特開 2025-19569 ＲＮＡ制御組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025019569

(43)【公開日】2025-02-07

(54)【発明の名称】ＲＮＡ制御組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20250131BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20250131BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20250131BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20250131BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20250131BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61P37/02

A61K31/7088

A61K47/55

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】2

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023123241

(22)【出願日】2023-07-28

(71)【出願人】

【識別番号】000125347

【氏名又は名称】学校法人近畿大学

(71)【出願人】

【識別番号】523287517

【氏名又は名称】株式会社クオリティートライアル

(74)【代理人】

【識別番号】100118924

【弁理士】

【氏名又は名称】廣幸 正樹

(72)【発明者】

【氏名】藤井 政幸

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076CC07

4C076EE59

4C084AA13

4C084ZB07

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB07

(57)【要約】

【課題】Ｒｅｇｎａｓｅ－１を用いたＲＮＡ制御組成物を提供する。
【解決手段】標的となるＲＮＡに対するアンチセンス核酸部と、
Ｒｅｇｎａｓｅ－１をリクルートできるステムループ部を有するＲＮＡ制御組成物は、アンチセンス核酸部を標的とするＲＮＡに結合するように設計し、Ｒｅｇｎａｓｅ－１をリクルートできるステムループ部を結合させた構造をしているので、標的とするＲＮＡの結合箇所に結合すると、Ｒｅｇｎａｓｅ－１がリクルートされ、Ｒｅｇｎａｓｅ－１が標的ＲＮＡを切断することで、任意のＲＮＡに対する制御組成物を提供することができる。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的となるＲＮＡに対するアンチセンス核酸部と、
Ｒｅｇｎａｓｅ－１をリクルートできるステムループ部を有するＲＮＡ制御組成物。

【請求項2】

前記ステムループ部は前記アンチセンス核酸部より５’側に設けられている請求項１に記載されたＲＮＡ制御組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はＩＬ－６等の炎症性関連ｍＲＮＡの安定性制御に関与しているＲｅｇｎａｓｅ－１（レグネース－１）が結合するステムループ構造（ＳＬ）とｍＲＮＡに配列特異的に結合するアンチセンス核酸（ＡＳＯ）を連結した化学修飾ＡＳＯ－ＳＬによるｍＲＮＡの翻訳領域および非翻訳領域の任意の配列に結合してそのｍＲＮＡを切断し、タンパク質への翻訳を阻害する物質に関する。

【背景技術】

【0002】

炎症性サイトカインの暴走であるサイトカインストームは、様々な疾患で問題となる。ＩＬ－６等の炎症性サイトカインはＲＮＡ分解酵素であるＲｅｇｎａｓｅ－１によって制御されているとされている。しかし、Ｒｅｇｎａｓｅ－１を標的とした自己免疫疾患制御法は従来開発されていなかった。

【0003】

この課題に鑑みて、特許文献１では、Ｒｅｇｎａｓｅ－１ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊することでＲｅｇｎａｓｅ－１を増加させることを見出したことで、炎症性サイトカインを制御する組成物が提案された。ここでは、Ｒｅｇｎａｓｅ－１ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊する物質として、特定の配列のヌクレオチドが示されている。

【0004】

この作用機序は、Ｒｅｇｎａｓｅ－１ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるステムループ構造を破壊することで、Ｒｅｇｎａｓｅ－１が自分自身を破壊することが無くなるため結果としてＲｅｇｎａｓｅ－１が増加するというものである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１９／１８２０５５号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の基礎と今後の臨床展開、日本輸血細胞治療学会誌、第６５巻第６号８５１－８５７

【非特許文献2】Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＥＧＮＡＳＥ－１ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｌｏｎｇ－ｌｉｖｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃeｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｗｅｉ Ｊ，ＬｏｎｇＬ［．．］ Ｃｈｉ Ｈ．Ｎａｙｕｒｅ．２０１９－１２－１１．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

Ｒｅｇｎａｓｅ－１ｍＲＮＡのステムループ構造を破壊することで、自分自身の増加を促せるというのは、従来にない作用機序であり、将来的に炎症性サイトカインの制御の一躍を担うと考えられる。

【0008】

一方、Ｒｅｇｎａｓｅ－１を標的とする方法の出現によって、これまで課題とされていた以下の問題を解決できるのではないかと想到した。

【0009】

（１）ＣＡＲ－Ｔ細胞療法薬の免疫疲弊
ゲノム編集技術により癌細胞への攻撃力を強化したＴ細胞を利用したＣＡＲ－Ｔ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）細胞療法薬キムリア（登録商標）（ノバルティスファーマ、２０１９年３月２６日厚生労働省承認）が初の細胞療法薬として再発又は難治性のＣＤ１９陽性Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病および、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の治療に効果を発揮しており、さらに固形がんへの応用などが期待されている。

【0010】

しかし、ＣＡＲ－Ｔでは時間経過とともにその効果が減弱する免疫疲弊が課題となっている（非特許文献１）。一方で、Ｒｅｇｎａｓｅ－１をノックアウトしたＣＤ８陽性Ｔ細胞は疲弊することなく活性が持続することが報告されている（非特許文献２）。

【0011】

しかしながら、Ｒｅｇｎａｓｅ－１を生体内でノックアウトすることなどできないので、この報告技術をＣＡＲ－Ｔ療法に応用することは不可能である。

【0012】

（２）免疫チェックポイント阻害薬への耐性
近年、多くの免疫チェックポイント阻害剤が開発され、様々な癌治療に適用されて効果を発揮している。しかし、免疫チェックポイント阻害薬の治療効果は患者の３０％に限定され、７０％では免疫チェックポイント阻害薬抵抗性である。これらの免疫チェックポイント阻害薬抵抗性癌に対する免疫機能（細胞傷害性Ｔ細胞）の活性化が課題となっている。

【0013】

（３）ｍＲＮＡワクチンによる強い副反応
新型コロナウイルスに対するｍＲＮＡはその高い効果により、新型コロナウイルスパンデミック克服への救世主として多大な貢献をしている。一方で、効果が高いゆえに、高熱を発生したり、接種部が腫れるなどの強い副反応も報告されている。

【0014】

（４）アンチセンス核酸医薬、ｓｉＲＮＡ核酸医薬の限界
核酸医薬は化学合成オリゴ核酸を用いて標的となる特定の遺伝子発現を制御して疾病を治療するものであり、近年、多くの核酸医薬が承認されている。核酸医薬にはいくつかの作用機序が知られているが、アンチセンス核酸や、ｓｉＲＮＡ核酸にはよりｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害することにより疾病を治療する機序は大行的なものである。

【0015】

アンチセンス核酸は化学修飾により機能向上が図られるが多くの場合ＲＮａｓｅＨの活性を阻害して、アンチセンス核酸としての効果が減弱する。ｓｉＲＮＡ核酸は細胞内のアルゴノート２等複合体を形成してその機能を発揮するが、非特異的なオフターゲット効果が問題であり、化学修飾によりその効果が低下することが多い。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明の発明者は上記の特許文献１および上記課題に鑑みて、これらの課題を解決できる発想を得た。すなわち、本発明は、Ｒｅｇｎａｓｅ－１が特定のステムループによってリクルートされ、リクルートされた先のＲＮＡを切断する能力を有する点に着目したもので、標的とする任意のＲＮＡに結合するアンチセンス核酸にそのステムループを結合させた組成物である。

【0017】

より具体的に本発明は、
標的となるＲＮＡに対するアンチセンス核酸部と、
Ｒｅｇｎａｓｅ－１をリクルートできるステムループ部を有するＲＮＡ制御組成物を提供する。

【発明の効果】

【0018】

本発明に係る組成物は、それ自身はＲＮＡを切断しないが、細胞内のようにＲｅｇｎａｓｅ－１が存在する環境下では、Ｒｅｇｎａｓｅ－１をリクルートすることで、ＲＮＡを切断することができる。これによって、以下のような応用が考えられる。

【0019】

（１）ＣＡＲ－Ｔ細胞療法薬の免疫疲弊の防止
本技術を応用してＲｅｇｎａｓｅ－１を標的とするＡＳＯ－ＳＬをＣＡＲ－Ｔ細胞療法薬と併用することによって、Ｒｅｇｎａｓｅ－１のｍＲＮＡを強く抑制して免疫疲弊を防ぎながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を維持した療法が可能であると期待できる。

【0020】

（２）免疫チェックポイント阻害薬耐性癌の克服
本技術を応用してＲｅｇｎａｓｅ－１を標的とするＡＳＯ－ＳＬを免疫チェックポイント阻害薬と併用することによって、Ｒｅｇｎａｓｅ－１のｍＲＮＡを強く抑制して免疫疲弊を防ぎながら、免疫チェックポイント阻害薬の活性を維持した療法が可能であると期待できる。

【0021】

（３）ｍＲＮＡワクチンによる強い副反応
ｍＲＮＡワクチンと炎症関連ｍＲＮＡを標的とする化学合成ＡＳＯ－ＳＬを併用することでｍＲＮＡワクチンによる副反応を緩和できる可能性がある。

【0022】

（４）アンチセンス核酸医薬、ｓｉＲＮＡ核酸医薬の弱点を克服した新規核酸医薬
本技術はｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害することで特定の遺伝子発現を制御する手法として新規なものであり、本来、炎症関連遺伝子のｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（非翻訳領域）に作用するＲｅｇｎａｓｅ－１を利用して、癌慣例遺伝子や様々な遺伝子のｍＲＮＡのコーディング領域（ＣＤＳ）に作用してその発現制御を可能にした。しかも、Ｒｅｇｎａｓｅ－１はｍＲＮＡに形成されるステムループ構造を認識してそのｍＲＮＡを切断する機能を有しているが、化学合成したステムループ構造核酸を外部から導入することによってもＲｅｇｎａｓｅ－１によるｍＲＮＡを切断する機能を可能にした点で、簡便にあらゆる遺伝子の発現を人為的に制御することを可能にしたものである。

【0023】

しかも、ＡＳＯには、様々な種類の核酸誘導体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルポリノ核酸、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）核酸、糖２’－修飾核酸（２’－ＯＭｅＲＮＡ、２’－ＭＯＥＲＮＡ、ＢＮＡ、ＥＮＡなど）、ホスホロチオエート核酸などを利用でき、生体内での安定性や標的への親和性など用途にあわせて調整が可能である。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】本発明に係るＲＮＡ制御組成物の構造の模式図である。

【図2】本発明に係るＲＮＡ制御組成物の動作を説明する模式図である。

【図3】各種細胞に発現するＲｅｇｎａｓｅ－１の発現量を調べたグラフである。

【図4】本発明に係るＲＮＡ制御組成物を含む様々なサンプルが、ＨｅＬａ細胞中のＫＲＡＳの発現量をどのように変化させるかを調べたグラフである。

【図5】本発明に係るＲＮＡ制御組成物を含む様々なサンプルが、ＰＫ－４５Ｈ細胞中のＫＲＡＳＧ１２Ｄの発現量をどのように変化させるかを調べたグラフである。

【図6】本発明に係るＲＮＡ制御組成物を含む様々なサンプルが、ＨｅＬａ細胞中のＮＲＡＳの発現量をどのように変化させるかを調べたグラフである。

【図7】本発明に係るＲＮＡ制御組成物を含む様々なサンプルが、ＰＫ－４５Ｈ細胞中のＮＲＡＳの発現量をどのように変化させるかを調べたグラフである。

【図8】本発明に係るＲＮＡ制御組成物を含む様々なサンプルが、ＨｅＬａ細胞中のＨＲＡＳの発現量をどのように変化させるかを調べたグラフである。

【図9】本発明に係るＲＮＡ制御組成物を含む様々なサンプルが、ＰＫ－４５Ｈ細胞中のＨＲＡＳの発現量をどのように変化させるかを調べたグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0025】

以下に本発明に係るＲＮＡ制御組成物について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。また、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。

【0026】

図１に本発明に係るＲＮＡ制御組成物の構造を模式的に示す。本発明に係るＲＮＡ制御組成物１は、標的となるＲＮＡに結合するアンチセンス核酸部１０とＲｅｇｎａｓｅ－１をリクルートできるステムループ部１２が結合された組成物である。アンチセンス核酸部１０は、標的となるＲＮＡの所望の箇所の塩基配列に対するアンチセンス核酸である。

【0027】

アンチセンス核酸としては、ＲＮａｓｅＨ依存性と、非依存性の作用機序が知られている。ＲＮａｓｅＨ非依存的に立体的ブロックによりｍＲＮＡからの翻訳を阻害するアンチセンス核酸としては、２’－ＯＭｅＲＮＡ（２’－Ｏ－メチルＲＮＡ）、２’－ＭＯＥＲＮＡ（２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（Ｎ－エチルＢＮＡ）などの糖修飾核酸、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルホリノ核酸、オリゴＲＮＡなどが知られている。

【0028】

一方、ＲＮａｓｅＨ依存的に標的ｍＲＮＡを切断するＡＳＯとしてはオリゴＤＮＡ、ホスホロチオエート核酸、ホスホロアミデート核酸やこれらの核酸を２’－ＯＭｅＲＮＡやＬＮＡなどで挟んだＧａｐｍｅｒＡＳＯなどが知られている。本発明においては、技術には両方のＡＳＯをアンチセンス核酸部１０として用いることができる。

【0029】

ステムループ部１２は、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－１２ｐ４０４－７といった炎症作用に係る遺伝子や、Ｒｅｇｎａｓｅ－１自身の３’ＵＴＲに形成されるステムループ構造が好適に利用できる。また、これらのステムループ構造を参考に人工的に設計されたステムループ構造であってもよい。具体的な例示を表１に示す。

【0030】

【表1】

【0031】

表１を参照して、配列番号１はＩＬ－６の３’－ＵＴＲに形成されているステムループ構造である。また、配列番２および配列番号３は、Ｒｅｇｎａｓｅ－１のｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ部分に形成されているステムループ構造である。

【0032】

また、配列番号４、配列番号５、配列番号６はこれらのステムループ構造から設計した人工的なステムループ構造である。これらの塩基構造が好適に利用できるが、これら以外の構造であっても、Ｒｅｇｎａｓｅ－１を好適にリクルートできれば、もちろん利用することができる。

【0033】

アンチセンス核酸部１０とステムループ部１２は、後述する実施例でも示すように、ステムループ部１２が５’側に配置させるのがよい。

【0034】

次に本発明に係るＲＮＡ制御組成物１の動作について説明する。図２（ａ）を参照する。標的となるＲＮＡ（以後「標的Ｔ１０」と呼ぶ。）は、任意のＲＮＡでよい。つまり、ｍＲＮＡであることに限定されない。また、翻訳領域、非翻訳領域の区別も不用であり、どちらの領域でも構わない。標的Ｔ１０にＲＮＡ制御組成物１を結合させる箇所を結合箇所Ｔ１０ｓとする。もちろん、ＲＮＡ制御組成物１のアンチセンス核酸部１０は、結合箇所Ｔ１０ｓに対するアンチセンスの構造を有する。そこで、ＲＮＡ制御組成物１のアンチセンス核酸部１０は結合箇所Ｔ１０ｓに結合する。

【0035】

図２（ｂ）を参照する。標的Ｔ１０の結合箇所Ｔ１０ｓにＲＮＡ制御組成物１が結合すると、Ｒｅｇｎａｓｅ－１（２０）がステムループ部１２にリクルートされてくる。そして、標的Ｔ１０を切断する。このようにして、ＲＮＡ制御組成物１は標的Ｔ１０を切断することができる。したがって、本発明に係るＲＮＡ制御組成物１はＲｅｇｎａｓｅ－１が存在する環境での使用が前提となる。

【実施例0036】

＜各種細胞のＲｅｇｎａｓｅ－１の発現量の定量＞
本発明に係るＲＮＡ制御組成物１はＲｅｇｎａｓｅ－１が存在する環境が必要である。そこで、各種細胞におけるＲｅｇｎａｓｅ－１の発現量を定量した。定量した細胞腫は以下のとおりである。ＨｅＬａ細胞（子宮頸癌由来細胞株）、ＰＫ－４５Ｈ（ヒト膵臓癌由来細胞株）、ＰＫ－１（ヒト膵臓癌由来細胞株）、ＰＫ－５６（ヒト膵臓癌由来細胞株））、Ｔ３Ｍ－１０（肺大細胞癌由来細胞株）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）、Ｋ５６２（白血病細胞株）、ＭＴ－１（白血病細胞株）、ＭＴ－２（白血病細胞株）、ＴＨＰ－１細胞（ヒト単球由来細胞株）、Ｕ２ＯＳ ＧＦＰ－ＮＵＰ９８（骨肉腫細胞由来細胞株）、２９３（ヒト胎児腎由来細胞株）、２９３Ｔ（ヒト胎児腎由来細胞株）である。

【0037】

各種細胞のＲｅｇｎａｓｅ－１の発現量については常法により算出した。用いたプライマーを表２に示す。

【0038】

【表2】

【0039】

結果を図３に示す。図３を参照して、横軸は各種細胞であり、縦軸はＲｅｇｎａｓｅ－１の発現量である。なお、発現量は各種細胞におけるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）の発現量に対する相対値である。また、横軸の各種細胞は２回ずつ測定したことを表す。

【0040】

図３を参照して、癌細胞、正常細胞を問わず、Ｒｅｇｎａｓｅ－１は細胞内に存在することが確認された。したがって、本発明に係るＲＮＡ制御組成物１は、生体細胞に対して利用することができる。

【0041】

＜ＫＲＡＳ遺伝子の選択的抑制＞
［ＨｅＬａ細胞］
野生型ＫＲＡＳを発現するＨｅＬａ細胞中でＫＲＡＳ－ＷＴｍ、ＫＲＡＳ－ＷＴｍ－３ＳＬ、ＫＲＡＳ－ＷＴｍ－５ＳＬのサイレンシング効果を評価した。比較対象としてｓｉＲＮＡＷＴ（１３）とｓｉＲＮＡＧ１２Ｄ（１３）によるサイレンシング効果も評価した。これらの核酸誘導体は通常のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置と市販試薬を使って、標準的なホスホアミダイト法により合成した。合成後、常法に従ってアンモニア水中５５℃で５～６時間加熱した後、逆相ＨＰＬＣにより生成した。得られた化合物は逆相ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレー質量分析装置（ＥＳＩ－ＭＳ）により目的の化合物であることを確認した。

【0042】

なお、ＫＲＡＳ－ＷＴｍは、ＫＲＡＳの野生型に結合するアンチセンス核酸を示す。「ｍ」はこれらのアンチセンス核酸が２’－ＯＭｅＲＮＡ（２’－Ｏ－メチルＲＮＡ）であることを示す。これは核酸を構成する糖部分の２’末端がメチル化されているもので、構造の安定性を持たせるためである。

【0043】

ＫＲＡＳ－ＷＴｍ－３ＳＬは、ＫＲＡＳの野生型に結合するアンチセンス核酸部（ＫＲＡＳ－ＷＴｍ）にステムループ部（－３ＳＬ）がアンチセンス核酸部の３’末端側に結合した構造であることを示す。ここでは配列番号４のステムループ構造を用いた。

【0044】

ＫＲＡＳ－ＷＴｍ－５ＳＬは同様に、ＫＲＡＳの野生型に結合するアンチセンス核酸部（ＫＲＡＳ－ＷＴｍ）にステムループ部（－５ＳＬ）がアンチセンス核酸部の５’末端側に結合した構造であることを示す。表３にこれらの塩基配列を配列番号９－１１として示す。また、これらの緒言を表４に示す。

【0045】

【表3】

【0046】

【表4】

【0047】

また、比較対象としたｓｉＲＮＡＷＴ（１３）はｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を用いてＫＲＡＳの野生型をノックアウトするものである。また、ｓｉＲＮＡＧ１２Ｄ（１３）はＫＲＡＳの第１２アミノ酸をＧ（グリシン）からＤ（アスパラギン酸）に変異させたミュータントを標的としてノックアウトするものである。それぞれの塩基配列を配列番号１２および１３として表５に示す。

【0048】

【表5】

【0049】

ｓｉＲＮＡＷＴ（１３）とｓｉＲＮＡＧ１２Ｄ（１３）は５’末端から１３番目の塩基が変わっている。表５では、右肩に「＊」をつけたシトシンとウラシルの違いである。

【0050】

結果を図４に示す。図４を参照して、横軸はサンプルの種類であり、縦軸は１８Ｓに対するＫＲＡＳ発現量の相対値である。横軸を参照して、「Ｎｏｎｅ」は・・・を表し、「ＬＰ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）という遺伝子導入試薬だけを細胞培養液に加えて、その時のＫＲＡＳｍＲＮＡを定量した値を表し、Ｃｏｎｔｒｏｌは、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を表す。

【0051】

また、「ＷＴ（１３）」はｓｉＲＮＡＷＴ（１３）を用いた場合を表し、「Ｇ１２Ｄ（１３）」はｓｉＲＮＡＧ１２Ｄ（１３）を用いた場合を表す。「ＷＴｍ」、「３ＳＬ」、「５ＳＬ」はそれぞれＫＲＡＳ－ＷＴｍ、ＫＲＡＳ－ＷＴｍ－３ＳＬ、ＫＲＡＳ－ＷＴｍ－５ＳＬを用いた場合である。

【0052】

なお、以下サイレンシング効果（％）は、ＬＰ２０００の値を１００％とし、バーが１００より下がった分をサイレンシング効果（％）とした。

【0053】

野生型ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡＷＴ（１３）ではＫＲＡＳＷＴｍＲＮＡをほぼ濃度依存的に抑制し、１０ｎＭ、１００ｎＭにおいて約７５％のサイレンシング効果を示した。一方、変異型ＫＲＡＳＧ１２ＤｍＲＮＡ標的とするｓｉＲＮＡＧ１２Ｄ（１３）では全くサイレンシング効果は見られなかった。

【0054】

また、野生型ＫＲＡＳｍＲＮＡに対するアンチセンス配列ＫＲＡＳ－ＷＴｍは全くサイレンシング効果を示さなかったが、Ｒｅｇｎａｓｅ－１結合ＲＮＡモチーフをＫＲＡＳ－ＷＴＴｍの３’－末端側に結合したＫＲＡＳ－ＷＴｍ－３ＳＬはＫＲＡＳＷＴｍＲＮＡを濃度依存的に抑制し、１００ｎＭで５０％、１０００ｎＭで７５％のサイレンシング効果を示した。しかしながら、ＫＲＡＳ－ＷＴｍ－５ＳＬは優位なサイレンシング効果は示さなかった。

【0055】

これらの結果はＫＲＡＳ－ＷＴｍ－３ＳＬがＲｅｇｎａｓｅ－１をリクルートし、Ｒｅｇｎａｓｅ－１がその結合部位の３’側でＫＲＡＳＷＴｍＲＮＡを切断することによりサイレンシング効果を発揮したと強く示唆された。

【0056】

［ＰＫ－４５Ｈ細胞］
変異型ＫＲＡＳＧ１２Ｄを発現するＰＫ－４５Ｈ細胞中でのサイレンシング効果を評価した。結果を図５に示す。図５を参照して、横軸はサンプル種であり、縦軸はＫＲＡＳＧ１２Ｄの発現量である。各サンプル種は図４の場合と同様である。

【0057】

比較対象となるｓｉＲＮＡ－ＷＴ（１３）は弱いながら２５－５０％のサイレンシング効果を示した。ＰＫ－４５Ｈ細胞中では野生型ＫＲＡＳＷＴを発現していないことからｓｉＲＮＡ－ＷＴ（１３）が変異型ＫＲＡＳＧ１２ＤｍＲＮＡも標的としたことがわかる。

【0058】

すなわち、ｓｉＲＮＡ－ＷＴ（１３）は標的の一塩基変異を識別できなかったことになる。ｓｉＲＮＡＧ１２Ｄ（１３）は順当に濃度依存的にサイレンシング効果を示し、１０ｎＭで７５％、１００ｎＭで８０％のサイレンシング効果を示した。

【0059】

一方、ＫＲＡＳ－ＷＴｍ、ＫＲＡＳ－ＷＴｍ－３ＳＬ、ＫＲＡＳ－ＷＴｍ－５ＳＬのサイレンシング効果を評価したところ、いずれも全くサイレンシング効果を示さなかった。ＫＲＡＮ－ＷＴｍの配列は、ＫＲＡＳＧ１２ＤｍＲＮＡに対して中央にミスマッチを有しており（表４参照）、その対合の熱力学的安定性の低下によりサイレンシング効果を示さなかったと考えられ、ＫＲＡＳ－ＷＴｍ－３ＳＬは非常に高い１塩基変異識別能を有していることを示している。

【0060】

さらには、ＲＡＳファミリーのＨＲＡＳ遺伝子やＮＲＡＳ遺伝子には全く影響を与えないことも実証できた（図６～図９）。すなわち、ＡＳＯ－ＳＬモチーフを利用する遺伝子サイレンシング法は非常に特異性の高い新規核酸医薬として有望であり、特に一塩基変異を識別する変異癌遺伝子を標的とする核酸医薬として有望である。

【0061】

図６にはＨｅＬａ細胞のＮＲＡＳについて、図７はＰＫ－４５Ｈ細胞のＮＲＡＳについて調べたものである。また、図８はＨｅＬａ細胞のＨＲＡＳについて、図９はＰＫ－４５Ｈ細胞のＨＲＡＳについて調べたものである。いずれの場合もＫＲＡＳ－ＷＴｍ－３ＳＬは全くサイレンシング効果を示していないことがわかる。

【0062】

＜発明による効果＞
１．ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする化学修飾アンチセンス核酸（ＡＳＯ）とＲｅｇｎａｓｅ－１結合配列（ＳＬ）を連結した化学合成ＡＳＯ－ＳＬを子宮頸がん由来ＨｅＬａ細胞に導入することによりＫＲＡＳｍＲＮＡの発現を濃度依存的に制御することに成功した。新規遺伝子発現制御法として新規核酸医薬への応用が期待できる。

【0063】

２．上記ＡＳＯ－ＳＬを膵癌由来ＰＫ－４５Ｈ細胞に導入した場合に発現しているＧ１２Ｄ変異ＫＲＡＳ遺伝子ｍＲＡＮ量はほとんど影響を受けなった。すなわち、ＡＳＯ－ＳＬはＫＲＡＳ遺伝子中の１塩基変異（３５Ｇ＞Ａ）を識別して、標的遺伝子を特異的に抑制した。

【0064】

３．上記ＡＳＯ－ＳＬはＨｅＬａ細胞中でも、ＰＫ－４５Ｈ細胞中でも、ＨＲＡＳ遺伝子やＮＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡ量に全く影響を与えなかった。すなわち、ＡＳＯ－ＳＬはＨｅＬａ細胞中の野生型ＫＲＡ遺伝子ｍＲＮＡのみを選択的に制御した。

【0065】

４．Ｒｅｇｎａｓｅ－１は本来炎症関連遺伝子のｍＲＮＡの非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に作用するが、化学合成ＡＳＯ－ＳＬを利用することであらゆる細胞に発現するあらゆる遺伝子に作用させることが可能となった。しかも、ｍＲＮＡの翻訳領域（コーディング領域）を標的とすることが可能となり、汎用性の高い直接的な翻訳制御が可能となった。

【0066】

５．化学合成ＡＳＯ－ＳＬを利用することで、生体内で安定的に遺伝子発現制御を行うことが可能となった。

【0067】

６．ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲｅｇｎａｓｅ－１を標的とする化学合成ＡＳＯ－ＳＬを併用することで、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の効果が次第に減弱する免疫疲弊を解決する方法となり得る。

【0068】

７．免疫チェックポイント阻害薬とＲｅｇｎａｓｅ－１を標的とする化学合成ＡＳＯ－ＳＬを併用することで免疫チェックポイント阻害薬治療後のＴ細胞疲弊を解消できる可能性がある。

【0069】

８．ｍＲＮＡワクチンと炎症関連ｍＲＮＡを標的とする化学合成ＡＳＯ－ＳＬを併用することでｍＲＮＡワクチンによる副反応を緩和できる可能性がある。

【0070】

９．癌関連遺伝子ｍＲＮＡを標的とする化学合成ＡＳＯ－ＳＬを用いて癌細胞の増殖を抑制できる可能性がある。

【0071】

１０．疾病関連遺伝子を標的とする化学合成ＡＳＯ－ＳＬを用いて疾病を根本治療できる可能性がある。

【産業上の利用可能性】

【0072】

本技術により癌遺伝子の選択的発現抑制、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法や免疫チェックポイント阻害剤との併用による免疫疲弊の防止、ｍＲＮＡワクチンの副反応抑制などが期待できる。

【符号の説明】

【0073】

１ ＲＮＡ制御組成物
１０ アンチセンス核酸部
１２ ステムループ部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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