特開 2025-19991 マクロファージの貪食促進剤、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化剤及びミエロイド系樹状細胞の活性化剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025019991

(43)【公開日】2025-02-07

(54)【発明の名称】マクロファージの貪食促進剤、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化剤及びミエロイド系樹状細胞の活性化剤

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/135 20160101AFI20250131BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250131BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20250131BHJP

   A61K 35/747 20150101ALI20250131BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20250131BHJP

【ＦＩ】

A23L33/135

A61P43/00 111

A61P37/04

A61P43/00 107

A61K35/747

C12N1/20 A

【審査請求】有

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024076335

(22)【出願日】2024-05-09

(31)【優先権主張番号】P 2023123519

(32)【優先日】2023-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】598162665

【氏名又は名称】株式会社山田養蜂場本社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100211199

【弁理士】

【氏名又は名称】原田 さやか

(74)【代理人】

【識別番号】100206944

【弁理士】

【氏名又は名称】吉川 絵美

(72)【発明者】

【氏名】野々部 修平

(72)【発明者】

【氏名】奥村 暢章

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 隆志

(72)【発明者】

【氏名】板谷 颯

【テーマコード（参考）】

4B018

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B018LB01

4B018LB08

4B018LB09

4B018LB10

4B018MD86

4B018ME14

4B018MF04

4B018MF05

4B018MF06

4B018MF13

4B018MF14

4B065AA30X

4B065AC14

4B065BA22

4B065CA41

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC56

4C087MA16

4C087MA17

4C087MA22

4C087MA23

4C087MA28

4C087MA34

4C087MA35

4C087MA37

4C087MA41

4C087MA43

4C087MA52

4C087MA55

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB22

4C087ZC02

(57)【要約】

【課題】乳酸菌によるマクロファージの貪食促進剤を提供する。また、乳酸菌によるプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化剤も提供する。さらには、乳酸菌によるミエロイド系樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化剤も提供する。
【解決手段】ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を有効成分として含むことにより、マクロファージの貪食促進剤、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化剤、ミエロイド系樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化剤を提供することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を有効成分として含む、マクロファージの貪食促進剤。

【請求項2】

ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を有効成分として含む、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化剤。

【請求項3】

ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を有効成分として含む、ミエロイド系樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化剤。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載の剤を含む、免疫賦活剤。

【請求項5】

食品組成物、医薬品又は医薬部外品である、請求項４に記載の免疫賦活剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マクロファージの貪食促進剤、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化剤及びミエロイド系樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化剤に関する。具体的には、女王蜂由来乳酸菌（ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６））によるマクロファージの貪食促進剤、プラズマサイトイド樹状細胞の活性化剤及びミエロイド系樹状細胞活性化剤に関する。

【背景技術】

【0002】

乳酸菌は、免疫を活性化（免疫賦活化）するものとして注目されている。また、免疫賦活は免疫細胞が活性化することで起こることも知られている。免疫はマクロファージや樹状細胞、ＮＫ細胞が中心となり抗原非特異的に初期応答を示す自然免疫と、リンパ球が中心となり抗原特異的に応答を示す獲得免疫に大別される。

【0003】

乳酸菌によってマクロファージを活性化する方法が検討されている。例えば特許文献１には、ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２と呼ばれる花粉荷から単離された乳酸菌がマクロファージの活性化を有することが開示されている。

【0004】

また、特許文献２には、乳酸菌によってプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を活性化する方法が開示されている。

【0005】

さらに、特許文献３には、女王蜂成虫の腸内から単離されたラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）と呼ばれる乳酸菌を用いて、ローヤルゼリーに含む１０－ヒドロキシ－２－デセン酸を１０－ヒドロキシデカン酸に変換する方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０２２－１０８８６０号公報

【特許文献2】特開２０１７－２０１９８４号公報

【特許文献3】国際公開第２０２１／０３３７２６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、新規なマクロファージの貪食促進剤、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化剤及びミエロイド系樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らが、上記目的を達成すべく鋭意研究の結果、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）がマクロファージの貪食促進作用、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化作用及びミエロイド系樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化を有することを見出し、本発明を完成させた。

【0009】

すなわち、本発明には、例えば以下の発明に関する。
［１］ ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を有効成分として含む、マクロファージの貪食促進剤。
［２］ ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を有効成分として含む、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化剤。
［３］ ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を有効成分として含む、ミエロイド系樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化剤。
［４］ ［１］～［３］のいずれか一項に記載の剤を含む、免疫賦活剤。
［５］ 食品組成物、医薬品又は医薬部外品である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の剤。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、新規なマクロファージの貪食促進剤、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化剤及びミエロイド系樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株の添加によるマクロファージの貪食率及び平均蛍光強度を示すグラフである。

【図2】ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株の添加によるｐＤＣ及びｍＤＣにおける樹状細胞活性化マーカーの平均蛍光強度を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本発明において、プラズマサイトイド樹状細胞は「ｐＤＣ」とも表記され、ミエロイド系樹状細胞は「ｍＤＣ」とも表記される。また、本発明においてラクトバチルス・パニサピウムＭ１株は、「Ｍ１株」とも表記される。

【0013】

本実施形態に係るマクロファージの貪食促進剤は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株を有効成分として含む。つまり本実施形態に係るマクロファージの貪食促進剤は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株を有効成分として含むため、マクロファージの貪食を促進させることができる。

【0014】

本実施形態に係るｐＤＣの活性化剤は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株を有効成分として含む。つまり本実施形態に係るｐＤＣの活性化剤は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株を有効成分として含むため、ｐＤＣを活性化させることができる。

【0015】

本実施形態に係るｍＤＣの活性化剤は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株を有効成分として含む。つまり本実施形態に係るｍＤＣの活性化剤は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株を有効成分として含むため、ｍＤＣを活性化させることができる。

【0016】

ｐＤＣ又はｍＤＣの活性化とは、具体的には例えば、ｐＤＣ又はｍＤＣのＴ細胞への抗原提示能の向上であってよい。

【0017】

［ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株］
ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６として独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２－０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に２０２０年１月１６日付で寄託されており、入手可能である。

【0018】

有効成分としてのＭ１株は、菌体そのものであってよく、菌体処理物であってもよい。菌体は、生菌体又は死菌体であってよい。菌体処理物は、菌に、例えば、加熱、ペースト化、乾燥（凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥等）、凍結、溶菌、破砕、抽出等の処理がなされたものであってよい。破砕は、例えば超音波により行うことができる。処理は複数種を組み合わせて行ってもよい。菌体処理物は、菌体処理物に除タンパク処理を行った後の上清、又は菌体培養物及び発酵物の固形分を除去した上清であってもよいＭ１株としては、単離した菌体であってもよく、菌体の発酵物又は培養物であってもよい。

【0019】

Ｍ１株の培養は、常法に従って行うことができる。培地は、当該菌が培養できるものであれば特に制限はなく、天然培地、合成培地、半合成培地等を用いることができる。培地としては、窒素源及び炭素源を含有するものを使用することができ、窒素源としては、肉エキス、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、グルテン、大豆粉、大豆加水分解物、アミノ酸等が挙げられ、炭素源としては、グルコース、ラクトース、フラクトース、イノシトール、ソルビトール、水飴、澱粉、麹汁、フスマ、バカス、糖蜜等が挙げられる。その他、無機質（例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、炭酸カルシウム、鉄、マンガン、モリブデン）、各種ビタミン類などを添加することができる。

【0020】

培養温度は、例えば４～４５℃であってよく、２５～４０℃、２８～３７℃、３０～３３℃であってもよい。培養は、通気振とう又は通気撹拌して行ってもよい。培地のｐＨは、例えば４．０～９．０であってよく、６．０～８．０であることが好ましい。培養方法としては、例えば、ＭＲＳ培地に菌体を植菌し、３０℃で４８時間培養することが挙げられる。

【0021】

マクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤がＭ１株を有効成分として含む場合、マクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤は、例えば、Ｍ１株を含む発酵製品、乳酸菌飲料、乳酸菌入り飲料等であってもよい。

【0022】

本実施形態に係るマクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤は、Ｍ１株の固形分量として、例えば体重６０ｋｇの成人に一日当たり１ｍｇ以上５０ｍｇ以下の用量で用いることができ、３ｍｇ以上３０ｍｇ以下の用量で用いることが好ましく、５ｍｇ以上１５ｍｇ以下の用量で用いることがより好ましい。当該用量は、摂取する人の健康状態、投与方法及び他の剤との組み合わせ等の因子に応じて、上記範囲内で適宜設定することができる。

【0023】

マクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤中のＭ１株の含有量は、剤全量に対して固形分で０．００１質量％以上、０．００５質量％以上、０．０１質量％以上、０．０２質量％以上、０．０３質量％以上、０．０５質量％以上、０．１質量％以上、１質量％以上、又は１０質量％以上であってよい。また、マクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤中のＭ１株の含有量は、剤全量に対して固形分で１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下、０．１質量％以下、０．０５質量％以下、０．０３質量％以下、又は０．０１質量％以下であってよい。

【0024】

本実施形態に係るマクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤は、上記の有効成分に加えて、他の成分を更に含有していてもよい。他の成分としては、例えば、薬学的に許容される成分（例えば、賦形剤、結合材、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤、抗酸化剤）、食品として許容される成分（例えば、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤）を挙げることができる。

【0025】

本実施形態に係るマクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤は、食品組成物、医薬品、又は医薬部外品であってよい。本実施形態に係るマクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤は、食品組成物、医薬品、又は医薬部外品そのものとして使用することができ、食品組成物、医薬品、又は医薬部外品中の成分として使用することもできる。マクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤を一成分として含む食品組成物、医薬品、又は医薬部外品は、例えば、これら製品の製造工程における中間製品に、上記マクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤を添加することにより製造することができる。

【0026】

本実施形態に係るマクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤は、固体、液体、ペースト等のいずれの形状であってもよく、タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠、トローチ剤等を含む）、カプセル剤、丸剤、粉末剤（散剤）、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、シロップ、ペースト、注射剤（使用時に、蒸留水又はアミノ酸輸液若しくは電解質輸液等の輸液に配合して液剤として調製する場合を含む）等の剤形であってもよい。これらの各種製剤は、例えば、有効成分と、必要に応じて他の成分とを混合して上記剤形に成形することによって調製することができる。

【0027】

食品組成物として又は食品組成物の一成分として用いる場合、該食品組成物は、食品の３次機能、すなわち体調調節機能が強調されたものであることが好ましい。食品の３次機能が強調された製品としては、例えば、健康食品、機能性表示食品、栄養機能食品、栄養補助食品、サプリメント及び特定保健用食品を挙げることができる。

【0028】

食品組成物としては例えば、コーヒー、ジュース及び茶飲料等の清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、並びに、日本酒、洋酒、果実酒及びハチミツ酒等の酒などの飲料；カスタードクリーム等のスプレッド；フルーツペースト等のペースト；チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、ゼリー、キャンデー、クッキー、ケーキ及びプリン等の洋菓子；大福、餅、饅頭、カステラ、あんみつ及び羊羹等の和菓子；アイスクリーム、アイスキャンデー及びシャーベット等の氷菓；カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム等の調理済みの食品；ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料及びスープの素等の調味料などが挙げられる。

【0029】

本実施形態に係るマクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤は、体内に摂取されることが好ましい。投与態様は、経口投与であってもよく、非経口投与であってもよい。本実施形態に係るマクロファージの貪食促進剤、ｐＤＣの活性化剤又はｍＤＣの活性化剤は、一日一回投与されてもよく、一日二回、一日三回等、複数回に分けて投与されてもよい。

【実施例0030】

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0031】

以下の方法に従って女王蜂成虫の腸内から単離されたラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）によるマクロファージの貪食能、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の活性化及びミエロイド系樹状細胞（ｍＤＣ）の活性化に与える影響を検討した。

【0032】

＜実施例１：マクロファージ貪食能評価＞
被験物質のマクロファージ活性化能について、貪食能を指標として評価した。概要としては、被験物質を含む培養液でマクロファージを２４時間培養後、蛍光標識されたＣａｌｂｏｘｙｌａｔｅ ｌａｔｅｘ ｂｅａｄｓを加え、１時間インキュベートした。細胞を回収し、フローサイトメーターによる解析に供試した。具体的には以下のとおりである。

【0033】

ＪＣＲＢ細胞バンクより購入したマウスマクロファージＪ７７４．１細胞株を試験に用いた。Ｊ７７４．１細胞株はマクロファージ貪食試験に一般的に使用されている細胞株の一つである。

【0034】

陰性対照物質としては、被験物質の溶解に用いた培養液を用いた。培養液としては、ＲＰＭＩ培地（ナカライ、＃３０２６４－８５）５００ｍＬ、非働化ＦＢＳ５５．５ｍＬ、及びペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（１００×）５．５ｍＬを混合したものを用いた。非働化ＦＢＳは、ＦＢＳを５６℃で３０分間加熱処理し、分注して－２０℃で保存したものである。

【0035】

［被験物質］
被験物質としては、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を用いた。詳細は以下のとおりである。ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）は、生菌を８０℃以上、２０分熱処理したものを凍結乾燥させ粉末乾燥させたものを用いた。粉末を１０ｍｇ／ｍＬとなるように培養液に溶解し、１、５、１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、３０分間超音波処理したものを使用した。

【0036】

［前培養］
Ｊ７７４．１細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地にて継代培養した。培養は１０ｃｍ ｄｉｓｈを用いて行い、３日に１度、６．０８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで継代した。培養は３７℃に設定した５％ＣＯ_２インキュベーター内で行った。

【0037】

［Ｃａｌｂｏｘｙｌａｔｅ ｌａｔｅｘ ｂｅａｄｓ懸濁液］
Ｃａｌｂｏｘｙｌａｔｅ ｌａｔｅｘ ｂｅａｄｓ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｌ３０３０）５μＬをＲＰＭＩ培地９９５μＬに溶解し、試験に使用した。

【0038】

［Ｈｏｅｃｈｅｓｔ染色液の調製］
Ｈｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｈ３５７０）１μＬをＰＢＳ ２０００μＬで希釈し、染色液とした。

【0039】

［貪食試験］
１）１０ｃｍ ｄｉｓｈにて前培養したＪ７７４．１細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３７℃、５分間処理して壁から剥がし、得られた細胞の懸濁液を５０ｍＬコニカルチューブに移した。チューブを室温で２００×ｇ、５分間遠心を行った。上清をデカンテーションで捨て、細胞をペレットとして回収した。タッピングにより細胞をほぐした後、培養液を５ｍＬ加え、細胞懸濁液２０μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに移し、細胞数及び生存率を測定した。

【0040】

２）測定した細胞数に基づいて、５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を１０００μＬずつ１２ウェルプレートの各ウェルに加えた。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで一晩培養した。

【0041】

３）前培養後、インキュベーターからプレートを取り出した。細胞を播種しているウェルからピペットマンで培養液を取り除いた。培地又は１μｇ／ｍＬのＭ１株懸濁液１０００μＬを加えた。続いて、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養を行った。

【0042】

４）培養後、培養液を取り除き、Ｃａｌｂｏｘｙｌａｔｅ ｌａｔｅｘ ｂｅａｄｓを含む培養液１０００μＬを加えた後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１時間培養した。

【0043】

５）ピペットでゆっくり上清を取り除いた後、加温したＰＢＳを１０００μＬを加え、洗浄した。ピペットでＰＢＳを取り除き、加温したＰＢＳを１０００μＬ加えた。この操作を３度繰り返した。

【0044】

６） 洗浄後、ＰＢＳを取り除き、各ｗｅｌｌにＨｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２染色液 ５００μＬを加え、暗所で５分間静置した。

【0045】

７）染色液を取り除き、ピペットでＰＢＳを取り除き、１０００μＬのフローサイトバッファー（２％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳ）を加えた。

【0046】

８）ピペッティングにより細胞を回収し、６００×ｇ、５分間、遠心した。

【0047】

９）遠心後の上清を取り除き、フローサイトバッファー（２％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳ）１００μＬを加えた。細胞懸濁液をフローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による解析に供した。５０、０００細胞を解析し、貪食率及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を求めた。貪食率はＨｏｅｃｈｅｓｔ陽性細胞に対するＣａｌｂｏｘｙｌａｔｅ ｌａｔｅｘ ｂｅａｄｓが検出されるＰＥ波長領域における陽性細胞の割合を示す。ＭＦＩはＣａｌｂｏｘｙｌａｔｅ ｌａｔｅｘ ｂｅａｄｓが検出されるＰＥ波長領域における陽性細胞のＰＥの蛍光強度を示す。

【0048】

マクロファージ貪食試験の結果を図１に示す。図１の（ａ）は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株の添加によるマクロファージ貪食率を示すグラフである。図１の（ｂ）は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株の添加による平均蛍光強度を示すグラフである。ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）において、陰性対照区（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して貪食率及び平均蛍光強度が上昇したことが確認された。したがって、本試験で用いたラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）について、マクロファージ貪食亢進作用があることが確認された。

【0049】

＜実施例２：樹状細胞活性化能の評価＞
ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）のｐＤＣ及びｍＤＣの活性化能についても検討を行った。概要としては、ＩＣＲマウスから採取した骨髄細胞を分化させたのち、被験物質を含む培養液で分化させた細胞全体を４８時間培養後、樹状細胞における樹状細胞のＴ細胞への抗原提示に関わる各種マーカーで標識した。細胞を回収し、フローサイトメーターによる解析に供試した。具体的には以下のとおりである。

【0050】

［被験物質］
被験物質としては、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を用いた。詳細は以下のとおりである。ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）は、生菌を８０℃以上、２０分熱処理したものにカラギナンとデキストリンを加え、凍結乾燥させ粉末乾燥させたものを用いた。粉末を１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、１、５、１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、３０分間超音波処理したものを使用した。

【0051】

［前培養］
ＩＣＲマウス骨髄細胞（コスモバイオ、＃ＢＭＣ１２Ｃ）は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２μＭ ２－メルカプトエタノール及び１００ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ－３Ｌを含有するＲＰＭＩ培地にて培養することで分化誘導した。培養は１２ｗｅｌｌプレートを用いて行い、７日間培養した。培養は３７℃に設定した５％ＣＯ_２インキュベーター内で行った。

【0052】

［樹状細胞評価試験］
１）前培養にて分化誘導後、インキュベーターからプレートを取り出した。細胞を播種しているウェルからピペットマンでゆっくり培養液を取り除いた。続いて、１０μｇ／ｍＬのラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）を含む被験液を１０００μＬ加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養を行った。

【0053】

２）培養後、ピペットマンで上清を取り除き、１０００μＬの氷冷した２％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳで懸濁した。

【0054】

３）６００×ｇ、５分間、遠心し、１００μＬの氷冷した２％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳで懸濁した。

【0055】

４）ｐＤＣ及びｍＤＣゲート用に抗ＶｉｏＢｌｕｅ－ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ：１３０－１１０－８５１）２μＬ、抗ＰＥＶｉｏ ７７０－ＣＤ１１ｃ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ：１３０－１１０－８４０）２μＬ、ＡＰＣ－Ｖｉｏ ７７０－ＣＤ１１ｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ：１３０－１１３－８０３）２μＬ、抗７－ＡＡＤ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ：１３０－１１１－５６８）１０μＬ、樹状細胞における樹状細胞のＴ細胞への抗原提示能の活性化指標として抗ＶｉｏＧｒｅｅｎ－ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ：１３０－１１２－３９５）２μＬ、抗Ｖｉｏ（登録商標）Ｂｒｉｇｈｔ Ｂ５１５－ＣＤ４０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ：１３０－１１６－１１５） ２μＬ、抗ＰＥ－ＣＤ８０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ：１３０－１１６－４６０）２μＬ、抗ＡＰＣ－ＣＤ８６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ：１３０－１２２－１３０）２μＬを加え、暗所、４℃で１５分間染色後、６００×ｇ、５分間、遠心した。

【0056】

５）上清を除去し、２％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ含有ＨＢＳＳを加え、フローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による解析に供した。Ｂ２２０陽性ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ１１ｃ陽性細胞をｐＤＣ、Ｂ２２０陰性ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１１ｃ陽性細胞をｍＤＣとした。それぞれの樹状細胞について、Ｔ細胞へ抗原提示する役割を持つＭＨＣ－ＩＩ、そのシグナルを増強する役割を持つＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を求めた。試験は６回実施し、平均蛍光強度は平均値±標準偏差で示した。平均蛍光強度の平均値について、t検定により陰性対照区との有意差を求めた（＊：ｐ＜０．０５）。

【0057】

樹状細胞評価試験の結果を図２に示す。図２の（ａ）は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株の添加によるｐＤＣ（Ｂ２２０陽性ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ１１ｃ陽性細胞）の各種樹状細胞活性化マーカーの平均蛍光強度を示すグラフである。図２の（ｂ）は、ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株の添加によるｍＤＣ（Ｂ２２０陰性ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１１ｃ陽性細胞）の各種樹状細胞活性化マーカーの平均蛍光強度を示すグラフである。ラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）の添加により、ｐＤＣではＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４０、及びＣＤ８６について、ｍＤＣではＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６について、陰性対照区と比較して平均蛍光強度が有意に上昇したことが確認された。したがって、本試験で用いたラクトバチルス・パニサピウムＭ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１０６）について、樹状細胞活性化作用があることが確認された。

【図1】

【図2】