特開 2025-20041 オンシジウム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ）植物抽出物、および糖尿病を治療し、肝臓を保護し、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を防止するための薬剤製造のためのその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025020041

(43)【公開日】2025-02-07

(54)【発明の名称】オンシジウム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ）植物抽出物、および糖尿病を治療し、肝臓を保護し、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を防止するための薬剤製造のためのその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/8984 20060101AFI20250131BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20250131BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20250131BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20250131BHJP

【ＦＩ】

A61K36/8984

A61P1/16

A61P3/10

A61P11/00

【審査請求】有

【請求項の数】20

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024120868

(22)【出願日】2024-07-26

(31)【優先権主張番号】63/516,145

(32)【優先日】2023-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520458635

【氏名又は名称】長庚學校財團法人長庚科技大學

(74)【代理人】

【識別番号】100183564

【弁理士】

【氏名又は名称】西村 伸也

(72)【発明者】

【氏名】黄聰龍

(72)【発明者】

【氏名】張祐嘉

【テーマコード（参考）】

4C088

【Ｆターム（参考）】

4C088AB89

4C088AC05

4C088AC11

4C088BA08

4C088CA05

4C088CA06

4C088CA07

4C088MA17

4C088MA52

4C088MA66

4C088NA14

4C088ZA59

4C088ZA75

4C088ZC35

(57)【要約】      （修正有）

【課題】天然化合物、及び糖尿病を治療し、肝臓を保護し、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を防止するための薬剤製造のためのその使用を提供する。
【解決手段】オンシジウム植物抽出物が提供される。その調製ステップは、オンシジウム植物試料を採取するステップと、試料を乾燥させて粉砕し、粉砕オンシジウム植物試料を得るステップと、次いで、加速溶媒抽出または超音波抽出によって、粉砕オンシジウム植物試料を溶媒中で抽出して、オンシジウム植物抽出物を得るステップと、を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オンシジウム植物抽出物であって、以下のステップ：
オンシジウム植物試料を採取するステップと、
前記試料を乾燥させて粉砕し、粉砕オンシジウム植物試料を得るステップと、
加速溶媒抽出または超音波抽出によって、前記粉砕オンシジウム植物試料を溶媒中で抽出して、オンシジウム植物抽出物を得るステップと、
によって調製される、前記オンシジウム植物抽出物。

【請求項2】

前記溶媒が、アルコール、エステル、または水であり、前記オンシジウム植物抽出物が、オンシジウム植物のアルコール抽出物、エステル抽出物、または水によって抽出され、次いでエステルによって抽出された抽出物である、請求項１記載のオンシジウム植物抽出物。

【請求項3】

前記オンシジウム植物抽出物が、前記オンシジウム植物の根、茎または葉から抽出されるか、あるいは前記オンシジウム植物の根、茎および葉で構成される混合物である、請求項１記載のオンシジウム植物抽出物。

【請求項4】

前記オンシジウム植物抽出物が、前記オンシジウム植物の根から抽出される、請求項３記載のオンシジウム植物抽出物。

【請求項5】

オンシジウム種が、オンシジウム・スタシ（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｓｔａｃｙｉ）、オンシジウム・スプレンジドゥム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｍ）、オンシジウム・プシルム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｐｕｓｉｌｌｕｍ）、オンシジウム・ジョネシアヌム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｊｏｎｅｓｉａｎｕｍ）、オンシジウム・ハウケシアナ（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｈａｗｋｅｓｉａｎａ）、オンシジウム・アセンデンス（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ａｓｃｅｎｄｅｎｓ）、オンシジウム・アムプリアツム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ａｍｐｌｉａｔｕｍ）、またはオンシジウム・フレクスオスム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｆｌｅｘｕｏｓｕｍ）を含む、請求項1記載のオンシジウム植物抽出物。

【請求項6】

糖尿病治療を必要とする被験体において、糖尿病を治療するための薬剤製造のための、請求項１～５のいずれかに記載のオンシジウム植物抽出物の使用。

【請求項7】

前記オンシジウム植物抽出物の有効量が、０．００７ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項６記載の使用。

【請求項8】

前記オンシジウム植物抽出物の有効量が、０．０３５ｍｇ／ｋｇ体重～７５ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項６記載の使用。

【請求項9】

ヒトにおける前記オンシジウム植物抽出物の有効量が、０．０７ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項６記載の使用。

【請求項10】

前記被験体が哺乳動物またはヒトである、請求項６記載の使用。

【請求項11】

肝臓保護を必要とする被験体において、肝臓を保護するための薬剤製造のための、請求項１～５のいずれかに記載のオンシジウム植物抽出物の使用。

【請求項12】

前記オンシジウム植物抽出物の有効量が、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１１記載の使用。

【請求項13】

前記オンシジウム植物抽出物の有効量が、０．００９ｍｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１１記載の使用。

【請求項14】

前記オンシジウム植物抽出物の有効量が、０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１１記載の使用。

【請求項15】

前記被験体が哺乳動物またはヒトである、請求項１１記載の使用。

【請求項16】

急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）防止を必要とする被験体において、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を防止するための薬剤製造のための、請求項１～５のいずれかに記載のオンシジウム植物抽出物の使用。

【請求項17】

ヒトにおける前記オンシジウム植物抽出物の有効量が、０．００７ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１６記載の使用。

【請求項18】

ヒトにおける前記オンシジウム植物抽出物の有効量が、０．０２ｍｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１６記載の使用。

【請求項19】

ヒトにおける前記オンシジウム植物抽出物の有効量が、０．０３５ｍｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１６記載の使用。

【請求項20】

前記被験体が哺乳動物またはヒトである、請求項１６記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、オンシジウム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ）植物抽出物、および糖尿病を治療し、肝臓を保護し、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を防止するための薬剤製造のためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

糖尿病（ＤＭ）は、インスリンおよび／またはインスリン産生の障害によって引き起こされる代謝性疾患であり、高血糖を導く。ＤＭ患者はしばしば、多くの合併症を有し、このうちの１つが自己治癒障害である。

【0003】

糖尿病創傷治癒障害は、糖尿病患者の主要かつ最も難治性の合併症であり、血管、神経障害、免疫および生化学構成要素などの多様な要因に関連する。高血糖は動脈を硬化させ、続いて循環遅延および微小血管機能障害、ならびに組織酸素供給減少を導き；高血糖はまた、創傷への白血球の遊走を減少させ、ヒトをより感染しやすくする。ＤＭにおける末梢神経障害は、その領域を無感覚にし、疼痛を感じる能力を減少させる可能性があり、このため、創傷が直ちに気付かれず、適切な治療が取られなくなる可能性がある。

【0004】

肝臓は、人体における最も重要な臓器の１つであり、薬剤、アルコール、食餌、低質な仕事や休息によって損傷を受けうる。肝臓傷害は、肝細胞の変性、壊死、線維性組織過形成および他の病変を導く可能性があり、続いて、一連の肝臓病的変化および続発性疾患、例えば肝炎、肝癌、および肝硬変を導くであろう。

【0005】

グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）は、人体において、アミノ酸およびタンパク質の代謝に主に関与し、肝細胞で高濃度であるため、ひとたび肝臓が損傷を受けると、ＧＯＴおよびＧＰＴは血中に流れ込み、したがってこれらは血液試験において、肝臓傷害を同定する生物学的指標として用いられる。

【0006】

急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）は、肺への急性炎症性傷害であり、肺胞の正常な機能に影響を及ぼし、呼吸交換に影響して、血中の不十分な酸素濃度や、それに続く体の多様な臓器への損傷を生じる、致死性急性疾病である。ＡＲＤＳの治療は、人工呼吸器などの支持療法に基づく。

【0007】

天然化合物は、豊富に供給され多様な骨格を持つ利点があり、薬剤開発の重要な基剤である。１９８１年から２０１９年まで、新規ＦＤＡ認可薬剤の半数近くが天然産物またはその誘導体に由来しており、例えば癌治療用のコカイン由来麻薬、モルヒネ由来鎮痛剤、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびパクリタキセル、ならびに抗生物質としての真菌由来ペニシリンがある。したがって、本発明は、どの天然化合物が、ＤＭを治療し、肝臓を保護し、またはＡＲＤＳを防止するための新規薬剤として発展させる潜在的可能性を有するかを決定するため、積極的に研究する。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、オンシジウム植物抽出物であり、その調製ステップは、オンシジウム植物試料を採取するステップと、この試料を乾燥させて粉砕し、粉砕オンシジウム植物試料を得るステップと、次いで、加速溶媒抽出または超音波抽出によって粉砕オンシジウム植物試料を溶媒中で抽出して、オンシジウム植物抽出物を得るステップである。

【0009】

本発明において、溶媒は、好ましくは、アルコール、エステル、または水であり、オンシジウム植物抽出物は、好ましくは、オンシジウム植物のアルコール抽出物、エステル抽出物、または水によって抽出され、次いでエステルによって抽出された抽出物である。

【0010】

本発明のアルコールは、限定されるわけではないが、最も好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール、ヘキサノールを含み、エステルは、限定されるわけではないが、最も好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチルを含む。

【0011】

本発明のオンシジウム植物抽出物は、好ましくは、オンシジウム植物の根、茎または葉、あるいはオンシジウム植物の根、茎および葉で構成される混合物から抽出される。

【0012】

本発明のオンシジウム植物抽出物は、最も好ましくは、オンシジウム植物の根から抽出される。

【0013】

本発明において、オンシジウム種は、オンシジウム・スタシ（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｓｔａｃｙｉ）、オンシジウム・スプレンジドゥム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｍ）、オンシジウム・プシルム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｐｕｓｉｌｌｕｍ）、オンシジウム・ジョネシアヌム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｊｏｎｅｓｉａｎｕｍ）、オンシジウム・ハウケシアナ（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｈａｗｋｅｓｉａｎａ）、オンシジウム・アセンデンス（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ａｓｃｅｎｄｅｎｓ）、オンシジウム・アムプリアツム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ａｍｐｌｉａｔｕｍ）、またはオンシジウム・フレクスオスム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｆｌｅｘｕｏｓｕｍ）を含む。

【0014】

本発明は、糖尿病治療を必要とする被験体において、糖尿病を治療するための薬剤を製造するためのオンシジウム植物抽出物の使用に関する。

【0015】

本発明はまた、肝臓保護を必要とする被験体において、肝臓を保護するための薬剤を製造するためのオンシジウム植物抽出物の使用に関する。

【0016】

本明細書で使用される際、本発明における用語「肝臓保護」は、肝臓傷害から被験体を保護するか、肝臓傷害の可能性を減少させるか、または肝臓傷害の度合いを軽減することを指す。本発明の用語「肝臓傷害」には、限定されるわけではないが、肝臓傷害、肝臓疾患、例えば肝炎（限定されるわけではないが、アルコール性肝炎、薬剤誘導性肝炎、脂肪性肝炎、慢性肝炎を含む）、肝癌、肝硬変、肝線維症、脂肪肝、肝機能低下（ｈｅｐａｔｉｃ ｄｅｃｌｉｎｅ）、および肝臓傷害によって引き起こされる他の肝臓疾患（限定されるわけではないが、急性肝臓傷害または慢性肝臓傷害）が含まれる。

【0017】

本発明はさらに、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）防止を必要とする被験体において、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を防止するための薬剤を製造するためのオンシジウム植物抽出物の使用に関する。

【0018】

本明細書で使用される際、本発明の用語「急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）」は、輸血関連肺傷害、人工呼吸器誘導性肺傷害、細菌誘導性肺傷害、またはウイルス誘導性肺傷害を含む。

【0019】

本発明において、薬剤は、オンシジウム植物抽出物に関して医薬的に許容されうるキャリアーをさらに含んでもよい。

【0020】

用語「有効量」は、個体に投与された際に有効な結果を達成しうる量、あるいはｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで望ましい活性を有する量である。炎症性障害の場合、無治療と比較した際、有効臨床転帰には、疾患または状態と関連する症状の度合いまたは重症度の軽減、および／または個体の生命の延長、および／または個体の生活の質の改善が含まれる。個体に投与される化合物の正確な量は、疾患または症状のタイプおよび重症度に応じ、かつ個体の全身健康状態、個体の年齢、性別、体重、および薬剤耐性などの個々の特性に応じる。こうした量は、炎症性障害、自己免疫障害およびアレルギー性障害の状態、重症度およびタイプ、または望ましい免疫抑制効果によっても支配される。当業者は、本発明の開示される技術的特徴に基づいて、これらのおよび他の要因にしたがって、適切な用量を決定することが可能であろう。

【0021】

本発明において、本発明のオンシジウム植物抽出物の有効量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0022】

さらに、本発明のオンシジウム植物抽出物の有効量は、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。

【0023】

本発明の有効量は、２００５年７月にＦＤＡによって刊行された、Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ： Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅｓ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）に提供される公式および安全性要因にしたがって、異なる種の被験体の同等の有効量に変換されうる。

【0024】

被験体において、糖尿病を治療するための薬剤製造のための使用において、被験体はヒトまたは哺乳動物であり、本発明の有効量は、０．００７ｍｇ／ｋｇ体重～１．５ｍｇ／ｋｇ体重であり；本発明の有効量は、好ましくは、０．０３５ｍｇ／ｋｇ体重～１．３ｍｇ／ｋｇ体重であり；本発明の有効量は、最も好ましくは、０．０７ｍｇ／ｋｇ体重～０．７５ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0025】

詳細には、被験体において糖尿病を治療するための薬剤製造のための使用において、平均体重２５グラムのマウスにおける本発明の有効量は、１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重１０キログラムのイヌまたはネコにおける同等な有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～１．５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重６０キログラムの成人における同等な有効量は０．００７ｍｇ／ｋｇ体重～０．８ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重２０キログラムの小児における同等な有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～１．２ｍｇ／ｋｇ体重であり；好ましくは、平均体重２５グラムのマウスにおける本発明の有効量は、５ｍｇ／ｋｇ体重～７５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重１０キログラムのイヌまたはネコにおける同等な有効量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重～１．３ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重６０キログラムの成人における同等な有効量は０．０３５ｍｇ／ｋｇ体重～０．６ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重２０キログラムの小児における同等な有効量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重～０．８５ｍｇ／ｋｇ体重であり；最も好ましくは、平均体重２５グラムのマウスにおける本発明の有効量は、１０ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重１０キログラムのイヌまたはネコにおける同等な有効量は、０．１３ｍｇ／ｋｇ体重～０．７５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重６０キログラムの成人における同等な有効量は０．０７ｍｇ／ｋｇ体重～０．４５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重２０キログラムの小児における同等な有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重～０．６ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0026】

被験体において肝臓を保護するための薬剤製造のための使用において、被験体はヒトまたは哺乳動物であり、本発明の有効量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１．７５ｍｇ／ｋｇ体重であり；本発明の有効量は、好ましくは、０．００９ｍｇ／ｋｇ体重～１ｍｇ／ｋｇ体重であり；本発明の有効量は、最も好ましくは、０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重～０．４ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0027】

詳細には、被験体において肝臓を保護するための薬剤製造のための使用において、平均体重３５０グラムのラットにおける本発明の有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重１０キログラムのイヌまたはネコにおける同等な有効量は、０．００３ｍｇ／ｋｇ体重～１．７５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重６０キログラムの成人における同等な有効量は０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１．２５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重２０キログラムの小児における同等な有効量は、０．００２ｍｇ／ｋｇ体重～１．５ｍｇ／ｋｇ体重であり；好ましくは、平均体重３５０グラムのラットにおける本発明の有効量は、０．５ｍｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重１０キログラムのイヌまたはネコにおける同等な有効量は、０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重～１ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重６０キログラムの成人における同等な有効量は０．００９ｍｇ／ｋｇ体重～０．５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重２０キログラムの小児における同等な有効量は、０．０１３ｍｇ／ｋｇ体重～０．７ｍｇ／ｋｇ体重であり；最も好ましくは、平均体重３５０グラムのラットにおける本発明の有効量は、１ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重１０キログラムのイヌまたはネコにおける同等な有効量は、０．０３ｍｇ／ｋｇ体重～０．４ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重６０キログラムの成人における同等な有効量は０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重～０．２ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重２０キログラムの小児における同等な有効量は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ体重～０．３ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0028】

被験体において急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を防止するための薬剤製造のための使用において、被験体はヒトまたは哺乳動物であり、本発明の有効量は、０．００７ｍｇ／ｋｇ体重～０．７５ｍｇ／ｋｇ体重であり；本発明の有効量は、好ましくは、０．０２ｍｇ／ｋｇ体重～０．４ｍｇ／ｋｇ体重であり；本発明の有効量は、最も好ましくは、０．０３５ｍｇ／ｋｇ体重～０．３５ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0029】

詳細には、被験体において急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を防止するための薬剤製造のための使用において、平均体重２５グラムのマウスにおける本発明の有効量は、１ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重１０キログラムのイヌまたはネコにおける同等な有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～０．７５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重６０キログラムの成人における同等な有効量は０．００７ｍｇ／ｋｇ体重～０．４５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重２０キログラムの小児における同等な有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重～０．６５ｍｇ／ｋｇ体重であり；好ましくは、平均体重２５グラムのマウスにおける本発明の有効量は、３ｍｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重１０キログラムのイヌまたはネコにおける同等な有効量は、０．０４ｍｇ／ｋｇ体重～０．４ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重６０キログラムの成人における同等な有効量は０．０２ｍｇ／ｋｇ体重～０．２５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重２０キログラムの小児における同等な有効量は、０．０３ｍｇ／ｋｇ体重～０．３ｍｇ／ｋｇ体重であり；最も好ましくは、平均体重２５グラムのマウスにおける本発明の有効量は、５ｍｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重１０キログラムのイヌまたはネコにおける同等な有効量は、０．０６ｍｇ／ｋｇ体重～０．３５ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重６０キログラムの成人における同等な有効量は０．０３５ｍｇ／ｋｇ体重～０．２ｍｇ／ｋｇ体重であり、平均体重２０キログラムの小児における同等な有効量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重～０．２５ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0030】

本発明において、本発明の被験体はヒト（例えば乳児、幼児、ティーンエージャー、若年成人、中年成人または高齢者）、齧歯類（例えばマウス、ラット）または哺乳類（例えばコンパニオン動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、テン（ｍａｒｔｅｎ）；実用動物（ｅｃｏｎｏｍｉｃ ａｎｉｍａｌ）、例えばウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ）である。好ましい様式において、本発明の被験体はヒトまたは哺乳動物である。本発明の被験体は、最も好ましくはヒトである。

【0031】

本発明はまた、医薬的に許容されうるキャリアーを含んでもよく、特に、あらかじめ決定された溶媒または油、ｐＨ調整剤をさらに含んでもよく、望ましい場合、分散剤をさらに含んでもよい。
本発明で用いられる溶媒の例には、限定されるわけではないが、水、エタノール、イソプロパノール、１，３－ブタンジオール、プロピレングリコール、グリセリン等が含まれる。本発明で用いられる油の例は、限定されるわけではないが、コーン油、ゴマ油、亜麻仁油、綿実油、大豆油、ピーナツ油、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ミネラルオイル、スクアレン、ホホバ油、オリーブ油、月見草油、ルリジサ油、ブドウ種子油、ココナツ油、ヒマワリ油、シアバター、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される。

【0032】

溶媒および油を単独で、またはその任意の組み合わせで用いてもよい。

【0033】

本発明に有益な有用な分散剤の例には、限定されるわけではないが、レシチン、有機モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ステアリン酸ソルビタン等が含まれてもよい。これらの原材料もまた、単独で、またはその任意の組み合わせで用いてもよい。

【0034】

本発明において、薬剤は、好ましくは経口で、または注射によって投与される。

【0035】

本発明において、本発明の薬剤はまた、外用剤として調製されてもよく、外用剤の例には、限定されるわけではないが、クリーム、軟膏、ジェル、洗浄ローションまたはパッチ等が含まれてもよく、あるいは吸入剤、エアロゾル、座薬等であってもよい。

【0036】

薬剤を外用剤として用いる際、基材として適切な皮膚外用剤を用いてもよく、既知の方法にしたがって、水性溶液、非水性溶媒、懸濁物、エマルジョンまたは凍結乾燥調製剤等を用い、滅菌してもよい。既知の方法を用いることによって、かつ既知の柔軟剤、乳化剤および増粘剤または当該技術分野に知られる他の材料を添加することによって、ジェル、クリームおよび軟膏の形の組成物を調製してもよい。

【0037】

例えば、柔軟剤、例えばトリメチロールプロパン、ポリエチレングリコールおよびグリセロール、例えばプロピレングリコール、エタノールおよびイソセチルアルコールの溶媒、ならびに純水を添加することによって、ジェル型組成物を調製してもよい。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】図１は、窒素フリーラジカルＤＰＰＨを阻害する際の各オンシジウム植物抽出物の有効性を例示する。^＊＊／^＊＊＊は有意に異なることを意味する。

【図2】図２は、酸素フリーラジカルＡＡＰＨを阻害する際の各オンシジウム植物抽出物の有効性を例示する。ΔＡＵＣは、受信者操作特性曲線の曲線下面積を意味する；^＊＊／^＊＊＊は有意に異なることを意味する。

【図3】図３は、Ｉ型糖尿病の治療におけるオンシジウム植物抽出物の有効性を評価するための動物実験のフロー図を示す。記号の説明：＊はストレプトゾトシンによる糖尿病の誘導を示す；＄は非絶食時血中グルコースレベルのチェックを示す；＃は１８時間絶食時血中グルコースレベルのチェックを示す；→はオンシジウム植物抽出物を投与する期間を示す；！は屠殺を示す；％は肝臓機能指数（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ））および腎臓機能指数（クレアチニン（ＣＲＥ）、尿素窒素（ＢＵＮ））を決定するための血液パラメータを示す。

【図4】図４は、健康なマウス、糖尿病マウス、およびオンシジウム植物抽出物を投与された糖尿病マウスにおける、絶食前および１８時間絶食後の血中グルコースレベルを例示する。^＊は、処置群を非処置群に比較した際の有意差（Ｐ＜０．０５）を示す；＋は投与を示す；－は非投与を示す。

【図5】図５は、健康なマウス、糖尿病マウス、およびオンシジウム植物抽出物を投与された糖尿病マウスにおける、耐糖試験を例示する。^＊は、低投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群を非処置群に比較した際の有意差（Ｐ＜０．０５）を示す；＃は、中程度投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群を非処置群に比較した際の有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。

【図6】図６は、健康なマウス、糖尿病マウス、およびオンシジウム植物抽出物を投与された糖尿病マウスの血液パラメータを例示する。^＊は、処置群を非処置群に比較した際の有意差を示す；＋は投与を示す；－は非投与を示す。

【図7】図７は、健康なマウス、糖尿病マウス、およびオンシジウム植物抽出物を投与された糖尿病マウス由来の肝臓および腎臓切片の染色を例示する。＋は投与を示す；－は非投与を示す。

【図8】図８は、健康なマウス、糖尿病マウス、およびオンシジウム植物抽出物を投与された糖尿病マウスの体重変化を例示する。^＊は、低投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群を非処置群に比較した際の有意差（Ｐ＜０．０５）を示す；＃は、中程度投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群を非処置群に比較した際の有意差（Ｐ＜０．０５）を示す；＠は、高投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群を非処置群に比較した際の有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。

【図9】図９は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）治療におけるオンシジウム植物抽出物の有効性を評価するための動物実験のフロー図を示す。記号の説明：＊は非絶食時血中グルコースレベルのチェックを示す；＄は８時間絶食時血中グルコースレベルのチェックを示す；＃は腹腔内（Ｉ．Ｐ．）インスリン耐性試験を示す；＠はＩ．Ｐ．耐糖試験を示す；→はオンシジウム植物抽出物を投与する期間を示す；！は屠殺を示す；％は肝臓機能指数（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ））および腎臓機能指数（クレアチニン（ＣＲＥ）、尿素窒素（ＢＵＮ））を決定するための血液パラメータを示す。

【図10】図１０は、Ｔ２ＤＭマウス、およびオンシジウム植物抽出物を４週間投与されたＴ２ＤＭマウスにおける、８時間絶食後の血中グルコースレベルを示す。^＊＊は、処置群を非処置群に比較した際の有意差（Ｐ＜０．０１）を示す。

【図11】図１１は、Ｔ２ＤＭマウス、およびオンシジウム植物抽出物を４週間投与されたＴ２ＤＭマウスにおける、耐糖試験を示す。^＊は、５０ｍｇ／ｋｇ処置群を非処置群に比較した際の有意差（Ｐ＜０．０１）を示す。

【図12】図１２は、Ｔ２ＤＭマウス、およびオンシジウム植物抽出物を４週間投与されたＴ２ＤＭマウスにおける、インスリン耐性試験を示す。＃は、１０ｍｇ／ｋｇ処置群を非処置群に比較した際の有意差（ｐ＜０．０１）を示す。＠は、２５ｍｇ／ｋｇ処置群を非処置群に比較した際の有意差（ｐ＜０．０１）を示す。^＊は、５０ｍｇ／ｋｇ処置群を非処置群に比較した際の有意差（ｐ＜０．０１）を示す。

【図13】図１３は、Ｔ２ＤＭマウス、およびオンシジウム植物抽出物を４週間投与されたＴ２ＤＭマウスの血液パラメータを示す。－は非投与を示す。

【図14】図１４は、肝臓保護におけるオンシジウム植物抽出物の有効性を評価するための動物実験のフロー図を示す。記号の説明：＊は、ＣＣｌ_４による肝線維症の誘導を示す；％は血液収集を示す；→はオンシジウム植物抽出物を投与する期間を示す；！は屠殺を示す。

【図15】図１５は、異なる群における肝線維症ラットの第７週の血液生化学分析結果（ＧＯＴ、ＧＰＴ）を例示する。＋は投与を示す；－は非投与を示す。

【図16】図１６は、異なる群における肝線維症ラットの血液生化学分析の週ごとの変化を例示する。

【図17】図１７は、異なる群における肝線維症ラットのラット体重追跡結果を例示する。

【図18】図１８は、オンシジウム植物抽出物が、マウスにおけるＤ－ＧａｌＮ／ＬＰＳ誘導性急性肝傷害（ＡＬＩ）を緩和したことを示す。＋は投与を示す；－は非投与を示す；^＊は、処置群を非処置群に比較した際の有意差（ｐ＜０．０５）を示す；^＊＊＊は、処置群を非処置群に比較した際の有意差（ｐ＜０．００５）を示す。

【図19】図１９は、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を防止する際のオンシジウム植物抽出物の有効性を評価するための動物実験のフロー図を示す。記号の説明：＊は、リポ多糖（ＬＰＳ）によるＡＲＤＳの誘導を示す；％は、オンシジウム植物抽出物の投与を示す；！は屠殺を示す。

【図20】図２０は、異なる群のマウスにおける肺組織切片の染色結果を例示する。＋は投与を示す；－は非投与を示す。

【図21】図２１は、異なる群のマウスにおける血液分析結果を例示する。＋は投与を示す；－は非投与を示す。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本実施形態は、単に、最適な実施形態を記載し、本発明を制限するようには意図されない。

【0040】

オンシジウム植物抽出物の調製

【0041】

本発明において、抽出調製に用いられるオンシジウム植物試料は、オンシジウム植物の根（Ｒ）、茎（Ｂ）または葉（Ｌ）、あるいはその根、茎および葉の混合物のいずれかであった。オンシジウム植物の種は、オンシジウム・スタシ、オンシジウム・スプレンジドゥム、オンシジウム・プシルム、オンシジウム・ジョネシアヌム、オンシジウム・ハウケシアナ、オンシジウム・アセンデンス、オンシジウム・アムプリアツム、またはオンシジウム・フレクスオスムより選択されてもよい。オンシジウム植物試料を乾燥させ、粉砕し、使用準備が整うまで－２０℃で保存した。

【0042】

本発明において、オンシジウム試料をまず、加速溶媒抽出（Ａ）および超音波抽出（Ｕ）によって抽出した。

【0043】

加速溶媒抽出において、酢酸エチル（Ａ－ＥＡ）、９５％エタノール（Ａ－ＥｔＯＨ）、Ｈ_２Ｏ（Ａ－Ｗ）、およびＨ_２Ｏで抽出した後の残渣を、次いで、それぞれ、精製および抽出のための溶媒として酢酸エチルを用いることによって再抽出し、抽出温度は３０～７０℃であり（好ましくは５０℃であり）、抽出時間は１０～３０分間であり（好ましくは１５分間であり）、抽出圧は１３００～１７００ｐｓｉであり（抽出プロセス中のわずかな圧力変動のため、好ましくは１５００ｐｓｉの平均圧であり）、次いで、本発明のオンシジウム植物抽出物（ＯＲＣ００１）を得た。異なる抽出部分および異なる溶媒にしたがって、抽出を：ＯＲＣ００１Ｒ－Ａ－ＥＡ、ＯＲＣ００１Ｒ－Ａ－ＥｔＯＨ、ＯＲＣ００１Ｒ－Ａ－Ｗ、ＯＲＣ００１Ｒ－Ａ－Ｗ＋ＥＡ、ＯＲＣ００１Ｂ－Ａ－ＥＡ、ＯＲＣ００１Ｂ－Ａ－ＥｔＯＨ、ＯＲＣ００１Ｂ－Ａ－Ｗ、ＯＲＣ００１Ｂ－Ａ－Ｗ＋ＥＡ、ＯＲＣ００１Ｌ－Ａ－ＥＡ、ＯＲＣ００１Ｌ－Ａ－ＥｔＯＨ、ＯＲＣ００１Ｌ－Ａ－Ｗ、およびＯＲＣ００１Ｌ－Ａ－Ｗ＋ＥＡと名付けた。

【0044】

超音波抽出において、酢酸エチル（Ｕ－ＥＡ）、９５％エタノール（Ｕ－ＥｔＯＨ）、Ｈ_２Ｏ（Ｕ－Ｗ）、およびＨ_２Ｏで抽出した後の残渣を、次いで、それぞれ、室温での精製および抽出のための溶媒として酢酸エチルを用いることによって再抽出し、抽出温度は３０～７０℃であり（好ましくは５０℃であり）、抽出時間は１５～６０分間であり（好ましくは３０分間であり）、出力は２００～６００ワットであり（好ましくは４００ワットであり）、周波数は２０～６０Ｈｚであり（好ましくは４０Ｈｚであり）、次いで、本発明のオンシジウム植物抽出物（ＯＲＣ００１）を得た。抽出部分および溶媒にしたがって、抽出を：ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥＡ、ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ、ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－Ｗ、ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－Ｗ＋ＥＡ、ＯＲＣ００１Ｂ－Ｕ－ＥＡ、ＯＲＣ００１Ｂ－Ｕ－ＥｔＯＨ、ＯＲＣ００１Ｂ－Ｕ－Ｗ、ＯＲＣ００１Ｂ－Ｕ－Ｗ＋ＥＡ、ＯＲＣ００１Ｌ－Ｕ－ＥＡ、ＯＲＣ００１Ｌ－Ｕ－ＥｔＯＨ、ＯＲＣ００１Ｌ－Ｕ－Ｗ、およびＯＲＣ００１Ｌ－Ｕ－Ｗ＋ＥＡと名付けた。

【0045】

異なる種のオンシジウム植物抽出物（同じ部分、同じ溶媒、同じ抽出法）の構成要素プロファイルの決定を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）フィンガープリントによって行い、結果は、異なる種のオンシジウム植物抽出物で類似のフィンガープリントが観察されることを明らかにし、これは、これらの異なる種のオンシジウム植物抽出物に同じ化合物が存在することを示した。したがって、本発明のオンシジウム植物試料として、オンシジウム・フレクスオスム種を選択した。

【0046】

スーパーオキシドアニオンおよびエラスターゼ放出の阻害試験

【0047】

上述の多様なオンシジウム植物抽出物の抗炎症能を、スーパーオキシドアニオンおよびエラスターゼ放出の阻害試験を通じて、本発明において評価した。

【0048】

まず、好中球の調製を行った。

【0049】

健康なドナー（２０～３５歳；通常の仕事および休息を行い、１週間を超えて薬剤の摂取を控えている）の血液約５０ｍＬを肘静脈から真空無菌血液収集チューブに収集し、これを等体積の３％デキストラン溶液（デキストラン）に添加し、均一に混合し、静置させて赤血球を沈降させた。好中球を含有する上清を採取し、遠心管中に含有されるＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ溶液上を覆い、次いで、遠心管を遠心分離して、異なる血液細胞を密度勾配によって分離させ、底部に沈殿した好中球およびわずかな赤血球を得た。残渣赤血球を異なる濃度のＮａＣｌ溶液で膨張させ、２つの細胞間の浸透圧耐性の相違を利用することによって、必要な好中球を保持した。

【0050】

呼吸器ブラスティング（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｌａｓｔｉｎｇ）実験および脱顆粒機能の評価によって、好中球に対する、上述の多様なオンシジウム植物抽出物の炎症反応の評価を行った。

【0051】

呼吸器ブラスティングは、主に、スーパーオキシドアニオン（Ｏ_２ ^・－）及び反応性酸素種（ＲＯＳ）を生じ、上記オンシジウム植物抽出物に、０．６ｍｇ／ｍＬのフェリチトクロムｃを含有する好中球懸濁物（６ｘ１０^５細胞／ｍＬ）を３７℃で２分間添加することによって、スーパーオキシドアニオン（Ｏ_２ ^・－）の検出を行い、次いで、１μｇ／ｍＬサイトカラシンＢ（ＣＢ）で３分間処理した。次いで、Ｎ－ホルミル－Ｌ－メチオニル－Ｌ－ロイシノイル－Ｌ－フェニルアラニン（ｆＭＬＦ）を刺激剤として用いて、細胞を約１０分間活性化した。次いで、ＵＶ分光光度計を用いて、５５０ｎｍの波長で、吸光度値を測定した。

【0052】

エラスターゼ放出実験において、１００μＭエラスターゼアクセプター、メトキ
シスクシニル－ａｌａ－ａｌａ－プロリネート－バリン－ｐ－ニトロアニリド（ＭｅＯＳｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－ｐ－ニトロアニリド）を含有する好中球懸濁物（６ｘ１０^５細胞／ｍＬ）を５分間、あらかじめ温めて３７℃に到達させた後、上記の多様なオンシジウム植物抽出物を２分間添加した。細胞を０．５μｇ／ｍＬサイトカラシンＢ（ＣＢ）で３分間処理し、０．１μＭ ｆＭＬＦでおよそ１０分間刺激することによって好中球を活性化し、最後に、ＵＶ分光光度計を用いて、４０５ｎｍで吸光度値を測定した。実験結果を阻害パーセントとして表した。

【0053】

結果を表１に示す。

【0054】

【表1】

１０μｇ／ｍｌでの阻害パーセント（阻害％）。結果を平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提示する（ｎ＝３～５）。対照（ＤＭＳＯまたはＨ_２Ｏ）と比較して、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。
^ａ５０％阻害に必要な濃度（ＩＣ_５０）
^ｂＨ_２Ｏ中に溶解。
^ｃ実験前に、ＯＲＣ００１Ｒ－Ａ－ＥＡ（１０μｇ／ｍｌ）を０．２２μｍフィルターでろ過した。

【0055】

本発明のオンシジウム植物抽出物の細胞傷害性を表２に示した。

【0056】

【表2】

１０μｇ／ｍｌでの細胞生存パーセント（％）。結果を平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提示する（ｎ＝３）。
^ａ実験前に、ＯＲＣ００１Ｒ－Ａ－ＥＡ（１０μｇ／ｍｌ）を０．２２μｍフィルターでろ過した。

【0057】

フリーラジカルスカベンジング能試験

【0058】

窒素ラジカル：１，１－ジフェニル－ｐ－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）、および酸素ラジカル：２，２’－アゾビス（２－アミノプロパン）ヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）は、炎症と関連する安定フリーラジカルである。本発明において、１０μｇ／ｍＬの各オンシジウム植物抽出物が、フリーラジカルをスカベンジングする能力をさらに試験し、ここで、ＤＭＳＯまたはＨ_２Ｏを対照群として用い、α－トコフェロールを比較試薬として用い、各オンシジウム植物抽出物がフリーラジカルをスカベンジングする能力を有する場合、これを、フリーラジカルスカベンジングの活性指数として、それぞれ、３０分間および２時間、エタノール設定ＤＰＰＨ（１００μＭ）またはＡＡＰＨ（２５ｍＭ）と混合した。

【0059】

図１に示されるように、オンシジウム根（ＯＲＣ００１Ｒ）の有機溶媒抽出物（ＥＡ、ＥｔＯＨ、Ｗ＋ＥＡ）は、窒素ラジカルＤＰＰＨの阻害において、より有意であった。

【0060】

さらに、図２に示されるように、オンシジウム根（ＯＲＣ００１Ｒ）およびオンシジウム茎（ＯＲＣ００１Ｂ）の有機溶媒抽出物（ＥＡ、ＥｔＯＨ、Ｗ＋ＥＡ）、ならびにオンシジウム葉（ＯＲＣ００１Ｌ）のＥｔＯＨおよび水抽出物は、酸素ラジカル阻害において、より有意であることを示した。

【0061】

１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）モデルの確立

【0062】

すべての実験は、長庚大学動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可された。

【0063】

まず、糖尿病の動物モデルを確立した。５日連続で、４時間絶食させた後、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中の５５ｍｇ／ｋｇストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射することによって、体重２０～２５グラムの７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、糖尿病を誘導した。１型糖尿病の誘導のため、第１日～第４日に、ＳＴＺ注射後に、通常の固形飼料および１％グルコース水を提供した。第５日以降は、グルコース水を提供する代わりに、通常の飲用水を提供した。

【0064】

ＳＴＺ注射の７２時間後、マウスを４時間絶食させた。尾を刺して出血させ、Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｐｌｕｓポータブル血糖測定器（Ａｓｃｅｎｓｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて、絶食時血中グルコースレベルを測定した。１５０～２５０ｍｇ／ｄＬの絶食時血中グルコースレベルを有する動物を前糖尿病と見なし、一方、＞２５０ｍｇ／ｄＬを糖尿病と見なし、続く実験に用いた。すべてのマウスの絶食時血中レベルは＞２５０ｍｇ／ｄＬであった。

【0065】

Ｔ１ＤＭ治療効果の評価

【0066】

抽出物投与を伴うまたは伴わない血中グルコースレベルを監視することによって、糖尿病におけるオンシジウム根抽出物（ＯＲＣ００１Ｒ）の療法効果を評価した。溶媒としてＥｔＯＨを用いたオンシジウム根超音波抽出物（ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ）を本発明に用いた。実験フロー図を図３に示す。

【0067】

総数２５のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを実験に用いた。これらのマウスをランダムに５群に分けた：処置対照群の４匹のマウス（生理食塩水中の１０％エタノールおよび１０％Ｔｗｅｅｎ－２０；ＮＣ）、非処置群の７匹のマウス（ＳＴＺ；Ｔ１ＤＭ）、低投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群の７匹のマウス（１０ｍｇ／ｋｇ ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを投与；Ｔ１ＤＭ＋ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ（１０ｍｇ／ｋｇ））、中程度投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群の４匹のマウス（２５ｍｇ／ｋｇ ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを投与；Ｔ１ＤＭ＋ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ（２５ｍｇ／ｋｇ））、および高投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群の３匹のマウス（５０ｍｇ／ｋｇ ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを投与；Ｔ１ＤＭ＋ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ（５０ｍｇ／ｋｇ））。

【0068】

薬剤投与前に、動物の体重をチェックし、尾端を刺し、血液を収集することにより、Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｐｌｕｓポータブル血糖測定器（Ａｓｃｅｎｓｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いることによって、動物の非絶食時血中グルコースレベルをチェックした。その後、動物を１８時間絶食させて、絶食時血中グルコースレベルを得た。薬剤投与後、７日目および１４日目に、これらのステップを反復して、血中グルコースレベルの傾向を観察した。

【0069】

図４に示されるように、投与１４日後の動物の１８時間絶食時血中レベルの結果は、低投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群が、血中グルコースを減少させる傾向を示し、中程度投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群では血中グルコースを減少させる好ましい効果が観察され、高投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群では血中グルコースを減少させる有意な効果が観察されることを示した。

【0070】

腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）によって、動物の血中グルコースレベルの傾向の結果を調べた。１８時間絶食後、１ｇ／ｋｇ体重の用量で、グルコース（Ｓｉｇｍａより購入）をマウスに腹腔内投与し、血糖測定器を用いることによって、注射０分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、および１８０分後の時点で血中グルコースレベルを検出した。結果を図５に示し、ここで、低投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群、中程度投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群および高投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群はすべて、連続１４日の経口投与後、血中グルコースレベルを減少させる傾向を有し、特に、血中グルコースレベルを減少させる最良の傾向は、中程度投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群および高投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群の両方で示されることが立証された。

【0071】

連続１４日のＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ処置後、動物モデルの心臓から血液を抜き取り、次いで、２０００ｘｇで１５分間、室温で遠心分離して、全血から血清を分離し、富士フイルムＤＲＩ－ＣＨＥＭ ＮＸ５００ｉデバイスを用いることによって、動物の血液において、肝機能指数（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ））および腎機能指数（クレアチニン（ＣＲＥ）、尿素窒素（ＢＵＮ））を試験し、肝臓組織および腎臓組織の切片作製も行い、ヘマトキシリン－エオジンで染色し（Ｈ＆Ｅ染色）、結果を図６および７に示し、ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨは、肝臓または腎臓において毒性を示さず、また、糖尿病によって引き起こされる肝臓および腎臓の損傷を修復する効果も有した。

【0072】

動物の体重変化を図８に示し、動物におけるＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ投与は、第９日以降、体重再増加の傾向を示した。

【0073】

２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）モデルの確立

【0074】

すべての実験は、長庚大学動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可された。

【0075】

まず、２型糖尿病動物モデルを確立した。本発明は、体重３１～３５グラムの５週齢雄ＢＫＳ．Ｃｇ－Ｄｏｃｋ７ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊｎａｒｌマウスを選択した。この系統は、遺伝子操作された自発性２型糖尿病マウスで、長年確立されてきており、メタボリックシンドローム疾患のモデルとして広く許容されている。

【0076】

尾を刺して出血させ、Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｐｌｕｓポータブル血糖測定器（Ａｓｃｅｎｓｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて、絶食時血中グルコースレベルを測定した。１５０～２５０ｍｇ／ｄＬの絶食時血中グルコースレベルを有する動物を前糖尿病状態と見なす。実験の週が進むにつれて、マウスの絶食時血中グルコースレベルは徐々に増加し、＞２５０ｍｇ／ｄＬを糖尿病と分類した。

【0077】

Ｔ２ＤＭ治療効果の評価

【0078】

抽出物投与を伴うまたは伴わない血中グルコースレベルを監視することによって、糖尿病におけるオンシジウム根抽出物（ＯＲＣ００１Ｒ）の療法効果を評価した。溶媒としてＥｔＯＨを用いたオンシジウム根超音波抽出物（ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ）を本発明に用いた。実験フロー図を図９に示す。

【0079】

総数１２のＢＫＳ．Ｃｇ－Ｄｏｃｋ７ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊｎａｒｌ雄マウスを実験に用いた。これらのマウスをランダムに４群に分けた：非処置群の３匹のマウス（Ｔ２ＤＭ）（１％Ｔｗｅｅｎ２０および９９％ＣＭＣ溶液（０．５％ｗ／ｖ）；Ｔ２ＤＭ）、低投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群の３匹のマウス（１０ｍｇ／ｋｇ ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを投与；Ｔ２ＤＭ＋ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ（１０ｍｇ／ｋｇ））、中程度投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群の３匹のマウス（２５ｍｇ／ｋｇ ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを投与；Ｔ２ＤＭ＋ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ（２５ｍｇ／ｋｇ））、および
高投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群の３匹のマウス（５０ｍｇ／ｋｇ ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを投与；Ｔ２ＤＭ＋ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ（５０ｍｇ／ｋｇ））。

【0080】

薬剤投与前に、動物の体重をチェックし、尾端を刺し、血液を収集することにより、Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｐｌｕｓポータブル血糖測定器（Ａｓｃｅｎｓｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いることによって、動物の非絶食時血中グルコースレベルをチェックした。その後、動物を８時間絶食させて、絶食時血中グルコースレベルを得た。薬剤投与後、１日目、７日目、１４日目、２１日目および２８日目に、これらのステップを反復して、血中グルコースレベルの傾向を観察した。

【0081】

処置２８日後の実験動物の絶食時血中グルコースレベルを図１０に示す。結果は、ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨの根抽出物が、低用量で血中グルコースを低下させる傾向を示すことを示す。中程度用量では、より顕著な血中グルコース低下効果を示し、高用量では、有意な血中グルコース低下効果を示し、用量依存性反応を示した。

【0082】

腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）によって、動物の血中グルコースレベルの傾向の結果を調べた。１８時間絶食後、１ｇ／ｋｇ体重の用量で、グルコース（Ｓｉｇｍａより購入）をマウスに腹腔内注射し、血糖測定器を用いることによって、注射０分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、および１８０分後の時点で血中グルコースレベルを検出した。結果を図１１に示し、ここで、低投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群、中程度投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群および高投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群はすべて、連続２８日の経口投与後、血中グルコースレベルを減少させる傾向を有し、特に、血中グルコースレベルを減少させる最良の傾向は、低投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群および高投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群の両方で示されることが立証された。高用量のみが、非処置群に比較して、有意な改善を示す。

【0083】

Ｉ．Ｐ．インスリン耐性試験（ＩＰＩＴＴ）のため、マウスにインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ Ｒ Ｕ－５００，Ｌｉｌｌｙ）０．７５Ｕ／ｋｇ体重を、５時間の絶食後に注射し、０分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、および１８０分後の時点で血糖測定器でグルコース濃度を決定した。結果を図１２に示し、ここで、低投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群、中程度投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群および高投薬量ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ群はすべて、連続２８日の経口投与後、血中グルコースレベルを減少させる傾向を有することが立証された。この傾向は、インスリン感度を改善する有意な改善を立証し、用量依存性反応を示す。

【0084】

連続２８日のＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ処置後、動物モデルの心臓から血液を抜き取り、次いで、２０００ｘｇで１５分間、室温で遠心分離して、全血から血清を分離し、富士フイルムＤＲＩ－ＣＨＥＭ ＮＸ５００ｉデバイスを用いることによって、動物の血液において、肝機能指数（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ））および腎機能指数（クレアチニン（ＣＲＥ）、尿素窒素（ＢＵＮ））を試験した。結果を図１３に示す。ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨは、肝臓または腎臓において毒性を示さなかった。

【0085】

肝臓保護に関する効果の評価

【0086】

動物に関するすべての実験は、長庚大学ＩＡＣＵＣガイドラインに準拠した。

【0087】

実験法は、台湾衛生福利部（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｗｅｌｆａｒｅ ｏｆ Ｔａｉｗａｎ）の健康食品の肝臓保護およびヘルスケア有効性の評価法（２０１６年４月２５日の衛生署（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の食品特性公示（Ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔ Ｆｏｏｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ）第１０３１３０４０６３号の改訂版）に準拠して設計された。

【0088】

まず、ＣＣｌ_４溶液およびＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ懸濁物を調製した。ラットにおいて肝線維症を誘導するため、ＣＣｌ_４を４０％濃度でコーン油に溶解した。ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ抽出物を、１％Ｔｗｅｅｎ８０＋９９体積％の０．５％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）で構成される混合溶液中に溶解して、懸濁物を生成した。

【0089】

８～１０週齢の１０匹のＳＤ雄ラットをＬａｓｃｏから得て、以下の群にランダムに分けた：ビヒクル群（１％Ｔｗｅｅｎ８０＋９９体積％の０．５％ＣＭＣ、ＣＣｌ_４誘導なし；ｎ＝３）、ＣＣｌ_４対照（ｎ＝３）、ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ １ｍｇ／ｋｇ－ＢＷ（ｋｇ体重）（ｎ＝２）、およびＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ １０ｍｇ／ｋｇ－ＢＷ（ｎ＝２）。

【0090】

それぞれの処置にしたがってまたは１％Ｔｗｅｅｎ８０＋９９体積％の０．５％ＣＭＣ（ビヒクル群）を毎日１週間経口投与した後、４０％ＣＣｌ_４によって肝線維症を誘導し、次いで、同じ投与ステップを８週間維持した。週２回、全部で８週間の期間、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射を通じて、動物に肝線維症を誘導した。肝線維症を誘導する日、ＣＣｌ_４の腹腔内注射の１時間後に動物に投与した。

【0091】

ＧＯＴ、ＧＰＴ、アルブミン、トリグリセリド、およびコレステロールの生化学分析のため、第０週、１週、２週、４週、７週、８週および９週に血液試料を収集した。９週の終わりに、すべてのラットを人道的に屠殺し；血液、肝臓、腎臓、および脾臓試料を採取した。実験のタイムラインを図１４に示す。

【0092】

第７週の血液生化学分析、血液生化学分析の週ごとの変化およびラット体重追跡の結果を図１５～１７に示す。

【0093】

第７週の血液生化学分析の結果（図１５）および血液生化学分析の週ごとの変化の結果（図１６）は、低用量（１ｍｇ／ｋｇ－ＢＷ）および高用量（１０ｍｇ／ｋｇ－ＢＷ）のＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨがどちらも、血清ＧＯＴおよびＧＰＴレベルを顕著に減少させることを示し、これはＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨが肝臓保護の潜在能力を有することを示した。ラットの体重追跡の結果（図１７）は、本発明のＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨが、ラットに副作用を引き起こさないことを示した。

【0094】

以前の研究は、オンシジウム植物の一種のオンシジウム・ソトアヌム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｓｏｔｏａｎｕｍ）が、肝臓保護または糖尿病の改善に効果を有するクリシン（５，７ジヒドロキシフラボン）を含むことを示した。したがって、本発明は本発明のオンシジウム植物抽出物がクリシンを含むかどうかを分析した。興味深いことに、本発明のオンシジウム植物抽出物中にはクリシンの化学的シグナルはまったく検出されなかった（データ未提示）。

【0095】

別の実験において、Ｄ－ＧａｌＮ（Ｄ－ガラクトサミン）およびＬＰＳの組み合わせ処置が、マウスにおいて急性肝臓傷害（ＡＬＩ）を誘導した。

【0096】

雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３群（６～８匹のマウス／群）にランダムに分けた：ビヒクルのみ（ＤＭＳＯ、ＬＰＳ＋Ｄ－ＧａｌＮを含まず、ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを含まない）、ＬＰＳ＋Ｄ－ＧａｌＮ対照（ＬＰＳ、４０μｇ／ｍＬ；Ｄ－ガラクトサミン、５００ｍｇ／ｋｇ、ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを含まない）、ＬＰＳ＋Ｄ－ＧａｌＮ＋ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ抽出物（２５ｍｇ／ｋｇ体重）群。各マウスに１０％ＤＭＳＯまたはＬＰＳ＋Ｄ－ＧａｌＮを１時間腹腔内注射した後、対応する群に、さらに５時間、ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ抽出物を静脈内注射した。血液試料を収集し、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、および尿素窒素（ＢＵＮ）のレベルに関して分析した。

【0097】

結果は、血清中のＧＯＴ、ＧＰＴ、ＣＲＥ、およびＢＵＮのレベル上昇によって立証されるように、Ｄ－ＧａｌＮ／ＬＰＳが重大な肝臓組織損傷を引き起こすことを示した。しかし、オンシジウム植物抽出物での処置は、ＧＯＴおよびＧＰＴのレベル上昇を有効に減少させた（図１８）。

【0098】

急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を防止するための効果の評価

【0099】

動物に対するすべての実験は、長庚大学ＩＡＣＵＣガイドラインに準拠した。

【0100】

１５匹の７～１０週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウスを選択し、以下の群にランダムに分けた：陰性対照群（非処置、非誘導；ｎ＝３）、リポ多糖（ＬＰＳ）誘導対照（非処置、ＬＰＳによるＡＲＤＳ誘導；ｎ＝３）、低投薬量群（５ｍｇ／ｋｇ体重のＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを投与、ＬＰＳによるＡＲＤＳ誘導；ｎ＝３）、中程度投薬量群（１０ｍｇ／ｋｇ体重のＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを投与、ＬＰＳによるＡＲＤＳ誘導；ｎ＝３）、および高投薬量群（２０ｍｇ／ｋｇ体重のＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨを投与、ＬＰＳによるＡＲＤＳ誘導；ｎ＝３）。

【0101】

図１９に示されるように、実験開始時、陰性対照群およびＬＰＳ対照群を除いて、すべての実験動物にはまず、それぞれ、群にしたがって、本発明のＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨの静脈内注射（Ｉ．Ｖ．）を与えた。ＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ投与の１時間後、肺投与噴霧器（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｙｕｙａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄより購入）を用い、陰性対照群を除くすべての実験動物に５ｍｇ／ｋｇ体重のＬＰＳを投与し、マウスにおいてＡＲＤＳを誘導した。すべての実験動物をＡＲＤＳ誘導の２４時間後に安楽死させ、血液を収集し、遠心分離し、続く生化学値検出のため、上清を採取し、２１ｃｍ Ｈ_２Ｏカラム圧下で肺を収集し、このうち半分をヘマトキシリン－エオジン（Ｈ＆Ｅ）組織切片染色分析のために用い、もう半分を後に使用するために－８０℃で凍結した。

【0102】

結果を図２０および２１に示し、肺組織切片の染色は、本発明のＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨ投与がＡＲＤＳの発生を有効に防止するか、またはＡＲＤＳの度合いを軽減することが可能であり、これが用量依存性であることを示した。
血液分析結果はまた、本発明のＯＲＣ００１Ｒ－Ｕ－ＥｔＯＨが実験動物の肝臓および腎臓に明らかな害を示さなかったことも示す。

【0103】

本発明は、当業者がこれを行い使用するために十分に詳細に記載され例示されてきているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多様な代替物、修飾および改善が明らかであるはずである。

【0104】

当業者は、本発明が目的を実行し、言及されるとともに内在性である目標および利点を得るためによく適応されることを容易に認識する。これらを産生するための細胞、動物、ならびにプロセスおよび方法は、好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定とは意図されない。その修飾および他の使用が当業者には思い浮かぶであろう。これらの修飾は、本発明の精神内に含まれ、特許請求の範囲によって定義される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【外国語明細書】