症、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、アトピー性皮膚炎などの皮膚炎を含む。
【0020】
本明細書において「免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状」とは、免疫系の異常に起因する任意の疾患、障害または症状を指す。したがって、免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状は、自己免疫疾患および／もしくはアレルギー、あるいはそれらに関連する疾患、障害または症状を含むことができ、自己免疫疾患としては本明細書の他の箇所に記載される自己免疫疾患を含むことができる。
【0021】
本明細書において、「アレルギー」とは、ある抗原に感作されている生体に、再びその抗原が入った場合に起こる過敏反応、またはその過敏反応を示す状態をいう。抗原と接触した場合、あるいは当該抗原を摂取した場合に、アレルギー反応を生じ得る。したがって、本明細書において、「アレルギー、あるいはそれらに関連する疾患、障害または症状」には、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹などが含まれる。
【0022】
本明細書において、「自己免疫疾患」とは、本来外部から侵入した病原微生物等の異物を認識し排除する役割を果たすべき自然免疫系もしくは獲得免疫系に異常が生じ、自己の細胞や組織を構成する成分を異物として認識することで自己抗体や自己反応性のリンパ球が恒常的に過剰に産生され、全身的あるいは臓器特異的にサイトカインの産生などを伴った炎症が生じ組織障害に至る疾患の総称をいう。したがって、本明細書において、「自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状」には、例えば、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症、進行性全身性硬化症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥ、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、ＩｇＧ４関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病（甲状腺機能亢進症）、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性Ｉ型糖尿病（成人潜在性自己免疫性糖尿病）、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、アトピー性皮膚炎、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、サルコイドーシス、水疱性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、自己免疫性腸炎、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、ＩＢＤ、ＩＢＳ、肥満細胞症、及びＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の増殖を伴う自己免疫疾患などが含まれる。
【0023】
本明細書において、「炎症」とは、免疫系細胞の反応の結果引き起こされる病理学上の変化を示す。「炎症」には、各種の刺激、損傷、感染等によって引き起こされる様々な反応機序が含まれる。炎症が惹起されているかは、公知の炎症マーカーを用いて特定できる。炎症マーカーとしては、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ｉＮＯＳ、ＩＮＦ－γ、ＣＯＸ－２、ＮＦ－κＢ等が知られている。
【0024】
本明細書で使用されるとき、「処置する」、「治療する」、「処置」または「治療」は、疾患を有する対象において、疾患の原因を軽減または除去すること、その進行を遅延または停止させること、その症状を軽減、緩和、改善または除去すること、および／または、その症状の悪化を抑制することを意味する。
【0025】
本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。したがって、「ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物」という場合は、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸自体のほか、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸のフラグメント、変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状の治療または予防作用を１つ以上有するもの、ならびに、作用する時点においてＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸自体またはこのＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸のフラグメント、変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸自体またはＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸のフラグメント、変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。「ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物」としては、ＣＴＬＡ－４およびそのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つの因子が代表例として挙げられる。本開示において、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸と同様に用いられうることが理解される。
【0026】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１～ｎ－１までの配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなＣＴＬＡ－４は、その活性、例えば、増殖抑制または維持の因子として機能する場合、そのフラグメント自体も本発明の範囲内に入ることが理解される。本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
【0027】
本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本発明のポリペプチド、フラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、フラグメントまたは誘導体を指す。
【0028】
本明細書において、ＣＴＬＡ－４の「フラグメント」とは、ＣＴＬＡ－４の任意のフラグメントを指し、本発明において使用される因子としては、ＣＴＬＡ－４全長のみならず、ＣＴＬＡ－４のフラグメントも、その機能、特に創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防する限り使用されうることが理解される。したがって本発明において使用されるＣＴＬＡ－４のフラグメントは、通常、ＣＴＬＡ－４の機能を少なくとも１つ有する。そのような機能としては、特に創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防する機能が含まれうる。
【0029】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【0030】
本明細書において「誘導する因子」とは、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物を発現し、転写し、翻訳し、または分化誘導などすることにより、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物の産生を促進する因子をいう。
【0031】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様である。本明細書において「発現量」は、このような「発現」の任意の量を指す。したがって、本明細書において「発現産物」とは、このようなポリペプチドもしくはタンパク質、またはｍＲＮＡを含む。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。例えば、ＣＴＬＡ－４の発現レベルまたは発現量は、任意の方法によって決定することができる。具体的には、ＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡの量、ＣＴＬＡ－４タンパク質の量、そして、ＣＴＬＡ－４タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ＣＴＬＡ－４の発現レベルを知ることができる。このような測定値はコンパニオン診断において使用し得る。、ＣＴＬＡ－４のｍＲＮＡやタンパク質の量は、本明細書の他の箇所に詳述したような方法あるいは他の当該分野において公知の方法によって決定することができる。
【0032】
（好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
【0033】
［組成物］
本開示の一局面において、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物が提供される。
本開示の一局面において、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物が提供される。
【0034】
本開示の他の局面において、疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物が提供される。
【0035】
さらに本開示の他の局面において、免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための、分泌型ＣＴＬＡ－４もしくはそれをコードする核酸、またはその機能的等価物、またはそれらの少なくとも１つを誘導する因子を含む医薬組成物が提供される。
【0036】
ＣＴＬＡ－４は制御性Ｔ細胞において恒常的に発現しており、免疫を負に制御する分子である。そのため、制御性Ｔ細胞の機能不全、もしくはＣＴＬＡ－４分子が欠損することにより、致死の自己免疫疾患を引き起こすことから、ＣＴＬＡ－４は免疫恒常性の維持に必須の分子として知られる。ＴｒｅｇにおいてＣＴＬＡ－４エクソン２とエクソン３の両方を発生工学的に破壊すると、Ｔｒｅｇ欠損ｓｃｕｒｆｙマウスに類似した全身性リンパ球増殖およびＩｇＥ・ＩｇＧの過剰産生を伴う致死的な自己免疫疾患が生じる。また、ヒトにおけるＣＴＬＡ－４ハプロ不全は自己免疫疾患の特徴を示す。分泌型ＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４、Ｓ）と膜型ＣＴＬＡ－４（ｍＣＴＬＡ－４、Ｍ）の機能または発現にネガティブな影響を与える一塩基多型は関節リウマチ、グレーブス病および１型糖尿病などの自己免疫疾患のリスクに関連している。そして、多くのヒトの慢性自己免疫疾患ではｓＣＴＬＡ－４の血清中濃度が上昇し、Ｔ細胞上のｍＣＴＬＡ－４発現も増加する。これらの知見は、ｓＣＴＬＡ－４とｍＣＴＬＡ－４がともにＴｒｅｇ介在性の自己寛容および免疫抑制に重要な分子であることを示唆している。
【0037】
ＣＴＬＡ－４はそのリガンドであるＣＤ８０／ＣＤ８６と相互作用し、直接および間接的にＣＤ８０／８６分子の発現を減少させ、過剰な免疫応答を妨げる。例えば、ＣＴＬＡ－４を高発現しているＴｒｅｇは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ８０／８６分子を引き抜き、物理的にＡＰＣ上のＣＤ８０／８６を減少させる。ＡＰＣ上のＣＤ８０の減少は、ＡＰＣ上のフリーのＰＤ－Ｌ１（普段はＣＤ８０とシス結合しＰＤ－Ｌ１の働きは抑制されている）を増加させ、ＰＤ－１を発現したＴ細胞の活性を妨げる。また、ＣＴＬＡ－４はＣＤ２８と比較しＣＤ８０／８６分子に優位に競合結合でき、Ｔ細胞活性化のための共刺激（ＣＤ２８とＣＤ８０／８６分子の相互作用）を阻害する。ＣＴＬＡ－４のエクソン２は進化的に保存されたＭＹＰＰＰＹモチーフを含み、ＭＹＰＰＰＹモチーフはＣＤ８０／８６との結合および相互作用の安定化に重要である。エクソン２を有するＣＴＬＡ－４スプライシングバリアントは２つ存在する。１つは、エクソン３によってコードされる膜貫通ドメインを有し、細胞膜中に係留されるｍＣＴＬＡ－４である。もう１つは、分泌のためにエクソン３を持たないｓＣＴＬＡ－４である。
【0038】
上記のとおり、ＣＴＬＡ－４分子が欠損することにより、致死の自己免疫疾患を引き起こすことから、ＣＴＬＡ－４は免疫恒常性の維持に必須の分子として知られており、分泌型ＣＴＬＡ－４についても、その機能や発現を減少させるような一塩基多型は、グレーブス病や１型糖尿病などの自己免疫疾患のリスクに関連することが知られている。本実施例においても、マウスにおける分泌型ＣＴＬＡ－４の欠損が加齢に伴って１型免疫の制御異常を引き起こし、前臨床的な自己免疫がもたらされることが示されており、また創傷の治癒の遅延など、炎症の修復において重要な働きを果たしていることが示されている（図６Ａ～Ｒ）。
【0039】
現在までのＣＴＬＡ－４に関するほとんどの研究では免疫恒常性における各ＣＴＬＡ－４バリアントの役割を区別していない。抗ｓＣＴＬＡ－４特異的抗体またはｓＣＴＬＡ－４に対するｓｉＲＮＡによってｓＣＴＬＡ－４の機能や発現を低下させると、Ｔ細胞のリコール応答が促進されたり、がん転移が減少すること、ＮＯＤマウスにおいて１型糖尿病に対する感受性が増加することなどが示されている。しかしながら、ｓＣＴＬＡ－４のブロッキングおよびノックダウン解析のみではインビボでのｓＣＴＬＡ－４とｍＣＴＬＡ－４の役割を理解するのに十分ではなく、例えばｍＣＴＬＡ－４非存在下でのｓＣＴＬＡ－４の具体的な機能に関しては全く示せていない。
【0040】
上記のとおり、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）は免疫を負に制御する分子であり、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において恒常的に高発現している。ＣＴＬＡ－４のエクソン２は進化的に保存されたＭＹＰＰＰＹモチーフを含んでおり、ＭＹＰＰＰＹモチーフはＣＤ８０／８６との結合および相互作用の安定化に重要である。
【0041】
ＣＴＬＡ－４には２つのスプライシングバリアント（膜型ＣＴＬＡ－４（ｍＣＴＬＡ－４）および分泌型ＣＴＬＡ－４（ｓＣＴＬＡ－４））が存在する。ｍＣＴＬＡ－４はエクソン１～４を有し、エクソン３によってコードされる膜貫通ドメインによって細胞膜中に係留されている。ｓＣＴＬＡ－４はエクソン３を欠損しており、細胞外に分泌される。
【0042】
したがって、本開示の一実施形態において、本開示の医薬組成物に含まれるＣＴＬＡ－４は、分泌型ＣＴＬＡ－４、及び膜型ＣＴＬＡ－４からなる群より選択される少なくとも１つを含むことができる。好ましくは、本開示の医薬組成物に含まれるＣＴＬＡ－４は、分泌型ＣＴＬＡ－４を含むものである。
【0043】
また、本開示の一実施形態において、ＣＴＬＡ－４の機能的等価物には、ＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ２にコードされるＭＹＰＰＰＹモチーフ領域を含むタンパク質またはペプチド、そのようなタンパク質またはペプチドの二量体または多量体、またはＣＴＬＡ－４遺伝子のＥｘｏｎ１にコードされるシグナル配列が、同種または異種由来の他のシグナル配列に置換されて発現されたタンパク質が含まれる。
【0044】
代表的なヒトｓＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ４２８０３に開示されている。また、代表的なマウスｓＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ６９８９３に開示されている。本願のｓＣＴＬＡ－４はヒトまたはマウス由来のタンパク質であってもよく、他の哺乳動物（例えば、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）由来のタンパク質であってもよい。
【0045】
ある実施形態において、ｓＣＴＬＡ－４は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ４２８０３で特定されるアミノ酸配列、またはＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ４２８０３で特定されるアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。この実施形態における「１個または複数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を意味する。他の実施形態において、ｓＣＴＬＡ－４は、ＮＣＢＩ参照番号ＣＣＤＳ４２８０３で特定されるアミノ酸配列と約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなる。さらなる実施形態において、ｓＣＴＬＡ－４は、ＭＹＰＰＰＹモチーフを含む。
【0046】
上述したアミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換であってもよく、非保存的アミノ酸置換であってもよい。本明細書において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅなど）である。例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性アミノ酸）；リジン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性アミノ酸）；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン（非極性アミノ酸）；グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニンおよびチロシン（非荷電極性アミノ酸）；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン（芳香族アミノ酸）といった、側鎖に類似性のあるアミノ酸同士で起こる置換を挙げることができる。同様に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニン（脂肪族アミノ酸）；セリンおよびトレオニン（脂肪族－ヒドロキシアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド型アミノ酸）；システインおよびメチオニン（含硫アミノ酸）といった分類をすることができる。ｓＣＴＬＡ－４は、上記配列に基づき一般に周知の方法で製造すれば良い。
【0047】
本明細書で用いる場合、「配列同一性」とは、二以上の配列（塩基配列又はアミノ酸配列）が、配列の一致度が最大となるように、ギャップおよび挿入を考慮してアラインメントされる場合の、二以上の配列における対応する位置での同一の塩基又はアミノ酸のパーセンテージを意味する。同一性を決定する方法は、アラインメントされる配列間に最大の一致度を与えるように設計される。二つの配列間の同一性を決定する方法は、限定するものではないが、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ等が挙げられる。また、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて決定することもできる。あるいは、短鎖ペプチドであれば、単純に配列を比較して決定することもできる。当業者であれば、上述のような方法で、配列間の同一性を決定することができる。
【0048】
本開示の組成物は、医薬上許容される担体および／または添加剤をさらに含んでも良い。本開示において、「医薬上許容される担体」は、ｓＣＴＬＡ－４と組み合わせた場合にその成分の生物学的活性を保持し得る任意の物質が含まれる。例えば、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、ｐＨ調整剤および抗酸化剤などが挙げられる。
【0049】
一実施形態において、本開示の組成物は、抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬と組み合わせて投与されることができる。抗生物質、抗真菌薬、または抗ウイルス薬としては、本分野に公知の種々のものを用いることができる。また本開示の一局面において、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための、ＣＴＬＡ－４と抗生物質とを含む組み合わせ物が開示される。
【0050】
本開示の組成物の投与経路は、経口投与または非経口投与を含み、特に限定されない。適用部位や対象とする疾患に応じて公知の各種投与形態を採用できる。例えば、非経口投与は、全身投与でも局所投与でもよく、より具体的には、例えば、気管内投与、髄腔内投与、くも膜下腔投与、頭蓋内投与、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、口腔内投与等が挙げられる。
【0051】
剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、チュアブル剤、液剤、懸濁剤、乳濁液などが挙げられる。活性物質の放出を延長する剤形を採用してもよい。注射または点滴用の剤形としては、水性および非水性の注射溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、等張化剤等を含んでもよい）；ならびに水性および非水性の注射懸濁液（懸濁剤、増粘剤等を含んでもよい）が挙げられる。これらの剤形は、密閉したアンプルやバイアル中に液体として提供されてもよく、凍結乾燥物として提供され、使用直前に滅菌液体（例えば、注射用水）を加えて調製してもよい。注射溶液または懸濁液を、粉末、顆粒または錠剤から調製してもよい。
【0052】
これらの剤形は、常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。
【0053】
本開示の組成物の投与量および投与回数は、有効量の有効成分が対象に投与されるように、投与対象の動物種、投与対象の健康状態、年齢、体重、投与経路、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。ある状況での有効量は、日常的な実験によって容易に決定することができ、通常の臨床医の技術および判断の範囲内である。例えば、成人１日あたりの投与量は約０．０１～約１，０００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得るが、これに限定はされない。
【0054】
本開示の組成物は、１種以上のさらなる有効成分、特に自己免疫疾患、創傷またはアレルギーの処置のための有効成分と併用できる。成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが自己免疫疾患、創傷またはアレルギーの処置のために使用される限り、各成分を同時に、連続的に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。
【0055】
一実施形態において、自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状には、例えば、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症（全身性強皮症、進行性全身性硬化症）、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性動脈周囲炎（結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎）、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、成人スティル病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥ、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋膜炎、ＩｇＧ４関連疾患（例えば、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性膵炎など）、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、大動脈炎症候群、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨赤芽球性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、バセドウ病（甲状腺機能亢進症）、橋本病、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病（慢性副腎皮質機能低下症）、Ｉ型糖尿病、緩徐進行性Ｉ型糖尿病（成人潜在性自己免疫性糖尿病）、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、乾癬、乾癬性関節炎、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線状ＩｇＡ水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、尋常性白斑、アトピー性皮膚炎、視神経脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、サルコイドーシス、水疱性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、筋委縮性側索硬化症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、習慣性流産、自己免疫性腸炎、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、セリアック病、ＩＢＤ、ＩＢＳ、肥満細胞症、及び包括的な病態としてＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の増殖を伴う自己免疫疾患などが含まれる。ある実施態様では、自己免疫疾患は、自己免疫性腸炎である。
【0056】
一実施形態において、創傷には、表皮、真皮、皮下組織、上皮（若しくは、粘膜上皮）、粘膜固有層、及び粘膜下層などの皮膚や粘膜組織において、擦過傷、裂傷、切創、挫傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、熱傷、炎症、細胞壊死等、何らかの要因によって組織表面が欠損した状態を含む。
【0057】
一実施形態において、アレルギーに関連する疾患、障害または症状には、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹などが含まれる。
【0058】
上記のとおり、ＣＴＬＡ－４は免疫恒常性の維持に必須の分子として知られていることから、本開示の一実施形態において、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状、免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状、自己免疫疾患に関連する疾患、障害または症状、アレルギーに関連する疾患、障害または症状はいずれも、膜型および／または分泌型ＣＴＬＡ－４の異常に関連する疾患、障害または症状ということができる。ＣＤ４陽性Ｔ細胞がの分化・活性化のために受け取るシグナルには、必須のシグナル１（ＴＣＲ）とシグナル２（ＣＤ２８）があり、ＣＴＬＡ－４はシグナル２を妨げる分子となるため、本開示の一実施形態において、本開示の医薬組成物の治療または予防対象となり得る疾患、障害または症状は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のエフェクター分化・活性化が抑制されない状態、つまりＣＤ４陽性Ｔ細胞のエフェクター分化・活性化が恒常的に起こる疾患、障害または症状とすることができる。またＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の分化・活性化には、他のタイプのエフェクターＴ細胞よりもシグナル２の要求性が高いため、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のエフェクター分化・活性化が抑制されない疾患、障害または症状は、ＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の分化・活性化が抑制されない（つまり、恒常的に起こる）疾患、障害または症状ということもできる。ＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の分化・活性化が抑制されない場合には、自己免疫性腸炎などが生じ、また創傷治癒の遅延も生じる。
【0059】
本願の組成物の投与対象としては、動物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サルなど）が挙げられるが、ヒトが特に好ましい。
【0060】
［スクリーニング方法］
本開示の一局面において、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、細胞を候補物質と接触させる工程と、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程とを含む、方法が提供される。
本開示の一局面において、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、細胞を候補物質と接触させる工程と、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程とを含む、方法が提供される。
【0061】
また本開示の他の局面において、免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を治療または予防するための物質をスクリーニングする方法であって、細胞を候補物質と接触させる工程と、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程と、該候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択する工程とを含む、方法が提供される。
【0062】
一実施形態において、「候補物質」には、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物、無機化合物などのあらゆる物質が包含される。候補物質は、典型的には、精製または単離されているものを使用できるが、未精製または未単離の粗精製品であっても混合物であってもよい。候補物質は、化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ランダムペプチドライブラリーなどの形態で提供されてもよく、また、天然物として提供されてもよい。
【0063】
本開示の一実施形態の方法において、細胞を候補物質と接触させる場合には、細胞は膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４を発現できる限り特に限定されないが、例えば制御性Ｔ細胞である。候補物質は、例えば細胞を含む培養培地に添加され得る。
【0064】
候補物質の標的との接触は、例えば、上記の培地や各種緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に被検物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される被検物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約０．１ｎＭ～約１００μＭの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約１０分～約２４時間が挙げられる。
【0065】
本開示の一実施形態の方法において、細胞中、または細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の発現量を測定する。この場合、測定されるＣＴＬＡ－４は膜型ＣＴＬＡ－４である。他の実施形態において、細胞中、または細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を測定することもできる。細胞中、細胞外、または細胞表面のＣＴＬＡ－４の発現量は、細胞中、細胞外、または細胞表面のＣＴＬＡ－４の遺伝子量および／またはタンパク質量であってもよい。ＣＴＬＡ－４の遺伝子量および／またはタンパク質量は周知の方法によって測定することができる。ＣＴＬＡ－４の遺伝子量は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンプロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などによって測定できる。また、ＣＴＬＡ－４のタンパク質量は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法などにより測定できる。
【0066】
本開示の一実施形態の方法において、候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞表面におけるＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択することができる。他の実施形態において、候補物質との接触前と比較して、該細胞中、または該細胞外における分泌型ＣＴＬＡ－４の量またはレベルを増加させる該候補物質を選択することができる。ある態様において、ＣＴＬＡ－４の発現量を測定する工程において測定した細胞中の膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量を対照の膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量と比較することもできる。対照は、例えば候補物質を接触させていない細胞または候補物質を接触させる前の細胞であってもよい。細胞中、細胞外、または細胞表面の膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量が対照の膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４の発現量と比較して増加していた場合、その候補物質を、膜型、または分泌型ＣＴＬＡ－４の発現を誘導または促進する物質として選択することができる。選択された候補物質は、創傷、または創傷を伴う疾患、障害もしくは症状、または免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を予防または治療するための物質として使用できる。
【0067】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８９）． Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ， ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ； Ｓｎｉｎｓｋｙ， Ｊ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９９）． ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８９）． Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ， ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ； Ｓｎｉｎｓｋｙ， Ｊ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９９）． ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【0068】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．（１９８５）． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．（１９９０）． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｆ．（１９９１）． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ａｄａｍｓ， Ｒ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）． Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ； Ｓｈａｂａｒｏｖａ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ； Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｇ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９９６）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【0069】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【0070】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例0071】
［試料および方法］
マウス
雌性５～６週齢のＣ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄマウス、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕマウス、およびＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスをＣＬＥＡ Ｊａｐａｎから購入した。ＣＴＬＡ－４ ｆｕｌｌ ＫＯ（ｅｘｏｎ２とｅｘｏｎ３の欠損）、ＣＤ４５．１、ＲＡＧ２ ＫＯ、ＦＬＰｅＲ、およびＤＥＲＥＧマウスは以前に報告されている（Waterhouse, P. et al. Lymphoproliferative Disorders with Early Lethality in Mice Deficient in Ctla-4. Science 270, 985-988 (1995).；Farley, F., Soriano, P., Steffen, L. & Dymecki, S. Widespread recombinase expression using FLPeR (Flipper) mice. genesis 28, 106-110 (2000).；Lahl, K. et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine 204, 57-63 (2007).）。ｓＣＴＬＡ－４ノックインマウスを標準的な分子的手法で作製した。簡潔に述べると、Ｂａｌｂ／ｃ－Ｉ ＥＳ細胞（B. Ledermannから受領した；Noben-Trauth, Kohler, Burki & Ledermann. Efficient targeting of the IL-4 gene in a BALB/c embryonic stem cell line. Transgenic research 5, 487-91 (1996).）に、ＣＴＬＡ－４遺伝子座のエクソン３の前側のスプライシングアクセプター部位（８６ｂｐ）を除去した改変ＣＴＬＡ－４標的化ベクター（ＲＰ２３－１４６Ｊ１７）を遺伝子導入した。標的化ベクターを、ファージに基づく大腸菌相同組換えシステムを用いて作製した。ＢＡＣ（ｓＣＴＬＡ－４－ｍＣＴＬＡ－４＋）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを、エクソン３とエクソン４を結合させたＣＴＬＡ－４ ＢＡＣ導入遺伝子によって作製し、Ｓ－Ｍ－マウスと交配させた。特に記載がない限り、すべてのマウスをＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドに１０回以上戻し交配した。すべてのマウスを特定の病原体が存在しない条件下で維持し、大阪大学免疫学フロンティア研究センターまたは京都大学ウイルス・再生医科学研究所によって承認された動物福祉のガイドラインに従って処置した。ｓＣＴＬＡ－４ノックインマウス（Ｓ＋Ｍ－マウス）およびＣＴＬＡ－４ ｆｕｌｌ ＫＯマウス（Ｓ－Ｍ－マウス）を３週齢で使用し、ＢＡＣ Ｔｇ ＣＴＬＡ－４ ｆｕｌｌ ＫＯマウス（Ｓ－Ｍ＋マウス）を３０～３２週齢で使用した。
マウス
雌性５～６週齢のＣ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄマウス、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウス、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕマウス、およびＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスをＣＬＥＡ Ｊａｐａｎから購入した。ＣＴＬＡ－４ ｆｕｌｌ ＫＯ（ｅｘｏｎ２とｅｘｏｎ３の欠損）、ＣＤ４５．１、ＲＡＧ２ ＫＯ、ＦＬＰｅＲ、およびＤＥＲＥＧマウスは以前に報告されている（Waterhouse, P. et al. Lymphoproliferative Disorders with Early Lethality in Mice Deficient in Ctla-4. Science 270, 985-988 (1995).；Farley, F., Soriano, P., Steffen, L. & Dymecki, S. Widespread recombinase expression using FLPeR (Flipper) mice. genesis 28, 106-110 (2000).；Lahl, K. et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine 204, 57-63 (2007).）。ｓＣＴＬＡ－４ノックインマウスを標準的な分子的手法で作製した。簡潔に述べると、Ｂａｌｂ／ｃ－Ｉ ＥＳ細胞（B. Ledermannから受領した；Noben-Trauth, Kohler, Burki & Ledermann. Efficient targeting of the IL-4 gene in a BALB/c embryonic stem cell line. Transgenic research 5, 487-91 (1996).）に、ＣＴＬＡ－４遺伝子座のエクソン３の前側のスプライシングアクセプター部位（８６ｂｐ）を除去した改変ＣＴＬＡ－４標的化ベクター（ＲＰ２３－１４６Ｊ１７）を遺伝子導入した。標的化ベクターを、ファージに基づく大腸菌相同組換えシステムを用いて作製した。ＢＡＣ（ｓＣＴＬＡ－４－ｍＣＴＬＡ－４＋）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを、エクソン３とエクソン４を結合させたＣＴＬＡ－４ ＢＡＣ導入遺伝子によって作製し、Ｓ－Ｍ－マウスと交配させた。特に記載がない限り、すべてのマウスをＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドに１０回以上戻し交配した。すべてのマウスを特定の病原体が存在しない条件下で維持し、大阪大学免疫学フロンティア研究センターまたは京都大学ウイルス・再生医科学研究所によって承認された動物福祉のガイドラインに従って処置した。ｓＣＴＬＡ－４ノックインマウス（Ｓ＋Ｍ－マウス）およびＣＴＬＡ－４ ｆｕｌｌ ＫＯマウス（Ｓ－Ｍ－マウス）を３週齢で使用し、ＢＡＣ Ｔｇ ＣＴＬＡ－４ ｆｕｌｌ ＫＯマウス（Ｓ－Ｍ＋マウス）を３０～３２週齢で使用した。
【0072】
抗体
以下の抗体をフローサイトメトリー分析およびインビトロでの実験に使用し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した：抗ｍＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）、抗ｍＣＤ２８（３７．５１）、抗ｍＣＤ４（ＲＭ４－５）、抗ｍＣＤ８（５３－６．７）、抗ｍＣＤ２５（ＰＣ６１）、抗ｍＧＩＴＲ（ＤＴＡ－１）、抗ｍＦＲ４（ＴＨ６）、抗ｍＴＣＲβ（Ｈ５７－５９７）、抗ｍＣＴＬＡ－４（ＵＣ１０－４Ｆ１０－１１）、抗ｍＰＤ１（ＲＰＭ１－３０）、抗ｍＣＤ４４（ＩＭ７）、抗ｍＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、抗ｍＣＤ１０３（２Ｅ７）、抗ｍＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４）、抗ｍＣＤ４５ＲＢ（Ｃ３６３．１６Ａ）、抗ｍＣＤ２２３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）、抗ｍＣＤ９０．２（５３－２．１）、抗ｍＣＤ８０（１６－１０Ａ１）、抗ｍＣＤ８６（ＰＯ３．１）、抗ｍＬｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）、抗ｍＬｙ６Ｇ（１Ａ８）、抗ｍＧｒ－１（ＲＢ６－８Ｃ５）、抗ＴＥＲ１１９（ＴＥＲ１１９）、抗Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ（Ｅ５０－２４４０）、抗ｍＣＤ４１（ＭＷＲｅｇ３０）、抗ｍＣＤ１１７（２Ｂ８）、抗ＣＤ２００Ｒ３（Ｂａ１３）、抗ｍＣＤ２４（Ｍ１／６９）、抗ｍＦｃεＲＩα（ＭＡＲ－１）、抗ｍＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）、抗ｈ／ｍＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、抗ｍＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８またはＨＬ３）、抗ｍＣＸ３ＣＲ１（２Ａ９－１）、抗ｍＦ４／８０（ＢＭ８）、抗ｍＣＤ２０６（Ｃ０６８Ｃ２）、抗ｍＣＤ６８（ＦＡ－１１）、抗ｍＣＤ６４（Ｘ５４－５／７．１）、抗ｍＣＤ７１（ＲＩ７２１７）、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ（Ｍ５／１１４．１５．２）、抗ｍＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、抗ｍＣＤ４５．１（Ａ２０）、抗ｍＣＤ４５．２（１０４）、抗ｍＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）、抗ｍＣＤ１９（１Ｄ３）、抗ｍＣＸＣＲ５（Ｌ１３８Ｄ７）、抗ｍＢｃｌ－６（Ｋ１１２－９１）、抗ＣＤ３８（９０）、抗ｈ／ｍＧＬ－７（ＧＬ－７）、抗ｍＩｇＤ（１１－２６ｃ．２ａ）、抗ｍＩｇＭ（ｌｌ／４１）、抗ｍＣＤ１３８（２８１－２）、抗ｍＣＤ１６／３２（２．４Ｇ２）、抗ｍＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４）、抗ｍＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）、抗ｍＩＬ－４（ＢＶＤ４－１Ｄ１１）、抗ｍＩＬ－５（ＴＲＦＫ５）、抗ｍＩＬ－１７Ａ（ＴＣ１１－１８Ｈ１０．１）、抗ｍＩＬ－１０（ＪＥＳ５－１６Ｅ３）、抗ｍＦｏｘｐ３（ＦＪＫ－１６ｓ）、抗ｍＧａｔａ－３（ＴＷＡＪ）、抗ｍＴ－ｂｅｔ（Ｏ４－４６）、抗ｍＨｅｌｉｏｓ（２２Ｆ６）、抗ｍＥｏｍｅｓ（Ｄａｎ１１ｍａｇ）、抗ｈＣＤ２５（Ｍ－Ａ２５１）、抗ｈＣＤ４ （ＲＰＡ－Ｔ４）、抗ｈＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）、抗ｈ／ｍＫｉ－６７（Ｂ５６）、および抗バキュロウイルスｇｐ６４（ＡｃＶ１）。抗ｉＮＯＳ ｍＡｂ（４Ｅ５、Ａｂｃａｍ）を、Ｚｅｎｏｎ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。マウスＣＤ４＋ Ｔ細胞をインビトロで活性化するために、抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ｓＣＴＬＡ－４特異的アミノ酸のペプチド（NH2-AKEKKSSYNRGLCENAPNRARM-COOH；配列番号１）を用いてモノクローナル抗体を作製するために、抗ｓＣＴＬＡ－４特異的アミノ酸抗体を標準的な手法により作製した。
以下の抗体をフローサイトメトリー分析およびインビトロでの実験に使用し、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した：抗ｍＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）、抗ｍＣＤ２８（３７．５１）、抗ｍＣＤ４（ＲＭ４－５）、抗ｍＣＤ８（５３－６．７）、抗ｍＣＤ２５（ＰＣ６１）、抗ｍＧＩＴＲ（ＤＴＡ－１）、抗ｍＦＲ４（ＴＨ６）、抗ｍＴＣＲβ（Ｈ５７－５９７）、抗ｍＣＴＬＡ－４（ＵＣ１０－４Ｆ１０－１１）、抗ｍＰＤ１（ＲＰＭ１－３０）、抗ｍＣＤ４４（ＩＭ７）、抗ｍＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、抗ｍＣＤ１０３（２Ｅ７）、抗ｍＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４）、抗ｍＣＤ４５ＲＢ（Ｃ３６３．１６Ａ）、抗ｍＣＤ２２３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）、抗ｍＣＤ９０．２（５３－２．１）、抗ｍＣＤ８０（１６－１０Ａ１）、抗ｍＣＤ８６（ＰＯ３．１）、抗ｍＬｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）、抗ｍＬｙ６Ｇ（１Ａ８）、抗ｍＧｒ－１（ＲＢ６－８Ｃ５）、抗ＴＥＲ１１９（ＴＥＲ１１９）、抗Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ（Ｅ５０－２４４０）、抗ｍＣＤ４１（ＭＷＲｅｇ３０）、抗ｍＣＤ１１７（２Ｂ８）、抗ＣＤ２００Ｒ３（Ｂａ１３）、抗ｍＣＤ２４（Ｍ１／６９）、抗ｍＦｃεＲＩα（ＭＡＲ－１）、抗ｍＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）、抗ｈ／ｍＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、抗ｍＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８またはＨＬ３）、抗ｍＣＸ３ＣＲ１（２Ａ９－１）、抗ｍＦ４／８０（ＢＭ８）、抗ｍＣＤ２０６（Ｃ０６８Ｃ２）、抗ｍＣＤ６８（ＦＡ－１１）、抗ｍＣＤ６４（Ｘ５４－５／７．１）、抗ｍＣＤ７１（ＲＩ７２１７）、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ（Ｍ５／１１４．１５．２）、抗ｍＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、抗ｍＣＤ４５．１（Ａ２０）、抗ｍＣＤ４５．２（１０４）、抗ｍＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）、抗ｍＣＤ１９（１Ｄ３）、抗ｍＣＸＣＲ５（Ｌ１３８Ｄ７）、抗ｍＢｃｌ－６（Ｋ１１２－９１）、抗ＣＤ３８（９０）、抗ｈ／ｍＧＬ－７（ＧＬ－７）、抗ｍＩｇＤ（１１－２６ｃ．２ａ）、抗ｍＩｇＭ（ｌｌ／４１）、抗ｍＣＤ１３８（２８１－２）、抗ｍＣＤ１６／３２（２．４Ｇ２）、抗ｍＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４）、抗ｍＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）、抗ｍＩＬ－４（ＢＶＤ４－１Ｄ１１）、抗ｍＩＬ－５（ＴＲＦＫ５）、抗ｍＩＬ－１７Ａ（ＴＣ１１－１８Ｈ１０．１）、抗ｍＩＬ－１０（ＪＥＳ５－１６Ｅ３）、抗ｍＦｏｘｐ３（ＦＪＫ－１６ｓ）、抗ｍＧａｔａ－３（ＴＷＡＪ）、抗ｍＴ－ｂｅｔ（Ｏ４－４６）、抗ｍＨｅｌｉｏｓ（２２Ｆ６）、抗ｍＥｏｍｅｓ（Ｄａｎ１１ｍａｇ）、抗ｈＣＤ２５（Ｍ－Ａ２５１）、抗ｈＣＤ４ （ＲＰＡ－Ｔ４）、抗ｈＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）、抗ｈ／ｍＫｉ－６７（Ｂ５６）、および抗バキュロウイルスｇｐ６４（ＡｃＶ１）。抗ｉＮＯＳ ｍＡｂ（４Ｅ５、Ａｂｃａｍ）を、Ｚｅｎｏｎ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。マウスＣＤ４＋ Ｔ細胞をインビトロで活性化するために、抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ｓＣＴＬＡ－４特異的アミノ酸のペプチド（NH2-AKEKKSSYNRGLCENAPNRARM-COOH；配列番号１）を用いてモノクローナル抗体を作製するために、抗ｓＣＴＬＡ－４特異的アミノ酸抗体を標準的な手法により作製した。
【0073】
細胞培養
マウスＴ細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および５０μＭ ２－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ－２（Ｉｍｕｎａｓｅ３５、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）の存在下においてＴ細胞を枯渇させ、マイトマイシンＣ（ＫＹＯＷＡ ＫＩＲＩＮ）で処理した脾細胞を伴って抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または抗ＣＤ３抗体により活性化した。２１日齢のｓＣＴＬＡ－４ ＫＩ（Ｓ＋Ｍ－）、ＣＴＬＡ－４ ｆｕｌｌ ＫＯ（Ｓ－Ｍ－）および同腹の対照（Ｓ＋Ｍ＋）から調製した脾細胞またはリンパ球を、Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下において２５ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１μＭイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で５時間刺激した。細胞を、サイトカインの染色のためにＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍおよびＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定および透過処理し、Ｆｏｘｐ３の染色のためにＦｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定および透過処理し、Ｆｏｘｐ３とサイトカインの共染色のためにＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定および透過処理した。マウスマクロファージを、ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ ２４ Ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＣｅｌｌＳｅｅｄ）を用いて１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１０の存在下で培養した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を、１０％ＦＣＳおよびペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で培養した。Ｓｆ９細胞を、１０％ＦＣＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび０．１％プルロニックＦ－６８（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ Ｍｅｄｉｕｍ－Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｈｉｎｋ（ＴＮＭ－ＦＨ）中で２７℃において１３０ｒｐｍで振盪させた振盪フラスコを用いて培養した。Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）を、ペニシリン－ストレプトマイシン、１０Ｕ／ｍＬヘパリンおよび１８ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で２７℃において１３０ｒｐｍで振盪させた振盪フラスコを用いて培養した。
マウスＴ細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および５０μＭ ２－メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。Ｔ細胞を、１００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ－２（Ｉｍｕｎａｓｅ３５、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）の存在下においてＴ細胞を枯渇させ、マイトマイシンＣ（ＫＹＯＷＡ ＫＩＲＩＮ）で処理した脾細胞を伴って抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または抗ＣＤ３抗体により活性化した。２１日齢のｓＣＴＬＡ－４ ＫＩ（Ｓ＋Ｍ－）、ＣＴＬＡ－４ ｆｕｌｌ ＫＯ（Ｓ－Ｍ－）および同腹の対照（Ｓ＋Ｍ＋）から調製した脾細胞またはリンパ球を、Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下において２５ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１μＭイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で５時間刺激した。細胞を、サイトカインの染色のためにＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍおよびＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定および透過処理し、Ｆｏｘｐ３の染色のためにＦｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定および透過処理し、Ｆｏｘｐ３とサイトカインの共染色のためにＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定および透過処理した。マウスマクロファージを、ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ ２４ Ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＣｅｌｌＳｅｅｄ）を用いて１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１０の存在下で培養した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を、１０％ＦＣＳおよびペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で培養した。Ｓｆ９細胞を、１０％ＦＣＳ、ペニシリン－ストレプトマイシンおよび０．１％プルロニックＦ－６８（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ Ｍｅｄｉｕｍ－Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｈｉｎｋ（ＴＮＭ－ＦＨ）中で２７℃において１３０ｒｐｍで振盪させた振盪フラスコを用いて培養した。Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）を、ペニシリン－ストレプトマイシン、１０Ｕ／ｍＬヘパリンおよび１８ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で２７℃において１３０ｒｐｍで振盪させた振盪フラスコを用いて培養した。
【0074】
ＥＬＩＳＡ
ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＩＬ－３、ＩＬ－１０およびＴＳＬＰを、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－３３およびＭ－ＣＳＦを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＩＬ－５およびＩＬ－１７Ａを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したＢｉｏ－ｐｌｅｘキットを用いて測定した。血清抗体を、Ｍｏｕｓｅ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ６ｐｌｅｘ ＫｉｔおよびＭｏｕｓｅ ＩｇＥ ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。エオタキシン（ＣＣＬ１１）、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２およびＣＸＣＬ１３を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手したＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘキットを用いて測定した。抗マウスｄｓＤＮＡ ＩｇＧおよび抗マウスＩｇＥを、Ｓｉｂａｙａｇｉから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。抗胃壁抗体を以前に記載されたように決定した（Wing, K. et al. CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science 322, 271-5 (2008).）。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫からの全タンパク質を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）とともにＭ－ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて回収した。細胞抽出物を４℃において１８０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。溶解物中のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。腫瘍溶解物中のＩＦＮγ（ｐｇ／全タンパク質のｍｇ）の濃度を、ＥＬＩＳＡにより定量した。腹腔マクロファージ中のＩＬ－１０産生を、インビトロでの細胞培養の２４時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。
ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＩＬ－３、ＩＬ－１０およびＴＳＬＰを、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－３３およびＭ－ＣＳＦを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＩＬ－５およびＩＬ－１７Ａを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したＢｉｏ－ｐｌｅｘキットを用いて測定した。血清抗体を、Ｍｏｕｓｅ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ６ｐｌｅｘ ＫｉｔおよびＭｏｕｓｅ ＩｇＥ ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって測定した。エオタキシン（ＣＣＬ１１）、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２およびＣＸＣＬ１３を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手したＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘキットを用いて測定した。抗マウスｄｓＤＮＡ ＩｇＧおよび抗マウスＩｇＥを、Ｓｉｂａｙａｇｉから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。抗胃壁抗体を以前に記載されたように決定した（Wing, K. et al. CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science 322, 271-5 (2008).）。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫からの全タンパク質を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）とともにＭ－ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて回収した。細胞抽出物を４℃において１８０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。溶解物中のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。腫瘍溶解物中のＩＦＮγ（ｐｇ／全タンパク質のｍｇ）の濃度を、ＥＬＩＳＡにより定量した。腹腔マクロファージ中のＩＬ－１０産生を、インビトロでの細胞培養の２４時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。
【0075】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。リアルタイムＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０プローブマスター（Ｒｏｃｈｅ）およびユニバーサルプローブライブラリープローブ（Ｒｏｃｈｅ）を用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ）により実施した。転写物をＨＰＲＴ１レベルに正規化した。アッセイ番号は以下である：Hprt、Mm01545399_m1；Il10、Mm00439614_m1；Ifng、Mm01168134_m1；Il4、Mm00445259_m1；Il17a、Mm00439618_m1；Il6、Mm00446190_m1；Ebi3、mm00469294_m1；Tgfb1、Mm03024053_m1；Nos2、Mm00440502_m1；Mrc1、Mm00485148_m1；Retnla、Mm00445109_m1；Arg1、Mm00475988_m1。ｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４のプライマー配列は以下である：マウスsCTLA-4；フォワード：5’-cgcagatttatgtcattgctaaag - 3’（配列番号２）；リバース：5’- aaacggcctttcagttgatg - 3’（配列番号３）；TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）：5’- aagaagtcctcttacaacagg - 3’（配列番号４）：マウスmCTLA-4；フォワード：5’-ggcaacgggacgcaga - 3’（配列番号５）；リバース：5’- cccaagctaactgcgacaagg - 3’（配列番号６）；TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）：5’- ttatgtcattgatccagaacc - 3’（配列番号７）：ヒトsCTLA-4；フォワード：5’-ggacacgggactctacatctg - 3’（配列番号８）；リバース：5’- aagagggcttcttttctttagca - 3’（配列番号９）；ユニバーサルプローブライブラリープローブ＃39（Roche）：ヒトmCTLA-4；フォワード：5’-ataggcaacggaacccagat - 3’（配列番号１０）；リバース：5’- cccgaactaactgctgcaa - 3’（配列番号１１）；ユニバーサルプローブライブラリープローブ＃69（Roche）：ヒトHPRT1；フォワード：5’-gaccagtcaacaggggacat - 3’（配列番号１２）；リバース：5’- gtgtcaattatatcttccacaatcaag - 3’（配列番号１３）；ユニバーサルプローブライブラリープローブ＃22（Roche）。
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。リアルタイムＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０プローブマスター（Ｒｏｃｈｅ）およびユニバーサルプローブライブラリープローブ（Ｒｏｃｈｅ）を用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ）により実施した。転写物をＨＰＲＴ１レベルに正規化した。アッセイ番号は以下である：Hprt、Mm01545399_m1；Il10、Mm00439614_m1；Ifng、Mm01168134_m1；Il4、Mm00445259_m1；Il17a、Mm00439618_m1；Il6、Mm00446190_m1；Ebi3、mm00469294_m1；Tgfb1、Mm03024053_m1；Nos2、Mm00440502_m1；Mrc1、Mm00485148_m1；Retnla、Mm00445109_m1；Arg1、Mm00475988_m1。ｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４のプライマー配列は以下である：マウスsCTLA-4；フォワード：5’-cgcagatttatgtcattgctaaag - 3’（配列番号２）；リバース：5’- aaacggcctttcagttgatg - 3’（配列番号３）；TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）：5’- aagaagtcctcttacaacagg - 3’（配列番号４）：マウスmCTLA-4；フォワード：5’-ggcaacgggacgcaga - 3’（配列番号５）；リバース：5’- cccaagctaactgcgacaagg - 3’（配列番号６）；TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）：5’- ttatgtcattgatccagaacc - 3’（配列番号７）：ヒトsCTLA-4；フォワード：5’-ggacacgggactctacatctg - 3’（配列番号８）；リバース：5’- aagagggcttcttttctttagca - 3’（配列番号９）；ユニバーサルプローブライブラリープローブ＃39（Roche）：ヒトmCTLA-4；フォワード：5’-ataggcaacggaacccagat - 3’（配列番号１０）；リバース：5’- cccgaactaactgctgcaa - 3’（配列番号１１）；ユニバーサルプローブライブラリープローブ＃69（Roche）：ヒトHPRT1；フォワード：5’-gaccagtcaacaggggacat - 3’（配列番号１２）；リバース：5’- gtgtcaattatatcttccacaatcaag - 3’（配列番号１３）；ユニバーサルプローブライブラリープローブ＃22（Roche）。
【0076】
プラスミド
マウスｍＣＴＬＡ－４ ｃＤＮＡをＢａｌｄｂ／ｃ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞からクローニングした。ｓＣＴＬＡ－４ ｃＤＮＡを作製するために、ｍＣＴＬＡ－４ ｃＤＮＡをｐＣＭＶ－Ｔａｇ４Ａベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローニングし、ｅｘｏｎ３欠失コンストラクトをＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）により作製した。Ｙ１３９Ａ（１３９番目のチロシン＞アラニン）変異体ｓＣＴＬＡ－４を、ＭＹＰＰＰＹモチーフ（ATGTACCCACCGCCATAC（配列番号１４） → ATGTACCCACCGCCAGCC（配列番号１５））に変異を導入することにより作製した。レトロウイルス遺伝子導入のために、野生型ｓＣＴＬＡ－４、Ｙ１３９Ａ変異体ｓＣＴＬＡ－４およびＣＴＬＡ－４ Ｉｇ（pME18S-mCTLA4/WT-hIgG、T. Saito, RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, Kanagawa, Japanから受領した）をｐＭＣｓＩｇレトロウイルスベクター（T. Kitamura, The Institute of Medical Sciences, The University of Tokyo, Tokyo, Japanから受領した）にサブクローニングし、ｐＭＣｓＩｇ－ｓＣＴＬＡ－４、ｐＭＣｓＩｇ－ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９ＡおよびｐＭＣｓＩｇ－ＣＴＬＡ－４ Ｉｇを作製した。組換えバキュロウイルスを作製するために、ｐＣＭＶ－Ｔａｇ４Ａ内のＦＬＡＧタグ付きＷＴ ｓＣＴＬＡ－４およびＹ１３９Ａ ｓＣＴＬＡ－４をｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にサブクローニングし、ｐＦａｓｔＢａｃ－ｓＣＴＬＡ－４－ＦＬＡＧおよびｐＦａｓｔＢａｃ－ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ－ＦＬＡＧを作製した。
マウスｍＣＴＬＡ－４ ｃＤＮＡをＢａｌｄｂ／ｃ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞からクローニングした。ｓＣＴＬＡ－４ ｃＤＮＡを作製するために、ｍＣＴＬＡ－４ ｃＤＮＡをｐＣＭＶ－Ｔａｇ４Ａベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローニングし、ｅｘｏｎ３欠失コンストラクトをＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）により作製した。Ｙ１３９Ａ（１３９番目のチロシン＞アラニン）変異体ｓＣＴＬＡ－４を、ＭＹＰＰＰＹモチーフ（ATGTACCCACCGCCATAC（配列番号１４） → ATGTACCCACCGCCAGCC（配列番号１５））に変異を導入することにより作製した。レトロウイルス遺伝子導入のために、野生型ｓＣＴＬＡ－４、Ｙ１３９Ａ変異体ｓＣＴＬＡ－４およびＣＴＬＡ－４ Ｉｇ（pME18S-mCTLA4/WT-hIgG、T. Saito, RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, Kanagawa, Japanから受領した）をｐＭＣｓＩｇレトロウイルスベクター（T. Kitamura, The Institute of Medical Sciences, The University of Tokyo, Tokyo, Japanから受領した）にサブクローニングし、ｐＭＣｓＩｇ－ｓＣＴＬＡ－４、ｐＭＣｓＩｇ－ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９ＡおよびｐＭＣｓＩｇ－ＣＴＬＡ－４ Ｉｇを作製した。組換えバキュロウイルスを作製するために、ｐＣＭＶ－Ｔａｇ４Ａ内のＦＬＡＧタグ付きＷＴ ｓＣＴＬＡ－４およびＹ１３９Ａ ｓＣＴＬＡ－４をｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にサブクローニングし、ｐＦａｓｔＢａｃ－ｓＣＴＬＡ－４－ＦＬＡＧおよびｐＦａｓｔＢａｃ－ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ－ＦＬＡＧを作製した。
【0077】
ｓＣＴＬＡ－４またはＣＴＬＡ－４ Ｉｇを発現するＢ１６Ｆ１０黒色腫
レトロウイルスコンストラクトの遺伝子導入を、以前に記載されているように実施した（Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A. & Krogsgaard, M. Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells. J Vis Exp Jove 2307 (2010). doi:10.3791/2307）。Ｂ１６Ｆ１０細胞は接着細胞であるが、スピンイノキュレーションのプロトコルを用いて８μｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により３２℃で１０００×ｇにおいて９０分間形質導入を行った。レトロウイルスを形質導入した後、ＧＦＰ＋形質導入細胞をＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩによって２回選別および濃縮した。タンパク質の発現を、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡによって評価した。
レトロウイルスコンストラクトの遺伝子導入を、以前に記載されているように実施した（Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A. & Krogsgaard, M. Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells. J Vis Exp Jove 2307 (2010). doi:10.3791/2307）。Ｂ１６Ｆ１０細胞は接着細胞であるが、スピンイノキュレーションのプロトコルを用いて８μｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により３２℃で１０００×ｇにおいて９０分間形質導入を行った。レトロウイルスを形質導入した後、ＧＦＰ＋形質導入細胞をＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩによって２回選別および濃縮した。タンパク質の発現を、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡによって評価した。
【0078】
ｓＣＴＬＡ－４の発現および精製
組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて作製した。Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）にバキュロウイルスを感染させ、ＦＬＡＧタグ付きＷＴ ｓＣＴＬＡ－４およびＹ１３９Ａ変異ｓＣＴＬＡ－４を産生させた。培養上清中のＦＬＡＧタグ付きＷＴ ｓＣＴＬＡ－４（配列番号１６、ＣＣＤＳ６９８９３）またはＹ１３９Ａ ｓＣＴＬＡ－４を抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により精製し、洗浄緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で洗浄し、溶出緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、１６０μｇ／ｍＬ ３ｘＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で溶出し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてリン酸緩衝生理食塩水で透析した。ｓＣＴＬＡ－４の濃度をＥＬＩＳＡおよびＣＢＢ染色により概算した。
組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて作製した。Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞（ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４）にバキュロウイルスを感染させ、ＦＬＡＧタグ付きＷＴ ｓＣＴＬＡ－４およびＹ１３９Ａ変異ｓＣＴＬＡ－４を産生させた。培養上清中のＦＬＡＧタグ付きＷＴ ｓＣＴＬＡ－４（配列番号１６、ＣＣＤＳ６９８９３）またはＹ１３９Ａ ｓＣＴＬＡ－４を抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により精製し、洗浄緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で洗浄し、溶出緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、１６０μｇ／ｍＬ ３ｘＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で溶出し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてリン酸緩衝生理食塩水で透析した。ｓＣＴＬＡ－４の濃度をＥＬＩＳＡおよびＣＢＢ染色により概算した。
【0079】
細胞移植および腫瘍接種
６週齢のＣ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄマウスに、ＣＤ４５．１コンジェニックマウスから精製した４×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ細胞を単独または３週齢のＤＥＲＥＧ Ｓ＋Ｍ－マウスもしくはＤＥＲＥＧ Ｓ－Ｍ－マウス由来の３×１０５個のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）細胞とともに静脈内投与した。腫瘍の実験では、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０メラニン細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種した。
６週齢のＣ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄマウスに、ＣＤ４５．１コンジェニックマウスから精製した４×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ細胞を単独または３週齢のＤＥＲＥＧ Ｓ＋Ｍ－マウスもしくはＤＥＲＥＧ Ｓ－Ｍ－マウス由来の３×１０５個のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）細胞とともに静脈内投与した。腫瘍の実験では、１×１０６個のＢ１６Ｆ１０メラニン細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種した。
【0080】
粘膜固有層細胞の単離
大腸粘膜固有層リンパ球および骨髄細胞を、以前に記載されている方法を用いて単離した（Weigmann, B. et al. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols 2, 2307-2311 (2007).）。酵素処理により単細胞懸濁した後、ＣＤ４５＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ－Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋大腸マクロファージをＦＡＣＳソートし（純度＞９９％）、ｍＲＮＡの測定を行った。
大腸粘膜固有層リンパ球および骨髄細胞を、以前に記載されている方法を用いて単離した（Weigmann, B. et al. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols 2, 2307-2311 (2007).）。酵素処理により単細胞懸濁した後、ＣＤ４５＋Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ－Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋大腸マクロファージをＦＡＣＳソートし（純度＞９９％）、ｍＲＮＡの測定を行った。
【0081】
組織学的分析
大腸の組織学的分析を以前に記載されているように実施した（Yamaguchi, T. et al. Construction of self-recognizing regulatory T cells from conventional T cells by controlling CTLA-4 and IL-2 expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2116-25 (2013).）。肺切片のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色をＢＺ－Ｘ７００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）により観察した。肺全体の面積およびリンパ球が浸潤した面積（細胞病巣：＞１０００μｍ２）をＢＺ－Ｘアナライザーソフトウェア（ＫＥＹＥＮＣＥ）により算出および定量した。
大腸の組織学的分析を以前に記載されているように実施した（Yamaguchi, T. et al. Construction of self-recognizing regulatory T cells from conventional T cells by controlling CTLA-4 and IL-2 expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2116-25 (2013).）。肺切片のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色をＢＺ－Ｘ７００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）により観察した。肺全体の面積およびリンパ球が浸潤した面積（細胞病巣：＞１０００μｍ２）をＢＺ－Ｘアナライザーソフトウェア（ＫＥＹＥＮＣＥ）により算出および定量した。
【0082】
ＲＮＡ ｓｅｑ
全ＲＮＡを、単離したＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋Ｆ４／８０ｈｉｇｈ＋腹腔マクロファージからｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。ＦＡＣＳソート後のマクロファージの純度は＞９９％であった。ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により調製したｃＤＮＡライブラリーを、ＨｉＳｅｑ ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列決定した。リード配列をＴｏｐＨａｔにより参照ゲノム（ｍｍ１０）にマッピングした。すべての試料からの全体的なリードマッピング率は＞９４％であった。発現レベルおよび統計的有意性を、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓのパッケージに含まれているＣｕｆｆｄｉｆｆにより算出および検定した。出力ファイルを、Ｒ環境のＣｕｍｍｅＲｂｕｎｄおよびｇｐｌｏｔｓパッケージにより可視化した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析のために、各遺伝子のリードカウントをＨＴＳｅｑのスクリプトであるｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔにより算出し、発現変動解析をＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｅｄｇｅＲパッケージにより実施した。発現変動遺伝子のリストを評価するために、ＥｒｍｉｎｅＪソフトウェアの過剰出現分析（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＯＲＡ）法を用いた。
全ＲＮＡを、単離したＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋Ｆ４／８０ｈｉｇｈ＋腹腔マクロファージからｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。ＦＡＣＳソート後のマクロファージの純度は＞９９％であった。ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により調製したｃＤＮＡライブラリーを、ＨｉＳｅｑ ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列決定した。リード配列をＴｏｐＨａｔにより参照ゲノム（ｍｍ１０）にマッピングした。すべての試料からの全体的なリードマッピング率は＞９４％であった。発現レベルおよび統計的有意性を、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓのパッケージに含まれているＣｕｆｆｄｉｆｆにより算出および検定した。出力ファイルを、Ｒ環境のＣｕｍｍｅＲｂｕｎｄおよびｇｐｌｏｔｓパッケージにより可視化した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析のために、各遺伝子のリードカウントをＨＴＳｅｑのスクリプトであるｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔにより算出し、発現変動解析をＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｅｄｇｅＲパッケージにより実施した。発現変動遺伝子のリストを評価するために、ＥｒｍｉｎｅＪソフトウェアの過剰出現分析（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＯＲＡ）法を用いた。
【0083】
喘息モデル
アレルゲンの抗原感作、投与および分析を、以前に記載されているように実施した（Reddy, A., Lakshmi, S. & Reddy, R. Murine Model of Allergen Induced Asthma. Journal of Visualized Experiments e3771 (2012). doi:10.3791/3771；Misharin, A., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G., Budinger, S. & Perlman, H. Flow Cytometric Analysis of Macrophages and Dendritic Cell Subsets in the Mouse Lung. American journal of respiratory cell and molecular biology 49, 130522202035005 (2013).）。簡潔に述べると、マウスに、２ｍｇのアルハイドロゲルアジュバント（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）中に乳化させた４０μｇのグレードＶのオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を０日目と７日目に２回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。１４、１６、１８および２０日目にマウスの気管を外科的に露出させ、５０μＬ ０．１％オボアルブミンをマイクロシリンジにより気管内（ｉ．ｔ．）に注入した。２２日目にマウスを屠殺し、肺をＰＢＳで灌流した。肺組織切片を酵素液（１ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０５ｍｇ／ｍＬリベラーゼＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）、および０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ））で処理した後、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって単細胞懸濁液を得た。
アレルゲンの抗原感作、投与および分析を、以前に記載されているように実施した（Reddy, A., Lakshmi, S. & Reddy, R. Murine Model of Allergen Induced Asthma. Journal of Visualized Experiments e3771 (2012). doi:10.3791/3771；Misharin, A., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G., Budinger, S. & Perlman, H. Flow Cytometric Analysis of Macrophages and Dendritic Cell Subsets in the Mouse Lung. American journal of respiratory cell and molecular biology 49, 130522202035005 (2013).）。簡潔に述べると、マウスに、２ｍｇのアルハイドロゲルアジュバント（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）中に乳化させた４０μｇのグレードＶのオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を０日目と７日目に２回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。１４、１６、１８および２０日目にマウスの気管を外科的に露出させ、５０μＬ ０．１％オボアルブミンをマイクロシリンジにより気管内（ｉ．ｔ．）に注入した。２２日目にマウスを屠殺し、肺をＰＢＳで灌流した。肺組織切片を酵素液（１ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０５ｍｇ／ｍＬリベラーゼＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）、および０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ））で処理した後、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって単細胞懸濁液を得た。
【0084】
オボアルブミンによるＤＯ１１．１０マウスの免疫
８～１２週齢のＤＥＲＥＧ ＤＯ１１．１０ ＴＣＲトランスジェニックマウスの腋窩／上腕リンパ節または鼠径リンパ節に近い背部の４点に、フロイント完全アジュバントＨ３７ Ｒａ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）と２ｍｇ／ｍＬのグレードＶのオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の１：１エマルジョンを５０μＬ皮下注射した。０、７、１４および２１日目に、ｑＰＣＲによるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡの定量のために、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）Ｔｒｅｇを流入領域リンパ節から単離した（純度＞９９％）。
８～１２週齢のＤＥＲＥＧ ＤＯ１１．１０ ＴＣＲトランスジェニックマウスの腋窩／上腕リンパ節または鼠径リンパ節に近い背部の４点に、フロイント完全アジュバントＨ３７ Ｒａ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ）と２ｍｇ／ｍＬのグレードＶのオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の１：１エマルジョンを５０μＬ皮下注射した。０、７、１４および２１日目に、ｑＰＣＲによるｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡの定量のために、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（ＧＦＰ＋）Ｔｒｅｇを流入領域リンパ節から単離した（純度＞９９％）。
【0085】
創傷治癒モデルおよび再上皮化の免疫蛍光
皮膚の切除および創傷治癒の定量を以前に記載されているように行った（Keyes, B. et al. Impaired Epidermal to Dendritic T Cell Signaling Slows Wound Repair in Aged Skin. Cell 167, 1323-1338.e14 (2016).）。簡潔に述べると、剪毛した背部の皮膚にエタノールで消毒し、６ｍｍ生検パンチ（ｋａｉ ｍｅｄｉｃａｌ）によって２組の創傷を生成した。創傷後１、３および５日目に、２組の傷の平均創傷面積（ｍｍ２）を定規と共に撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアバージョン１．５３ａ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて面積を算出した。創傷５日後に、背部皮膚組織を免疫染色のために採取し、４％パラホルムアルデヒドで４℃において４８時間固定後、パラフィン包埋し、創傷領域の長軸について薄片（５μｍ）を作製した。再水和し、１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中において１２１℃で５分間蒸気滅菌することにより抗原賦活化し、精製抗ケラチン１４抗体（Ｐｏｌｙ９０６０、ニワトリポリクローナルＩｇＹ、１：５００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、その後Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８と結合した吸着処理済み抗ニワトリＩｇＹ二次抗体（ヤギポリクローナルＩｇＧ、１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＤＡＰＩで染色した。創傷下の再上皮化の画像をＢＺ－Ｘ７００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）で撮影し、創縁から移動したＫ１４＋表皮角化細胞層の長さをＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量した。
皮膚の切除および創傷治癒の定量を以前に記載されているように行った（Keyes, B. et al. Impaired Epidermal to Dendritic T Cell Signaling Slows Wound Repair in Aged Skin. Cell 167, 1323-1338.e14 (2016).）。簡潔に述べると、剪毛した背部の皮膚にエタノールで消毒し、６ｍｍ生検パンチ（ｋａｉ ｍｅｄｉｃａｌ）によって２組の創傷を生成した。創傷後１、３および５日目に、２組の傷の平均創傷面積（ｍｍ２）を定規と共に撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアバージョン１．５３ａ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて面積を算出した。創傷５日後に、背部皮膚組織を免疫染色のために採取し、４％パラホルムアルデヒドで４℃において４８時間固定後、パラフィン包埋し、創傷領域の長軸について薄片（５μｍ）を作製した。再水和し、１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中において１２１℃で５分間蒸気滅菌することにより抗原賦活化し、精製抗ケラチン１４抗体（Ｐｏｌｙ９０６０、ニワトリポリクローナルＩｇＹ、１：５００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、その後Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８と結合した吸着処理済み抗ニワトリＩｇＹ二次抗体（ヤギポリクローナルＩｇＧ、１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＤＡＰＩで染色した。創傷下の再上皮化の画像をＢＺ－Ｘ７００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）で撮影し、創縁から移動したＫ１４＋表皮角化細胞層の長さをＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量した。
【0086】
統計分析
すべての図において、各データ点はランダムに選択された異なる個体動物、独立して実施された実験、または別々の動物から単離されたｍＲＮＡの定量で測定された値を表す。特に記載がない限り、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０ｄ（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて一元配置分散分析により分析し、次いで適用可能な場合には、複数群についてＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ多重比較検定または２群について対応のない両側ｔ検定を行った。複数群のノンパラメトリック検定を行う場合は、クラスカル・ウォリス検定およびＤｕｎｎの多重比較検定を適用した。２群のノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定またはログランク検定によって統計分析を行った場合、各図面の説明に記載した。Ｐ値＞０．０５をＮＳ（有意でない）とみなした。
すべての図において、各データ点はランダムに選択された異なる個体動物、独立して実施された実験、または別々の動物から単離されたｍＲＮＡの定量で測定された値を表す。特に記載がない限り、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０ｄ（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて一元配置分散分析により分析し、次いで適用可能な場合には、複数群についてＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ多重比較検定または２群について対応のない両側ｔ検定を行った。複数群のノンパラメトリック検定を行う場合は、クラスカル・ウォリス検定およびＤｕｎｎの多重比較検定を適用した。２群のノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定またはログランク検定によって統計分析を行った場合、各図面の説明に記載した。Ｐ値＞０．０５をＮＳ（有意でない）とみなした。
【0087】
［結果］
ｓＣＴＬＡ－４は免疫調節の役割を有する
ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２ＬｌｏｗエフェクターＴｒｅｇは、ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２ＬｈｉｇｈナイーブＴｒｅｇまたは従来のＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２ＬｌｏｗエフェクターＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）と比較してｓＣＴＬＡ－４の発現が２倍以上に増加していた（図１Ａ）。この結果と一致して、ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ２５ｈｉｇｈ（＜１％）エフェクターＴｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ナイーブＴｒｅｇと比較して生体内でのｓＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡの発現が最も高かった（図１Ｂ）。ｓＣＴＬＡ－４とｍＣＴＬＡ－４の長期的な動態を調べるために、ＤＥＲＥＧ ＤＯ１１．１０ ＴＣＲトランスジェニック（Ｔｇ）マウスをＯＶＡ抗原で免疫し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞をインビボで刺激した。Ｔｒｅｇ中のｓＣＴＬＡ－４は免疫７日後に減少したが、免疫２１日後にはｓＣＴＬＡ－４の量は増加し、定常レベルを上回った（図１Ｃ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４が炎症の後期に必要とされ得ることを示唆している。さらに、喧嘩により皮膚に慢性的な傷を有する雄マウスは、無傷の雄マウスと比較してｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４を高発現していた（図１Ｄ）。これらの結果から、炎症条件において活性化ＴｒｅｇがｓＣＴＬＡ－４の転写・発現を一時的に停止させた後に、ｓＣＴＬＡ－４を増加させていることを示唆している。
ｓＣＴＬＡ－４は免疫調節の役割を有する
ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２ＬｌｏｗエフェクターＴｒｅｇは、ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２ＬｈｉｇｈナイーブＴｒｅｇまたは従来のＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２ＬｌｏｗエフェクターＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）と比較してｓＣＴＬＡ－４の発現が２倍以上に増加していた（図１Ａ）。この結果と一致して、ヒトＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ２５ｈｉｇｈ（＜１％）エフェクターＴｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５＋ナイーブＴｒｅｇと比較して生体内でのｓＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡの発現が最も高かった（図１Ｂ）。ｓＣＴＬＡ－４とｍＣＴＬＡ－４の長期的な動態を調べるために、ＤＥＲＥＧ ＤＯ１１．１０ ＴＣＲトランスジェニック（Ｔｇ）マウスをＯＶＡ抗原で免疫し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞をインビボで刺激した。Ｔｒｅｇ中のｓＣＴＬＡ－４は免疫７日後に減少したが、免疫２１日後にはｓＣＴＬＡ－４の量は増加し、定常レベルを上回った（図１Ｃ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４が炎症の後期に必要とされ得ることを示唆している。さらに、喧嘩により皮膚に慢性的な傷を有する雄マウスは、無傷の雄マウスと比較してｓＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４を高発現していた（図１Ｄ）。これらの結果から、炎症条件において活性化ＴｒｅｇがｓＣＴＬＡ－４の転写・発現を一時的に停止させた後に、ｓＣＴＬＡ－４を増加させていることを示唆している。
【0088】
炎症状況におけるｓＣＴＬＡ－４の生体での機能を評価するためにｓＣＴＬＡ－４＋ ｍＣＴＬＡ－４－マウス（Ｓ＋Ｍ－マウス）を作製した（図１Ｅ）。簡潔に述べると、内在性ＣＴＬＡ－４遺伝子座のエクソン３の上流にあるスプライシングアクセプター部位を欠損させた。Ｓ＋Ｍ－マウスはタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルにおいてｍＣＴＬＡ－４を欠失したが、ｓＣＴＬＡ－４を発現していた（図１Ｆ～１Ｈ）。予想されたように、ｍＣＴＬＡ－４の欠損は、ｓＣＴＬＡ－４の存在下においても体重減少、脾臓およびリンパ節の肥大、ならびに自己抗体（抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ抗体および抗胃壁細胞抗体など）の血清中濃度の上昇を伴う致死的な自己免疫疾患を引き起こした（図１Ｉ～１Ｌ）。ｓＣＴＬＡ－４は従来のＳ－Ｍ－マウスにおいて観察される自己免疫疾患を防ぐことが出来なかったが、自己免疫病に伴う体重減少やリンパ球の増加を有意に抑制し、生存期間を有意に延長させた（図１Ｍ）。
【0089】
以上から、ｓＣＴＬＡ－４はｍＣＴＬＡ－４の欠損により引き起こされる自己免疫の重篤な表現型を緩和できるが、免疫恒常性の維持にはｍＣＴＬＡ－４が重要な役割を果たしていると結論付けた。これはｓＣＴＬＡ－４が炎症状況において重要であるが、ｍＣＴＬＡ－４とは異なる機序で働いていることを示唆している。
【0090】
ｓＣＴＬＡ－４はＭ２マクロファージの分化を促進する
ｍＣＴＬＡ－４とｓＣＴＬＡ－４がＣＤ８０／８６分子と相互作用するＭＹＰＰＰＹモチーフをｅｘｏｎ２に有していることを考慮して、抗原提示細胞（ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、およびＢ２２０＋細胞など）がＣＤ８０／８６を発現する割合を評価した。強い炎症を有しているにもかかわらず、Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ８０＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は増加していなかったが、Ｓ－Ｍ－マウスのＣＤ８０＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は炎症により増加していた（図２Ａ）。対照的に、ＣＤ１１ｃ＋またはＢ２２０＋細胞のＣＤ８０＋またはＣＤ８６＋サブセットにおいてはＳ＋Ｍ－マウスとＳ－Ｍ－マウスとの間に有意な差はなかったが、Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ８６＋Ｂ２２０＋細胞は増加していた（図２Ａ）。ｓＣＴＬＡ－４がＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型に影響を与えるか否かを調べるために、脾臓および腹腔内のＣＤ１１ｂ＋細胞のサイトカイン発現レベルをｑＰＣＲにより測定した。Ｓ＋Ｍ－マウスの脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞はＩＬ－４を最も高く発現していたが、Ｓ－Ｍ－マウスの脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞はＩＬ－６を最も高く発現していた（図２Ｂ）。また、Ｓ＋Ｍ－マウスから単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋腹腔マクロファージ（腹腔内ＣＤ１１ｂ＋細胞の主な集団である）は、Ｓ－Ｍ－マウスから単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋腹腔マクロファージよりも高いＩＬ－１０産生を示した（図２Ｃ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４が単球・マクロファージ・顆粒球を主としたＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型の変化に関与していることを示唆している。さらに、Ｓ＋Ｍ－マウスは、血清ＩＬ－１０のレベルが１．５倍高かった（図２Ｄ）。以上から、Ｓ＋Ｍ－マウスとＳ－Ｍ－マウスは、ともにリンパ球の過剰増殖および自己抗体を含む抗体産生を伴う自己免疫疾患を発症していたが、Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ１１ｂ＋サブセットの表現型は、ＣＤ８０、ＩＬ４、ＩＬ－６およびＩＬ－１０の発現に関してＳ－Ｍ－マウスとは異なっていた。
ｍＣＴＬＡ－４とｓＣＴＬＡ－４がＣＤ８０／８６分子と相互作用するＭＹＰＰＰＹモチーフをｅｘｏｎ２に有していることを考慮して、抗原提示細胞（ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、およびＢ２２０＋細胞など）がＣＤ８０／８６を発現する割合を評価した。強い炎症を有しているにもかかわらず、Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ８０＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は増加していなかったが、Ｓ－Ｍ－マウスのＣＤ８０＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は炎症により増加していた（図２Ａ）。対照的に、ＣＤ１１ｃ＋またはＢ２２０＋細胞のＣＤ８０＋またはＣＤ８６＋サブセットにおいてはＳ＋Ｍ－マウスとＳ－Ｍ－マウスとの間に有意な差はなかったが、Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ８６＋Ｂ２２０＋細胞は増加していた（図２Ａ）。ｓＣＴＬＡ－４がＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型に影響を与えるか否かを調べるために、脾臓および腹腔内のＣＤ１１ｂ＋細胞のサイトカイン発現レベルをｑＰＣＲにより測定した。Ｓ＋Ｍ－マウスの脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞はＩＬ－４を最も高く発現していたが、Ｓ－Ｍ－マウスの脾臓ＣＤ１１ｂ＋細胞はＩＬ－６を最も高く発現していた（図２Ｂ）。また、Ｓ＋Ｍ－マウスから単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋腹腔マクロファージ（腹腔内ＣＤ１１ｂ＋細胞の主な集団である）は、Ｓ－Ｍ－マウスから単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋腹腔マクロファージよりも高いＩＬ－１０産生を示した（図２Ｃ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４が単球・マクロファージ・顆粒球を主としたＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型の変化に関与していることを示唆している。さらに、Ｓ＋Ｍ－マウスは、血清ＩＬ－１０のレベルが１．５倍高かった（図２Ｄ）。以上から、Ｓ＋Ｍ－マウスとＳ－Ｍ－マウスは、ともにリンパ球の過剰増殖および自己抗体を含む抗体産生を伴う自己免疫疾患を発症していたが、Ｓ＋Ｍ－マウスのＣＤ１１ｂ＋サブセットの表現型は、ＣＤ８０、ＩＬ４、ＩＬ－６およびＩＬ－１０の発現に関してＳ－Ｍ－マウスとは異なっていた。
【0091】
ｓＣＴＬＡ－４の有無で、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージのトランスクリプトーム（全転写物）に違いがあるかＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。主座標分析（ＰＣｏＡ）と遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析により、Ｓ＋Ｍ－マウスのマクロファージが、例えば貪食、創傷治癒、細胞走化性および血管新生に関して、Ｓ－Ｍ－マウスのマクロファージとは異なる遺伝子発現プロファイルを有していることが確認された（図２Ｅ～２Ｈ）。Ｓ＋Ｍ－とＳ－Ｍ－マウスのマクロファージとの間で有意な差を示す発現変動遺伝子は、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージの働きや性質に重要な遺伝子を数多く含んでいた（図２Ｉ）。次に、Ｍ１／Ｍ２マクロファージを規定する確立されたマーカーを選択し、これらの遺伝子を比較した。Ｓ＋Ｍ－マウスのマクロファージは、Ｍ２マーカーとしてよく知られているＭｒｃ１（ＣＤ２０６をコードしている）、Ｒｅｔｎｌａ（Ｆｉｚｚ１）、Ａｒｇ１およびＹｍ１を高レベルで発現しており、Ｓ－Ｍ－マウスのマクロファージは、Ｍ１マーカーとして知られるＮＯＳ２（ｉＮＯＳ）、Ｉｌ６およびＴｎｆを高レベルで発現していた（図２Ｊ）。また、Ｍｒｃ１やＲｅｔｎｌａ以外にもマクロファージにおいてＩＬ－４やＩＬ－１３によって制御される典型的な遺伝子であるＦｃｇｒ２ｂ、Ｍｇｌ２、Ｃｌｅｃ７ａ、およびＩｇｆ１は、すべてＳ＋Ｍ－マウスのマクロファージにおいて有意に発現が高かった（図２Ｋ）。
【0092】
以上から、炎症状況におけるｓＣＴＬＡ－４の存在は、ＣＤ１１ｂ＋細胞の表現型に直接的または間接的に影響を与え、マクロファージをＭ２様の表現型に分化させた。
【0093】
ｓＣＴＬＡ－４は炎症状態においてＴｈ２と好酸球の循環を増加させる
ＩＬ－４は生体外および生体内でＭ２マクロファージを誘導するのに重要なサイトカインであるため、Ｓ＋Ｍ－マウスのＴｈ２サイトカイン発現を調べた。高い血中濃度のＩＬ－５およびＩＬ－４がＳ＋Ｍ－マウスにおいて検出され（図３Ａ）、血中のＩＬ－４／ＩＬ－５産生ＣＤ４＋Ｔ細胞がＳ＋Ｍ－マウスで有意に増加していた（図３Ｂ～３Ｃ）。対照的に、Ｓ－Ｍ－マウスの血中ではＩＬ－４／ＩＬ－５産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が著しく低かった。ＩＬ－５は好酸球の分化、遊走およびエフェクター機能に関与しているため、血中の好酸球の割合を評価した。好酸球は、Ｓ－Ｍ－マウスよりもＳ＋Ｍ－マウスの血中において有意に多く遊走していた（図３Ｄ）。好酸球はＴｈ２サイトカイン刺激に応答して成熟し、活性化に伴いより多くのＩＬ－４およびシグネチャー遺伝子であるＳｉｇｌｅｃ－Ｆを発現する。Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆはアポトーシスを誘導し、負のフィードバック様式で好酸球の過剰増加を抑制する。Ｓ＋Ｍ－マウスの組織浸潤性成熟好酸球ではＳｉｇｌｅｃ－Ｆが増加しており、Ｓ－Ｍ－マウスの２倍以上ＩＬ－４を発現していた（図３Ｅおよび３Ｆ）。というよりむしろ、Ｓ－Ｍ－マウスの好酸球では、Ｓ＋Ｍ－マウスおよびＳ＋Ｍ＋野生型マウスの好酸球と比較してＩＬ－４産生能が低下していた。Ｓ＋Ｍ－マウスにおいてＩＬ－４／ＩＬ－５産生ＣＤ４＋Ｔ細胞および循環好酸球が増加していることは、エオタキシン（ＣＣＬ１１）、ＣＣＬ２２およびＣＣＬ２４（これらはＴｈ２サイトカインにより増加し、Ｔｈ１サイトカインにより減少する）のレベルがＳ－Ｍ－マウスと比較してＳ＋Ｍ－マウスにおいて有意に高かったという観察結果と一致する（図３Ｇおよび３Ｈ）。この結果は、炎症下のＴｈ２サイトカインの増加とＴｈ１サイトカインの抑制により、Ｔｈ２、ＩＬ－４産生好酸球および更なるＴｈ２サイトカインの循環が増加することを示唆している。次いで、Ｔｈ２や好酸球が集積しやすい肺の肺胞マクロファージの表現型を評価した。Ｓ＋Ｍ－マウスの肺胞マクロファージではＣＤ２０６の発現が有意に増加しており、Ｍ２様の表現型を示していた。この結果から、Ｓ＋Ｍ－マウスでは、腹腔だけでなく、肺においてもＭ２マクロファージへの分化偏向が見られた（図３Ｉ）。
ＩＬ－４は生体外および生体内でＭ２マクロファージを誘導するのに重要なサイトカインであるため、Ｓ＋Ｍ－マウスのＴｈ２サイトカイン発現を調べた。高い血中濃度のＩＬ－５およびＩＬ－４がＳ＋Ｍ－マウスにおいて検出され（図３Ａ）、血中のＩＬ－４／ＩＬ－５産生ＣＤ４＋Ｔ細胞がＳ＋Ｍ－マウスで有意に増加していた（図３Ｂ～３Ｃ）。対照的に、Ｓ－Ｍ－マウスの血中ではＩＬ－４／ＩＬ－５産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が著しく低かった。ＩＬ－５は好酸球の分化、遊走およびエフェクター機能に関与しているため、血中の好酸球の割合を評価した。好酸球は、Ｓ－Ｍ－マウスよりもＳ＋Ｍ－マウスの血中において有意に多く遊走していた（図３Ｄ）。好酸球はＴｈ２サイトカイン刺激に応答して成熟し、活性化に伴いより多くのＩＬ－４およびシグネチャー遺伝子であるＳｉｇｌｅｃ－Ｆを発現する。Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆはアポトーシスを誘導し、負のフィードバック様式で好酸球の過剰増加を抑制する。Ｓ＋Ｍ－マウスの組織浸潤性成熟好酸球ではＳｉｇｌｅｃ－Ｆが増加しており、Ｓ－Ｍ－マウスの２倍以上ＩＬ－４を発現していた（図３Ｅおよび３Ｆ）。というよりむしろ、Ｓ－Ｍ－マウスの好酸球では、Ｓ＋Ｍ－マウスおよびＳ＋Ｍ＋野生型マウスの好酸球と比較してＩＬ－４産生能が低下していた。Ｓ＋Ｍ－マウスにおいてＩＬ－４／ＩＬ－５産生ＣＤ４＋Ｔ細胞および循環好酸球が増加していることは、エオタキシン（ＣＣＬ１１）、ＣＣＬ２２およびＣＣＬ２４（これらはＴｈ２サイトカインにより増加し、Ｔｈ１サイトカインにより減少する）のレベルがＳ－Ｍ－マウスと比較してＳ＋Ｍ－マウスにおいて有意に高かったという観察結果と一致する（図３Ｇおよび３Ｈ）。この結果は、炎症下のＴｈ２サイトカインの増加とＴｈ１サイトカインの抑制により、Ｔｈ２、ＩＬ－４産生好酸球および更なるＴｈ２サイトカインの循環が増加することを示唆している。次いで、Ｔｈ２や好酸球が集積しやすい肺の肺胞マクロファージの表現型を評価した。Ｓ＋Ｍ－マウスの肺胞マクロファージではＣＤ２０６の発現が有意に増加しており、Ｍ２様の表現型を示していた。この結果から、Ｓ＋Ｍ－マウスでは、腹腔だけでなく、肺においてもＭ２マクロファージへの分化偏向が見られた（図３Ｉ）。
【0094】
Ｓ＋Ｍ－とＳ－Ｍ－マウスのマクロファージの表現型の差異が、単にＴｈ２サイトカインの発現の差異によるものであるのか否かを調べた。Ｓ－Ｍ－マウスから単離した脾臓マクロファージをインビトロにおいてＩＬ－４およびＩＬ－１０で処理すると、マクロファージのＣＤ８０が減少し、ＣＤ２０６が増加した（図３Ｊ）。この結果は、Ｓ＋Ｍ－マウスから単離したＣＤ１１ｂ＋細胞がＣＤ８０ｌｏｗおよびＣＤ２０６ｈｉｇｈの表現型を示した観察結果と一致する。最後に、ＩＬ－４／ＩＬ－５を過剰産生するＩＬＣ２（２型自然リンパ球）、好塩基球またはマスト細胞が、Ｓ＋Ｍ－マウスにおいて増加していた可能性を排除するために、これらの細胞の２型免疫応答を促進するＩＬ３３／ＴＳＬＰ血中濃度と細胞の割合について評価した。血清ＩＬ－３３およびＴＳＬＰはＳ＋Ｍ－マウスおよびＳ－Ｍ－マウスの両方において抑制され（図３Ｋおよび３Ｌ）、Ｓ＋Ｍ－マウスの血中および腸間膜中のＬｉｎ－ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ ＩＬＣ（自然リンパ球の共通マーカー）の割合は減少しており（図３Ｍおよび３Ｎ：Ｓ＋Ｍ－マウスのＧＡＴＡ３＋ＩＬＣ細胞は検出できなかった）、Ｓ＋Ｍ－マウスの好塩基球またはｃ－ｋｉｔ＋細胞は増加していなかった（図３Ｏ）
【0095】
これらのデータは、炎症下でＩＬ－４／ＩＬ－５産生Ｔｈ２細胞の増加およびＩＬ－４ｈｉｇｈ浸潤性好酸球の増加が、マクロファージの表現型変化に影響を与えることを示唆している。
【0096】
ｓＣＴＬＡ－４はＴｈ１とＴｈ２の分化偏向に作用する
ｓＣＴＬＡ－４によって制御される利用可能なＣＤ８０／８６分子の量が、Ｔｈ１およびＴｈ２の分化に影響を与えるか否かを評価した。まずは、ＣＤ８０／８６共刺激の一方または両方を阻害する抗体を用いると、Ｔｈ１分化はフリーのＣＤ８０／８６分子の数に大きく依存していたが、Ｔｈ２の分化は依存しないことが分かった（図４Ａおよび４Ｂ）。面白いことに、ＣＤ８６をブロックすることによってＴｈ２の分化が有意に促進された（図４Ｂ）。ｓＣＴＬＡ－４が生体内においてＴｈ１とＴｈ２の割合を変化させているという仮説に基づいて、Ｔｈ細胞分化におけるｓＣＴＬＡ－４の生理的役割を明らかにするために、野生型のｓＣＴＬＡ－４組換えタンパク質およびＣＤ８０／８６に結合できない変異型ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ組換えタンパク質を作製した。抗ＣＤ８０／８６抗体と同様に、インビトロでの組換えｓＣＴＬＡ－４の添加はＴｈ１分化を用量依存的に阻害し、逆に高い濃度では有意にＴｈ２分化を促進した（図４Ｃ～４Ｆ）。以上から、ｓＣＴＬＡ－４は抗ＣＤ８０／８６抗体と同様の機能を有しており、ｓＣＴＬＡ－４によるＣＤ８０／８６分子のブロックはＴｈ１分化を抑制する。また、ｓＣＴＬＡ－４は、十分なＴＣＲ刺激下ではＴｈ２分化に影響しないどころか、Ｔｈ２分化を促進することが示唆された。最後に、Ｓ＋Ｍ－マウスで増加したｓＣＴＬＡ－４が単球／マクロファージを直接作用してＭ２マクロファージに分化させた可能性を排除するために、単球／マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７をｓＣＴＬＡ－４で処理した。その結果、ｓＣＴＬＡ－４自体は、ＩＬ－４およびＩＬ－１０とは異なり、Ｍ２マクロファージの分化に有意な影響を与えなかった（図４Ｇ）。
ｓＣＴＬＡ－４によって制御される利用可能なＣＤ８０／８６分子の量が、Ｔｈ１およびＴｈ２の分化に影響を与えるか否かを評価した。まずは、ＣＤ８０／８６共刺激の一方または両方を阻害する抗体を用いると、Ｔｈ１分化はフリーのＣＤ８０／８６分子の数に大きく依存していたが、Ｔｈ２の分化は依存しないことが分かった（図４Ａおよび４Ｂ）。面白いことに、ＣＤ８６をブロックすることによってＴｈ２の分化が有意に促進された（図４Ｂ）。ｓＣＴＬＡ－４が生体内においてＴｈ１とＴｈ２の割合を変化させているという仮説に基づいて、Ｔｈ細胞分化におけるｓＣＴＬＡ－４の生理的役割を明らかにするために、野生型のｓＣＴＬＡ－４組換えタンパク質およびＣＤ８０／８６に結合できない変異型ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａ組換えタンパク質を作製した。抗ＣＤ８０／８６抗体と同様に、インビトロでの組換えｓＣＴＬＡ－４の添加はＴｈ１分化を用量依存的に阻害し、逆に高い濃度では有意にＴｈ２分化を促進した（図４Ｃ～４Ｆ）。以上から、ｓＣＴＬＡ－４は抗ＣＤ８０／８６抗体と同様の機能を有しており、ｓＣＴＬＡ－４によるＣＤ８０／８６分子のブロックはＴｈ１分化を抑制する。また、ｓＣＴＬＡ－４は、十分なＴＣＲ刺激下ではＴｈ２分化に影響しないどころか、Ｔｈ２分化を促進することが示唆された。最後に、Ｓ＋Ｍ－マウスで増加したｓＣＴＬＡ－４が単球／マクロファージを直接作用してＭ２マクロファージに分化させた可能性を排除するために、単球／マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７をｓＣＴＬＡ－４で処理した。その結果、ｓＣＴＬＡ－４自体は、ＩＬ－４およびＩＬ－１０とは異なり、Ｍ２マクロファージの分化に有意な影響を与えなかった（図４Ｇ）。
【0097】
以上から、ｓＣＴＬＡ－４はＴＣＲの刺激が十分であってもＴｈ１分化を抑制し、Ｔｈ２分化を促進する機能を有しており、Ｍ２マクロファージの分化を間接的に促進すると結論付けた。
【0098】
ｓＣＴＬＡ－４は腸内および腫瘍環境においてＴｈ１炎症を妨げる
腸間膜リンパ節およびパイエル板中のＣＤ４＋Ｔ細胞は健常状態において他の体表リンパ節（鼠径リンパ節など）と比較してｓＣＴＬＡ－４を２倍以上発現していた（図５Ａ）。さらに、ｓＣＴＬＡ－４を欠損したＳ－Ｍ－マウスは、Ｓ＋Ｍ－マウスと比較して３週齢において大腸が有意に短く、体重が著しく減少しており、大腸組織にリンパ球浸潤性の小病巣が発生していた（図５Ｂ～Ｄおよび図１Ｉ）。このことから、ｓＣＴＬＡ－４が生体内で腸間膜リンパ節中のＴｈ１細胞および大腸マクロファージの分化制御に影響を与えているか否かを調べた。Ｓ－Ｍ－マウスの腸間膜リンパ節中のＴｈ１細胞およびＴｈ１７細胞の数は、ｓＣＴＬＡ－４の欠失により有意に増加していた（図５Ｅ）。さらに、Ｓ－Ｍ－マウスから単離した大腸マクロファージは、ＩＦＮγ産生Ｔｈ１の増加に伴ってｉＮＯＳおよびＩＬ－６が高発現しており（これはＭ１様の表現型を示している）、Ｓ＋Ｍ－マウスから単離した大腸マクロファージではＣＤ２０６およびＦｉｚｚ１が高く発現していた（これはＭ２様の表現型を示している）（図５Ｆ）。この結果から、同じｍＣＴＬＡ－４欠損により生じた自己免疫病マウスでも、ｓＣＴＬＡ－４を有していると、腸管でのＴｈ１やＭ１マクロファージの分化が抑制されることが示唆された。また、Ｓ＋Ｍ－マウスでは、腹腔や肺だけでなく、腸管においてもＭ２マクロファージへの分化偏向が起きていることが分かった。
腸間膜リンパ節およびパイエル板中のＣＤ４＋Ｔ細胞は健常状態において他の体表リンパ節（鼠径リンパ節など）と比較してｓＣＴＬＡ－４を２倍以上発現していた（図５Ａ）。さらに、ｓＣＴＬＡ－４を欠損したＳ－Ｍ－マウスは、Ｓ＋Ｍ－マウスと比較して３週齢において大腸が有意に短く、体重が著しく減少しており、大腸組織にリンパ球浸潤性の小病巣が発生していた（図５Ｂ～Ｄおよび図１Ｉ）。このことから、ｓＣＴＬＡ－４が生体内で腸間膜リンパ節中のＴｈ１細胞および大腸マクロファージの分化制御に影響を与えているか否かを調べた。Ｓ－Ｍ－マウスの腸間膜リンパ節中のＴｈ１細胞およびＴｈ１７細胞の数は、ｓＣＴＬＡ－４の欠失により有意に増加していた（図５Ｅ）。さらに、Ｓ－Ｍ－マウスから単離した大腸マクロファージは、ＩＦＮγ産生Ｔｈ１の増加に伴ってｉＮＯＳおよびＩＬ－６が高発現しており（これはＭ１様の表現型を示している）、Ｓ＋Ｍ－マウスから単離した大腸マクロファージではＣＤ２０６およびＦｉｚｚ１が高く発現していた（これはＭ２様の表現型を示している）（図５Ｆ）。この結果から、同じｍＣＴＬＡ－４欠損により生じた自己免疫病マウスでも、ｓＣＴＬＡ－４を有していると、腸管でのＴｈ１やＭ１マクロファージの分化が抑制されることが示唆された。また、Ｓ＋Ｍ－マウスでは、腹腔や肺だけでなく、腸管においてもＭ２マクロファージへの分化偏向が起きていることが分かった。
【0099】
ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＣＤ４＋ Ｔ細胞をＳＣＩＤマウスに養子移入することで誘導される炎症性腸疾患（ＩＢＤ）はエフェクターＴｈ１細胞の分化が関与している。Ｓ＋Ｍ－ ＴｒｅｇまたはＳ－Ｍ－ Ｔｒｅｇ（両者の差異はｓＣＴＬＡ－４の有無）を、ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞とともにＳＣＩＤマウスに移入することで、ｓＣＴＬＡ－４の生体内でのＴｈ１抑制機能を検証した。Ｓ＋Ｍ－ Ｔｒｅｇの同時移入ではマウスを大腸炎の発症から保護できたが、Ｓ－Ｍ－ Ｔｒｅｇの同時移入は、大腸炎を抑制できなかった（図５Ｇ～Ｉ）。このＳ－Ｍ－ Ｔｒｅｇの同時移入マウスは著しい体重減少、顕著な大腸上皮細胞過形成および大腸炎疾患スコアの上昇を示した（図５Ｇ～５Ｉ）。次に、野生型ｓＣＴＬＡ－４または変異型ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａを分泌するＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞株を作製した。ｓＣＴＬＡ－４ Ｙ１３９Ａを分泌するＢ１６Ｆ１０黒色腫株はＣＤ８０／８６分子をブロックする能力を持たない。これらのＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞株をＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに皮下投与し、ｓＣＴＬＡ－４が、ＩＦＮγ依存的抗腫瘍免疫に影響を与えるか評価した。腫瘍微小環境でＴｒｅｇにより分泌されるｓＣＴＬＡ－４を模倣したｓＣＴＬＡ－４産生黒色腫は、ヌードマウス（Ｔ細胞欠損マウス）を用いた試験と同様に、急速な腫瘍増殖を示した（図５Ｊおよび５Ｋ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４産生黒色腫がＴ細胞依存的抗腫瘍免疫を抑制したことを示唆している。この結果と一致して、腫瘍環境中のｓＣＴＬＡ－４はＩＦＮγ産生を有意に抑制していたことが分かった（図５Ｌ）。ＩＦＮγの抑制は、腫瘍組織中のＣＤ２０６ｈｉｇｈ Ｍ２様腫瘍マクロファージ（ＴＡＭ）の顕著な増加を伴っていた（図５Ｍ）。
【0100】
以上から、生体内炎症環境におけるｓＣＴＬＡ－４のＴｈ１阻害は、Ｍ２マクロファージの分化を促進していた。
【0101】
ｓＣＴＬＡ－４は健常状態においてＩＦＮγ産生Ｔ細胞の自発的な分化および自己抗体の産生を防ぐ
より健常状態に近い状態におけるｓＣＴＬＡ－４の機能を調べるために、Ｓ－Ｍ＋（ｓＣＴＬＡ－４ ＫＯ）マウスを作製した（図６Ａ）。このマウスは、ｍＣＴＬＡ－４のみ（ｍＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡおよびタンパク質）を野生型マウスと同じレベルで発現する（図６Ｂおよび６Ｃ）。ＣＤ４４＋ＣＤ８＋エフェクター・メモリー型Ｔ細胞の割合は、脾臓およびリンパ節において齢とともに徐々に増加し、２４週齢では８週齢の２倍以上となり（図６Ｄ）、ＣＤ４４＋ＣＤ４＋エフェクター・メモリー型Ｔ細胞の割合はリンパ節で増加していたことから（図６Ｅ）、３０週齢において野生型マウスと比較することにした。ｍＣＴＬＡ－４を欠損したマウスと比較して、Ｓ－Ｍ＋マウスは正常な外観を示し、３０週齢においても脾臓およびリンパ節の肥大を示さなかった（図６Ｆ～６Ｈ）。しかし、３０週齢Ｓ－Ｍ＋マウスは脂肪組織に異所性リンパ節構造を示し、肺組織に白血球浸潤が認められた（図６Ｉ）。また、Ｓ－Ｍ＋マウスでは、３０週齢において自己抗体である抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ、抗胃壁細胞ＩｇＧ、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αのレベルがＳ＋Ｍ＋マウスよりも著しく高かった（図６Ｊ）。さらに、Ｓ－Ｍ＋マウスの腹腔から単離したマクロファージは、ｉＮＯＳおよびＩＬ－６を有意に高発現していた（図６Ｋ）。この結果は、Ｓ－Ｍ＋マウスの腹腔マクロファージがＭ１様の表現型を有していることを示している。上述の観察と一致するように、ｓＣＴＬＡ－４の欠損は、脾臓、腸間膜リンパ節および体表リンパ節におけるＩＦＮγ産生ＣＤ８＋ Ｅｏｍｅｓ＋エフェクター／メモリーＴ細胞およびＩＦＮγ産生ＣＤ４＋ Ｔｈ１細胞の顕著な増加をもたらした（図６Ｌおよび６Ｍ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４の欠損が加齢に伴って１型免疫の制御異常を引き起こし、前臨床的な自己免疫をもたらすことを示唆している。
より健常状態に近い状態におけるｓＣＴＬＡ－４の機能を調べるために、Ｓ－Ｍ＋（ｓＣＴＬＡ－４ ＫＯ）マウスを作製した（図６Ａ）。このマウスは、ｍＣＴＬＡ－４のみ（ｍＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡおよびタンパク質）を野生型マウスと同じレベルで発現する（図６Ｂおよび６Ｃ）。ＣＤ４４＋ＣＤ８＋エフェクター・メモリー型Ｔ細胞の割合は、脾臓およびリンパ節において齢とともに徐々に増加し、２４週齢では８週齢の２倍以上となり（図６Ｄ）、ＣＤ４４＋ＣＤ４＋エフェクター・メモリー型Ｔ細胞の割合はリンパ節で増加していたことから（図６Ｅ）、３０週齢において野生型マウスと比較することにした。ｍＣＴＬＡ－４を欠損したマウスと比較して、Ｓ－Ｍ＋マウスは正常な外観を示し、３０週齢においても脾臓およびリンパ節の肥大を示さなかった（図６Ｆ～６Ｈ）。しかし、３０週齢Ｓ－Ｍ＋マウスは脂肪組織に異所性リンパ節構造を示し、肺組織に白血球浸潤が認められた（図６Ｉ）。また、Ｓ－Ｍ＋マウスでは、３０週齢において自己抗体である抗ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ、抗胃壁細胞ＩｇＧ、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αのレベルがＳ＋Ｍ＋マウスよりも著しく高かった（図６Ｊ）。さらに、Ｓ－Ｍ＋マウスの腹腔から単離したマクロファージは、ｉＮＯＳおよびＩＬ－６を有意に高発現していた（図６Ｋ）。この結果は、Ｓ－Ｍ＋マウスの腹腔マクロファージがＭ１様の表現型を有していることを示している。上述の観察と一致するように、ｓＣＴＬＡ－４の欠損は、脾臓、腸間膜リンパ節および体表リンパ節におけるＩＦＮγ産生ＣＤ８＋ Ｅｏｍｅｓ＋エフェクター／メモリーＴ細胞およびＩＦＮγ産生ＣＤ４＋ Ｔｈ１細胞の顕著な増加をもたらした（図６Ｌおよび６Ｍ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４の欠損が加齢に伴って１型免疫の制御異常を引き起こし、前臨床的な自己免疫をもたらすことを示唆している。
【0102】
炎症促進性のＭ１から炎症抑制性のＭ２マクロファージの表現型移行を阻害すると、組織修復に好ましくない結果となる。このため、炎症時の１型免疫（Ｔｈ１、Ｍ１型）の抑制および２型免疫（Ｔｈ２、Ｍ２型）の促進に対するｓＣＴＬＡ－４の寄与が、皮膚切除創傷モデルを用いた創傷治癒プロセスを促進できるか評価した。１２週齢Ｓ－Ｍ＋マウスは、創傷後１、３および５日目においてＳ＋Ｍ＋対照マウスと比較して創傷閉鎖が一貫して遅延していた（図６Ｎ）。外傷の観察と一致するように、１２週齢Ｓ－Ｍ＋マウスでは、創傷下の（表皮基底層に位置する）Ｋ１４＋ケラチノサイトの遊走を伴う再上皮化プロセスが有意に障害されていた（図６Ｏ）。一方、ｓＣＴＬＡ－４を有する対照マウスでは、創傷は創傷後５日目には再上皮化によりほとんど閉鎖していた（図６Ｎおよび６Ｏ）。自己免疫を伴う３０週齢のＳ－Ｍ＋マウスと、Ｓ＋Ｍ＋マウスの比較によっても同様の観察を得て、ｓＣＴＬＡ－４の組織修復プロセスへの重要性を確認した（図６Ｐおよび６Ｑ）。上述しているとおり、３０週齢のＳ－Ｍ＋マウスではＴｈ１およびＩＦＮγ＋ＣＤ８＋細胞が著しく増加していたため、１２週齢と３０週齢のＳ－Ｍ＋マウスの創傷閉鎖をさらに比較した。創傷後１日目および３日目の創傷部に大きな差はなかったが、５日目では１２週齢のＳ－Ｍ＋マウスと比較して３０週齢のＳ－Ｍ＋マウスにおいて創傷閉鎖が有意に遅延していた（図６Ｒ）。これらの結果から、ｓＣＴＬＡ－４は炎症の終焉に重要な組織修復およびリモデリングを促進していた。
【0103】
以上から、Ｓ－Ｍ＋マウスのデータおよび皮膚創傷後の創傷閉鎖および再上皮化プロセスのｓＣＴＬＡ－４による促進は、ｓＣＴＬＡ－４がＴｈ１分化の抑制およびマクロファージ分化の偏向（Ｍ１→Ｍ２）に作用していると言う結論を支持している。
【0104】
ｓＣＴＬＡ－４は、Ｔｆｈとアレルゲン反応性Ｔｈ２の分化およびＩｇＥの産生を抑制する
Ｓ－Ｍ＋マウスでは、ＩｇＥの値が高レベルであった（図７Ａ）が、Ｓ－Ｍ＋マウスのリンパ節にＩＬ－４産生Ｔｈ２細胞は検出されなかった（データは示していない）。Ｔｈ２ではなくＴｆｈ細胞由来のＩＬ－４がＩｇＥのクラススイッチに重要であることが報告されている。また、Ｔｆｈは、分化のためにＣＤ８０／８６要求性が高いことが報告されている。そこで、ｓＣＴＬＡ－４が生体内でＴｆｈ分化に影響を与えているのか否かを調べた。ｓＣＴＬＡ－４の欠損は、パイエル板および腸間膜リンパ節におけるＢｃｌ６＋ＰＤ１＋ＣＸＣＲ５＋Ｔｆｈ細胞の割合を増加させ、腸間膜リンパ節におけるＣＤ３８－ＧＬ７＋ＩｇＤ－ＩｇＭ－胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞の割合を増加させた（図７Ｂおよび７Ｃ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４が健常状態でパイエル板および腸間膜リンパ節において高レベルで発現していることを考慮すると、ｓＣＴＬＡ－４はＴｆｈ細胞の分化制御に重要な役割を果たしていることが示唆される（図５Ａ）。
Ｓ－Ｍ＋マウスでは、ＩｇＥの値が高レベルであった（図７Ａ）が、Ｓ－Ｍ＋マウスのリンパ節にＩＬ－４産生Ｔｈ２細胞は検出されなかった（データは示していない）。Ｔｈ２ではなくＴｆｈ細胞由来のＩＬ－４がＩｇＥのクラススイッチに重要であることが報告されている。また、Ｔｆｈは、分化のためにＣＤ８０／８６要求性が高いことが報告されている。そこで、ｓＣＴＬＡ－４が生体内でＴｆｈ分化に影響を与えているのか否かを調べた。ｓＣＴＬＡ－４の欠損は、パイエル板および腸間膜リンパ節におけるＢｃｌ６＋ＰＤ１＋ＣＸＣＲ５＋Ｔｆｈ細胞の割合を増加させ、腸間膜リンパ節におけるＣＤ３８－ＧＬ７＋ＩｇＤ－ＩｇＭ－胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞の割合を増加させた（図７Ｂおよび７Ｃ）。この結果は、ｓＣＴＬＡ－４が健常状態でパイエル板および腸間膜リンパ節において高レベルで発現していることを考慮すると、ｓＣＴＬＡ－４はＴｆｈ細胞の分化制御に重要な役割を果たしていることが示唆される（図５Ａ）。
【0105】
ｓＣＴＬＡ－４は炎症状態ではＴｈ１分化を抑制することでＴｈ２分化を促進し、健常状態ではＴｈ１やＴｆｈ細胞の自発的な分化と増加を抑制していた。アレルゲン反応性Ｔｈ２細胞に依存する喘息実験モデルを用いてｓＣＴＬＡ－４がアレルギーの進行に抑制的に働くか否か調べた。８週齢の健常な（ＩＦＮγ＋産生Ｔ細胞が増加していない）Ｓ－Ｍ＋マウスまたはＳ＋Ｍ＋マウスをＯＶＡとアジュバント混合物の腹腔内投与（ｉ．ｐ．）により感作し、次にＯＶＡ溶液を外科的気管内注入（ｉ．ｔ．）し、ＯＶＡ反応性Ｔｈ２細胞を刺激することで喘息を誘導した。Ｓ－Ｍ＋マウスは、Ｓ＋Ｍ＋マウスと比較して肺組織により多くのＴｈ２細胞、好酸球およびＭ２肺胞マクロファージを有していた（図７Ｄ～７Ｇ）。これは、健常状態下の早期炎症において、ｓＣＴＬＡ－４がのＴｈ２分化の促進物ではなく、アレルゲン反応性ナイーブＴ細胞の活性化閾値（Ｔｈ２への分化を抑制する力）として機能していることを示唆している。重要なことは、Ｍ２マクロファージの分化は、ｓＣＴＬＡ－４の非存在下においても、Ｔｈ２および好酸球の増加により促進されていた（図７Ｆ）。これらの結果により、非炎症状態でＣＤ８０／８６の量が少ない場合（健常状態では抗原提示細胞の数も少なくＣＤ８０／８６の発現も低い）、ｓＣＴＬＡ－４はＣＤ８０／８６を十分にブロックでき、Ｔｈ２細胞の分化をも妨げることが分かった。これはｓＣＴＬＡ－４を有するＳ＋Ｍ＋マウスで観察されたように、ｓＣＴＬＡ－４はアレルギーの発症を遅延もしくは抑制出来ることを示唆する。
【0106】
結論として、ｓＣＴＬＡ－４は非炎症状態および炎症状態の両方においてナイーブＴ細胞およびエフェクターＴ細胞の活性化閾値を上昇させ、ヘルパーＴ細胞とマクロファージの分化偏向のバランスを調節する。健常状態において自己免疫およびアレルギーを抑制し、炎症状態において Ｔｈ２・Ｍ２マクロファージ分化および組織修復／リモデリングを促進することで炎症を軽減または鎮静化する。
【0107】
本明細書に記載の通り、ｓＣＴＬＡ－４はＣＤ８０／８６を介したナイーブＴ細胞のエフェクターＴ細胞への分化を制限し、炎症時の持続的な共刺激（ＣＤ２８－ＣＤ８０／８６相互作用）を妨げることにより、ヘルパーＴ細胞の分化偏向を調節するという特有の能力を有する。また、ｓＣＴＬＡ－４が炎症状態におけるＭ２マクロファージの分化に重要な役割を果たしており、炎症の鎮静化に関与することも実証された。さらに、ｓＣＴＬＡ－４が豊富な腫瘍環境では大量のＭ２腫瘍マクロファージとともに腫瘍増殖が促進されたが、健常な状態ではｓＣＴＬＡ－４はリンパ組織における自発的な自己抗体産生ならびにＴｈ１、Ｔｆｈ、Ｔｈ１７およびＴｈ２の異常分化を妨げた。これらの結果は、ｓＣＴＬＡ－４の機能障害または過剰産生が自己免疫疾患、腫瘍およびアレルギーなどの様々な病態に幅広く関与することを示している。これらの知見は、ｓＣＴＬＡ－４組換えタンパク質もしくは阻害物質が治療物質として有用であることを支持する。
【0108】
（炎症性腸疾患の治療）
ＩＢＤなどの炎症性腸疾患を、ＳＣＩＤマウスにＣＤ４５ＲＢ高陽性のナイーブＴ細胞を養子移入することで誘導する。観察期間中、リコンビナント分泌型ＣＴＬＡ－４を定期的に腹腔投与し、炎症性腸疾患の進行や程度を複数のパラメーターで測定する。体重は週ごとに測定する。観察期間が終わった後、大腸を病理組織学的に解析し、病理スコアで分泌型ＣＴＬＡ－４の効果を評価する。また同時に、腸管リンパ節におけるＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の増殖がどの程度あったかをＦＡＣＳにより測定し、分泌型ＣＴＬＡ－４の効果を評価する。分泌型ＣＴＬＡ－４の効果が見られた場合、体重減少の抑制、病理スコアの低下、そしてＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の増殖抑制が見られる。
ＩＢＤなどの炎症性腸疾患を、ＳＣＩＤマウスにＣＤ４５ＲＢ高陽性のナイーブＴ細胞を養子移入することで誘導する。観察期間中、リコンビナント分泌型ＣＴＬＡ－４を定期的に腹腔投与し、炎症性腸疾患の進行や程度を複数のパラメーターで測定する。体重は週ごとに測定する。観察期間が終わった後、大腸を病理組織学的に解析し、病理スコアで分泌型ＣＴＬＡ－４の効果を評価する。また同時に、腸管リンパ節におけるＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の増殖がどの程度あったかをＦＡＣＳにより測定し、分泌型ＣＴＬＡ－４の効果を評価する。分泌型ＣＴＬＡ－４の効果が見られた場合、体重減少の抑制、病理スコアの低下、そしてＩＦＮγ産生型ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の増殖抑制が見られる。
【0109】
（アレルギー疾患の治療）
喘息アレルギー疾患を、マウスに卵白アルブミンを用い、感作・誘導する。観察期間中、リコンビナント分泌型ＣＴＬＡ－４を定期的に腹腔投与し、最終的なアレルギーの進行や程度を複数のパラメーターで測定する。分泌型ＣＴＬＡ－４が、Ｔｈ２分化や好酸球の集積を遅らせるか評価するために、肺組織懸濁液や気管支肺胞洗浄液のＦＡＣＳ解析、および肺の病理組織学的解析を行う。分泌型ＣＴＬＡ－４の効果が見られた場合、上記のＴｈ２分化や好酸球の集積が抑制される。
喘息アレルギー疾患を、マウスに卵白アルブミンを用い、感作・誘導する。観察期間中、リコンビナント分泌型ＣＴＬＡ－４を定期的に腹腔投与し、最終的なアレルギーの進行や程度を複数のパラメーターで測定する。分泌型ＣＴＬＡ－４が、Ｔｈ２分化や好酸球の集積を遅らせるか評価するために、肺組織懸濁液や気管支肺胞洗浄液のＦＡＣＳ解析、および肺の病理組織学的解析を行う。分泌型ＣＴＬＡ－４の効果が見られた場合、上記のＴｈ２分化や好酸球の集積が抑制される。
【0110】
（創傷治癒）
マウスの背部に生検パンチを用い、傷を作成する。観察期間中、リコンビナント分泌型ＣＴＬＡ－４を定期的に創傷部位に塗布または腹腔投与し、創傷治癒の進行や程度を複数のパラメーターで測定する。傷の大きさは、毎日測定する。加えて創傷後の再上皮化プロセスを、Ｋ１４＋表皮基底角化細胞がどれだけ創傷部位を覆ったかによって再上皮化を定量する。分泌型ＣＴＬＡ－４の効果が見られた場合、創傷治癒が促進され、創傷部位がより早く小さくなることに加えて、再上皮化プロセスも促進される。
マウスの背部に生検パンチを用い、傷を作成する。観察期間中、リコンビナント分泌型ＣＴＬＡ－４を定期的に創傷部位に塗布または腹腔投与し、創傷治癒の進行や程度を複数のパラメーターで測定する。傷の大きさは、毎日測定する。加えて創傷後の再上皮化プロセスを、Ｋ１４＋表皮基底角化細胞がどれだけ創傷部位を覆ったかによって再上皮化を定量する。分泌型ＣＴＬＡ－４の効果が見られた場合、創傷治癒が促進され、創傷部位がより早く小さくなることに加えて、再上皮化プロセスも促進される。
【0111】
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【0112】
本開示の医薬組成物は様々な自己免疫疾患、アレルギー、創傷などの炎症性疾患の治療や予防のために用いることができる。また本開示の医薬組成物は、生体に適用した場合にも、副作用がなく、安全に免疫抑制を誘導することができ、医療分野への応用が期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【0113】
配列番号１：sCTLA-4特異的アミノ酸のペプチド配列
配列番号２～３：マウスsCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号４：TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）
配列番号５～６：マウスmCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号７：TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）
配列番号８～９：ヒトsCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号１０～１１：ヒトmCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号１２～１３：ヒトHPRT1のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号１４：ＭＹＰＰＰＹモチーフ
配列番号１５：変異ＭＹＰＰＰＹモチーフ
配列番号１６：WTsCTLA-4のアミノ酸配列
配列番号２～３：マウスsCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号４：TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）
配列番号５～６：マウスmCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号７：TaqManプローブ（FAMNFQ-MGB）
配列番号８～９：ヒトsCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号１０～１１：ヒトmCTLA-4のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号１２～１３：ヒトHPRT1のフォワードおよびリバースプライマー配列
配列番号１４：ＭＹＰＰＰＹモチーフ
配列番号１５：変異ＭＹＰＰＰＹモチーフ
配列番号１６：WTsCTLA-4のアミノ酸配列
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図1J】
【図1K】
【図1L】
【図1M】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図2K】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図3K】
【図3L】
【図3M】
【図3N】
【図3O】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図5J】
【図5K】
【図5L】
【図5M】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図6J】
【図6K】
【図6L】
【図6M】
【図6N】
【図6O】
【図6P】
【図6Q】
【図6R】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【図7I】
【図7J】
【配列表】