知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
2025-186395ＮＫｐ４６に結合するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞エンゲージャー及びＦＣエンジニアリングを有するＢＣＭＡ変異体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025186395
(43)【公開日】2025-12-23
(54)【発明の名称】ＮＫｐ４６に結合するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞エンゲージャー及びＦＣエンジニアリングを有するＢＣＭＡ変異体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20251216BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20251216BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20251216BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20251216BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20251216BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20251216BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20251216BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20251216BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20251216BHJP
A61K 40/33 20250101ALI20251216BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20251216BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20251216BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20251216BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20251216BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20251216BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20251216BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20251216BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20251216BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12P21/08
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61K40/33
A61K47/55
A61K47/68
A61P35/00
A61K48/00
C07K16/28
C07K16/30
C12N15/13
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】35
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2025153938
(22)【出願日】2025-09-17
(62)【分割の表示】P 2024569737の分割
【原出願日】2023-05-26
(31)【優先権主張番号】22305783.7
(32)【優先日】2022-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】22306564.0
(32)【優先日】2022-10-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】63/416,081
(32)【優先日】2022-10-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/425,639
(32)【優先日】2022-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/487,470
(32)【優先日】2023-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/454,158
(32)【優先日】2023-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504456798
【氏名又は名称】サノフイ
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ
(71)【出願人】
【識別番号】505473891
【氏名又は名称】イネイト・ファルマ
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ニコラ・グルダン
(72)【発明者】
【氏名】ローラン・ゴティエ
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンドル・タン
(72)【発明者】
【氏名】マリエル・シロン
(72)【発明者】
【氏名】アンジェラ・ヴィロン－オッドス
(72)【発明者】
【氏名】アレッサンドロ・マーシエロ
(72)【発明者】
【氏名】ヨーヘン・ベニンガ
(72)【発明者】
【氏名】インゴ・フォッケン
(72)【発明者】
【氏名】ボードー・ティルマン
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアン・ランゲ
(72)【発明者】
【氏名】サンバシヴァ・ラオ
(72)【発明者】
【氏名】ヤンフェン・チョウ
(72)【発明者】
【氏名】レイラ・セヴィニー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】管理可能な安全性プロファイルを有する強力な抗ＢＣＭＡ治療を提供する。
【解決手段】第１及び第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）並びに免疫グロブリンＦｃ領域又はその変異体の全部又は一部を含む多機能結合タンパク質を提供する。第１のＡＢＤはヒトＢＣＭＡに特異的に結合し、第２のＡＢＤはヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、免疫グロブリンＦｃ領域又はその変異体の全部又は一部はヒトＦｃ－γ受容体に結合する。また、多発性骨髄腫（ＭＭ）を含む増殖性障害の治療又は予防を含む、当該結合タンパク質を作製するための方法、その組成物、及びそれらの使用を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】第１及び第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）並びに免疫グロブリンＦｃ領域又はその変異体の全部又は一部を含む多機能結合タンパク質を提供する。第１のＡＢＤはヒトＢＣＭＡに特異的に結合し、第２のＡＢＤはヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、免疫グロブリンＦｃ領域又はその変異体の全部又は一部はヒトＦｃ－γ受容体に結合する。また、多発性骨髄腫（ＭＭ）を含む増殖性障害の治療又は予防を含む、当該結合タンパク質を作製するための方法、その組成物、及びそれらの使用を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を有する第２のＡＢＤとを含む結合タンパク質であって、
（ａ）前記第１のＡＢＤが、
（ａ１）ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
（ａ２）ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）と、を含み、
（ｂ）前記第２のＡＢＤが、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を含む、結合タンパク質。
（ａ）前記第１のＡＢＤが、
（ａ１）ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
（ａ２）ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）と、を含み、
（ｂ）前記第２のＡＢＤが、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を含む、結合タンパク質。
【請求項2】
（ｂ）前記第２のＡＢＤが、
（ｂ１）第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）であって、
－ＤＹＶＩＮを含むＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮＹＹＮＥＫＦＫＡを含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹを含むＨＣＤＲ３配列、
－ＧＹＴＦＳＤＹＶＩＮ（配列番号１９）を含むＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮ（配列番号２０）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）を含むＨＣＤＲ３配列、
－ＳＤＹＡＷＮ（配列番号２２）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＥＳ（配列番号２３）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＧＹＹＧＳＳＷＧＶＦＡＹ（配列番号２４）を含むＨＣＤＲ３配列、
－ＥＹＴＭＨ（配列番号２５）を含むＨＣＤＲ１配列、ＧＩＳＰＮＩＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２６）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＧＳＦＤＹ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ３配列、
－ＳＦＴＭＨ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＮＰＳＳＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＳＳＲＧＦＤＹ（配列番号３０）を含むＨＣＤＲ３配列、又は
－ＳＤＹＡＷＮ（配列番号３１）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＣＷＤＹＡＬＹＡＭＤＣ（配列番号３３）を含むＨＣＤＲ３配列、を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）と、
（ｂ２）第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）であって、
－ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３４）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３５）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＱＧＮＴＲＰＷＴ（配列番号３６）を含むＬＣＤＲ３配列、
－ＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号３７）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３８）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ３配列、
－ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号４２）を含むＬＣＤＲ３配列、
－ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号４３）を含むＬＣＤＲ１配列、ＡＡＴＮＬＡＤ（配
列番号４４）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＲＴ（配列番号４５）を含むＬＣＤＲ３配列、又は
－ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号４６）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＤＴＰＬＴ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ３配列、を含む第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）と
を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
（ｂ１）第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）であって、
－ＤＹＶＩＮを含むＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮＹＹＮＥＫＦＫＡを含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹを含むＨＣＤＲ３配列、
－ＧＹＴＦＳＤＹＶＩＮ（配列番号１９）を含むＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮ（配列番号２０）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）を含むＨＣＤＲ３配列、
－ＳＤＹＡＷＮ（配列番号２２）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＥＳ（配列番号２３）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＧＹＹＧＳＳＷＧＶＦＡＹ（配列番号２４）を含むＨＣＤＲ３配列、
－ＥＹＴＭＨ（配列番号２５）を含むＨＣＤＲ１配列、ＧＩＳＰＮＩＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２６）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＧＳＦＤＹ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ３配列、
－ＳＦＴＭＨ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＮＰＳＳＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＳＳＲＧＦＤＹ（配列番号３０）を含むＨＣＤＲ３配列、又は
－ＳＤＹＡＷＮ（配列番号３１）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＣＷＤＹＡＬＹＡＭＤＣ（配列番号３３）を含むＨＣＤＲ３配列、を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）と、
（ｂ２）第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）であって、
－ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３４）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３５）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＱＧＮＴＲＰＷＴ（配列番号３６）を含むＬＣＤＲ３配列、
－ＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号３７）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３８）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ３配列、
－ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号４２）を含むＬＣＤＲ３配列、
－ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号４３）を含むＬＣＤＲ１配列、ＡＡＴＮＬＡＤ（配
列番号４４）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＲＴ（配列番号４５）を含むＬＣＤＲ３配列、又は
－ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号４６）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＤＴＰＬＴ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ３配列、を含む第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）と
を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項3】
前記ＶＬ１が、
－ＣＡＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
－ＣＲＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
－ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＩＫＰＰ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＹＧＧＱＷＶ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、又は
－ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＧＹＹＡＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＮＫＰＰ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＹＹＧＧＱＷＶ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
－ＣＡＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
－ＣＲＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
－ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＩＫＰＰ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＹＧＧＱＷＶ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、又は
－ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＧＹＹＡＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＮＫＰＰ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＹＹＧＧＱＷＶ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項4】
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意に、
－前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５３のアミノ酸
配列を含むか、又は
－前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５４のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の結合タンパク質。
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
－前記ＶＨ１が、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意に、
－前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５３のアミノ酸
配列を含むか、又は
－前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５４のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の結合タンパク質。
【請求項5】
－前記ＶＨ２が、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
－前記ＶＨ２が、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意に、
前記ＶＨ２が配列番号５６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６４のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号５７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６５のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号５８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６６のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号５９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６７のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号６０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号６１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号６２のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号７０のアミノ酸配列を含むか、又は
前記ＶＨ２が配列番号６３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号７１のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
－前記ＶＨ２が、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
－前記ＶＨ２が、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
－前記ＶＨ２が、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意に、
前記ＶＨ２が配列番号５６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６４のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号５７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６５のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号５８のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６６のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号５９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６７のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号６０のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号６１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、
前記ＶＨ２が配列番号６２のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号７０のアミノ酸配列を含むか、又は
前記ＶＨ２が配列番号６３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号７１のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項6】
免疫グロブリンＦｃドメイン又はその変異体の全部又は一部を更に含み、任意に、
前記免疫グロブリンＦｃドメイン若しくはその変異体の全部若しくは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合し、
前記免疫グロブリンＦｃドメイン若しくはその変異体の全部若しくは一部が、ヒトＣＤ１
６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩ）ポリペプチドに結合し、
前記Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２９７に天然グリカンを含み、及び／又は
前記結合タンパク質が、Ｎ－グリコシル化されている、
請求項１～５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
前記免疫グロブリンＦｃドメイン若しくはその変異体の全部若しくは一部が、ヒトＦｃ－γ受容体に結合し、
前記免疫グロブリンＦｃドメイン若しくはその変異体の全部若しくは一部が、ヒトＣＤ１
６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩ）ポリペプチドに結合し、
前記Ｆｃドメインが、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２９７に天然グリカンを含み、及び／又は
前記結合タンパク質が、Ｎ－グリコシル化されている、
請求項１～５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項7】
前記Ｆｃドメイン又はその変異体が、第１のＦｃ重鎖及び第２のＦｃ重鎖を含む、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項8】
少なくとも１つのＦｃ重鎖が、
（ｉ）アミノ酸位置２４２のロイシン（Ｌ）及びアミノ酸位置３３４のリジン（Ｋ）、
又は
（ｉｉｉ）アミノ酸位置２９２のアルギニン（Ｒ）及びアミノ酸位置３０２のバリン（Ｖ）
に代わるシステイン（Ｃ）の対によって媒介される操作された鎖内ジスルフィド結合を含み、前記アミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、請求項７に記載の結合タンパク質。
（ｉ）アミノ酸位置２４２のロイシン（Ｌ）及びアミノ酸位置３３４のリジン（Ｋ）、
又は
（ｉｉｉ）アミノ酸位置２９２のアルギニン（Ｒ）及びアミノ酸位置３０２のバリン（Ｖ）
に代わるシステイン（Ｃ）の対によって媒介される操作された鎖内ジスルフィド結合を含み、前記アミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う、請求項７に記載の結合タンパク質。
【請求項9】
前記第１及び前記第２のＦｃ重鎖がそれぞれ、Ｌ２４２Ｃ／Ｋ３３４Ｃ置換を含む、請求項８に記載の結合タンパク質。
【請求項10】
前記第１及び前記第２のＦｃ重鎖がそれぞれ、Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ置換を含む、請求項８に記載の結合タンパク質。
【請求項11】
少なくとも１つのＦｃ重鎖が、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置３３２における置換を含み、任意に、アミノ酸位置３３２における前記置換がグルタミン酸（Ｅ）であり、任意に、少なくとも１つのＦｃ重鎖を更に含み、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６、２３９又は３３０における１つ以上の置換を更に含み、任意に、アミノ酸位置２３６における前記置換がアラニン（Ａ）であり、アミノ酸位置２３９における前記置換がアスパラギン酸（Ｄ）であり、アミノ酸位置３３０における前記置換がロイシン（Ｌ）である、請求項７～１０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項12】
少なくとも１つのＦｃ重鎖が、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含むか、
少なくとも１つのＦｃ重鎖が、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含むか、又は
少なくとも１つのＦｃ重鎖が、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３３０にロイシン（Ｌ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含む、請求項７～１１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
少なくとも１つのＦｃ重鎖が、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含むか、又は
少なくとも１つのＦｃ重鎖が、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３３０にロイシン（Ｌ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含む、請求項７～１１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項13】
少なくとも２つの抗原結合部位を形成する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、少なくとも１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
少なくとも１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉの前記ポリペプチドと式ＩＩの前記ポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成し、任意に、前記結合タンパク質が、２つの抗原結合部位を形成する３つのポリペプチド鎖を含み、１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖が、式：
ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり、
ヒンジは、前記ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉの前記ポリペプチドと式ＩＩの前記ポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する、
請求項１～１２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
少なくとも１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉの前記ポリペプチドと式ＩＩの前記ポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成し、任意に、前記結合タンパク質が、２つの抗原結合部位を形成する３つのポリペプチド鎖を含み、１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖が、式：
ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり、
ヒンジは、前記ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉの前記ポリペプチドと式ＩＩの前記ポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する、
請求項１～１２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項14】
（ａ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４が、それぞれ独立して、０アミノ酸長であるか、若しくはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ、ＧＱＰＫＡＡＰ、及びＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧからなる群から選択される配列を含むか、又は
（ｂ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４が、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ、ＧＱＰＫＡＡＰ、及びＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧからなる群から選択される配列を含む、
請求項１３に記載の結合タンパク質。
（ｂ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４が、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ、ＧＱＰＫＡＡＰ、及びＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧからなる群から選択される配列を含む、
請求項１３に記載の結合タンパク質。
【請求項15】
（ｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖と、
を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖と、
を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項16】
ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を有する第２のＡＢＤとを含む結合タンパク質であって、
（ａ）前記第１のＡＢＤが、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含み、
（ｂ）前記第２のＡＢＤが、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）と、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第２の免疫グロブ
リン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）とを含み、任意に、
前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
前記ＶＨ２が配列番号５６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６４のアミノ酸配列を含む、結合タンパク質。
（ａ）前記第１のＡＢＤが、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含み、
（ｂ）前記第２のＡＢＤが、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）と、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第２の免疫グロブ
リン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）とを含み、任意に、
前記ＶＨ１が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１が配列番号５５のアミノ酸配列を含み、
前記ＶＨ２が配列番号５６のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２が配列番号６４のアミノ酸配列を含む、結合タンパク質。
【請求項17】
（ｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖と、
を含む、請求項１６に記載の結合タンパク質。
（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖と、
を含む、請求項１６に記載の結合タンパク質。
【請求項18】
ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を有する第２のＡＢＤとを含む結合タンパク質であって、前記結合タンパク質が、
（ｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖と、
を含む、結合タンパク質。
（ｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、
（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖と、
を含む、結合タンパク質。
【請求項19】
医薬品として使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項20】
疾患又は障害の治療又は予防のための方法に使用するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項21】
癌の治療又は予防のための方法に使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項22】
多発性骨髄腫の治療又は予防のための方法に使用するための、請求項１～２１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項23】
請求項１～１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項24】
請求項１～１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項25】
請求項２４に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項26】
請求項２４に記載の核酸分子を含む、単離された細胞。
【請求項27】
請求項２５に記載の発現ベクターを含む、単離された細胞。
【請求項28】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２７に記載の単離された細胞。
【請求項29】
請求項２６又は２７に記載の単離された細胞を好適な条件下で培養することと、前記結合タンパク質を回収することとを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質を作製する方法。
【請求項30】
疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項２３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項31】
癌を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項２３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項32】
多発性骨髄腫を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項２３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項33】
ＮＫｐ４６発現細胞の活性の回復又は増強を必要とする患者においてＮＫｐ４６発現細胞の活性を回復又は増強させる方法であって、請求項２３に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項34】
癌細胞の排除を必要とする患者において癌細胞を排除する方法であって、請求項２３に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項35】
癌細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を必要とする患者において癌細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を誘発又は増加させる方法であって、請求項２３に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、成熟Ｂ細胞及びＢ細胞由来腫瘍細胞上に発現される、いくつかのＢ細胞癌（例えば、多発性骨髄腫）及びＢ細胞疾患又は障害（例えば、軽鎖アミロイドーシス又はＬＣＡ）の進行に関与している。したがって、ＢＣＭＡは、抗Ｂ細胞癌治療及びＢ細胞関連疾患又は障害の治療のための魅力的な標的である。抗ＣＤ３ｘＢＣＭＡ Ｔ細胞エンゲージャー等の数少ない既存のＢＣＭＡ標的化療法は、過剰な炎症促進性サイトカイン放出等の強力な毒性問題を誘発する。
【背景技術】
【0002】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫に関与するリンパ球の亜集団である。ＮＫ細胞は、腫瘍又はウイルス感染細胞等の望ましくない細胞を排除することができる効率的な免疫監視機構を提供する。ＮＫ細胞の特徴及び生物学的特性は、ＣＤ１６、ＣＤ５６及び／又はＣＤ５７を含む表面抗原の発現、細胞表面上のα／β又はγ／δＴＣＲ複合体の非存在、ＭＨＣ非拘束的に細胞に結合して死滅させる能力、特に特定の細胞溶解酵素の活性化によってＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない「自己」細胞、腫瘍細胞又はＮＫ活性化受容体に対するリガンドを発現する他の疾患細胞を死滅させる能力、及び免疫応答を刺激するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を含む。潜在的な抗腫瘍特性のために、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の周囲で関心が高まっている。
【0003】
管理可能な安全性プロファイルを有する強力な抗ＢＣＭＡ治療が当技術分野で必要とされている。ここで特許請求の範囲に記載される抗ＢＣＭＡ×ＮＫｐ４６結合タンパク質は、この必要性を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示は、第１及び第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）並びに免疫グロブリンＦｃ領域又はその変異体の全部又は一部を含む多機能結合タンパク質に関し、第１のＡＢＤはヒトＢＣＭＡに特異的に結合し、第２のＡＢＤはヒトＮＫｐ４６に特異的に結合し、免疫グロブリンＦｃ領域又はその変異体の全部又は一部はヒトＦｃ－γ受容体に結合する。特に、開示されるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡエンゲージャーは、（抗体の定常領域（Ｆｃ）へのＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合を介して）ＡＤＣＣ活性及び／又は血清半減期を増強する広範なＦｃ操作を有する。
【0005】
開示されたＮＫｐ４６－ＢＣＭＡエンゲージャーは、ＮＫｐ４６及びＣＤ１６との二重ＮＫ係合により強い効力を示し、良好な安全性プロファイル（Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）モダリティと比較して最小の炎症促進性サイトカイン放出）及び長い血清半減期を有する。
【0006】
本開示はまた、当該結合タンパク質を作製するための方法、その組成物、及びそれらの使用に関する。
【0007】
一態様では、本開示は、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を有する第２のＡＢＤとを含む結合タンパク質であって、
（ａ）第１のＡＢＤが、（ａ１）ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ
２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、（ａ２）ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含み、
（ｂ）第２のＡＢＤが、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を含む、結合タンパク質を提供する。
（ａ）第１のＡＢＤが、（ａ１）ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ
２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、（ａ２）ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含み、
（ｂ）第２のＡＢＤが、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を含む、結合タンパク質を提供する。
【0008】
特定の実施形態では、（ｂ）第２のＡＢＤは、
（ｂ１）第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）であって、
－ＤＹＶＩＮを含むＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮＹＹＮＥＫＦＫＡを含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹを含むＨＣＤＲ３配列；－ＧＹＴＦＳＤＹＶＩＮ（配列番号１９）を含むＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮ（配列番号２０）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）を含むＨＣＤＲ３配列；－ＳＤＹＡＷＮ（配列番号２２）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＥＳ（配列番号２３）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＧＹＹＧＳＳＷＧＶＦＡＹ（配列番号２４）を含むＨＣＤＲ３配列；－ＥＹＴＭＨ（配列番号２５）を含むＨＣＤＲ１配列、ＧＩＳＰＮＩＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２６）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＧＳＦＤＹ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ３配列；－ＳＦＴＭＨ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＮＰＳＳＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＳＳＲＧＦＤＹ（配列番号３０）を含むＨＣＤＲ３配列；又は－ＳＤＹＡＷＮ（配列番号３１）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＣＷＤＹＡＬＹＡＭＤＣ（配列番号３３）を含むＨＣＤＲ３配列を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、並びに
（ｂ２）第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）であって、
－ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３４）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３５）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＱＧＮＴＲＰＷＴ（配列番号３６）を含むＬＣＤＲ３配列；－ＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号３７）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３８）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ３配列；－ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号４２）を含むＬＣＤＲ３配列；－ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号４３）を含むＬＣＤＲ１配列、ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号４４）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＲＴ（配列番号４５）を含むＬＣＤＲ３配列；又は－ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号４６）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＤＴＰＬＴ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ３配列を含む、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。
（ｂ１）第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）であって、
－ＤＹＶＩＮを含むＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮＹＹＮＥＫＦＫＡを含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹを含むＨＣＤＲ３配列；－ＧＹＴＦＳＤＹＶＩＮ（配列番号１９）を含むＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮ（配列番号２０）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）を含むＨＣＤＲ３配列；－ＳＤＹＡＷＮ（配列番号２２）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＥＳ（配列番号２３）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＧＹＹＧＳＳＷＧＶＦＡＹ（配列番号２４）を含むＨＣＤＲ３配列；－ＥＹＴＭＨ（配列番号２５）を含むＨＣＤＲ１配列、ＧＩＳＰＮＩＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２６）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＧＳＦＤＹ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ３配列；－ＳＦＴＭＨ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＮＰＳＳＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＳＳＲＧＦＤＹ（配列番号３０）を含むＨＣＤＲ３配列；又は－ＳＤＹＡＷＮ（配列番号３１）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＣＷＤＹＡＬＹＡＭＤＣ（配列番号３３）を含むＨＣＤＲ３配列を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、並びに
（ｂ２）第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）であって、
－ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３４）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３５）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＱＧＮＴＲＰＷＴ（配列番号３６）を含むＬＣＤＲ３配列；－ＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号３７）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３８）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ３配列；－ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号４２）を含むＬＣＤＲ３配列；－ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号４３）を含むＬＣＤＲ１配列、ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号４４）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＲＴ（配列番号４５）を含むＬＣＤＲ３配列；又は－ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号４６）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＤＴＰＬＴ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ３配列を含む、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。
【0009】
特定の実施形態では、ＶＬ１は、－ＣＡＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列；－ＣＲＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列；－ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＩＫＰＰ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＹＧＧ
ＱＷＶ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列；又は－ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＧＹＹＡＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＮＫＰＰ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＹＹＧＧＱＷＶ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
ＱＷＶ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列；又は－ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＧＹＹＡＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＮＫＰＰ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＹＹＧＧＱＷＶ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
【0010】
特定の実施形態では、－ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；－ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；－ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；－ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；－ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；又は－ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【0011】
特定の実施形態では、ＶＨ１は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５５のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ１は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５０のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ１は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５１のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ１は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５２のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ１は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５３のアミノ酸配列を含む；又は－ＶＨ１は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
【0012】
特定の実施形態では、－ＶＨ２は、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；ＶＨ２は、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む；又は－ＶＨ２は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【0013】
特定の実施形態では、－ＶＨ２は配列番号５６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６４のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は配列番号５７のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６５のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は配列番号５８のアミノ酸配列を含み、Ｖ
Ｌ２は配列番号６６のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は配列番号５９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６７のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６８のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６９のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号７０のアミノ酸配列を含む；又は－ＶＨ２は配列番号６３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
Ｌ２は配列番号６６のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は配列番号５９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６７のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６８のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６９のアミノ酸配列を含む；－ＶＨ２は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号７０のアミノ酸配列を含む；又は－ＶＨ２は配列番号６３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
【0014】
特定の実施形態では、結合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその変異体の全部又は一部を更に含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメイン若しくはその変異体の全部若しくは一部は、ヒトＦｃ－γ受容体に結合する。特定の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその変異体の全部又は一部がヒトＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩ）ポリペプチドに結合する。
【0015】
特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２９７に天然グリカンを含む。
【0016】
特定の実施形態では、結合タンパク質は、Ｎ－グリコシル化される。
【0017】
特定の実施形態では、Ｆｃドメイン又はその変異体は、第１のＦｃ重鎖及び第２のＦｃ重鎖を含む。
【0018】
特定の実施形態では、少なくとも１つのＦｃ重鎖は、以下を置換する一対のシステイン（Ｃ）によって媒介される操作された鎖内ジスルフィド結合を含む：（ｉ）アミノ酸位置２４２のロイシン（Ｌ）及びアミノ酸位置３３４のリジン（Ｋ）；又は（ｉｉ）アミノ酸位置２９２にアルギニン（Ｒ）及びアミノ酸位置３０２にバリン（Ｖ）（アミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う）。
【0019】
特定の実施形態では、第１のＦｃ重鎖又は第２のＦｃ重鎖は、システインの対を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のＦｃ重鎖はそれぞれ、システインの対を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のＦｃ重鎖はそれぞれ、Ｌ２４２Ｃ／Ｋ３３４Ｃ置換を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のＦｃ重鎖はそれぞれ、Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ置換を含む。
【0020】
特定の実施形態では、少なくとも１つのＦｃ重鎖は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置３３２に置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸位置３３２における置換は、グルタミン酸（Ｅ）である。
【0021】
特定の実施形態では、少なくとも１つのＦｃ重鎖は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６、２３９又は３３０に１つ以上の置換を更に含む。特定の実施形態では、アミノ酸位置２３６における置換は、アラニン（Ａ）である。特定の実施形態では、アミノ酸位置２３９における置換は、アスパラギン酸（Ｄ）である。特定の実施形態では、アミノ酸位置３３０における置換は、ロイシン（Ｌ）である。
【0022】
特定の実施形態では、少なくとも１つのＦｃ重鎖は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＦｃ重鎖は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含む。特定の実施形態では、少なくとも
１つのＦｃ重鎖は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３３０にロイシン（Ｌ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含む。
１つのＦｃ重鎖は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３３０にロイシン（Ｌ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含む。
【0023】
特定の実施形態では、結合タンパク質は、少なくとも２つの抗原結合部位を形成する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、少なくとも１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
少なくとも１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
少なくとも１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
【0024】
特定の実施形態では、結合タンパク質は、２つの抗原結合部位を形成する３つのポリペプチド鎖を含み、１つのポリペプチド鎖は、以下の式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖は、式：
ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり、
ヒンジは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖は、式：
ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり、
ヒンジは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
【0025】
特定の実施形態では、（ａ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立して、長さが０アミノ酸であるか、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８２）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号８３）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号８４）及びＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号８５）からなる群から選択される配列を含むか、又は（ｂ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ、ＧＱＰＫＡＡＰ、及びＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧからなる群より選択される配列を含む。
【0026】
特定の実施形態では、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む。特定の実施形態では、Ｌ３及びＬ４はそれぞれ存在しない。
【0027】
特定の実施形態では、結合タンパク質は、（ｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖とを含む。
【0028】
別の態様では、本開示は、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を有する第２のＡＢＤとを含む結合タンパク質であって、（ａ）第１のＡＢＤが、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含み、（ｂ）第２のＡＢＤが、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）と、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）とを含む、結合タンパク質を提供する。
【0029】
特定の実施形態では、ＶＨ１は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５５のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２は配列番号５６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
【0030】
特定の実施形態では、結合タンパク質は、（ｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖とを含む。
【0031】
別の態様では、本開示は、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を有する第２のＡＢＤとを含む結合タンパク質を提供し、結合タンパク質は、（ｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖とを含む。
【0032】
特定の実施形態では、上記の結合タンパク質は、医薬品として使用するためのものである。
【0033】
特定の実施形態では、上記の結合タンパク質は、疾患又は障害を治療するための方法に使用するためのものである。
【0034】
特定の実施形態では、上記の結合タンパク質は、癌の治療又は予防のための方法に使用するためのものである。
【0035】
特定の実施形態では、上記の結合タンパク質は、多発性骨髄腫の治療又は予防のための方法に使用するためのものである。
【0036】
特定の実施形態では、上記の結合タンパク質は、軽鎖アミロイドーシス（ＬＣＡ）の治療又は予防のための方法に使用するためのものである。
【0037】
別の態様では、本開示は、上記の結合タンパク質及び薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【0038】
別の態様では、本開示は、癌を治療又は予防する方法であって、上記の医薬組成物を、当該治療又は予防を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【0039】
別の態様では、本開示は、上記の結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【0040】
別の態様では、本開示は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【0041】
別の態様では、本開示は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【0042】
別の態様では、本開示は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【0043】
別の態様では、本開示は、上記の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【0044】
別の態様では、本開示は、上記の核酸分子を含む単離された細胞を提供する。
【0045】
別の態様では、本開示は、上記の発現ベクターを含む単離された細胞を提供する。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
【0046】
別の態様では、本開示は、結合タンパク質を作製する方法であって、単離された細胞を適切な条件下で培養すること、及び結合タンパク質を回収することを含む方法を提供する。
【0047】
別の態様では、本開示は、上記の結合タンパク質を作製するための方法であって、（ａ）複数の組換えポリペプチドを発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養する工程であって、当該複数が、（ｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、（ｂ）任意に、発現された組換えポリペプチドを回収する工程と、を含む方法を提供する。
【0048】
別の態様では、本開示は、上記の作製方法によって産生される結合タンパク質を提供する。別の態様では、本開示は、疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に上記の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0049】
別の態様では、本開示は、癌を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に上記の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0050】
別の態様では、本開示は、多発性骨髄腫を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に上記の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、多発性骨髄腫は、再発性多発性骨髄腫である。特定の実施形態では、多発性骨髄腫は、難治性多発性骨髄腫である。特定の実施形態では、多発性骨髄腫は、くすぶり型多発性骨髄腫である。
【0051】
別の態様では、本開示は、軽鎖アミロイドーシス（ＬＣＡ）を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に上記の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、ＬＣＡは、再発ＬＣＡである。特定の実施形態では、ＬＣＡは、難治性ＬＣＡである。
【0052】
別の態様では、本開示は、ＮＫｐ４６発現細胞の活性の回復又は増強を必要とする患者においてＮＫｐ４６発現細胞の活性を回復又は増強する方法であって、上記の医薬組成物
を患者に投与することを含む方法を提供する。
を患者に投与することを含む方法を提供する。
【0053】
別の態様では、本開示は、癌細胞の除去を必要とする患者において癌細胞を除去する方法であって、上記の医薬組成物を患者に投与することを含む方法を提供する。
【0054】
別の態様では、本開示は、癌細胞のＮＫ細胞媒介性溶解の誘発又は増加を必要とする患者において癌細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を誘発又は増加させる方法であって、上記の医薬組成物を患者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、癌細胞は、ＢＣＭＡを発現する。
【0055】
別の態様では、本開示は、ＮＫ細胞による癌細胞の排除の誘導を必要とする患者においてＮＫ細胞による癌細胞の排除を誘導する方法であって、上記の医薬組成物を患者に投与することを含む方法を提供する。
【0056】
別の態様では、本開示は、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）と、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を有する第２のＡＢＤとを含む結合タンパク質を提供する。
【0057】
特定の実施形態では、結合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその変異体の全部又は一部を更に含み、任意に、免疫グロブリンＦｃドメイン若しくはその変異体の全部又は一部はヒトＦｃ－γ受容体に結合する；免疫グロブリンＦｃドメイン若しくはその変異体の全部若しくは一部はヒトＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）ポリペプチドに結合する；Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２９７に天然グリカンを含む；及び／又は結合タンパク質はＮ－グリコシル化されている。
【0058】
特定の実施形態では、Ｆｃドメイン又はその変異体は、第１のＦｃ重鎖及び第２のＦｃ重鎖を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＦｃ重鎖は、以下を置換する一対のシステイン（Ｃ）によって媒介される操作された鎖内ジスルフィド結合を含む：（ｉ）アミノ酸位置２４２のロイシン（Ｌ）及びアミノ酸位置３３４のリジン（Ｋ）；又は（ｉｉ）アミノ酸位置２９２にアルギニン（Ｒ）及びアミノ酸位置３０２にバリン（Ｖ）；（アミノ酸位置はＥＵナンバリングに従う）。
【0059】
特定の実施形態では、第１及び第２のＦｃ重鎖はそれぞれ、Ｌ２４２Ｃ／Ｋ３３４Ｃ置換を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のＦｃ重鎖はそれぞれ、Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ置換を含む。
【0060】
特定の実施形態では、少なくとも１つのＦｃ重鎖は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置３３２における置換を含み、任意に、アミノ酸位置３３２における置換はグルタミン酸（Ｅ）であり、任意に、少なくとも１つのＦｃ重鎖を更に含み、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６、２３９又は３３０における１つ以上の置換を更に含み、任意に、アミノ酸位置２３６における置換がアラニン（Ａ）であり、アミノ酸位置２３９における置換がアスパラギン酸（Ｄ）であり、アミノ酸位置３３０における置換がロイシン（Ｌ）である。
【0061】
特定の実施形態では、少なくとも１つのＦｃ重鎖は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含むか、少なくとも１つのＦｃ重鎖は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含むか、又は少なくとも１つのＦｃ重鎖は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２３９にアスパラギン酸（Ｄ
）、アミノ酸位置３３０にロイシン（Ｌ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含む。
）、アミノ酸位置３３０にロイシン（Ｌ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を更に含む。
【0062】
本開示の前述及び他の特徴及び利点は、添付の図面と併せて、例示的な実施形態の以下の詳細な説明からより完全に理解される。
【図面の簡単な説明】
【0063】
【図1A-1B】図１Ａ～図１Ｂは、ＮＫｐ４６多重特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＮＫＣＥ）の概略図である。図１Ａは、腫瘍細胞（例えば、ＢＣＭＡ）の表面の抗原に対する一方のアーム及びＮＫ細胞上のＮＫｐ４６受容体に対する他方のアームと結合するＮＫｐ４６ ＮＫＣＥを表す。ＮＫＣＥのＦｃドメインはまた、ＮＫ細胞上のＣＤ１６に結合する。図１Ｂは、ＮＫｐ４６とＦｃγ受容体ＣＤ１６ａの両方の二重結合を介してＮＫ細胞を動員し、強化型ＦｃコンピテントフォーマットでＡＤＣＣ活性を誘導しながら、腫瘍細胞の表面でＢＣＭＡと係合する異なるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥフォーマットを示す。強化型Ｆｃコンピテントフォーマット（以下「ＣＯＤＶ－ＯＬ１－ＡＤＥ－ＤＳＢ」と呼ぶ）は、以下を含む：（１）ＡＤＣＣ活性を増強するためのＣＨ２におけるＡＤＥ変異（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）；（２）熱安定化及び生産性（例えば、細胞における発現性及び全体的な収率）のためのＣＨ２中のＤＳＢ（Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ）；（３）Ｆｃ－（３ａ）ノブ（ＶＨ／ＶＬドメインを含有する重鎖）におけるヘテロ二量体形成を促進するためのＣＨ３のノブ－イントゥ－ホール変異（ＫＩＨ：ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）：Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ及び（３ｂ）ホール（ＶＨ／ＶＬドメインを欠く重鎖）：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ；並びに（４）Ｆｃ中のヘテロ二量体の精製を促進するための１つのＣＨ３中のＲＦ変異異（Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ）。全てのＦｃドメインアミノ酸ナンバリングはＥＵに従う。このＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥ＿Ｆｃ ＣＯＤＶ－ＯＬ１－ＡＤＥ－ＤＳＢは、軽鎖に２つのリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含み、１つは、ＶＬ抗ＢＣＭＡとＶＬ抗ＮＫｐ４６との間であり、ＶＬ ＮＫｐ４６とＣＬとの間である。ＮＫｐ４６結合部位：３Ｄ９；ＢＣＭＡ結合部位：ＣＡ１０ｖ７；ＡＤＣＣコンピテントＦｃドメインを介したＣＤ１６結合。
【図2A-2B】図２Ａは、細胞表面ＦＩＴＣ蛍光発光に基づく多発性骨髄腫細胞株のパネル上のＢＣＭＡ密度を表す棒グラフである。図２Ｂは、降順にランク付けされた各細胞株上のＢＣＭＡ密度を記録する対応する表である。
【図3A-3B】図３Ａは、ＲＰＭＩ ８２２６細胞上のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの代表的な滴定である。示されている滴定データは、抗体濃度の範囲にわたる蛍光強度の中央値である。５つの独立した滴定のＥＣ５０値を示す。図３Ｂは、健常志願者のＰＢＭＣから精製したヒトＮＫ細胞上のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの代表的な滴定である。示されている滴定データは、抗体濃度の範囲にわたる蛍光強度の中央値である。３名のＮＫドナーのＥＣ５０値を示す。
【図4】図４は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用することによって定量化される、ヒトＣＤ１６ａの２つの異なる変異体（アミノ酸位置１７６にバリン（Ｖ）又はフェニルアラニン（Ｆ）のいずれかを持つ）に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－ＮＫＣＥの１２個の異なるＦｃフォーマットの結合親和性（ＫＤで測定）を示す表である。
【図6】図６は、６名の異なるドナー（Ｄ４１０、Ｄ７００、Ｄ１１４、Ｄ９７４、Ｄ２４５及びＤ４０９）ＲＰＭＩ８２２６細胞からの精製休止期ＮＫ細胞の存在下でインキュベートした、漸増濃度（ｎＭ）での強化型ＡＤＣＣ（Ｆｃ－ＤＥ、Ｆｃ－ＤＥ－ＤＳＢ、Ｆｃ－ＡＤＥ、Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ）及び非強化型ＡＤＣＣ（ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ）と、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－ＮＫＣＥの細胞傷害性を比較するインビトロ細胞細胞傷害性アッセイであり、ＲＰＭＩ８２２６細胞を標的として使用し、エフェクターとして精製休止期ＮＫ細胞を使用した。
【図6-1】同上。
【図6-2】同上。
【図7】図７は、２名の異なるドナー（Ｄ６１１及びＤ２２２）由来の精製された休止ＮＫ細胞の存在下でＲＰＭＩ８２２６又はＭＭ．１ｓ細胞のいずれかとインキュベートした、漸増濃度（ｎＭ）でのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ、参照－１、ＢＣＭＡ＿ＩｇＧ１、ＩＣ＿ＩｇＧ１－ＤＥ及びＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆｃ対照の細胞傷害性を比較するインビトロ細胞細胞傷害性アッセイである。ＲＰＭＩ ８２２６及びＭＭ．１ｓ細胞を標的として使用し、精製休止期ＮＫ細胞をエフェクターとして使用した。
【図8】図８は、３名の異なるドナー（Ｄ７８６、Ｄ３７１又はＤ６９５）由来の精製された休止ＮＫ細胞の存在下でＲＰＭＩ８２２６細胞と共にインキュベートした漸増濃度（ｎＭ）でのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ、参照－１、ＢＣＭＡ＿ＩｇＧ１及びＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆｃ－ＡＤＥ対照の細胞傷害性を比較するインビトロ細胞細胞傷害性アッセイである。ＲＰＭＩ ８２２６細胞を標的として使用し、精製休止期ＮＫ細胞をエフェクターとして使用した。
【図9】図９は、精製休止期ＮＫ細胞を使用したＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ及びＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆｃ－ＡＤＥの細胞傷害性をＲＰＭＩ ８２２６細胞と比較するインビトロ細胞細胞傷害性アッセイである。ＲＰＭＩ ８２２６細胞を標的として使用し、精製休止期ＮＫ細胞（左パネル）又はＲＰＭＩ ８２２６細胞（右パネル）に５１Ｃｒを負荷して、同じアッセイで標的細胞死滅及びＮＫ対ＮＫフラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）毒性の両方を決定した。（２名のＮＫ細胞ドナーを示す）。
【図10】図１０は、種々の可溶性ＢＣＭＡ濃度の存在下におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－ＮＫＣＥの細胞傷害性を比較するインビトロ細胞細胞傷害性アッセイである。漸増濃度の可溶性ＢＣＭＡ組換えタンパク質（０、２、２０及び２００ｎｇ／ｍＬ）の存在下でのＲＰＭＩ ８２２６細胞に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの細胞傷害活性。ＲＰＭＩ ８２２６を標的として使用し、エフェクター（２つのＮＫ細胞ドナー、Ｄ５０４及びＤ９３０が示されている）として精製休止期ＮＫ細胞を使用した。
【図14A】図１４Ａは、インビボＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ抗腫瘍活性を決定するための実験マウスモデルの概略図である。ヒトＢＣＭＡをそれぞれ非発現及び発現する緑色（ｅＧＦＰ）及び赤色（ｄｓＲｅｄ）蛍光マウスリンパ腫ＲＭＡ細胞の１：１混合物を、ヒトＮＫｐ４６遺伝子導入Ｒａｇ１欠損マウス（Ｔｇ ｈｕＮＫｐ４６ Ｒａｇ１ －／－）に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。腫瘍担持マウス（各群ｎ＝７）を、総用量１２．２ピコモルのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ又は対照としてのビヒクルで１回処置した。マウスの肝臓を処置の４８時間後に生検し、浸潤したＲＭＡ細胞の絶対数を、図１４Ｂ～図１４Ｅに記載されるようにフローサイトメトリーによって監視した。
【図14B-14D】図１４Ｂは、生着前にフローサイトメトリーによって分析された緑色（ｅＧＦＰ－ｈｕＢＣＭＡ陰性）及び赤色（ｄｓＲｅｄ－ｈｕＢＣＭＡ陽性）蛍光マウスリンパ腫ＲＭＡ細胞の混合集団を示す。図１４Ｃは、緑色（ｅＧＦＰ）及び赤色（ｄｓＲｅｄ）蛍光マウスリンパ腫ＲＭＡ細胞のフローサイトメトリーによるヒトＢＣＭＡの発現を示す。図１４Ｄは、フローサイトメトリーによって分析した、生着前（インビトロ）及び肝臓生検（エクスビボ）における生着後のｄｓＲｅｄ ＲＭＡ細胞上のヒトＢＣＭＡの発現を示す。
【図14E】図１４Ｅは、処置の４８時間後にフローサイトメトリーによって分析された肝臓浸潤ＲＭＡ細胞の絶対数（左）及びｄｓＲｅｄ／ｅＧＦＰ細胞比（右）を示す。データを分析するために使用される統計的検定は、マン・ホイットニー検定である。ｐ＞０．０５の場合、非有意（ｎｓ）；有意（＊＊）ｐ＜０．０１。
【図15A】図１５Ａは、１名のＭＭ患者由来の全血由来ＰＢＭＣを１０μｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ、又は２０μｇ／ｍＬの参照－４抗体（抗ＣＤ３８ ＩｇＧ１抗体）、又は対照アイソタイプ（ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ）で一晩処置した後の、ＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋細胞として定義される多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞の割合、並びにＣＤ３－ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞として定義されるＮＫ細胞によるＣＤ１０７ａ及びＣＤ６９の発現の割合のフローサイトメトリーによる測定を示す。左パネルは、１名のＭＭ患者由来のＰＢＭＣのＣＤ１３８及びＣＤ３８染色、並びにＣＤ１３８＋ＣＤ３８＋（ＭＭ）細胞に対するゲーティングを示すドットプロットである。中央パネルの輪郭図は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞のＣＤ１０７ａ及びＣＤ１６染色を示す。右パネルの等高線図は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞のＣＤ６９及びＣＤ１６染色を示す。
【図15B】図１５Ｂ、左の棒グラフは、ＰＢＭＣ中のＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋（ＭＭ）細胞の割合を表し、中央の棒グラフは、ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ３－ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の割合を表し、右の棒グラフは、１０μｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ（黒色）、又は２０μｇ／ｍＬの参照－４抗体（灰色－抗ＣＤ３８ ＩｇＧ１抗体）、又は対照アイソタイプ（白色）で１名のＭＭ患者由来の全血由来ＰＢＭＣを一晩処置した後の、ＣＤ６９を発現するＣＤ３－ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の割合を表す。
【図16A-16C】図１６Ａ～１６Ｃは、治療未経験であるか、又は標準治療後に再発した患者である、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢでエクスビボで治療された患者試料のＭＭ細胞死％を示す。ＴＣ＝治療クラス；≦４ＴＣ：Ｉｍｉｄ、Ｄｅｘ、ＰＩ及び抗ＣＤ３８ｍＡｂ；＞４ＴＣ：以前の薬剤及び／又はアルキル化剤、ＢＨ３模倣物、及び／又はＢＣＭＡ若しくはＣＤ３８ＴＣＥ、及び／又は抗ＣＤ４７ ｍＡｂ、及び／又はヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）。
【図17】図１７は、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥ＿Ｆｃ ＣＯＤＶ－ＯＬ１－ＡＤＥ－ＤＳＢ分子上のＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号８６）、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号８７）及びＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号８８）ペプチドの位置を示す。
【図18】図１８は、雌ｈｕＦｃＲｎ ｔｇ３２トランスジェニックマウスへの単回静脈内（２．５ｍｇ／ｋｇ）投与後のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの平均（Ｎ＝３）血漿中濃度対時間プロファイルを表す。
【図19】図１９は、雌ｈｕＦｃＲｎ ｔｇ３２トランスジェニックマウスへの単回静脈内（２．５ｍｇ／ｋｇ）投与後のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの個々の血漿中濃度対時間プロファイルを表す。
【図20】図２０は、ｈｕＮＫｐ４６－Ｔｇ ｘ Ｒａｇマウスにおける播種性ＥＬ４－ｈｕＢＣＭＡ腫瘍細胞に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ ＣＯＤＶ－ＯＬ１二重特異性抗体の活性を示す。グラフは、５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ ＣＯＤＶ－ＯＬ１二重特異性抗体によって処置された動物についてのカプラン・マイヤー曲線を、参照２化合物に対して表し、対照ＮＫＣＥは、ＣＤ１６（青色）、ＮＫｐ４６（緑色）若しくはＢＣＭＡ結合（黒色）又は未処置群のいずれかについて無効化された。
【図21】図２１は、ｈｕＦｃｇＲ－Ｔｇマウスにおける播種性ＥＬ４－ｈｕＢＣＭＡ腫瘍細胞に対するサロゲートｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＢＣＭＡ ＣＯＤＶ－ＯＬ１ Ｆｃ ＷＴ及びＦＣ－ＡＤＥ二重特異性抗体の活性を示す。グラフは、５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇのＦｃ ＷＴ及びＦｃ－ＡＤＥ ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＢＣＭＡサロゲート二重特異性抗体で処置した動物のカプラン・マイヤー曲線を表す。
【図22】図２２は、キャピラリー電気泳動（ｃＧＥ）によって測定されたＤＴＴによる非還元試料の主ピークの還元のパーセント用量反応曲線を示す。ｍＡｂ ｃｔｒｌ（黄色）、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ｗｔ（青色）、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ（赤色）、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ－ＤＳＢ（黒色）。
【図23A-23B】図２３は、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ｗｔ（パネルＡ）、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ（パネルＢ）、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ－ＤＳＢ（パネルＣ）のＮＥＭ取り込み％／ＤＳＢ減少の用量反応曲線を示す。分析されたシステイン残基は、分析されたタンパク質に従ってナンバリングして図の凡例に示されている。
【図23C】同上。
【図24A】図２４Ａ～図２４Ｂは、ＲＰＭＩ８２２６細胞とのＮＫ細胞共培養物（図２４Ａ）におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの細胞傷害性及びＰＭＢＣとの当該共培養物（図２４Ｂ）における炎症促進性サイトカイン放出（ＩＬ－１－β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ）を示す。
【図24B】図２４Ａ～図２４Ｂは、ＲＰＭＩ８２２６細胞とのＮＫ細胞共培養物（図２４Ａ）におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの細胞傷害性及びＰＭＢＣとの当該共培養物（図２４Ｂ）における炎症促進性サイトカイン放出（ＩＬ－１－β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ）を示す。
【図25A】図２５Ａ～図２５Ｂは、ＮＫ細胞共培養（図２５Ａ）におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの存在下でのＭＭ１Ｒ腫瘍細胞株の増殖、及びＰＭＢＣとの当該共培養（図２５Ｂ）における炎症促進性サイトカイン放出（ＩＬ－１－β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ）を示す。
【図25B】図２５Ａ～図２５Ｂは、ＮＫ細胞共培養（図２５Ａ）におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの存在下でのＭＭ１Ｒ腫瘍細胞株の増殖、及びＰＭＢＣとの当該共培養（図２５Ｂ）における炎症促進性サイトカイン放出（ＩＬ－１－β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ）を示す。
【図26A】図２６Ａ～図２６Ｄは、ＲＰＭＩ ８２２６ ＭＭ細胞の存在下又は非存在下での活性化マーカーＣＤ６９（図２６Ａ及び図２６Ｃ）及びＣＤ１０７ａ／ｂ（図２６Ｂ及び図２６Ｄ）によって示されるＮＫ細胞活性化に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの有効性を示す。
【図26B】同上。
【図26C】同上。
【図26D】同上。
【図27A】図２７Ａ～図２７Ｆは、ＲＰＭＩ ８８２６ ＭＭ細胞の存在下又は非存在下でのＮＫ細胞によるＴＦＮα（図２７Ａ及び図２７Ｄ）、ＩＦＮγ（図２７Ｂ及び図２７Ｅ）及びＭＩＰ１β（図２７Ｃ及び図２７Ｆ）の細胞内産生に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの有効性を示す。
【図27B】同上。
【図27C】同上。
【図27D】同上。
【図27E】同上。
【図27F】同上。
【図28A】図２８Ａ～図２８Ｂは、ＲＰＭＩ ８２２６－ＦＲＰ細胞と共培養したヒト全血を用いたインビトロアッセイにおいて、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）又は陰性対照若しくは陽性対照から調製した１、１０，１００及び３００ ｕｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢで処置した後のＩＦＮ－γ（図２８Ａ）及びＭＩＰ－１α（図２８Ｂ）血漿レベルを示す。
【図28B】図２８Ａ～図２８Ｂは、ＲＰＭＩ ８２２６－ＦＲＰ細胞と共培養したヒト全血を用いたインビトロアッセイにおいて、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）又は陰性対照若しくは陽性対照から調製した１、１０，１００及び３００ ｕｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢで処置した後のＩＦＮ－γ（図２８Ａ）及びＭＩＰ－１α（図２８Ｂ）血漿レベルを示す。
【図29A】図２９Ａ～図２９Ｂは、ＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ細胞と共培養したヒト全血を用いたインビトロアッセイにおいて、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）から調製した１、１０，１００及び３００ｕｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ又は陰性対照若しくは陽性対照で処置した後のＴＮＦ－α（図２９Ａ）及びＩＬ－１β（図２９Ｂ）血漿レベルを示す。
【図29B】図２９Ａ～図２９Ｂは、ＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ細胞と共培養したヒト全血を用いたインビトロアッセイにおいて、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）から調製した１、１０，１００及び３００ｕｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ又は陰性対照若しくは陽性対照で処置した後のＴＮＦ－α（図２９Ａ）及びＩＬ－１β（図２９Ｂ）血漿レベルを示す。
【図30A】図３０Ａ～図３０Ｂは、ＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ細胞と共培養したヒト全血を用いたインビトロアッセイにおいて、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）から調製した１、１０、１００及び３００ｕｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ又は陰性対照若しくは陽性対照で処置した後のＩＬ－６（図３０Ａ）及びＩＬ－８（図３０Ｂ）血漿中レベルを示す。
【図30B】図３０Ａ～図３０Ｂは、ＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ細胞と共培養したヒト全血を用いたインビトロアッセイにおいて、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）から調製した１、１０、１００及び３００ｕｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ又は陰性対照若しくは陽性対照で処置した後のＩＬ－６（図３０Ａ）及びＩＬ－８（図３０Ｂ）血漿中レベルを示す。
【図31A】図３１Ａ～図３１Ｂは、ＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ細胞と共培養したヒト全血を用いたインビトロアッセイにおいて、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）又は陰性対照若しくは陽性対照から調製した１、１０、１００及び３００ｕｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢで処置した後のＩＬ－２（図３１Ａ）及びＧＭ－ＣＳＦ（図３１Ｂ）血漿レベルを示す。
【図31B】図３１Ａ～図３１Ｂは、ＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ細胞と共培養したヒト全血を用いたインビトロアッセイにおいて、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）又は陰性対照若しくは陽性対照から調製した１、１０、１００及び３００ｕｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢで処置した後のＩＬ－２（図３１Ａ）及びＧＭ－ＣＳＦ（図３１Ｂ）血漿レベルを示す。
【図32A】図３２Ａ～図３２Ｂは、ＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ細胞と共培養したヒト全血を用いたインビトロアッセイにおいて、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）又は陰性対照若しくは陽性対照から調製した１、１０、１００及び３００ｕｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢで処置した後のＩＬ－４（図３２Ａ）及びＩＬ－１０（図３２Ｂ）血漿レベルを示す。
【図32B】図３２Ａ～図３２Ｂは、ＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ細胞と共培養したヒト全血を用いたインビトロアッセイにおいて、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）又は陰性対照若しくは陽性対照から調製した１、１０、１００及び３００ｕｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢで処置した後のＩＬ－４（図３２Ａ）及びＩＬ－１０（図３２Ｂ）血漿レベルを示す。
【図33A-33C】図３３Ａ～図３３Ｃは、診断時及び再発時の一次患者試料を用いたインビトロ及びエクスビボでのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢによるＮＫ細胞活性化及び腫瘍細胞枯渇の誘導を示す。図３３ＡはＭＭ細胞死の％であり、図３３ＢはＣＤ１０７＋細胞の％であり、図３３ＣはＩＮＦγ＋細胞の％である。
【発明を実施するための形態】
【0064】
本開示は、免疫ＮＫ細胞上の１つの表面バイオマーカー、すなわちＮＫｐ４６と、正常及び悪性形質細胞の細胞膜上の１つの目的の抗原、すなわちＢＣＭＡとに結合し、ＢＣＭＡ表面バイオマーカーを発現する標的細胞を溶解するようにＮＫ細胞をリダイレクトすることができる多機能結合タンパク質を提供する。本開示の多機能結合タンパク質は、Ｆｃ－γ受容体（ＦｃγＲ）、特に活性化Ｆｃ－γ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＣＤ１６ａとも呼ばれるＦｃγＲＩＩＩａに結合するＦｃ領域又はその変異体の全部又は一部を更に含む。
【0065】
本開示は、改善された熱安定性を有する新規Ｆｃドメイン変異体（例えば、Ｆｃドメイン変異体を含む新規結合ポリペプチド）を提供する。本開示はまた、Ｆｃ受容体への結合が改善された新規Ｆｃドメイン変異体（例えば、Ｆｃドメイン変異体を含む新規結合ポリペプチド）を提供する。本開示は更に、野生型（例えば、非修飾）Ｆｃドメインと比較して抗体エフェクター分子との相互作用を増強するグリコシル化Ｆｃドメインを含む新規Ｆｃドメイン変異体（例えば、Ｆｃドメイン変異体を含む結合ポリペプチド）を提供する。本開示はまた、Ｆｃドメイン変異体（例えば、Ｆｃドメイン変異体を含む新規結合ポリペプチド）をコードする核酸、Ｆｃドメイン変異体（例えば、Ｆｃドメイン変異体を含む新規結合ポリペプチド）を作製するための組換え発現ベクター及び宿主細胞、並びに単離されたＦｃドメイン変異体（例えば、Ｆｃドメイン変異体を含む新規結合ポリペプチド）を含む医薬組成物を提供する。１つ以上の疾患又は障害を処置するために本開示のＦｃドメイン変異体（例えば、Ｆｃドメイン変異体を含む新規結合ポリペプチド）を使用する方法も提供される。
【0066】
本開示に記載される方法は、そのような方法及び条件が変化し得るため、本明細書に開示される特定の方法及び実験条件に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解されたい。
【0067】
さらに、本明細書に記載の実験は、特に指示しない限り、当業者の技術の範囲内の従来の分子的及び細胞的生物学的及び免疫学的技術を使用する。そのような技術は当業者に周知であり、文献で十分に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９８７－２００８）（全てのサプリメントを含む）、ＭＲ Ｇｒｅｅｎ及びＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版）、並びにＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２０１３年、第２版）を参照されたい。
【0068】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。潜在的な曖昧さがある場合、本明細書で提供される定義は、辞書又は外部定義に優先する。文脈上他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。「又は」の使用は、特に明記しない限り、「及び／又は」を意味する。「含む／挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語並びに「含む／挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる／挙げられる（
ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等の他の形態の使用は限定的ではない。
ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等の他の形態の使用は限定的ではない。
【0069】
一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は周知であり、当技術分野で一般的に使用される。本明細書で提供される方法及び技術は、一般に、特に指示がない限り、当技術分野で周知の従来の方法に従って、本明細書を通して引用及び議論される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されているように実施される。酵素反応及び精製技術は、当技術分野において一般的に遂行される通り又は本明細書に記載の通り、製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医薬品及び医薬化学に関連して使用される命名法、並びにその実験手順及び技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な技術は、患者の化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化及び送達、並びに治療に使用される。
【0070】
本開示がより容易に理解され得ることから、選択用語を以下に定義する。
【0071】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指し、文脈に矛盾しない限り、天然若しくは人工のタンパク質、タンパク質配列のポリペプチド類似体若しくは変異体、又はそれらの断片を包含する。ポリペプチドは、単量体又は多量体であり得る。ポリペプチド断片は、例えば、少なくとも約５個の連続するアミノ酸、少なくとも約１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１５個の連続するアミノ酸、又は少なくとも約２０個の連続するアミノ酸を含む。
【0072】
「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源又は由来源により、その天然の状態でそれに付随する天然に関連する成分に関連しない；同じ種由来の他のタンパク質を実質的に含まない；異なる種由来の細胞によって発現される；又は自然界では生じないタンパク質又はポリペプチドを指す。したがって、天然に由来する細胞とは異なる細胞系で化学合成又は合成されるタンパク質又はポリペプチドは、その天然に関連する成分から「単離される」。タンパク質又はポリペプチドはまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して単離することによって、天然に関連する成分を実質的に含まないようにしてもよい。
【0073】
本明細書で使用される場合、「結合タンパク質」又は「結合ポリペプチド」という用語は、目的の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）への選択的結合に関与する少なくとも１つの結合部位を含むタンパク質又はポリペプチド（例えば、抗体又はイムノアドヘシン）を指す。例示的な結合部位としては、抗体可変ドメイン、受容体のリガンド結合部位、又はリガンドの受容体結合部位が挙げられる。特定の態様では、結合タンパク質又は結合ポリペプチドは、複数の（例えば、２、３、４、又はそれ以上）結合部位を含む。特定の態様では、結合タンパク質又は結合ポリペプチドは治療用酵素である。
【0074】
「リガンド」という用語は、別の物質に結合することができる、又は結合することができる任意の物質を指す。同様に、「抗原」という用語は、抗体が生成され得る任意の物質を指す。「抗原」は抗体結合基質に関して一般的に使用され、「リガンド」は受容体結合基質に関して使用されることが多いが、これらの用語は、一方と他方とを区別するものではなく、広範囲の重複する化学的実体を包含する。疑義を回避するため、抗原及びリガンドは、本明細書全体を通して同義に使用される。抗原／リガンドは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アプタマー、多糖、糖分子、炭水化物、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成分子、無機分子、有機分子、及びそれらの任意の組み合わせであり得る。
【0075】
結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）は、例えば、表面プラズモン共鳴により決定することができる。一般に、表面プラズモン共鳴分析は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、リガンド（バイオセンサーマトリックス上の標的抗原）と検体（溶液中の結合タンパク質）との間のリアルタイム結合相互作用を測定する。アナライト（バイオセンサーマトリックス上の結合タンパク質）を固定化し、リガンド（標的抗原）を提示することにより、表面プラズモン解析を行うこともできる。本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、特定の結合タンパク質と標的抗原との間の相互作用の解離定数を指す。
【0076】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、最大で約１×１０－６Ｍ、約１×１０－７Ｍ、約１×１０－８Ｍ、約１×１０－９Ｍ、約１×１０－１０Ｍ、約１×１０－１１Ｍ、約１×１０－１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で標的（例えば、抗原）に結合する、及び／又は非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも約２倍大きい親和性で抗原に結合する抗体又はイムノアドヘシンの能力を指す。抗体の特異的結合は、ＣＤＲ配列を介した標的抗原への結合であり得る。抗体はまた、Ｆｃ領域を介してＦｃＲｎ又はＦｃγＲＩＩＩａ等のＦｃＲに特異的に結合することができる。
【0077】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、目的の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に対して有意な既知の特異的免疫反応性活性を有するそのような集合体（例えば、インタクトな抗体分子、イムノアドヘシン、又はそれらの変異体）を指す。抗体及び免疫グロブリンは、軽鎖及び重鎖を含み、それらの間に鎖間共有結合があってもなくてもよい。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている。
【0078】
以下により詳細に考察するように、一般用語「抗体」は、生化学的に区別することができる５つの異なるクラスの抗体を含む。５つ全てのクラスの抗体が明らかに本開示の範囲内であるが、以下の議論は一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは、分子量およそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖と、分子量５３，０００～７０，０００の２つの同一の重鎖とを含む。４つの鎖は、軽鎖が「Ｙ」の口から始まり可変領域を通って続く重鎖を支持する「Ｙ」配置のジスルフィド結合によってつながっている。
【0079】
免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかと結合し得る。一般に、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「尾部」部分は共有ジスルフィド結合又は非共有結合によって互いに結合する。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ配置の分岐した末端のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端まで延びる。当業者は、重鎖がガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はイプシロン（ε）として分類され、それらの中にいくつかのサブクラスがあることを理解するであろう（例えば、γｌ－γ４）。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンアイソタイプサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等。）は、十分に特徴付けられており、機能的な特殊化を付与することが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの修飾バージョンは、本開示を考慮すると当業者には容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内である。
【0080】
軽鎖及び重鎖の両方が、構造的相同性及び機能的相同性の領域に分けられる。「領域」という用語は、免疫グロブリン又は抗体鎖の一部又は一部を指し、定常領域又は可変領域、並びに当該領域のより別個の部分又は一部を含む。例えば、軽鎖可変領域は、本明細書
で定義される「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」の間に散在する「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」を含む。
で定義される「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」の間に散在する「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」を含む。
【0081】
免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の領域は、「定常領域」の場合には様々なクラスメンバーの領域内の配列変異の相対的欠如に基づいて、又は「可変領域」の場合には様々なクラスメンバーの領域内の有意な変異に基づいて、「定常」（Ｃ）領域又は「可変」（Ｖ）領域として定義され得る。「定常領域」及び「可変領域」という用語はまた、機能的に使用され得る。これに関して、免疫グロブリン又は抗体の可変領域が抗原認識及び特異性を決定することが理解されよう。逆に、免疫グロブリン又は抗体の定常領域は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等の重要なエフェクター機能を付与する。様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元構成は周知である。
【0082】
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域は、ドメインに折り畳まれる。「ドメイン」という用語は、例えば、βプリーツシート及び／又は鎖内ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループ（例えば、３～４個のペプチドループを含む）を含む重鎖又は軽鎖の球状領域を指す。免疫グロブリンの軽鎖上の定常領域ドメインは、「軽鎖定常領域ドメイン」、「ＣＬ領域」、「ＣＬドメイン」又は「ＣＫドメイン」と同義に呼ばれる。重鎖上の定常ドメイン（例えば、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン）は、「重鎖定常領域ドメイン」、「ＣＨ」領域ドメイン又は「ＣＨドメイン」と同義に呼ばれる。軽鎖上の可変ドメインは、「軽鎖可変領域ドメイン」、「ＶＬ領域ドメイン」又は「ＶＬドメイン」と同義に呼ばれる。重鎖上の可変ドメインは、「重鎖可変領域ドメイン」、「ＶＨ領域ドメイン」又は「ＶＨドメイン」と同義に呼ばれる。
【0083】
慣例により、可変定常領域ドメインのアミノ酸のナンバリングは、それらが免疫グロブリン又は抗体の抗原結合部位又はアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。各重及び軽免疫グロブリン鎖のＮ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である。ＣＨ３ドメイン及びＣＬドメインは、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。したがって、軽鎖免疫グロブリンのドメインはＶＬ－ＣＬ配向で配置され、重鎖のドメインはＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３配向で配置される。
【0084】
各可変領域ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７ ａｎｄ １９９１）の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、異なる重鎖可変領域間又は異なる軽鎖可変領域間の対応する残基に同じ番号を割り当てる、広く使用されているナンバリング規則（Ｋａｂａｔナンバリング）を提供する。ＶＬドメインのＣＤＲ １、２及び３は、本明細書ではそれぞれＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３とも呼ばれる。ＶＨドメインのＣＤＲ １、２及び３は、本明細書ではそれぞれＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３とも呼ばれる。そうであれば、ＣＤＲの割り当ては、Ｋａｂａｔの代わりにＩＭＧＴ（登録商標）（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７：５５－７７；２００３）に従うことができる。重鎖定常領域のナンバリングは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７ ａｎｄ １９９１）に記載のＥＵインデックスによる。所与のＣＤＲ又はＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム），ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６），“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２－７４５．（「接触」ナンバリングスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ ｅｔ ａｌ．，“ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３ Ｊａｎｕａｒｙ；２７（１）：５５－７７（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）、及びＨｏｎｅｇｇｅｒ Ａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ，“Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ，”Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００１ Ｊｕｎ．８；３０９（３）：６５７－７０（ＡＨｏナンバリングスキーム）によって記載されたものを含むいくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。
ｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム），ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６），“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２－７４５．（「接触」ナンバリングスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ ｅｔ ａｌ．，“ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３ Ｊａｎｕａｒｙ；２７（１）：５５－７７（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）、及びＨｏｎｅｇｇｅｒ Ａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ，“Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ，”Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００１ Ｊｕｎ．８；３０９（３）：６５７－７０（ＡＨｏナンバリングスキーム）によって記載されたものを含むいくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。
【0085】
所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、識別に使用されるスキームに応じて異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造アラインメントに基づくが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造情報に基づく。Ｋａｂａｔスキーム及びＣｈｏｔｈｉａスキームの両方に対するナンバリングは、最も一般的な抗体領域配列長に基づいており、挿入は、挿入文字、例えば「３０ａ」によって収容され、欠失は、いくつかの抗体において現れる。２つのスキームは、異なる位置に特定の挿入及び欠失（「インデル」）を配置し、異なるナンバリングをもたらす。接触スキームは、複雑な結晶構造の分析に基づいており、多くの点でＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに類似している。
【0086】
本明細書で使用される場合、抗体のＣＤＲを、Ｌｅｆｒａｎｃ（１９９９），Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，ｖｏｌ．７：１３２－１３６及びＬｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２７：２０９－２１２に記載されている「ＩＭＧＴ」と呼ばれるナンバリングシステムに従って決定することができる。
【0087】
本明細書で使用される場合、抗体のＣＤＲを、免疫グロブリン構造ループの位置を指すＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに従って決定することができる。Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２７３：９２７－９４８；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２２７：７９９－８１７；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ Ａ ｅｔ
ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２１５（１）：１７５－８２．
ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２１５（１）：１７５－８２．
【0088】
本明細書で使用される場合、抗体のＣＤＲを、Ｈｏｎｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．３０９（３）：６５７－６７０に記載されるＨｏｎｅｇｇｅｒ－Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎナンバリングスキームに従って決定することができる。
【0089】
本明細書で使用される場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＶＬドメイン」という用語は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ末端可変ドメインを含む。
【0090】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、例えばＫａｂａｔナンバリングシステムの約１１４～２２３の位置（ＥＵ位置１１８～２１５）から延びる免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端にあり、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部を形成しない。
【0091】
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインにつなぐ重鎖分子の一部を含む。ヒンジ領域はおよそ２５残基を含み、柔軟であり、したがって２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、以下の３つの異なるドメインに細分することができる。上部、中央、及び下部ヒンジドメイン（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６１：４０８３）。
【0092】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムの約２４４～３６０の位置（ＥＵ位置２３１～３４０）から延びる重鎖免疫グロブリン分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対になっていないという点で独特である。むしろ、２つのＮ結合分枝炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挟まれている。一実施形態では、本開示の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。
【0093】
本明細書で使用される場合、「ＣＨ３ドメイン」という用語は、ＣＨ２ドメインのＮ末端から、例えばＫａｂａｔナンバリングシステムの約３６１位～４７６位（ＥＵ位置３４１～４４５位）からおよそ１１０残基延びる重鎖免疫グロブリン分子の部分を含む。ＣＨ３ドメインは、典型的には、抗体のＣ末端部分を形成する。しかしながら、いくつかの免疫グロブリンでは、更なるドメインがＣＨ３ドメインから伸長して、分子のＣ末端部分を形成し得る（例えば、ＩｇＭのμ鎖中のＣＨ４ドメイン及びＩｇＥのｅ鎖）。一実施形態では、本開示の結合ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【0094】
本明細書で使用される場合、「ＣＬドメイン」という用語は、例えばＫａｂａｔ位置約１０７ＡからＫａｂａｔ位置約２１６まで延びる免疫グロブリン軽鎖の定常領域ドメインを含む。ＣＬドメインはＶＬドメインに隣接している。一実施形態では、本開示の結合ポリペプチドは、カッパ軽鎖（例えば、ヒトカッパ軽鎖）に由来するＣＬドメインを含む。
【0095】
抗体の可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメインとＶＨドメインが組み合わさって、三次元抗原結合部位を規定する可変領域（Ｆｖ）を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって定義される。本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原（例えば、細胞表面又は可溶性抗原）に特異的に結合する部位を含む。抗原結合部位は免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を含み、これらの可変領域によって形成される結合部位は抗体の特異性を決定する。抗原結合部位は、抗体ごとに異なる可変領域によって形成される。本開示の改変された抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を含む。
【0096】
特定の実施形態では、本開示の結合ポリペプチドは、結合ポリペプチドと選択された抗原との会合を提供する少なくとも２つの抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、同じ免疫グロブリン分子に由来する必要はない。これに関して、可変領域は、体液性応答を開始し、所望の抗原に対する免疫グロブリンを生成するように誘導することができる任意の種類の動物に由来してもよい。したがって、結合ポリペプチドの可変領域は、例えば、哺乳動物起源のものであり得、例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、非ヒト
霊長類（例えばカニクイザル、マカク等）、ルピナス（ｌｕｐｉｎｅ）又はラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ及び関連種から）であり得る。
霊長類（例えばカニクイザル、マカク等）、ルピナス（ｌｕｐｉｎｅ）又はラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ及び関連種から）であり得る。
【0097】
天然に存在する抗体では、各単量体抗体上に存在する６つのＣＤＲは、抗体が水性環境でその三次元構成をとるときに抗原結合部位を形成するように特異的に配置されるアミノ酸の短い不連続配列である。重及び軽可変ドメインの残りの部分は、アミノ酸配列においてより少ない分子間変動性を示し、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は、主にβシート立体配座をとり、ＣＤＲは、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によって６つのＣＤＲを正しい向きに配置する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を画定する。この相補的な表面は、免疫反応性抗原エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。
【0098】
例示的な結合ポリペプチドは、抗体変異体を含む。本明細書で使用される場合、「抗体変異体」という用語は、天然に存在しないように改変された抗体、例えば、少なくとも２つの重鎖部分を含むが２つの完全な重鎖を含まない抗体の合成形態及び操作形態（例えば、ドメイン欠失抗体又はミニボディ）；２つ以上の異なる抗原又は単一抗原上の異なるエピトープに結合するように改変された多重特異性形態の抗体（例えば、二重特異性、三重特異性等で）；ｓｃＦｖ分子等につながった重鎖分子を含む。さらに、「抗体変異体」という用語は、抗体の多価形態（例えば、同じ抗原の３つ、４つ又はそれを超えるコピーに結合する三価、四価等の抗体）を含む。
【0099】
本明細書で使用される場合、「結合価」という用語は、ポリペプチド中の潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、標的分子上の１つの標的分子又は特異的部位に特異的に結合する。ポリペプチドが２つ以上の標的結合部位を含む場合、各標的結合部位は、同じ又は異なる分子（例えば、異なるリガンド若しくは異なる抗原、又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合し得る）に特異的に結合し得る。対象結合ポリペプチドは、典型的には、ヒト抗原分子に特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。例えば、典型的なＩｇＧ１モノクローナル抗体は、１つの標的抗原に特異的である。二価抗体は、２つの異なる抗原を標的とする抗原結合ドメイン、又は１つの抗原を標的とする２つの抗原結合ドメインを含むものである。同様に、三価抗体は、単一抗原に対する３つの標的化ドメインを有する単一特異性抗体であり得る。三価抗体は、２つの結合ドメインを有する第１の抗原及び別の結合ドメインを有する第２の抗原に結合する場合、二重特異性であり得る。三価抗体は三重特異性であり得、３つの異なる標的に結合する。
【0100】
「特異性」という用語は、所与の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）に特異的に結合する（例えば、）能力を指す。結合ポリペプチドは単一特異性であり得、標的に特異的に結合する１つ以上の結合部位を含み得るか、又はポリペプチドは多重特異性であり得、同じ又は異なる標的に特異的に結合する２つ以上の結合部位を含み得る。特定の実施形態では、結合ポリペプチドは、同じ標的の２つの異なる（例えば、重なり合わない）部分に特異的である。特定の実施形態では、結合ポリペプチドは、２つ以上の標的に特異的である。腫瘍細胞上に発現される抗原に結合する抗原結合部位を含む例示的な結合ポリペプチド（例えば、抗体）は当技術分野で公知であり、そのような抗体からの１つ以上のＣＤＲは、本明細書に記載の抗体に含めることができる。
【0101】
本明細書で使用される場合、「抗原」又は「標的抗原」という用語は、結合ポリペプチドの結合部位によって結合され得る分子又は分子の一部を指す。標的抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【0102】
「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の約１０％以内、約５％以内、又は約１％以下等、約２０％以内を意味する。
【0103】
本明細書で使用される場合、「投与する」又は「投与」は、それだけに限らないが、肺（例えば、吸入）、粘膜（例えば、鼻腔内）、皮内、静脈内、筋肉内、皮下送達、及び／又は本明細書に記載される若しくは当技術分野で公知の任意の他の物理的送達方法等によって、体外（例えば、本明細書で提供される単離された結合ポリペプチド）に存在する物質を患者に注射又は他の方法で物理的に送達する行為を指す。疾患又はその症状が管理又は治療されている場合、物質の投与は、典型的には、疾患又はその症状の発症後に行われる。疾患又はその症状が予防されている場合、物質の投与は、典型的には、疾患又はその症状の発症前に行われ、疾患関連症状の出現又は大きさを延期又は減少させるために慢性的に継続され得る。
【0104】
本明細書で使用される場合、「組成物」という用語は、特定の成分（例えば、本明細書で提供される単離された結合ポリペプチド）を任意に特定の量で含有する生成物、並びに特定の成分の任意選択により特定の量の組み合わせから直接又は間接的に生じる任意の生成物を包含することを意図する。
【0105】
「有効量」は、薬剤を必要とする個体において所望の生理学的転帰を達成するのに十分な活性医薬（例えば、本開示の単離された結合ポリペプチド）の量を意味する。有効量は、治療される個体の健康及び体調、治療される個体の分類群、組成物の製剤、個体の病状の評価、及び他の関連因子に応じて個体間で異なり得る。
【0106】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は互換的に使用される。本明細書で使用される場合、対象は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）又は霊長類（例えば、サル及びヒト）等の哺乳動物であり得る。特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物等の脊椎動物を指す。哺乳動物としては、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、野生動物、野生化動物（ｆｅｒａｌ ａｎｉｍａｌ）、家畜、スポーツ動物及びペットが挙げられる。
【0107】
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、疾患又はそれに関連する症状の予防、管理、治療及び／又は改善に使用することができる任意のプロトコル、方法及び／又は薬剤を指す。いくつかの実施形態では、「治療」という用語は、対象における感染又はそれに関連する症状に対する免疫応答の調節に使用することができる任意のプロトコル、方法及び／又は薬剤を指す。いくつかの実施形態では、「治療法／療法（複数）」及び「治療法／療法」という用語は、生物学的療法、支持療法、及び／又は医療従事者等の当業者に知られている、疾患又はそれに関連する症状の予防、管理、治療及び／又は改善に有用な他の療法を指す。他の実施形態では、「治療法／療法（複数）」及び「治療法／療法」という用語は、生物学的療法、支持療法、及び／又は医療従事者等の当業者に知られている、対象における感染に対する免疫応答若しくはそれに関連する症候の調節に有用な他の療法指す。
【0108】
本明細書で使用される場合、「治療／処置する（ｔｒｅａｔ）」、「治療／処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及び「治療／処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、１つ以上の治療（限定されないが、１つ以上の予防剤又は治療剤、例えば、本明細書中に提供される単離された結合ポリペプチドの投与を含む）の投与から生じる疾患又はそれに関連する症状の進行、重症度及び／又は持続期間の減少又は改善を指す。本明細書で使用される場合、「治療／処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語はまた、治療される対象の疾患経過を変化させることを指すこともできる。治療の治療効果としては、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症状（）の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果
の減少、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、並びに寛解又は予後の改善が挙げられる。
の減少、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、並びに寛解又は予後の改善が挙げられる。
【0109】
ＢＣＭＡ
本明細書で使用される場合、用語「ＢＣＭＡ」とは、Ｂ細胞成熟抗原のことを指す。ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＣＭ又はＣＤ２６９としても知られている）は腫瘍壊死受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーであり、主に最終分化Ｂ細胞、例えばメモリーＢ細胞及び形質細胞上に発現される。そのリガンドは、ＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）と呼ばれる。ＢＣＭＡは、長期の体液性免疫を維持するための形質細胞の生存の媒介に関与する。ＢＣＭＡの遺伝子は、１６番染色体上にコードされ、１８４アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿００１１８３．２）をコードする９９４ヌクレオチド長（ＮＣＢＩアクセッションＮＭ＿００１１９２．２）の一次３５ ｍＲＮＡ転写物を生成する。ＢＣＭＡ遺伝子座に由来する第２のアンチセンス転写物が記載されており、これはＢＣＭＡ発現の調節に役割を果たし得る。（Ｌａａｂｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２：１１４７－１１５４）更なる転写変異体が、未知の有意性で記載されている（Ｓｍｉｒｎｏｖａ Ａ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，４５（４）：１１７９－１１８３。ＴＶ４としても知られる第２のアイソフォームが同定されている（Ｕｎｉｐｒｏｔ識別子Ｑ０２２２３－２）。「ＢＣＭＡ」は、全長野生型ＢＣＭＡの変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失、及びスプライス変異体を含むタンパク質を含む。
本明細書で使用される場合、用語「ＢＣＭＡ」とは、Ｂ細胞成熟抗原のことを指す。ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＣＭ又はＣＤ２６９としても知られている）は腫瘍壊死受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーであり、主に最終分化Ｂ細胞、例えばメモリーＢ細胞及び形質細胞上に発現される。そのリガンドは、ＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）と呼ばれる。ＢＣＭＡは、長期の体液性免疫を維持するための形質細胞の生存の媒介に関与する。ＢＣＭＡの遺伝子は、１６番染色体上にコードされ、１８４アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿００１１８３．２）をコードする９９４ヌクレオチド長（ＮＣＢＩアクセッションＮＭ＿００１１９２．２）の一次３５ ｍＲＮＡ転写物を生成する。ＢＣＭＡ遺伝子座に由来する第２のアンチセンス転写物が記載されており、これはＢＣＭＡ発現の調節に役割を果たし得る。（Ｌａａｂｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２：１１４７－１１５４）更なる転写変異体が、未知の有意性で記載されている（Ｓｍｉｒｎｏｖａ Ａ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，４５（４）：１１７９－１１８３。ＴＶ４としても知られる第２のアイソフォームが同定されている（Ｕｎｉｐｒｏｔ識別子Ｑ０２２２３－２）。「ＢＣＭＡ」は、全長野生型ＢＣＭＡの変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失、及びスプライス変異体を含むタンパク質を含む。
【0110】
ナチュラルキラー細胞
本明細書で使用される場合、「ナチュラルキラー細胞」又は「ＮＫ細胞」は、自然免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞に対するＣＤ１６、ＣＤ５６及び／又はＣＤ５７、ＮＫｐ４６を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面上のアルファ／ベータ又はガンマ／デルタＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解機構の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞に結合して死滅させる能力、ＮＫ活性化受容体に対するリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の疾患細胞を死滅させる能力、並びに免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力等の特定の特徴及び生物学的特性によって同定することができる。これらの特徴及び活性のいずれも、当技術分野で周知の方法を使用してＮＫ細胞を同定するために使用することができる。ＮＫ細胞の任意の亜集団もまた、ＮＫ細胞という用語に包含される。本明細書の文脈内で、「活性」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解する能力又は他の細胞の免疫機能を増強する能力を有するＮＫ細胞を含む、生物学的に活性なＮＫ細胞を指す。ＮＫ細胞は、血液試料からの単離、細胞吸着除去療法（ｃｙｔａｐｈｅｒｅｓｉｓ）、組織又は細胞の採取等、当技術分野で公知の様々な技術によって得ることができる。ＮＫ細胞を含むアッセイに有用なプロトコルは、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＳ及びＣｏｌｏｎｎａ Ｍによって編集）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．２１９－２３８（２０００）に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「ナチュラルキラー細胞」又は「ＮＫ細胞」は、自然免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞に対するＣＤ１６、ＣＤ５６及び／又はＣＤ５７、ＮＫｐ４６を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面上のアルファ／ベータ又はガンマ／デルタＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解機構の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現しない細胞に結合して死滅させる能力、ＮＫ活性化受容体に対するリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の疾患細胞を死滅させる能力、並びに免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力等の特定の特徴及び生物学的特性によって同定することができる。これらの特徴及び活性のいずれも、当技術分野で周知の方法を使用してＮＫ細胞を同定するために使用することができる。ＮＫ細胞の任意の亜集団もまた、ＮＫ細胞という用語に包含される。本明細書の文脈内で、「活性」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解する能力又は他の細胞の免疫機能を増強する能力を有するＮＫ細胞を含む、生物学的に活性なＮＫ細胞を指す。ＮＫ細胞は、血液試料からの単離、細胞吸着除去療法（ｃｙｔａｐｈｅｒｅｓｉｓ）、組織又は細胞の採取等、当技術分野で公知の様々な技術によって得ることができる。ＮＫ細胞を含むアッセイに有用なプロトコルは、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＳ及びＣｏｌｏｎｎａ Ｍによって編集）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．２１９－２３８（２０００）に見出すことができる。
【0111】
ＮＫｐ４６
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３３５」又は「ＮＫＰ４６」又は「ＮＫ－ｐ４６」又は「ＬＹ９４」としても知られる「ＮＫｐ４６」マーカー又は「天然細胞傷害性誘発受容体１」は、Ｎｃｒ１遺伝子によってコードされるタンパク質又はポリペプチドを指す。全長ヒトＮＫｐ４６タンパク質の参照配列は、アクセッション番号ＮＰ＿００４８２０でＮＣＢＩデータベースから入手可能である。ヒトＮＫｐ４６ ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８２９に記載されている。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３３５」又は「ＮＫＰ４６」又は「ＮＫ－ｐ４６」又は「ＬＹ９４」としても知られる「ＮＫｐ４６」マーカー又は「天然細胞傷害性誘発受容体１」は、Ｎｃｒ１遺伝子によってコードされるタンパク質又はポリペプチドを指す。全長ヒトＮＫｐ４６タンパク質の参照配列は、アクセッション番号ＮＰ＿００４８２０でＮＣＢＩデータベースから入手可能である。ヒトＮＫｐ４６ ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８２９に記載されている。
【0112】
ＮＫ細胞エンゲージャー
本明細書で使用される場合、単離されたエフェクターコンピテントポリペプチドは、Ｎ
Ｋ細胞エンゲージャーフォーマットの多重特異性抗体を含む。「ＮＫ細胞エンゲージャー」は、活性化ＮＫ細胞受容体、抗原特異的標的化領域、及び任意にＦｃ領域を標的化するモノクローナル抗体ドメインを含む結合タンパク質を指す（Ｇａｕｔｈｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｅｌｌ，１７７：１７０１－１３）。ＮＫ細胞は、抗体のＦｃ部分に低親和性で結合するＦｃγＲＩＩＩａとしても知られるＣＤ１６ａを発現する（Ｃｅｒｗｅｎｋａ ａｎｄ Ｌａｎｉｅｒ（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：６３８３）。ＣＤ１６ａの係合は、立体障害がより低いためにＣＤ３係合と比較して要求が少なく、補助分子の欠如によって更に促進される。抗体で装飾された標的細胞を認識すると、ＮＫ細胞は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、標的細胞を死滅させる（Ｌｏ Ｎｉｇｒｏ（２０１９）Ａｎｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７：１０５）。この天然に存在する機構を利用して、ＮＫｐ４６（別の活性化ＮＫ細胞受容体）と組み合わせてＣＤ１６を係合させて、三機能性ナチュラルキラー細胞エンゲージャー（すなわち、ＮＫＣＥ）を生成し、印象的な治療転帰をもたらすことができる。ＮＫ細胞エンゲージャーの総説については、Ｄｅｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５１（８）：１９３４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、単離されたエフェクターコンピテントポリペプチドは、Ｎ
Ｋ細胞エンゲージャーフォーマットの多重特異性抗体を含む。「ＮＫ細胞エンゲージャー」は、活性化ＮＫ細胞受容体、抗原特異的標的化領域、及び任意にＦｃ領域を標的化するモノクローナル抗体ドメインを含む結合タンパク質を指す（Ｇａｕｔｈｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｅｌｌ，１７７：１７０１－１３）。ＮＫ細胞は、抗体のＦｃ部分に低親和性で結合するＦｃγＲＩＩＩａとしても知られるＣＤ１６ａを発現する（Ｃｅｒｗｅｎｋａ ａｎｄ Ｌａｎｉｅｒ（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：６３８３）。ＣＤ１６ａの係合は、立体障害がより低いためにＣＤ３係合と比較して要求が少なく、補助分子の欠如によって更に促進される。抗体で装飾された標的細胞を認識すると、ＮＫ細胞は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、標的細胞を死滅させる（Ｌｏ Ｎｉｇｒｏ（２０１９）Ａｎｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７：１０５）。この天然に存在する機構を利用して、ＮＫｐ４６（別の活性化ＮＫ細胞受容体）と組み合わせてＣＤ１６を係合させて、三機能性ナチュラルキラー細胞エンゲージャー（すなわち、ＮＫＣＥ）を生成し、印象的な治療転帰をもたらすことができる。ＮＫ細胞エンゲージャーの総説については、Ｄｅｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５１（８）：１９３４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0113】
三官能性ＮＫＣＥは、同じ抗原を標的とする臨床治療抗体よりもインビトロで強力であり、完全ＩｇＧ抗体と同様のインビボ薬物動態を有し、オフターゲット効果はない。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２１／６２４９４号を参照されたい。
【0114】
Ｆｃドメイン
本開示の特定の態様では、Ｆｃドメイン、例えばＦｃドメイン変異体が提供される。本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」という用語は、パパイン切断部位（すなわち、ＩｇＧ中の残基２１６、重鎖定常領域の最初の残基を１１４とする）のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる重鎖定常領域の部分を指す。したがって、完全なＦｃ領域は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
本開示の特定の態様では、Ｆｃドメイン、例えばＦｃドメイン変異体が提供される。本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」という用語は、パパイン切断部位（すなわち、ＩｇＧ中の残基２１６、重鎖定常領域の最初の残基を１１４とする）のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる重鎖定常領域の部分を指す。したがって、完全なＦｃ領域は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【0115】
抗体のＦｃ領域は、非抗原結合に関与し、Ｆｃ受容体に結合することによってエフェクター機能を媒介することができる。Ｆｃ受容体にはいくつかの異なるタイプがあり、それらはそれらが認識する抗体のタイプに基づいて分類される。例えば、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）はＩｇＧクラス抗体に結合し、Ｆｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）はＩｇＡクラス抗体に結合し、Ｆｃ－イプシロン受容体（ＦｃεＲ）はＩｇＥクラス抗体に結合する。新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体のＦｃ領域と相互作用して、正常なリソソーム分解の救済による抗体リサイクルを促進する。ＦｃγＲは、いくつかのメンバー、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂを含むファミリーに属する。
【0116】
本明細書で使用される場合、「天然Ｆｃ」又は「野生型Ｆｃ」という用語は、抗体の消化から生じるか、又は単量体若しくは多量体形態であるかにかかわらず、他の手段によって産生された非抗原結合断片の配列に対応する分子を指し、ヒンジ領域を含むことができる。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン源は、典型的にはヒト起源であり、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１及びＩｇＧ２であり得る。天然Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合によって二量体又は多量体形態に連結することができる単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ）又はサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、及びＩｇＧＡ２）に応じて１～４つの範囲にある。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化に起因するジスルフィド結合二量体である。本明細書で使用される場合、「天然Ｆｃ」という用語は、単量体、二量体及び多量
体形態のどれにも使える。
体形態のどれにも使える。
【0117】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン変異体」、「Ｆｃ変異体」又は「修飾Ｆｃ」という用語は、天然／野生型Ｆｃから修飾されているが、依然としてＦｃＲの結合部位を含む分子又は配列を指す。したがって、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含むことができる。さらに、天然Ｆｃは、本明細書中に記載される抗体様結合ポリペプチドに必要とされない構造的特徴又は生物学的活性を提供するので、除去され得る領域を含む。したがって、「Ｆｃ変異体」という用語は、１つ以上の天然Ｆｃ部位若しくは残基を欠くか、又は１つ以上のＦｃ部位若しくは残基が修飾されており、以下に影響を及ぼすか又は関与する分子又は配列を含む：（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現時のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。
【0118】
本明細書で使用される場合、「エフェクターコンピテント（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｆｃ変異体」又は「エフェクターコンピテントポリペプチド」は、本明細書中に更に記載されるような１つ以上のＦｃエフェクター機能を有するＦｃドメインをいう。
【0119】
特定の例示的な実施形態では、本明細書において特徴付けられるＦｃ変異体は、野生型Ｆｃと比較して、増加した血清半減期、増強されたＦｃＲｎ結合親和性、酸性ｐＨでの増強されたＦｃＲｎ結合親和性、増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性、及び／又は同様の熱安定性の１つ以上を有する。
【0120】
ＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１７６、又はＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８、又はヒトＣＤ１６ａ－Ｖ受容体、又はＣＤ１６ａＶは、天然抗体のＦｃ領域に結合し、抗体依存性細胞傷害性を媒介し、位置１７６又は位置１５８にバリン（Ｖ）を持つＣＤ１６ヒト受容体の断片を含むポリペプチドコンストラクトを指し、これは文献ではアロタイプＣＤ１６ａ Ｖ１７６又はアロタイプＣＤ１６ａ Ｖ１５８としても報告されている。
【0121】
ＦｃγＲＩＩＩａ Ｆ１７６、又はＦｃγＲＩＩＩａ Ｆ１５８、又はヒトＣＤ１６ａ－Ｆ受容体、又はＣＤ１６ａＦは、天然抗体のＦｃ領域に結合し、抗体依存性細胞傷害性を媒介し、位置１７６又は位置１５８にフェニルアラニン（Ｆ）を持つＣＤ１６ヒト受容体の断片を含むポリペプチドコンストラクトを指し、アロタイプＣＤ１６ａ Ｆ１７６又はアロタイプＣＤ１６ａ Ｆ１５８として文献にも報告されている。
【0122】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」という用語は、本明細書で定義される天然／野生型Ｆｃ及びＦｃ変異体並びに配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃ分子と同様に、「Ｆｃドメイン」という用語は、全抗体から消化されるか、又は他の手段によって産生されるかにかかわらず、単量体又は多量体形態の分子を含む。
【0123】
特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載のＦｃドメインは熱的に安定化されている。
【0124】
特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載のＦｃドメインは、グリコシル化（例えば、Ｎ－結合型グリコシル化を介して）されている。特定の例示的な実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばアミノ酸配列ＮＸＴ又はＮＸＳ（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸残基である）を含むＮ結合型グリコシル化モチーフにＮ結合型グリコシル化を含む。特定の例示的な実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２９７でグリコシル化される。
【0125】
特定の例示的な実施形態では、本明細書中に記載されるＦｃドメインは、エフェクターコンピテントである。
【0126】
特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載のＦｃドメインは、熱安定化、グリコシル化、及びエフェクターコンピテントの任意の組み合わせである。
【0127】
熱安定化Ｆｃドメイン変異体
定常抗体ドメインの構造は、ループ及び短いヘリックスと接続したβ鎖からなる可変ドメインの構造と類似している。重定常領域のＣＨ２ドメインは、他のドメインで示される広範な鎖間相互作用とは対照的に、炭水化物媒介性の弱い鎖間タンパク質間相互作用を示す。単離されたマウスＣＨ２ドメインは、生理学的温度では比較的不安定であるが（Ｆｅｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４４：１０７－１１８）、これまでの研究では、ＣＨ２ドメインの熱安定性が、鎖内ジスルフィド結合の付加によって増強される場合があり、これらが結合体の足場として使用され得ることが実証されている（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：１４２０３－２１０）。
定常抗体ドメインの構造は、ループ及び短いヘリックスと接続したβ鎖からなる可変ドメインの構造と類似している。重定常領域のＣＨ２ドメインは、他のドメインで示される広範な鎖間相互作用とは対照的に、炭水化物媒介性の弱い鎖間タンパク質間相互作用を示す。単離されたマウスＣＨ２ドメインは、生理学的温度では比較的不安定であるが（Ｆｅｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４４：１０７－１１８）、これまでの研究では、ＣＨ２ドメインの熱安定性が、鎖内ジスルフィド結合の付加によって増強される場合があり、これらが結合体の足場として使用され得ることが実証されている（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：１４２０３－２１０）。
【0128】
野生型Ｆｃドメインと比較して増加した熱不安定性（すなわち、熱安定性の低下）を示すエフェクター増強Ｆｃドメイン変異体が公知である。例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ及びＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異体は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析における融解温度（Ｔｍ）の低下によって示されるように、ＣＨ２ドメインの安定性の低下をもたらす。Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅは、野生型と比較した場合、タンパク質の熱シフト測定が減少し、ｈＦｃγＲトランスジェニックマウスにおいて半減期がかなり減少している。（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（６）：３５７１、及び総説についてはＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ９（４）：６４を参照）
【0129】
野生型と比較して安定性が有意に低下していない、ＦｃγＲ結合が改善されたエフェクター増強Ｆｃドメイン変異体が知られている。（例えば、Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第２ ９４０ １３５号明細書を参照）
【0130】
熱安定化されたＦｃドメイン変異体は、Ｆｃドメインに１つ以上のジスルフィド結合を導入することによって産生され得ることが更に発見された。したがって、一態様では、本開示は、１つ以上の操作された（例えば、非天然）ジスルフィド結合、例えば、例えば１つ又は複数のシステイン対によって媒介される鎖内ジスルフィド結合を含むＦｃドメイン変異体を提供する。
【0131】
特定の例示的な実施形態では、ジスルフィド結合は、Ｆｃドメインの２つのＣＨ２領域間の鎖内ジスルフィド結合である。特定の例示的な実施形態では、ジスルフィド結合は、Ｆｃドメインの２つのＣＨ３領域間の鎖内ジスルフィド結合である。特定の例示的な実施形態では、２つ以上の鎖内ジスルフィド結合が、Ｆｃドメインの２つのＣＨ２領域間及び／又はＦｃドメインの２つのＣＨ３領域間に存在する。
【0132】
熱安定性、又はＦｃドメイン（例えば、結合ポリペプチドを含む又は含まないＦｃドメイン）が展開する傾向は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて決定され得る。例えば、アンフォールディング又は変性温度は、ナノフォーマット示差走査熱量測定（ｎａｎｏＤＳＣ）又はナノフォーマット示差走査蛍光測定（ｎａｎｏＤＳＦ）によって測定することができる（Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９３：１１３５８１）。タンパク質が展開し始める検出可能な温度はＴｏｎｓｅｔである。
【0133】
特定の例示的な実施形態では、熱安定化されたＦｃドメイン変異体（例えば、１つ以上の操作されたジスルフィド結合を有する）のＴｏｎｓｅｔは、熱安定化されていないＦｃドメイン変異体と比較して増加している。特定の例示的な実施形態では、熱安定化Ｆｃドメイン変異体のＴｏｎｓｅｔは、熱安定化されていないＦｃドメイン変異体に対して約１．０℃、約１．５℃、約２．０℃、約２．５℃、約３．０℃、約３．５℃、約４．０℃、約４．５℃、約５．０℃、約５．５℃、約６．０℃、約６．５℃、約７．０℃、約７．５℃、約８．０℃、約８．５℃、約９．０℃、約９．５℃、約１０．０℃、約１０．５℃、約１１．０℃、約１１．５℃、約１２．０℃、約１２．５℃、約１３．０℃、約１３．５℃、約１４．０℃、約１４．５℃、約１５．０℃、約１５．５℃、約１６．０℃、約１６．５℃、約１７．０℃、約１７．５℃、約１８．０℃、約１８．５℃、約１９．０℃、約１９．５℃、約２０．０℃、約２０．５℃、約２１．０℃、約２１．５℃、約２２．０℃、約２２．５℃、約２３．０℃、約２３．５℃、約２４．０℃、約２４．５℃又は約２５．０℃上昇する。
【0134】
特定の例示的な実施形態では、熱安定化Ｆｃドメイン変異体は、以下の位置にシステイン置換からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換対を有する：アミノ酸位置２４２及び３３４；アミノ酸位置２４０及び３３４；アミノ酸位置２８７及び３０６；アミノ酸位置２９２及び３０２；アミノ酸位置３２３及び３３２；アミノ酸位置２５９及び３０６；アミノ酸位置３５０及び４４１；アミノ酸位置３４３及び４３１；アミノ酸位置３７５及び４０４；アミノ酸位置３７５及び３９６；並びにアミノ酸位置３４８及び４３９（ＥＵナンバリングに従う）。（Ｗｏｚｎｉａｋ－Ｋｎｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３００８３；Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０２：１８６５－７５；総説については国際公開第２０１４１５３０６３号パンフレットを参照）
【0135】
特定の例示的な実施形態では、熱安定化Ｆｃドメイン変異体は、ＥＵナンバリングに従う、（ｉ）アミノ酸位置２４２のロイシン（Ｌ）及びアミノ酸位置３３４のリジン（Ｋ）；（ｉｉ）アミノ酸位置２８７のアラニン（Ａ）及びアミノ酸位置３０６のロイシン（Ｌ）；又は（ｉｉｉ）アミノ酸位置２９２のアルギニン（Ｒ）及びアミノ酸位置３０２のバリン（Ｖ）を置換する一対のシステインによって媒介される操作された（例えば、非天然）鎖内ジスルフィド結合を含む。
【0136】
特定の例示的な実施形態では、熱安定化Ｆｃドメイン変異体は、ＥＵナンバリングに従う、（ｉ）アミノ酸位置２４２のロイシン（Ｌ）及びアミノ酸位置３３４のリジン（Ｋ）；（ｉｉ）アミノ酸位置２９２のアルギニン（Ｒ）及びアミノ酸位置３０２のバリン（Ｖ）を置換する一対のシステインによって媒介される操作された（例えば、非天然）鎖内ジスルフィド結合を含む。
【0137】
特定の例示的な実施形態では、熱安定化Ｆｃドメイン変異体は、アミノ酸位置２４２のロイシン（Ｌ）及びアミノ酸位置３３４のリジン（Ｋ）を置換する一対のシステインによって媒介される操作された（例えば、非天然）鎖内ジスルフィド結合を含む。特定の例示的な実施形態では、熱安定化Ｆｃドメイン変異体は、アミノ酸位置２８７のアラニン（Ａ）及びアミノ酸位置３０６のロイシン（Ｌ）を置換する一対のシステインによって媒介される操作された（例えば、非天然）鎖内ジスルフィド結合を含む。特定の例示的な実施形態では、熱安定化Ｆｃドメイン変異体は、アミノ酸位置２９２のアルギニン（Ｒ）及びアミノ酸位置３０２のバリン（Ｖ）を置換する一対のシステインによって媒介される操作された（例えば、非天然）鎖内ジスルフィド結合を含む。特定の例示的な実施形態では、熱安定化Ｆｃドメイン変異体は、少なくとも１つの操作された鎖内ジスルフィド結合を含み得る。特定の例示的な実施形態では、熱安定化Ｆｃドメイン変異体は、２つ以上の操作さ
れた鎖内ジスルフィド結合を含み得る。
れた鎖内ジスルフィド結合を含み得る。
【0138】
エフェクター増強Ｆｃドメイン変異体
一態様では、本開示は、エフェクター増強アミノ酸置換を含むＦｃドメイン変異体を提供する。
一態様では、本開示は、エフェクター増強アミノ酸置換を含むＦｃドメイン変異体を提供する。
【0139】
一実施形態では、本明細書に開示される、１つ以上のアミノ酸置換を含む、改変されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を有するＦｃドメイン変異体。一実施形態では、本明細書に開示される１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性が増強されたＦｃドメイン変異体。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性が増強されたＦｃドメイン変異体は、本明細書に開示される２つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性が増強されたＦｃドメイン変異体は、本明細書に開示される３つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性が増強されたＦｃドメイン変異体は、本明細書に開示される４つ以上のアミノ酸置換を含む。
【0140】
一実施形態では、改変ＦｃＲｎ結合を有するＦｃドメイン変異体は、本明細書に開示される１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。一実施形態では、増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃドメイン変異体は、本明細書に開示される１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。一実施形態では、増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃドメイン変異体は、本明細書に開示される２つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。一実施形態では、増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃドメイン変異体は、本明細書に開示される３つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。
【0141】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、種特異的ＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。一実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、ＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。一実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、カニクイザルＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、異種間ＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。そのようなＦｃドメイン変異体は、１つ以上の異なる種にわたって交差反応性であると言われる。一実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、ヒトとカニクイザルの両方のＦｃＲｎ結合親和性を示し得る。
【0142】
新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体のＦｃ領域と相互作用して、正常なリソソーム分解の救済によるリサイクルを促進する。このプロセスは、酸性ｐＨ（例えば、６．５未満のｐＨ）でエンドソームにおいて起こるが、血流の生理学的ｐＨ（例えば、非酸性ｐＨ）条件下では起こらないｐＨ依存性プロセスである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、野生型Ｆｃドメインと比較して、酸性ｐＨにおいて増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、野生型Ｆｃドメインと比較して、７．０未満のｐＨ、例えば約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．０、約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．０で増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、上昇した非酸性ｐＨでの野生型ＦｃドメインのＦｃＲｎ結合親和性と比較して、７．０未満のｐＨ、例えば約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．０、約ｐＨ５．５、約ｐＨ５．０で増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有する。上昇した非酸性ｐＨは、例えば、７．０を超えるｐＨ、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．８、約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．５、約ｐＨ９．０であり得る。
【0143】
特定の実施形態では、Ｆｃドメイン変異体が、非酸性ｐＨで野生型Ｆｃドメインとほぼ同じＦｃＲｎ結合親和性を示すことが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体が、非酸性ｐＨで、ＥＵナンバリングに従って、二重アミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有する修飾Ｆｃドメインを含む結合ポリペプチドよりも低いＦｃＲ
ｎ結合親和性を示すことが望ましい場合がある（米国特許第８，０８８，３７６号明細書を参照）。したがって、Ｆｃドメイン変異体は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合に対して最小限の摂動を示すことが望ましい場合がある。
ｎ結合親和性を示すことが望ましい場合がある（米国特許第８，０８８，３７６号明細書を参照）。したがって、Ｆｃドメイン変異体は、ｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合に対して最小限の摂動を示すことが望ましい場合がある。
【0144】
いくつかの実施形態では、酸性ｐＨで増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃドメイン変異体は、野生型Ｆｃドメインと比較して減少した（すなわち、より遅い）ＦｃＲｎオフ速度を有する。いくつかの実施形態では、上昇した非酸性ｐＨにおける結合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合親和性と比較して、酸性ｐＨにおける増強されたＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃドメイン変異体は、上昇した非酸性ｐＨにおける野生型ＦｃドメインのＦｃＲｎオフ速度と比較して、酸性ｐＨにおけるより遅いＦｃＲｎオフ速度を有する。
【0145】
特定の実施形態は、ほぼ同じ免疫原性の完全な変化していない抗体と比較した場合に、所望の生化学的特徴、例えば、低下した又は増強されたエフェクター機能、非共有二量体化する能力、腫瘍の部位に局在する能力の増加、血清半減期の減少、又は血清半減期の増加を提供するように、定常領域ドメインの１つ以上の中の少なくとも１つのアミノ酸が欠失されているか、そうでなければ改変されているＦｃドメイン変異体を含む。
【0146】
特定の他の実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、異なる抗体アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のうちの２つ以上に由来する定常領域）に由来する定常領域を含む。他の実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、キメラヒンジ（すなわち、異なる抗体アイソタイプのヒンジドメイン、例えばＩｇＧ４分子由来の上部ヒンジドメイン及びＩｇＧ１中間ヒンジドメインに由来するヒンジ部分を含むヒンジ）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、当技術分野で公知の技術を使用してエフェクター機能を増加又は減少させるように変異され得る。
【0147】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、Ｆｃ受容体に対する変化した結合親和性を有する。Ｆｃ受容体にはいくつかの異なるタイプがあり、それらはそれらが認識する抗体のタイプに基づいて分類される。例えば、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）はＩｇＧクラス抗体に結合し、Ｆｃ－アルファ受容体（ＦｃαＲ）はＩｇＡクラス抗体に結合し、Ｆｃ－イプシロン受容体（ＦｃεＲ）はＩｇＥクラス抗体に結合する。ＦｃγＲは、いくつかのメンバー、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂを含むファミリーに属する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、野生型Ｆｃドメインと比較して、変化したＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、野生型Ｆｃドメインと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性が低下している。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、野生型Ｆｃドメインと比較して、増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体修飾Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、ほぼ同じＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性を有する。
【0148】
特定の実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、１つ以上のエフェクター機能を媒介する抗体定常領域（例えばＩｇＧ定常領域、例えばヒトＩｇＧ定常領域、例えばヒトＩｇＧ１定常領域）を含む。例えば、抗体定常領域へのＣ１複合体の結合は、補体系を活性化し得る。補体系の活性化は、細胞病原体のオプソニン化及び溶解において重要である。補体系の活性化は炎症反応も刺激し、自己免疫過敏症にも関与し得る。さらに、抗体は、Ｆｃドメインを介して様々な細胞上の受容体に結合する（抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する）。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）及びＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、異なるクラスの抗体に特異的ないくつかのＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害又はＡＤＣＣと呼ばれる）による抗体被覆標的細胞の溶
解、炎症性メディエーターの放出、胎盤移行及び免疫グロブリン産生の制御を含む、いくつかの重要で多様な生物学的応答を引き起こす。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体、例えば結合ポリペプチド（例えば、抗体、イムノアドヘシン又は抗体変異体）は、Ｆｃ－ガンマ受容体に結合する。代替的な実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、１つ以上のエフェクター機能を欠いている（例えば、ＡＤＣＣ活性）及び／又はＦｃγ受容体に結合することができない定常領域を含んでいた。
解、炎症性メディエーターの放出、胎盤移行及び免疫グロブリン産生の制御を含む、いくつかの重要で多様な生物学的応答を引き起こす。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体、例えば結合ポリペプチド（例えば、抗体、イムノアドヘシン又は抗体変異体）は、Ｆｃ－ガンマ受容体に結合する。代替的な実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、１つ以上のエフェクター機能を欠いている（例えば、ＡＤＣＣ活性）及び／又はＦｃγ受容体に結合することができない定常領域を含んでいた。
【0149】
特定の例示的な実施形態では、エフェクター増強Ｆｃドメイン変異体は、以下からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する：アミノ酸位置２２１のアスパラギン酸（Ｄ）；アミノ酸位置２２２のシステイン（Ｃ）；アミノ酸位置２３４のチロシン（Ｙ）；アミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）；アミノ酸位置２３６のトリプトファン（Ｗ）；アミノ酸位置２３９のアスパラギン酸（Ｄ）；アミノ酸位置２４３のロイシン（Ｌ）；アミノ酸位置２６７のグルタミン酸（Ｅ）；アミノ酸位置２６８のフェニルアラニン（Ｆ）；アミノ酸位置２９２のプロリン（Ｐ）；アミノ酸位置２９８のアラニン（Ａ）；アミノ酸位置３００のロイシン（Ｌ）；アミノ酸位置３０５にイソロイシン（Ｉ）；アミノ酸位置３２４のトレオニン（Ｔ）；アミノ酸位置３２６のトリプトファン（Ｗ）；アミノ酸位置３２６にアラニン（Ａ）；アミノ酸位置３３０のロイシン（Ｌ）；アミノ酸位置３３２のグルタミン酸（Ｅ）；アミノ酸位置３３３にアラニン（Ａ）；アミノ酸位置３３３のセリン（Ｓ）；アミノ酸位置３３４にアラニン（Ａ）；アミノ酸位置３３６にアラニン（Ａ）；アミノ酸位置３４５のアルギニン（Ｒ）；アミノ酸位置３９６のロイシン（Ｌ）（ＥＵナンバリングに従う）。（総説については、Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．０１２９６を参照）
【0150】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６、２３９、３３０及び３３２から選択される位置にアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、置換は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９にアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３３０にロイシン（Ｌ）、及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、アミノ酸位置２３６のアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３３０のロイシン（Ｌ）、及びアミノ酸位置３３２のグルタミン酸（Ｅ）から選択される任意の２つのアミノ酸位置に二重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、アミノ酸位置２３６のアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３３０のロイシン（Ｌ）、及びアミノ酸位置３３２のグルタミン酸（Ｅ）から選択される任意の３つのアミノ酸位置に三重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、アミノ酸位置２３６のアラニン（Ａ）、アミノ酸２３９のアスパラギン酸（Ｄ）、アミノ酸位置３３０のロイシン（Ｌ）、及びアミノ酸位置３３２のグルタミン酸（Ｅ）から選択される任意の４つのアミノ酸位置に四重アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、アミノ酸２３９にアスパラギン酸（Ｄ）及びアミノ酸位置３３２にグルタミン酸（Ｅ）を含むアミノ酸置換の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、アミノ酸位置２３６にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置３３２にアスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸を含むアミノ酸置換の組み合わせを含み得る。
【0151】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２５６及び／又は３０７にアミノ酸置換を更に含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、アミノ酸位置２５６にアスパラギン酸（Ｄ）を含み、アミノ酸位置３０７にグルタミン（Ｑ）を含むアミノ酸置換の組み合わせを含み得る（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｃｋｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９ ＭＡｂｓ
１１：１２７６－８８；国際公開第２０１９１４７９７３Ａ１号パンフレットを参照）
。
１１：１２７６－８８；国際公開第２０１９１４７９７３Ａ１号パンフレットを参照）
。
【0152】
グリコシル化Ｆｃドメイン変異体
特定の例示的な実施形態では、結合タンパク質は、グリコシル化されている。それらの定常領域内の保存された位置における抗体のグリコシル化は、抗体機能、特に上記のようなエフェクター機能に大きな影響を及ぼすことが知られている（例えば、Ｂｏｙｄ ｅｔ
ａｌ（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，３２：１３１１－１３１８，１９９６を参照）。１つ以上の炭水化物部分が付加、置換、欠失又は修飾されている本開示の結合タンパク質のグリコシル化が企図される。いくつかの実施形態では、結合タンパク質のＦｃドメインのグリコシル化は、Ｎ結合型グリコシル化である。アスパラギン－Ｘ－セリン又はアスパラギン－Ｘ－トレオニンモチーフの導入は、炭水化物部分の酵素的結合のための潜在的な部位を作り出し、したがってＦｃドメイン変異体のグリコシル化を操作するために使用され得る。Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：８８６８－８８７６，２００１）では、ＴＮＦＲ－ＩｇＧ免疫アドヘシンの最終的なシアリル化は、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ及び／又はアルファ、２，３シアリルトランスフェラーゼを使用した再ガラクトシル化及び／又は再シアリル化のプロセスを通して増加した。末端シアリル化を増加させると、免疫グロブリンの半減期が増加すると考えられている。
特定の例示的な実施形態では、結合タンパク質は、グリコシル化されている。それらの定常領域内の保存された位置における抗体のグリコシル化は、抗体機能、特に上記のようなエフェクター機能に大きな影響を及ぼすことが知られている（例えば、Ｂｏｙｄ ｅｔ
ａｌ（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，３２：１３１１－１３１８，１９９６を参照）。１つ以上の炭水化物部分が付加、置換、欠失又は修飾されている本開示の結合タンパク質のグリコシル化が企図される。いくつかの実施形態では、結合タンパク質のＦｃドメインのグリコシル化は、Ｎ結合型グリコシル化である。アスパラギン－Ｘ－セリン又はアスパラギン－Ｘ－トレオニンモチーフの導入は、炭水化物部分の酵素的結合のための潜在的な部位を作り出し、したがってＦｃドメイン変異体のグリコシル化を操作するために使用され得る。Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：８８６８－８８７６，２００１）では、ＴＮＦＲ－ＩｇＧ免疫アドヘシンの最終的なシアリル化は、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ及び／又はアルファ、２，３シアリルトランスフェラーゼを使用した再ガラクトシル化及び／又は再シアリル化のプロセスを通して増加した。末端シアリル化を増加させると、免疫グロブリンの半減期が増加すると考えられている。
【0153】
抗体は、ほとんどの糖タンパク質と共通して、典型的にはグリコフォームの混合物として産生される。この混合物は、抗体が真核生物、特に哺乳動物細胞で産生される場合に特に明らかである。定義されたグリコフォームを製造するための様々な方法が開発されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：３７１；Ｓｅａｒｓ
ｅｔ ａｌ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３４４；Ｗａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：５７９；Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７を参照）。いくつかの実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２９７に天然グリカンを含む。ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン中のアミノ酸位置２９７におけるアスパラギンのグリコシル化は、ＦｃドメインとＦｃγＲとの間の相互作用を促進することが公知である。このグリコシル化部位の排除は、エフェクター機能を排除する（Ｌｅａｂｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＭＡｂｓ ５：８９６－９０３）。特に例示的な実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２９７に野生型レベル又はほぼ野生型レベルのグリコシル化を含む。
ｅｔ ａｌ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：２３４４；Ｗａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：５７９；Ｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７を参照）。いくつかの実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２９７に天然グリカンを含む。ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン中のアミノ酸位置２９７におけるアスパラギンのグリコシル化は、ＦｃドメインとＦｃγＲとの間の相互作用を促進することが公知である。このグリコシル化部位の排除は、エフェクター機能を排除する（Ｌｅａｂｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＭＡｂｓ ５：８９６－９０３）。特に例示的な実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングに従うアミノ酸位置２９７に野生型レベル又はほぼ野生型レベルのグリコシル化を含む。
【0154】
いくつかの実施形態では、グリコシル化Ｆｃドメイン変異体は、操作されたグリカン又は非天然グリカンを含む。いくつかの実施形態では、操作されたグリカン又は非天然グリカンは、治療分子（例えば、抗体－薬物コンジュゲート）にコンジュゲートさせることができる修飾グリカンである。
【0155】
Ｆｃ含有結合ポリペプチド
一態様では、本開示は、少なくとも１つの結合ドメイン（例えば、少なくとも１つの結合ポリペプチド）を含むか又はそれと複合体化した（例えば、融合した）単離されたＦｃドメイン変異体を提供する。特定の実施形態では、結合ドメインは、１つ以上の抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、親Ｆｃドメインと同じ分子に由来する必要はない。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、抗体中に存在する。
一態様では、本開示は、少なくとも１つの結合ドメイン（例えば、少なくとも１つの結合ポリペプチド）を含むか又はそれと複合体化した（例えば、融合した）単離されたＦｃドメイン変異体を提供する。特定の実施形態では、結合ドメインは、１つ以上の抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、親Ｆｃドメインと同じ分子に由来する必要はない。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、抗体中に存在する。
【0156】
一実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、抗体中に存在するか、又は抗体と複合体化している。任意の供給源又は種からの任意の抗体を、本明細書に開示されるＦｃドメイン変異体と共に使用することができる。適切な抗体としては、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が挙げられる。適切な抗体としては、限定されないが、全長抗体
、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は単一ドメイン抗体、例えばＶＨＨ抗体が挙げられる。
、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は単一ドメイン抗体、例えばＶＨＨ抗体が挙げられる。
【0157】
特定の例示的な実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、抗体の抗原結合断片に結合又は複合体化され得る。「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合するか、又は抗原結合（すなわち、特異的結合）についてインタクト抗体と（すなわち、それらが由来するインタクトな抗体を用と）競合する免疫グロブリン又は抗体のポリペプチドフラグメントを指す。抗原結合断片は、当技術分野で周知の組換え又は生化学的方法によって産生することができる。例示的な抗原結合断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及び（Ｆａｂ’）２を含む。特定の例示的な実施形態では、本開示の結合ポリペプチドは、少なくとも１つの抗原結合断片及びＦｃドメイン変異体を含む。
【0158】
いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドは、一本鎖可変領域配列（ＳｃＦｖ）を含む。一本鎖可変領域配列は、１つ以上の抗原結合部位、例えば、柔軟なリンカーによってＶＨドメインに連結されたＶＬドメインを有する単一ポリペプチドを含む。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向で構築することができる。抗原結合部位を構成するＶＬ及びＶＨドメインを連結する可撓性ヒンジは、約１０～約５０個のアミノ酸残基を含む。連結ペプチドは当技術分野で公知である。結合ポリペプチドは、少なくとも１つのｓｃＦｖ及び／又は少なくとも１つの定常領域を含み得る。一実施形態では、本開示の結合ポリペプチドは、Ｆｃドメイン変異体に連結又は融合された少なくとも１つのｓｃＦｖを含み得る。
【0159】
いくつかの実施形態では、本開示の結合ポリペプチドは、抗体をコードするＤＮＡ配列をＳｃＦｖ分子（例えば、改変ＳｃＦｖ分子）と融合することによって産生される多価（例えば、四価）抗体である。例えば、一実施形態では、これらの配列は、ＳｃＦｖ分子（例えば、改変されたＳｃＦｖ分子）がそのＮ末端又はＣ末端で柔軟なリンカー（例えば、ｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）を介してＦｃドメイン変異体に連結されるように組み合わされる。別の実施形態では、本開示の四価抗体は、ＳｃＦｖ分子を、Ｆｃドメイン変異体に融合されてＳｃＦｖ－Ｆａｂ四価分子を構築する連結ペプチドに融合することによって作製することができる。
【0160】
別の実施形態では、本開示の結合ポリペプチドは、改変されたミニボディである。本開示の改変されたミニボディは、接続ペプチドを介してＦｃドメイン変異体に融合されたＳｃＦｖ分子をそれぞれ含む２つのポリペプチド鎖で構成される二量体分子である。ミニボディは、ＳｃＦｖ成分を構築し、当技術分野に記載されている方法を使用してペプチド成分を連結することによって作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号明細書又は国際公開第９４／０９８１７Ａｌ号パンフレットを参照）。別の実施形態では、四価のミニボディを構築することができる。四価のミニボディは、２つのＳｃＦｖ分子が可撓性リンカーを用いて連結されていることを除いて、ミニボディと同じ様式で構築することができる。次いで、連結されたｓｃＦｖ－ｓｃＦｖコンストラクトをＦｃドメイン変異体につなぐ。
【0161】
別の実施形態では、本開示の結合ポリペプチドは、ダイアボディを含む。ダイアボディは、それぞれがｓｃＦｖ分子に類似するポリペプチドを有するが、通常、両方の可変ドメインを接続する短い（１０未満、例えば約１～約５）アミノ酸残基リンカーを有する二量体四価分子であり、その結果、同じポリペプチド鎖上のＶＬドメイン及びＶＨドメインは相互作用することができない。代わりに、１つのポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、第２のポリペプチド鎖上のＶＨ及びＶＬドメイン（例えば、国際公開第０２／０２７８１号パンフレットを参照）と相互作用する。本開示のダイアボディは、Ｆｃドメイン変異体に融合されたｓｃＦｖ様分子を含む。
【0162】
別の実施形態では、本開示の結合ポリペプチドは、ＶＨＨ又はナノボディとも呼ばれる単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘの登録商標である。ＶＨＨは、軽鎖を欠く可変重鎖ドメインを含む。従来のＶＨドメインと同様に、ＶＨＨは４つのＦＲ及び３つのＣＤＲを含む。ＶＨＨは、従来の抗体に勝る利点を有する。それらはＩｇＧ分子よりも約１０倍小さいため、適切に折り畳まれた機能性ＶＨＨは、高い収率を達成しながらインビトロ発現によって産生され得る。さらに、ＶＨＨは非常に安定であり、プロテアーゼの作用に耐性である。ＶＨＨの特性及び生成は、Ｈａｒｍｓｅｎ及びＤｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；７７（１）：１３－２２）によって概説されている。
【0163】
特定の例示的な実施形態では、Ｆｃドメインは、１つ以上のＶＨＨと融合される。
【0164】
他の実施形態では、結合ポリペプチドは、同じポリペプチド鎖上に直列に１つ以上の可変ドメインを含む多重特異性抗体又は多価抗体、例えばタンデム可変ドメイン（ＴＶＤ）ポリペプチドを含む。例示的なＴＶＤポリペプチドは、米国特許第５，９８９，８３０号明細書に記載されている「ダブルヘッド」又は「二重Ｆｖ」構成を含む。二重Ｆｖ配置では、２つの異なる抗体の可変ドメインは、２つの別個の鎖（１つの重鎖及び１つの軽鎖）上にタンデム配向で発現され、一方のポリペプチド鎖は、任意によりペプチドリンカー（ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２）によって分離された直列の２つのＶＨドメインを有し、他方のポリペプチド鎖は、任意にペプチドリンカー（ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２）によって直列に接続された相補的ＶＬドメインからなる。クロスオーバーダブルヘッド配置では、２つの異なる抗体の可変ドメインは、２つの別個のポリペプチド鎖（１つの重鎖及び１つの軽鎖）上にタンデム配向で発現され、一方のポリペプチド鎖は、任意にペプチドリンカー（ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２）によって分離された直列の２つのＶＨドメインを有し、他方のポリペプチド鎖は、任意に反対の配向のペプチドリンカー（ＶＬ２－リンカー－ＶＬ１）によって直列に接続された相補的ＶＬドメインからなる。「二重Ｆｖ」フォーマットに基づく更なる抗体変異体としては、二重可変ドメインＩｇＧ（ＤＶＤ－ＩｇＧ）二重特異性抗体（米国特許第７，６１２，１８１号明細書及びＴＢＴＩフォーマット（米国特許出願公開第２０１０／０２２６９２３Ａ１号明細書を参照）が挙げられる。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドは、Ｆｃドメイン変異体に融合された同じポリペプチド鎖上に直列の１つ以上の可変ドメインを含む多重特異性又は多価抗体を含む。
【0165】
別の実施形態では、結合ポリペプチドは、「ダブルヘッド」配置（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０２５１５４１号Ａ１を参照）に基づくクロスオーバー二重可変ドメインＩｇＧ（ＣＯＤＶ－ＩｇＧ）二重特異性抗体を含む。
【0166】
他の実施形態では、結合ポリペプチドは、ＣｒｏｓｓＭａｂ又はＣｒｏｓｓＭａｂ－Ｆａｂ多重特異性フォーマット（国際公開第２００９０８０２５３号パンフレット及びＳｃｈａｅｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１１），１０８：１１１８７－１１９１を参照）を含む。ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマットに基づく抗体変異体は、正確な鎖会合を可能にする二重特異性ＩｇＧ抗体の１つのアーム内の抗体ドメインの交差を有する。
【0167】
他の実施形態では、グリコシル化エフェクターコンピテントポリペプチドは、Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットの多重特異性抗体を含む。「Ｔ細胞エンゲージャー」とは、宿主の免疫系に向けられたタンパク質、より具体的にはＴ細胞の細胞傷害活性、並びに腫瘍標的タンパク質に向けられた結合タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、単離されたエフェクターコンピテントポリペプチドは、ＮＫ細胞エンゲージャーフォーマットの多
重特異性抗体を含む。「ＮＫ細胞エンゲージャー」は、活性化ＮＫ細胞受容体、抗原特異的標的化領域、及びＦｃ領域を標的化するモノクローナル抗体断片を含む結合タンパク質を指す（Ｇａｕｔｈｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１９），１７７：１７０１－１３）。
重特異性抗体を含む。「ＮＫ細胞エンゲージャー」は、活性化ＮＫ細胞受容体、抗原特異的標的化領域、及びＦｃ領域を標的化するモノクローナル抗体断片を含む結合タンパク質を指す（Ｇａｕｔｈｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１９），１７７：１７０１－１３）。
【0168】
本明細書に記載のＦｃドメイン変異体を含む本開示の結合ポリペプチドは、既知の「親」抗体のＣＤＲ配列又は可変ドメイン配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、親抗体及び本開示の抗体は、本明細書に開示されるＦｃドメインに対する修飾を除いて、類似又は同一の配列を共有することができる。
【0169】
クロスオーバー二重可変
特定の実施形態では、「クロスオーバー二重可変」又は「ＣＯＤＶ」は、少なくとも１つの標的抗原又は少なくとも１つの標的エピトープに特異的に結合し、少なくとも２つの抗原結合部位を形成する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む抗原結合ドメインを指し、少なくとも１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
少なくとも１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
特定の実施形態では、「クロスオーバー二重可変」又は「ＣＯＤＶ」は、少なくとも１つの標的抗原又は少なくとも１つの標的エピトープに特異的に結合し、少なくとも２つの抗原結合部位を形成する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む抗原結合ドメインを指し、少なくとも１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
少なくとも１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
【0170】
特定の例示的な実施形態では、本開示の結合タンパク質は、２つの抗原結合部位を形成する３つのポリペプチド鎖を含む「ＣＯＤＶ－ＯＬ１」フォーマットを含み、１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖が、式：
ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり、
ヒンジは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖が、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
１つのポリペプチド鎖が、式：
ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり、
ヒンジは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
【0171】
特定の実施形態では、ＣＯＤＶ抗原結合ドメインは、少なくとも１つの標的抗原又は少なくとも１つの標的エピトープに特異的に結合し、４つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、２つのポリペプチド鎖はそれぞれ、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
２つのポリペプチド鎖はそれぞれ、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－Ｆｃ［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
Ｆｃは免疫グロブリンヒンジ領域、並びにＣＨ２及びＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成し、
ＶＨ１／ＶＬ１対は、第１の抗原結合特異性を含み、ＶＨ２／ＶＬ２対は、第２の抗原結合特異性を含む。
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
２つのポリペプチド鎖はそれぞれ、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－Ｆｃ［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
Ｆｃは免疫グロブリンヒンジ領域、並びにＣＨ２及びＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成し、
ＶＨ１／ＶＬ１対は、第１の抗原結合特異性を含み、ＶＨ２／ＶＬ２対は、第２の抗原結合特異性を含む。
【0172】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、１つ以上の異なる抗原標的に特異的に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性及び／又は三価抗原結合タンパク質であり、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
第２ポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり、
ヒンジは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
第２ポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり、
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり、
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり、
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり、
ヒンジは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、アミノ酸リンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４のいずれか１つ以上は場合により存在せず、
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドとが、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
【0173】
特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、２つの異なる抗原結合部位を形成する交差配向を有する。いくつかの実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１は結合対を形成し、第１の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、ＶＨ２及びＶＬ２は、結合対を形成し、第２の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、第３のポリペプチド及び第４のポリペプチドは、第３の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、ＶＨ３及びＶＬ３は、結合対を形成し、第３の抗原結合部位を形成する。
【0174】
そのような抗原結合タンパク質は、少なくとも３つの抗原結合部位を含む。それは、少なくとも三価の抗原結合分子である。特定の実施形態では、それは１つの抗原標的に特異的に結合する、すなわち単一特異性抗原結合分子である。別の実施形態では、それは２つの異なる抗原標的に特異的に結合する、すなわち二重特異性抗原結合分子である。別の実施形態では、それは３つの異なる抗原標的に特異的に結合する、すなわち三重特異性抗原結合分子である。
【0175】
上に列挙した例は、本開示の範囲を決して限定することを意図するものではなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン及びプロリンからなる群から選択されるランダムに選択されたアミノ酸を含むリンカーが、本明細書に記載の抗体様結合タンパク質に適していることが示されている。
【0176】
結合タンパク質の特定の実施形態では、（ａ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立して、長さが０アミノ酸であるか、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ、ＧＱＰＫＡＡＰ及びＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧからなる群から選択される配列を含むか、又は（ｂ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ、ＧＱＰＫＡＡＰ及びＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧからなる群より選択される配列を含む。
【0177】
特定の実施形態では、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む。
【0178】
特定の実施形態では、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ存在しない。
【0179】
ＣＯＤＶ抗体フォーマット、ＣＯＤＶ抗体フォーマットの様々な置換、及びリンカーに関する更なる詳細は、国際公開第２０１２／１３５３４５Ａ１号パンフレット及び国際公開第２０１７／１８０９１３Ａ２号パンフレットに更に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0180】
核酸及びベクター
一態様では、本明細書に開示される結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。これらのポリヌクレオチドを発現させることを含む結合タンパク質の作製方法も提供される。
一態様では、本明細書に開示される結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。これらのポリヌクレオチドを発現させることを含む結合タンパク質の作製方法も提供される。
【0181】
本明細書に開示される結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、
所望の量の特許請求される結合タンパク質を産生するために使用され得る宿主細胞への導入のための発現ベクターに挿入される。したがって、特定の態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びにこれらのベクター及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
所望の量の特許請求される結合タンパク質を産生するために使用され得る宿主細胞への導入のための発現ベクターに挿入される。したがって、特定の態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びにこれらのベクター及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【0182】
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために、細胞に所望の遺伝子を導入して発現させるために使用されるベクターを意味するために本明細書で使用される。当業者に知られているように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。一般に、ベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限部位、並びに真核細胞又は原核細胞に入る及び／又は複製する能力を含む。
【0183】
多数の発現ベクター系が、使用され得る。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。その他は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニックな系の使用を伴う。さらに、ＤＮＡをそれらの染色体に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）又は銅等の重金属に対する耐性を提供し得る。選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結され得るか、又は共形質転換によって同じ細胞に導入され得る。ｍＲＮＡの最適な合成のために、更なるエレメントも必要とされ得る。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルを含み得る。いくつかの実施形態では、クローニングされた可変領域遺伝子は、上記のように合成された重鎖定常領域遺伝子及び軽鎖定常領域遺伝子（ヒト遺伝子等）と共に発現ベクターに挿入される。
【0184】
他の実施形態では、本明細書に記載されるグリコシル化エフェクターコンピテントポリペプチドは、ポリシストロニックコンストラクトを使用して発現され得る。そのような発現系では、抗体の重鎖及び軽鎖等の目的の複数の遺伝子産物が、単一のポリシストロニックコンストラクトから産生され得る。これらの系は、有益なことに、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を用いて、真核宿主細胞において、比較的高いレベルのポリペプチドをもたらす。適合性のあるＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。当業者は、そのような発現系が、本出願に開示される全範囲のポリペプチドを効果的に産生するために使用され得ることを理解するであろう。
【0185】
より一般的には、本開示の結合タンパク質をコードするベクター又はＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入してもよい。すなわち、宿主細胞が形質転換され得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知の様々な技法によって行うことができる。これらの技法としては、トランスフェクション（電気泳動及びエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープ化ＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、並びにインタクトウイルスへの感染が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．“Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｃｈａｐｔｅｒ ２４．２，ｐｐ．４７０－４７２ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ １９８８）を参照されたい。トランスフォーメーションした細胞を、軽鎖と重鎖の産生に適する条件下で成長させて、重鎖タンパク質及び／又は軽鎖タンパク質の合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（
ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーター解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等が挙げられる。
ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーター解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等が挙げられる。
【0186】
本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、遺伝子型を変化させ、結果としてレシピエント細胞の変化をもたらす、レシピエント宿主細胞へのＤＮＡの導入を指す広義に使用されるものとする。
【0187】
同様に、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換された細胞を指す。組換え宿主からポリペプチドを単離するプロセスの説明においては、「細胞」及び「細胞培養液」という用語は、明らかに別段の定めのない限り、抗体の供給源を示す目的で同義的に使用する。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、スピンダウンした全細胞、又は培地と懸濁細胞の両方を含む細胞培養液のいずれかからの回収を意味し得る。
【0188】
一実施形態では、結合タンパク質の発現に使用される宿主細胞株は、真核生物又は原核生物起源のものである。一実施形態では、結合タンパク質の発現に使用される宿主細胞株は、細菌起源のものである。一実施形態では、結合タンパク質の発現に使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源のものである。当業者は、その中で発現される所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を決定することができる。例示的な宿主細胞株としては、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、細胞株は、そこから発現される抗体の変化したグリコシル化、例えば、アフコシル化を提供する（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）又はＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞株（ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（商標）細胞）（Ｂｉｏｗａ、ニュージャージー州プリンストン））。一実施形態では、ＮＳ０細胞が使用され得る。宿主細胞株は、典型的には、商業サービスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又は公の文献から入手可能である。
【0189】
インビトロ生成により、所望の結合タンパク質を大量に得るためのスケールアップが可能になる。組織培養条件下で哺乳動物細胞を培養する技法は、当技術分野において公知であり、この技法としては、例えば、エアリフト反応器若しくは連続撹拌反応器での均質懸濁培養、又は例えば、中空繊維内、マイクロカプセル内、アガロースマイクロビーズ上若しくはセラミックカートリッジ上に固定又は捕捉した細胞の培養が挙げられる。必要及び／又は所望であれば、ポリペプチドの溶液は、慣用的なクロマトグラフィ法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥ－セルロースでのクロマトグラフィ、及び／又は（免疫）アフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。
【0190】
グリコシル化結合タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子はまた、細菌又は酵母又は植物細胞等の非哺乳動物細胞において発現され得る。この関連においては、哺乳動物以外の様々な単細胞微生物（細菌等）もトランスフォーメーションでき、すなわち、これらの微生物を培養又は発酵で成長させることができることは分かるであろう。形質転換に感受性の細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）又はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の株等のエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のメンバーが挙げられる。細菌で発現される場合、Ｆｃドメ
イン変異体及び／又は結合ポリペプチドは封入体の一部になり得ることが更に理解されるであろう。結合タンパク質は、単離され、精製され、次いで、機能性分子に組み立てられなければならない。
イン変異体及び／又は結合ポリペプチドは封入体の一部になり得ることが更に理解されるであろう。結合タンパク質は、単離され、精製され、次いで、機能性分子に組み立てられなければならない。
【0191】
原核生物に加えて、真核生物微生物も使用され得る。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母は、真核微生物の中で最も一般的に使用されるが、多くの他の株が一般的に利用可能である。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現のために、プラスミドＹＲｐ７、例えば、（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））が一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の変異株、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４－１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））に対する選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有する。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ病変の存在は、トリプトファンの非存在下での成長による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【0192】
使用方法／治療方法
一態様では、本開示は、本明細書に開示される結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の疾患又は障害を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、疾患及び障害、例えば、癌を、そのような処置を必要とする哺乳動物対象において処置するためのキット及び方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、疾患及び障害、例えば、アミロイドーシス又は多発性骨髄腫を、そのような処置を必要とする哺乳動物対象において処置するためのキット及び方法を提供する。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の疾患又は障害を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、疾患及び障害、例えば、癌を、そのような処置を必要とする哺乳動物対象において処置するためのキット及び方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、疾患及び障害、例えば、アミロイドーシス又は多発性骨髄腫を、そのような処置を必要とする哺乳動物対象において処置するためのキット及び方法を提供する。
【0193】
特定の実施形態では、疾患は、癌である。特定の実施形態では、癌は、血液癌である。特定の実施形態では、血液癌は、形質細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態では、形質細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄腫である。特定の実施形態では、多発性骨髄腫は、再発／難治性多発性骨髄腫、新たに診断された多発性骨髄腫、又はくすぶり型多発性骨髄腫である。特定の他の実施形態では、疾患は、軽鎖アミロイドーシス（ＬＣＡ）である。特定の実施形態では、ＬＣＡは、再発／難治性ＬＣＡ、新たに診断されたＬＣＡ、又はくすぶり型ＬＣＡである。本開示の結合タンパク質は、いくつかの異なる用途に有用である。例えば、一実施形態では、対象結合タンパク質は、結合タンパク質によって認識されるエピトープを持つ細胞を減少又は排除するのに有用である。別の実施形態では、対象結合タンパク質は、循環中の可溶性抗原の濃度を低下させるか又は排除するのに有効である。別の実施形態では、対象結合タンパク質は、ＮＫ細胞エンゲージャーとして有効である。一実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、腫瘍サイズを減少させ、腫瘍成長を阻害し、及び／又は腫瘍担持動物の生存期間を延長し得る。したがって、本開示はまた、有効な非毒性量の本開示の結合タンパク質をヒト又は他の動物に投与することによって、ヒト又は他の動物の腫瘍を治療する方法に関する。
【0194】
別の実施形態では、対象結合タンパク質は、限定されないが、感染症、自己免疫障害、炎症性障害、又は癌を含む他の障害の治療に有用である。疾患は、任意に、ＢＣＭＡを発現する細胞（例えば、疾患を引き起こす細胞、疾患を引き起こすＢリンパ球又は他の免疫細胞）によって特徴付けられるとして特定され得る。例えば、癌細胞、特に血液癌又は形質細胞悪性腫瘍は、癌細胞の表面にＢＣＭＡを発現すると特徴付けることができる。したがって、本開示は、例えば、半減期が延長された対象のエフェクターコンピテントポリペプチドを使用することから利益を得るであろう様々な病態を治療する方法に関する。
【0195】
当業者は、日常的な実験によって、悪性腫瘍を治療する目的で、結合タンパク質の有効
な非毒性量が何であるかを決定することができるであろう。例えば、本開示の結合タンパク質の治療活性量は、疾患段階（例えば、ステージＩ対ステージＩＶ）、対象の年齢、性別、医学的合併症（例えば、免疫抑制状態又は疾患）及び体重、並びに対象において所望の応答を誘発する修飾抗体の能力等の因子に従って変動し得る。
な非毒性量が何であるかを決定することができるであろう。例えば、本開示の結合タンパク質の治療活性量は、疾患段階（例えば、ステージＩ対ステージＩＶ）、対象の年齢、性別、医学的合併症（例えば、免疫抑制状態又は疾患）及び体重、並びに対象において所望の応答を誘発する修飾抗体の能力等の因子に従って変動し得る。
【0196】
一般に、本開示において提供される組成物は、結合タンパク質による癌性細胞の標的化を可能にする抗原マーカーを含む任意の新生物を予防的又は治療的に処置するために使用され得る。
【0197】
多発性骨髄腫の治療方法／使用
一態様では、本開示は、多発性骨髄腫の治療及び予防に関する。
一態様では、本開示は、多発性骨髄腫の治療及び予防に関する。
【0198】
「多発性骨髄腫（ＭＭ）」（形質細胞骨髄腫、骨髄腫症、又はカーレル病としても知られている）という用語は、通常抗体の産生を担う白血球の一種である形質細胞の進行性血液癌である。この状態は、骨髄中の過剰な数の形質細胞及びインタクトなモノクローナル免疫グロブリン又は遊離モノクローナル軽鎖の過剰産生を特徴とする。臨床的には、疾患は、ヘモグロビン及び血清カルシウム濃度と共に、血清及び／又は尿中のモノクローナル（又は骨髄腫）タンパク質（Ｍタンパク質）の量に基づく骨髄腫腫瘍細胞塊、骨格調査に基づく溶解性骨病変の数、並びに腎不全の有無を含む様々なパラメータに基づいて診断、病期分類、及び治療される。状態を特徴付けるための更なるアプローチとしては、骨髄検査で１０パーセント（１０％）を超える形質細胞の検出、軟部組織形質細胞腫の存在、並びに遊離カッパ及びラムダ血清免疫グロブリン軽鎖の検出が挙げられる。骨髄検査は、標準的な組織学及び免疫組織化学技術を用いて行われる。予後を決定するために、骨髄試料の更なる細胞遺伝学が行われ得る。追跡調査は、その侵襲性のために臨床的に示される場合、化学及び骨髄評価からなる。
【0199】
特定の実施形態では、本発明の方法は、再発性及び／又は難治性のＭＭを有する患者、又はＭＭのための１つ以上の事前治療を受けたことがあるＭＭを有する患者の処置を含む。特定の実施形態では、多発性骨髄腫は、再発性／難治性多発性骨髄腫（ＲＲ／ＭＭ）である。いくつかの実施形態では、患者は、多発性骨髄腫に対する少なくとも１つ又は２つの以前の治療（例えば、レナリドミド等のサリドマイド類似体、プロテアソーム阻害剤、又は自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ））を受けており、最後の治療で又は最後の治療の完了後に疾患進行を実証していた。
【0200】
「再発性ＭＭ」とは、以前に治療されており、進行し、更なる治療の開始を必要とするが、原発性「難治性」又は再発性及び難治性のＭＭのいずれかの基準を満たさない多発性骨髄腫を指す。再発を判定するための臨床基準は、当業者に周知である。例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＩＭＷＧ）が開発した臨床基準は、１ｇｍ／ｄＬを超える血清Ｍ成分の増加、新しい軟部組織形質細胞腫又は骨病変の発症、及び既存の形質細胞腫又は骨病変のサイズの増加を含む。
【0201】
「難治性ＭＭ」は、非応答性（例えば、治療中に最小限の応答を達成できないか、又は進行性疾患を発症する）の多発性骨髄腫を指す。特定の実施形態では、多発性骨髄腫は、一次療法又はサルベージ療法中は非応答性であるか、又は最後の療法から６０日以内に進行する。
【0202】
特定の実施形態では、ＭＭは、「再発性及び難治性ＭＭ」である。「再発性及び難治性のＭＭ」は、サルベージ療法（例えば、一次治療による治療が失敗した後に投与される治療）を受けている間は非応答性であるか、又は現在の疾患経過において進行する前のある時点で最小の応答若しくはより良好な応答を達成している患者において最後の療法の６０
日間以内に進行する疾患である。
日間以内に進行する疾患である。
【0203】
特定の実施形態では、ＭＭは、原発性難治性ＭＭである。原発性難治性ＭＭは、いかなる治療でも最小応答又はそれ以上の応答を達成したことがない患者において非応答性であるＭＭ疾患である。
【0204】
特定の実施形態では、ＭＭは、前癌性又は「くすぶり型」ＭＭである。くすぶり型多発性骨髄腫は、血液中の特定のタンパク質を変化させ、及び／又は骨髄中の形質細胞を増加させる前癌状態であるが、疾患の症状を引き起こさない。しかし、この状態と診断された人の約半数が５年以内に多発性骨髄腫を発症する。患者を、活動性多発性骨髄腫への進行の証拠について綿密に監視する。患者は、特定の基準を満たす場合、くすぶり型多発性骨髄腫と診断される：３ｇ／ｄｌを超える血液のＭタンパク質を示す血液検査、又は５００ｍｇ以上のタンパク質を示す２４時間尿検査、又は形質細胞が骨髄中の血球の１０％～５９％を構成することを示す骨髄生検；活動性骨髄腫が引き起こし得る異常な骨病変又は腎臓損傷の兆候はない。現在、くすぶり型多発性骨髄腫に対する承認された治療法はない。
【0205】
「疾患応答」は、血液悪性腫瘍及び病期分類の標準的な基準に従って決定され得る。血液悪性腫瘍の疾患応答を評価する方法は、当業者に公知である。例えば、疾患応答を評価する方法には、Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（それぞれ、Ｏｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９８２；５（６）：６４９－６５５ ａｎｄ Ｋｕｍａｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１６；１７（８）：３２８－３４６を参照）。疾患応答を評価する方法はまた、疾患マーカーの定量化、骨髄生検及び／又は吸引、形質細胞腫の放射線画像化、骨骨格調査、Ｍタンパク質定量化（血清及び／又は２４時間尿）及び無血清軽鎖レベル又は尿中軽鎖レベル、血清ｂ２－ミクログロブリン、リンパ節生検、放射線腫瘍評価（Ｘ線、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、ＰＥＴスキャン、又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による）、並びに芽球数を含む血球数を含み得る。この評価方法のリストは、非限定的であると理解されるべきである。
【0206】
次いで、疾患応答の評価から得られた結果に基づいて、疾患応答は、基礎疾患に対する標準的な基準に従って層別化し、完全奏効又は完全寛解（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、安定疾患（ＳＤ）、又は進行性疾患（ＰＤ）に分類され得る。
【0207】
別の態様では、本開示は、多発性骨髄腫の治療又は予防を必要とする対象において多発性骨髄腫を治療又は予防する方法であって、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメインと、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞マーカーに対する結合特異性を有する第２の抗原結合ドメインとを含む、本明細書に開示される結合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0208】
一態様では、本開示は、多発性骨髄腫を治療又は予防することを必要とする対象において多発性骨髄腫を治療又は予防する方法であって、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメインと、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞マーカーに対する結合特異性を有する第２の抗原結合ドメインとを含む結合タンパク質を対象に投与することを含み、第１の抗原結合ドメインは、
ａ．ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
ｂ．ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含む。
ａ．ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
ｂ．ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含む。
【0209】
特定の実施形態では、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメインは、
ａ．ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
ｂ．ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含む。
ａ．ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
ｂ．ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含む。
【0210】
特定の実施形態では、ＶＬ１は、
ａ．ＣＡＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
ｂ．ＣＲＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
ｃ．ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＩＫＰＰ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＹＧＧＱＷＶ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、又は
ｄ．ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＧＹＹＡＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＮＫＰＰ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＹＹＧＧＱＷＶ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、を含む。
ａ．ＣＡＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
ｂ．ＣＲＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
ｃ．ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＩＫＰＰ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＹＧＧＱＷＶ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、又は
ｄ．ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＧＹＹＡＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＮＫＰＰ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＹＹＧＧＱＷＶ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、を含む。
【0211】
特定の実施形態では、
ａ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｂ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｃ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｄ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミ
ノ酸配列を含み、
ｅ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
ｆ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
ａ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｂ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｃ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｄ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミ
ノ酸配列を含み、
ｅ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
ｆ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0212】
特定の実施形態では、
ａ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、
ｄ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５３のアミノ酸配列を含むか、又は
ｆ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
ａ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、
ｄ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５３のアミノ酸配列を含むか、又は
ｆ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
【0213】
特定の実施形態では、ＮＫ細胞マーカーに対する結合特異性を有する第２の抗原結合ドメインは、
ａ．第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）であって、
ｉ．ＤＹＶＩＮ（配列番号８０）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮＹＹＮＥＫＦＫＡ（配列番号８１）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２配列、ＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３配列；
ｉｉ．ＳＤＹＡＷＮ（配列番号２２）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＥＳ（配列番号２３）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＧＹＹＧＳＳＷＧＶＦＡＹ（配列番号２４）を含むＨＣＤＲ３配列；
ｉｉｉ．ＥＹＴＭＨ（配列番号２５）を含むＨＣＤＲ１配列、ＧＩＳＰＮＩＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２６）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＧＳＦＤＹ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ３配列；
ｉｖ．ＳＦＴＭＨ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＮＰＳＳＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＳＳＲＧＦＤＹ（配列番号３０）を含むＨＣＤＲ３配列；又は
ｖ．ＳＤＹＡＷＮ（配列番号３１）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＣＷＤＹＡＬＹＡＭＤＣ（配列番号３３）を含むＨＣＤＲ３配列、を含む、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインと、
ｂ．第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）であって、
ｉ．ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＱＧＮＴＲＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｉ．ＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号３７）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３８）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｉｉ．ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号４２）を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｖ．ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号４３）を含むＬＣＤＲ１配列、ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号４４）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＲＴ（配列番号４５）を含むＬＣＤＲ３配列；又は
ｖ．ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号４６）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＤＴＰＬＴ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ３配列を含む、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、を含む。
ａ．第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）であって、
ｉ．ＤＹＶＩＮ（配列番号８０）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮＹＹＮＥＫＦＫＡ（配列番号８１）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２配列、ＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３配列；
ｉｉ．ＳＤＹＡＷＮ（配列番号２２）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＥＳ（配列番号２３）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＧＹＹＧＳＳＷＧＶＦＡＹ（配列番号２４）を含むＨＣＤＲ３配列；
ｉｉｉ．ＥＹＴＭＨ（配列番号２５）を含むＨＣＤＲ１配列、ＧＩＳＰＮＩＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２６）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＧＳＦＤＹ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ３配列；
ｉｖ．ＳＦＴＭＨ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＮＰＳＳＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＳＳＲＧＦＤＹ（配列番号３０）を含むＨＣＤＲ３配列；又は
ｖ．ＳＤＹＡＷＮ（配列番号３１）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＣＷＤＹＡＬＹＡＭＤＣ（配列番号３３）を含むＨＣＤＲ３配列、を含む、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインと、
ｂ．第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）であって、
ｉ．ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＱＧＮＴＲＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｉ．ＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号３７）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３８）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｉｉ．ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号４２）を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｖ．ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号４３）を含むＬＣＤＲ１配列、ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号４４）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＲＴ（配列番号４５）を含むＬＣＤＲ３配列；又は
ｖ．ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号４６）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＤＴＰＬＴ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ３配列を含む、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、を含む。
【0214】
特定の実施形態では、
ａ．ＶＨ２は、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ２は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ２は、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｄ．ＶＨ２は、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ２は、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｆ．ＶＨ２は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｇ．ＶＨ２は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
ｈ．ＶＨ２は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
ａ．ＶＨ２は、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ２は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ２は、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｄ．ＶＨ２は、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ２は、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｆ．ＶＨ２は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｇ．ＶＨ２は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
ｈ．ＶＨ２は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0215】
特定の実施形態では、
ａ．ＶＨ２は配列番号５６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６４のアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ２は配列番号５７のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６５のアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ２は配列番号５８のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６６のアミノ酸配列を含むか、
ｄ．ＶＨ２は配列番号５９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６７のアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ２は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、
ｆ．ＶＨ２は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、
ｇ．ＶＨ２は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号７０のアミノ酸配列を含むか、又は
ｈ．ＶＨ２は配列番号６３のアミノ酸配列を含むか、ＶＬ２は配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
ａ．ＶＨ２は配列番号５６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６４のアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ２は配列番号５７のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６５のアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ２は配列番号５８のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６６のアミノ酸配列を含むか、
ｄ．ＶＨ２は配列番号５９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６７のアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ２は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、
ｆ．ＶＨ２は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、
ｇ．ＶＨ２は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号７０のアミノ酸配列を含むか、又は
ｈ．ＶＨ２は配列番号６３のアミノ酸配列を含むか、ＶＬ２は配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
【0216】
特定の実施形態では、本方法は、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその変異体の全部又は一部を更に含む。
【0217】
特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン又はその変異体は、第１のＦｃ重鎖及び第２のＦｃ重鎖を含む。特定の実施形態では、第１のＦｃ重鎖又は第２のＦｃ重鎖は、システインの対を含む。
【0218】
特定の実施形態では、対象は、本明細書中に開示されるようなＮＫＣＥによる処置の前に処置又は治療を受けたことがある。特定の実施形態では、多発性骨髄腫は、再発性／難治性多発性骨髄腫である。
【0219】
軽鎖アミロイドーシスの治療方法／使用
一態様では、本開示は、軽鎖アミロイドーシス（ＬＣＡ）の治療及び予防に関する。
一態様では、本開示は、軽鎖アミロイドーシス（ＬＣＡ）の治療及び予防に関する。
【0220】
特定の実施形態では、本開示は、疾患及び障害、例えば、そのような処置を必要とする哺乳動物対象におけるアミロイドーシスを処置するためのキット及び方法を提供する。ＬＣＡのためのケアの現在の基準は、頻繁な臓器機能不全を伴うこの集団における耐容性のために制限されている。このように、有効且つ安全なＬＣＡのための追加の治療薬の必要性は依然として満たされていない。
【0221】
別の態様では、本開示は、軽鎖アミロイドーシスの治療又は予防を必要とする対象において軽鎖アミロイドーシスを治療又は予防する方法であって、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメインと、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞マーカーに対する結合特異性を有する第２の抗原結合ドメインとを含む、本明細書に開示される結合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0222】
一態様では、本開示は、ＬＣＡを治療又は予防することを必要とする対象においてＬＣＡを治療又は予防する方法であって、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメインと、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞マーカーに対する結合特異性を有する第２の抗原結合ドメインとを含む結合タンパク質を対象に投与することを含み、第１の抗原結合ドメインは、
ａ．ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
ｂ．ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含む。
ａ．ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
ｂ．ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含む。
【0223】
特定の実施形態では、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメインは、
ａ．ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の
免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
ｂ．ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含む。
ａ．ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の
免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
ｂ．ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含む。
【0224】
特定の実施形態では、ＶＬ１は、
ａ．ＣＡＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
ｂ．ＣＲＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
ｃ．ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＩＫＰＰ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＹＧＧＱＷＶ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、又は
ｄ．ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＧＹＹＡＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＮＫＰＰ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＹＹＧＧＱＷＶ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、を含む。
ａ．ＣＡＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
ｂ．ＣＲＳＳＴＧＴＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＳＲＰＰ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＦＧＮＱＷＶ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、
ｃ．ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＳＮＹＡＮ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＩＫＰＰ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＷＹＧＧＱＷＶ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、又は
ｄ．ＣＡＳＳＴＧＡＶＴＰＧＹＹＡＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＮＫＰＰ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＹＹＧＧＱＷＶ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列、を含む。
【0225】
特定の実施形態では、
ａ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｂ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｃ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｄ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｅ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
ｆ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
ａ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｂ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｃ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｄ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｅ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
ｆ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0226】
特定の実施形態では、
ａ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５１のアミノ酸
配列を含むか、
ｄ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５３のアミノ酸配列を含むか、又は
ｆ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
ａ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５１のアミノ酸
配列を含むか、
ｄ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は配列番号５３のアミノ酸配列を含むか、又は
ｆ．ＶＨ１は、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
【0227】
特定の実施形態では、ＮＫ細胞マーカーに対する結合特異性を有する第２の抗原結合ドメインは、
ａ．第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）であって、
ｉ．ＤＹＶＩＮ（配列番号８０）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮＹＹＮＥＫＦＫＡ（配列番号８１）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２配列、ＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３配列；
ｉｉ．ＳＤＹＡＷＮ（配列番号２２）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＥＳ（配列番号２３）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＧＹＹＧＳＳＷＧＶＦＡＹ（配列番号２４）を含むＨＣＤＲ３配列；
ｉｉｉ．ＥＹＴＭＨ（配列番号２５）を含むＨＣＤＲ１配列、ＧＩＳＰＮＩＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２６）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＧＳＦＤＹ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ３配列；
ｉｖ．ＳＦＴＭＨ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＮＰＳＳＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＳＳＲＧＦＤＹ（配列番号３０）を含むＨＣＤＲ３配列；又は
ｖ．ＳＤＹＡＷＮ（配列番号３１）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＣＷＤＹＡＬＹＡＭＤＣ（配列番号３３）を含むＨＣＤＲ３配列、を含む、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインと、
ｂ．第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）であって、
ｉ．ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＱＧＮＴＲＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｉ．ＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号３７）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３８）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｉｉ．ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号４２）を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｖ．ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号４３）を含むＬＣＤＲ１配列、ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号４４）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＲＴ（配列番号４５）を含むＬＣＤＲ３配列；又は
ｖ．ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号４６）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＤＴＰＬＴ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ３配列を含む、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、を含む。
ａ．第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）であって、
ｉ．ＤＹＶＩＮ（配列番号８０）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮＹＹＮＥＫＦＫＡ（配列番号８１）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２配列、ＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３配列；
ｉｉ．ＳＤＹＡＷＮ（配列番号２２）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＥＳ（配列番号２３）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＧＹＹＧＳＳＷＧＶＦＡＹ（配列番号２４）を含むＨＣＤＲ３配列；
ｉｉｉ．ＥＹＴＭＨ（配列番号２５）を含むＨＣＤＲ１配列、ＧＩＳＰＮＩＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２６）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＧＳＦＤＹ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ３配列；
ｉｖ．ＳＦＴＭＨ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＮＰＳＳＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＧＳＳＲＧＦＤＹ（配列番号３０）を含むＨＣＤＲ３配列；又は
ｖ．ＳＤＹＡＷＮ（配列番号３１）を含むＨＣＤＲ１配列、ＹＩＴＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＣＷＤＹＡＬＹＡＭＤＣ（配列番号３３）を含むＨＣＤＲ３配列、を含む、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインと、
ｂ．第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）であって、
ｉ．ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＱＧＮＴＲＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｉ．ＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号３７）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号３８）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＧＴＰＷＴ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｉｉ．ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＮＧＨＳＦＰＬＴ（配列番号４２）を含むＬＣＤＲ３配列；
ｉｖ．ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ（配列番号４３）を含むＬＣＤＲ１配列、ＡＡＴＮＬＡＤ（配列番号４４）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＦＷＧＴＰＲＴ（配列番号４５）を含むＬＣＤＲ３配列；又は
ｖ．ＲＴＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号４６）を含むＬＣＤＲ１配列、ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＨＨＹＤＴＰＬＴ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ３配列を含む、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、を含む。
【0228】
特定の実施形態では、
ａ．ＶＨ２は、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ２は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ２は、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｄ．ＶＨ２は、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ２は、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｆ．ＶＨ２は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｇ．ＶＨ２は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
ｈ．ＶＨ２は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
ａ．ＶＨ２は、配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ２は、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ２は、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｄ．ＶＨ２は、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ２は、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｆ．ＶＨ２は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、
ｇ．ＶＨ２は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は
ｈ．ＶＨ２は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0229】
特定の実施形態では、
ａ．ＶＨ２は配列番号５６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６４のアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ２は配列番号５７のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６５のアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ２は配列番号５８のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６６のアミノ酸配列を含むか、
ｄ．ＶＨ２は配列番号５９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６７のアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ２は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、
ｆ．ＶＨ２は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、
ｇ．ＶＨ２は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号７０のアミノ酸配列を含むか、又は
ｈ．ＶＨ２は配列番号６３のアミノ酸配列を含むか、ＶＬ２は配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
ａ．ＶＨ２は配列番号５６のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６４のアミノ酸配列を含むか、
ｂ．ＶＨ２は配列番号５７のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６５のアミノ酸配列を含むか、
ｃ．ＶＨ２は配列番号５８のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６６のアミノ酸配列を含むか、
ｄ．ＶＨ２は配列番号５９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６７のアミノ酸配列を含むか、
ｅ．ＶＨ２は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６８のアミノ酸配列を含むか、
ｆ．ＶＨ２は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号６９のアミノ酸配列を含むか、
ｇ．ＶＨ２は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２は配列番号７０のアミノ酸配列を含むか、又は
ｈ．ＶＨ２は配列番号６３のアミノ酸配列を含むか、ＶＬ２は配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
【0230】
特定の実施形態では、本方法は、免疫グロブリンＦｃドメイン又はその変異体の全部又は一部を更に含む。
【0231】
特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン又はその変異体は、第１のＦｃ重鎖及び第２のＦｃ重鎖を含む。特定の実施形態では、第１のＦｃ重鎖又は第２のＦｃ重鎖は、システインの対を含む。
【0232】
特定の実施形態では、ＮＫ細胞マーカーは、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＫＩＲ受容体（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ３）、ＣＤ９４、及びＮＫＧ２から選択される。特定の実施形態では、ＮＫ細胞マーカーは、ＮＫｐ４６である。
【0233】
特定の実施形態では、本方法は、軽鎖アミロイドーシスを有する対象の選択を更に含み、その選択は、
ａ．軽鎖アミロイドーシスを有する対象「を診断すること、
ｂ．本明細書に開示される予後システムに基づいて疾患の病期分類を決定すること、及び／又は
ｃ．対象が多発性骨髄腫の事前診断を受けていないと決定することを含む。
ａ．軽鎖アミロイドーシスを有する対象「を診断すること、
ｂ．本明細書に開示される予後システムに基づいて疾患の病期分類を決定すること、及び／又は
ｃ．対象が多発性骨髄腫の事前診断を受けていないと決定することを含む。
【0234】
特定の実施形態では、対象は、治療未経験である。
【0235】
特定の実施形態では、対象は、軽鎖アミロイドーシス（例えば、化学療法、自己幹細胞移植、免疫調節薬、免疫療法、プロテアソーム阻害剤及びそれらの任意の組み合わせ）のための１つ以上の治療薬を受けたことがあるか、又は受けている。特定の実施形態では、対象は、少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤を受けたことがある。
【0236】
特定の実施形態では、ＬＣＡは、再発性／難治性ＬＣＡである。
【0237】
一態様では、本開示は、ＬＣＡの処置又は予防を必要とする対象においてＬＣＡを処置又は予防する方法であって、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメインと、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を有する第２の抗原結合ドメインとを含む結合タンパク質を対象に投与することを含み、
ａ．第１の抗原結合ドメインは、
ｉ．ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
ｉｉ．ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含み、
ｂ．第２の抗原結合ドメインは、
ｉ．ＤＹＶＩＮ（配列番号１９）を含むＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮＹＹＮＥＫＦＫＡ（配列番号２０）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）を含むＨＣＤＲ３配列、並びに
ｉｉ．ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３４）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３５）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＱＧＮＴＲＰＷＴ（配列番号３６）を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
ａ．第１の抗原結合ドメインは、
ｉ．ＧＦＴＦＳＮＦＧＭＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、ＶＩＷＳＤＥＴＮＲ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、及びＤＱＱＹＣＳＳＤＳＣＦＴＷＦＤＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）と、
ｉｉ．ＣＸ１ＳＳＴＧＸ２ＶＴＰＸ３Ｘ４ＹＡＮ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列であって、Ｘ１がＲ又はＡであり、Ｘ２がＴ又はＡであり、Ｘ３がＳ又はＧであり、Ｘ４がＮ又はＹであるＬＣＤＲ１配列、ＤＮＮＸ５Ｘ６ＰＰ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列であって、Ｘ５がＳ、Ｉ又はＮであり、Ｘ６がＲ又はＫであるＬＣＤＲ２配列、及びＡＬＸ７Ｘ８ＧＸ９ＱＷＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３配列であって、Ｘ７がＷ又はＹであり、Ｘ８がＦ又はＹであり、Ｘ９がＮ又はＧであるＬＣＤＲ３配列を含む、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）とを含み、
ｂ．第２の抗原結合ドメインは、
ｉ．ＤＹＶＩＮ（配列番号１９）を含むＨＣＤＲ１配列、ＥＩＹＰＧＳＧＴＮＹＹＮＥＫＦＫＡ（配列番号２０）を含むＨＣＤＲ２配列、及びＲＧＲＹＧＬＹＡＭＤＹ（配列番号２１）を含むＨＣＤＲ３配列、並びに
ｉｉ．ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号３４）を含むＬＣＤＲ１配列、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３５）を含むＬＣＤＲ２配列、及びＱＱＧＮＴＲＰＷＴ（配列番号３６）を含むＬＣＤＲ３配列を含む。
【0238】
一態様では、本開示は、ＬＣＡの処置又は予防を必要とする対象においてＬＣＡを処置又は予防する方法であって、ＢＣＭＡに対する結合特異性を有する第１の抗原結合ドメインと、ＮＫｐ４６に対する結合特異性を有する第２の抗原結合ドメインとを含む結合タンパク質を対象に投与することを含み、
ａ．第１の抗原結合ドメインは、
ｉ．配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ１と、
ｉｉ．配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬ１と、を含み、
ｂ．第２の抗原結合ドメインは、
ｉ．配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ２と、
ｉｉ．配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ１と、
を含む。
ａ．第１の抗原結合ドメインは、
ｉ．配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ１と、
ｉｉ．配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＬ１と、を含み、
ｂ．第２の抗原結合ドメインは、
ｉ．配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ２と、
ｉｉ．配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ１と、
を含む。
【0239】
特定の実施形態では、結合タンパク質は、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、又は膣内投与によって投与される。特定の実施形態では、結合タンパク質は、皮下投与によって投与される。
【0240】
特定の実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、ＡＤＣＣ活性を増強するためのＣＨ２中のＡＤＥ変異（Ｇ２３６／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）を含む。
【0241】
特定の実施形態では、Ｆドメイン変異体は、安定化のためのＣＨ２中のジスルフィド結合置換（Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ）を含む。
【0242】
特定の実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、Ｆｃドメイン中のヘテロ二量体形成を促進するためのＣＨ３中のノブ－イントゥ－ホール変異（ＫＩＨ）を含む。特定の実施形態では、「ノブ」変異は、位置Ｃ４８２／Ｗ４９４にあり、「ホール」変異は、位置Ｃ１２９／Ｓ１４６／Ａ１４８／Ｖ１８７にある。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体は、Ｆｃドメイン中のヘテロ二量体の精製を促進するために、１つのＣＨ３中にＲＦ変異（Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ）を含む。
【0243】
特定の実施形態では、疾患は、アミロイドーシス又はアミロイド疾患である。本明細書で使用される場合、「アミロイドーシス」又は「アミロイド疾患」という用語は、形質細胞障害（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ ｄｙｓｃｒａｓｉａｓ）の範疇に入る疾患又は障害を指す。アミロイドーシス又はアミロイド疾患は、アミロイドが臓器に蓄積し、正常な生理学的機能を妨げる場合に生じる。本明細書で使用される場合、「アミロイド」という用語は、臓器及び組織に見られる異常な線維性で細胞外のタンパク質性沈着物を指す。アミロイドは通常体内には見られないが、いくつかの異なるタイプのタンパク質から形成され得る。アミロイドは、典型的には不溶性であり、βシート構造によって構造的に支配されている。影響を受ける可能性がある臓器としては、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、神経系、皮膚及び消化管が挙げられる。「アミロイドーシス」という用語は、共通の特徴、すなわち臓器及び組織における病的な不溶性原線維タンパク質の細胞外沈着を共有する疾患のクラスターを指すために使用される。
【0244】
アミロイド疾患の顕著な特徴は、色素コンゴーレッドに結合し、色素チオフラビンＴに結合したときに蛍光複屈折を示す直径約５～１５ｎｍの線維状形態を特徴とするアミロイドの産生である。線維は、プリーツ状のβシートからなるプロトフィラメントと呼ばれる二次構造を形成することができ、これにより分解に対して耐性になる。Ｔｏｙａｍａ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ（２０１１），Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，８０：５５７－５８５；Ｐｉｃｋｅｎ（２０２０），Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ，ｖｏｌ．１４３：３２２－３３４．
【0245】
特定の実施形態では、アミロイドーシス又はアミロイド疾患は、軽鎖アミロイドーシス又はアミロイド軽鎖アミロイドーシスである。アミロイドの現在の分類は、アミロイドタンパク質のタイプに基づく。例えば、アミロイドは「Ａ」（アミロイドの場合）と呼ばれ、その後にタンパク質型の略語が続く：ＡＬ（免疫グロブリン軽鎖由来のアミロイド）。「アミロイド軽鎖アミロイドーシス」又は「軽鎖アミロイドーシス」又は「ＬＣＡ」とい
う用語は、ＡＬアミロイドーシス、ＡＬ、ＡＬＡ又はＡＬ原発性アミロイドーシスとも呼ばれ、米国及び先進国における全身性アミロイドーシスの最も一般的な形態である。Ｐｉｃｋｅｎ（２０２０），Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ，ｖｏｌ．１４３：３２２－３３４．患者は、第１の症例のＬＣＡ（新たに診断されたＬＣＡ）を呈する場合があるか、又はＬＣＡは、再発性及び／若しくは難治性（再発性／難治性ＬＣＡ）であり得る。ＬＣＡは、全身性アミロイドーシスの最も一般的な形態であり、根底にある形質細胞障害に関連する。異常な形質細胞は、単一の形質細胞源に由来し、毒性フィブリル形成遊離軽鎖を分泌する。これらの形質細胞は、ＢＣＭＡ陽性であることが示されている（Ｇｏｄａｒａ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｂｌｏｏｄ １３４（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ＿１）：４４０９）。特定の実施形態では、ＬＣＡを有する患者は、治療未経験である。いくつかの実施形態では、ＬＣＡを有する患者は、軽鎖アミロイドーシス（例えば、化学療法、自己幹細胞移植、免疫調節薬、免疫療法、プロテアソーム阻害剤及びそれらの任意の組み合わせ）のための１つ以上の治療薬を受けたことがあるか、又は受けている。
う用語は、ＡＬアミロイドーシス、ＡＬ、ＡＬＡ又はＡＬ原発性アミロイドーシスとも呼ばれ、米国及び先進国における全身性アミロイドーシスの最も一般的な形態である。Ｐｉｃｋｅｎ（２０２０），Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ，ｖｏｌ．１４３：３２２－３３４．患者は、第１の症例のＬＣＡ（新たに診断されたＬＣＡ）を呈する場合があるか、又はＬＣＡは、再発性及び／若しくは難治性（再発性／難治性ＬＣＡ）であり得る。ＬＣＡは、全身性アミロイドーシスの最も一般的な形態であり、根底にある形質細胞障害に関連する。異常な形質細胞は、単一の形質細胞源に由来し、毒性フィブリル形成遊離軽鎖を分泌する。これらの形質細胞は、ＢＣＭＡ陽性であることが示されている（Ｇｏｄａｒａ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｂｌｏｏｄ １３４（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ＿１）：４４０９）。特定の実施形態では、ＬＣＡを有する患者は、治療未経験である。いくつかの実施形態では、ＬＣＡを有する患者は、軽鎖アミロイドーシス（例えば、化学療法、自己幹細胞移植、免疫調節薬、免疫療法、プロテアソーム阻害剤及びそれらの任意の組み合わせ）のための１つ以上の治療薬を受けたことがあるか、又は受けている。
【0246】
特定の実施形態では、Ｆｃドメイン変異体を含む結合タンパク質を含む結合タンパク質は、いくつかの異なる用途に有用である。例えば、一実施形態では、主題の結合タンパク質は、Ｆｃドメイン変異体の結合ドメインによって認識されるエピトープを持つ細胞を低減又は排除するために有用である。別の実施形態では、対象Ｆｃドメイン変異体は、循環中の可溶性抗原の濃度を低下させるか又は排除するのに有効である。別の実施形態では、対象Ｆｃドメイン変異体は、Ｔ細胞エンゲージャーとして有効である。
【0247】
別の実施形態では、Ｆｃドメイン変異体を含むものを含む対象結合タンパク質は、異常なモノクローナルＢ細胞又は形質細胞に関連する疾患又は障害の治療に有用である。一実施形態では、異常なモノクローナルＢ細胞又は形質細胞はＢＣＭＡを発現する。
【0248】
結合タンパク質は、形質細胞障害のカテゴリー内の疾患又は障害の治療に特に有用であり得る。一実施形態では、形質細胞障害は、多発性骨髄腫ではない。一実施形態では、形質細胞障害はアミロイドーシス、例えばＬＣＡ（軽鎖アミロイドーシス、ＡＬ（原発性）アミロイドーシス、全身性アミロイドーシス、ＡＬ、又はＡＬＡとも呼ばれる）である。
【0249】
ＬＣＡは、ミスフォールドした免疫グロブリン軽鎖を産生するクローン形質細胞によって主に引き起こされる血液学的障害である。これらの異常な軽鎖は、形質細胞中で毒性凝集体を形成し、臓器及び組織中に原線維（アミロイド）を沈着させ、これにより、重大で時には永続的な臓器機能不全がもたらされる。ＬＣＡは、脳以外の任意の臓器に影響を及ぼし得る。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｊ Ｉｎｔ Ｍｅｄ Ｒｅｓ．，４７（４）：１７７８－１７８６．アミロイド原性免疫グロブリン軽鎖が臓器機能不全をもたらす機序は、十分に特徴付けられていないが、アミロイド沈着物及び原線維前凝集物の両方が、根底にある臓器（）に対する細胞傷害性効果をもたらす可能性が高い。原発性ＬＣＡは、多発性骨髄腫の合併症と関連も考慮もしていないＬＣＡである。
【0250】
症状は、影響を受ける基礎臓器に依存し、一般に疾患進行の後期に認識される。ＬＣＡの初期の徴候及び症状としては、足首及び脚の腫脹；重度の疲労及び脱力感（例えば、息切れ；手又は足のしびれ、刺痛又は疼痛）、下痢又は便秘、意図しない著しい体重減少；肥大した舌、皮膚の変化（目の周りの肥厚若しくはあざができやすい、又は紫色の斑点等）、不規則な心拍、又は嚥下困難が挙げられるが、これらに限定されない。より重度のＬＣＡの臨床的特徴としては、心臓、腎臓、肝臓、及び胃腸の関与及び／又は機能不全、並びに神経障害及び巨舌症が挙げられる。心臓病変（例えば、心不全及び不整脈）は、最も一般的なＬＣＡ症状であり、単一の最も悪い予後特徴を表す。Ｂｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０２１），Ｃａｒｄｉｏｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３：４．
【0251】
ＬＣＡの診断基準は、（１）全身性症候群の存在、（２）アミロイドの組織学的記録、（３）モノクローナル形質細胞障害（例えば、骨髄又は脂肪吸引物及び／又は標的生検及び血清学的パラメータに基づく）の証拠、及び（４）Ｉｇ軽鎖の同定のためのアミロイドーシス分類（例えば、ＬＣ－ＭＳ又は免疫電子顕微鏡法を介して）を含む。Ｋｏｈ（２０２０）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓ．，５５（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ５４－Ｓ５７．
【0252】
ＬＣＡ患者の疾患の転帰は、多段階予後システムに基づいて予測することができる。現在、４つの異なる予後モデルがある：（１）Ｍａｙｏ Ｍｏｄｅｌ ２００４（Ｄｉｓｐｅｎｚｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．２２：３７５１－７）；（２）Ｍａｙｏ Ｍｏｄｅｌ ２０１２（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．３０：９８９－９５）；（３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｄｅｌ ２０１５（Ｍｕｃｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｖｏｌ．３３：８１１－４）；（４）Ｂｏｓｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ ２０１９（Ｌｉｌｌｅｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１３３：２１５－２３）。Ｍａｙｏ Ｍｏｄｅｌ ２０１２及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｄｅｌ ２０１５は、最近の検証研究において最良の予測性能を示した。Ｖａｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ，４０：１００６３６．
【0253】
自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）はＬＣＡ患者にとって最も効果的な治療法である。Ｓａｎｃｈｏｒａｗａｌａ（２０２０），Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ，ｖｏｌ．１４３：３８１－３８７．トロポニンＴレベル＞０．０６ｎｇ／ｍｌ又はＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベル＞５０００ｎｇ／Ｌが高い移植関連死亡率と関連することから、ＡＳＣＴ適格性の評価のために心臓バイオマーカーがしばしば試験される。Ｇａｖｒｉａｔｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｖｏｌ．３２：１１８３－１８９８．ＬＣＡ患者の大部分は幹細胞移植に不適格であり、基礎となる血漿細胞を根絶するために単剤又は併用化学療法及び／又は免疫療法レジメンを受け得る。中リスク患者の標準治療は、経口メルファラン／デキサメタゾン（Ｍｄｅｘ）、ボルテゾミブに基づくレジメン（ＢＭＤｅｘ、又はＶＣＤ）であった。しかしながら、治療に関連する死亡率は相当である（２４％）。Ｉｄ．迅速奏効率を達成できない患者は、第二選択治療、すなわち免疫調節薬（ＩＭＩＤ）について考慮される。ＩＩＭＩＤには、サリドマイド、レナリドマイド及びポマリドマイド、並びにそれらのアルキル化剤との組み合わせが含まれる。しかしながら、免疫療法は、患者、特に心臓ＬＣＡを有する患者では忍容性が低い。Ｓｉｄｉｑｉ ＆ Ｇｅｒｔｚ（２０２１），Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．１１：９０．全体として、現在使用されているＬＣＡ処置レジメンは、しばしば疾患症状を増強する治療の持続的な副作用に屈することが多い患者では、患者が忍容することが困難であることが多い。Ｈａｓｓａｎ ａｎｄ Ｓａｎｃｈｏｒａｗａｌａ（２０２２），Ｈｅｍａｔｏ，ｖｏｌ．３：３８－４６．より最近では、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８）－ＶＣＤが、フェーズ３ＡＮＤＲＯＭＥＤＡ研究（ＮＣＴ０３２０１９６５）に基づいて、新たに診断されたＬＣＡ患者における標準治療として承認された（Ｋａｓｔｒｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．２０２１．ＮＥＪＭ，３８５：４６－５８）。
【0254】
本明細書に開示されるＮＫ細胞エンゲージャーの治療有効量は、対象において「治療応答」を誘導するのに十分な用量又は量、例えばアミロイド疾患の少なくとも１つの尺度の改善、例えば既存のアミロイド沈着物又はプラークのサイズの減少、アミロイド沈着速度の減少、又は標準的な技術によって測定される臓器機能の改善であり得る。共通の標的臓器に特異的な共通の提示徴候の例及び改善された臓器機能の例を以下に要約する。
【0255】
心臓
アミロイド沈着物の一般的に現れる徴候は、労作時呼吸困難、起座呼吸、発作性夜間呼
吸困難、下肢浮腫、胸水、頸静脈拡張、不整脈、失神、狭心症である。患者のＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）のレベルの低下、又は患者のニューヨーク心臓病学会（ＮＹＨＡ）機能分類レベルの低下は、心臓の改善の指標となり得る。Ｐａｌｌａｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１０７：２４４０－２４４５．改善された心機能はまた、心臓トロポニン値を測定することによって、心臓ＭＲＩ及び心エコー図を分析することによって評価され得る。
アミロイド沈着物の一般的に現れる徴候は、労作時呼吸困難、起座呼吸、発作性夜間呼
吸困難、下肢浮腫、胸水、頸静脈拡張、不整脈、失神、狭心症である。患者のＮ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）のレベルの低下、又は患者のニューヨーク心臓病学会（ＮＹＨＡ）機能分類レベルの低下は、心臓の改善の指標となり得る。Ｐａｌｌａｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１０７：２４４０－２４４５．改善された心機能はまた、心臓トロポニン値を測定することによって、心臓ＭＲＩ及び心エコー図を分析することによって評価され得る。
【0256】
腎臓
腎臓におけるアミロイド沈着の一般的な徴候は、下肢浮腫、全身浮腫、及び尿毒症である。タンパク尿又は尿中のタンパク質排出速度及び推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）の低下は、腎機能の改善の指標となり得る。Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌ（２０１１），ｖｏｌ．３（１）：１９－６２．
腎臓におけるアミロイド沈着の一般的な徴候は、下肢浮腫、全身浮腫、及び尿毒症である。タンパク尿又は尿中のタンパク質排出速度及び推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）の低下は、腎機能の改善の指標となり得る。Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌ（２０１１），ｖｏｌ．３（１）：１９－６２．
【0257】
肝臓
肝臓におけるアミロイド沈着物の一般的な徴候は、右上腹部圧痛、肝腫大、腹水及び／又は乏尿である。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベル、血清ｙ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）レベルの改善は、肝機能の改善の指標であり得る。高脂血症、凝固異常、血小板減少症、プロトロンビン時間（ＰＴ）、赤血球沈降速度、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び／又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、血清アルブミン及び補体断片のレベル等の他の測定基準の改善も、肝アミロイドーシスに対する特異性を欠くため、これらのパラメータを任意の治療前に評価した場合に、肝機能の改善を示すことができる。Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．８２（５）：２９１－２９８．
肝臓におけるアミロイド沈着物の一般的な徴候は、右上腹部圧痛、肝腫大、腹水及び／又は乏尿である。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベル、血清ｙ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）レベルの改善は、肝機能の改善の指標であり得る。高脂血症、凝固異常、血小板減少症、プロトロンビン時間（ＰＴ）、赤血球沈降速度、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び／又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、血清アルブミン及び補体断片のレベル等の他の測定基準の改善も、肝アミロイドーシスに対する特異性を欠くため、これらのパラメータを任意の治療前に評価した場合に、肝機能の改善を示すことができる。Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．８２（５）：２９１－２９８．
【0258】
ＧＩ管
胃腸（ＧＩ）管内のアミロイド沈着物の一般的に現れる症状は、運動性の喪失、胃腸出血、吸収不良、体重減少、食欲不振、嘔吐、悪心、血腫、びらん及び潰瘍、又は結節性胃炎である。改善されたＧＩ管機能は、従来のイメージング（例えば、エコーグラフィ、コンピュータ断層撮影スキャナー、Ｘ線、内視鏡検査）を使用して評価され得る。
胃腸（ＧＩ）管内のアミロイド沈着物の一般的に現れる症状は、運動性の喪失、胃腸出血、吸収不良、体重減少、食欲不振、嘔吐、悪心、血腫、びらん及び潰瘍、又は結節性胃炎である。改善されたＧＩ管機能は、従来のイメージング（例えば、エコーグラフィ、コンピュータ断層撮影スキャナー、Ｘ線、内視鏡検査）を使用して評価され得る。
【0259】
神経系
神経の近傍又は神経内のアミロイド沈着物の一般的に現れる症状は、神経障害性疼痛、しびれ、及び進行した場合には脱力の症状を特徴とする感覚運動性多発神経障害である。神経系機能の改善は、神経伝導検査（ＮＣＳ）、筋電図検査（ＥＭＧ）、自律神経機能検査（ＡＦＴ）、及び定量的副運動軸索反射検査（ＱＳＡＲＴ）等の電気生理学的検査によって評価され得る。
神経の近傍又は神経内のアミロイド沈着物の一般的に現れる症状は、神経障害性疼痛、しびれ、及び進行した場合には脱力の症状を特徴とする感覚運動性多発神経障害である。神経系機能の改善は、神経伝導検査（ＮＣＳ）、筋電図検査（ＥＭＧ）、自律神経機能検査（ＡＦＴ）、及び定量的副運動軸索反射検査（ＱＳＡＲＴ）等の電気生理学的検査によって評価され得る。
【0260】
当業者は、日常的な実験によって、ＬＣＡを治療する目的のために、有効な非毒性量の結合タンパク質又はＦｃドメイン変異体が何であるかを決定することができるであろう。例えば、本開示のＦｃドメイン変異体を含むものを含む結合タンパク質の治療活性量は、予後判定病期分類システム、対象の年齢、性別、医学的合併症（例えば、免疫抑制状態又は疾患）及び体重、並びに対象において所望の応答を誘発する修飾抗体の能力等の因子に従って変動し得る。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少させてもよい。
【0261】
一般に、本開示において提供される組成物は、Ｆｃドメイン変異体を含むものを含む、結合タンパク質による癌性細胞の標的化を可能にする抗原マーカーを含む任意の新生物を予防的又は治療的に処置するために使用され得る。
【0262】
本開示の結合タンパク質を、複数の機会に投与することができる。単回投与間の間隔は、毎週、毎月又は毎年であり得る。間隔はまた、患者における結合タンパク質又は結合抗原の血中レベルを測定することによって示されるように不規則であり得る。いくつかの方法では、投薬量は、約１～１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では約２５～３００μｇ／ｍｌの血漿修飾結合ポリペプチド濃度を達成するように調整される。或いは、結合タンパク質は、持続放出製剤として投与することができ、その場合、必要とされる投与頻度は少ない。抗体の場合、投薬量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト化抗体は最も長い半減期を示し、次いでキメラ抗体及び非ヒト抗体が続く。
【0263】
投薬量及び投与頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに応じて変化し得る。予防的適用において、本発明のポリペプチド又はそのカクテルを含有する組成物は、患者の耐性を高めるために、まだ疾患状態にない患者に投与される。そのような量は、「予防有効用量」であると定義される。この使用では、正確な量はやはり患者の健康状態及び一般的な免疫に依存するが、一般に、用量あたり約０．１～約２５ｍｇ、特に用量あたり約０．５～約２．５ｍｇの範囲である。長期間にわたって、比較的低頻度の間隔で、比較的低い投薬量が投与される。一部の患者は、残りの存命期間中、治療を受け続ける。治療用途では、疾患の進行が軽減若しくは終了するまで、又は患者が疾患症状の部分的若しくは完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投薬量（例えば、約１～４００ｍｇ／ｋｇの抗体／用量であり、約５～２５ｍｇの投薬量が放射性免疫コンジュゲートのためにより一般的に使用され、より高用量が細胞毒素－薬物修飾抗体のために使用される）が必要とされることがある。その後、患者に予防的レジメンを投与することができる。
【0264】
本開示の結合タンパク質（Ｆｃ変異体を含むものを含む）は、任意に、治療（例えば、予防的又は治療的）を必要とする障害又は状態を治療するのに有効な他の薬剤と組み合わせて投与することができる。本開示の９０Ｙ標識修飾抗体の有効な単単回治療の投薬量（すなわち、治療有効量）は、約５～約７５ｍＣｉ、例えば約１０～約４０ｍＣｉの範囲である。１３１Ｉ修飾抗体の有効な単回治療非骨髄除去投薬量は、約５～約７０ｍＣｉ、又は約５～約４０ｍＣｉの範囲である。１３１Ｉ標識抗体の有効な単回治療除去投薬量（すなわち、自家骨髄移植を必要とする場合がある）は、約３０ｍＣｉ～約６００ｍＣｉ、例えば、約５０ｍＣｉ～約５００ｍＣｉ未満の範囲である。キメラ抗体と併せて、より長い循環半減期Ｉマウス抗体のために、ヨウ素－１３１標識キメラ抗体の非骨髄除去の有効な単回治療の投薬量は、約５ｍＣｉ～約４０ｍＣｉ、例えば、約３０ｍＣｉ未満の範囲である。例えば１１１Ｉｎ標識のイメージング基準は、典型的には約５ｍＣｉ未満である。
【0265】
結合タンパク質は上記のように投与され得るが、他の実施形態では、ポリペプチドは第一選択療法として他の点では健康な患者に投与され得ることを強調しなければならない。そのような実施形態では、結合タンパク質は、正常又は平均的な赤骨髄予備能を有する患者並びに／又は治療を受けたことがない及び受けていない患者に投与され得る。本明細書で使用される場合、補助療法と組み合わせて又は併用してポリペプチドを投与することは、治療及び開示される抗体の連続的に、同時に、同一の広がりをもって、同時、同時発生的に又は同時に存在して投与すること又は適用することを意味する。当業者は、組み合わせた療法レジメンの様々な構成要素の投与又は適用の時間を、治療の全体的な効果を強化するために調整し得ることを理解するであろう。
【0266】
前述のように、本開示の結合タンパク質（Ｆｃ変異体を含むものを含む）、その抗体、治療用ポリペプチド又はＦｃ変異融合ポリペプチドは、哺乳動物障害のインビボ治療のための薬学的有効量で投与され得る。これに関して、開示された結合タンパク質は、投与を容易にし、活性薬剤の安定性を促進するために製剤化されることが理解されよう。
【0267】
医薬組成物及びその投与
本開示の結合タンパク質を調製し、対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、又は当業者によって容易に決定される。本開示の結合ポリペプチドの投与経路は、経口、非経口、吸入又は局所であり得る。本明細書で使用される場合、非経口という用語は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、又は膣内投与を含む。これらの全ての投与形態は、本開示の範囲内にあると明確に企図されるが、投与形態は、注射用、特に静脈内又は動脈内注射若しくは点滴用又は皮下投与用の溶液である。通常、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意に安定剤（例えば、ヒトアルブミン）等を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体を有害細胞集団の部位に直接送達することができ、それにより疾患組織の治療剤への曝露を増加させる。
本開示の結合タンパク質を調製し、対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、又は当業者によって容易に決定される。本開示の結合ポリペプチドの投与経路は、経口、非経口、吸入又は局所であり得る。本明細書で使用される場合、非経口という用語は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、又は膣内投与を含む。これらの全ての投与形態は、本開示の範囲内にあると明確に企図されるが、投与形態は、注射用、特に静脈内又は動脈内注射若しくは点滴用又は皮下投与用の溶液である。通常、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意に安定剤（例えば、ヒトアルブミン）等を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン変異体を有害細胞集団の部位に直接送達することができ、それにより疾患組織の治療剤への曝露を増加させる。
【0268】
非経口投与のための調製物としては、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、及び乳剤が挙げられる。水性担体として、水、アルコール性／水性の溶液、エマルション、又は懸濁液（例えば、生理食塩水、及び緩衝媒体）が挙げられる。本開示の組成物及び方法では、薬学的に許容され得る担体としては、０．０１～０．１Ｍ、例えば０．０５Ｍリン酸緩衝液又は０．８％生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。その他の一般的な非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとして、流体及び栄養補充物、電解質補充物（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）等が挙げられる。保存剤及び他の添加剤（例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等）も存在し得る。より詳細には、注射用に好適な医薬組成物としては、無菌の水性溶液（水溶性）又は分散液、及び無菌の注射液又は分散液の即時使用調製物のための無菌の粉末が挙げられる。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易に注射し得る程度に流動性である必要がある。これは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、典型的には、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びその好適な混合物を含有する、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材の使用によって、分散液の場合は要求される粒子径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【0269】
多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムが組成物に含まれる。吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによって、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。
【0270】
いずれの場合でも、滅菌注射液を、活性化合物（例えば、本開示の結合タンパク質）を、必要に応じて、本明細書に列挙した成分の１つ又は組み合わせを含む適切な溶媒中に必要な量で組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合は、例示的な調製方法は、活性成分と予め濾過滅菌しておいた溶液からの任意の所望の追加成分との粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥を含む。注射のための調製物を、処理して、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ、又はバイアル等の容器に充填し、当技術分野で公知の方法に従って無菌条件下で密封する。また、キットの形態で包装して販売してもよい。そのような製造品は、典型的には、関連する組成物が自己免疫障害又は新生物障害に罹患しているか、又はその素因がある対象を治療するのに有用であることを示すラベル又は添付文書を有する。
【0271】
上記の病態の治療のための本開示の組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者
の生理的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の医薬品、及び治療が予防的であるか又は治療的であるかを含む、多くの異なる因子によって異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。安全性及び有効性を最適化するために、当業者に公知である慣行的な方法を使用して、治療投薬量を調節してもよい。
の生理的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の医薬品、及び治療が予防的であるか又は治療的であるかを含む、多くの異なる因子によって異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。安全性及び有効性を最適化するために、当業者に公知である慣行的な方法を使用して、治療投薬量を調節してもよい。
【0272】
本開示による医薬組成物は、生理的食塩水、非毒性緩衝液、保存剤等の薬学的に許容され得る非毒性無菌担体を含むことができる。本出願の目的のために、結合タンパク質の薬学的有効量は、抗原への有効な結合を達成し、利益を達成する、例えば、疾患若しくは障害の症状を改善するため、又は物質若しくは細胞を検出するために十分な量を意味するように保持されるものとする。腫瘍細胞の場合、ポリペプチドは、新生物細胞又は免疫反応性細胞上の選択された抗原と相互作用し、それらの細胞の死を増加させることができる。当然のことながら、本開示の医薬組成物は、薬学的有効量の修飾結合ポリペプチドを提供するために単回又は複数回用量で投与され得る。
【0273】
本開示の範囲に従って、本開示の結合タンパク質は、治療効果又は予防効果をもたらすのに十分な量で、上述の治療方法に従ってヒト又は他の動物に投与され得る。本開示の結合タンパク質を、公知の技術に従って、本開示の抗体を従来の薬学的に許容され得る担体又は希釈剤と組み合わせることによって調製された従来の剤形で、そのようなヒト又は他の動物に投与することができる。薬学的に許容され得る担体又は希釈剤の形態及び特徴は、それと組み合わせる活性成分の量、投与経路及び他の周知の可変因子によって決定されることが当業者によって認識されるであろう。当業者は、本開示に記載される結合ポリペプチドの１つ以上の種を含むカクテルが特に有効であることが判明し得ることを更に理解するであろう。
【0274】
論文、特許、及び特許出願、並びに本明細書で言及又は引用される他の全ての文書及び電子的に利用可能な情報の内容は、あたかも各個々の刊行物が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、そのような物品、特許、特許出願、又は他の物理的及び電子的文書からのありとあらゆる材料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保する。
【0275】
本開示をその特定の実施形態を参照して説明してきたが、本開示の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われてもよく、同等物を置き換える得ることが当業者によって理解されるべきである。本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、適切な同等物を使用して、本明細書に記載される方法の他の適切な修正及び適合を行い得ることは、当業者には容易に明らかであろう。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスス工程又は工程を本開示の目的、趣旨及び範囲に適合させるために、多くの修正を行ってもよい。そのような修正はいずれも、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。ここで特定の実施形態を詳細に説明したが、これは、例示のみを目的として含まれ、限定することを意図するものではない以下の実施例を参照することによってより明確に理解されるであろう。
【実施例0276】
本開示は、更なる限定として解釈されるべきではない以下の例によって更に説明される。
【0277】
実施例１：ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥ結合タンパク質の設計
序論
今日まで、抗腫瘍療法はエフェクターＴ細胞の操作に焦点を当ててきた。Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットは臨床開発中であるが、潜在的な毒性のためにそれらの使用は血液
疾患に限定されている。対照的に、ＮＫＣＥを介した癌におけるＮＫ細胞の操作は、エフェクターＴ細胞と比較した場合、ＮＫ細胞の抗腫瘍エフェクター潜在性のために治療的代替法であるが、好ましい毒性プロファイルである。図１Ａは、腫瘍細胞の表面の抗原に対する一方のアーム及びＮＫ細胞上のＮＫｐ４６受容体に対する他方のアームと結合するＮＫｐ４６ ＮＫＣＥを図式化している。
序論
今日まで、抗腫瘍療法はエフェクターＴ細胞の操作に焦点を当ててきた。Ｔ細胞エンゲージャーフォーマットは臨床開発中であるが、潜在的な毒性のためにそれらの使用は血液
疾患に限定されている。対照的に、ＮＫＣＥを介した癌におけるＮＫ細胞の操作は、エフェクターＴ細胞と比較した場合、ＮＫ細胞の抗腫瘍エフェクター潜在性のために治療的代替法であるが、好ましい毒性プロファイルである。図１Ａは、腫瘍細胞の表面の抗原に対する一方のアーム及びＮＫ細胞上のＮＫｐ４６受容体に対する他方のアームと結合するＮＫｐ４６ ＮＫＣＥを図式化している。
【0278】
図１Ｂに示されるようなユニークなＦｃフォーマット（すなわち、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿ＣＯＤＶ－ＯＬ１＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ）で操作されたＮＫｐ４６ ＮＫＣＥは、腫瘍細胞の表面でＢＣＭＡと係合し、同時にＮＫｐ４６及びＦｃγ受容体、ＣＤ１６ａの両方とエンゲージする。ＡＤＣＣ活性は、その新規な強化型Ｆｃコンピテントフォーマットで誘導される。新規な強化型Ｆｃコンピテントフォーマット（以下「ＣＯＤＶ－ＯＬ１－ＡＤＥ－ＤＳＢ」と呼ぶ）は、以下を含む：（１）ＡＤＣＣ活性を増強するためのＣＨ２におけるＡＤＥ変異（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）；（２）熱安定化のためのＣＨ２中のＤＳＢ（Ｒ２９２Ｃ／Ｖ３０２Ｃ）；（３）Ｆｃ－（３ａ）ノブ（ＶＨ／ＶＬドメインを含有する重鎖）におけるヘテロ二量体形成を促進するためのＣＨ３のノブ－イントゥ－ホール変異（ＫＩＨ）：Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ及び（３ｂ）ホール（ＶＨ／ＶＬドメインを欠く重鎖）：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ；並びに（４）Ｆｃ中のヘテロ二量体の精製を促進するための１つのＣＨ３中のＲＦ変異異（Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ）。このＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥ＿Ｆｃ ＣＯＤＶ－ＯＬ１－ＡＤＥ－ＤＳＢは、軽鎖に２つのリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含み、１つは、ＶＬ抗ＢＣＭＡとＶＬ抗ＮＫｐ４６との間であり、ＶＬ ＮＫｐ４６とＣＬとの間である。
【0279】
材料及び方法－ヒト組換えタンパク質、クローニング、生産、精製
組換えヒトＮＫｐ４６－クローニング、産生、及び精製
ヒトＮＫｐ４６（Ｇｌｎ２２－Ａｓｎ２５５、ＮＣＢＩ参照：ＮＭ＿００４８２９．５）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードする配列を発現ベクターに挿入し、精製のためにＣ末端６×Ｈｉｓタグを付加した。以下のプライマーをヒトＰＢＭＣに対するＰＣＲに使用した：５’ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＧＣ３’（配列番号１０７）及び５’ＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＡＴＣＣＣ３’（配列番号１０８）。アンプリコンの配列を確認した。次いで、ベクターを使用してＣＨＯ細胞株をトランスフェクトし、タンパク質を産生するクローンを選択した。タンパク質をＮｉ－ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、＃１０１８２４４）で培養上清から精製し、Ｓ２００サイズ排除クロマトグラフィーを実施して凝集体の除去を確実にした後、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた結合速度論の下流の質問の特性評価を行った。
組換えヒトＮＫｐ４６－クローニング、産生、及び精製
ヒトＮＫｐ４６（Ｇｌｎ２２－Ａｓｎ２５５、ＮＣＢＩ参照：ＮＭ＿００４８２９．５）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードする配列を発現ベクターに挿入し、精製のためにＣ末端６×Ｈｉｓタグを付加した。以下のプライマーをヒトＰＢＭＣに対するＰＣＲに使用した：５’ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＧＣ３’（配列番号１０７）及び５’ＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＡＴＣＣＣ３’（配列番号１０８）。アンプリコンの配列を確認した。次いで、ベクターを使用してＣＨＯ細胞株をトランスフェクトし、タンパク質を産生するクローンを選択した。タンパク質をＮｉ－ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、＃１０１８２４４）で培養上清から精製し、Ｓ２００サイズ排除クロマトグラフィーを実施して凝集体の除去を確実にした後、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた結合速度論の下流の質問の特性評価を行った。
【0280】
カニクイザルＮＫｐ４６のＥＣＤをコードする配列（Ｐｒｏ２２－Ａｓｎ２５４、ＮＰ＿００１２７１５０９．１）を発現ベクターにクローニングし、精製のためにＣ末端Ｆｌａｇ－Ｍ２タグを付加した。カニクイザルＰＢＭＣから予想される配列を増幅するために使用したプライマーは以下の通りであった：５’ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣ３’（配列番号１０９）及び５’ＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣＣ３’（配列番号１１０）。配列検証後、ベクターを使用してＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞株をトランスフェクトし、産生細胞クローンを選択した。最初の３つのバッチをＭ２アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ビーズを、組換えタンパク質を含有する上清と共に一晩インキュベートした。次いで、ビーズをＰＢＳ１Ｘで洗浄し、溶出をＰＢＳ１Ｘ中１５０ｎｇ／μｌの溶出ペプチドで行った。次いで、タンパク質をＰＢＳ １倍に対して透析する。次のバッチを、製造者の説明書（ＧＥヘルスケア、＃２０３８１、バッチＱＢ２１３８１５）に従って、抗ＮＫｐ４６抗体をＡｍｉｎｏＬｉｎｋカップリング樹脂にカップリングさせることによるア
フィニティークロマトグラフィーによって精製した。次いで、ビーズを、組換えタンパク質を含有する上清と共に一晩インキュベートした。次いで、ビーズをＰＢＳ １倍で洗浄し、グリシン０．１Ｍ ｐＨ２．５を用いて溶出を行った。次いで、タンパク質をＴＢＳ緩衝液ｐＨ７．５に対して透析し、濃縮して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムで分取サイズ排除クロマトグラフィーを行う。
フィニティークロマトグラフィーによって精製した。次いで、ビーズを、組換えタンパク質を含有する上清と共に一晩インキュベートした。次いで、ビーズをＰＢＳ １倍で洗浄し、グリシン０．１Ｍ ｐＨ２．５を用いて溶出を行った。次いで、タンパク質をＴＢＳ緩衝液ｐＨ７．５に対して透析し、濃縮して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムで分取サイズ排除クロマトグラフィーを行う。
【0281】
組換えヒトＢＣＭＡ－クローニング、産生、及び精製
組換えヒトＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）の作製のために、ジフテリア毒素断片Ａ（ＤＴＡ）及びＨｉｓ６精製タグに融合したヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインをコードする合成ＨＥＫ２９３コドン最適化ＤＮＡ断片をＡｔｕｍ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）から注文した。次いで、合成ＤＮＡ断片を、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，）を使用してｐＴＴ５哺乳動物発現ベクターにクローニングして、哺乳動物細胞における異種発現のための組換えプラスミドを作製した。
組換えヒトＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）の作製のために、ジフテリア毒素断片Ａ（ＤＴＡ）及びＨｉｓ６精製タグに融合したヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインをコードする合成ＨＥＫ２９３コドン最適化ＤＮＡ断片をＡｔｕｍ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）から注文した。次いで、合成ＤＮＡ断片を、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，）を使用してｐＴＴ５哺乳動物発現ベクターにクローニングして、哺乳動物細胞における異種発現のための組換えプラスミドを作製した。
【0282】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、市販のプロトコルを使用してプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。細胞を６日間の成長後に回収し、馴化培地（ＣＭ）を遠心分離によって採取した。タンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。樹脂を、１０００×ｇで５分間回転させ、毎回新鮮なＰＢＳをデカント／添加することによって、ＰＢＳ ｐＨ７．２中で３回平衡化した。平衡樹脂をＣＭと共にローラーボトルに添加し、室温で１時間回転させた。２００ｍｌの馴化培地ごとに１ｍｌの樹脂を使用した。インキュベーション後、ＣＭ／樹脂スラリーを重力落下カラムに注ぎ、１０ＣＶのＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。ＰＢＳ中の１０ＣＶの６００ｍＭイミダゾールでタンパク質を溶出した。溶出液をＰＢＳ ｐＨ７．２に緩衝液交換し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。分取ＳＥＣは、ＰＢＳ中で実行されるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（１６／６０）カラム（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。最終試料をプールし、ＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍｌ超の最終濃度に濃縮した。
【0283】
ＣＯＤＶ－ＯＬ１分子－産生及び精製
対応するコンストラクトの異なる鎖をコードする発現プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａで増殖させた。トランスフェクションに使用したプラスミドを、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から調製した。
対応するコンストラクトの異なる鎖をコードする発現プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａで増殖させた。トランスフェクションに使用したプラスミドを、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から調製した。
【0284】
Ｆ１７無血清懸濁培養 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で成長するＨＥＫ ２９３－ＦＳ細胞を、ポリエチレンイミントランスフェクション試薬を使用して示されたプラスミドでトランスフェクトした。８％ＣＯ２で３７℃で６日間培養した後、遠心分離によって細胞を除去し、上清を０．２２μｍフィルタに通して粒子を除去した。
【0285】
タンパク質をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ）で捕捉し、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９で中和した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２６／６０（Ｃｙｔｉｖａ）及び０．２２μｍ濾過及びＵＶ２８０濃度決定を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってタンパク質を研磨した後、タンパク質を更なる特性評価に使用した。
【0286】
組換え対照試料
以下に列挙するヒト及びカニクイザルの組換えタンパク質を、以前に記載された通りに（ＬＧ Ｃｅｌｌ ２０１９）、Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａにおいて産生及び精製した：ヒトＮＫｐ４６（Ｇｌｎ２２－Ａｓｎ２５５、ＮＣＢＩ参照：ＮＭ＿００４８２９．５
）、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ５５８９９）、ヒトＣＤ１６ａ（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ Ｖ及びＦアイソフォーム、ＮＣＢＩ参照：ＡＡＨ３６７２３）、ヒトＣＤ３２ａ（ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＮＣＢＩ参照：ＡＡＨ２０８２３）、ヒトＣＤ３２ｂ（ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００３９９２）、ヒトＣＤ１６ｂ（ヒトＦｃｇＲＩＩＩＢ、ＮＣＢＩ参照：ＡＡＩ２８５６３）、ヒトＣＤ６４（ヒトＦｃγＲＩ、ＮＣＢＩ参照：Ｐ１２３１４）、カニクイザルＮＫｐ４６（Ｇｌｎ１７－Ａｓｎ２５４、ＮＰ＿００１２７１５０９．１）、カニクイザルＦｃＲｎ（ＮＣＢＩ参照：Ｑ８ＳＰＶ９）、カニクイザルＣＤ１６（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１２７０１２１．１）、カニクイザルＣＤ３２ａ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１２７０５９８．１）、カニクイザルＣＤ３２ｂ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１２７１０６０．１）及びカニクイザルＣＤ６４（ＮＣＢＩ参照：ＡＡＬ９２０９５．１）。組換えヒトＢＣＭＡを、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
以下に列挙するヒト及びカニクイザルの組換えタンパク質を、以前に記載された通りに（ＬＧ Ｃｅｌｌ ２０１９）、Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａにおいて産生及び精製した：ヒトＮＫｐ４６（Ｇｌｎ２２－Ａｓｎ２５５、ＮＣＢＩ参照：ＮＭ＿００４８２９．５
）、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ５５８９９）、ヒトＣＤ１６ａ（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ Ｖ及びＦアイソフォーム、ＮＣＢＩ参照：ＡＡＨ３６７２３）、ヒトＣＤ３２ａ（ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＮＣＢＩ参照：ＡＡＨ２０８２３）、ヒトＣＤ３２ｂ（ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００３９９２）、ヒトＣＤ１６ｂ（ヒトＦｃｇＲＩＩＩＢ、ＮＣＢＩ参照：ＡＡＩ２８５６３）、ヒトＣＤ６４（ヒトＦｃγＲＩ、ＮＣＢＩ参照：Ｐ１２３１４）、カニクイザルＮＫｐ４６（Ｇｌｎ１７－Ａｓｎ２５４、ＮＰ＿００１２７１５０９．１）、カニクイザルＦｃＲｎ（ＮＣＢＩ参照：Ｑ８ＳＰＶ９）、カニクイザルＣＤ１６（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１２７０１２１．１）、カニクイザルＣＤ３２ａ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１２７０５９８．１）、カニクイザルＣＤ３２ｂ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１２７１０６０．１）及びカニクイザルＣＤ６４（ＮＣＢＩ参照：ＡＡＬ９２０９５．１）。組換えヒトＢＣＭＡを、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【0287】
【表1】
【0288】
実施例２：骨髄性骨髄腫細胞株のパネル上のＢＣＭＡ受容体密度の決定
序論
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）発現は、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者における悪性形質細胞の同定のためのマーカーとして提案されている。ほぼ全てのＭＭ腫瘍細胞がＢＣＭＡを発現するが、正常な組織発現は形質細胞及び成熟Ｂ細胞のサブセットに限定される。Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（５）：５８５－６０１．細胞あたりのＢＣＭＡ分子の数を決定するために、フローサイトメトリーに基づくＢＣＭＡ受容体アッセイを使用して、ＢＣＭＡ表面発現を定量し、続いて、ＢＣＭＡ抗体の下流分析に適した選択肢となるＭＭ細胞株を選択した。
序論
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）発現は、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者における悪性形質細胞の同定のためのマーカーとして提案されている。ほぼ全てのＭＭ腫瘍細胞がＢＣＭＡを発現するが、正常な組織発現は形質細胞及び成熟Ｂ細胞のサブセットに限定される。Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（５）：５８５－６０１．細胞あたりのＢＣＭＡ分子の数を決定するために、フローサイトメトリーに基づくＢＣＭＡ受容体アッセイを使用して、ＢＣＭＡ表面発現を定量し、続いて、ＢＣＭＡ抗体の下流分析に適した選択肢となるＭＭ細胞株を選択した。
【0289】
この研究で使用したＭＭ細胞株のリストを以下の表２に示す。
【0290】
【表2】
【0291】
材料及び方法－フローサイトメトリーによってＭＭ細胞株表面上のＢＣＭＡ発現に対する抗原結合能を決定するための分析手順。
実験セットアップ
ＢＣＭＡ密度測定のために、ＣＥＬＬＱＵＡＮＴ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、参照：７２０８）を使用した。最初に、２００，０００個のＭＭ細胞（全ての試験した細胞株について以下のリストを参照）を、１００ｍＬの試薬１中の９６ウェル丸底プレート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、参照９２０９７）に、１倍（蒸留水中で１／１０に希釈）＋１０ｍＬのＦｃＲブロッキング試薬、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、参照１３０－０５９－９０１）に、４℃で１５分間播種した。
実験セットアップ
ＢＣＭＡ密度測定のために、ＣＥＬＬＱＵＡＮＴ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、参照：７２０８）を使用した。最初に、２００，０００個のＭＭ細胞（全ての試験した細胞株について以下のリストを参照）を、１００ｍＬの試薬１中の９６ウェル丸底プレート（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、参照９２０９７）に、１倍（蒸留水中で１／１０に希釈）＋１０ｍＬのＦｃＲブロッキング試薬、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、参照１３０－０５９－９０１）に、４℃で１５分間播種した。
【0292】
次いで、上清を除去する前に、ＭＭ細胞を３００ｇで５分間スピンダウンした。１０ｍｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体５０ｍＬを添加した後、４℃で３０分間インキュベートした（ＢＤ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン１９Ｆ２ ｒｅｆ ３５７５０２、０．５ｍｇ／ｍＬのストック濃度、５ｍＬの抗ＢＣＭＡを２４５ｍＬの試薬１と１倍で混合することによる１／５０の希釈）。
【0293】
対照アイソタイプの場合、５０ｍＬの精製マウスＩｇＧ２ａカッパアイソタイプ対照１０ｍｇ／ｍＬを代わりに添加した後、４℃で３０分間インキュベートした（ＢＤ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、参照番号４００２０１、ストック濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬのＩｇＧ２ａを２４５ｍＬの試薬１と１倍で混合することによる１／５０の希釈）。
【0294】
ウェルに２００ｍＬの試薬１を１倍で添加し、続いて４℃で１分間、２０００ｒｐｍで遠心分離することによって、２回の連続洗浄工程を実施した。上清を除去した後、細胞を事前に１倍の試薬１で１／１０に希釈した５０ｍＬの抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ二次抗体（１５ｍＬ使用の場合、Ｂｉｏｃｙｔｅｘキットの試薬３、参照番号７２０８、１．５ｍＬ試薬３＋１３．５ｍＬ試薬１）に再懸濁した。較正ビーズを含む５０ｍＬを較正専用のウェル（Ｂｉｏｃｙｔｅｘキットの試薬２）に添加し、５ｍＬの試薬３を細胞と同じ染色
条件になるように較正ウェル（希釈せず）に最後に添加した。次いで、９６ウェルプレートを４℃で２０分間インキュベートし、光から保護した。
条件になるように較正ウェル（希釈せず）に最後に添加した。次いで、９６ウェルプレートを４℃で２０分間インキュベートし、光から保護した。
【0295】
ウェルに２００ｍＬの試薬１を１倍で添加し、続いて４℃で１分間、２０００ｒｐｍで遠心分離することによって、３回の連続洗浄工程を実施した。上清を除去した後、細胞を１００ｍＬの冷ＰＢＳに再懸濁した後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０又はＭＡＣＳＱｕａｎｔ ＶＹＢ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ）で読み取った。
【0296】
取得を、ＦＩＴＣ染色のためのＢ１チャネル及びＤＡＰＩ染色のためのＶ１チャネル（細胞生存マーカー）で行う。
【0297】
ＢＣＭＡ密度の算出
ＦＩＴＣ蛍光に基づいてＭＭ細胞株上のＢＣＭＡ密度を決定するために、較正ビーズ情報を使用して、以下の表３に示すような線形較正曲線を作成した。
ＦＩＴＣ蛍光に基づいてＭＭ細胞株上のＢＣＭＡ密度を決定するために、較正ビーズ情報を使用して、以下の表３に示すような線形較正曲線を作成した。
【0298】
【表3】
【0299】
分析のため、細胞あたりのＢＣＭＡ密度を以下の式を使用して計算した。
ＢＣＭＡ密度＝１０（ｌｏｇ（ＦＩＴＣ ＢＣＭＡ）×ａ＋ｂ）－１０（ｌｏｇ（ＦＩＴＣアイソタイプ）×ａ＋ｂ）
ＢＣＭＡ密度＝１０（ｌｏｇ（ＦＩＴＣ ＢＣＭＡ）×ａ＋ｂ）－１０（ｌｏｇ（ＦＩＴＣアイソタイプ）×ａ＋ｂ）
【0300】
結果
ＭＭ細胞株のパネルでの細胞あたりのＢＣＭＡ密度の計算は、パネルで使用される他のＭＭ細胞株と比較して、ＥＪＭ細胞株が最も高いレベルのＢＣＭＡ密度を有し、ＭＭ１Ｓ細胞株が細胞表面で最も低いレベルのＢＣＭＡ密度を有することを明らかにした。図２は、１細胞あたりのＢＣＭＡ密度の高い順にＭＭ細胞株のランキングを示す。これらの結果に基づいて、ＭＭ細胞に対するＢＣＭＡに対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ結合親和性及び細胞溶解活性を調べる下流の研究に使用するために、細胞株を選択した。特に、ＲＰＭＩ ８２２６は、約２０００部位／細胞のＢＣＭＡ密度を有し、これは多発性骨髄腫細胞における平均に近い。ＭＭ１Ｓは、約８００部位／細胞のＢＣＭＡ密度を有し、これは、健康な形質細胞におけるＢＣＭＡ発現のレベルにほぼ対応する。ＭＭ１Ｒは、約５５００部位／細胞のＢＣＭＡ密度を有し、本開示の結合タンパク質の効率を高発現レベルで決定するのに有用である。
ＭＭ細胞株のパネルでの細胞あたりのＢＣＭＡ密度の計算は、パネルで使用される他のＭＭ細胞株と比較して、ＥＪＭ細胞株が最も高いレベルのＢＣＭＡ密度を有し、ＭＭ１Ｓ細胞株が細胞表面で最も低いレベルのＢＣＭＡ密度を有することを明らかにした。図２は、１細胞あたりのＢＣＭＡ密度の高い順にＭＭ細胞株のランキングを示す。これらの結果に基づいて、ＭＭ細胞に対するＢＣＭＡに対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ結合親和性及び細胞溶解活性を調べる下流の研究に使用するために、細胞株を選択した。特に、ＲＰＭＩ ８２２６は、約２０００部位／細胞のＢＣＭＡ密度を有し、これは多発性骨髄腫細胞における平均に近い。ＭＭ１Ｓは、約８００部位／細胞のＢＣＭＡ密度を有し、これは、健康な形質細胞におけるＢＣＭＡ発現のレベルにほぼ対応する。ＭＭ１Ｒは、約５５００部位／細胞のＢＣＭＡ密度を有し、本開示の結合タンパク質の効率を高発現レベルで決定するのに有用である。
【0301】
実施例３：ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃフォーマット変異体の結合特性評価
序論
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥをＲＰＭＩ細胞に対して滴定して、ＭＭ腫瘍細胞並びにドナーＮＫ細胞への結合についてのＫＤ値を決定した。その後、ＦｃＲｎ並びにＣＤ１６ａ受容体の２つの変異体に対する親和性を確認するために、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－ＮＫＣＥの異なるＦｃフォーマット変異体をＳＰＲによって試験した。
序論
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥをＲＰＭＩ細胞に対して滴定して、ＭＭ腫瘍細胞並びにドナーＮＫ細胞への結合についてのＫＤ値を決定した。その後、ＦｃＲｎ並びにＣＤ１６ａ受容体の２つの変異体に対する親和性を確認するために、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－ＮＫＣＥの異なるＦｃフォーマット変異体をＳＰＲによって試験した。
【0302】
材料及び方法
細胞
ＲＰＭＩ ８２２６多発性骨髄腫細胞株を、ＡＴＣＣで購入した。細胞を完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１×非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ－１６４０）中で培養した。
細胞
ＲＰＭＩ ８２２６多発性骨髄腫細胞株を、ＡＴＣＣで購入した。細胞を完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１×非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ－１６４０）中で培養した。
【0303】
滴定アッセイ
休止期ＮＫ細胞及びＲＰＭＩ ８２２６細胞（１．１０５細胞／ウェル）を、それぞれ２２５μｇ／ｍＬ及び５００μｇ／ｍＬから始まる非コンジュゲート化分子の１／１０段階希釈範囲を有するＵ底９６ウェルプレートで１時間染色した。二次抗体による染色を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ １０９－１１６－１７０）を用いて行った。染色後、細胞をＢＤ Ｃｅｌｌｆｉｘに再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。パラメータを記録し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。染色ＥＣ５０値を、４パラメータロジスティクス非線形回帰モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄプリズムを用いて計算した。
休止期ＮＫ細胞及びＲＰＭＩ ８２２６細胞（１．１０５細胞／ウェル）を、それぞれ２２５μｇ／ｍＬ及び５００μｇ／ｍＬから始まる非コンジュゲート化分子の１／１０段階希釈範囲を有するＵ底９６ウェルプレートで１時間染色した。二次抗体による染色を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ １０９－１１６－１７０）を用いて行った。染色後、細胞をＢＤ Ｃｅｌｌｆｉｘに再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。パラメータを記録し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。染色ＥＣ５０値を、４パラメータロジスティクス非線形回帰モデルを使用してＧｒａｐｈＰａｄプリズムを用いて計算した。
【0304】
ＳＰＲ結合実験－ＣＤ１６ａ
ＣＤ１６ａによる結合親和性測定のために、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログ番号ＢＲ１００６－６９）を、１００ｍＬの１０×ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を９００ｍＬの精製水と混合することによって調製した。
ＣＤ１６ａによる結合親和性測定のために、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログ番号ＢＲ１００６－６９）を、１００ｍＬの１０×ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を９００ｍＬの精製水と混合することによって調製した。
【0305】
ヒトＣＤ１６ａタンパク質の親和性捕捉を、Ｈｉｓ捕捉キット（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログ番号２８９９５０５６）を使用して達成した。抗Ｈｉｓ捕捉抗体をランニング緩衝液で１：２０に希釈し、標準アミンカップリングを使用してＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログ番号２９１４９６０３）にカップリングさせ、アミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログ番号ＢＲ－１００－５０）を使用しておよそ８０００の応答単位（ＲＵ）を得た。
【0306】
ＨＢＳ－ＥＰ＋アッセイ緩衝液中の二重特異性抗体の１０段階１：１希釈液を、５．８ｎｍｏｌ／Ｌ、１１．７ｎｍｏｌ／Ｌ、２３．４ｎｍｏｌ／Ｌ、４６．８ｎｍｏｌ／Ｌ、９３．７５ｎｍｏｌ／Ｌ、１８７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、３７５ｎｍｏｌ／Ｌ、７５０ｎｍｏｌ／Ｌ、１５００ｎｍｏｌ／Ｌ及び３０００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度に調製した。ＣＤ１６ａ（Ｖ／Ｆ）タンパク質をＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液で０．１ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈し、この濃度で実験に使用した。ＣＤ１６ａ（Ｖ１７６）及びＣＤ１６ａ（Ｖ１７６Ｆ）をそれぞれフローセル２及び４上で１０μＬ／分の流速で３０秒間捕捉して、およそ３０ＲＵの最大応答（Ｒｍａｘ）値を得た。
【0307】
測定を、多サイクル動力学実験で行った。各マルチサイクル実験において、ＣＤ１６ａを、シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（ヒト抗体捕捉キット、Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログ番号ＢＲ１００８－３９）に固定化された抗Ｈｉｓ抗体を介して捕捉した。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液に希釈した二重特異性抗体を、５．８ｎｍｏｌ／Ｌ～３０００
ｎｍｏｌ／Ｌの１：１希釈系列で１２０秒間、３０μＬ／分の流速で注入し、続いて１２０秒間解離相を注入した。二重参照のために、全ての分析物濃度を複数の緩衝液ブランクと共に２連で実行した。捕捉表面の再生を、再生溶液（１０ｍｍｏｌ／ＬグリシンｐＨ１．５）の２回の連続注入を用いて３０μＬ／分で３０秒間行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ）を用いて、測定した抗体濃度に対するＳＰＲ応答の定常状態適合を用いて、ヒトＣＤ１６ａに対する二重特異性抗体の結合親和性（ＫＤ値）を評価した。
ｎｍｏｌ／Ｌの１：１希釈系列で１２０秒間、３０μＬ／分の流速で注入し、続いて１２０秒間解離相を注入した。二重参照のために、全ての分析物濃度を複数の緩衝液ブランクと共に２連で実行した。捕捉表面の再生を、再生溶液（１０ｍｍｏｌ／ＬグリシンｐＨ１．５）の２回の連続注入を用いて３０μＬ／分で３０秒間行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ）を用いて、測定した抗体濃度に対するＳＰＲ応答の定常状態適合を用いて、ヒトＣＤ１６ａに対する二重特異性抗体の結合親和性（ＫＤ値）を評価した。
【0308】
ＳＰＲ結合実験－ｈｕＮＫｐ ４６及びＢＣＭＡ
ｈｕＮＫｐ４６及びＢＣＭＡによる結合親和性測定のために、ヒトＮＫｐ４６（濃度範囲５０ｎＭ～０．１ｎＭ）、カニクイザルＮＫｐ４６（濃度範囲５０ｎＭ～０．１ｎＭ）、ヒトＢＣＭＡ（濃度範囲５０ｎＭ～０．１ｎＭ）及びカニクイザルＢＣＭＡ（ＰＰＢ－１７９９０；５０ｎＭ～０．１ｎＭの濃度範囲）の連続二倍希釈物をＨＢＳ－ＥＰ＋アッセイ緩衝液中で調製した。
ｈｕＮＫｐ４６及びＢＣＭＡによる結合親和性測定のために、ヒトＮＫｐ４６（濃度範囲５０ｎＭ～０．１ｎＭ）、カニクイザルＮＫｐ４６（濃度範囲５０ｎＭ～０．１ｎＭ）、ヒトＢＣＭＡ（濃度範囲５０ｎＭ～０．１ｎＭ）及びカニクイザルＢＣＭＡ（ＰＰＢ－１７９９０；５０ｎＭ～０．１ｎＭの濃度範囲）の連続二倍希釈物をＨＢＳ－ＥＰ＋アッセイ緩衝液中で調製した。
【0309】
ｍＡｂ試料（ＦＦ－２０－１３１９－１、ＦＦ－２０－１３２０－１、ＦＦ－２０－１６３４－１、ＦＦ－２０－１６３５－１、ＥＦＦ－２０－１０６－１、ＥＦＦ－２０－１０７－１）の親和性捕捉を、ヒト抗体捕捉キット（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログ番号ＢＲ１００８－３９）を製造者の説明書に従って使用して達成した。抗Ｆｃ捕捉抗体をランニング緩衝液で１：２０に希釈し、標準アミンカップリングを使用してＣＭ５チップ（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログ番号２９１４９６０３）にカップリングさせ、アミンカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログ番号ＢＲ－１００－５０）を使用しておよそ８０００の応答単位（ＲＵ）を得た。
【0310】
抗体をＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液で０．１～０．４μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、この濃度で実験に使用した。抗体を１０μＬ／分の流速で１２０秒間捕捉して、およそ３０ＲＵの最大応答（Ｒｍａｘ）値を得た。
【0311】
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置を使用して、各抗体の多サイクル動態実験で測定を行った。各マルチサイクル実験において、抗体を、シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（ヒト抗体捕捉キット、Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、カタログ番号ＢＲ１００８－３９）に固定化された抗ｈｕｍ Ｆｃ抗体を介して捕捉した。
【0312】
上記のように希釈した抗原（濃度範囲０．１ｎＭ～５０ｎＭ）を、６０μＬ／分の流速で２４０秒間注入し、続いて４００秒間の解離相を注入した。二重参照のために、全ての分析物濃度を複数の緩衝液ブランクと共に２連で実行した。捕捉面の再生を、再生液（３ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２）を用いて３０μＬ／分で６０秒行った。物質移行制限を伴う１：１結合モデルを使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアバージョン１．１．１．７４４２を用いて結合速度論データを評価した。
【0313】
結果
ＲＰＭＩ細胞及びドナーＮＫ細胞上のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの滴定は、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、ＡＤＣＣを増強したＦｃフォーマットのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡが依然としてＮＫｐ４６及びＢＣＭＡ標的に対する親和性を保持していることを実証した。
ＲＰＭＩ細胞及びドナーＮＫ細胞上のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの滴定は、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、ＡＤＣＣを増強したＦｃフォーマットのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡが依然としてＮＫｐ４６及びＢＣＭＡ標的に対する親和性を保持していることを実証した。
【0314】
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－ＮＫＣＥの１２の異なるＦｃフォーマットのより大きなパネルでのＳＰＲ結合分析により、図４及び図５にそれぞれ示すように、ＣＤ１６ａ及びＦｃＲｎに対する親和性が確認された。特に、全てのＡＤＣＣ増強分子は、図４に示すように、ＣＤ１６（Ｖ１７６）及び（Ｆ１７６）変異体に対する結合の増加を実証した。
【0315】
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥについて、ＮＫｐ４６（ヒト及びカニクイザル）、ＢＣＭＡ（ヒト及びカニクイザル）、及びＦｃγＲに対する結合速度も計算し、結果を以下の表４、５、及び６に示す。
【0316】
【表4】
【0317】
【表5】
【0318】
【表6】
【0319】
実施例４：Ｆｃ操作ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥは増強されたインビトロ細胞細胞傷害活性を実証する
序論
増強されたＡＤＣＣ（Ｆｃ－ＤＥ、Ｆｃ－ＤＥ－ＤＳＢ、Ｆｃ－ＡＤＥ、Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ）又は増強されていないＡＤＣＣ（ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ）のいずれかを有する、異なるＦｃフォーマットで操作されたＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥを、ＮＫドナー細胞の存在下でＭＭ腫瘍細胞の溶解を促進する能力について、並びに潜在的なオフターゲットＮＫ細胞毒性の評価について評価した。さらに、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥを抗ＢＣＭＡ抗体対照と比較して、それらのＭＭ腫瘍死滅能を評価した。
序論
増強されたＡＤＣＣ（Ｆｃ－ＤＥ、Ｆｃ－ＤＥ－ＤＳＢ、Ｆｃ－ＡＤＥ、Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ）又は増強されていないＡＤＣＣ（ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ）のいずれかを有する、異なるＦｃフォーマットで操作されたＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥを、ＮＫドナー細胞の存在下でＭＭ腫瘍細胞の溶解を促進する能力について、並びに潜在的なオフターゲットＮＫ細胞毒性の評価について評価した。さらに、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥを抗ＢＣＭＡ抗体対照と比較して、それらのＭＭ腫瘍死滅能を評価した。
【0320】
材料及び方法
細胞
ヒトＮＫ細胞．健康なヒトのバフィーコートはＥｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ＥＦＳ、フランスの血液サービス、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ；ＡＣ－２０１９－３４２８）によって提供された。末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によってバフィーコートから単離した。ヒトＮＫ細胞を、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃのビーズベースの陰性選択キットを用いてＰＢＭＣから精製した。
ＭＭ細胞株．ＲＰＭＩ ８２２６及びＭＭ１．Ｓ多発性骨髄腫細胞株を、ＡＴＣＣで購入した。細胞を完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１×非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ－１６４０）中で培養した。
細胞
ヒトＮＫ細胞．健康なヒトのバフィーコートはＥｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ＥＦＳ、フランスの血液サービス、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ；ＡＣ－２０１９－３４２８）によって提供された。末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によってバフィーコートから単離した。ヒトＮＫ細胞を、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又はＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃのビーズベースの陰性選択キットを用いてＰＢＭＣから精製した。
ＭＭ細胞株．ＲＰＭＩ ８２２６及びＭＭ１．Ｓ多発性骨髄腫細胞株を、ＡＴＣＣで購入した。細胞を完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１×非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ－１６４０）中で培養した。
【0321】
ＮＫ細胞に基づく細胞傷害性アッセイ
ＭＭ細胞株に対して行われる細胞傷害性アッセイのために、標的細胞にＣｒ－５１を交互に負荷した。実験に応じて５、１０又は１５μｇ／ｍＬから始めて、試験項目及び対照項目について１／１０段階希釈範囲を実施した。試験した分子、標識された標的細胞（約３，０００個の細胞）及び健常ドナー（新鮮又は一晩放置）由来のヒトＮＫ細胞（約３０，０００個の細胞）を、丸底９６ウェルプレートの各ウェルに連続的に添加して、１０：１（Ｅ：Ｔ）の比を得た。４時間の共インキュベーション後、上清をＬｕｍａｐｌａｔｅ（Ｃｒ－５１用）に移した。Ｃｒ－５１に基づく細胞傷害性アッセイでは、死んだ標的細胞から放出されたＣｒ－５１をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ及びＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）で測定した。各ウェルについて６０秒間のγ放出をカウントすることによって、放射能を測定した。結果を、ｃｐｍ＝毎分のカウントで表す。特異的溶解パーセントを、以下の式を用いて計算した：
特異的溶解（％）＝（ＥＲ（ｃｐｍ）－ＳＲ（ｃｐｍ））／（ＭＲ（ｃｐｍ）－ＳＲ（ｃｐｍ））×１００
式中、ＥＲ＝実験的放出、ＳＲ＝自発的放出及びＭＲ＝最大放出である。
ＭＭ細胞株に対して行われる細胞傷害性アッセイのために、標的細胞にＣｒ－５１を交互に負荷した。実験に応じて５、１０又は１５μｇ／ｍＬから始めて、試験項目及び対照項目について１／１０段階希釈範囲を実施した。試験した分子、標識された標的細胞（約３，０００個の細胞）及び健常ドナー（新鮮又は一晩放置）由来のヒトＮＫ細胞（約３０，０００個の細胞）を、丸底９６ウェルプレートの各ウェルに連続的に添加して、１０：１（Ｅ：Ｔ）の比を得た。４時間の共インキュベーション後、上清をＬｕｍａｐｌａｔｅ（Ｃｒ－５１用）に移した。Ｃｒ－５１に基づく細胞傷害性アッセイでは、死んだ標的細胞から放出されたＣｒ－５１をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ及びＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）で測定した。各ウェルについて６０秒間のγ放出をカウントすることによって、放射能を測定した。結果を、ｃｐｍ＝毎分のカウントで表す。特異的溶解パーセントを、以下の式を用いて計算した：
特異的溶解（％）＝（ＥＲ（ｃｐｍ）－ＳＲ（ｃｐｍ））／（ＭＲ（ｃｐｍ）－ＳＲ（ｃｐｍ））×１００
式中、ＥＲ＝実験的放出、ＳＲ＝自発的放出及びＭＲ＝最大放出である。
【0322】
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて適切な非線形回帰曲線（「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４つのパラメータ）」モデルの選択）を描くことによって、各分子についてＥＣ５０を決定した。
【0323】
結果
図６に示すように、ＡＤＣＣを増強したＦｃフォーマット（Ｆｃ－ＤＥ、Ｆｃ－ＤＥ－ＤＳＢ、Ｆｃ－ＡＤＥ、Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ）において操作されたＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥは、非増強ＡＤＣＣフォーマットＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃよりも効果的にＮＫ細胞媒介性ＭＭ腫瘍細胞傷害活性を促進した。細胞傷害活性は、分子を安定化するＤＳＢの導入によって損なわれなかった。図７及び図８に示すように、ＮＫ細胞エフェクターの存在下でのＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆｃ－ＡＤＥ及びＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃの両方がＭＭ腫瘍細胞死を、ＩｇＧ１フォーマットの抗ＢＣＭＡ抗体（ＢＣＭＡ＿ＩｇＧ１）又は脱フコシル化ＩｇＧ１フォーマットの抗ＢＣＭＡ抗体（参照－１）と同様のレベルまで、又は優れた細胞傷害活性で媒介した。
図６に示すように、ＡＤＣＣを増強したＦｃフォーマット（Ｆｃ－ＤＥ、Ｆｃ－ＤＥ－ＤＳＢ、Ｆｃ－ＡＤＥ、Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ）において操作されたＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥは、非増強ＡＤＣＣフォーマットＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃよりも効果的にＮＫ細胞媒介性ＭＭ腫瘍細胞傷害活性を促進した。細胞傷害活性は、分子を安定化するＤＳＢの導入によって損なわれなかった。図７及び図８に示すように、ＮＫ細胞エフェクターの存在下でのＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆｃ－ＡＤＥ及びＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃの両方がＭＭ腫瘍細胞死を、ＩｇＧ１フォーマットの抗ＢＣＭＡ抗体（ＢＣＭＡ＿ＩｇＧ１）又は脱フコシル化ＩｇＧ１フォーマットの抗ＢＣＭＡ抗体（参照－１）と同様のレベルまで、又は優れた細胞傷害活性で媒介した。
【0324】
ＮＫｐ４６－ＩＣ＿Ｆｃ－ＡＤＥ及びＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃの両方が、ＮＫ細胞の存在下でＭＭ腫瘍細胞に対して優れた細胞傷害活性を有したが、フラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄａｌ）ＮＫ細胞死滅は観察されず、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥが潜在的な毒性オフターゲット効果を誘導しないことを示している（図９）。
ＭＭ患者の血清中の可溶性ＢＣＭＡの存在が記載されている。Ｈｉｐｐ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３１：１７４３－１７５１．ＭＭ細胞及びＮＫ細胞共培養物を用いた細胞傷害性アッセイにおいて漸増濃度で滴定した可溶性ＢＣＭＡは、可溶性ＢＣＭＡが、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの効力にわずかに影響したが、図１０に示すように、ＭＭ細胞溶解の最大レベルには影響しなかったことを実証している。
ＭＭ患者の血清中の可溶性ＢＣＭＡの存在が記載されている。Ｈｉｐｐ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３１：１７４３－１７５１．ＭＭ細胞及びＮＫ細胞共培養物を用いた細胞傷害性アッセイにおいて漸増濃度で滴定した可溶性ＢＣＭＡは、可溶性ＢＣＭＡが、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの効力にわずかに影響したが、図１０に示すように、ＭＭ細胞溶解の最大レベルには影響しなかったことを実証している。
【0325】
実施例５：指標としてカルセイン放出を使用するインビトロ細胞傷害性アッセイ
材料及び方法
全血試料：ＥＦＳ Ｉｌｅ ｄｅ ＦｒａｎｃｅとＳａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｅｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｐｅｍｅｎｔとの間で確立された合意Ｎ １２／ＥＦＳ／１３１に記載されている「ｔｅｒｍｓ ＆ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」に従って、ＥＦＳ Ｉｌｅ ｄｅ Ｆｒａｎｃｅから供給された健康なドナーの全血試料から新鮮なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。
材料及び方法
全血試料：ＥＦＳ Ｉｌｅ ｄｅ ＦｒａｎｃｅとＳａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｅｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｐｅｍｅｎｔとの間で確立された合意Ｎ １２／ＥＦＳ／１３１に記載されている「ｔｅｒｍｓ ＆ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」に従って、ＥＦＳ Ｉｌｅ ｄｅ Ｆｒａｎｃｅから供給された健康なドナーの全血試料から新鮮なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。
【0326】
全血からのヒトＰＢＭＣの単離：ヒトＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離によって健康なドナー（ＨＤ）の全血から単離した。
【0327】
全血を血液バッグから回収し、４０ｍＬの滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈した。１５ ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ Ｃｙｔｉｖａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、参照番号１７－１４４０－０２）を４本のｓｅｐＭａｔｅ－５０チューブの中央に分注した（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｒｅｆ＃８５４５０）。次いで、８０ｍＬの希釈血液を、Ｆｉｃｏｌｌ溶液（２０ｍｌ／チューブ）を含む各ｓｅｐＭａｔｅ－５０チューブの縁に穏やかに加えた。管を１２００ｇで２０分間、室温（ＲＴ）でブレーキなしで遠心分離した。４つのバフィーコート層を回収し、２つの５０ｍＬチューブに採取した。白血球溶液を、最終容量５０ｍＬまでの滅菌ＰＢＳで完成させた。２本の管を、ブレーキをかけながら室温で１０分間、４００ｇで２回（各遠心分離の間に、上清を捨て、５０ｍＬのＰＢＳを添加した）遠心分離した。最後の遠心分離後、ペレットを混合し、１０％ウシ胎児血
清（ＦＢＳ）及び２ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（完全培養培地）によって体積を１０ｍＬに完成させた。総生存ＰＢＭＣ数を、Ｖｉｃｅｌｌ ＸＲ計数（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞計数器）によって定義した。
清（ＦＢＳ）及び２ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（完全培養培地）によって体積を１０ｍＬに完成させた。総生存ＰＢＭＣ数を、Ｖｉｃｅｌｌ ＸＲ計数（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞計数器）によって定義した。
【0328】
ＮＫ細胞の採取：ヒトＮＫ細胞を、供給者の推奨に従ってＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから精製した。次いで、ＮＫ細胞を、活性化アッセイに使用する前に、＋３７℃、５％ＣＯ２で、５×１０６細胞／ｍＬの完全培地で一晩培養した（いわゆる「休止期」ＮＫ細胞）。１×１０６個の細胞を放置して、フローサイトメトリーによってそれらのＮＫｐ４６及びＣＤ１６の発現を評価した。
【0329】
細胞株：ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１５５）、ＭＭ．１Ｒ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２９７５）及びＭＭ．１Ｓ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２９７４）細胞は、多発性骨髄腫細胞株（形質細胞腫）である。それらは主に懸濁液中で成長するが、一部の細胞は接着性に成長し得る（場合によっては最大５０％）。維持のために、細胞を新鮮な完全培地に０．３×１０６細胞／ｍＬで３日間又は４日間再懸濁した。
【0330】
ストック溶液：各抗体のストック溶液をＰＢＳ中に４℃で保存した。アッセイの日に、産物をボルテックスして潜在的な凝集物を除去した後、カスケード希釈した。２００ｎＭ（２倍濃縮）～０．０２ｐＭ（１／１０段階希釈）の希釈範囲を完全培養培地で実施した。
【0331】
これらの連続希釈物のうち、細胞懸濁液（５０μｌのＢＣＭＡ＋ＲＰＭＩ８２２６標的細胞及び５０μｌのＮＫ）を含有する各ウェルに１００μＬを添加して、１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１ｎＭの最終濃度を得た。組合せ抗体（ＮＫｐ４６又はＣＤ１６に結合しない）の条件については、第１の濃度を４倍濃縮し、５０μｌのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－Ｆｃ ＡＤＥ－ＤＳＢを試験した他の抗体の同じ濃度に到達させた。
【0332】
細胞傷害性アッセイ：ＢＣＭＡ＋ＲＰＭＩ８２２６（又はＭＭ．１Ｒ又はＭＭ．１Ｓ）標的細胞をアッセイの当日に計数し、実験に必要な細胞の量を評価した（５０００細胞／ウェル）。１×１０６／ｍｌの濃度の標的細胞を、２５μｌのＤＭＳＯ中で予め再構成した１０μｌのカルセイン－ＡＭ（５０μｇ）を含有する４ｍｌの完全培地に再懸濁した。標識細胞を、５％ＣＯ２（二酸化炭素）の存在下、３７℃で３０分間インキュベートした。
【0333】
抗体連続希釈液を調製し、Ｕ底９６ウェルプレート（１００μｌ／ウェル）に添加した（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）超低接着多重９６ウェルプレート；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【0334】
標的細胞を５ｍｌの完全培地で３回洗浄した（毎回洗浄した後、３００ｇを５分間遠心分離し、上清を廃棄した）。プロベネシド（４倍濃縮）を含有する完全培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で最終洗浄を行った。標的細胞を計数し、５０００細胞／５０μｌ／ウェルで播種した。最後に、１０：１のＥ／Ｔ比のＮＫ細胞を標的細胞及び抗体の懸濁液に添加した。対照として、標的細胞単独及びＮＫを有するが抗体を含まない標的細胞を添加した。さらに、最大の標的細胞死に達するために、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘを考慮した。各条件を二連で実施した。培養プレートを５％ＣＯ２の存在下、３７℃で４時間インキュベートし、その最後に１００μｌの上清を採取し、黒色の９６ウェルマイクロプレートの平底Ｍｅｄ結合に移して、ＴＥＣＡＮ １０００Ｐｒｏマシンで死標的細胞からのカルセイン放出を評価した。
【0335】
データ分析：抗体の濃度をｍｇ／ｍｌからＭに変換するために、以下の式を使用した：濃度（ｍｇ／ｍｌ）／分子量（Ｄａ）＝モル濃度（Ｍ）
死滅分析のため、特異的溶解パーセントを以下の式を使用して計算した。
細胞傷害性％＝［（ＥＲ－ＳＲ）×１００／（ＭＲ－ＳＲ）］
ＥＲ＝実験的放出（標的細胞＋ＮＫ＋［抗体］）
ＳＲ＝自発的放出（標的細胞のみ）
ＭＲ＝最大放出（標的細胞＋２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）
死滅分析のため、特異的溶解パーセントを以下の式を使用して計算した。
細胞傷害性％＝［（ＥＲ－ＳＲ）×１００／（ＭＲ－ＳＲ）］
ＥＲ＝実験的放出（標的細胞＋ＮＫ＋［抗体］）
ＳＲ＝自発的放出（標的細胞のみ）
ＭＲ＝最大放出（標的細胞＋２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）
【0336】
統計分析：分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ９．１．２を用いて行った。溶解値の上限は、観察された最大溶解（重複値の平均）に対応していた。Ｒａｔｋｏｗｓｋｙ
ａｎｄ Ｒｅｅｄｙに従って、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値をｐＭで表し、４パラメータロジスティクス非線形回帰モデルを使用して計算した。
ａｎｄ Ｒｅｅｄｙに従って、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値をｐＭで表し、４パラメータロジスティクス非線形回帰モデルを使用して計算した。
【0337】
結果
ＮＫ細胞活性化を、ＮＫ細胞によるＲＰＭＩ ８２２６細胞の％特異的溶解及び以下のいずれかを測定することによって決定した：ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ、これはＮＫｐ４６及びＣＤ１６ａの両方と係合する；ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－Ｆｃインコンピテント－ＤＳＢ（ＮＫｐ４６のみに結合する分子）；Ｘ－ＢＣＭＡ－ＡＤＥ－ＤＳＢ（ＣＤ１６ａのみに結合する分子）；ＮＫｐ４６のみの結合剤とＣＤ１６ａのみの結合剤又はアイソタイプ対照抗体との組合せ（ＮＫ細胞上ではなく腫瘍細胞上のＢＣＭＡにのみ結合するＸ－ＢＣＭＡ－Ｆｃインコンピテント－ＤＳＢ、及び腫瘍細胞上ではなくＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及びＣＤ１６ａに結合するＮＫｐ４６－Ｘ－ＡＤＥ－ＤＳＢ）。他の４つの抗体と単一の標的化剤との組み合わせと比較して、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢで最適なＮＫ細胞活性化が起こり、（１）ＮＫｐ４６及びＣＤ１６ａの二重標的化が、単一の係合よりも高い腫瘍細胞死滅における効力及び有効性をもたらすこと、並びに（２）最適化された効力のためにＮＫｐ４６アーム及びＣＤ１６ａアームを同じ分子上に有することの重要性を示した（図１１）。
ＮＫ細胞活性化を、ＮＫ細胞によるＲＰＭＩ ８２２６細胞の％特異的溶解及び以下のいずれかを測定することによって決定した：ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ、これはＮＫｐ４６及びＣＤ１６ａの両方と係合する；ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－Ｆｃインコンピテント－ＤＳＢ（ＮＫｐ４６のみに結合する分子）；Ｘ－ＢＣＭＡ－ＡＤＥ－ＤＳＢ（ＣＤ１６ａのみに結合する分子）；ＮＫｐ４６のみの結合剤とＣＤ１６ａのみの結合剤又はアイソタイプ対照抗体との組合せ（ＮＫ細胞上ではなく腫瘍細胞上のＢＣＭＡにのみ結合するＸ－ＢＣＭＡ－Ｆｃインコンピテント－ＤＳＢ、及び腫瘍細胞上ではなくＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及びＣＤ１６ａに結合するＮＫｐ４６－Ｘ－ＡＤＥ－ＤＳＢ）。他の４つの抗体と単一の標的化剤との組み合わせと比較して、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢで最適なＮＫ細胞活性化が起こり、（１）ＮＫｐ４６及びＣＤ１６ａの二重標的化が、単一の係合よりも高い腫瘍細胞死滅における効力及び有効性をもたらすこと、並びに（２）最適化された効力のためにＮＫｐ４６アーム及びＣＤ１６ａアームを同じ分子上に有することの重要性を示した（図１１）。
【0338】
さらに、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの高い効力は、低レベルのＢＣＭＡ（例えば、ＭＭ１Ｓ細胞）を発現するＭＭ細胞モデルにおいてさえ、腫瘍細胞死滅における強い効率を可能にすることが見出された（図１２）。
【0339】
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢも、増強されたＡＤＣＣ特徴を有する抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体と比較した（例えば、脱フコシル化抗ＢＣＭＡ抗体）。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢは、ＲＰＭＩ ８２２６細胞及びＭＭ１Ｓ細胞の両方において、脱フコシル化抗ＢＣＭＡ抗体と比較した場合、同等の最大溶解及びより良好な効力を実証した（図１３）。
【0340】
実施例６：Ｆｃ操作ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥは強力且つ特異的なインビボ抗腫瘍活性を実証する
序論
腫瘍細胞に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥのインビボ有効性を評価するために、ＣＤ１６を発現しない異種移植マウスモデルを確立した。図１４Ａは、異種移植マウスモデルにおけるインビボＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ抗腫瘍活性を決定するための実験セットの概略図である。簡潔には、ヒトＢＣＭＡをそれぞれ非発現及び発現する緑色（ｅＧＦＰ）及び赤色（ｄｓＲｅｄ）蛍光マウスリンパ腫ＲＭＡ細胞の１：１混合物を、ヒトＮＫｐ４６遺伝子導入Ｒａｇ１欠損マウス（Ｔｇ ｈｕＮＫｐ４６ Ｒａｇ１ －／－）に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。腫瘍担持マウス（各群ｎ＝７）を、総用量１２．２ピコモルのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ又は対照としてのビヒクルで１回処置した。処置の４８
時間後にマウスの肝臓を生検し、浸潤したＲＭＡ細胞の絶対数をフローサイトメトリーによって監視した。処置の４８時間後にマウスの肝臓を生検し、浸潤したＲＭＡ細胞の絶対数を以下に記載され、対応する図１４Ｂ～図１４Ｅに示されるようにフローサイトメトリーによって監視した。
序論
腫瘍細胞に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥのインビボ有効性を評価するために、ＣＤ１６を発現しない異種移植マウスモデルを確立した。図１４Ａは、異種移植マウスモデルにおけるインビボＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ抗腫瘍活性を決定するための実験セットの概略図である。簡潔には、ヒトＢＣＭＡをそれぞれ非発現及び発現する緑色（ｅＧＦＰ）及び赤色（ｄｓＲｅｄ）蛍光マウスリンパ腫ＲＭＡ細胞の１：１混合物を、ヒトＮＫｐ４６遺伝子導入Ｒａｇ１欠損マウス（Ｔｇ ｈｕＮＫｐ４６ Ｒａｇ１ －／－）に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。腫瘍担持マウス（各群ｎ＝７）を、総用量１２．２ピコモルのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ又は対照としてのビヒクルで１回処置した。処置の４８
時間後にマウスの肝臓を生検し、浸潤したＲＭＡ細胞の絶対数をフローサイトメトリーによって監視した。処置の４８時間後にマウスの肝臓を生検し、浸潤したＲＭＡ細胞の絶対数を以下に記載され、対応する図１４Ｂ～図１４Ｅに示されるようにフローサイトメトリーによって監視した。
【0341】
材料及び方法
短期間モデルにおけるインビボでの抗腫瘍活性
ＢＣＭＡ－ＮＫＣＥ分子の活性を、ヒトＢＣＭＡの発現のため、形質導入されたＲＭＡ－ｄｓＲｅｄ－ｈｕＢＣＭＡ Ｃｌ．Ｅ６（ＢＣＭＡ陽性）又はＲＭＡ－ｅＧＦＰ Ｃｌ．５Ａ６ではない（ＢＣＭＡ陰性）マウスＲＭＡ白血病細胞を使用する播種性腫瘍モデルにおいて評価し、ＮＫ細胞上にヒトＮＫｐ４６を発現する免疫不全マウス（ＨｕＮＫｐ４６ Ｔｇ Ｒａｇ１－／－）（Ｎ＝１４）の０日目に尾静脈における注射のため１：１の比で混合した。マウスを２つの群に分け、０日目に、ビヒクル（Ｎ＝７）又はＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ分子（Ｎ＝７）で、マウスあたり１２．３ピコモルの平坦な用量で処置した。
２日目（処置の４８時間後）にマウスを屠殺し、ＯｃｔｏＭａｃｓ（登録商標）及びＰｅｒｃｏｌｌ勾配単離による破砕によって播種性ＲＭＡ細胞を肝臓から抽出した。肝臓に浸潤するＲＭＡ細胞を分析し、フローサイトメトリーによって計数した。
短期間モデルにおけるインビボでの抗腫瘍活性
ＢＣＭＡ－ＮＫＣＥ分子の活性を、ヒトＢＣＭＡの発現のため、形質導入されたＲＭＡ－ｄｓＲｅｄ－ｈｕＢＣＭＡ Ｃｌ．Ｅ６（ＢＣＭＡ陽性）又はＲＭＡ－ｅＧＦＰ Ｃｌ．５Ａ６ではない（ＢＣＭＡ陰性）マウスＲＭＡ白血病細胞を使用する播種性腫瘍モデルにおいて評価し、ＮＫ細胞上にヒトＮＫｐ４６を発現する免疫不全マウス（ＨｕＮＫｐ４６ Ｔｇ Ｒａｇ１－／－）（Ｎ＝１４）の０日目に尾静脈における注射のため１：１の比で混合した。マウスを２つの群に分け、０日目に、ビヒクル（Ｎ＝７）又はＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ分子（Ｎ＝７）で、マウスあたり１２．３ピコモルの平坦な用量で処置した。
２日目（処置の４８時間後）にマウスを屠殺し、ＯｃｔｏＭａｃｓ（登録商標）及びＰｅｒｃｏｌｌ勾配単離による破砕によって播種性ＲＭＡ細胞を肝臓から抽出した。肝臓に浸潤するＲＭＡ細胞を分析し、フローサイトメトリーによって計数した。
【0342】
定量及び統計分析
得られたデータの逐次統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７を用いて行った。得られた比のデータを対数変換して統計解析を行った。正常性試験（ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ－Ｐｅａｒｓｏｎ）を行って、ノンパラメトリック試験（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ、続いて比較後の試験）の使用を確認した。各処置群を対照ビヒクル群と体系的に比較した。データが正常に分布していない場合、対になった試料集団間の差の統計学的有意性を、ウィルコクソンのマッチした対の符号付き順位検定を用いて決定した。Ｎは、実験に用いた試料の数である。ＳＤを示すエラーバーの有無にかかわらず、平均値又は中央値を示す。有意性を以下のように示す。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。４パラメータ非線形回帰分析を使用して、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ ＮＫＣＥ ＥＣ５０を計算した。
得られたデータの逐次統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７を用いて行った。得られた比のデータを対数変換して統計解析を行った。正常性試験（ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ－Ｐｅａｒｓｏｎ）を行って、ノンパラメトリック試験（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ、続いて比較後の試験）の使用を確認した。各処置群を対照ビヒクル群と体系的に比較した。データが正常に分布していない場合、対になった試料集団間の差の統計学的有意性を、ウィルコクソンのマッチした対の符号付き順位検定を用いて決定した。Ｎは、実験に用いた試料の数である。ＳＤを示すエラーバーの有無にかかわらず、平均値又は中央値を示す。有意性を以下のように示す。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。４パラメータ非線形回帰分析を使用して、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ ＮＫＣＥ ＥＣ５０を計算した。
【0343】
結果
生着前に、フローサイトメトリーによって分析した場合、ｅＧＦＰ－ｈｕＢＣＭＡ陰性細胞よりも相対的に１．５倍多いｄｓＲｅｄ－ｈｕＢＣＭＡ ＲＭＡ細胞が存在し、ＲＭＡ ｄｓＲｅｄ細胞のみがＢＣＭＡを発現した（図１４Ｂ～１４Ｃ）。フローサイトメトリーによって分析した、生着前（インビトロ）及び肝臓生検における生着後（エクスビボ）のｄｓＲｅｄ ＲＭＡ細胞上のヒトＢＣＭＡの発現も検出することができた（図１４Ｄ）。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－ＦＣ又はビヒクル対照による処置の４８時間後、フローサイトメトリーによって分析した肝臓浸潤ＲＭＡ細胞の絶対数（左）及びｄｓＲｅｄ／ｅＧＦＰ細胞比（右）は、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ腫瘍死滅がＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞に特異的であることを実証した（図１４Ｅ）。
生着前に、フローサイトメトリーによって分析した場合、ｅＧＦＰ－ｈｕＢＣＭＡ陰性細胞よりも相対的に１．５倍多いｄｓＲｅｄ－ｈｕＢＣＭＡ ＲＭＡ細胞が存在し、ＲＭＡ ｄｓＲｅｄ細胞のみがＢＣＭＡを発現した（図１４Ｂ～１４Ｃ）。フローサイトメトリーによって分析した、生着前（インビトロ）及び肝臓生検における生着後（エクスビボ）のｄｓＲｅｄ ＲＭＡ細胞上のヒトＢＣＭＡの発現も検出することができた（図１４Ｄ）。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ－ＦＣ又はビヒクル対照による処置の４８時間後、フローサイトメトリーによって分析した肝臓浸潤ＲＭＡ細胞の絶対数（左）及びｄｓＲｅｄ／ｅＧＦＰ細胞比（右）は、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ腫瘍死滅がＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞に特異的であることを実証した（図１４Ｅ）。
【0344】
実施例７：ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢは、エクスビボでの自己ＮＫ細胞活性化及び多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞死滅を促進する
序論
多発性骨髄腫細胞及び自己免疫エフェクター細胞を含む骨髄及び末梢血試料を、デノボ多発性骨髄腫又は再発性多発性骨髄腫のいずれかを有する未治療又は標準治療の診断された患者から得て、エクスビボでのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの累積的影響を評価した。
序論
多発性骨髄腫細胞及び自己免疫エフェクター細胞を含む骨髄及び末梢血試料を、デノボ多発性骨髄腫又は再発性多発性骨髄腫のいずれかを有する未治療又は標準治療の診断された患者から得て、エクスビボでのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの累積的影響を評価した。
【0345】
材料及び方法
細胞及び染色
骨髄及び末梢血試料をＭＹＲＡＣＬＥコホートから得た（Ｂｅｎａｎｉｂａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，２０１９）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び骨髄単核球（ＢＭＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅを用いた密度勾配遠心分離によって単離した。標準治療の処置を受けた患者からの試料は、以前に、ダラツムマブ、カルフィルゾミブ、デキサメタゾン及びレブリミドで治療されていた。
細胞及び染色
骨髄及び末梢血試料をＭＹＲＡＣＬＥコホートから得た（Ｂｅｎａｎｉｂａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，２０１９）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び骨髄単核球（ＢＭＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅを用いた密度勾配遠心分離によって単離した。標準治療の処置を受けた患者からの試料は、以前に、ダラツムマブ、カルフィルゾミブ、デキサメタゾン及びレブリミドで治療されていた。
【0346】
細胞（４×１０５細胞／ウェル）を、ＣＴＬ－ＮＫＣＥ２、ＮＫＣＥ２（１０ｕｇ／ｍｌ）、参照－４（２０ｕｇ／ｍｌ）又はオビヌツズマブ（１０ｕｇ／ｍｌ）の存在下、５％ＦＣＳ及び３ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６を含有するＲＰＭＩ中で２４時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞をＶ底プレートに移し、プレートを３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄した。ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＢＳＡ／Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ中の抗体のパネルを、以下の表に記載の各条件で添加した。
【0347】
細胞をＦＡＣ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｓｙｍｐｈｏｎｙを使用してフローサイトメトリーによって分析した。以下に更に記載するＮＫ細胞活性化を、ＣＤ３－／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ及びＣＤ６９発現によって評価し、骨髄腫細胞死を、ＣＤ１３８＋／ＣＤ３８＋細胞の消失によって評価した。
【0348】
【表7】
【0349】
ＮＫ細胞活性化アッセイ
分子をＵ底９６ウェルプレートに添加した。次いで、５０，０００個の休止期ＮＫ細胞及び５０，０００個のＲＰＭＩ ８２２６細胞を各ウェルに連続的に添加して、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を得た。対照条件は、５０，０００個の休止期ＮＫ細胞のみをウェルによって添加することによって実施した。ＢＤ ＧｏｌｇｉＳＴＯＰ（商標）溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５４７２４）を、各ウェルにおいて最終希釈１／６０００ｅで添加した（対照及び実験）。最終１２５ ｎｇ／ｍＬのＰｈｏｒｂｏｌ
１２ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３ ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、ＳＩＧＭＡ、Ｐ８１３９）及び１μｇ／ｍＬの最終イオノマイシン（ＩＯＮＯ，ＳＩＧＭＡ、Ｉ０６３４）を５０，０００個の休止期ＮＫ細胞にウェル添加して、ＮＫ細胞活性化の陽性対照を行った。各条件を二連で実施した。３７±１℃及び５±１％ＣＯ２での４時間のコインキュベーションの後、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ及びＣＤ１０７ｂマーカーについて細胞外染色を行った。細胞の固定及び透過化後、細胞内ＩＦＮｇ、ＴＮＦα及びＭＩＰ１
β産生の測定のために細胞内染色を行った。抗体の混合物を１６０００ｇで＋４℃で１０分間遠心分離して、潜在的な凝集体を除去した。細胞を最後の染色後に染色緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％アジド）に再懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＣ）によって分析した。
分子をＵ底９６ウェルプレートに添加した。次いで、５０，０００個の休止期ＮＫ細胞及び５０，０００個のＲＰＭＩ ８２２６細胞を各ウェルに連続的に添加して、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を得た。対照条件は、５０，０００個の休止期ＮＫ細胞のみをウェルによって添加することによって実施した。ＢＤ ＧｏｌｇｉＳＴＯＰ（商標）溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５４７２４）を、各ウェルにおいて最終希釈１／６０００ｅで添加した（対照及び実験）。最終１２５ ｎｇ／ｍＬのＰｈｏｒｂｏｌ
１２ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３ ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、ＳＩＧＭＡ、Ｐ８１３９）及び１μｇ／ｍＬの最終イオノマイシン（ＩＯＮＯ，ＳＩＧＭＡ、Ｉ０６３４）を５０，０００個の休止期ＮＫ細胞にウェル添加して、ＮＫ細胞活性化の陽性対照を行った。各条件を二連で実施した。３７±１℃及び５±１％ＣＯ２での４時間のコインキュベーションの後、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ及びＣＤ１０７ｂマーカーについて細胞外染色を行った。細胞の固定及び透過化後、細胞内ＩＦＮｇ、ＴＮＦα及びＭＩＰ１
β産生の測定のために細胞内染色を行った。抗体の混合物を１６０００ｇで＋４℃で１０分間遠心分離して、潜在的な凝集体を除去した。細胞を最後の染色後に染色緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％アジド）に再懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＣ）によって分析した。
【0350】
ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてフローサイトメトリーデータを分析した。パーセントＮＫ細胞活性化の分析を、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムを用いて行った。活性化の最上位値は、観察された最大活性化に対応していた。最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値は、以下の式に対応する４パラメータロジスティクス非線形回帰モデルを使用して計算した。
【数1】
【0351】
ＥＣ５０と同じモデルを使用して、活性化の最下位計算値、活性化の最上位計算値、傾き及び９５％信頼区間（ＣＩ）値を計算した。
【0352】
結果
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥで治療したＭＭ患者ＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析は、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ１ ＤＥ抗体又は抗体なし対照と比較して、ＣＤ１３８＋／ＣＤ３８＋細胞の消失によって特徴付けられる骨髄腫細胞の頻度の減少（図１５Ａ左パネル）、及びＣＤ３－／ＣＤ ５６＋ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ及びＣＤ６９発現によって評価される活性化ＮＫ細胞の増加（図１５Ａ中央右パネル）を示した。マーカーの発現レベルのこれらの差を、図１５Ｂに示すように対応する棒グラフで定量した。図１６は、診断時、又は標準治療（ＳｏＣ）治療（ダラツムマブ、イサツキシマブ、プロテアソーム阻害剤、ＩＭＩＤ、デキサメタゾン、アルキル化剤、ＢＨ３模倣物、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）、抗ＣＤ４７、ＣＤ３－ＣＤ３８又はＣＤ３－ＢＣＭＡ Ｔ細胞エンゲージャーを含む多様な治療（ＴＣ；治療クラス）に失敗したＭＭ患者からの骨髄吸引物を用いた自己設定におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＮＫＣＥ腫瘍死滅活性のエクスビボ特性評価を示す。１０％以下の溶解を示す試料は、非常に低いＥ：Ｔ比と関連していた。
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥで治療したＭＭ患者ＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析は、抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ１ ＤＥ抗体又は抗体なし対照と比較して、ＣＤ１３８＋／ＣＤ３８＋細胞の消失によって特徴付けられる骨髄腫細胞の頻度の減少（図１５Ａ左パネル）、及びＣＤ３－／ＣＤ ５６＋ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ及びＣＤ６９発現によって評価される活性化ＮＫ細胞の増加（図１５Ａ中央右パネル）を示した。マーカーの発現レベルのこれらの差を、図１５Ｂに示すように対応する棒グラフで定量した。図１６は、診断時、又は標準治療（ＳｏＣ）治療（ダラツムマブ、イサツキシマブ、プロテアソーム阻害剤、ＩＭＩＤ、デキサメタゾン、アルキル化剤、ＢＨ３模倣物、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）、抗ＣＤ４７、ＣＤ３－ＣＤ３８又はＣＤ３－ＢＣＭＡ Ｔ細胞エンゲージャーを含む多様な治療（ＴＣ；治療クラス）に失敗したＭＭ患者からの骨髄吸引物を用いた自己設定におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＮＫＣＥ腫瘍死滅活性のエクスビボ特性評価を示す。１０％以下の溶解を示す試料は、非常に低いＥ：Ｔ比と関連していた。
【0353】
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥは、診断時又は再発時に患者の試料において同様のエクスビボ抗骨髄腫活性（自己状況）を示す。再発時に抗骨髄腫活性の低下は観察されない。
【0354】
これらのデータは、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥが、例えば、同じ患者由来の多発性骨髄腫細胞及びＮＫ細胞を用いた自己アッセイにおいて、ＭＭ患者由来の一次試料中のエクスビボＮＫ細胞を活性化することを実証している。
【0355】
実施例８：Ｆｃ操作されたＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥは、強力且つ特異的なインビボ抗腫瘍活性及び良好な排出半減期を実証する
序論
この実施例は、雌ｈｕＦｃＲｎ Ｔｇ３２トランスジェニックマウスへの単回静脈内（２．５ｍｇ／ｋｇ）投与後のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの薬物動態（ＰＫ）プロファイル及びパラメータを評価する。
序論
この実施例は、雌ｈｕＦｃＲｎ Ｔｇ３２トランスジェニックマウスへの単回静脈内（２．５ｍｇ／ｋｇ）投与後のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの薬物動態（ＰＫ）プロファイル及びパラメータを評価する。
【0356】
材料及び方法
ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＰＫ研究
マウス実験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来し、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入したトランスジェニックＴｇ３２（Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔｔｍ、１Ｄｃｒ Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ）マウスで行った。ＦｃＲｎ－／－ｈＦｃＲｎ（系統３２）Ｔｇマウスは、マウス遺伝子及びその天然のヒトプロモータの制御下でｈＦｃＲｎ α鎖導入遺伝子を発現する導入遺伝子についてヌル変異を有する。３匹のＴｇ３２ホモ接合性ナイーブ成体雌マウス（平均体重２１．４ｇ）を研究開始時に使用した。
ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＰＫ研究
マウス実験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来し、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入したトランスジェニックＴｇ３２（Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔｔｍ、１Ｄｃｒ Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ）マウスで行った。ＦｃＲｎ－／－ｈＦｃＲｎ（系統３２）Ｔｇマウスは、マウス遺伝子及びその天然のヒトプロモータの制御下でｈＦｃＲｎ α鎖導入遺伝子を発現する導入遺伝子についてヌル変異を有する。３匹のＴｇ３２ホモ接合性ナイーブ成体雌マウス（平均体重２１．４ｇ）を研究開始時に使用した。
【0357】
投薬レジメンのために、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥ（ストック溶液液：１．５ｍｇ／ｍｌ）を、同じ緩衝液に希釈した１０ｍＭ Ｈｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６緩衝液中に即時調製し、２．５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量として１０ｍＬ／ｋｇの投与量で尾静脈内に投与した。動物を、２８日間の研究期間にわたって投薬後０．０８３、４、２４、７２、１６８、３３６、５０４及び６７２時間の連続サンプリングアプローチを利用して評価した。各時点で、血液試料（約２０μＬ－連続サンプリング）を伏在静脈からＫ３－ＥＤＴＡ採取装置に採血した。採取直後に、血液試料を湿った氷上に置き、次いで遠心分離した。次いで、４μＬの血漿を６０μｌのＤＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に希釈した。
【0358】
分析方法は以下の通りであった：
各時点での濃度を、以下の一般的な方法を使用してボトムアップＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによって決定した：血漿アリコートの沈殿後、サロゲートペプチドの分析の前に、血漿ペレットをタンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化、及び固相抽出に供した。Ｆａｂ領域（軽鎖）に属するサロゲートペプチドＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫを、その選択性及び応答因子に応じて、定量化のために各抗体について選択した。１、２．８、７、１４、４０、８０及び１００μｇ／ｍＬで抗体を血漿に添加することによって較正標準を調製した。逆相Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、３．５μＭ、３００Å、水）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＨＰＬＣシステムで、６００μＬ／分の流速で、水中０．１％ギ酸及びアセトニトリル中０．１％ギ酸の段階的勾配でペプチド分離を行った。検出のために、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ６６００ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ質量分析計を正プロダクトイオンモードで使用し、ソース温度は５００℃、イオンスプレー電圧は５５００Ｖ、カーテンガスは３５、及びネブライザガスは５０であった。滞留時間は各実験について１５ｍｓであった。デクラスタリングポテンシャル（Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は９０Ｖ、衝突エネルギーは２６Ｖであった。抗体のユニークなサロゲートペプチドの６２６．０ｍ／ｚ親イオンの８０７．４０９８ｍ／ｚ断片を、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔソフトウェアのＭＱ４統合アルゴリズムからのピーク面積を使用して、標準及び対照と比較した濃度決定に使用した。
各時点での濃度を、以下の一般的な方法を使用してボトムアップＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによって決定した：血漿アリコートの沈殿後、サロゲートペプチドの分析の前に、血漿ペレットをタンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化、及び固相抽出に供した。Ｆａｂ領域（軽鎖）に属するサロゲートペプチドＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫを、その選択性及び応答因子に応じて、定量化のために各抗体について選択した。１、２．８、７、１４、４０、８０及び１００μｇ／ｍＬで抗体を血漿に添加することによって較正標準を調製した。逆相Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、３．５μＭ、３００Å、水）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＵＨＰＬＣシステムで、６００μＬ／分の流速で、水中０．１％ギ酸及びアセトニトリル中０．１％ギ酸の段階的勾配でペプチド分離を行った。検出のために、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ６６００ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ質量分析計を正プロダクトイオンモードで使用し、ソース温度は５００℃、イオンスプレー電圧は５５００Ｖ、カーテンガスは３５、及びネブライザガスは５０であった。滞留時間は各実験について１５ｍｓであった。デクラスタリングポテンシャル（Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は９０Ｖ、衝突エネルギーは２６Ｖであった。抗体のユニークなサロゲートペプチドの６２６．０ｍ／ｚ親イオンの８０７．４０９８ｍ／ｚ断片を、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔソフトウェアのＭＱ４統合アルゴリズムからのピーク面積を使用して、標準及び対照と比較した濃度決定に使用した。
【0359】
アッセイ方法
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥ濃度を、探索的ＬＢＡ法を使用して血漿中で決定した。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥを、Ｇｙｒｏｌａｂ微細構造ディスクのストレプトアビジンビーズ上に結合したビオチン－ＢＣＭＡ抗原によって捕捉し、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃｇ Ａｌｅｘａタグトレーサーを使用して検出した。定量下限（ＬＬＯＱ）値は１．００μｇ／ｍＬであった。
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥ濃度を、探索的ＬＢＡ法を使用して血漿中で決定した。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥを、Ｇｙｒｏｌａｂ微細構造ディスクのストレプトアビジンビーズ上に結合したビオチン－ＢＣＭＡ抗原によって捕捉し、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃｇ Ａｌｅｘａタグトレーサーを使用して検出した。定量下限（ＬＬＯＱ）値は１．００μｇ／ｍＬであった。
【0360】
統計分析
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの個々の血漿濃度値（μｇ／ｍＬで表す）を記述統計（平均、標準偏差（ＳＤ）及び変動係数（ＣＶ％））によって要約し、サンプリング時間によって集計した。全ての結果は、小数点なしのＣＶ％を除いて、３つの有効数字で報告した。
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの個々の血漿濃度値（μｇ／ｍＬで表す）を記述統計（平均、標準偏差（ＳＤ）及び変動係数（ＣＶ％））によって要約し、サンプリング時間によって集計した。全ての結果は、小数点なしのＣＶ％を除いて、３つの有効数字で報告した。
【0361】
個々のＰＫパラメータを、上記のように記述統計学によって要約した。個々の値及び平
均値を３つの有効数字で表した（ｔｍａｘ及びｔｌａｓｔは時間値に対して適切に四捨五入されており、中央値及び範囲［最小－最大］値のみが報告されていることを除く）。
均値を３つの有効数字で表した（ｔｍａｘ及びｔｌａｓｔは時間値に対して適切に四捨五入されており、中央値及び範囲［最小－最大］値のみが報告されていることを除く）。
【0362】
結果
研究中に臨床徴候又は症状は観察されなかった。
研究中に臨床徴候又は症状は観察されなかった。
【0363】
雌ｈｕＦｃＲｎ ｔｇ３２マウスへのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの単回ＩＶ（２．５ ｍｇ／ｋｇ）投与後に得られたＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥ血漿濃度（ｕｇ／ｍｌ）の平均値及び個別値（Ｎ＝３）を以下の表８に報告し、対応する平均血漿濃度及び個別血漿濃度対時間プロファイルをそれぞれ図１８及び図１９に示す。
【0364】
【表8】
【0365】
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの単回静脈内（２．５ｍｇ／ｋｇ）投与後の血漿中のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥの薬物動態パラメータの平均及び個々の値（Ｎ＝３）を以下の表９に示す。
【0366】
【表9】
【0367】
２．５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与後、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥ濃度は、最大２８日間（最後のサンプリング時間）まで血漿中で定量可能であり、血漿クリアランスは６．４±０．５４６ｍＬ／日／ｋｇと推定され、定常状態での分布体積は１２１±９．８２ｍＬ／ｋｇであり、約１４日間の最終排出半減期（ｔ１／２）をもたらした。
【0368】
実施例９：ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ ＣＯＤＶ－ＯＬ１は、用量応答様式で強力な抗腫瘍活性を示し、ＮＫ細胞上のＣＤ１６及びＮＫｐ４６の両方と共係合することに
よってより良好な活性を実証する。
序論
ヒトＢＣＭＡを発現する播種性マウスＥＬ４細胞を移植したｈｕＮＫｐ４６－Ｔｇ ｘ
Ｒａｇマウスにおいて、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ ＣＯＤＶ－ＯＬ１の有効性を評価した。ＩｇＧ１コンピテントＦｃドメインは、全ての活性化マウスＦｃγＲに結合し、マウスエフェクター細胞を動員し、マウスＮＫ細胞でＡＤＣＣを誘導することができる。
よってより良好な活性を実証する。
序論
ヒトＢＣＭＡを発現する播種性マウスＥＬ４細胞を移植したｈｕＮＫｐ４６－Ｔｇ ｘ
Ｒａｇマウスにおいて、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ ＣＯＤＶ－ＯＬ１の有効性を評価した。ＩｇＧ１コンピテントＦｃドメインは、全ての活性化マウスＦｃγＲに結合し、マウスエフェクター細胞を動員し、マウスＮＫ細胞でＡＤＣＣを誘導することができる。
【0369】
材料及び方法
０日目にマウスに０．５×１０６個の腫瘍細胞を静脈内接種した。処置は、腫瘍移植後１日目にＩＰで投与した。以下の対照抗体を５ｍｇ／ｋｇで投与した：ｈｕＮＫｐ４６及びマウスＦｃγＲに結合するがｈｕＢＣＭＡには結合しない、ＮＫｐ４６－ＣＤ１６－Ｘ
Ｆｃ ＷＴ；ｈｕＮＫｐ４６及びＢＣＭＡに結合するが、マウスＦｃγＲへの結合及びＣＤ１６を介したマウスエフェクター細胞の動員を阻害するＬＡＬＡ Ｆｃ変異を有するＮＫｐ４６－Ｘ－ＢＣＭＡ；ｈｕＢＣＭＡ及びマウスＦｃγＲに結合するが、ｈｕＮＫｐ４６には結合しない、Ｘ－ＣＤ１６－ＢＣＭＡ。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ ＣＯＤＶ－ＯＬ１を５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇで投与した。対照群は未治療のままにした。
０日目にマウスに０．５×１０６個の腫瘍細胞を静脈内接種した。処置は、腫瘍移植後１日目にＩＰで投与した。以下の対照抗体を５ｍｇ／ｋｇで投与した：ｈｕＮＫｐ４６及びマウスＦｃγＲに結合するがｈｕＢＣＭＡには結合しない、ＮＫｐ４６－ＣＤ１６－Ｘ
Ｆｃ ＷＴ；ｈｕＮＫｐ４６及びＢＣＭＡに結合するが、マウスＦｃγＲへの結合及びＣＤ１６を介したマウスエフェクター細胞の動員を阻害するＬＡＬＡ Ｆｃ変異を有するＮＫｐ４６－Ｘ－ＢＣＭＡ；ｈｕＢＣＭＡ及びマウスＦｃγＲに結合するが、ｈｕＮＫｐ４６には結合しない、Ｘ－ＣＤ１６－ＢＣＭＡ。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ ＣＯＤＶ－ＯＬ１を５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇで投与した。対照群は未治療のままにした。
【0370】
マウスを毎日確認し、有害な臨床反応を認めた。個々のマウスの体重を実験終了まで毎日測定した（６０日目）。マウスは、動物の苦痛を避けるために、所定の基準に従って瀕死の状態になったときに安楽死させた。重大であると考えられる病態に関連する臨床徴候は、四肢麻痺、腹水症、触知可能な内部腫瘍塊、２０％以上の罹患率又は体重減少である。
主要有効性エンドポイントは、日単位の生存期間中央値（ＭＳＴ）、パーセント増加寿命（％ＩＬＳ）、及び長期生存率であった。
各マウスの個々の死亡日（もしあれば）を報告した。ＭＳＴを各群について決定し、比率ＩＬＳを計算し、百分率として表した：
％ＩＬＳ＝１００×（Ｔ－Ｃ）／Ｃ
式中、Ｔ＝処置群のＭＳＴ及びＣ＝対照群のＭＳＴである。
主要有効性エンドポイントは、日単位の生存期間中央値（ＭＳＴ）、パーセント増加寿命（％ＩＬＳ）、及び長期生存率であった。
各マウスの個々の死亡日（もしあれば）を報告した。ＭＳＴを各群について決定し、比率ＩＬＳを計算し、百分率として表した：
％ＩＬＳ＝１００×（Ｔ－Ｃ）／Ｃ
式中、Ｔ＝処置群のＭＳＴ及びＣ＝対照群のＭＳＴである。
【0371】
用量は、％ＩＬＳが２５％よりも優れている場合には治療的に活性であり、％ＩＬＳが５０％よりも優れている場合には非常に活性であると考えられる（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＩ
ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８４（１０）：１４２４－１４３１）。ＮＣＩ前臨床インビトロモデル及びインビボモデルにおける薬物活性と初期臨床試験との間の関係。Ｉｄ．
ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８４（１０）：１４２４－１４３１）。ＮＣＩ前臨床インビトロモデル及びインビボモデルにおける薬物活性と初期臨床試験との間の関係。Ｉｄ．
【0372】
長期生存率は、百分率で表される群のマウスの総数に対する対照群のＭＳＴの２倍以上の生存期間を有するマウスの数として定義される。
【0373】
結果
結果を図２０及び表１０に示す。
結果を図２０及び表１０に示す。
【0374】
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ ＮＫＣＥは、ＥＬ４－ｈｕＢＣＭＡ播種性モデルにおいて５、０．５、及び０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で統計学的に有意な活性を誘導し、対照と比較したＩＬＳは５の用量で長期生存者の２１５％及び５７％、０．５の用量で長期生存者の２１５％及び６２．５％、並びに０．２５ｍｇ／ｋｇの用量で長期生存者の１３２％及び１２．５％であった。
【0375】
対照のＸ－ＣＤ１６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥは、ＥＬ４－ｈｕＢＣＭＡ播種性モデルにお
いて５ｍｇ／ｋｇの用量で統計学的に有意な活性を誘導し、長期生存者のＩＬＳは１４７％及び２８．６％であったが、対照のＮＫｐ４６－Ｘ－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥは５ｍｇ／ｋｇの用量で有意な活性を誘導せず、ＩＬＳは８４％であり、長期生存者はいなかった。
いて５ｍｇ／ｋｇの用量で統計学的に有意な活性を誘導し、長期生存者のＩＬＳは１４７％及び２８．６％であったが、対照のＮＫｐ４６－Ｘ－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥは５ｍｇ／ｋｇの用量で有意な活性を誘導せず、ＩＬＳは８４％であり、長期生存者はいなかった。
【0376】
結論として、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＮＫＣＥは、０．０５ｍｇ／ｋｇからのロバストな活性を有する用量依存的活性を示し、ＮＫｐ４６－Ｘ－ＢＣＭＡ及びＸ－ＣＤ１６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥ対照との活性は、ＮＫ細胞をＮＫｐ４６及びＦｃγＲの両方と共係合させてインビボ有効性を改善する利点を実証した。
【0377】
【表10】
【0378】
実施例１０：ＡＤＣＣ増強ＮＫＣＥは、Ｆｃ ＷＴ ＮＫＣＥと比較してインビボで明らかな優位性を示す。
序論
ヒトＢＣＭＡを発現する播種性マウスＥＬ４細胞を移植したｈｕＦｃｇＲ－Ｔｇマウスにおいて、サロゲートｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ及びＦｃ－ＡＤＥ ＣＯＤＶ－ＯＬ１の有効性を評価した。ｈｕＦｃｇＲ－Ｔｇマウスは、ロックフェラー研究所によって作製され（Ｓｍｉｔｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＮＡＳ，１０９（１６）：６１８１－６１８６）、これらのマウスは、５つのヒトＦｃ γ受容体全てを発現する。ＡＤＥ変異は、ＮＫ細胞によって発現されるヒトＦｃｇＲＩＩＩＡ受容体に対するＦｃ受容体の親和性を高めるが、マウスオルソログＦｃｇＲＩＶに対する親和性は高めない。ｈｕＦｃｇＲ－Ｔｇマウスを使用して、ＷＴ ＮＫＣＥに対するＡＤＥの潜在的な増強された活性を評価した。対照サロゲートは、ＩｇＧ１コンピテントＦｃドメインを含有する。
序論
ヒトＢＣＭＡを発現する播種性マウスＥＬ４細胞を移植したｈｕＦｃｇＲ－Ｔｇマウスにおいて、サロゲートｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ及びＦｃ－ＡＤＥ ＣＯＤＶ－ＯＬ１の有効性を評価した。ｈｕＦｃｇＲ－Ｔｇマウスは、ロックフェラー研究所によって作製され（Ｓｍｉｔｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＮＡＳ，１０９（１６）：６１８１－６１８６）、これらのマウスは、５つのヒトＦｃ γ受容体全てを発現する。ＡＤＥ変異は、ＮＫ細胞によって発現されるヒトＦｃｇＲＩＩＩＡ受容体に対するＦｃ受容体の親和性を高めるが、マウスオルソログＦｃｇＲＩＶに対する親和性は高めない。ｈｕＦｃｇＲ－Ｔｇマウスを使用して、ＷＴ ＮＫＣＥに対するＡＤＥの潜在的な増強された活性を評価した。対照サロゲートは、ＩｇＧ１コンピテントＦｃドメインを含有する。
【0379】
材料及び方法
０日目にマウスに５×１０６個の腫瘍細胞を静脈内接種した。処置は、腫瘍移植後１日目にＩＰで投与した。ｈｕＢＣＭＡ（ｍｕＮＫｐ４６－Ｘ）ではなく、ｍｕＮＫｐ４６に結合する対照抗体を、５ｍｇ／ｋｇで投与した。ｍｕＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ及びＦｃ－ＡＤＥ ＣＯＤＶ－ＯＬ１を５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇで投与した。
０日目にマウスに５×１０６個の腫瘍細胞を静脈内接種した。処置は、腫瘍移植後１日目にＩＰで投与した。ｈｕＢＣＭＡ（ｍｕＮＫｐ４６－Ｘ）ではなく、ｍｕＮＫｐ４６に結合する対照抗体を、５ｍｇ／ｋｇで投与した。ｍｕＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ及びＦｃ－ＡＤＥ ＣＯＤＶ－ＯＬ１を５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇで投与した。
【0380】
マウスを毎日確認し、有害な臨床反応を認めた。個々のマウスの体重を実験終了まで毎日測定した（６０日目）。マウスは、動物の苦痛を避けるために、所定の基準に従って瀕死の状態になったときに安楽死させた。重大であると考えられる病態に関連する臨床徴候は、四肢麻痺、腹水症、触知可能な内部腫瘍塊、２０％以上の罹患率又は体重減少である。
【0381】
主要有効性エンドポイントは、日単位の生存期間中央値（ＭＳＴ）、パーセント増加寿命（％ＩＬＳ）、及び長期生存率であった。
【0382】
各マウスの個々の死亡日（もしあれば）を報告した。ＭＳＴを各群について決定し、比率ＩＬＳを計算し、百分率として表した：
％ＩＬＳ＝１００×（Ｔ－Ｃ）／Ｃ
式中、Ｔ＝処置群のＭＳＴ及びＣ＝対照群のＭＳＴである。
％ＩＬＳ＝１００×（Ｔ－Ｃ）／Ｃ
式中、Ｔ＝処置群のＭＳＴ及びＣ＝対照群のＭＳＴである。
【0383】
用量は、％ＩＬＳが２５％よりも優れている場合には治療的に活性であり、％ＩＬＳが５０％よりも優れている場合には非常に活性であると考えられる（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＩ
ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４（１０）：１４２４－３１）。
ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４（１０）：１４２４－３１）。
【0384】
長期生存率は、百分率で表される群のマウスの総数に対する対照群のＭＳＴの２倍以上の生存期間を有するマウスの数として定義される。
【0385】
結果
結果を図２１及び表１１に示す。
結果を図２１及び表１１に示す。
【0386】
サロゲートｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＢＣＭＡ Ｆｃ ＷＴ ＮＫＣＥは、ＥＬ４－ｈｕＢＣＭＡ播種性モデルにおいて５、０．５及び０．０５ ｍｇ／ｋｇの用量で統計学的に有意な活性を誘導しなかった（対照ＮＫＣＥ群と比較）。対照的に、サロゲートｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＢＣＭＡ Ｆｃ ＡＤＥ ＮＫＣＥは、５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの用量で統計学的に有意な活性を誘導し、ＩＬＳは長期生存者の１００％及び９０％超であった。０．０５ｍｇ／ｋｇのより低い用量は、統計学的に有意な活性を誘導しなかった。
【0387】
結論として、ｍｕＮＫｐ４６－ｈｕＢＣＭＡ Ｆｃ ＡＤＥサロゲートＮＫＣＥは、ＷＴ Ｆｃサロゲートよりも良好な活性を用量依存的に示した。
【0388】
【表11】
【0389】
実施例１１：還元条件におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＣＯＤＶ－ＯＬ１分子内のジスルフィド結合Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃの化学的安定性／完全性
序論
Ｆｃ ＣＨ２ドメイン上のジスルフィド結合（ＤＳＢ）の操作は安定性を高める。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１９３，６６５号明細書を参照されたい。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＣＯＤＶ－ＯＬ１分子内の操作されたＤＳＢ、Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃ及びＡＤＥ変異（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）がＤＳＢ還元挙動に異常に影響しないことを確実にするために、還元速度をＤＴＴ及びその後のトリプシンペプチドマッピングによって測定した。
序論
Ｆｃ ＣＨ２ドメイン上のジスルフィド結合（ＤＳＢ）の操作は安定性を高める。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６３／１９３，６６５号明細書を参照されたい。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＣＯＤＶ－ＯＬ１分子内の操作されたＤＳＢ、Ｒ２９２Ｃ＿Ｖ３０２Ｃ及びＡＤＥ変異（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）がＤＳＢ還元挙動に異常に影響しないことを確実にするために、還元速度をＤＴＴ及びその後のトリプシンペプチドマッピングによって測定した。
【0390】
材料及び方法
還元感受性アッセイ
ＰＢＳ－ＥにおけるＤＴＴの段階希釈を行った（アッセイにおける最終ＤＴＴ濃度：２０、１０、５、２、１、０．５、０．２及び０．１ｍＭ）。タンパク質バッチＦＦ－２０－８１９－１、ＦＦ－２０－８２１－１及びＦＦ－２１－１７０－５を、スピン脱塩カラムを使用してＰＢＳ－Ｅ緩衝液中に透析して、還元中にｐＨ７．２が得られるようにした。タンパク質試料をＰＢＳ－Ｅ中１．５ｍｇ／ｍＬに正規化した。正規化した試料の二部を各ＤＴＴ希釈液の一部にＰＣＲプレートに添加し、添加後に混合した。この工程は、１分以内に最低濃度から最高濃度のＤＴＴ濃度まで実施した。Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ Ｃ Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ上で２５℃で１０分間インキュベートすることによって還元を行った。３部のＮＥＭストック溶液を全てのウェルに添加することによって、反応をクエンチした。アッセイの一貫性を確実にするために、１分以内に最低から最高のＤＴＴ濃度までＮＥＭ添加を行い、添加後に混合した。調製したプレートを、キャピラリーゲル電気泳
動（ｃＧＥ）及び質量分析（ペプチドマッピング）による測定まで室温で保存した。以下の表１２及び表１３は、それぞれ還元感受性アッセイ及びキャピラリーゲル電気泳動のための試薬及び材料のリストを含む。
還元感受性アッセイ
ＰＢＳ－ＥにおけるＤＴＴの段階希釈を行った（アッセイにおける最終ＤＴＴ濃度：２０、１０、５、２、１、０．５、０．２及び０．１ｍＭ）。タンパク質バッチＦＦ－２０－８１９－１、ＦＦ－２０－８２１－１及びＦＦ－２１－１７０－５を、スピン脱塩カラムを使用してＰＢＳ－Ｅ緩衝液中に透析して、還元中にｐＨ７．２が得られるようにした。タンパク質試料をＰＢＳ－Ｅ中１．５ｍｇ／ｍＬに正規化した。正規化した試料の二部を各ＤＴＴ希釈液の一部にＰＣＲプレートに添加し、添加後に混合した。この工程は、１分以内に最低濃度から最高濃度のＤＴＴ濃度まで実施した。Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ Ｃ Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ上で２５℃で１０分間インキュベートすることによって還元を行った。３部のＮＥＭストック溶液を全てのウェルに添加することによって、反応をクエンチした。アッセイの一貫性を確実にするために、１分以内に最低から最高のＤＴＴ濃度までＮＥＭ添加を行い、添加後に混合した。調製したプレートを、キャピラリーゲル電気泳
動（ｃＧＥ）及び質量分析（ペプチドマッピング）による測定まで室温で保存した。以下の表１２及び表１３は、それぞれ還元感受性アッセイ及びキャピラリーゲル電気泳動のための試薬及び材料のリストを含む。
【0391】
【表12】
【0392】
【表13】
【0393】
還元感受性アッセイを実施した後、製造業者の指示に従って、プロテインクリアＨＲアッセイの非還元プロトコルを使用して試料を測定した。
【0394】
チップを調製するために、全てのアッセイ成分を室温に平衡化させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃｌｅａｒ ＨＲ ＧｅｌマトリックスをＰｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲ Ｄｙｅ溶液と混合し、濾過した後、製造業者の指示に従ってリンスしたチップウェルに添加した。
Ｃｌｅａｒ ＨＲ ＧｅｌマトリックスをＰｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲ Ｄｙｅ溶液と混合し、濾過した後、製造業者の指示に従ってリンスしたチップウェルに添加した。
【0395】
提供されたアッセイ対照ＶｅｒｉＭＡｂ標準を非還元性試料緩衝液で希釈し、７０℃で１０分間変性させ、製造業者の指示に従って水と混合し、アッセイ較正のためにＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ機器に入れた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲ Ｌａｄｄｅｒを水中で１：１０希釈した後、示された体積のラダー溶液及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｅａｒ ＨＲ Ｗａｓｈ緩衝液を対応するチューブに移し、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ機器に入れた。較正プロセスを、試料を測定する前に首尾よく終了した。
【0396】
試料を調製するために、還元感受性アッセイからの各試料５μＬをＰＣＲプレート中の非還元性試料緩衝液１８μＬに添加し、これを密封し、試料をサーモスタットＣ Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ上で７０℃で１０分間変性させた。変性後、試料を３５μＬの水で希釈した。調製したアッセイプレートを、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ機器で測定するまで室温で保存した。
【0397】
測定後、ＬａｂＣｈｉｐ Ｒｅｖｉｅｗｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを分析した。相対ピーク面積が０．８５％以上の全てのピークを積分した。残りのインタクトな分子の相対ピーク面積［％］をＤＴＴ濃度に対してプロットし、曲線を４パラメータロジスティックモデル／シグモイド用量応答モデル（Ｘｌｆｉｔ、用量反応の一部位、モデル２０５）によってフィッティングした。ＤＴＴを添加していない試料の面積を標準化のために使用し、１００％に設定した。インタクトな分子の５０％が残っている各試料のＤＴＴ濃度をＥＣ５０値として使用して、還元に対する分子の感受性を評価した。
【0398】
トリプシンペプチドマッピング実験のための還元アッセイ後の抗体試料調製
還元感受性アッセイを行った後、試料を消化手順に供した。抗体試料あたり１００μｇを、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ヒスチジン、５．６ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジニウムｐＨ６を使用して、０．５ｍＬ Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８９８８３）との緩衝液交換によって変性させた。緩衝液交換を１回繰り返して、ＮＥＭの完全な除去を確実にした。次いで、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｔ２５５６）を３７℃で１時間添加することによって試料を還元した。その後、緩衝液を０．５ｍＬ Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８９８８３）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ヒスチジン、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＣＥＰ、ｐＨ６に交換した。抗体をトリプシンにより３７℃で一晩、１：２０の酵素対基質比で消化した。７μＬの１０％ギ酸溶液を添加することによって消化を停止し、試料を更なる分析まで－８０℃で凍結した。
還元感受性アッセイを行った後、試料を消化手順に供した。抗体試料あたり１００μｇを、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ヒスチジン、５．６ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジニウムｐＨ６を使用して、０．５ｍＬ Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８９８８３）との緩衝液交換によって変性させた。緩衝液交換を１回繰り返して、ＮＥＭの完全な除去を確実にした。次いで、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｔ２５５６）を３７℃で１時間添加することによって試料を還元した。その後、緩衝液を０．５ｍＬ Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８９８８３）で２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ヒスチジン、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＣＥＰ、ｐＨ６に交換した。抗体をトリプシンにより３７℃で一晩、１：２０の酵素対基質比で消化した。７μＬの１０％ギ酸溶液を添加することによって消化を停止し、試料を更なる分析まで－８０℃で凍結した。
【0399】
液体クロマトグラフィータンデム質量分析による修飾ペプチドの検出
ペプチドを、ＥＡＳＹ－ＥＴＤイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を備えたｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析計に連結されたＶａｎｑｕｉｓｈ（商標）Ｆｌｅｘ ＵＨＰＬＣシステムを使用して分析した。
ペプチド分離のために、二成分溶媒系を使用した：（Ａ）０．１％ギ酸及び（Ｂ）９０％アセトニトリル、０．１％ギ酸。トリプシン消化した試料２μｇを、直線的に漸増濃度の溶媒Ｂを用いて１時間の勾配で５０分間分離し、続いて９５％Ｂで５分間洗浄し、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤＴＭ Ｃ１８ ＬＣカラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒径１．９μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２５００３
－１５２１３０－Ｖ）で５％溶媒Ｂに５分間再平衡化した。カラム上で分離されたペプチドを、以下の重要な設定で検出された：質量範囲を３７５～２０００に設定し、自動利得制御（ＡＧＣ）の目標を４．０ｅ５とし、最大注入時間を５０ｍｓとし、１μスキャンを用いて、１２０，０００の分解能（２００ｍ／ｚで定義）で完全ＭＳスペクトルを取得した。２００ｍｓの注入時間内に５．０ｅ４ ＡＧＣ標的を蓄積した後、１５，０００の分解能（２００ｍ／ｚで定義）を使用して上位５データ依存モードでデータ依存（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルを取得した。イオンを１．６Ｔｈの単離ウィンドウで単離し、３０％正規化衝突エネルギーでＨＣＤ、ＥｔｈｃＤ又はＥｔｃｉＤを使用して断片化した。動的排除を１０秒に設定した。
ペプチドを、ＥＡＳＹ－ＥＴＤイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を備えたｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析計に連結されたＶａｎｑｕｉｓｈ（商標）Ｆｌｅｘ ＵＨＰＬＣシステムを使用して分析した。
ペプチド分離のために、二成分溶媒系を使用した：（Ａ）０．１％ギ酸及び（Ｂ）９０％アセトニトリル、０．１％ギ酸。トリプシン消化した試料２μｇを、直線的に漸増濃度の溶媒Ｂを用いて１時間の勾配で５０分間分離し、続いて９５％Ｂで５分間洗浄し、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤＴＭ Ｃ１８ ＬＣカラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒径１．９μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２５００３
－１５２１３０－Ｖ）で５％溶媒Ｂに５分間再平衡化した。カラム上で分離されたペプチドを、以下の重要な設定で検出された：質量範囲を３７５～２０００に設定し、自動利得制御（ＡＧＣ）の目標を４．０ｅ５とし、最大注入時間を５０ｍｓとし、１μスキャンを用いて、１２０，０００の分解能（２００ｍ／ｚで定義）で完全ＭＳスペクトルを取得した。２００ｍｓの注入時間内に５．０ｅ４ ＡＧＣ標的を蓄積した後、１５，０００の分解能（２００ｍ／ｚで定義）を使用して上位５データ依存モードでデータ依存（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルを取得した。イオンを１．６Ｔｈの単離ウィンドウで単離し、３０％正規化衝突エネルギーでＨＣＤ、ＥｔｈｃＤ又はＥｔｃｉＤを使用して断片化した。動的排除を１０秒に設定した。
【0400】
データ処理
取得したＭＳデータを、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔソフトウェア（ＧｅｎｅＤａｔａバージョン１３．５）を使用して処理し、正確な割り当て及び相対定量精度を確保するために手動で検査した。試料分子のアミノ酸配列に対してマススペクトルを検索した。重要な設定は、それぞれ１０ｐｐｍに設定されたＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルの質量公差である。検索パラメータ内で考慮された翻訳後修飾は、システインに対するＮＥＭ修飾及びＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔからのＩｇＧ Ｎ－グリカンライブラリを使用した一般的なＮ末端グリコシル化であった。
取得したＭＳデータを、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔソフトウェア（ＧｅｎｅＤａｔａバージョン１３．５）を使用して処理し、正確な割り当て及び相対定量精度を確保するために手動で検査した。試料分子のアミノ酸配列に対してマススペクトルを検索した。重要な設定は、それぞれ１０ｐｐｍに設定されたＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルの質量公差である。検索パラメータ内で考慮された翻訳後修飾は、システインに対するＮＥＭ修飾及びＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔからのＩｇＧ Ｎ－グリカンライブラリを使用した一般的なＮ末端グリコシル化であった。
【0401】
結果
ＥＣ５０値を、図２２に示されるような用量応答曲線から計算した。キャピラリー電気泳動（ｃＧＥ）によって測定されたＤＴＴによる非還元試料の主ピークの減少は、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ｗｔ、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ及びＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ－ＤＳＢについて同一であり、ＣＨ２ドメイン中のＡＤＥ変異も操作されたジスルフィド結合もタンパク質の還元感受性に影響を及ぼさないことを示している。
ＥＣ５０値を、図２２に示されるような用量応答曲線から計算した。キャピラリー電気泳動（ｃＧＥ）によって測定されたＤＴＴによる非還元試料の主ピークの減少は、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ｗｔ、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ及びＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ－ＤＳＢについて同一であり、ＣＨ２ドメイン中のＡＤＥ変異も操作されたジスルフィド結合もタンパク質の還元感受性に影響を及ぼさないことを示している。
【0402】
ペプチドマッピングによって分析された還元感受性アッセイからのタンパク質、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ｗｔ、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ及びＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ－ＤＳＢは、図２３Ａ（ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ｗｔ）、図２３Ｂ（ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ）及び図２３Ｃ（ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ－ＤＳＢ）に示すように、還元感受性分子間ジスルフィド結合（ＤＳＢ）の同様の還元挙動を示す。用量応答曲線に基づいて、ＥＣ５０値は、３つのタンパク質について１．２～１．５ ｍＭのＤＴＴの範囲にあると推定され、操作されたＤＳＢが典型的な分子間ＤＳＢと同様に還元安定性であることを示している。
【0403】
ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ｗｔ、ＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ及びＣＯＤＶ－ＯＬ１ ＡＤＥ－ＤＳＢ－発現収率
抗体を以下のように作製した：
対応するコンストラクトの異なる鎖をコードする発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５ａで増殖させた。トランスフェクションに使用したプラスミドを、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から調製した。Ｆ１７無血清懸濁培養 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で成長するＨＥＫ ２９３－ＦＳ細胞を、ポリエチレンイミントランスフェクション試薬を使用して示されたプラスミドでトランスフェクトした。８％ＣＯ２で３７℃で６日間培養した後、遠心分離によって細胞を除去し、上清を０．２２μｍフィルタに通して粒子を除去した。タンパク質をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ）で捕捉し、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９で中和した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２６／６０（Ｃｙｔｉｖａ）及び０．２２μｍ濾過及びＵＶ２８０濃度決定を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってタンパク質を研磨した後、タンパク質を更なる特性評価に使用した。収率を以下の表１４に報告する。
抗体を以下のように作製した：
対応するコンストラクトの異なる鎖をコードする発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５ａで増殖させた。トランスフェクションに使用したプラスミドを、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から調製した。Ｆ１７無血清懸濁培養 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で成長するＨＥＫ ２９３－ＦＳ細胞を、ポリエチレンイミントランスフェクション試薬を使用して示されたプラスミドでトランスフェクトした。８％ＣＯ２で３７℃で６日間培養した後、遠心分離によって細胞を除去し、上清を０．２２μｍフィルタに通して粒子を除去した。タンパク質をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（Ｃｙｔｉｖａ）で捕捉し、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９で中和した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ２６／６０（Ｃｙｔｉｖａ）及び０．２２μｍ濾過及びＵＶ２８０濃度決定を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってタンパク質を研磨した後、タンパク質を更なる特性評価に使用した。収率を以下の表１４に報告する。
【0404】
【表14】
【0405】
正常なＩｇＧ１ Ｆｃ骨格を有する抗体は、２５．２ｍｇ／Ｌの試料収率を実証したが、Ｆｃ骨格にＡＤＥ又はＤＥ変異を有する抗体は、試料収率において５ｍｇ／Ｌ未満の強い減少を示す。ＡＤＥ又はＤＥ変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ及びジスルフィド結合を有する抗体は、ＷＴと同様の試料収率を実証した。
【0406】
実施例１２：ＢＣＭＡ陽性ＲＰＭＩ ８２２６ ＭＭ腫瘍細胞とＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢとの共培養におけるＰＢＭＣ中のインビトロサイトカイン放出
材料及び方法
ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３のインビトロ安全性手順（ＰＢＭＣ＋ＭＭ １Ｒ－ＲＦＰ、エフェクター：標的比＝３：１）
ＰＢＭＣ精製の１日後、ＰＢＭＣとＭＭ１Ｒ－ＲＦＰの両方をＶｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲでカウントした（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ）。
材料及び方法
ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３のインビトロ安全性手順（ＰＢＭＣ＋ＭＭ １Ｒ－ＲＦＰ、エフェクター：標的比＝３：１）
ＰＢＭＣ精製の１日後、ＰＢＭＣとＭＭ１Ｒ－ＲＦＰの両方をＶｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲでカウントした（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ）。
【0407】
標的細胞：ＭＭ１Ｒ細胞株をＡＴＣＣ／Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＢＤＷから購入し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅインキュベーターを用いて数日間にわたって追跡することができるｍＫａｔｅ２ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＦＰ）を発現させるために、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄレンチウイルス（ＥｓｓｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、参照番号４４７６）でトランスフェクトした。ＭＭ１Ｒ－ＲＦＰ細胞の選択は、培養培地［２０％のウシ胎児血清熱不活性化ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、参照番号Ｓ１４０Ｈ－１００）及び１％のＬ－グルタミン２００ｍＭ（１００倍）（Ｄｅｎｍａｒｋ、ＧＩＢＣＯ、参照番号２５０３０－０２４）を含むＲＰＭＩ培地１６４０（１倍）（ＧＩＢＣＯ、Ｄｅｎｍａｒｋ、参照番号３１８７０－０２５）］中の最終濃度１μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩化物水和物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ、参照番号１０７８１６９１）の添加（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）によって得た。
【0408】
ＭＭ１Ｒ－ＲＦＰは半接着性細胞であるため、培養培地を除去し、Ｎｕｎｃ ＥａｓＹフラスコ７５ｃｍ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を洗浄するために使用した５ｍｌのＰＢＳ １倍と共に５０ｍｌファルコンチューブに入れた。１ｍｌ／７５ｃｍ２フラスコのＡｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、参照番号２５－０５８－ＣＩ）を添加することによって、残りの接着細胞を剥離した。アキュターゼの作用を３７℃で５分後に９ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ＋２０％ＦＢＳ、最終容量１０ｍｌ）で停止させ、ＭＭ１Ｒ－ＲＦＰ細胞をＶｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲにおいて計数した。適切な数の細胞を調製し、３：１のＥ：Ｔ比を持つように、３０ ０００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）の密度で播種した。
【0409】
抗体：全てのＡｂをＲＰＭＩ培養培地中で２倍濃縮して調製する（５０μｌの標的細胞＋１００μｌのＡｂ ２Ｘ＋５０μｌのＰＢＭＣを各ウェルに添加したため）。実験に使用した抗体をＤｅｅｐｗｅｌｌプレート（Ａｘｉｇｅｎ、参照番号Ｐ－ＤＷ－１１－Ｃ－
Ｓ）中の培地で１／１００倍希釈した。初期濃度が１００ｎＭ（約２００ｎＭ）であったＣＤ３－ＢＣＭＡ Ｔ細胞エンゲージャーを除いて、全てのＡｂの出発濃度は１０００ｎＭ（約２０００ｎＭが計算された）であり、３回の希釈を行った。
Ｓ）中の培地で１／１００倍希釈した。初期濃度が１００ｎＭ（約２００ｎＭ）であったＣＤ３－ＢＣＭＡ Ｔ細胞エンゲージャーを除いて、全てのＡｂの出発濃度は１０００ｎＭ（約２０００ｎＭが計算された）であり、３回の希釈を行った。
【0410】
エフェクター細胞：総ＰＢＭＣを３００ ０００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）の密度で調製した（Ｅ：Ｔ比３：１）。計数後、必要な数のＰＢＭＣを３００ｇで５分間遠心分離し（加速度＝９、ブレーキ＝９）、最終濃度が２００μｌの最終容量／ウェルで１ｍｇ／ｍｌになるように、４ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、参照番号Ｉ４５０６）を含む適切な容量のＲＰＭＩ培養培地に再懸濁した：［５０μｌのＭＭ１ Ｒ－ＲＦＰ＋１００μｌの抗体（２倍）＋５０μｌのＰＢＭＣ］。
【0411】
細胞を９６ウェルプレートのポリＤ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、参照番号６５５９４６）に播種し、外部ウェルを２００μｌのＰＢＳ １倍で満たした。
【0412】
腫瘍細胞（５０μｌ／ウェル）＋Ａｂ（１００μｌ／ウェル）＋ＰＢＭＣ（５０μｌ／ウェル）を播種した後、プレートを室温で１分間１００ｇで遠心分離し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）のインキュベーターに入れたが、温度の差を避けるためにプレートを少なくとも３０分後にのみ読み取った。
【0413】
以下のパラメータを使用して、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３上のプレートを読み取った：分析タイプ（Ｂａｓｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）、ＲＥＤ、対物レンズ１０倍、４画像／ウェル、時点４８時間（４時間ごとの画像）、取得時間４００ｍｓ。
【0414】
４８時間後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅスキャナーを停止させ、プレートを３００ｇで５分間遠心分離し、次いで、１００μｌの上清／ウェルを採取して、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｉ（４－Ｐｌｅｘ）Ｋｉｔ Ｖ－Ｐｌｅｘによるサイトカイン放出の分析を行った。
【0415】
ヒト前炎症性Ｉ（４－Ｐｌｅｘ）キットＶ－Ｐｌｅｘによるサイトカイン放出の分析のための手順
サイトカイン放出の分析のために、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｉ（４－Ｐｌｅｘ）キットＶ－Ｐｌｅｘを使用した（ＭＳＤ、参照番号Ｋ１５０５２Ｄ－１）。
サイトカイン放出の分析のために、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｉ（４－Ｐｌｅｘ）キットＶ－Ｐｌｅｘを使用した（ＭＳＤ、参照番号Ｋ１５０５２Ｄ－１）。
【0416】
最初に、対照範囲を調製した：凍結乾燥チューブを１０００μｌの希釈剤２（校正器、参照番号Ｃ００４９－２）で再開し、３０分間静置した。希釈剤２（すなわち、７５μｌのＣｘ＋２２５μｌの希釈剤２）で１／４の７つの連続希釈を行った。最後の管ｎ８を陰性対照（希釈剤２単独＝０）とみなした一方、チューブではｎであった。１出発溶液は希釈しなかった。
【0417】
続いて、ＤＡＲＴ（すなわち、５０μｌ／ウェル、５μｌＤＡＲＴ／濃度＋４９５μｌ希釈剤２の調製）については１／１００、他の抗体については１／５（すなわち、５０μｌ／ウェル、１００μｌ Ａｂ／濃度＋４００μｌ希釈剤２の調製）の希釈で試料を調製した。
【0418】
二次抗体を希釈液３：１００μｌのＩＦＮγ＋１００μｌのＩＬ１β＋１００μｌのＩＬ６＋１００μｌのＴＮＦα＋４６００μｌの希釈液３（最終容量５ｍｌ）中で調製し、次いで、２５μｌの二次Ａｂ混合物を全てのウェルに分配した。
【0419】
試料をプレートに添加する前に、プレートを１５０μｌのＰＢＳ １Ｘ ｔｗｅｅｎ
０．０５％（ＰＢＳ １Ｘ １Ｌ中の５００μｌのＴｗｅｅｎ２０を用いて調製した洗浄緩衝液）で３回洗浄した。次いで、５０μｌ／ウェルの試験される希釈試料及び５０μｌ／ウェルの標準範囲を添加した。プレートをフィルムで覆い、室温で撹拌しながら２時間放置した。
０．０５％（ＰＢＳ １Ｘ １Ｌ中の５００μｌのＴｗｅｅｎ２０を用いて調製した洗浄緩衝液）で３回洗浄した。次いで、５０μｌ／ウェルの試験される希釈試料及び５０μｌ／ウェルの標準範囲を添加した。プレートをフィルムで覆い、室温で撹拌しながら２時間放置した。
【0420】
プレートを１５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、２５μｌの二次Ａｂを試料に添加し（二次Ａｂのより良好な分布のためにプレートをタップした）、プレートを再びフィルムで覆い、室温で撹拌しながら２時間放置した。１５０μｌの洗浄緩衝液で洗浄する３工程を行い、１５０μｌの読み取り緩衝液を全てのウェルに添加した［Ｈ２Ｏ中の１／２希釈によって調製した読み取り緩衝液（４倍）］。プレートをＭＳＤ装置１２５０に読み取った。
【0421】
結果
図２４Ａ及び図２４Ｂに示すように、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢは、ＢＣＭＡ発現細胞の強力な細胞傷害性を媒介したが、共培養物中のＰＢＭＣからのサイトカイン放出は最小限であった。図２５Ａ及び図２５Ｂに示すように、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢはまた、サイトカイン放出を最小限に誘発しながら、低下したＭＭ１Ｒ腫瘍細胞増殖を媒介した。インビトロでのサイトカイン放出の減少は、好ましい安全性プロファイルを示す。
図２４Ａ及び図２４Ｂに示すように、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢは、ＢＣＭＡ発現細胞の強力な細胞傷害性を媒介したが、共培養物中のＰＢＭＣからのサイトカイン放出は最小限であった。図２５Ａ及び図２５Ｂに示すように、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢはまた、サイトカイン放出を最小限に誘発しながら、低下したＭＭ１Ｒ腫瘍細胞増殖を媒介した。インビトロでのサイトカイン放出の減少は、好ましい安全性プロファイルを示す。
【0422】
実施例１３．ＭＭ細胞の存在下での休止期ＮＫ細胞によるＮＫ細胞活性化及びサイトカイン／ケモカイン産生に対するＮＫＣＥのインビトロ特性評価。
この実施例は、ＢＣＭＡ陽性細胞株（ＲＰＭＩ ８２２６多発性骨髄腫細胞）の存在下でのＮＫ細胞の活性化及びサイトカイン／ケモカイン産生に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢのインビトロ有効性の特徴付けに向けられている。
この実施例は、ＢＣＭＡ陽性細胞株（ＲＰＭＩ ８２２６多発性骨髄腫細胞）の存在下でのＮＫ細胞の活性化及びサイトカイン／ケモカイン産生に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢのインビトロ有効性の特徴付けに向けられている。
【0423】
材料及び方法
末梢血単核細胞：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートをＲＰＭＩで約１／５に希釈し、室温のＰａｎｃｏｌｌチューブに移した。チューブをブレーキなしで８００ｇで２０分間遠心分離した。最初の細胞洗浄を、ブレーキを用いて室温で１０分間、４００ｇでの遠心分離を用いてＲＰＭＩ中で行った。細胞の２回目の洗浄を、ブレーキを用いて室温で１０分間、１３０ｇでの遠心分離を用いてＲＰＭＩ中で行った。
末梢血単核細胞：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートをＲＰＭＩで約１／５に希釈し、室温のＰａｎｃｏｌｌチューブに移した。チューブをブレーキなしで８００ｇで２０分間遠心分離した。最初の細胞洗浄を、ブレーキを用いて室温で１０分間、４００ｇでの遠心分離を用いてＲＰＭＩ中で行った。細胞の２回目の洗浄を、ブレーキを用いて室温で１０分間、１３０ｇでの遠心分離を用いてＲＰＭＩ中で行った。
【0424】
ＮＫ細胞の採取：ヒトＮＫ細胞を、ＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、供給業者によって推奨されるプロトコルに従って、手動磁気標識及びその後のＬＳカラムによる手動分離を用いたネガティブ選択によってＰＢＭＣ試料から精製した。次いで、ＮＫ細胞を、活性化アッセイに使用する前に、３７±１℃、５±１％ＣＯ２で約２４時間、１×１０６細胞／ｍＬの完全ＲＰＭＩ中で培養した（いわゆる「休止期」ＮＫ細胞）。
【0425】
エフェクター細胞の生存基準を９０％以上に設定した。休止期ＮＫ細胞上のＣＤ１６ａ及びＮＫｐ４６の両方の細胞表面発現を、実験当日にフローサイトメトリーによって監視した。
【0426】
ＮＫ細胞活性化アッセイ
ＮＫＣＥ分子をＵ底９６ウェルプレートのウェルに添加した。５０，０００個の休止期（例えば、活性化されていない）ＮＫ細胞及び５０，０００個のＲＰＭＩ ８２２６ ＭＭ細胞を各ウェルに連続的に添加して、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を得た。対照条件は、各ウェルに５０，０００個の休止期ＮＫ細胞のみを添加することによって実施した。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液を各ウェル（対照及び実験）に１／１５００の最終希釈で添加して、細胞外の細胞内タンパク質輸
送を遮断し、ゴルジ複合体にサイトカインを蓄積させた。１２５ｎｇ／ｍＬの最終濃度のホルボール１２ミリステート１３アセテート（ＰＭＡ）及び５０，０００個の休止期ＮＫ細胞に添加した１μｇ／ｍＬの最終濃度のイオノマイシンを使用することによって、ＮＫ細胞活性化の陽性対照を行った。各条件を一連（ｓｉｍｐｌｉｃａｔｅ）で実施した。
ＮＫＣＥ分子をＵ底９６ウェルプレートのウェルに添加した。５０，０００個の休止期（例えば、活性化されていない）ＮＫ細胞及び５０，０００個のＲＰＭＩ ８２２６ ＭＭ細胞を各ウェルに連続的に添加して、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を得た。対照条件は、各ウェルに５０，０００個の休止期ＮＫ細胞のみを添加することによって実施した。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液を各ウェル（対照及び実験）に１／１５００の最終希釈で添加して、細胞外の細胞内タンパク質輸
送を遮断し、ゴルジ複合体にサイトカインを蓄積させた。１２５ｎｇ／ｍＬの最終濃度のホルボール１２ミリステート１３アセテート（ＰＭＡ）及び５０，０００個の休止期ＮＫ細胞に添加した１μｇ／ｍＬの最終濃度のイオノマイシンを使用することによって、ＮＫ細胞活性化の陽性対照を行った。各条件を一連（ｓｉｍｐｌｉｃａｔｅ）で実施した。
【0427】
３７±１℃で４時間共インキュベートした後、フローサイトメトリー分析のために細胞外マーカー（ＣＤ３、Ｃｄ５６、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ及びＣＤ１０７ｂ）について染色を行うことによって細胞を染色した。固定及び透過化工程の後、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＭＩＰ１βについて細胞内染色を行った。細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して最後の染色後１５分間固定し、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ－２０を用いたフローサイトメトリーによって分析した。ＦＳＣ－Ａ、ＦＳＣ－Ｈ、ＦＳＣ－Ｗ、ＳＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ｈ、ＳＳＣ－Ｗ、ＦＬ－１、ＦＬ－３、ＦＬ－６、ＦＬ－７、ＦＬ－９、ＦＬ－１３及びＦＬ－１６パラメータをＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアで記録し、分析をＦｌｏｗＪｏソフトウェアで行った。
【0428】
ＮＫ細胞活性化のパーセント及び活性化マーカーの蛍光強度中央値（ＭｅｄＦＩ）の分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて行った。活性化の最上位値は、観察された最大活性化に対応していた。最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値は、以下の式に対応する４パラメータロジスティクス非線形回帰モデルを使用して計算した。
【数2】
【0429】
ＥＣ５０と同じモデルを使用して、活性化の底部の計算値、活性化の最上位計算値、傾き及び９５％信頼区間（ＣＩ）値を計算した。
【0430】
休止期ＮＫ細胞及び標的細胞の純度及び表現型についてのフローサイトメトリー分析
ＮＫ細胞活性化実験に使用した休止期ＮＫ細胞を、純度、ＣＤ１６ａの発現、及びＮＫｐ４６に関して分析した。ＲＰＭＩ ８２２６ ＭＭ細胞を、ＣＤ３２及びＢＣＭＡの発現について分析した。
ＮＫ細胞活性化実験に使用した休止期ＮＫ細胞を、純度、ＣＤ１６ａの発現、及びＮＫｐ４６に関して分析した。ＲＰＭＩ ８２２６ ＭＭ細胞を、ＣＤ３２及びＢＣＭＡの発現について分析した。
【0431】
実験当日に、休止期ＮＫ細胞及び標的細胞の染色を行った。１×１０５細胞／ウェルを、色素に結合した抗体（アロフィコシアニン、パシフィックブルー、又はフィコエリトリン）を用いてＵ底９６ウェルプレートで染色した。
【0432】
結果；
ＮＫ細胞活性化を以下によって評価した：１）細胞表面における活性化マーカー（ＣＤ６９及びＣＤ１０７ａ／ｂ）の発現、並びに２）サイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα）及びケモカイン（ＭＩＰ１β）の細胞内産生。７名のＮＫ細胞ドナーを研究で評価した。
ＮＫ細胞活性化を以下によって評価した：１）細胞表面における活性化マーカー（ＣＤ６９及びＣＤ１０７ａ／ｂ）の発現、並びに２）サイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα）及びケモカイン（ＭＩＰ１β）の細胞内産生。７名のＮＫ細胞ドナーを研究で評価した。
【0433】
図２６Ａ～図２６Ｄに示すように、ＲＰＭＩ ８２２６ ＭＭ細胞の非存在下では、陽性対照であるＰＭＡ－イオノマイシンは、ＣＤ６９及びＣＤ１０７ａ／ｂの発現を誘導することによってＮＫ細胞を活性化した。対照的に、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ及び対照ＮＫＣＥは、４．８８ｎｇ／ｍＬからの非シグモイド用量応答活性化を誘導し、ＣＤ６９陽性細胞の約４０％（１５０前後のＣＤ６９ ＭｅｄＦＩ）及びＣＤ１０７陽性細胞の１４％（９０前後のＣＤ１０７ ＭｅｄＦＩ）の最高濃度（４．８８μｇ／ｍＬ）に達した。
【0434】
ＲＰＭＩ ８２２６ ＭＭ細胞の存在下では、ＮＫ細胞は分子の非存在下で活性化され
なかった。対照ＮＫＣＥの添加は、標的細胞の非存在下で得られた活性化と同様に、ＮＫ細胞の低レベルの活性化を誘導した。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの添加は、対照ＮＫＣＥで得られた活性化よりも高いＮＫ細胞活性化のためのシグモイド用量応答を誘導した。より正確には、ＣＤ６９発現（陽性細胞の約６０％及びＮＫ細胞上の３５１のＭｅｄＦＩ）及びＣＤ１０７ａ／ｂ発現（陽性細胞の約２２％及びＮＫ細胞上の１３２のＭｅｄＦＩ）について約４８．８ｎｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢについて飽和相が観察された（表１５）。
なかった。対照ＮＫＣＥの添加は、標的細胞の非存在下で得られた活性化と同様に、ＮＫ細胞の低レベルの活性化を誘導した。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの添加は、対照ＮＫＣＥで得られた活性化よりも高いＮＫ細胞活性化のためのシグモイド用量応答を誘導した。より正確には、ＣＤ６９発現（陽性細胞の約６０％及びＮＫ細胞上の３５１のＭｅｄＦＩ）及びＣＤ１０７ａ／ｂ発現（陽性細胞の約２２％及びＮＫ細胞上の１３２のＭｅｄＦＩ）について約４８．８ｎｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢについて飽和相が観察された（表１５）。
【0435】
【表15】
【0436】
ＣＤ６９発現についてＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢについて飽和相及びシグモイド用量応答が得られたので、ＥＣ５０を７名の選択されたドナーから抽出した（表１６）。ＣＤ１０７ａ／ｂの産生レベル（７名のドナーのうち３名について陽性細胞の約２０％以下）を考慮すると、ＣＤ１０７ａ／ｂ活性化マーカーについてＥＣ５０は推定されなかった。
【0437】
【表16】
【0438】
ＮＫ細胞によるＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＭＩＰ１βの分泌
同じ実験において、ＮＫ細胞による細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）及びケモカインＭＩＰ１βの産生を測定した。ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＭＩＰ１βの放出は、ＮＫ細胞活性化に比例した：より高いＮＫ細胞活性化は、より高いサイトカイン／ケモカイン産生をもたらした（図２７Ａ～図２７Ｆ）。
同じ実験において、ＮＫ細胞による細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）及びケモカインＭＩＰ１βの産生を測定した。ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＭＩＰ１βの放出は、ＮＫ細胞活性化に比例した：より高いＮＫ細胞活性化は、より高いサイトカイン／ケモカイン産生をもたらした（図２７Ａ～図２７Ｆ）。
【0439】
ＲＰＭＩ ８２２６ ＭＭ細胞及びＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢが存在しない場合、検出可能なＴＮＦα及びＩＦＮγはＮＫ細胞によって産生されなかったが、ＭＩＰ１βはＮＫ細胞の約８０％によって産生された。陽性対照（ＰＭＡ－イオノマイシン）の添加は、ＮＫ細胞によるＴＮＦα（Ｄ５８４については約８４％）、ＩＦＮγ（Ｄ５８４については約８３％）の産生を誘導し、ＭＩＰ１β（Ｄ５８４については約１００％）を増加させた。対照的に、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの添加は、ＩＦＮγ及びＴＮＦαの非常に低い標的依存的発現を用量依存的様式で誘導し、陽性細胞の２０％未満の観察された活性化の最上位値（ＩＦＮγについては８±５％及びＴＮＦαについては１２±７％）が観察された。ＭＩＰ１βは、４．８８ｎｇ／ｍＬからなるＮＫ細胞によって産生され、２つの分子の用量応答において約９５％の陽性細胞（ＮＫ細胞上の約５４００のＭＩＰ１β ＭｅｄＦＩ）に達した。
【0440】
結果は、ＲＰＭＩ ８２２６ ＭＭ細胞単独の存在は、ＮＫＣＥ分子の非存在下でＮＫ細胞によるサイトカイン分泌を誘導するのに十分ではないことを示した。高濃度の対照ＮＫＣＥ分子の添加は、ＮＫ細胞によるサイトカインの低産生又は非常に低い産生を誘導し、シグモイド用量応答を伴うＭＩＰ１βの高産生を誘導した。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの添加は、サイトカイン及びケモカイン産生を誘導した。３つのサイトカイン／ケモカインについて、産生の最大レベルは、ドナーに応じて４．８８～４８．８ｎｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの範囲の濃度で達成された。試験した７名のドナーについて、ＴＮＦα又はＩＦＮγを産生するＮＫ細胞の割合は、それぞれ約１２±７（ＮＫ細胞上のＴＮＦα ＭｅｄＦＩ：３９±７）及び８±５（ＮＫ細胞上のＩＦＮγ ＭｅｄＦＩ：１３７±３０）であり、ＭＩＰ１βを産生するＮＫ細胞の割合は、最高ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ濃度で約９４±２（ＮＫ細胞上のＭＩＰβ ＭｅｄＦＩ：１０１４５±４４１６）であった（表１７）。
【0441】
飽和相及びシグモイド用量応答がＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＭＩＰ１β産生についてのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢについて得られたので、７名の試験ドナーからのＭＩＰ１βについて観察された活性化の最上位値（ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＭＩＰ１β）及びＥＣ５０が観察された。ＴＮＦα及びＩＦＮγ産生のレベル（陽性細胞の２０％未満）を考慮すると、これらの２つのサイトカインについてＥＣ５０は推定されなかった（表１８）。
【0442】
【表17】
【0443】
【表18】
【0444】
実施例１４：共培養されたヒトドナー全血細胞及びＲＰＭＩ（多発性骨髄腫）細胞株を使用したＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢのインビトロサイトカイン放出分析序論
このアッセイで観察された応答の変動性／範囲を評価するために、１１名のヒトドナーに由来する全血球を、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ又は陰性対照若しくは陽性対照のいずれかで処置したＲＰＭＩ－８２２６－ＲＦＰ細胞と共培養した。共培養物を３７℃で一晩、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）から調製した１、１０，１００及び３００μｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ又は以下の材料及び方法のセクションで詳述する陰性対照若しくは陽性対照と共にインキュベートした。処置対照群は、２つの陰性対照（未処置共培養及びアイソタイプ対照３００μｇ／ｍＬで処置した共培養）及び３つの陽性対照：ヒト抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子（２５μｇ／ｍＬ；ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標））、抗ＣＤ５２組換え抗体（アレムツズマブ１００μｇ／ｍＬ；Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（登録商標））、及び内部ＢＣＭＡ Ｔ細胞エンゲージャーツール化合物（ＴＣＥ－ＢＣＭＡ １００μｇ／ｍＬ）を含んだ。
このアッセイで観察された応答の変動性／範囲を評価するために、１１名のヒトドナーに由来する全血球を、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ又は陰性対照若しくは陽性対照のいずれかで処置したＲＰＭＩ－８２２６－ＲＦＰ細胞と共培養した。共培養物を３７℃で一晩、２つの異なるバッチ（ＣＥＲ又はＧＭＰ）から調製した１、１０，１００及び３００μｇ／ｍＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ又は以下の材料及び方法のセクションで詳述する陰性対照若しくは陽性対照と共にインキュベートした。処置対照群は、２つの陰性対照（未処置共培養及びアイソタイプ対照３００μｇ／ｍＬで処置した共培養）及び３つの陽性対照：ヒト抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化因子（２５μｇ／ｍＬ；ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標））、抗ＣＤ５２組換え抗体（アレムツズマブ１００μｇ／ｍＬ；Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（登録商標））、及び内部ＢＣＭＡ Ｔ細胞エンゲージャーツール化合物（ＴＣＥ－ＢＣＭＡ １００μｇ／ｍＬ）を含んだ。
【0445】
材料及び方法
ＲＰＭＩ ８２２６細胞株をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＵＳＡ）から得て、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）でトランスフェクトした。この修飾ＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中、＋３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。
ＲＰＭＩ ８２２６細胞株をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＵＳＡ）から得て、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）でトランスフェクトした。この修飾ＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中、＋３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。
【0446】
サイトカイン放出アッセイの日に、細胞を計数し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｅｌｃｏｍ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）で生存率について評価した。ＲＰＭＩ－８２２６－ＲＦＰ細胞を８００，０００細胞／ｍＬの濃度に調整し、２５μＬの細胞を９６ウェル組織培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）に２０，０００細胞／ウェルの最終密度でウェル当たり播種した。
【0447】
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ及び対照を、１０％ ｗ／ｖウシ胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地、ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）に溶解した。２５μＬのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ及び対照をウェルあたり三連で添加した。陰性対照は、培地のみ及び３００μｇ／ｍＬの最終濃度のアイソタイプ対照であった。それぞれの濃度を有する陽性対照を上に列挙し、図２８～図３２にも標識する。
【0448】
同意した１１名のドナーからの全血を、ナトリウム－ヘパリン抗凝固薬を含有する１０ｍＬバキュテーナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）チューブに静脈穿刺した。試料を穏やかに混合し、研究開始まで周囲条件下で維持した。ＲＰＭＩ－８２２６－ＲＦＰ細胞をＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ又は処置対照群のいずれかに添加した後、ドナーからの新鮮な全血試料（２００μＬ）をウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ２の加湿雰囲気中＋３７℃で２４時間インキュベートした。
【0449】
インキュベーション期間の終了時に、プレートを５００×ｇで１０分間遠心分離した。これらのプレートから血漿を採取し、次いで新しい９６ウェル細胞培養プレートに直接移し、次いで２０００×ｇで１０分間遠心分離して残りの細胞残屑を除去した。最終血漿試料を新しい９６ウェル培養プレートに移し、サイトカインレベルの即時評価に使用した。
【0450】
製造業者（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）の説明書に従って、ＭＳＤ Ｕ－ＰＬＥＸアッセイ（カタログ番号Ｋ１５０６７Ｌ－２；Ｌｏｔ番号４０４４７１）を使用して、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ；定量範囲０．３３～１０，２００ｐｇ／ｍＬ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ；定量範囲９．４５～２７，０００ｐｇ／ｍＬ）、インターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β；定量範囲０．３５～４４３０ｐｇ／ｍＬ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２；ｑ定量範囲１．２４～１９９０ｐｇ／ｍＬ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４；定量範囲０．１６～１，７８０ｐｇ／ｍＬ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６；定量範囲０．８９～２，０５０ｐｇ／ｍＬ）、インターロイキン－８（ＩＬ－８；定量範囲０．３５～２，１８０ｐｇ／ｍＬ）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０；定量範囲０．３５～３，７７０ｐｇ／ｍＬ）、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ（ＭＩＰ－１α；定量範囲１４．５～５，５８０ｐｇ／ｍＬ）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α；定量範囲０．６６～２，９４０ｐｇ／ｍＬ）のレベルについて血漿試料を評価した。
【0451】
サイトカインレベルを、較正標準からのシグナルを１／Ｙ２の重み付けで４パラメータロジスティック又はシグモイド用量反応モデルに当てはめることによって、各サイトカインに対する較正曲線を用いて定義した。サイトカイン濃度を決定するための計算を、ＭＳＤ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＷＯＲＫＢＥＮＣＨ解析バージョン４．０（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を使用して行い、濃度をｐｇ／ｍＬの単位で表した。
【0452】
サイトカインデータ（３連）を分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン９．１．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、３連間の変動係数（％ＣＶ）を計算した。底部制約を０に設定したシグモイド線量応答４パラメータ可変勾配計算を分析に使用した。技術的エラーが発生し、何も検出されなかった試料は、未検出（ＵＤ）として報告された。定量下限（ＬＬＯＱ）以下の濃度の試料をＬＬＯＱとして報告し、この値を全ての計算に使用した。定量の上限（ＵＬＯＱ）を超える濃度の試料を、得られた外挿値として報告し、この値を全ての計算に使用した。陰性対照（未処置共培養物）と比較して、各処置試料についてサイトカインレベルの倍数変化を計算した［全体平均（ＳＤあり）及び中央値（Ｑ１及びＱ３：第１及び第３の四分位数）］。
【0453】
結果
図２８～図３２に示すように、陽性対照、抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＴＣＥ－ＢＣＭＡは、陰性対照（未処置及びアイソタイプ対照）と比較した場合、ＩＦＮ－γ（図２８Ａ）、ＭＩＰ－１α（図２８Ｂ）、ＴＮＦ－α（図２９Ａ）、ＩＬ－１β（図２９Ｂ）、ＩＬ－６（図３０Ａ）、ＩＬ－８（図３０Ｂ）、ＩＬ－２（図３１Ａ）、ＧＭ－ＣＳＦ（図３１Ｂ）、ＩＬ－４（図３２Ａ）及びＩＬ－１０（図３２Ｂ）についてサイトカイン放出の強い増加を実証する。陽性対照、抗ＣＤ５２は、ＩＦＮ－γ（図２８Ａ）、ＩＬ－６（図３０Ａ）、ＭＩＰ－１α（図２８Ｂ）、ＩＬ－１β（図２９Ｂ）及びＩＬ－８（図３０Ｂ）のサイトカイン放出を誘導したが、ＩＬ－２（図２８Ａ）、ＩＬ－１０（図３１Ａ）、ＧＭ－ＣＳＦ（図３１Ｂ）又はＩＬ－４（図３２Ａ）等の典型的にＴ細胞応答に関連するサイトカインは誘導しなかった。異なることに、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢは、ＩＦＮ－γ（図２８Ａ）及びＭＩＰ－１α（図２８Ｂ）のみの分泌を誘導し、評価した他の全てのサイトカインの変化は報告されなかった。
図２８～図３２に示すように、陽性対照、抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＴＣＥ－ＢＣＭＡは、陰性対照（未処置及びアイソタイプ対照）と比較した場合、ＩＦＮ－γ（図２８Ａ）、ＭＩＰ－１α（図２８Ｂ）、ＴＮＦ－α（図２９Ａ）、ＩＬ－１β（図２９Ｂ）、ＩＬ－６（図３０Ａ）、ＩＬ－８（図３０Ｂ）、ＩＬ－２（図３１Ａ）、ＧＭ－ＣＳＦ（図３１Ｂ）、ＩＬ－４（図３２Ａ）及びＩＬ－１０（図３２Ｂ）についてサイトカイン放出の強い増加を実証する。陽性対照、抗ＣＤ５２は、ＩＦＮ－γ（図２８Ａ）、ＩＬ－６（図３０Ａ）、ＭＩＰ－１α（図２８Ｂ）、ＩＬ－１β（図２９Ｂ）及びＩＬ－８（図３０Ｂ）のサイトカイン放出を誘導したが、ＩＬ－２（図２８Ａ）、ＩＬ－１０（図３１Ａ）、ＧＭ－ＣＳＦ（図３１Ｂ）又はＩＬ－４（図３２Ａ）等の典型的にＴ細胞応答に関連するサイトカインは誘導しなかった。異なることに、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢは、ＩＦＮ－γ（図２８Ａ）及びＭＩＰ－１α（図２８Ｂ）のみの分泌を誘導し、評価した他の全てのサイトカインの変化は報告されなかった。
【0454】
未処置全血及びＲＰＭＩ ８２２６－ＲＦＰ共培養物（陰性対照）と比較した場合、試験した全ての濃度（１、１０，１００、及び３００μｇ／ｍＬ）でドナー全体でＩＦＮ－γ及びＭＩＰ－１αの明らかなＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ関連増加があった。（全ての試験濃度で）ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢと共にインキュベートした試料中のＩＦＮ－γレベル（図２８Ａ）は、陰性対照よりも高かったが（３～６倍）、陽性対照よりもはるかに低かった。ＩＦＮ－γの増加に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ関連濃度依存性はなく、レベルはアイソタイプ対照に匹敵し、ＩＦＮ－γ分泌が、ＢＣＭＡ結合活性に関連するのではなく、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢによるＮＫ細胞係合に関与することを示唆した。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ誘導性ＭＩＰ－１α（図２８Ｂ）レベルは、陰性対照よりもわずかに高かったが（１～３倍）、陽性対照よりも著しく低かった。試験した両方のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢバッチ（ＣＥＲ及びＧＭＰ）間でサイトカイン放出プロファイルに差はなかった。
【0455】
総合すると、結果は、ヒトにおけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ結果ｎｉ ＣＲＳのリスクが低いと考えられることを示している。これらの結果はまた、実施例１２に示されるインビトロサイトカイン放出アッセイ（ＰＢＭＣ）からの結果を裏付け
ており、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢが好ましい安全性プロファイルを有するという結論を支持する。
ており、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢが好ましい安全性プロファイルを有するという結論を支持する。
【0456】
実施例１５：ＮＫｐ４６二重特異性抗体に応答したＮＫ細胞活性化及びＭＭ細胞溶解の分析
序論
この実施例は、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢが、ＭＭ末梢血からのＮＫ細胞を活性化し、ＭＭ細胞死を誘導する能力を評価した。標的細胞としてのＫａｒｐａｓ ６２０ ＭＭを、漸増濃度のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ、アイソタイプ対照抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）又はダラツムマブ（１０ｍｇ／ｍｌ）の存在下、Ｅ：Ｔ比１０：１で、エフェクター細胞としてのＭＭ患者（ｎ＝１３、表１８）からのＰＢＭＣと共インキュベートした。
序論
この実施例は、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢが、ＭＭ末梢血からのＮＫ細胞を活性化し、ＭＭ細胞死を誘導する能力を評価した。標的細胞としてのＫａｒｐａｓ ６２０ ＭＭを、漸増濃度のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ、アイソタイプ対照抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）又はダラツムマブ（１０ｍｇ／ｍｌ）の存在下、Ｅ：Ｔ比１０：１で、エフェクター細胞としてのＭＭ患者（ｎ＝１３、表１８）からのＰＢＭＣと共インキュベートした。
【0457】
この目的のために、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢを使用して、ＭＭ診断時にＭＭ患者由来のＰＢＭＣと共インキュベートしたＫａｒｐａｓ ６２０ ＭＭ細胞（Ｎ＝２）、又は再発したＭＭ症例（Ｎ＝１１）を処置した。ＣＤ１３８発現の喪失によるＭＭ細胞死について、フローサイトメトリーによって試料を分析した。並行して、ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮｇ発現によるＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６ｄｉｍ）の活性化を評価した。
【0458】
材料及び方法
（１）細胞精製及び共培養条件。ＭＭ細胞溶解アッセイの前日に、密度勾配遠心分離後に単離されたＭＭ患者由来のＰＢＭＣをＣＤ３－ＰＥ及びＣＤ５６－ＡＰＣによって直ちに染色し、ＮＫ活性化前にフローサイトメトリーを使用して結果を分析してＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞の割合を決定した。ＮＫ細胞が５％を超えるリンパ球を表す場合、ＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳ（ＮＫ細胞を保存するための自然ファルマ由来のＦＣＳ）を含有する培養培地中に３７℃及び５％ＣＯ２で一晩維持した。１０：１の比の休止期ＰＢＭＣ及びＭＭ標的細胞株を、試験した分子の存在下で４時間共培養した。次いで、（ｉ）ＮＫ細胞上の活性化マーカー（ＣＤ１０７ａ）の発現及びサイトカイン（ＩＦＮｇ）の細胞内産生、並びに（ｉｉ）ＭＭ細胞死（ＣＤ１３８）をフローサイトメトリーによって分析した。
（１）細胞精製及び共培養条件。ＭＭ細胞溶解アッセイの前日に、密度勾配遠心分離後に単離されたＭＭ患者由来のＰＢＭＣをＣＤ３－ＰＥ及びＣＤ５６－ＡＰＣによって直ちに染色し、ＮＫ活性化前にフローサイトメトリーを使用して結果を分析してＣＤ３－／ＣＤ５６＋細胞の割合を決定した。ＮＫ細胞が５％を超えるリンパ球を表す場合、ＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳ（ＮＫ細胞を保存するための自然ファルマ由来のＦＣＳ）を含有する培養培地中に３７℃及び５％ＣＯ２で一晩維持した。１０：１の比の休止期ＰＢＭＣ及びＭＭ標的細胞株を、試験した分子の存在下で４時間共培養した。次いで、（ｉ）ＮＫ細胞上の活性化マーカー（ＣＤ１０７ａ）の発現及びサイトカイン（ＩＦＮｇ）の細胞内産生、並びに（ｉｉ）ＭＭ細胞死（ＣＤ１３８）をフローサイトメトリーによって分析した。
【0459】
（２）細胞調製及び処置並びに対照群の条件。３００，０００個のＰＢＭＣ及び３０，０００個のＭＭ標的細胞（Ｋａｒｐａｓ ６２０）を採取し、Ｕ底９６ウェルプレートの各ウェルに計数して、エフェクターを得た：１０：１の比の標的（Ｅ：Ｔ）細胞比。４００，０００個のＰＢＭＣを、患者のＮＫ細胞の最小限の表現型検査（ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６）のためにインキュベーター内に保った。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、ＢＤ ＧｏｌｇｉＳＴＯＰ（商標）溶液（１／６０００）を含有する培地に再懸濁し、ウェルあたり３００，０００個のＰＢＭＣ及び３０，０００個のＭＭ細胞で分注した。対照条件は以下の通りであった：陰性対照は、処置を加えていないＫａｒｐａｓ
６２０、ＰＢＭＣ及びＫａｒｐａｓ ６２０＋ＰＢＭＣであった。ＮＫ活性化の陽性対照は、１２５ｎｇ／ｍｌのＰｈｏｒｂｏｌ １２ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３ ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ、参照Ｐ８１３９）及び１ｍｇ／ｍｌのイオノマイシン（シグマ、参照Ｉ０６３４）で処置したＰＢＭＣであった。処置群はアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ（１０ｍｇ／ｍｌ）を共培養試料に３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で４時間添加した。処置を加える前に、抗体を＋４℃で１０分間１６０００×ｇで遠心分離して、潜在的な凝集体を除去した。
６２０、ＰＢＭＣ及びＫａｒｐａｓ ６２０＋ＰＢＭＣであった。ＮＫ活性化の陽性対照は、１２５ｎｇ／ｍｌのＰｈｏｒｂｏｌ １２ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３ ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ、参照Ｐ８１３９）及び１ｍｇ／ｍｌのイオノマイシン（シグマ、参照Ｉ０６３４）で処置したＰＢＭＣであった。処置群はアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ（１０ｍｇ／ｍｌ）を共培養試料に３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で４時間添加した。処置を加える前に、抗体を＋４℃で１０分間１６０００×ｇで遠心分離して、潜在的な凝集体を除去した。
【0460】
（３）染色及びフローサイトメトリー分析。３７±１℃及び５±１％ＣＯ２での４時間のコインキュベーションの後、細胞をフローサイトメトリー分析のために細胞外又は細胞内で染色した。（３ａ）細胞外染色。細胞をＶ底プレートに移し、１９００×ｇで１分間
遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄し、再び１９００×ｇで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。５０μｌのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＢＳＡ／Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ ｐｌｕｓ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを各試料に添加した。ＮＫ活性化及びＭＭ細胞死解析に用いた抗体を以下の表１９に示す。その後、細胞を暗所で４℃で２０分間インキュベートした。最後に、細胞を２００μｌの染色緩衝液で洗浄し、１９００ｇで１分間遠心分離し、上清を廃棄した（２回）。（３ｂ）細胞内染色。細胞を１００ｍｌのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍに再懸濁し、暗所で４℃で２０分間インキュベートした。細胞を２００μｌの１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液（蒸留Ｈ２Ｏ中の１０×ＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液）で２回洗浄し、１９００ｇで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を５０μｌの抗体マスターミックス＋ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間暗所でインキュベートした。その後、細胞を２００μｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、１９００ｇで１分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、細胞を２００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー分析を行った。取得前に、ＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各抗体フルオロフォアで染色して、適切な蛍光補償対照を設定した。結果を、ＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ Ａ５及びＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析を行った。
遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄し、再び１９００×ｇで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。５０μｌのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＢＳＡ／Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ ｐｌｕｓ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを各試料に添加した。ＮＫ活性化及びＭＭ細胞死解析に用いた抗体を以下の表１９に示す。その後、細胞を暗所で４℃で２０分間インキュベートした。最後に、細胞を２００μｌの染色緩衝液で洗浄し、１９００ｇで１分間遠心分離し、上清を廃棄した（２回）。（３ｂ）細胞内染色。細胞を１００ｍｌのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍに再懸濁し、暗所で４℃で２０分間インキュベートした。細胞を２００μｌの１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液（蒸留Ｈ２Ｏ中の１０×ＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液）で２回洗浄し、１９００ｇで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を５０μｌの抗体マスターミックス＋ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間暗所でインキュベートした。その後、細胞を２００μｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、１９００ｇで１分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、細胞を２００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー分析を行った。取得前に、ＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各抗体フルオロフォアで染色して、適切な蛍光補償対照を設定した。結果を、ＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ Ａ５及びＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析を行った。
【0461】
【表19】
【0462】
結果
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢによって誘導されたＫａｒｐａｓ ６２０ ＭＭ細胞死を、フローサイトメトリーによってＣＤ１３８発現の喪失を測定することによって最初に分析した。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢは、疾患の病期にかかわらず、１３名のＭＭ患者のＰＢＭＣのうち１０名と共培養した場合、Ｋａｒｐａｓ ６２０ ＭＭ細胞死の誘導を実証した。予想されるように、アイソタイプ対照はＭＭ細胞死を誘導しない。興味深いことに、１０ｍｇ／ｍｌのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢによって誘導されたＭＭ細胞死は、有意であった（ｐ＝０．０１０５、図
３３Ａ）。
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢによって誘導されたＫａｒｐａｓ ６２０ ＭＭ細胞死を、フローサイトメトリーによってＣＤ１３８発現の喪失を測定することによって最初に分析した。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢは、疾患の病期にかかわらず、１３名のＭＭ患者のＰＢＭＣのうち１０名と共培養した場合、Ｋａｒｐａｓ ６２０ ＭＭ細胞死の誘導を実証した。予想されるように、アイソタイプ対照はＭＭ細胞死を誘導しない。興味深いことに、１０ｍｇ／ｍｌのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢによって誘導されたＭＭ細胞死は、有意であった（ｐ＝０．０１０５、図
３３Ａ）。
【0463】
並行して、ＮＫｄｉｍ細胞上のＩＦＮｇ及びＣＤ１０７ａ発現の測定によってＮＫ細胞活性化を誘導するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢの能力を評価した（図３３Ｂ及び図３３Ｃ）。ＩＦＮｇ及びＣＤ１０７ａの発現は、アイソタイプ対照よりもＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢに応答してより特異的に誘導される。
【0464】
まとめると、これらの結果は、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢが、原発性又は難治性のＭＭを有する患者を処置するための治療的可能性を有することを示している。
【0465】
実施例１６．ＭＭ患者試料に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢのエクスビボ機能活性
この実施例は、ＭＭ患者からの一次試料を使用して、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢがＭＭ細胞死を誘導する能力を評価する。細胞死を、ＣＤ１３８＋ＭＭ細胞の減少によって決定した。
この実施例は、ＭＭ患者からの一次試料を使用して、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢがＭＭ細胞死を誘導する能力を評価する。細胞死を、ＣＤ１３８＋ＭＭ細胞の減少によって決定した。
【0466】
材料及び方法
（１）細胞精製及び共培養条件。ＭＭ細胞死アッセイの日に、ＭＭ患者からの骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅを使用する密度勾配遠心分離によって単離し、抗ＣＤ１３８－ＰＥモノクローナル抗体で直ちに染色し、ＭＭ細胞（ＣＤ１３８＋細胞）の割合を決定するためにフローサイトメトリーを使用して分析した。ＢＭＭＣ又はＰＢＭＣを陰性対照又はＳＡＲ４４５５１４又はダラツムマブの存在下で１８時間インキュベートした。
（１）細胞精製及び共培養条件。ＭＭ細胞死アッセイの日に、ＭＭ患者からの骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅを使用する密度勾配遠心分離によって単離し、抗ＣＤ１３８－ＰＥモノクローナル抗体で直ちに染色し、ＭＭ細胞（ＣＤ１３８＋細胞）の割合を決定するためにフローサイトメトリーを使用して分析した。ＢＭＭＣ又はＰＢＭＣを陰性対照又はＳＡＲ４４５５１４又はダラツムマブの存在下で１８時間インキュベートした。
【0467】
（２）細胞調製及び処置並びに対照群の条件。４００，０００個のＢＭＭＣを、５％ＦＣＳ及び３ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－６を含有するＲＰＭＩ中のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。６００，０００個のＰＢＭＣを、患者ＮＫ細胞の最小限の表現型検査（ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６）のために、及びＭＭ細胞のＢＣＭＡ発現を決定するために、インキュベーター内に保った。対照条件は以下の通りであった：陰性対照は、処置を加えていないＢＭＭＣ又はＰＢＭＣであった。処置群は、アイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ）、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ（１０μｇ／ｍｌ）を３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で１８時間試料に添加した。処置を加える前に、抗体を＋４℃で１０分間１６０００×ｇで遠心分離して、潜在的な凝集体を除去した。
【0468】
（３）染色及びフローサイトメトリー分析。３７±１℃及び５±１％ＣＯ２での１８時間のコインキュベーションの後、細胞をフローサイトメトリー分析のために細胞外染色した。（３ａ）細胞をＶ底プレートに移し、１９００×ｇで１分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄し、再び１９００×ｇで１分間遠心分離した。上清を捨てた。５０μｌのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＢＳＡ／Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ ｐｌｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを各試料に添加し、暗所において４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２００μｌのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＢＳＡで洗浄し、１９００ｇで１分間遠心分離し、上清を捨てた。これを２回目に繰り返した。細胞をＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで５０μｌに再懸濁し、暗所で４℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を２００μＬのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＢＳＡ中で１回洗浄し、２００μＬのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＢＳＡに再懸濁させてフローサイトメトリー分析を実施した。
【0469】
試料取得前に、ＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各抗体フルオロフォアで染色して、適切な蛍光補償対照を設定した。試料及びｅＢｅａｄｓは、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えたＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ Ａ５を使用して取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析を行った。
【0470】
ＮＫ細胞活性化を、ＣＤ３－／ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞上のＣＤ１６、ＣＤ１０７ａ及びＣＤ６９発現によって評価した。骨髄腫細胞死をＣＤ１３８＋細胞の消失によって評価した。
【0471】
【表20】
【0472】
【表21】
【0473】
【表22】
【0474】
結果
ＭＭ患者試料（Ｎ＝１６）に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡのエクスビボ活性を試験した。このために、多発性骨髄腫患者由来のＢＭＭＣ又はＰＢＭＣを未処置とし、１０ｍｇ／ｍｌ ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢで処置し、又は１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照で１８時間処置した。ＭＭ細胞死を、フローサイトメトリーを使用するＣＤ１３８発現の喪失によって測定した。図１６Ａ～１６Ｃは、治療未経験患者からの試料におけるエクスビボＮＫｐ４６＝ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥ治療を、標準治療を事前に受けた者又は臨床試験に含まれた者と比較した結果を示す。患者試料は、ダラツムマブに対する治療未経験の場合、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ治療に対してより応答性であり（図１６Ａ）、患者が複数回の再発を有した場合、応答する可能性がわずかに低かった（図１６Ｂ）。図１６Ｃは、再発＞４ ＴＣ後に試料がＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢにあまり応答しなかったことを示す。
ＭＭ患者試料（Ｎ＝１６）に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡのエクスビボ活性を試験した。このために、多発性骨髄腫患者由来のＢＭＭＣ又はＰＢＭＣを未処置とし、１０ｍｇ／ｍｌ ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢで処置し、又は１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照で１８時間処置した。ＭＭ細胞死を、フローサイトメトリーを使用するＣＤ１３８発現の喪失によって測定した。図１６Ａ～１６Ｃは、治療未経験患者からの試料におけるエクスビボＮＫｐ４６＝ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥ治療を、標準治療を事前に受けた者又は臨床試験に含まれた者と比較した結果を示す。患者試料は、ダラツムマブに対する治療未経験の場合、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ治療に対してより応答性であり（図１６Ａ）、患者が複数回の再発を有した場合、応答する可能性がわずかに低かった（図１６Ｂ）。図１６Ｃは、再発＞４ ＴＣ後に試料がＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢにあまり応答しなかったことを示す。
【0475】
これらのデータは、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＮＫＣＥが、疾患の異なる段階（診断又は再発）のＭＭ患者からの試料においてＭＭ細胞死を誘導することを実証している。
【0476】
実施例１７．カニクイザルにおける反復皮下投与後の併用薬物動態（ＰＫ）及び安全性研究
方法及び材料
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢのストック溶液を、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．５、８％スクロース、０．０５％ＰＳ８０及び１０μＭ ＥＤＴＡ中５０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供した。
方法及び材料
ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢのストック溶液を、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．５、８％スクロース、０．０５％ＰＳ８０及び１０μＭ ＥＤＴＡ中５０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供した。
【0477】
用量レベル及び投与：両性（雄及び雌）の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢを１ｍＬ／ｋｇで週に１回（１、８、１５日目）、３週間皮下経路（ＳＣ、背部領域）で投与した。
【0478】
【表23】
【0479】
採取した試料：薬物動態（ＰＫ）及びサイトカイン評価のために血漿を採取した。
ＰＫ試料：ＰＫデータのための血漿試料を以下の時点で採取した：１日目、１、５、及び２４時間；８日目、０及び２４時間；１５日目、０、１、５、２４、及び１４４時間。
ＰＫ試料：ＰＫデータのための血漿試料を以下の時点で採取した：１日目、１、５、及び２４時間；８日目、０及び２４時間；１５日目、０、１、５、２４、及び１４４時間。
【0480】
サイトカイン（ＩＮＦ－ｇ、ＩＬ－６、ＩＬ－８及びＴＮＦ－ａ）評価：サンプリング時点は、処置前、各投薬の５時間後及び２４時間後であった（１、８、１５日目）。サンプリング部位は、大腿静脈、伏在静脈、及び／又は橈側静脈であった。血液試料（０．５ｍＬ）をＫ２－ＥＤＴＡサンプリングチューブに採取した。サル血漿試料中のＩＮＦ－ｇ、ＩＬ－６、ＩＬ－８及びＴＮＦ－αの測定は、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｕ－ＰＬＥＸ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍ Ｃｏｍｂｏ １（ＮＨＰ）ＳＥＣＴＯＲアッセイキット、カタログ番号Ｋ１５０７０Ｋ－２）からの探索ＥＣＬＩＡ（電気化学発光イムノアッセイ）法を用いて行った。全ての変動を、ベースライン値（１日目の最初の投薬前）と比較して表す。分析上のばらつきのために、値が対応するベースライン値よりも２倍超高い場合、サイトカインの増加は生物学的に有意であると考えられた。等級付けを以下のように適用した：２倍以下の変化：生物学的に関連する変化なし；３～１０倍の変化：非常に最小限の増加；１１～１００倍の変化：最小の増加；１０１～１０００倍の変化：中程度の増加；及び１００１倍以上の変化：著しい増加。
【0481】
結果
血漿中のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ濃度を、Ｇｙｒｏｌａｂプラットフォームで実行される探索免疫測定法を使用して決定した。カニクイザルにＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢを毎週ＳＣ投薬した後の血漿中の記述統計（平均及び％ＣＶ）ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＰＫパラメータを表２４に示す。個々のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＰＫパラメータを表２５に示す。個々の（及び平均）ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ血漿濃度値を表２６に示す。
血漿中のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ濃度を、Ｇｙｒｏｌａｂプラットフォームで実行される探索免疫測定法を使用して決定した。カニクイザルにＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢを毎週ＳＣ投薬した後の血漿中の記述統計（平均及び％ＣＶ）ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＰＫパラメータを表２４に示す。個々のＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＰＫパラメータを表２５に示す。個々の（及び平均）ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ血漿濃度値を表２６に示す。
【0482】
【表24】
【0483】
週３回のＳＣ投与後、８及び１５日目の血漿中にわずかなＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ蓄積が観察され、蓄積比はそれぞれ２５，０００及び５０，０００μｇ／ｋｇ／ａｄｍ（すなわち、２５及び５０ｍｇ／ｋｇ／ａｄｍ）で１．６～２．６の範囲であった（図３４Ａ及び図３４Ｂ）。
全体として、サルにおけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＳＣ投薬後、バイオアベイラビリティは９０％に近かった。
全体として、サルにおけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿Ｆｃ－ＡＤＥ－ＤＳＢ ＳＣ投薬後、バイオアベイラビリティは９０％に近かった。
【0484】
【表25】
【0485】
【表26】
【0486】
サイトカイン（ＩＮＦ－ｇ、ＩＬ－６、ＩＬ－８及びＴＮＦ－ａ）評価：サイトカイン（ＩＮＦ－ｇ、ＩＬ－６、ＩＬ－８及びＴＮＦ－α）を、方法及び材料の節で指定された時点で採取した血漿試料において測定した。毎週のＳＣ投薬後、ＩＦＮ－ｇ及びＴＮＦ－αレベルの変化はいずれの動物においても観察されなかった。ＩＬ－６（図３５）については、試験した最高用量の５０ｍｇ／ｋｇ／ａｄｍの後に、一過性の非常に最小限（雌２５番における最大１０倍の変化）から最小限（雌２４番における最大２１倍の変化）の増加のみが観察された。ＩＬ－８については、２５ｍｇ／ｋｇ／ａｄｍを投与した両動物において、非常に最小限の増加（最大６倍の変化）が観察された。
【0487】
実施例１８．多発性骨髄腫患者におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥ結合タンパク質の研究
これは、再発性／難治性多発性骨髄腫（ｒ／ｒ ＭＭ）の参加者において本明細書に開示されるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥを評価するためのファーストインヒューマンフェーズ１／フェーズ２研究である。
これは、再発性／難治性多発性骨髄腫（ｒ／ｒ ＭＭ）の参加者において本明細書に開示されるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥを評価するためのファーストインヒューマンフェーズ１／フェーズ２研究である。
【0488】
研究は３つの部分を含む。第１に、用量最適化部で試験される２つの用量を決定するために投与されるいくつかの用量を評価するｒ／ｒ ＭＭ参加者における用量漸増フェーズ
である。第２に、事前推奨フェーズ２用量（ｐＲＰ２Ｄ）を決定し、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥのスケジュールを決定するために用量漸増フェーズから決定された２つの用量を評価することになる用量最適化フェーズである。第３に、確認された推奨第２相用量（ｃＲＰ２Ｄ）の予備的有効性を評価し、ｒ／ｒのＭＭ患者におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥのスケジュールを行う用量拡大フェーズ。
である。第２に、事前推奨フェーズ２用量（ｐＲＰ２Ｄ）を決定し、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥのスケジュールを決定するために用量漸増フェーズから決定された２つの用量を評価することになる用量最適化フェーズである。第３に、確認された推奨第２相用量（ｃＲＰ２Ｄ）の予備的有効性を評価し、ｒ／ｒのＭＭ患者におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥのスケジュールを行う用量拡大フェーズ。
【0489】
参加者は、登録及び治験介入によって治療され、そのまま分離される：第１部／用量漸増フェーズの約１８～３０名の参加者；第２部／用量最適化フェーズの約３０名の参加者；及び約１５名の参加者が、第３部／用量拡大に参加した。
【0490】
参加者の研究期間は、サイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ１）の前の最大２８日間のスクリーニング期間、登録した参加者が４週間サイクルのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの皮下投与を受ける治療期間を含む。治療訪問の終了は、最後の治験医薬製品投与又は更なる治療の開始前のいずれか早い方から３０日間（＋／－７日）行われる。
【0491】
主要評価項目測定：
・用量漸増：用量制限毒性（ＤＬＴ）の存在。ＤＬＴは、ＣＲＳ又はＩＣＡＮＳのＮＣＩ
ＣＴＣＡＥバージョン５．０又はＡＳＴＣＴ基準を使用して定義される。
・用量の最適化：全奏効率（ＯＲＲ）。ＯＲＲは、２０１６年のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＩＭＷＧ）基準による、最後の参加者が少なくとも４サイクル治療された後、又は早期に中止された後の、ストリンジェントな完全奏効（ｓＣＲ）、完全奏効（ＣＲ）、非常に良好な部分奏効（ＶＧＰＲ）、及び部分奏効（ＰＲ）を有する参加者の割合として定義される。
・用量拡大：全奏効率（ＯＲＲ）。ＯＲＲは、２０１６年のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＩＭＷＧ）基準による、ストリンジェントな完全奏効（ｓＣＲ）、完全奏効（ＣＲ）、非常に良好な部分奏効（ＶＧＰＲ）、及び部分奏効（ＰＲ）を有する参加者の割合として定義される。
・用量漸増：用量制限毒性（ＤＬＴ）の存在。ＤＬＴは、ＣＲＳ又はＩＣＡＮＳのＮＣＩ
ＣＴＣＡＥバージョン５．０又はＡＳＴＣＴ基準を使用して定義される。
・用量の最適化：全奏効率（ＯＲＲ）。ＯＲＲは、２０１６年のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＩＭＷＧ）基準による、最後の参加者が少なくとも４サイクル治療された後、又は早期に中止された後の、ストリンジェントな完全奏効（ｓＣＲ）、完全奏効（ＣＲ）、非常に良好な部分奏効（ＶＧＰＲ）、及び部分奏効（ＰＲ）を有する参加者の割合として定義される。
・用量拡大：全奏効率（ＯＲＲ）。ＯＲＲは、２０１６年のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｍｙｅｌｏｍａ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＩＭＷＧ）基準による、ストリンジェントな完全奏効（ｓＣＲ）、完全奏効（ＣＲ）、非常に良好な部分奏効（ＶＧＰＲ）、及び部分奏効（ＰＲ）を有する参加者の割合として定義される。
【0492】
副次評価項目測定：
・用量漸増全奏効率（ＯＲＲ）：ＯＲＲは、２０１６ ＩＭＷＧ基準によるｓＣＲ、ＣＲ、ＶＧＰＲ及びＰＲを有する参加者の割合として定義される。
・用量の最適化：ＤＬＴの存在及び治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ：ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ｅｍｅｒｇｅｎｔ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ）を経験している参加者の割合。ＴＥＡＥは、治療期間中に発症する、悪化する、又は重篤になる有害事象として定義される。治療期間は、治験治療の最初の用量から治験治療最後の用量の３０日後までの時間として定義される。
・用量の最適化及び拡大：
ｏ非常に良好な部分奏効又はより良好なレート
ｏ奏効期間（ＤＯＲ）。ＤＯＲは、最初の応答の日付から進行性疾患の最初の発生の日付までの時間（治験責任医師によって決定されたＰＤ又は何らかの原因による死亡のいずれか早い方）として定義される。ＤＯＲは、応答（ＰＲ又はそれ以上）を達成した参加者に対してのみ決定される。
ｏ最初の応答までの時間（ＴＴ１Ｒ）：ＴＴ１Ｒは、最初の応答の日付から進行性疾患の最初の発生の日付までの時間（治験責任医師によって決定されたＰＤ又は何らかの原因による死亡のいずれか早い方）として定義される。ＤＯＲは、応答（ＰＲ又はそれ以上）を達成した参加者に対してのみ決定される。
ｏ最良効果までの時間（ＴＴＢＲ）：ＴＴＢＲは、ＩＭＰの最初の投与から、続いて確認される最良総合効果（ＰＲ又はそれ以上）の最初の発生の日までの時間として定義される。
ｏ無増悪生存期間（ＰＦＳ）：ＰＦＳは、ＩＭＰの最初の投与日から進行性疾患の最初の
文書化日又は任意の原因による死亡日のいずれか早い方までの時間として定義される。応答をＩＭＷＧ基準に従って決定する。パラプロテインに基づく進行は、２つの連続した評価に基づいて確認される。
ｏ全生存期間（ＯＳ）：ＯＳは、ＩＭＰの最初の投与の日付から任意の原因で死亡するまでの時間として定義される。
ｏ臨床的有効率（ＣＢＲ）：ＣＢＲは、ＩＭＷＧ ２０１６基準に従って治験責任医師によって決定された、最初のＩＭＰ投与から少なくとも６ヶ月の任意の時点での確認されたＣＲ若しくはＰＲ又は安定疾患（ＳＤ）を有する参加者の割合である。
ｏ治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）を経験している参加者の割合：治療下で発現した有害事象（Ａｅｓ）は、処置期間中に発症するか、悪化するか、又は重篤になるＡｅｓとして定義される。治療期間は、治験治療の最初の用量から治験治療の最後の用量の３０日後までの時間として定義される。
ｏ注入関連反応（ＩＡＲ）の発生率
ｏ注射部位反応の発生率（ＩＳＲ）
ｏ検査異常の発生率
ｏ単剤療法ＡＵＣｌａｓｔにおけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの薬物動態（ＰＫ）パラメータの評価：時間０から定量下限を超えて観察された最後の濃度の時間まで台形法を使用して計算した血漿濃度対時間曲線下面積（すなわち、Ｃｌａｓｔ）
ｏ単剤療法におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの薬物動態（ＰＫ）パラメータの評価：Ｃｍａｘ（最大観察濃度）
ｏ単剤療法におけるＳＡＲ４４５５１４の薬物動態（ＰＫ）パラメータの評価：Ｔｍａｘ（Ｃｍａｘに達する最初の時間）
ｏ単剤療法におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生率
ｏ最小残存病変（ＭＲＤ）陰性率：ＶＧＰＲ又はそれ以上の応答を有する患者におけるＭＲＤの状態
・用量漸増全奏効率（ＯＲＲ）：ＯＲＲは、２０１６ ＩＭＷＧ基準によるｓＣＲ、ＣＲ、ＶＧＰＲ及びＰＲを有する参加者の割合として定義される。
・用量の最適化：ＤＬＴの存在及び治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ：ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ｅｍｅｒｇｅｎｔ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ）を経験している参加者の割合。ＴＥＡＥは、治療期間中に発症する、悪化する、又は重篤になる有害事象として定義される。治療期間は、治験治療の最初の用量から治験治療最後の用量の３０日後までの時間として定義される。
・用量の最適化及び拡大：
ｏ非常に良好な部分奏効又はより良好なレート
ｏ奏効期間（ＤＯＲ）。ＤＯＲは、最初の応答の日付から進行性疾患の最初の発生の日付までの時間（治験責任医師によって決定されたＰＤ又は何らかの原因による死亡のいずれか早い方）として定義される。ＤＯＲは、応答（ＰＲ又はそれ以上）を達成した参加者に対してのみ決定される。
ｏ最初の応答までの時間（ＴＴ１Ｒ）：ＴＴ１Ｒは、最初の応答の日付から進行性疾患の最初の発生の日付までの時間（治験責任医師によって決定されたＰＤ又は何らかの原因による死亡のいずれか早い方）として定義される。ＤＯＲは、応答（ＰＲ又はそれ以上）を達成した参加者に対してのみ決定される。
ｏ最良効果までの時間（ＴＴＢＲ）：ＴＴＢＲは、ＩＭＰの最初の投与から、続いて確認される最良総合効果（ＰＲ又はそれ以上）の最初の発生の日までの時間として定義される。
ｏ無増悪生存期間（ＰＦＳ）：ＰＦＳは、ＩＭＰの最初の投与日から進行性疾患の最初の
文書化日又は任意の原因による死亡日のいずれか早い方までの時間として定義される。応答をＩＭＷＧ基準に従って決定する。パラプロテインに基づく進行は、２つの連続した評価に基づいて確認される。
ｏ全生存期間（ＯＳ）：ＯＳは、ＩＭＰの最初の投与の日付から任意の原因で死亡するまでの時間として定義される。
ｏ臨床的有効率（ＣＢＲ）：ＣＢＲは、ＩＭＷＧ ２０１６基準に従って治験責任医師によって決定された、最初のＩＭＰ投与から少なくとも６ヶ月の任意の時点での確認されたＣＲ若しくはＰＲ又は安定疾患（ＳＤ）を有する参加者の割合である。
ｏ治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）を経験している参加者の割合：治療下で発現した有害事象（Ａｅｓ）は、処置期間中に発症するか、悪化するか、又は重篤になるＡｅｓとして定義される。治療期間は、治験治療の最初の用量から治験治療の最後の用量の３０日後までの時間として定義される。
ｏ注入関連反応（ＩＡＲ）の発生率
ｏ注射部位反応の発生率（ＩＳＲ）
ｏ検査異常の発生率
ｏ単剤療法ＡＵＣｌａｓｔにおけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの薬物動態（ＰＫ）パラメータの評価：時間０から定量下限を超えて観察された最後の濃度の時間まで台形法を使用して計算した血漿濃度対時間曲線下面積（すなわち、Ｃｌａｓｔ）
ｏ単剤療法におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの薬物動態（ＰＫ）パラメータの評価：Ｃｍａｘ（最大観察濃度）
ｏ単剤療法におけるＳＡＲ４４５５１４の薬物動態（ＰＫ）パラメータの評価：Ｔｍａｘ（Ｃｍａｘに達する最初の時間）
ｏ単剤療法におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生率
ｏ最小残存病変（ＭＲＤ）陰性率：ＶＧＰＲ又はそれ以上の応答を有する患者におけるＭＲＤの状態
【0493】
選択基準：
・参加者は、次のものを有しなければならない：
ｏ多発性骨髄腫の文書化された診断
ｏ再発／難治性多発性骨髄腫（ｒ／ｒ ＭＭ）
ｏｒ／ｒ ＭＭの測定可能な疾患
ｏＭＭを有する参加者は、第二世代又は第三世代の免疫調節薬、ステロイド、プロテアソーム阻害薬及び抗ＣＤ３８モノクローナル抗体の少なくとも２回の連続サイクルを含まなければならない少なくとも２種類の事前治療を受けていなければならない。
ｏＩＭＷＧ ２０１６基準による、進行性疾患（ＰＤ）の文書化された証拠がなければならない
ｏ用量漸増の場合、体重４０～１２０ｋｇ以内
ｏ署名されたインフォームドコンセントを与えることができる
・参加者は、次のものを有しなければならない：
ｏ多発性骨髄腫の文書化された診断
ｏ再発／難治性多発性骨髄腫（ｒ／ｒ ＭＭ）
ｏｒ／ｒ ＭＭの測定可能な疾患
ｏＭＭを有する参加者は、第二世代又は第三世代の免疫調節薬、ステロイド、プロテアソーム阻害薬及び抗ＣＤ３８モノクローナル抗体の少なくとも２回の連続サイクルを含まなければならない少なくとも２種類の事前治療を受けていなければならない。
ｏＩＭＷＧ ２０１６基準による、進行性疾患（ＰＤ）の文書化された証拠がなければならない
ｏ用量漸増の場合、体重４０～１２０ｋｇ以内
ｏ署名されたインフォームドコンセントを与えることができる
【0494】
除外基準：
・原発性難治性ＭＭは、疾患経過中に任意の治療で少なくとも最小限の応答を達成したことがない参加者として定義される。
・第２の原発性悪性腫瘍
・原発性全身ＬＣＡ及び形質細胞白血病
・鬱血性心不全
・治験治療前１４日以内の制御されていない感染
・抗ウイルス治療を必要とする公知の後天性免疫不全症候群関連疾患又は公知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患又は活動性Ａ型肝炎（Ａ型肝炎抗原陽性又はＩｇＭ陽性として定義される）；スクリーニング時のＨＩＶ血清学は、地域の規制によって要求される国
の参加者に対して試験される。
・制御されない又は活動性のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染：陽性Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及び／又はＨＢＶデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を有する参加者
・活動性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染：陽性ＨＣＶリボ核酸（ＲＮＡ）及び陰性抗ＨＣＶ
・治験治療前１４日以内の任意の抗ＭＭ薬物治療
・活動性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を伴う以前の同種異系造血幹細胞（ＨＳＣ）移植（ＧｖＨＤ、任意のグレード及び／又は無作為化前の最後の２ヶ月以内の免疫抑制治療下にある）
・治験治療の開始前１４日以内の任意の主要手順
・治験治療の最初の投与の９０日前未満での抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（イサツキシマブ又はダラツムマブ）の投与
・治験治療の投与の２１日前未満での抗ＢＣＭＡ剤（限定されないが、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＴＣＥ、抗体薬物コンジュゲートを含む）の投与
・ＣＴＣＡＥバージョン５．０グレード１に解消されていないと定義される、以前の抗癌療法からの解消されていない毒性。
・デキサメタゾンに対する禁忌を有する参加者
・２８日以内又は治験治療からの５半減期のいずれか短い方の期間内に、この研究のための任意の他の治験薬物又は禁止された治療を受けた
・ヘモグロビン＜８ｇ／ｄＬ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）
・血小板＜５０×１０＾９／Ｌ（このレベルに達するようにスクリーニング血小板数前１週間以内に参加者に輸血することは許容されない）
・絶対好中球数（ＡＮＣ）＜１０００μＬ（１×１０＾９／Ｌ）
・クレアチニンクリアランス＜３０ｍＬ／分（腎疾患処方における食餌の修正）
・総ビリルビン＞１．５×正常値の上限（ＵＬＮ）（対象がギルバート症候群を実証していない限り、その場合直接ビリルビンは＞２．５×ＵＬＮであるべきではない）
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ／ＳＧＯＴ）又はアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＳＧＰＴ）＞２．５×ＵＬＮ
・グレード３又は４の高カルシウム血症（１２．５ｍｇ／ｄＬ超の補正血清カルシウム；３．１ｍｍｏｌ／Ｌ超；１．６ｍｍｏｌ／Ｌ超のイオン化カルシウム；又は入院を必要とする）を有する患者は、患者が抗高カルシウム血症処置下でグレード２以下に回復しない限り適格ではない。
・規制又は法的命令のために機関に収容されている個人；法的に施設に収容されている被収容者又は参加者。
・治験責任医師が判断した理由を問わず参加に適さない参加者
・治験介入、又はその成分、又は治験責任医師の意見では研究への参加を禁忌とする薬物又は他のアレルギーのいずれかに対する感受性
・原発性難治性ＭＭは、疾患経過中に任意の治療で少なくとも最小限の応答を達成したことがない参加者として定義される。
・第２の原発性悪性腫瘍
・原発性全身ＬＣＡ及び形質細胞白血病
・鬱血性心不全
・治験治療前１４日以内の制御されていない感染
・抗ウイルス治療を必要とする公知の後天性免疫不全症候群関連疾患又は公知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患又は活動性Ａ型肝炎（Ａ型肝炎抗原陽性又はＩｇＭ陽性として定義される）；スクリーニング時のＨＩＶ血清学は、地域の規制によって要求される国
の参加者に対して試験される。
・制御されない又は活動性のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染：陽性Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及び／又はＨＢＶデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を有する参加者
・活動性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染：陽性ＨＣＶリボ核酸（ＲＮＡ）及び陰性抗ＨＣＶ
・治験治療前１４日以内の任意の抗ＭＭ薬物治療
・活動性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を伴う以前の同種異系造血幹細胞（ＨＳＣ）移植（ＧｖＨＤ、任意のグレード及び／又は無作為化前の最後の２ヶ月以内の免疫抑制治療下にある）
・治験治療の開始前１４日以内の任意の主要手順
・治験治療の最初の投与の９０日前未満での抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（イサツキシマブ又はダラツムマブ）の投与
・治験治療の投与の２１日前未満での抗ＢＣＭＡ剤（限定されないが、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＴＣＥ、抗体薬物コンジュゲートを含む）の投与
・ＣＴＣＡＥバージョン５．０グレード１に解消されていないと定義される、以前の抗癌療法からの解消されていない毒性。
・デキサメタゾンに対する禁忌を有する参加者
・２８日以内又は治験治療からの５半減期のいずれか短い方の期間内に、この研究のための任意の他の治験薬物又は禁止された治療を受けた
・ヘモグロビン＜８ｇ／ｄＬ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）
・血小板＜５０×１０＾９／Ｌ（このレベルに達するようにスクリーニング血小板数前１週間以内に参加者に輸血することは許容されない）
・絶対好中球数（ＡＮＣ）＜１０００μＬ（１×１０＾９／Ｌ）
・クレアチニンクリアランス＜３０ｍＬ／分（腎疾患処方における食餌の修正）
・総ビリルビン＞１．５×正常値の上限（ＵＬＮ）（対象がギルバート症候群を実証していない限り、その場合直接ビリルビンは＞２．５×ＵＬＮであるべきではない）
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ／ＳＧＯＴ）又はアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＳＧＰＴ）＞２．５×ＵＬＮ
・グレード３又は４の高カルシウム血症（１２．５ｍｇ／ｄＬ超の補正血清カルシウム；３．１ｍｍｏｌ／Ｌ超；１．６ｍｍｏｌ／Ｌ超のイオン化カルシウム；又は入院を必要とする）を有する患者は、患者が抗高カルシウム血症処置下でグレード２以下に回復しない限り適格ではない。
・規制又は法的命令のために機関に収容されている個人；法的に施設に収容されている被収容者又は参加者。
・治験責任医師が判断した理由を問わず参加に適さない参加者
・治験介入、又はその成分、又は治験責任医師の意見では研究への参加を禁忌とする薬物又は他のアレルギーのいずれかに対する感受性
【0495】
実施例１９．再発性／難治性軽鎖アミロイドーシス患者におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥ結合タンパク質の研究
ＬＣＡを治療するために使用される単一及び併用化学療法剤又は免疫療法レジメンは、患者にとってしばしば忍容が困難であり、患者は現在のＬＣＡ治療レジメンの持続する副作用に屈することが多い。Ｈａｓｓａｎ ａｎｄ Ｓａｎｃｈｏｒａｗａｌａ（２０２２），Ｈｅｍａｔｏ，ｖｏｌ．３：３８－４６．；Ｓｉｄｉｑｉ ＆ Ｇｅｒｔｚ（２０２１），Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．１１：９０．
ＬＣＡを治療するために使用される単一及び併用化学療法剤又は免疫療法レジメンは、患者にとってしばしば忍容が困難であり、患者は現在のＬＣＡ治療レジメンの持続する副作用に屈することが多い。Ｈａｓｓａｎ ａｎｄ Ｓａｎｃｈｏｒａｗａｌａ（２０２２），Ｈｅｍａｔｏ，ｖｏｌ．３：３８－４６．；Ｓｉｄｉｑｉ ＆ Ｇｅｒｔｚ（２０２１），Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．１１：９０．
【0496】
本明細書で設計されるナチュラルキラー細胞エンゲージャーは強力であるが、他の状況では好ましい毒性プロファイルを有する。したがって、ナチュラルキラー細胞エンゲージャーはＬＣＡ患者に対しても治療効果を有すると仮定される。
【0497】
再発性／難治性軽鎖アミロイドーシス患者に本明細書に開示されるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥを投薬することの安全性、耐容性及び実現可能性のフェーズ１研究を実施する。この研究は、患者に安全に投与することができるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの用量及びレジメンを同定することである。研究全体を通して、毒性、有害な副作用及び疾患の進行について患者を監視する。多発性骨髄腫の事前診断なしに軽鎖アミロイドーシスと診断された患者が、この研究のために選択される。
【0498】
研究の概要：
これは、再発性／難治性軽鎖アミロイドーシス（ＲＲＬＣＡ）患者における単剤療法としての、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするＮＫ細胞エンゲージャーであるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの安全性及び有効性を調査するためのファーストインヒューマン、非盲検フェーズ１／２研究である。
これは、再発性／難治性軽鎖アミロイドーシス（ＲＲＬＣＡ）患者における単剤療法としての、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とするＮＫ細胞エンゲージャーであるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの安全性及び有効性を調査するためのファーストインヒューマン、非盲検フェーズ１／２研究である。
【0499】
選択基準及び除外基準：
軽鎖アミロイドーシスの文書化された診断を有し、少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤を含む少なくとも１つの先行治療ラインを受けた患者の登録が許可される。患者は、国際アミロイドーシス学会（ＩＳＡ）２０１２更新に従って測定可能な疾患を示さなければならず、ＩＳＡ ２０１２基準に従って、進行性疾患（ＰＤ）の実証された証拠を有していなければならない。患者は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ）ガイドラインに従ってアミロイドーシスの影響を受ける１つ以上の臓器を有するべきである。
軽鎖アミロイドーシスの文書化された診断を有し、少なくとも１つのプロテアソーム阻害剤を含む少なくとも１つの先行治療ラインを受けた患者の登録が許可される。患者は、国際アミロイドーシス学会（ＩＳＡ）２０１２更新に従って測定可能な疾患を示さなければならず、ＩＳＡ ２０１２基準に従って、進行性疾患（ＰＤ）の実証された証拠を有していなければならない。患者は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ）ガイドラインに従ってアミロイドーシスの影響を受ける１つ以上の臓器を有するべきである。
【0500】
用量漸増目的のために、患者の体重は５０～１００ｋｇであるべきである。患者はまた、１８歳を超える成人でなければならず、署名されたインフォームドコンセントを与えることもできなければならない。
【0501】
以下のいずれかが実証された場合、患者は研究から除外される。
１．以下の１つ以上として定義される、臨床的に有意な心血管状態の証拠：
ａ．脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端プロホルモン（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）＞８５００ｎｇ／ｍＬ
ｂ．ニューヨーク心臓病学会（ＮＹＨＡ）分類ＩＩＩｂ又はＩＶ心不全
ｃ．治験責任医師の意見では、ＬＣＡ心筋症に主に関連しない心不全（限定されないが、虚血性心疾患、矯正されていない弁膜疾患、感染症を含む）
ｄ．急性冠動脈症候群、心筋梗塞又は不安定狭心症の過去６ヶ月の前の事象（病歴）、並びに過去６ヶ月間にステント及び／又は冠動脈バイパスによる経皮的心臓介入を経験した参加者
ｅ．心血管事象に関連する治療前の最後の４週間の入院
ｆ．持続性心室頻拍、房室の関連、又は洞房結節機能不全を含むが、これらに限定されない、ペースメーカー又は植込み型除細動器（ＩＣＤ）を必要とするが、それらが配置されていない不整脈及び／又は心伝導障害の既往歴
２．収縮期血圧＜１００ｍｍＨｇ又は拡張期血圧＜５５ｍｍＨｇ
３．溶解性骨疾患、形質細胞腫、骨髄中の６０％以上の形質細胞、又は高カルシウム血症の存在を含む、症候性多発性骨髄腫の以前又は現在の診断
４．治験治療前１４日以内の制御されていない感染
５．抗ウイルス治療を必要とする公知の後天性免疫不全症候群関連疾患又は公知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患又は活動性Ａ型肝炎（Ａ型肝炎抗原陽性又はＩｇＭ陽性として定義される）；スクリーニング時のＨＩＶ血清学は、地域の規制によって要求される国の参加者に対して試験される。
６．制御されない又は活動性のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染：陽性Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及び／又はＨＢＶデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を有する参加者
７．活動性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染症：陽性ＨＣＶリボ核酸（ＲＮＡ）及び陰性抗ＨＣＶ８．任意の非軽鎖アミロイドーシス
８．事前／併用療法：
ａ．治験治療前１４日以内の任意の抗多発性骨髄腫薬物治療
ｂ．無作為化前の最後の２ヶ月以内に、任意のグレードの活性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）及び／又は免疫抑制治療下である事前の同種異系造血幹細胞（ＨＳＣ）移植
ｃ．治験治療の開始前１４日以内の任意の主要手順
ｄ．治験治療の最初の投与の９０日前未満での抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（イサツキシマブ又はダラツムマブ）の投与
ｅ．治験治療の投与の２１日前未満での抗ＢＣＭＡ剤（限定されないが、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＴＣＥ、抗体薬物コンジュゲートを含む）の投与
ｆ．ＣＴＣＡＥバージョン５．０グレード１に解消されていないと定義される、以前の抗癌療法からの解消されていない毒性。
ｇ．デキサメタゾンに対する禁忌を有する参加者
９．事前／同時臨床研究経験
ａ．２８日以内又は治験治療からの５半減期のいずれか短い方の期間内に、この研究のための任意の他の治験薬物又は禁止された治療を受けた
１０．診断評価
ａ．ヘモグロビン＜８ｇ／ｄＬ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）
ｂ．血小板＜５０×１０９／Ｌ（このレベルに達するようにスクリーニング血小板数前１週間以内に参加者に輸血することは許容されない）
ｃ．絶対好中球数（ＡＮＣ）＜１０００μＬ（１×１０９／Ｌ）
ｄ．クレアチニンクリアランス＜３０ ｍ Ｌ／分（腎疾患式における食事の修飾）
ｅ．総ビリルビン＞１．５×正常値の上限（ＵＬＮ）（対象がギルバート症候群を実証していない限り、その場合直接ビリルビンは＞２．５×ＵＬＮであるべきではない）
ｆ．アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ／ＳＧＯＴ）又はアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＳＧＰＴ）＞２．５×ＵＬＮ
ｇ．グレード３又は４の高カルシウム血症（１２．５ｍｇ／ｄＬ超の補正血清カルシウム；３．１ｍｍｏｌ／Ｌ超；１．６ｍｍｌ／Ｌ超のイオン化カルシウム；又は入院を必要とする）を有する患者は、患者が抗高カルシウム血症処置下でグレード２以下に回復しない限り適格ではない。
１１．その他の除外：
ａ．規制又は法的命令のために機関に収容されている個人；法的に施設に収容されている被収容者又は参加者。
ｂ．治験責任医師が判断した理由を問わず参加に適さない参加者
ｃ．治験介入、又はその成分、又は治験責任医師の意見では研究への参加を禁忌とする薬物又は他のアレルギーのいずれかに対する感受性。
１．以下の１つ以上として定義される、臨床的に有意な心血管状態の証拠：
ａ．脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ末端プロホルモン（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）＞８５００ｎｇ／ｍＬ
ｂ．ニューヨーク心臓病学会（ＮＹＨＡ）分類ＩＩＩｂ又はＩＶ心不全
ｃ．治験責任医師の意見では、ＬＣＡ心筋症に主に関連しない心不全（限定されないが、虚血性心疾患、矯正されていない弁膜疾患、感染症を含む）
ｄ．急性冠動脈症候群、心筋梗塞又は不安定狭心症の過去６ヶ月の前の事象（病歴）、並びに過去６ヶ月間にステント及び／又は冠動脈バイパスによる経皮的心臓介入を経験した参加者
ｅ．心血管事象に関連する治療前の最後の４週間の入院
ｆ．持続性心室頻拍、房室の関連、又は洞房結節機能不全を含むが、これらに限定されない、ペースメーカー又は植込み型除細動器（ＩＣＤ）を必要とするが、それらが配置されていない不整脈及び／又は心伝導障害の既往歴
２．収縮期血圧＜１００ｍｍＨｇ又は拡張期血圧＜５５ｍｍＨｇ
３．溶解性骨疾患、形質細胞腫、骨髄中の６０％以上の形質細胞、又は高カルシウム血症の存在を含む、症候性多発性骨髄腫の以前又は現在の診断
４．治験治療前１４日以内の制御されていない感染
５．抗ウイルス治療を必要とする公知の後天性免疫不全症候群関連疾患又は公知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患又は活動性Ａ型肝炎（Ａ型肝炎抗原陽性又はＩｇＭ陽性として定義される）；スクリーニング時のＨＩＶ血清学は、地域の規制によって要求される国の参加者に対して試験される。
６．制御されない又は活動性のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染：陽性Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及び／又はＨＢＶデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を有する参加者
７．活動性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染症：陽性ＨＣＶリボ核酸（ＲＮＡ）及び陰性抗ＨＣＶ８．任意の非軽鎖アミロイドーシス
８．事前／併用療法：
ａ．治験治療前１４日以内の任意の抗多発性骨髄腫薬物治療
ｂ．無作為化前の最後の２ヶ月以内に、任意のグレードの活性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）及び／又は免疫抑制治療下である事前の同種異系造血幹細胞（ＨＳＣ）移植
ｃ．治験治療の開始前１４日以内の任意の主要手順
ｄ．治験治療の最初の投与の９０日前未満での抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（イサツキシマブ又はダラツムマブ）の投与
ｅ．治験治療の投与の２１日前未満での抗ＢＣＭＡ剤（限定されないが、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＴＣＥ、抗体薬物コンジュゲートを含む）の投与
ｆ．ＣＴＣＡＥバージョン５．０グレード１に解消されていないと定義される、以前の抗癌療法からの解消されていない毒性。
ｇ．デキサメタゾンに対する禁忌を有する参加者
９．事前／同時臨床研究経験
ａ．２８日以内又は治験治療からの５半減期のいずれか短い方の期間内に、この研究のための任意の他の治験薬物又は禁止された治療を受けた
１０．診断評価
ａ．ヘモグロビン＜８ｇ／ｄＬ（５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）
ｂ．血小板＜５０×１０９／Ｌ（このレベルに達するようにスクリーニング血小板数前１週間以内に参加者に輸血することは許容されない）
ｃ．絶対好中球数（ＡＮＣ）＜１０００μＬ（１×１０９／Ｌ）
ｄ．クレアチニンクリアランス＜３０ ｍ Ｌ／分（腎疾患式における食事の修飾）
ｅ．総ビリルビン＞１．５×正常値の上限（ＵＬＮ）（対象がギルバート症候群を実証していない限り、その場合直接ビリルビンは＞２．５×ＵＬＮであるべきではない）
ｆ．アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ／ＳＧＯＴ）又はアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＳＧＰＴ）＞２．５×ＵＬＮ
ｇ．グレード３又は４の高カルシウム血症（１２．５ｍｇ／ｄＬ超の補正血清カルシウム；３．１ｍｍｏｌ／Ｌ超；１．６ｍｍｌ／Ｌ超のイオン化カルシウム；又は入院を必要とする）を有する患者は、患者が抗高カルシウム血症処置下でグレード２以下に回復しない限り適格ではない。
１１．その他の除外：
ａ．規制又は法的命令のために機関に収容されている個人；法的に施設に収容されている被収容者又は参加者。
ｂ．治験責任医師が判断した理由を問わず参加に適さない参加者
ｃ．治験介入、又はその成分、又は治験責任医師の意見では研究への参加を禁忌とする薬物又は他のアレルギーのいずれかに対する感受性。
【0502】
研究目的：
この研究の主な目的は、以下の通りである：１）用量漸増中の推奨されるフェーズ２用量（ＲＰ２Ｄ）を決定する；２）用量拡大中の併用推奨フェーズ２用量での血液学的応答を決定する。ｐＲＰ２Ｄは、サイクル１での用量制限毒性（ＤＬＴ）を考慮に入れ、全体的な安全性プロファイル、薬物動態（適切な場合）、及びバイオマーカーを考慮に入れる。血液学的応答は、欧州血液学会／国際血液学会の作業グループ基準による、ストリンジェントな完全奏効（ｓＣＲ）、完全奏効（ＣＲ）、非常に良好な部分奏効（ＶＧＰＲ）及び部分奏効（ＰＲ）を有する参加者の割合として定義される。
この研究の主な目的は、以下の通りである：１）用量漸増中の推奨されるフェーズ２用量（ＲＰ２Ｄ）を決定する；２）用量拡大中の併用推奨フェーズ２用量での血液学的応答を決定する。ｐＲＰ２Ｄは、サイクル１での用量制限毒性（ＤＬＴ）を考慮に入れ、全体的な安全性プロファイル、薬物動態（適切な場合）、及びバイオマーカーを考慮に入れる。血液学的応答は、欧州血液学会／国際血液学会の作業グループ基準による、ストリンジェントな完全奏効（ｓＣＲ）、完全奏効（ＣＲ）、非常に良好な部分奏効（ＶＧＰＲ）及び部分奏効（ＰＲ）を有する参加者の割合として定義される。
【0503】
研究の副次的目的は、以下の通りである：１）参加者におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの潜在的有効性を評価する、２）参加者におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの安全性を評価する、３）単剤療法としてのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの薬物動
態（ＰＫ）を特徴付ける、４）単剤療法としてのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの潜在的免疫原性を評価する（ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生率）、及び５）ＶＧＰＲ以上の応答を有する患者におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの最小残存病変（ＭＲＤ）陰性率を評価する。
態（ＰＫ）を特徴付ける、４）単剤療法としてのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの潜在的免疫原性を評価する（ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生率）、及び５）ＶＧＰＲ以上の応答を有する患者におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの最小残存病変（ＭＲＤ）陰性率を評価する。
【0504】
研究の三次目的は以下の通りである：１）臨床転帰（日常生活動作（ＡＤＬ）及び手段的日常生活動作（ＩＡＤＬ）アンケート）に対する虚弱の影響を評価する；２）ＲＲＬＣＡ患者の神経学的症状に対するＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの影響を評価する
【0505】
研究設計：
これは、再発性／難治性ＬＣＡ（ＲＲＬＣＡ）を有する参加者における単剤としてのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの安全性及び有効性を評価するためのファーストインヒューマン（ＦＩＨ）非盲検研究である。用量が安全であることを確実にするために２つの用量を評価するためのＲＲＬＣＡにおける用量漸増フェーズ。用量拡大段階は、推奨されるフェーズ２用量（ＲＰ２Ｄ）の予備的有効性を評価し、スケジュールする。用量漸増フェーズ及び用量拡大フェーズの間、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥは、皮下経路を使用して参加者に投与される。
これは、再発性／難治性ＬＣＡ（ＲＲＬＣＡ）を有する参加者における単剤としてのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの安全性及び有効性を評価するためのファーストインヒューマン（ＦＩＨ）非盲検研究である。用量が安全であることを確実にするために２つの用量を評価するためのＲＲＬＣＡにおける用量漸増フェーズ。用量拡大段階は、推奨されるフェーズ２用量（ＲＰ２Ｄ）の予備的有効性を評価し、スケジュールする。用量漸増フェーズ及び用量拡大フェーズの間、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥは、皮下経路を使用して参加者に投与される。
【0506】
この研究は、以下を含む：
－研究開始前の最大２８日間のスクリーニング期間；
－登録された参加者が治験薬を受ける治療期間（４週間サイクル、皮下投与）
－治療訪問の終了。治療訪問の終了は、最後の治験薬からおよそ３０日後、又は更なる薬の開始前のいずれか早い方に行われる。
－研究開始前の最大２８日間のスクリーニング期間；
－登録された参加者が治験薬を受ける治療期間（４週間サイクル、皮下投与）
－治療訪問の終了。治療訪問の終了は、最後の治験薬からおよそ３０日後、又は更なる薬の開始前のいずれか早い方に行われる。
【0507】
参加者の研究期間は、以下を含む：
－スクリーニング期間：サイクル１の１日目の２８日前まで（Ｃ１Ｄ１）
－治療期間：登録された参加者は、４週間サイクルのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの皮下投与を受けるであろう。
－治療の終了は、治験医薬製品の最後の投与（ＩＭＰ）から３０日間（＋／－７日間）又は更なる治療の開始前のいずれか早い方から行われる。
－フォローアップ期間は、死亡するまで、参加者が研究の中止を要求したとき、最終的な全生存期間分析のとき、又は任意の時点での試験依頼者の裁量による生存フォローアップの中止のときまで継続する。
－スクリーニング期間：サイクル１の１日目の２８日前まで（Ｃ１Ｄ１）
－治療期間：登録された参加者は、４週間サイクルのＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの皮下投与を受けるであろう。
－治療の終了は、治験医薬製品の最後の投与（ＩＭＰ）から３０日間（＋／－７日間）又は更なる治療の開始前のいずれか早い方から行われる。
－フォローアップ期間は、死亡するまで、参加者が研究の中止を要求したとき、最終的な全生存期間分析のとき、又は任意の時点での試験依頼者の裁量による生存フォローアップの中止のときまで継続する。
【0508】
用量決定のための考察は、サイクル１でのＤＬＴ、全体的な安全性プロファイル、ＰＫ、及びバイオマーカー（例えば、ＮＫ細胞数、ＮＫ細胞活性化マーカー、可溶性ＢＣＭＡ）を含み（ただし、これらに限定されない可能性もある）、推定ＭＴＤを超えてはならない。
【0509】
用量拡大は、ｐＲＰ２Ｄで治療された１４名の参加者を含むであろう。コホートの主要エンドポイントは、最後の参加者が４サイクル治療された後、又は時期尚早に中止された後の血液学的応答である。ＬＣＡ血液学的応答及び進行並びに臓器応答及び進行を、ＩＳＡ ２０１２基準を使用して局所的に評価することになる。用量漸増及び用量拡大の間にｃＲＰ２Ｄで治療された全ての参加者（曝露集団）を、主要エンドポイント及び副次的エンドポイント分析のために考慮に入れることになる。ＬＰＩのおよそ１５ヶ月後にＰＦＳ及びＯＳ分析の更新があり、最終ＯＳ分析のカットオフ日はＬＰＥのおよそ３０ヶ月後であり、これも曝露集団で行われる。
【0510】
リスク評価：
この研究における、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿ＮＫＣＥの以下の重要な潜在的リスク（既
存の生物学的妥当性及び皮下投与経路を考慮）：注入反応、サイトカイン放出症候群、神経毒性（ＩＣＡＮ以外）、低ガンマグロブリン血症、Ｂ細胞枯渇及び感染症、ウイルス再活性化、コロナウイルス病２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）との関連におけるリスク、注射部位反応、免疫原性、並びに第２の原発性悪性腫瘍。
この研究における、ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿ＮＫＣＥの以下の重要な潜在的リスク（既
存の生物学的妥当性及び皮下投与経路を考慮）：注入反応、サイトカイン放出症候群、神経毒性（ＩＣＡＮ以外）、低ガンマグロブリン血症、Ｂ細胞枯渇及び感染症、ウイルス再活性化、コロナウイルス病２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）との関連におけるリスク、注射部位反応、免疫原性、並びに第２の原発性悪性腫瘍。
【0511】
エンドポイント：
主要エンドポイント：
用量漸増終了時の観察：
－サイクル１の終わり（４週間）での用量制限毒性（ＤＬＴ）の存在及びベースラインからフォローアップの終わり（およそ１５ヶ月）までに観察された治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）を経験している参加者の割合。
－血液学的応答（ＨＲ）。ＨＲは、サイクル１～４（サイクルあたり４週間）の間の、欧州血液学会／国際血液学会作業グループガイドラインによるストリンジェントな完全奏効（ｓＣＲ）、完全奏効（ＣＲ）、非常に良好な部分奏効（ＶＧＰＲ）及び部分奏効（ＰＲ）を有する参加者の割合として定義される。
主要エンドポイント：
用量漸増終了時の観察：
－サイクル１の終わり（４週間）での用量制限毒性（ＤＬＴ）の存在及びベースラインからフォローアップの終わり（およそ１５ヶ月）までに観察された治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）を経験している参加者の割合。
－血液学的応答（ＨＲ）。ＨＲは、サイクル１～４（サイクルあたり４週間）の間の、欧州血液学会／国際血液学会作業グループガイドラインによるストリンジェントな完全奏効（ｓＣＲ）、完全奏効（ＣＲ）、非常に良好な部分奏効（ＶＧＰＲ）及び部分奏効（ＰＲ）を有する参加者の割合として定義される。
【0512】
副次的エンドポイント：
用量漸増終了時の観察：
－全血液学的応答（ＯＨＲ）。ＯＨＲは、国際アミロイドーシス学会のガイドライン（ＩＳＡ ２０１２）に従って、ＣＲ、ＶＧＰＲ及びＰＲを有する参加者の割合として定義される。ＯＨＲは、サイクル１から最初の進行性疾患又はフォローアップの終了までのいずれか早い方まで（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月間）測定される。
用量漸増終了時の観察：
－全血液学的応答（ＯＨＲ）。ＯＨＲは、国際アミロイドーシス学会のガイドライン（ＩＳＡ ２０１２）に従って、ＣＲ、ＶＧＰＲ及びＰＲを有する参加者の割合として定義される。ＯＨＲは、サイクル１から最初の進行性疾患又はフォローアップの終了までのいずれか早い方まで（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月間）測定される。
【0513】
用量延長終了時の観察：
－血液学的完全奏効率（ＨＣＲ）。ＨＣＲは、ＩＳＡ ２０１２による完全奏効を有する患者の割合として定義される。サイクル１から最初の進行性疾患又はフォローアップの終了までのいずれか早い方まで（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月間）、ＨＣＲを評価する。
－血液学的完全奏効率（ＨＣＲ）。ＨＣＲは、ＩＳＡ ２０１２による完全奏効を有する患者の割合として定義される。サイクル１から最初の進行性疾患又はフォローアップの終了までのいずれか早い方まで（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月間）、ＨＣＲを評価する。
【0514】
用量拡大終了時の観察：
－全生存期間（ＯＳ）。ＯＳは、研究登録日から任意の原因による死亡までの時間として定義される。ＯＳは、サイクル１から死亡又はフォローアップの終了までのいずれか早い方（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月）で評価する。
－無増悪生存期間（ＰＦＳ）。ＰＦＳは、ＩＭＰの最初の投与から以下のいずれかまでの時間として定義される。血液学的進行、ＩＳＡ ２０１２基準による主要臓器進行（心臓、腎臓、又は肝臓）又は何らかの原因による死亡。ＰＦＳは、サイクル１から最初に来る最初の進行性疾患（臓器又は血液学的）又はフォローアップの終了（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月）まで評価される。
－最初の血液学的応答までの時間（ＴＴ１ＨＲ）。ＴＴ１ＨＲは、ＩＭＰの最初の投与から、続いて確認される最初の血液学的応答（ＰＲ又はそれ以上）の日付までの時間として定義される。サイクル１から最初の進行性疾患又はフォローアップの終了までのいずれか早い方まで（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月間）、ＴＴ１ＨＲを評価する。
－血液学的応答の持続時間（ＤＯＨＲ）。ＤＯＨＲは、ＩＭＰの最初の投与から以下のいずれかまでの時間として定義される。血液学的進行、ＩＳＡ ２０１２基準による主要臓器進行（心臓、腎臓、又は肝臓）又は何らかの原因による死亡。サイクル１から最初の進行性疾患又はフォローアップの終了までのいずれか早い方まで（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月間）、ＤＯＨＲを評価する。
－治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）を経験している参加者の割合：ＴＥＡＥは、治療期間中に発症する、悪化する、又は重篤になる有害事象として定義される。治療期間は、治験治療の最初の用量から治験治療の最後の用量の３０日後までの時間として定義され
る。ＴＥＡＥは、治験治療の最初の用量から試験治療の最後の用量の３０日後まで（２８日間のサイクルでおよそ１年間）評価する。
－全生存期間（ＯＳ）。ＯＳは、研究登録日から任意の原因による死亡までの時間として定義される。ＯＳは、サイクル１から死亡又はフォローアップの終了までのいずれか早い方（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月）で評価する。
－無増悪生存期間（ＰＦＳ）。ＰＦＳは、ＩＭＰの最初の投与から以下のいずれかまでの時間として定義される。血液学的進行、ＩＳＡ ２０１２基準による主要臓器進行（心臓、腎臓、又は肝臓）又は何らかの原因による死亡。ＰＦＳは、サイクル１から最初に来る最初の進行性疾患（臓器又は血液学的）又はフォローアップの終了（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月）まで評価される。
－最初の血液学的応答までの時間（ＴＴ１ＨＲ）。ＴＴ１ＨＲは、ＩＭＰの最初の投与から、続いて確認される最初の血液学的応答（ＰＲ又はそれ以上）の日付までの時間として定義される。サイクル１から最初の進行性疾患又はフォローアップの終了までのいずれか早い方まで（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月間）、ＴＴ１ＨＲを評価する。
－血液学的応答の持続時間（ＤＯＨＲ）。ＤＯＨＲは、ＩＭＰの最初の投与から以下のいずれかまでの時間として定義される。血液学的進行、ＩＳＡ ２０１２基準による主要臓器進行（心臓、腎臓、又は肝臓）又は何らかの原因による死亡。サイクル１から最初の進行性疾患又はフォローアップの終了までのいずれか早い方まで（２８日間のサイクルでおよそ１５ヶ月間）、ＤＯＨＲを評価する。
－治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）を経験している参加者の割合：ＴＥＡＥは、治療期間中に発症する、悪化する、又は重篤になる有害事象として定義される。治療期間は、治験治療の最初の用量から治験治療の最後の用量の３０日後までの時間として定義され
る。ＴＥＡＥは、治験治療の最初の用量から試験治療の最後の用量の３０日後まで（２８日間のサイクルでおよそ１年間）評価する。
【0515】
注入関連反応（ＩＡＲ）の発生率をサイクル１から治療終了まで（２８日間のサイクルでおよそ１年間）評価する。
【0516】
注射部位反応（ＩＳＲ）の発生率をサイクル１から治療終了まで（２８日間のサイクルでおよそ１年間）評価する。
【0517】
臨床検査値異常の発生率をサイクル１から治療終了まで（２８日間のサイクルでおよそ１年間）評価する。
【0518】
単剤療法におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの薬物動態（ＰＫ）パラメータの評価を、サイクル１から治療終了まで（２８日間のサイクルでおよそ１年間）評価する。
【0519】
単剤療法におけるＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生率を、サイクル１から治療終了まで（２８日間のサイクルでおよそ１年間）評価する。
【0520】
三次観察：
－日常生活動作（ＡＤＬ）及び手段的日常生活動作（ＩＡＤＬ）アンケートを使用した参加者の臨床転帰に対する虚弱の影響。
－起立性低血圧応答率は、スクリーニング時に起立性低血圧を有するコホートの参加者における起立性低血圧が１０ｍｍＨｇ増加したコホートの参加者の割合として定義され、仰臥収縮期血圧と比較した起立性収縮期血圧の２０ｍｍＨｇの減少として定義される。
－コホートにおけるパフォーマンスステータス改善率であって、カルノフスキーパフォーマンスステータス指数において少なくとも１０の改善を有する参加者の数として定義される、パフォーマンスステータス改善率。
－インターフェロン－ガンマ、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－ａ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１ｂ（ＩＬ－１ｂ）、ＭＩＰ－１ｂ等のサイトカインのレベル。
－免疫細胞プロファイリング及びＢＣＭＡ＋腫瘍細胞プロファイリング（血液及び骨髄［ＢＭ］吸引物）。
－細胞遺伝学的異常（主に限定されないが、ｔ［４；１４］、ｔ［１４；１６］；ｄｅｌ［１７ｐ］、及び［１ｑ２１＋］）。
－ＰＫ／薬力学的関係を調べる。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿ＮＫＣＥ ＰＫと、ＮＫ細胞数、ＮＫ細胞活性化マーカー、可溶性ＢＭＡ等のバイオマーカーとの関係。
－日常生活動作（ＡＤＬ）及び手段的日常生活動作（ＩＡＤＬ）アンケートを使用した参加者の臨床転帰に対する虚弱の影響。
－起立性低血圧応答率は、スクリーニング時に起立性低血圧を有するコホートの参加者における起立性低血圧が１０ｍｍＨｇ増加したコホートの参加者の割合として定義され、仰臥収縮期血圧と比較した起立性収縮期血圧の２０ｍｍＨｇの減少として定義される。
－コホートにおけるパフォーマンスステータス改善率であって、カルノフスキーパフォーマンスステータス指数において少なくとも１０の改善を有する参加者の数として定義される、パフォーマンスステータス改善率。
－インターフェロン－ガンマ、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－ａ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１ｂ（ＩＬ－１ｂ）、ＭＩＰ－１ｂ等のサイトカインのレベル。
－免疫細胞プロファイリング及びＢＣＭＡ＋腫瘍細胞プロファイリング（血液及び骨髄［ＢＭ］吸引物）。
－細胞遺伝学的異常（主に限定されないが、ｔ［４；１４］、ｔ［１４；１６］；ｄｅｌ［１７ｐ］、及び［１ｑ２１＋］）。
－ＰＫ／薬力学的関係を調べる。ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ＿ＮＫＣＥ ＰＫと、ＮＫ細胞数、ＮＫ細胞活性化マーカー、可溶性ＢＭＡ等のバイオマーカーとの関係。
【0521】
用量制限毒性（ＤＬＴ）：
この試験では、ＤＬＴを、サイクル１（２８日間）の間に国立癌研究所（ＮＣＩ）有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）バージョン５．０の基準を使用して評価して、最大耐量（ＭＴＤ）の確率を推定することになる。
この試験では、ＤＬＴを、サイクル１（２８日間）の間に国立癌研究所（ＮＣＩ）有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）バージョン５．０の基準を使用して評価して、最大耐量（ＭＴＤ）の確率を推定することになる。
【0522】
ＤＬＴ評価可能参加者とみなされるためには、参加者は、ＤＬＴ評価期間を完了し、ＤＬＴが発生しない限り、計画された用量の少なくとも７５％を受けなければならない。ＤＬＴ評価期間は、ＩＭＰの最初の投与から２８日目の終わりまでであるように選択されている。
【0523】
作用様式及びＢＣＭＡ標的化剤について採取された以前のデータを考慮すると、主に予想される治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）は以下の通りである。
【0524】
ＮＫ細胞係合に起因する：注入反応；
ＢＣＭＡ標的化に起因する：感染症に関連する又は関連しない血球減少症（好中球減少症、貧血及び血小板減少症）；Ｂ細胞形成不全；及び低ガンマグロブリン血症。
ＢＣＭＡ標的化に起因する：感染症に関連する又は関連しない血球減少症（好中球減少症、貧血及び血小板減少症）；Ｂ細胞形成不全；及び低ガンマグロブリン血症。
【0525】
この研究のＤＬＴは、以下を含む：
血液学的ＤＬＴ、疾患進行に起因しない限り、又は明らかに疾患進行又は明らかに無関係な原因に起因しない限り、以下のいずれか：
－連続して７日超持続するグレード４の好中球減少症
－グレード３以上の発熱性好中球減少症（ＡＮＣ＜１０００／ｍｍ＾３及び３８．３Ｃ超の単一温度又は３８．０℃以上の持続温度）又はグレード３以上の好中球減少性感染症。
－輸血を必要とする出血に関連するグレード３以上の血小板減少症。
－グレード４の血小板減少症が７日を超えて連続して持続する。
－基礎疾患によって説明されないグレード４の貧血。
－血小板減少症はＭＭの予期される合併症であり、参加者は既存の血小板減少症で研究に参加することができるため、出血がない場合の血小板輸血は、以前の基準を満たさない場合、ＤＬＴを示すとはみなされない。
血液学的ＤＬＴ、疾患進行に起因しない限り、又は明らかに疾患進行又は明らかに無関係な原因に起因しない限り、以下のいずれか：
－連続して７日超持続するグレード４の好中球減少症
－グレード３以上の発熱性好中球減少症（ＡＮＣ＜１０００／ｍｍ＾３及び３８．３Ｃ超の単一温度又は３８．０℃以上の持続温度）又はグレード３以上の好中球減少性感染症。
－輸血を必要とする出血に関連するグレード３以上の血小板減少症。
－グレード４の血小板減少症が７日を超えて連続して持続する。
－基礎疾患によって説明されないグレード４の貧血。
－血小板減少症はＭＭの予期される合併症であり、参加者は既存の血小板減少症で研究に参加することができるため、出血がない場合の血小板輸血は、以前の基準を満たさない場合、ＤＬＴを示すとはみなされない。
【0526】
非血液学的ＤＬＴ、疾患の進行又は明らかに無関係な原因による場合を除き、以下のいずれか：
－グレード３以上の非血液学的ＩＭＰ関連ＡＥ（ただし、以下を除く）：
・１週間未満継続するグレード３の疲労、又は
・１週間未満で少なくともグレード２に改善するグレード３の臨床検査異常（そうでない場合、関連するグレード４はＤＬＴとみなされるべきである）、又は
・７２時間まで持続し、臨床的に複雑ではなく、自発的に解消するか、又は従来の薬物介入に応答するグレード３以上の孤立性電解質異常、又は
・４８時間以内の最適な医学的管理に応答するグレード３の悪心／嘔吐／下痢、又は
・４８時間以内にグレード１以下又はベースラインに解消するグレード３注入関連反応又はサイトカイン放出症候群。期間にかかわらず任意のグレード４がＤＬＴであるべきである。
－肝機能障害：任意のグレード３以上の肝臓酵素（ＡＬＴ又はＡＳＴ）の上昇
－ＩＭＰ関連検査異常又はＴＥＡＥによるサイクル２の１４日を超える開始の遅延。
－治験責任医師及び治験依頼者がその重症度にかかわらず用量制限的であると考える任意の他のＡＥも、ＤＬＴとみなされ得る。
－グレード３以上の非血液学的ＩＭＰ関連ＡＥ（ただし、以下を除く）：
・１週間未満継続するグレード３の疲労、又は
・１週間未満で少なくともグレード２に改善するグレード３の臨床検査異常（そうでない場合、関連するグレード４はＤＬＴとみなされるべきである）、又は
・７２時間まで持続し、臨床的に複雑ではなく、自発的に解消するか、又は従来の薬物介入に応答するグレード３以上の孤立性電解質異常、又は
・４８時間以内の最適な医学的管理に応答するグレード３の悪心／嘔吐／下痢、又は
・４８時間以内にグレード１以下又はベースラインに解消するグレード３注入関連反応又はサイトカイン放出症候群。期間にかかわらず任意のグレード４がＤＬＴであるべきである。
－肝機能障害：任意のグレード３以上の肝臓酵素（ＡＬＴ又はＡＳＴ）の上昇
－ＩＭＰ関連検査異常又はＴＥＡＥによるサイクル２の１４日を超える開始の遅延。
－治験責任医師及び治験依頼者がその重症度にかかわらず用量制限的であると考える任意の他のＡＥも、ＤＬＴとみなされ得る。
【0527】
治験介入は、以下の順序に従って投与される：ＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥ（モンテルカストとは別に、ＮＫＣＥ投与の３０～６０分前）、次いでＮＫｐ４６－ＢＣＭＡ ＮＫＣＥの前投薬。
【0528】
参加者は、進行、許容できない毒性の発生、又は他の永続的な中止基準まで治験治療を受ける。
参加者は、潜在的な有害事象のリスクを予防又は低減するために、少なくとも４回の投与（モンテルカスト及びデキサメタゾン／メチルプレドニゾロンを除く）のために以下の薬物療法を受けるであろう。モンテルカストとは別に、全ての前投薬がＮＫＣＥ投与の１５～５０分前に与えられる。
・モンテルカスト（ＡＴＣコード：Ｒ０３ＤＣ０３）１０ｍｇ ＰＯ（サイクル１、１日目、８日目、１５日目にのみ投与する）：ＮＫＣＥ投与の２時間前。
・デキサメタゾン（ＡＴＣコード：Ｈ０２ＡＢ０２）投与の３０～６０分前に２０ｍｇ ＰＯ投与（サイクル１の１日目、８日目、１５日目）。或いは、メチルプレドニゾロン（ＡＴＣコード：Ｈ０２ＡＢ０４）又は同等物を１００ｍｇ ＩＶの用量で与えることがで
きる（サイクル１の１日目、８日目、１５日目）。
・アセトアミノフェン（パラセタモールＡＴＣコード：Ｎ０２ＢＥ０１）６５０ ｍｇ～１０００ｍｇ ＰＯ又はＩＶ
・ジフェンヒドラミン５０ｍｇ ＰＯ（ＡＴＣコード：Ｒ０５ＡＡ０２）又は同等物、例えば承認入手可能性によるセチリジン、プロメタジン、デクスクロルフェニラミン、又はジフェンヒドラミン２５～５０ｍｇ ＩＶ（又は同等物）。最初の４回のＮＫＣＥ投与には静脈内経路（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｒｏｏｔ）が好ましい。
参加者は、潜在的な有害事象のリスクを予防又は低減するために、少なくとも４回の投与（モンテルカスト及びデキサメタゾン／メチルプレドニゾロンを除く）のために以下の薬物療法を受けるであろう。モンテルカストとは別に、全ての前投薬がＮＫＣＥ投与の１５～５０分前に与えられる。
・モンテルカスト（ＡＴＣコード：Ｒ０３ＤＣ０３）１０ｍｇ ＰＯ（サイクル１、１日目、８日目、１５日目にのみ投与する）：ＮＫＣＥ投与の２時間前。
・デキサメタゾン（ＡＴＣコード：Ｈ０２ＡＢ０２）投与の３０～６０分前に２０ｍｇ ＰＯ投与（サイクル１の１日目、８日目、１５日目）。或いは、メチルプレドニゾロン（ＡＴＣコード：Ｈ０２ＡＢ０４）又は同等物を１００ｍｇ ＩＶの用量で与えることがで
きる（サイクル１の１日目、８日目、１５日目）。
・アセトアミノフェン（パラセタモールＡＴＣコード：Ｎ０２ＢＥ０１）６５０ ｍｇ～１０００ｍｇ ＰＯ又はＩＶ
・ジフェンヒドラミン５０ｍｇ ＰＯ（ＡＴＣコード：Ｒ０５ＡＡ０２）又は同等物、例えば承認入手可能性によるセチリジン、プロメタジン、デクスクロルフェニラミン、又はジフェンヒドラミン２５～５０ｍｇ ＩＶ（又は同等物）。最初の４回のＮＫＣＥ投与には静脈内経路（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｒｏｏｔ）が好ましい。
【0529】
トシリズマブ又は他の施設が推奨する介入は、参加者が重度のサイトカイン放出症候群の治療のために迅速な介入を必要とするベントにおいて常に現場で利用可能であるべきである。
【0530】
有効性評価：
主要エンドポイント及び副次的エンドポイントは、中央検査室Ｍタンパク質分析及びＩＳＡ ２０１２基準を使用した臓器進行／応答の局所評価に基づいて評価される。
主要エンドポイント及び副次的エンドポイントは、中央検査室Ｍタンパク質分析及びＩＳＡ ２０１２基準を使用した臓器進行／応答の局所評価に基づいて評価される。
【0531】
臨床検査は、スクリーニング時に（適格性について）、この場合もサイクル１／１日目（応答評価のためのベースライン）、次いで治療中から進行までの間の各サイクルの１日目に治験治療投与を開始する前の２４時間以内に、及び進行以外の理由で治験治療を中止する参加者については、ＰＤまでのフォローアップ中に４週間ごとに行われる：
・Ｍタンパク質定量（血清、２４時間尿、タンパク質免疫電気泳動、及び免疫固定）。サイクル１の１日目の後、検出不能なＭタンパク質（血清及び尿）の場合に免疫固定を行う。
・無血清軽鎖レベル。
・定量的免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）。
・Ｍタンパク質定量（血清、２４時間尿、タンパク質免疫電気泳動、及び免疫固定）。サイクル１の１日目の後、検出不能なＭタンパク質（血清及び尿）の場合に免疫固定を行う。
・無血清軽鎖レベル。
・定量的免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）。
【0532】
骨髄吸引：
形質細胞の割合を定量するためには、スクリーニング／ベースライン時（治験治療投与前２１日以内）に必要である。ＣＲ又はｓＣＲが疑われる場合、ＣＲ又はｓＣＲを確認するために繰り返す。
形質細胞の割合を定量するためには、スクリーニング／ベースライン時（治験治療投与前２１日以内）に必要である。ＣＲ又はｓＣＲが疑われる場合、ＣＲ又はｓＣＲを確認するために繰り返す。
【0533】
スクリーニングでのＭＲＤ評価のために、確認されたＣＲの時間、Ｃ１Ｄ１の１２ヶ月後（ＣＲ患者の場合）及び最初のＭＲＤ陰性の６ヶ月後。
【0534】
細胞遺伝学的評価の場合：スクリーニング時に、骨髄穿刺液を蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ｄｅｌ［１７ｐ］、ｔ［４；１４］、ｔ［１４；１６］）、１ｑ２１＋を含むが、これらに限定されない）分析のために採取する。
【0535】
スクリーニング時及び進行時のゲノム及び遺伝子プロファイリングのための骨髄吸引。
【0536】
全ての臓器の関与が、ベースライン時及び研究の経過中に評価されるべきである。臓器進行／応答は、ＩＳＡ ２０１２基準を使用して評価されるべきである。
【0537】
【表27】
【0538】
【表28】
【0539】
【表29】
【0540】
【表30】
【0541】
【表31】
【0542】
【表32】
【0543】
【表33】
【0544】
【表34】
【0545】
【表35】
【0546】
【表36】
【図1A-1B】
【図2A-2B】
【図3A-3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B-14D】
【図14E】
【図15A】
【図15B】
【図16A-16C】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23A-23B】
【図23C】
【図24A】
【図24B】
【図25A】
【図25B】
【図26A】
【図26B】
【図26C】
【図26D】
【図27A】
【図27B】
【図27C】
【図27D】
【図27E】
【図27F】
【図28A】
【図28B】
【図29A】
【図29B】
【図30A】
【図30B】
【図31A】
【図31B】
【図32A】
【図32B】
【図33A-33C】
【図34A-34B】
【図35】
【配列表】