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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025020021
(43)【公開日】2025-02-07
(54)【発明の名称】フコシダーゼ変異体とその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/26 20060101AFI20250131BHJP
C12N 9/44 20060101ALI20250131BHJP
【ＦＩ】
C12N9/26 ZNA
C12N9/44
C12N9/26 Z
C12N9/26
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024115463
(22)【出願日】2024-07-19
(31)【優先権主張番号】63/529,439
(32)【優先日】2023-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】521537830
【氏名又は名称】チョ ファーマ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ウー ウェイ－シェン
(72)【発明者】
【氏名】チュー クオ－チン
(57)【要約】
【課題】本開示は、増強されたα－（１，６）フコシダーゼ活性を示す、α－フコシダーゼ（α－Ｌ－フコシダーゼ）の新規変異体形態を提供すること。
【解決手段】本開示はまた、α－フコシダーゼの新規変異体形態を含む組成物、および複合糖質中のα－（１，６）－連結フコースを切断するためにα－フコシダーゼの新規変異体形態を使用する方法に関する。一実施形態において、本開示は、インビトロでのフコースの改善された酵素的加水分解のためのα－Ｌ－フコシダーゼの変異体形態を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本開示はまた、α－フコシダーゼの新規変異体形態を含む組成物、および複合糖質中のα－（１，６）－連結フコースを切断するためにα－フコシダーゼの新規変異体形態を使用する方法に関する。一実施形態において、本開示は、インビトロでのフコースの改善された酵素的加水分解のためのα－Ｌ－フコシダーゼの変異体形態を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む、変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
【請求項2】
前記置換変異が、Ｋ２４７Ａ、Ｋ２４７Ｃ、Ｋ２４７Ｄ、Ｋ２４７Ｅ、Ｋ２４７Ｆ、Ｋ２４７Ｇ、Ｋ２４７Ｉ、Ｋ２４７Ｌ、Ｋ２４７Ｍ、Ｋ２４７Ｎ、Ｋ２４７Ｐ、Ｋ２４７Ｑ、Ｋ２４７Ｓ、Ｋ２４７Ｔ、Ｋ２４７Ｖ、Ｋ２４７Ｗ、およびＫ２４７Ｙからなる群より選択される、請求項１に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
【請求項3】
配列番号２～１８のいずれか１つの配列を有する、請求項１または２に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと、少なくとも１つのグリコシダーゼとを含む組成物。
【請求項5】
インビトロで脱フコシル化複合糖質を作製する方法であって、１つまたは複数のフコースを含む複合糖質を、エンドグリコシダーゼおよび請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと順次または同時に接触させるステップを含む、方法。
【請求項6】
（ａ）前記複合糖質を前記エンドグリコシダーゼと接触させるステップ；および
（ｂ）前記複合糖質を請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと接触させるステップ
の連続ステップを含む、請求項５に記載の方法。
（ｂ）前記複合糖質を請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと接触させるステップ
の連続ステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
（ｃ）反応を終了させるステップをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
前記ステップ（ｃ）が、約６５℃で１５～２５分間実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）が、約３７℃で０．５～２時間実施される、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記エンドグリコシダーゼが、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびそれらのバリアントである、請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
ＥｎｄｏＳ２が、Ｔ１３８Ｄ、Ｔ１３８Ｅ、Ｔ１３８Ｆ、Ｔ１３８Ｈ、Ｔ１３８Ｋ、Ｔ１３８Ｌ、Ｔ１３８Ｍ、Ｔ１３８Ｎ、Ｔ１３８Ｑ、Ｔ１３８Ｒ、Ｔ１３８Ｖ、Ｔ１３８Ｗ、Ｄ１８２Ｑ、Ｄ２２６Ｑ、Ｔ２２７Ｑ、およびＴ２２８Ｑからなる群より選択される置換変異を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記フコースが、α－（１，２）、α－（１，３）、α－（１，４）およびα－（１，６）連結フコースからなる群から選択される、請求項５～１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本開示は、増強されたα－（１，６）フコシダーゼ活性を示す、α－フコシダーゼ（α－Ｌ－フコシダーゼ）の新規変異体形態に関する。本開示はまた、α－フコシダーゼの新規変異体形態を含む組成物、および複合糖質中のα－（１，６）－連結フコースを切断するためにα－フコシダーゼの新規変異体形態を使用する方法に関する。
本開示は、増強されたα－（１，６）フコシダーゼ活性を示す、α－フコシダーゼ（α－Ｌ－フコシダーゼ）の新規変異体形態に関する。本開示はまた、α－フコシダーゼの新規変異体形態を含む組成物、および複合糖質中のα－（１，６）－連結フコースを切断するためにα－フコシダーゼの新規変異体形態を使用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
Ｎ－グリコシル化は、哺乳動物のタンパク質中に観察される最も一般的な翻訳後修飾の一つであり、これらのタンパク質の固有の特徴および生物学的機能を調節する上で重要な役割を果たしている。例えば、Ｎ－グリカンの結合は、タンパク質のフォールディング、安定性、抗原性、および免疫原性に顕著に影響を与え得る。さらに、Ｎ－グリカンは、細胞接着、宿主－病原体相互作用、がん転移および免疫応答など、広範な生物学的認識プロセスに直接関与し得る。哺乳動物のＮ－グリカンは、基本的なオリゴ糖のコア構造を共有するが、シアリル化およびフコシル化など、コア構造に追加の修飾の導入は、生物学的機能に影響を及ぼす構造的多様性の増大したレベルに寄与する。
Ｎ－グリコシル化は、哺乳動物のタンパク質中に観察される最も一般的な翻訳後修飾の一つであり、これらのタンパク質の固有の特徴および生物学的機能を調節する上で重要な役割を果たしている。例えば、Ｎ－グリカンの結合は、タンパク質のフォールディング、安定性、抗原性、および免疫原性に顕著に影響を与え得る。さらに、Ｎ－グリカンは、細胞接着、宿主－病原体相互作用、がん転移および免疫応答など、広範な生物学的認識プロセスに直接関与し得る。哺乳動物のＮ－グリカンは、基本的なオリゴ糖のコア構造を共有するが、シアリル化およびフコシル化など、コア構造に追加の修飾の導入は、生物学的機能に影響を及ぼす構造的多様性の増大したレベルに寄与する。
【0003】
治療抗体の生理学的活性は、２つの異なるメカニズムによって媒介される。第一のメカニズムは、標的抗原中和またはアポトーシスに関与し、これが治療効力に寄与する。第二のメカニズムは、抗体エフェクター機能、抗体依存性細胞細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与し、これらは免疫複合体の形成によって活性化される。治療抗体の臨床効果における、特に抗がん抗体におけるＡＤＣＣの重要性は、患者の白血球受容体（ＦｃγＲ）多型の遺伝子解析を通じて解明されてきた。そのため、バイオ産業界は、抗体の定常領域（Ｆｃ）に結合したＮ－グリカンの修飾を含むＡＤＣＣ増強技術の開発に多大な労力を費やしてきた。抗体のＦｃ領域上のＮ－グリカンの最内側ＧｌｃＮＡｃに結合しているα－（１，６）－連結フコース（コアフコース）の量は、ＡＤＣＣ活性に影響を与えることが知られている。Ｆｃ領域上のＮ－グリカンの最内側ＧｌｃＮＡｃからコアフコースの除去は、非フコシル化抗体のＦｃγＲＩＩＩα受容体に対する結合親和性の増大のため、ＩｇＧのＡＤＣＣ活性を顕著に増強する。
【0004】
ＩｇＧのフコシル化を減少させることにより、ＦｃγＲＩＩＩα結合およびＡＤＣＣを増強するための数多くのアプローチが開発されてきた。いくつかの戦略は、α－（１，６）フコシルトランスフェラーゼの発現を除去または減少させる生産細胞株の開発に関する。フコシル化を減少させる代替戦略としては、ＲＮＡｉを用いることによりα－（１，６）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子をサイレンシングすることが挙げられる。しかし、インビトロでのＮ－グリカンの酵素的脱フコシル化は、Ｎ－グリカンが２つのＦｃドメインの間に埋め込まれているため、依然として困難である。Ｆｃドメインの存在はα－フコシダーゼのフコース残基へのアクセスを制限し、立体障害をもたらし、酵素的脱フコシル化の効率を低下させる。
【0005】
Ｆｃ領域の外側のＮ－グリカンを除去した後、最内側ＧｌｃＮＡｃ残基からコアフコースを除去できるα－Ｌ－フコシダーゼは、ウシ腎臓由来のα－Ｌ－フコシダーゼ、ヒト由来のα－Ｌ－フコシダーゼ（ＦｕｃＡ１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来のα－Ｌ－フコシダーゼ（ＢｆＦｕｃ）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ由来のα－Ｌ－フコシダーゼＣ（ＡｌｆＣ）など、ごくわずかしか開示されていない。野生型酵素の固有の機能および活性は限定的であり低いため、Ｎ－グリカンからコアフコースを効率的に切断する修飾酵素の開発が求められる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
概要
一実施形態において、本開示は、インビトロでのフコースの改善された酵素的加水分解のためのα－Ｌ－フコシダーゼの変異体形態を提供する。本開示は、増強されたα－（１，６）フコシダーゼ活性を示す、α－フコシダーゼ（α－Ｌ－フコシダーゼ）の新規変異体形態に関する。本開示はまた、α－フコシダーゼの新規変異体形態を含む組成物、および複合糖質中のα－（１，６）－連結フコースを切断するためにα－フコシダーゼの新規変異体形態を使用する方法に関する。
一実施形態において、本開示は、インビトロでのフコースの改善された酵素的加水分解のためのα－Ｌ－フコシダーゼの変異体形態を提供する。本開示は、増強されたα－（１，６）フコシダーゼ活性を示す、α－フコシダーゼ（α－Ｌ－フコシダーゼ）の新規変異体形態に関する。本開示はまた、α－フコシダーゼの新規変異体形態を含む組成物、および複合糖質中のα－（１，６）－連結フコースを切断するためにα－フコシダーゼの新規変異体形態を使用する方法に関する。
【0007】
つの実施形態において、本開示は、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む変異体α－Ｌ－フコシダーゼを提供する。
【0008】
つの実施形態において、本開示は、配列番号１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む変異体α－Ｌ－フコシダーゼを提供する。
【0009】
つの実施形態において、本開示は、配列番号１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む変異体α－Ｌ－フコシダーゼを提供する。
【0010】
つの実施形態において、本開示は、配列番号１の配列を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む変異体α－Ｌ－フコシダーゼを提供する。
【0011】
いくつかの実施形態において、置換変異は、Ｋ２４７Ａ、Ｋ２４７Ｃ、Ｋ２４７Ｄ、Ｋ２４７Ｅ、Ｋ２４７Ｆ、Ｋ２４７Ｇ、Ｋ２４７Ｉ、Ｋ２４７Ｌ、Ｋ２４７Ｍ、Ｋ２４７Ｎ、Ｋ２４７Ｐ、Ｋ２４７Ｑ、Ｋ２４７Ｓ、Ｋ２４７Ｔ、Ｋ２４７Ｖ、Ｋ２４７Ｗ、およびＫ２４７Ｙからなる群より選択される。
【0012】
いくつかの実施形態において、変異体α－Ｌ－フコシダーゼは、配列番号２～１８のいずれか１つの配列を有する。
【0013】
いくつかの実施形態において、本開示の変異体α－Ｌ－フコシダーゼは、糖タンパク質の変性または機能的劣化なしに、天然の糖タンパク質中のコアフコースを効率的に切断するのに有用である。
【0014】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のフコシダーゼは、１つまたは複数のα－（１，２）、α－（１，３）、α－（１，４）およびα－（１，６）連結フコースを加水分解することができる。フコースは、複合糖質におけるＮ－および／またはＯ－連結グリカンに存在してもよい。
【0015】
いくつかの実施形態において、α－フコシダーゼは、組換えＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓのα－フコシダーゼである。
【0016】
いくつかの実施形態において、α－フコシダーゼは、６．５～７．５に至適ｐＨを示す。
【0017】
いくつかの実施形態において、本開示は、治療抗体などの抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ糖操作を容易にするための、上記の変異体α－Ｌ－フコシダーゼを含む組成物を提供する。
【0018】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つのグリコシダーゼをさらに含む。
【0019】
いくつかの実施形態において、グリコシダーゼはエキソグリコシダーゼであり得る。
【0020】
いくつかの実施形態において、グリコシダーゼはエンドグリコシダーゼであり得る。エンドグリコシダーゼとしては、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0021】
いくつかの実施形態において、組成物は、インビトロで複合糖質の脱フコシル化を行うために有用かつ効率的である。特に、本明細書に記載の組成物は、インビトロで糖タンパク質のコア脱フコシル化を行うのに有用である。
【0022】
いくつかの実施形態において、コア脱フコシル化はコアα－（１，６）脱フコシル化である。
【0023】
いくつかの実施形態において、コア脱フコシル化はコアα－（１，３）脱フコシル化である。
【0024】
いくつかの実施形態において、脱フコシル化は、糖タンパク質の変性または機能的劣化なしに実施することができる。
【0025】
一実施形態において、本開示は、インビトロで脱フコシル化複合糖質を作製する方法であって、１つまたは複数のフコースを含む複合糖質を、エンドグリコシダーゼおよび上記の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと順次または同時に接触させるステップを含む方法を提供する。
【0026】
いくつかの実施形態において、方法は、以下の一連のステップを含む：（ａ）複合糖質をエンドグリコシダーゼと接触させるステップ；および（ｂ）複合糖質を上記の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと接触させるステップ。
【0027】
いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｃ）反応を終了させるステップをさらに含む。
【0028】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、約６５℃で１５～２５分間実施される。
【0029】
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）は、約３７℃で０．５～２時間実施される。
【0030】
いくつかの実施形態において、方法は、以下の一連のステップを含む：（ａ）複合糖質をエンドグリコシダーゼ（エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびそれらのバリアントが含まれるが、これらに限定されない）と接触させるステップ；（ｂ）複合糖質を上記の本発明の変異体α－フコシダーゼと接触させるステップ。複合糖質はα－（１，２）、α－（１，３）、α－（１，４）、およびα－（１，６）連結フコースから選択される１つまたは複数のフコースを含む。フコースは複合糖質中のＮ－および／またはＯ－連結グリカンに存在してもよい。
【0031】
いくつかの実施形態において、方法は、上記の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと、少なくとも１つのグリコシダーゼとを含む組成物を接触させることを含む。エンドグリコシダーゼとしては、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。複合糖質は、α－（１，２）、α－（１，３）、α－（１，４）、およびα－（１，６）結合フコースから選択される１つ以上のフコースを含む。フコースは複合糖質中のＮ－および／またはＯ－連結グリカンに存在してもよい。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む、変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
（項目２）
前記置換変異が、Ｋ２４７Ａ、Ｋ２４７Ｃ、Ｋ２４７Ｄ、Ｋ２４７Ｅ、Ｋ２４７Ｆ、Ｋ２４７Ｇ、Ｋ２４７Ｉ、Ｋ２４７Ｌ、Ｋ２４７Ｍ、Ｋ２４７Ｎ、Ｋ２４７Ｐ、Ｋ２４７Ｑ、Ｋ２４７Ｓ、Ｋ２４７Ｔ、Ｋ２４７Ｖ、Ｋ２４７Ｗ、およびＫ２４７Ｙからなる群より選択される、項目１に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
（項目３）
配列番号２～１８のいずれか１つの配列を有する、項目１または２に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
（項目４）
項目１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと、少なくとも１つのグリコシダーゼとを含む組成物。
（項目５）
インビトロで脱フコシル化複合糖質を作製する方法であって、１つまたは複数のフコースを含む複合糖質を、エンドグリコシダーゼおよび項目１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと順次または同時に接触させるステップを含む、方法。
（項目６）
（ａ）前記複合糖質を前記エンドグリコシダーゼと接触させるステップ；および
（ｂ）前記複合糖質を項目１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと接触させるステップ
の連続ステップを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
（ｃ）反応を終了させるステップをさらに含む、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
前記ステップ（ｃ）が、約６５℃で１５～２５分間実施される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）が、約３７℃で０．５～２時間実施される、項目６～８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記エンドグリコシダーゼが、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびそれらのバリアントである、項目６～９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
ＥｎｄｏＳ２が、Ｔ１３８Ｄ、Ｔ１３８Ｅ、Ｔ１３８Ｆ、Ｔ１３８Ｈ、Ｔ１３８Ｋ、Ｔ１３８Ｌ、Ｔ１３８Ｍ、Ｔ１３８Ｎ、Ｔ１３８Ｑ、Ｔ１３８Ｒ、Ｔ１３８Ｖ、Ｔ１３８Ｗ、Ｄ１８２Ｑ、Ｄ２２６Ｑ、Ｔ２２７Ｑ、およびＴ２２８Ｑからなる群より選択される置換変異を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記フコースが、α－（１，２）、α－（１，３）、α－（１，４）およびα－（１，６）連結フコースからなる群から選択される、項目５～１１のいずれか１項に記載の方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸位置２４７（Ｋ２４７）に置換変異を有するポリペプチドを含む、変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
（項目２）
前記置換変異が、Ｋ２４７Ａ、Ｋ２４７Ｃ、Ｋ２４７Ｄ、Ｋ２４７Ｅ、Ｋ２４７Ｆ、Ｋ２４７Ｇ、Ｋ２４７Ｉ、Ｋ２４７Ｌ、Ｋ２４７Ｍ、Ｋ２４７Ｎ、Ｋ２４７Ｐ、Ｋ２４７Ｑ、Ｋ２４７Ｓ、Ｋ２４７Ｔ、Ｋ２４７Ｖ、Ｋ２４７Ｗ、およびＫ２４７Ｙからなる群より選択される、項目１に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
（項目３）
配列番号２～１８のいずれか１つの配列を有する、項目１または２に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼ。
（項目４）
項目１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと、少なくとも１つのグリコシダーゼとを含む組成物。
（項目５）
インビトロで脱フコシル化複合糖質を作製する方法であって、１つまたは複数のフコースを含む複合糖質を、エンドグリコシダーゼおよび項目１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと順次または同時に接触させるステップを含む、方法。
（項目６）
（ａ）前記複合糖質を前記エンドグリコシダーゼと接触させるステップ；および
（ｂ）前記複合糖質を項目１～３のいずれか１項に記載の変異体α－Ｌ－フコシダーゼと接触させるステップ
の連続ステップを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
（ｃ）反応を終了させるステップをさらに含む、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
前記ステップ（ｃ）が、約６５℃で１５～２５分間実施される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）が、約３７℃で０．５～２時間実施される、項目６～８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記エンドグリコシダーゼが、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびそれらのバリアントである、項目６～９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
ＥｎｄｏＳ２が、Ｔ１３８Ｄ、Ｔ１３８Ｅ、Ｔ１３８Ｆ、Ｔ１３８Ｈ、Ｔ１３８Ｋ、Ｔ１３８Ｌ、Ｔ１３８Ｍ、Ｔ１３８Ｎ、Ｔ１３８Ｑ、Ｔ１３８Ｒ、Ｔ１３８Ｖ、Ｔ１３８Ｗ、Ｄ１８２Ｑ、Ｄ２２６Ｑ、Ｔ２２７Ｑ、およびＴ２２８Ｑからなる群より選択される置換変異を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記フコースが、α－（１，２）、α－（１，３）、α－（１，４）およびα－（１，６）連結フコースからなる群から選択される、項目５～１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【0032】
詳細説明
便宜上、本開示の文脈で使用される特定の用語をここに集める。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
便宜上、本開示の文脈で使用される特定の用語をここに集める。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0033】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の参照を含むように本明細書で使用される。
【0034】
ポリペプチドに言及する場合の「実質的同一性」または「実質的に同一」という用語は、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定した場合に、適切なポリペプチドの挿入または欠失を別のアミノ酸残基と最適に整列させたとき、参照ポリペプチド配列の全体配列に対して少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸残基においてポリペプチド配列同一性があることを示す。参照ポリペプチド配列と実質的同一性を有するポリペプチド配列は、同じ機能を示し得る。
【0035】
本明細書において、範囲は、「約」１つの特定の値のからおよび／または「約」別の特定の値までとして表現される。このような範囲が表現される場合、実施形態は、その１つの特定の値からおよび／またはその他の特定の値までの範囲を含む。同様に、「約」という語を使用することにより値が近似値として表現される場合、その特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。さらに、範囲のそれぞれの端点は、他の端点との関係において、および他の端点とは独立しての両方で有意であることが理解される。本明細書で使用する場合、用語「約」は±２０％、好ましくは±１０％、より好ましくは±５％を指す。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「グリカン」は多糖またはオリゴ糖を指す。グリカンは、単糖残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得、直鎖状または分岐状であり得る。グリカンはまた、糖タンパク質、糖脂質、またはプロテオグリカンなどの複合糖質の炭水化物部分を指すように使用され得る。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「グリコシダーゼ」は、グリコシド連結または結合の加水分解を触媒する酵素を指す。
【0038】
本明細書で使用される場合、用語「複合糖質」は、少なくとも１つの糖部分が少なくとも１つの他の部分に共有結合しているすべての分子を指し、Ｎ－連結糖タンパク質、Ｏ－連結糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【0039】
本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－連結糖タンパク質」は、通常アスパラギンまたはアルギニン側鎖の窒素にグリカンが結合した糖タンパク質を指す。
【0040】
本明細書で使用される場合、用語「Ｏ－連結糖タンパク質」は、通常セリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシリジン、またはヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシ酸素、あるいはセラミドのような脂質上の酸素にグリカンが結合した糖タンパク質を指す。
【0041】
本発明の第１の態様は、ポリペプチド配列番号１と配列実質的同一性を有し、２４７位に置換変異を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ由来のα－Ｌ－フコシダーゼの変異体形態を含むポリペプチド断片に関する。
【0042】
配列番号１は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ由来のα－フコシダーゼの配列を指し、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号はＣＡＱ６７９８４．１である。
【化1】
【0043】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ａ、Ｋ２４７Ｃ、Ｋ２４７Ｄ、Ｋ２４７Ｅ、Ｋ２４７Ｆ、Ｋ２４７Ｇ、Ｋ２４７Ｉ、Ｋ２４７Ｌ、Ｋ２４７Ｍ、Ｋ２４７Ｎ、Ｋ２４７Ｐ、Ｋ２４７Ｑ、Ｋ２４７Ｓ、Ｋ２４７Ｔ、Ｋ２４７Ｖ、Ｋ２４７Ｗ、およびＫ２４７Ｙ、好ましくはＫ２４７ＤおよびＫ２４７Ｅからなる群より選択される。
【0044】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｄであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化2】
【0045】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｅであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化3】
【0046】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｆであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化4】
【0047】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ａであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化5】
【0048】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｃであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化6】
【0049】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｇであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化7】
【0050】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｉであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化8】
【0051】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｌであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化9】
【0052】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｍであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化10】
【0053】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｎであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化11】
【0054】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｐであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化12】
【0055】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｑであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化13】
【0056】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｓであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化14】
【0057】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｔであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化15】
【0058】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｖであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化16】
【0059】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｗであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは以下の配列を有する
【化17】
【0060】
いくつかの実施形態において、上記の置換変異は、Ｋ２４７Ｙであり、変異体α－Ｌフコシダーゼは、
の配列を有する。
【化18】
【0061】
変異体α－フコシダーゼは、１つまたは複数のα－（１，２）、α－（１，３）、α－（１，４）、およびα－（１，６）－連結フコースを加水分解することができる。フコースは複合糖質中のＮ－および／またはＯ－連結グリカンに存在してもよい。フコースはコアα－（１，３）フコースであってもコアα－（１，６）フコースであってもよい。
【0062】
本発明の第２の態様は、上記の変異体α－フコシダーゼと、少なくとも１つのグリコシダーゼとを含む組成物に関する。
【0063】
いくつかの実施形態において、グリコシダーゼはエキソグリコシダーゼである。
【0064】
いくつかの実施形態において、グリコシダーゼはエンドグリコシダーゼである。エンドグリコシダーゼとしては、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0065】
いくつかの実施形態において、エンドグリコシダーゼは、Ｄ２３３位の変異体を含むＥｎｄｏＳである。
【0066】
いくつかの実施形態において、エンドグリコシダーゼは、Ｔ１３８位、Ｄ２２６位、Ｔ２２７位、および／またはＴ２２８位の変異体を含むＥｎｄｏＳ２である。
【0067】
いくつかの実施形態において、エンドグリコシダーゼは、Ｔ１３８Ｄ、Ｔ１３８Ｅ、Ｔ１３８Ｆ、Ｔ１３８Ｈ、Ｔ１３８Ｋ、Ｔ１３８Ｌ、Ｔ１３８Ｍ、Ｔ１３８Ｎ、Ｔ１３８Ｑ、Ｔ１３８Ｒ、Ｔ１３８Ｖ、Ｔ１３８Ｗ、Ｄ１８２Ｑ、Ｄ２２６Ｑ、Ｔ２２７Ｑ、およびＴ２２８Ｑからなる群より選択される変異体を含むＥｎｄｏＳ２である。
【0068】
いくつかの実施形態において、組成物は、インビトロで複合糖質の脱フコシル化を行うのに有用かつ効率的である。特に、本明細書に記載の組成物は、インビトロで糖タンパク質のコア脱フコシル化を行うのに有用である。脱フコシル化は、糖タンパク質の変性または機能低下なしに行うことができる。
【0069】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、抗体のＦｃ領域上のＮ－グリカンの効率的な加水分解に関する。本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－グリカン」は、抗体またはその断片のＦｃ領域のアスパラギン残基のアミド窒素に連結したＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）によって結合されたＮ－連結オリゴ糖を指す。
【0070】
いくつかの実施形態において、Ｎ－グリカンは、コアフコースを有するかまたは有さない高マンノース、ハイブリッドまたは複合型である。
【0071】
本発明の第３の態様は、インビトロで脱フコシル化複合糖質を作製する方法に関する。複合糖質は、エンドグリコシダーゼおよび上記の変異体α－フコシダーゼで順次または同時に処理することができる。
【0072】
いくつかの実施形態において、方法は、以下のステップを含む：（ａ）複合糖質をエンドグリコシダーゼ（エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびそれらのバリアントを含むが、これらに限定されない）と接触させるステップ；（ｂ）複合糖質を上記の本発明の変異体α－フコシダーゼと接触させるステップ。複合糖質はα－（１，２）、α－（１，３）、α－（１，４）、およびα－（１，６）連結フコースから選択される１つまたは複数のフコースを含む。フコースは複合糖質中のＮ－および／またはＯ－連結グリカンに存在してもよい。
【0073】
いくつかの実施形態において、方法は、上記の変異体α－Ｌ－フコシダーゼを含む組成物と、少なくとも１つのグリコシダーゼとを接触させることを含む。エンドグリコシダーゼとしては、Ｅｎｄｏ－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２、ＥｎｄｏＦ３、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２、およびそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。複合糖質は、α－（１，２）、α－（１，３）、α－（１，４）、およびα－（１，６）連結フコースから選択される１つまたは複数のフコースを含む。フコースは複合糖質中のＮ－および／またはＯ－連結グリカンに存在してもよい。
【0074】
いくつかの実施形態において、エンドグリコシダーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓエンドグリコシダーゼＳ２、アミノ酸位置Ｄ２３３に変異を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓエンドグリコシダーゼＳ、アミノ酸位置Ｔ１３８に変異を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓエンドグリコシダーゼＳ２、アミノ酸位置Ｄ１８２に変異を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓエンドグリコシダーゼＳ２である、アミノ酸位置Ｄ１８４に変異を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓエンドグリコシダーゼＳ２、アミノ酸位置Ｄ１８６に変異を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓエンドグリコシダーゼＳ２、アミノ酸位置Ｄ２２６に変異を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓエンドグリコシダーゼＳ２、またはアミノ酸位置Ｔ２２７に変異を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓエンドグリコシダーゼＳ２である。
【0075】
いくつかの実施形態において、エンドグリコシダーゼは、Ｄ２３３位の変異体を含むＥｎｄｏＳである。
【0076】
いくつかの実施形態において、エンドグリコシダーゼは、Ｔ１３８位、Ｄ２２６位、Ｔ２２７位、および／またはＴ２２８位の変異体を含むＥｎｄｏＳ２である。
【0077】
いくつかの実施形態において、エンドグリコシダーゼは、Ｔ１３８Ｄ、Ｔ１３８Ｅ、Ｔ１３８Ｆ、Ｔ１３８Ｈ、Ｔ１３８Ｋ、Ｔ１３８Ｌ、Ｔ１３８Ｍ、Ｔ１３８Ｎ、Ｔ１３８Ｑ、Ｔ１３８Ｒ、Ｔ１３８Ｖ、Ｔ１３８Ｗ、Ｄ１８２Ｑ、Ｄ２２６Ｑ、Ｔ２２７Ｑ、およびＴ２２８Ｑからなる群より選択される変異体を含むＥｎｄｏＳ２である。
【0078】
いくつかの実施形態において、反応混合物の持続時間は、少なくとも２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分または１００分、好ましくは６０分未満に設定される。反応温度は、好ましくは室温、より好ましくはおよそ２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃または４５℃、最も好ましくはおよそ３７℃で行われる。
【実施例0079】
実施例１．タンパク質発現構築物
【0080】
野生型α－フコシダーゼＣ（ＡｌｆＣ）は、Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＢＬ２３ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ ３９３）からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、Ｎ末端にＨｉｓタグ融合物を有するｐＥＴ４７Ｎにクローニングした。２４７位の野生型リジンの他の１９個の天然アミノ酸のそれぞれへの置換を、以下のフォワードプライマーおよびプラスミドにコードされた野生型ＡｌｆＣを鋳型として使用して、飽和変異誘発によって生成した。
【表1】
【0081】
すべての置換は、リバースプライマーとして以下を使用した：５’－ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＴＣ ＧＴＴ ＡＴＣ ＧＣＣ ＣＡＧ－３’（配列番号３８）。飽和変異誘発に用いたＰＣＲプログラムは以下の通りであった：９５℃で３分間、１６サイクルの９５℃で４５秒間、５８℃で５０秒間、６８℃で８分間、最終ステップの７２℃で１０分間。変異はＤＮＡ配列決定によって確認した。ＥｎｄｏＳまたはＥｎｄｏＳ２など、試験で使用した他の酵素を、Ｎ末端にＨｉｓタグ融合物を有するｐＥＴ２８ａにクローニングした。
【0082】
実施例２．タンパク質の発現および精製
タンパク質発現構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）に形質転換した。０．１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導により、１６℃で２０時間、タンパク質を過剰発現させた。細胞を高圧ホモジナイザーで破壊した後、遠心分離した後上清を回収した。回収した上清をＮｉ－ＮＴＡアガロースカラムにロードし、カラム容量の１０倍の洗浄バッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２００ｍＭの塩化ナトリウム、および４０ｍＭのイミダゾール）で洗浄した。溶出は、カラム容量の２倍の溶出バッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２００ｍＭの塩化ナトリウム、および３００ｍＭのイミダゾール）で行った。タンパク質の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで調べ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｕｌｔｒａ－０．５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＵＦＣ５０１０ＢＫ、１０ｋＤａカットオフ）により反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭマンニトール、５０ｍＭソルビトール、ｐＨ７．０）に交換した。
タンパク質発現構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）に形質転換した。０．１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導により、１６℃で２０時間、タンパク質を過剰発現させた。細胞を高圧ホモジナイザーで破壊した後、遠心分離した後上清を回収した。回収した上清をＮｉ－ＮＴＡアガロースカラムにロードし、カラム容量の１０倍の洗浄バッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２００ｍＭの塩化ナトリウム、および４０ｍＭのイミダゾール）で洗浄した。溶出は、カラム容量の２倍の溶出バッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２００ｍＭの塩化ナトリウム、および３００ｍＭのイミダゾール）で行った。タンパク質の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで調べ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｕｌｔｒａ－０．５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＵＦＣ５０１０ＢＫ、１０ｋＤａカットオフ）により反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭマンニトール、５０ｍＭソルビトール、ｐＨ７．０）に交換した。
【0083】
実施例３．糖タンパク質のコア脱フコシル化
変異体フコシダーゼのコア脱フコシル化活性を、酵素処理後のコアフコースパーセンテージを分析することにより行った。トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））（２４ｍｇ）をＥｎｄｏＳ２（１５．２μｇ）で３７℃で１時間処理し、続いてＡｌｆＣフコシダーゼ変異体（２．８μｇ）で３７℃でさらに１時間反応させた。反応物を６５℃で２０分間熱失活により懸濁させ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｕｌｔｒａフィルターデバイス中でｄｄＨ２Ｏにより３回洗浄した。質量分析のために上清を回収した（表２）。ブランク群（酵素なし）におけるＮ－グリカン上のコアフコースのパーセンテージは約８７％であった。野生型ＡｌｆＣ酵素の脱フコース活性は約１９％であった。Ｋ２４７残基を負電荷のアミノ酸残基に変異させると、脱フコシル化活性が約８０％まで顕著に改善されたが、Ｋ２４７の他の変異体も正電荷の残基を除いて脱フコシル化活性の向上を示した。脱フコシル化パーセンテージは次式で計算される。
「ＮＦ」はコアＧｌｃＮＡｃ－フコースの構造を表し、「Ｎ」はコアＧｌｃＮＡｃの構造を表す。
変異体フコシダーゼのコア脱フコシル化活性を、酵素処理後のコアフコースパーセンテージを分析することにより行った。トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））（２４ｍｇ）をＥｎｄｏＳ２（１５．２μｇ）で３７℃で１時間処理し、続いてＡｌｆＣフコシダーゼ変異体（２．８μｇ）で３７℃でさらに１時間反応させた。反応物を６５℃で２０分間熱失活により懸濁させ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標） Ｕｌｔｒａフィルターデバイス中でｄｄＨ２Ｏにより３回洗浄した。質量分析のために上清を回収した（表２）。ブランク群（酵素なし）におけるＮ－グリカン上のコアフコースのパーセンテージは約８７％であった。野生型ＡｌｆＣ酵素の脱フコース活性は約１９％であった。Ｋ２４７残基を負電荷のアミノ酸残基に変異させると、脱フコシル化活性が約８０％まで顕著に改善されたが、Ｋ２４７の他の変異体も正電荷の残基を除いて脱フコシル化活性の向上を示した。脱フコシル化パーセンテージは次式で計算される。
【数1】
【表2】
【0084】
本開示は、上記の特定の実施形態と併せて説明されてきたが、その多くの代替、ならびにその改変および変形は、当業者に明らかである。このような代替、改変および変形はすべて、本開示の範囲内に含まれるものとみなされる。
【0085】
参考文献
【0086】
ＵＳ１１１９３１５５Ｂ２
【0087】
Ｋｌｏｎｔｚ ＥＨ， Ｌｉ Ｃ， Ｋｉｈｎ Ｋ， Ｆｉｅｌｄｓ ＪＫ， Ｂｅｃｋｅｔｔ Ｄ， Ｓｎｙｄｅｒ ＧＡ， Ｗｉｎｔｒｏｄｅ ＰＬ， Ｄｅｒｅｄｇｅ Ｄ， Ｗａｎｇ ＬＸ， Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ＥＪ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ａｎ α－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｒｅｖｅａｌ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＩｇＧ ｔｒａｎｓｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０２０ Ｄｅｃ ４；１１（１）：６２０４
【0088】
Ｌｉ Ｃ， Ｚｈｕ Ｓ， Ｍａ Ｃ， Ｗａｎｇ ＬＸ． Ｄｅｓｉｇｎｅｒ α１，６－Ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｍｕｔａｎｔｓ Ｅｎａｂｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｏｒｅ Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔａｃｔ Ｎ－Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎ－Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ
Ｓｏｃ． ２０１７ Ｏｃｔ ２５；１３９（４２）：１５０７４－１５０８７．
Ｓｏｃ． ２０１７ Ｏｃｔ ２５；１３９（４２）：１５０７４－１５０８７．
【0089】
Ｏｓａｎｊｏ Ｇ， Ｄｉｏｎ Ｍ， Ｄｒｏｎｅ Ｊ， Ｓｏｌｌｅｕｘ Ｃ， Ｔｒａｎ Ｖ， Ｒａｂｉｌｌｅｒ Ｃ， Ｔｅｌｌｉｅｒ Ｃ． Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ－Ｌ－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ｉｎｔｏ ａｎ ａｌｐｈａ－Ｌ－ｔｒａｎｓｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００７ Ｊａｎ ３０；４６（４）：１０２２－３３．
【0090】
ＵＳ１０４１５０２１
【配列表】