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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025020219
(43)【公開日】2025-02-12
(54)【発明の名称】改良されたコロナウイルスワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/215 20060101AFI20250204BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20250204BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250204BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20250204BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20250204BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20250204BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20250204BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20250204BHJP
【ＦＩ】
A61K39/215 ZNA
A61P31/14
A61P37/04
A61K39/39
C07K14/165
A61K39/215
C12N15/09 Z
C12N15/50
C12N5/0783
【審査請求】有
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024188812
(22)【出願日】2024-10-28
(62)【分割の表示】P 2023502656の分割
【原出願日】2022-04-12
(31)【優先権主張番号】63/173,752
(32)【優先日】2021-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/190,199
(32)【優先日】2021-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】596118493
【氏名又は名称】アカデミア シニカ
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ｓｅｃ ２，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ １１５２９ ＴＷ
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウォン，チー－ヒューイ
(72)【発明者】
【氏名】マー，チェー
(72)【発明者】
【氏名】ホアン，ハン－イー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】新型コロナウイルス感染症をより良好に予防及び処置するための改良された免疫原、ワクチン、及び方法を提供する。
【解決手段】本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びそのバリアントの天然スパイクタンパク質と比較して免疫応答の増強を誘発することができる、糖鎖改変型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を提供する。糖鎖改変型スパイクタンパク質は、グリコシル化部位を露出すると同時に、スパイクタンパク質の三次構造を保持する。
【選択図】図１－１
【解決手段】本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びそのバリアントの天然スパイクタンパク質と比較して免疫応答の増強を誘発することができる、糖鎖改変型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を提供する。糖鎖改変型スパイクタンパク質は、グリコシル化部位を露出すると同時に、スパイクタンパク質の三次構造を保持する。
【選択図】図１－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の短縮型Ｎ－グリカン及び１つ以上の未改変Ｏ－グリカンを含む糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質を含む免疫原であって、糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアント、又はその免疫学的に活性な断片からなる、免疫原。
【請求項2】
複数の短縮型Ｎ－グリカンが単糖である、請求項１に記載の免疫原。
【請求項3】
単糖がＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）である、請求項２に記載の免疫原。
【請求項4】
複数の短縮型Ｎ－グリカンが受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に位置しており、それによって、ＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬ（配列番号４１）、ＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲ（配列番号４２）、ＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫ（配列番号４３）、ＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮ（配列番号４４）、ＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴ（配列番号４５）、ＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧ（配列番号４６）及び／又はＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有する複数の高度に保存されたエピトープが露出される、請求項１に記載の免疫原。
【請求項5】
複数の短縮型Ｎ－グリカンが、ヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ドメインに位置しており、それによって、ＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹ（配列番号４８）、ＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳ（配列番号４９）、ＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡ（配列番号５０）、ＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱ（配列番号５１）及び／又はＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰ（配列番号５２）のアミノ酸配列を有する複数の高度に保存されたエピトープが露出される、請求項１に記載の免疫原。
【請求項6】
糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質が、インビトロでの糖鎖改変により天然コロナウイルススパイクタンパク質から誘導される、請求項１に記載の免疫原。
【請求項7】
天然コロナウイルススパイクタンパク質が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲ－ＣｏＶ－２）又はそのバリアントのスパイクタンパク質である、請求項６に記載の免疫原。
【請求項8】
バリアントが、Ｄ６１４Ｇ、アルファ（Ｂ．１．１．７及びＱ系列）、ベータ（Ｂ．１．３５１及び子孫系列）、ガンマ（Ｐ．１及び子孫系列）、イプシロン（Ｂ．１．４２７及びＢ．１．４２９）、イータ（Ｂ．１．５２５）、イオタ（Ｂ．１．５２６）、カッパ（Ｂ．１．６１７．１）、１．６１７．３、ミュー（Ｂ．１．６２１、Ｂ．１．６２１．１）、ゼータ（Ｐ．２）、デルタ（Ｂ．１．６１７．２及びＡＹ系列）、並びにオミクロン（Ｂ．１．１．５２９及びＢＡ系列）からなる群から選択される、請求項７に記載の免疫原。
【請求項9】
糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質が三量体として存在する、請求項１に記載の免疫原。
【請求項10】
糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質が、天然コロナウイルススパイクタンパク質と同じ三次構造を保持している、請求項６に記載の免疫原。
【請求項11】
糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質が、天然コロナウイルススパイクタンパク質と比較して免疫応答の増強を誘発することができる、請求項４に記載の免疫原。
【請求項12】
免疫応答の増強が、ＩｇＧ力価の増加、ＩｇＭ力価の増加、中和力価の増加、ＣＤ４ Ｔ細胞応答の増加、ＣＤ８ Ｔ細胞応答の増加、又はそれらの組合せである、請求項１１に記載の免疫原。
【請求項13】
糖鎖改変型スパイクタンパク質が、化学的方法又は酵素的方法の１つ以上を使用して生成される、請求項６に記載の免疫原。
【請求項14】
糖鎖改変型スパイクタンパク質が、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）を使用して生成される、請求項１３に記載の免疫原。
【請求項15】
糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、ポリペプチドが、ＧｌｃＮＡｃ部分をそれぞれ有する２２個の短縮型Ｎ－グリカンからなる、請求項１に記載の免疫原。
【請求項16】
糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、ポリペプチドが、ＧｌｃＮＡｃ部分をそれぞれ有する２１個の短縮型Ｎ－グリカンからなる、請求項１に記載の免疫原。
【請求項17】
（ａ）請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫原、及び（ｂ）任意選択的にアジュバントを含む、免疫原性組成物。
【請求項18】
アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、スクアレン、ミョウバン、アルヒドロゲル、ＭＦ５９、ＱＳ－２１、ＣｐＧ １０１８、ＡＳ０３、ＡＳ３７、Ｍａｔｒｉｘ－Ｍ、又はそれらの組合せである、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項19】
天然コロナウイルススパイクタンパク質を使用するワクチンと比較して免疫応答の増強を誘発することができる改良されたコロナウイルスワクチンである、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項20】
コロナウイルスがＳＡＲ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントである、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項21】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫応答を必要とする対象において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘発する方法であって、対象に有効量の請求項１７又は１８に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【請求項22】
免疫応答がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントに対する中和抗体の産生を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
バリアントが、Ｄ６１４Ｇ、アルファ（Ｂ．１．１．７及びＱ系列）、ベータ（Ｂ．１．３５１及び子孫系列）、ガンマ（Ｐ．１及び子孫系列）、イプシロン（Ｂ．１．４２７及びＢ．１．４２９）、イータ（Ｂ．１．５２５）、イオタ（Ｂ．１．５２６）、カッパ（Ｂ．１．６１７．１）、１．６１７．３、ミュー（Ｂ．１．６２１、Ｂ．１．６２１．１）、ゼータ（Ｐ．２）、デルタ（Ｂ．１．６１７．２及びＡＹ系列）、並びにオミクロン（Ｂ．１．１．５２９及びＢＡ系列）からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントに対する免疫応答を必要とする対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントに対する免疫応答を誘発するための請求項１７又は１８に記載の免疫原性組成物の使用であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントに対する免疫応答を必要とする対象に有効量の免疫原性組成物を投与することを含む、使用。
【請求項25】
免疫応答がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントに対する中和抗体の産生を含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項26】
バリアントが、Ｄ６１４Ｇ、アルファ（Ｂ．１．１．７及びＱ系列）、ベータ（Ｂ．１．３５１及び子孫系列）、ガンマ（Ｐ．１及び子孫系列）、イプシロン（Ｂ．１．４２７及びＢ．１．４２９）、イータ（Ｂ．１．５２５）、イオタ（Ｂ．１．５２６）、カッパ（Ｂ．１．６１７．１）、１．６１７．３、ミュー（Ｂ．１．６２１、Ｂ．１．６２１．１）、ゼータ（Ｐ．２）、デルタ（Ｂ．１．６１７．２及びＡＹ系列）、並びにオミクロン（Ｂ．１．１．５２９及びＢＡ系列）からなる群から選択される、請求項２５に記載の使用。
【請求項27】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントによる感染からの防御を必要とする対象を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントによる感染から防御するための請求項１７又は１８に記載の免疫原性組成物の使用であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントによる感染からの防御を必要とする対象に有効量の免疫原性組成物を投与することを含む、使用。
【請求項28】
ＣＯＶＩＤ－１９疾患への罹患の予防を必要とする対象者がＣＯＶＩＤ－１９疾患に罹患するのを予防するための請求項１７又は１８に記載の免疫原性組成物の使用であって、ＣＯＶＩＤ－１９疾患への罹患の予防を必要とする対象者に有効量の免疫原性組成物を投与することを含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年４月１２日に出願した米国仮出願第６３／１７３，７５２号、及び２０２１年５月１８日に出願した米国仮出願第６３／６３／１９０，１９９号に対する優先権及び利益を主張するものである。
【背景技術】
【0002】
Ｃｏｖｉｄ－１９の発生は、２０１９年１２月に最初の症例が報告されて以来、世界中で３００万人以上の死者をもたらしている。現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対するいくつかのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが臨床試験段階で開発されており、一部のワクチンは、ヒトへの使用が承認されている。多くの認可されたワクチンが高い有効性を示したが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子バリアントが出現し、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックを通して世界中に流行している。
【0003】
したがって、新型コロナウイルス感染症のより良好な予防、及び／又は生命を脅かすコロナウイルス感染症の重症度の軽減のための改良されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
（本開示の要旨）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、広範にグリコシル化されている。本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントの天然スパイクタンパク質と比較して、グリカンシールドを欠いている又はグリカンによるシールドが少ない改変型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質による免疫化が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び懸念されるバリアント（例えば、アルファ、ガンマ、デルタ及びオミクロン）に対する免疫応答の増強を誘発するという認識に基づいている。受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ドメインを含むサブユニット２（Ｓ２）とに位置する１２個の高度に保存されたエピトープ（配列番号１～１２）は、ＧＩＳＡＩＤからの６００万を超えるＳタンパク質配列のアラインメントに基づき同定された。Ｎ－グリカントリミング（Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ｔｒｉｍｍｉｎｇ）によってグリカンシールドを除去してこれらの高度に保存されたエピトープをより良好に露出させることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びバリアントに対する広範な防御ワクチンを開発するための効果的なアプローチを提供する。スパイクタンパク質のＮ－グリカントリミングは、インビトロでの糖鎖改変操作によって達成することができる。これによって、糖鎖改変型スパイクタンパク質は、グリカンによりシールドされた高度に保存されたエピトープを露出すると同時に、スパイクタンパク質の三次構造を保持する。したがって、本開示は、新型コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症をより良好に予防及び処置するための改良された免疫原、ワクチン、及び方法を提供する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、広範にグリコシル化されている。本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントの天然スパイクタンパク質と比較して、グリカンシールドを欠いている又はグリカンによるシールドが少ない改変型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質による免疫化が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び懸念されるバリアント（例えば、アルファ、ガンマ、デルタ及びオミクロン）に対する免疫応答の増強を誘発するという認識に基づいている。受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ドメインを含むサブユニット２（Ｓ２）とに位置する１２個の高度に保存されたエピトープ（配列番号１～１２）は、ＧＩＳＡＩＤからの６００万を超えるＳタンパク質配列のアラインメントに基づき同定された。Ｎ－グリカントリミング（Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ｔｒｉｍｍｉｎｇ）によってグリカンシールドを除去してこれらの高度に保存されたエピトープをより良好に露出させることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びバリアントに対する広範な防御ワクチンを開発するための効果的なアプローチを提供する。スパイクタンパク質のＮ－グリカントリミングは、インビトロでの糖鎖改変操作によって達成することができる。これによって、糖鎖改変型スパイクタンパク質は、グリカンによりシールドされた高度に保存されたエピトープを露出すると同時に、スパイクタンパク質の三次構造を保持する。したがって、本開示は、新型コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症をより良好に予防及び処置するための改良された免疫原、ワクチン、及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0005】
したがって、本開示は、複数の短縮型Ｎ－グリカン及び未改変Ｏ－グリカン（例えば、Ｏ－結合型オリゴ糖）を含む糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質を含む免疫原を提供する。一部の実施形態では、複数の短縮型Ｎ－グリカンは、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に位置しており、それにより、ＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬ（配列番号４１）、ＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲ（配列番号４２）、ＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫ（配列番号４３）、ＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮ（配列番号４４）、ＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴ（配列番号４５）、ＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧ（配列番号４６）及び／又はＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有する複数の高度に保存されたエピトープが露出される。一部の実施形態では、複数の短縮型Ｎ－グリカンは、ヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ドメインに位置しており、それによって、ＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹ（配列番号４８）、ＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳ（配列番号４９）、ＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡ（配列番号５０）、ＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱ（配列番号５１）及び／又はＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰ（配列番号５２）のアミノ酸配列を有する複数の高度に保存されたエピトープが露出される。
【0006】
一部の実施形態では、複数の短縮型Ｎ－グリカンは、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）及びヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ドメインに位置しており、それによって、ＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬ（配列番号４１）、ＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲ（配列番号４２）、ＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫ（配列番号４３）、ＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮ（配列番号４４）、ＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴ（配列番号４５）、ＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧ（配列番号４６）、ＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣ（配列番号４７）、ＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹ（配列番号４８）、ＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳ（配列番号４９）、ＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡ（配列番号５０）、ＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱ（配列番号５１）及び／又はＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰ（配列番号５２）のアミノ酸配列を有する複数の高度に保存されたエピトープが露出される。
【0007】
本明細書に記載の糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアント、又はアミノ酸配列若しくはバリアントの免疫学的に活性な断片を含む。
【0008】
一部の実施形態では、糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、ポリペプチドは、ＧｌｃＮＡｃ部分をそれぞれ有する２２個の短縮型Ｎ－グリカンからなる。
【0009】
一部の実施形態では、糖鎖改変型コロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、ポリペプチドは、ＧｌｃＮＡｃ部分をそれぞれ有する２１個の短縮型Ｎ－グリカンからなる。
【0010】
一部の実施形態では、短縮型Ｎ－グリカンは、単糖、二糖又は三糖である。一部の実施形態では、短縮型Ｎ－グリカンは単糖である。好ましい実施形態では、単糖はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）である。
【0011】
好ましい実施形態では、本明細書に記載の短縮型Ｎ－グリカンは、実質的に均質である。「均質」という用語は、１つの所望するグリカン種によって表されるグリコシル化パターンを意味することを意図する。本明細書で使用される「実質的に均質な」という用語は、組成物中に存在する糖タンパク質の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％が１つの所望するグリコフォーム（例えば、ＧｌｃＮＡｃ修飾）によって表され、微量の望ましくないグリコフォームが組成物中に存在することを意味することを意図する。「微量」とは、糖タンパク質組成物中に存在する任意の所与の望ましくないグリコフォームが、総糖タンパク質の５％未満、好ましくは４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、さらには０．５％未満、又はさらには０．１％未満で存在することを意図する。
【0012】
本明細書に記載されている場合、「スパイクタンパク質」及び「スパイク糖タンパク質」及び「コロナウイルススパイクタンパク質」という用語は、交換可能に使用される。本明細書に記載の糖鎖改変型スパイクタンパク質は、糖鎖改変操作（例えば、インビトロ又はインビボにおける糖鎖改変操作）によって、天然コロナウイルススパイクタンパク質から生成され得る。一部の実施形態では、糖鎖改変型スパイクタンパク質は、化学的方法又は酵素的方法の１つ以上を使用して生成される。一部の実施形態では、糖鎖改変型スパイクタンパク質は、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）を使用して生成される。
【0013】
一部の実施形態では、本明細書に記載の天然コロナウイルススパイクタンパク質は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲ－ＣｏＶ－２）又はそのバリアントのスパイクタンパク質である。本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の武漢株（ｈＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ／ＷＨ０１／２０１９）である。本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントには、限定するものではないが、Ｄ６１４Ｇ、アルファ（Ｂ．１．１．７及びＱ系列）、ベータ（Ｂ．１．３５１及び子孫系列）、ガンマ（Ｐ．１及び子孫系列）、イプシロン（Ｂ．１．４２７及びＢ．１．４２９）、イータ（Ｂ．１．５２５）、イオタ（Ｂ．１．５２６）、カッパ（Ｂ．１．６１７．１）、１．６１７．３、ミュー（Ｂ．１．６２１、Ｂ．１．６２１．１）、ゼータ（Ｐ．２）、デルタ（Ｂ．１．６１７．２及びＡＹ系列）、並びにオミクロン（Ｂ．１．１．５２９及びＢＡ系列）が含まれる。一部の実施形態では、天然コロナウイルススパイクタンパク質は、コウモリコロナウイルスＲａＴＧ１３又はそのバリアントのスパイクタンパク質である。
【0014】
本明細書に記載されている場合、「天然コロナウイルススパイクタンパク質」、「天然コロナウイルススパイク糖タンパク質」、「天然スパイク糖タンパク質」及び「天然スパイクタンパク質」という用語は、交換可能である。
【0015】
一部の実施形態では、本明細書に記載の糖鎖改変型スパイクタンパク質は、三量体（例えば、溶液中の三量体）として存在する。本明細書に記載の糖鎖改変型スパイクタンパク質は、その天然コロナウイルススパイクタンパク質と同じ三次構造を保持し得る。
【0016】
本明細書に記載されている場合、糖鎖改変型スパイクタンパク質は、その天然コロナウイルススパイクタンパク質と比較して免疫応答の増強を誘導することができる。免疫応答の増強は、ＩｇＧ力価の増加、ＩｇＭ力価の増加、ＣＤ４ Ｔ細胞応答の増加、ＣＤ８ Ｔ細胞応答の増加、中和力価の増加、又はそれらの組合せである。
【0017】
別の態様では、本発明は、（ａ）本開示の免疫原、及び（ｂ）任意選択的にアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。
【0018】
本明細書に記載されている場合、アジュバントには、限定するものではないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、スクアレン、ミョウバン、アルヒドロゲル、ＭＦ５９、ＱＳ－２１、ＣｐＧ １０１８、ＡＳ０３、ＡＳ３７、Ｍａｔｒｉｘ－Ｍ、又はそれらの組合せが含まれる。
【0019】
本明細書に記載のコロナウイルスにはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びそのバリアントが含まれる場合があり、コウモリコロナウイルスＲａＴＧ１３又はそのバリアントが含まれ得る。好ましい実施形態では、コロナウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びそのバリアントによって引き起こされる。
【0020】
本明細書に記載されている場合、免疫原性組成物は、その天然ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を使用するワクチンに比較して免疫応答の増強を誘発することができ、それによって、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントによって引き起こされるコロナウイルス感染症に対する改良されたＣＯＶＩＤー１９ワクチンとして機能する。
【0021】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象においてＳＡＲ－ＣｏＶ－２又はバリアントに対する免疫応答を誘発する方法であって、対象に有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0022】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象をＳＡＲ－ＣｏＶ－２又はバリアントによる感染から防御する方法であって、対象に有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0023】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象がＣＯＶＩＤ－１９疾患に罹患するのを予防する方法であって、対象に有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0024】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘発するための本発明の免疫原性組成物の使用を提供する。
【0025】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染から防御するための本発明の免疫原性組成物の使用を提供する。
【0026】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象がＣＯＶＩＤ－１９疾患に罹患するのを予防するための本発明の免疫原性組成物の使用を提供する。
【0027】
これら及び他の態様は、以下の図面と併せて得られる好ましい実施形態の以下の説明から明らかになるが、本開示の新規概念の趣旨及び範囲から逸脱することなく、変形及び改変がとられる場合がある。
【0028】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに示すために含まれており、その発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1-1】（ａ）～（ｂ）。モノ－ＧｌｃＮＡｃ－装飾（ＳＭＧ）タンパク質ワクチンによる糖鎖改変型スパイクタンパク質の設計及び特性評価。（ａ）組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質構築物の模式図。タンパク質ドメインは、Ｎ－末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）、ヘプタッドリピート２（ＨＲ２）、中央ヘリックス（ＣＨ）、及び連結ドメイン（ＣＤ）として図示されている。可溶性スパイクタンパク質のＣ末端は、配列上のフォールドとＨｉｓタグ（Ｈｉｓ６）に結合されている。フリン切断部位はＧＳＡＧ（配列番号９）残基で置換され、２つのプロリン変異（Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ）はスパイクタンパク質を融合前状態で固定する。Ｎ－結合グリコシル化シークオン（Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ、式中、Ｘ≠Ｐ）の位置は、分岐として示す（Ｎ、Ａｓｎ；Ｘ、任意の残基；Ｓ、Ｓｅｒ；Ｔ、Ｔｈｒ；Ｐ、Ｐｒｏ）。ポンド記号の部位はトロンビン切断部位を示す。（ｂ）モノ－ＧｌｃＮＡｃで装飾したスパイクワクチン生産の概略図。ＳＨＭ、高マンノース型Ｎ－グリカンを含むスパイク。ＳＭＧ、Ｎ－グリコシル化部位にＧｌｃＮＡｃを有するスパイク。
【図1-2】（ｃ）。モノ－ＧｌｃＮＡｃ－装飾（ＳＭＧ）タンパク質ワクチンによる糖鎖改変型スパイクタンパク質の設計及び特性評価。（ｃ）精製したＳＭＧのサイズ排除クロマトグラフィー。黒色の曲線はＳＭＧを表し、灰色の曲線はタンパク質分子量マーカーを示す。
【図1-3】（ｄ）～（ｅ）。モノ－ＧｌｃＮＡｃ－装飾（ＳＭＧ）タンパク質ワクチンによる糖鎖改変型スパイクタンパク質の設計及び特性評価。（ｄ）ＳＦＧ（典型的な複合型Ｎ－グリカンを含むスパイク）、ＳＨＭ及びＳＭＧのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（ｅ）ＳＭＧの構造モデル。モデルは、プログラムＣｈｉｍｅｒａＸで表示されるＷｉｎｃｏｏｔｍａｎｄを使用してグリカンを付加することによってＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）ＩＤコード７ＣＮ９で作成した。
【図1-4】（ｆ）。モノ－ＧｌｃＮＡｃ－装飾（ＳＭＧ）タンパク質ワクチンによる糖鎖改変型スパイクタンパク質の設計及び特性評価。（ｆ）ＳＦＧ及びＳＭＧのＮ－グリカン組成の質量分析。
【図2-1】（Ａ）～（Ｃ）。ＳＭＧワクチン接種は、インビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御の増強を提供する。（Ａ）シリアンハムスターの免疫スケジュールを示す。ＳＦＧ（青色）、ＳＭＧ（赤色）、及び対照（灰色）。（Ｂ）体重変化をＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原負荷後のシリアンハムスターにおいて測定した。（Ｃ）抗原負荷されたハムスターの肺ウイルス力価を示す。破線は検出の下限を示す。
【図2-2】（Ｄ）。ＳＭＧワクチン接種は、インビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御の増強を提供する。（Ｄ）代表的な画像は、感染したハムスターの肺の組織病理学、免疫組織化学、及び免疫蛍光（３ｄｐｉ）を示す。１列目：ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色；スケールバー、５０μｍ。２列目：免疫組織化学（ＩＨＣ）染色；スケールバー、５０μｍ。３列目：免疫蛍光（ＩＦ）染色；スケールバー、１００μｍ。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ特異的ポリクローナル抗体は、ＩＨＣでは茶色の点及びＩＦ染色では緑色の点としてウイルス検出に使用された。青色：４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）。
【図2-3】（Ｅ）。ＳＭＧワクチン接種は、インビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御の増強を提供する。（Ｅ）ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２又はＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの免疫スケジュールを示す。
【図2-4】（Ｆ）～（Ｉ）。ＳＭＧワクチン接種は、インビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御の増強を提供する。（Ｆ）～（Ｉ）抗Ｓ ＩｇＧ力価（Ｆ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＴマイクロ中和力価（Ｇ）、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ（Ｈ）、及びＩｇＧ２ｃ：ＩｇＧ１比（Ｉ）を含むサブタイプＩｇＧ分析を、免疫したＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ｎ＝７）から採取した血清試料について示す。
【図2-5】（Ｊ）。ＳＭＧワクチン接種は、インビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御の増強を提供する。（Ｊ）感染したマウスの肺の代表的な組織病理学、免疫組織化学、及び免疫蛍光（７ｄｐｉ）を示す。スケールバーは、（Ｄ）と同じである。
【図2-6】（Ｋ）～（Ｍ）。（Ｋ）～（Ｍ）ＳＭＧワクチン接種は、インビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御の増強を提供する。（Ｋ）感染したＣＡＧ－ｈＡＣＥ２マウス（ｎ＝３）の肺ウイルス力価。破線は検出の下限を示す。（Ｌ）～（Ｍ）体重変化（Ｌ）及び生存分析（Ｍ）をＷＴ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で抗原負荷したＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ｎ＝４）について示す。
【図2-7】（Ｎ）～（Ｏ）。ＳＭＧワクチン接種は、インビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御の増強を提供する。（Ｎ）～（Ｏ）体重変化（Ｎ）及び生存分析（Ｏ）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファバリアントで抗原負荷したＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ｎ＝５）について示す。
【図2-8】（Ｐ）～（Ｑ）。ＳＭＧワクチン接種は、インビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御の増強を提供する。（Ｐ）～（Ｑ）体重変化（Ｐ）及び生存分析（Ｑ）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ガンマバリアントで抗原負荷したＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ｎ＝５）について示す。
【図2-9】（Ｒ）～（Ｓ）。ＳＭＧワクチン接種は、インビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する防御の増強を提供する。（Ｒ）～（Ｓ）体重変化（Ｒ）及び生存分析（Ｓ）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタバリアントで抗原負荷したＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ｎ＝４）について示す。データは平均値±ＳＥＭとして示し、２つの実験群を比較するために両側マン・ホイットニーＵ検定によって分析する。ｎｓ、有意でない；＊Ｐ＜０．０５。
【図3-1】（ａ）。ＳＭＧワクチン接種は、トランスジェニックｈＡＣＥ２マウスにおける致死量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するより良好な防御を提供する。（ａ）トランスジェニックマウスの免疫及び抗原負荷のスケジュール。
【図3-2】（ｂ）～（ｃ）。ＳＭＧワクチン接種は、トランスジェニックｈＡＣＥ２マウスにおける致死量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するより良好な防御を提供する。（ｂ）最初のワクチン接種後２８日目及び４２日目に採取した血清を抗スパイク特異的ＩｇＧについて検査した。（ｃ）最初のワクチン接種後４２日目に採取した血清を、ＣＰＥアッセイによる中和抗体力価について検査した。
【図3-3】（ｄ）～（ｅ）。ＳＭＧワクチン接種は、トランスジェニックｈＡＣＥ２マウスにおける致死量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するより良好な防御を提供する。（ｄ）抗原負荷後のトランスジェニックマウスの体重変化。（ｎ＝３）。（ｅ）抗原負荷後のトランスジェニックマウスの生存率。（ｎ＝３）。 データは、平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）である。比較は、スチューデントｔ検定（対応なし、両側）により実施した。ＳＦＧワクチンに対するＳＭＧによって誘発された抗体の結合及び中和倍率の増加は、棒の上に数字で示す。青色の四角形、ＳＦＧで免疫したトランスジェニックマウス；赤色の三角形、ＳＭＧで免疫したトランスジェニックマウス；灰色の点、対照群の動物（ミョウバンのみの群）。
【図4-1】（ａ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する結合及び中和の幅及び効力を増強するためにマウスにおいてＳＭＧワクチンによって誘導された抗体。（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質構造の模式図及びこの研究において使用したバリアントの変異ランドスケープを示す。ＲＢＤ、受容体結合ドメイン。変異マップにおいて、ドット（．）は野生型とその位置のアミノ酸が同じであることを示し、ダッシュ（－）は欠失を示す。
【図4-2】（ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する結合及び中和の幅及び効力を増強するためにマウスにおいてＳＭＧワクチンによって誘導された抗体。（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。ＳＦＧワクチンに対するＳＭＧにより誘発された抗体の結合倍率の増加は、棒上に数字により示す。
【図4-3】（ｃ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する結合及び中和の幅及び効力を増強するためにマウスにおいてＳＭＧワクチンによって誘導された抗体。（ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントシュードウイルス中和曲線を示す。
【図4-4】（ｄ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する結合及び中和の幅及び効力を増強するためにマウスにおいてＳＭＧワクチンによって誘導された抗体。（ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの５０％シュードウイルス中和（ｐＮＴ５０）を達成する力価がプロットされている。ＳＦＧワクチンに対するＳＭＧにより誘発された抗体の中和倍率の増加は、棒上に数字により示す。
【図4-5】（ｅ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する結合及び中和の幅及び効力を増強するためにマウスにおいてＳＭＧワクチンによって誘導された抗体。（ｅ）プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）により決定した感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの中和曲線を示す。
【図4-6】（ｆ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する結合及び中和の幅及び効力を増強するためにマウスにおいてＳＭＧワクチンによって誘導された抗体。（ｆ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの５０％中和（ＰＲＮＴ５０）を達成する力価がプロットされている。 データは平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）である。曲線はＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ９．０を使用した非線形回帰によりフィッティングされ、比較は複数のｔ検定（対応なし、両側）により実施した。力価の比較は、スチューデントｔ検定（対応なし、両側）により実施した。ＳＦＧワクチンに対するＳＭＧにより誘発された抗体の中和倍率の増加は、棒上に数字で示す。青色の四角形、ＳＦＧで免疫したトランスジェニックマウス；赤色の三角形、ＳＭＧで免疫したトランスジェニックマウス；灰色の点、対照群の動物（ＰＢＳ群）。
【図5-1】（Ａ）～（Ｂ）。Ｓタンパク質グリコシル化は、ＡＣＥ２受容体結合及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に影響を及ぼす。（Ａ）～（Ｂ）ＡＣＥ２の結合活性を、Ｅｎｄｏ Ｈ消化有り又は無し（Ｃ）のＢＥＡＳ－２Ｂ（Ａ）、ＨＥＫ２９３Ｔ（Ｂ）、及びＨＥＫ２９３Ｓ（ＧｎＴＩ－）細胞からの異なるグリコシル化Ｓタンパク質エクトドメインについて測定した（ＳＦＧ；元の完全グリコシル化、青色；ｄｅＳ、非シアリル化、水色；ＳＨＭ、高マンノース、黄色；ＳＭＧ、モノ－ＧｌｃＮＡｃ修飾、赤色）。３つの技術的反復実験のデータを平均値±ＳＤとして示し、曲線はＥＣ５０値の非線形回帰によりフィッティングさせる。
【図5-2】（Ｃ）～（Ｄ）。Ｓタンパク質グリコシル化は、ＡＣＥ２受容体結合及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に影響を及ぼす。ＡＣＥ２の結合活性を、Ｅｎｄｏ Ｈ消化有り又は無し（Ｃ）のＢＥＡＳ－２Ｂ（Ａ）、ＨＥＫ２９３Ｔ（Ｂ）、及びＨＥＫ２９３Ｓ（ＧｎＴＩ－）細胞からの異なるグリコシル化Ｓタンパク質エクトドメインについて測定した（ＳＦＧ；元の完全グリコシル化、青色；ｄｅＳ、非シアリル化、水色；ＳＨＭ、高マンノース、黄色；ＳＭＧ、モノ－ＧｌｃＮＡｃ修飾、赤色）。３つの技術的反復実験のデータを平均値±ＳＤとして示し、曲線はＥＣ５０値の非線形回帰によりフィッティングさせる。（Ｄ）異なるグリコシル化Ｓタンパク質を持つシュードウイルスについて、（Ｃ）と同様に色付けした同じ投入量（ｐ２４相当量の０．３μｇ／ｍｌ）でウイルス感染力を測定した。ＲＬＵ、相対発光単位。６つの技術的反復実験のデータを平均±ＳＤとして示し、通常の一方向ＡＮＯＶＡテストとそれに続くＴｕｋｅｙ多重比較テストにより分析した。ｎｓ、有意でない；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図5-3】（Ｅ）。Ｓタンパク質グリコシル化は、ＡＣＥ２受容体結合及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に影響を及ぼす。（Ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質［野生型（ＷＴ）］の模式図を、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ；１４～３０６；オレンジ色）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ；３１９～５４１；赤色）、２つのサブドメイン（ＳＤ１／２；５４２～６８５；黄色）、融合ペプチド近位領域（ＦＰＰＲ；８１６～８５６；緑色）、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１；９１２～９８４；青緑色）、連結ドメイン（ＣＤ；１０６３～１１６２；青色）、ヘプタッドリピート２（ＨＲ２；１１６３～１２１１；紫色）、及び膜貫通ドメイン（ＴＭ；１２１４～１２３４；白色）を含むドメインにより色付けして示した。Ｎ－グリカン（枝として描かれている）及びＯ－グリカン（円）の部位には、残基番号が付けられている。Ｓ１ドメイン及びＳ２ドメインは上に示されている。
【図5-4】（Ｆ）～（Ｇ）。Ｓタンパク質グリコシル化は、ＡＣＥ２受容体結合及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に影響を及ぼす。（Ｆ）ＷＴ Ｓタンパク質又は示した各グリコサイトでグリカンが除去された変異体を持つシュードウイルスについてウイルス力価を示し、ｐ２４定量により正規化し、（Ｅ）に従い色付けする。（Ｇ）５つのｈＡＣＥ２発現細胞株で試験した（Ｆ）と同じシュードウイルスのパネルの感染力。（Ｆ）及び（Ｇ）の値は、ＷＴ値（１００％として定義、濃い灰色で色付け）に対して、３つの独立した実験の平均±ＳＤにより正規化されている。
【図6-1】（Ａ）。Ｓタンパク質グリカンのプロファイルは２つの細胞株における差異を示しており、配列保存と相関している。（Ａ）ＢＥＡＳ－２Ｂ肺上皮細胞から発現された組換えＳタンパク質のＮ－グリコシル化のプロファイルの比較を示す。グリカンはグループ化され、以下に応じて色付けされている：複合体－Ｓ（シアリル化複合体タイプ；濃紺色）、複合体（非シアリル化複合体タイプ；水色）、ハイブリッド－Ｓ（シアリル化ハイブリッドタイプ；濃い黄色）、及びハイブリッド（非シアリル化ハイブリッドタイプ；明るい黄色）、高マンノース（緑色）、及び非占有（灰色）。各グリコサイトについての各グループのパーゼンテージを円グラフで示し、各グリコフォーム（番号１～２７）の割合を棒グラフで示す。棒グラフは、３つの生物学的反復実験の平均±ＳＤを示す。ハイブリッドは、フコシル化ハイブリッド型糖鎖を示す。
【図6-2】（Ｂ）。Ｓタンパク質グリカンのプロファイルは２つの細胞株における差異を示しており、配列保存と相関している。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ腎臓上皮細胞から発現された組換えＳタンパク質のＮ－グリコシル化のプロファイルの比較を示す。グリカンはグループ化され、以下に応じて色付けされている：複合体－Ｓ（シアリル化複合体タイプ；濃紺色）、複合体（非シアリル化複合体タイプ；水色）、ハイブリッド－Ｓ（シアリル化ハイブリッドタイプ；濃い黄色）、及びハイブリッド（非シアリル化ハイブリッドタイプ；明るい黄色）、高マンノース（緑色）、及び非占有（灰色）。各グリコサイトについての各グループのパーゼンテージを円グラフで示し、各グリコフォーム（番号１～２７）の割合を棒グラフで示す。棒グラフは、３つの生物学的反復実験の平均±ＳＤを示す。ハイブリッドは、フコシル化ハイブリッド型糖鎖を示す。
【図6-3】（Ｃ）。Ｓタンパク質グリカンのプロファイルは２つの細胞株における差異を示しており、配列保存と相関している。（Ａ）及び（Ｂ）からのグリカンのプロファイルを、Ｓ外部ドメインの３Ｄ構造にマッピングした（６ＶＳＢからモデル化）。グリカンは、表示されているように、ＢＥＡＳ－２Ｂ（左）又はＨＥＫ２９３Ｔ（右）のデータについて、最も豊富なグループにより色分けされている（複合型、青色；ハイブリッド型、黄色；高マンノース、緑色）。非複合型Ｎ－グリコサイトは、残基番号で表示されている。
【図6-4】（Ｄ）～（Ｅ）。Ｓタンパク質グリカンのプロファイルは２つの細胞株における差異を示しており、配列保存と相関している。（Ｄ）モデル化されたＳ構造タンパク質の相対表面アクセシビリティ（ＲＳＡ）のマッピングを示し、埋もれている残基は濃い黄色で色付けされ、シールドされたグリカンは黄色で色付けされ、露出されているものは明るい黄色で色付けされている。（Ｅ）モデル化されたＳタンパク質構造の配列バリアントのマッピングを示し、ヒートマップで色付けされており、濃い赤色は高い変異率を示す。いくつかの高度に保存されたグリカンシールド領域を強調表示している。（Ｄ）及び（Ｅ）に関する詳細については、図Ｓ９及びデータファイルＳ１で確認することができる。
【図7-1】（Ａ）～（Ｂ）。ＳＭＧワクチン接種は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳＦＧよりも強い体液性及び細胞性免疫応答を誘発する。（Ａ）ＳＦＧ及びＳＭＧタンパク質ワクチンの構造モデルを（図２Ｃに従って）示す。青色：グリカン；灰色：タンパク質。ＳＦＧは、さらに改変することなくＨＥＫ２９３Ｅにより発現された。ＳＭＧは、ＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ－によって発現されたＳＨＭのすべてのＮ－グリカンを単一ＧｌｃＮＡｃに切断する酵素消化により得られたが、Ｏ－グリカンは未改変であった。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫原として（Ａ）のようなタンパク質を使用した免疫化スケジュール（各実験においてｎ＝５）。ＳＦＧ（青色）、ＳＨＭ（黄色）、ＳＭＧ（赤色）、及び対照（灰色）。ミョウバン、水酸化アルミニウム。
【図7-2】（Ｃ）～（Ｇ）。ＳＭＧワクチン接種は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳＦＧよりも強い体液性及び細胞性免疫応答を誘発する。（Ｃ）血清試料の抗Ｓタンパク質ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより分析した。（Ｄ）血清試料の中和力価は、ＷＴ Ｓタンパク質を含むシュードウイルスを使用して測定した。（Ｅ）～（Ｇ）ＩｇＧ１（Ｅ）、ＩｇＧ２ａ（Ｆ）、及びＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１比（Ｇ）を含む、血清のＩｇＧ サブタイプ分析。
【図7-3】（Ｈ）～（Ｎ）。ＳＭＧワクチン接種は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳＦＧよりも強い体液性及び細胞性免疫応答を誘発する。（Ｈ）～（Ｋ）活性化非調節性ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｈ）でのＴｆｈのパーセンテージ、及びフローサイトメトリーによるＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節（ＬＮ）においてＩＦＮ－γ（Ｉ）発現、ＩＬ－４（Ｊ）発現、及びＩＬ－２１（Ｋ）発現Ｔｆｈ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ１９－ＣＤ４４ｈｉＦｏｘｐ３－ＰＤ－１＋ＣＸＣＲ５＋）のパーセンテージ。（Ｌ）フローサイトメトリーにより分析したＢＡＬＢ／ｃマウスのＬＮにおけるグランザイムＢ産生ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋Ｂ２２０－ＣＤ８＋ＣＤ４９ｂ－）のパーセンテージ。（Ｍ）脾臓におけるｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ（ＦＭＯ）対照染色（Ｓタンパク質なしで染色）（パーセンテージ）に対して正規化されたＳタンパク質特異的Ｂ細胞（ＣＤ３－ＣＤ１９＋Ｓタンパク質＋）の比率（パーセンテージ）を示す。（Ｎ）カッパ及びラムダ軽鎖使用を示す。
【図7-4】（Ｏ）～（Ｐ）。ＳＭＧワクチン接種は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳＦＧよりも強い体液性及び細胞性免疫応答を誘発する。（Ｏ）～（Ｐ）Ｂ細胞レパートリー分析の重鎖（Ｏ）及びカッパ鎖（Ｐ）分布。５％未満の使用は白色で示す。
【図7-5】（Ｑ）～（Ｓ）。ＳＭＧワクチン接種は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳＦＧよりも強い体液性及び細胞性免疫応答を誘発する。（Ｑ）～（Ｓ）抗Ｓタンパク質ＩｇＧ力価（Ｑ）、シュードウイルス中和力価（Ｒ）、及び真正ウイルス中和力価（Ｓ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＴ（又はＤ６１４Ｇ）及びバリアントに対する提示したワクチンを３回投与した後にＢＡＬＢ／ｃマウスから単離された血清について示す（各棒の上の数字は、ＳＦＧ群と比較したＳＭＧの増加の倍率を示す）。ｐＮＴ５０は、５０％中和を達成する逆数希釈を示す。棒グラフにおける点線は、検出下限を示す。データは平均値±ＳＥＭとして示し、２つの実験群を比較するために、両側マン・ホイットニーＵ検定により分析したが、ただし（Ｎ）では、５つの試料をともにプールし、カイ二乗検定を使用した。Ｐ値は各棒の上に示した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図8-1】（Ａ）～（Ｃ）。ＳＭＧワクチン接種によって誘発された抗体ｍ３１Ａ７の機能的、予防的、及び構造的特性決定は交差中和能力を示唆している。（Ａ）ｍ３１Ａ７のＳ１、Ｓ２、ＲＢＤ、又はＳ外部ドメイン全体へのＥＬＩＳＡ結合。（Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＴ及びバリアントのＳタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｍ３１Ａ７結合のフローサイトメトリー分析。（Ｃ）ＷＴ又はバリアントのＳタンパク質を有するシュードウイルスに対するｍ３１Ａ７の中和活性。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に関する３つの技術的反復実験のデータは、平均値±ＳＤとして示され、曲線はＥＣ５０値の非線形回帰によりフィッティングされる。
【図8-2】（Ｄ）～（Ｆ）。ＳＭＧワクチン接種によって誘発された抗体ｍ３１Ａ７の機能的、予防的、及び構造的特性決定は交差中和能力を示唆している。（Ｄ）Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ｎ＝３）に対する抗体注射及び抗原負荷スケジュールを示す。（Ｅ）～（Ｆ）ｍ３１Ａ７又はＰＢＳで処理したマウスについての体重変化（Ｅ）及び体温変化（Ｆ）を示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。
【図8-3】（Ｇ）。ＳＭＧワクチン接種によって誘発された抗体ｍ３１Ａ７の機能的、予防的、及び構造的特性決定は交差中和能力を示唆している。（Ｇ）ｍ３１Ａ７ ＩｇＧ及びＦａｂのＳタンパク質への結合速度を表し、解離定数（Ｋｄ）は上部に示している。
【図8-4】（Ｈ）。ＳＭＧワクチン接種によって誘発された抗体ｍ３１Ａ７の機能的、予防的、及び構造的特性決定は交差中和能力を示唆している。（Ｈ）ｍ３１Ａ７のＨＤＸ－ＭＳによるエピトープマッピングを時間経過で示しており、２つのペプチド候補４１９～４３３及び４７１～４８２が１５秒で１０％を超えるΔＨＤＸであることが明らかである。データは平均値±ＳＤとして示し、各時点で複数のｔ検定により分析されている。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図8-5】（Ｉ）～（Ｊ）。ＳＭＧワクチン接種によって誘発された抗体ｍ３１Ａ７の機能的、予防的、及び構造的特性決定は交差中和能力を示唆している。（Ｉ）ｍ３１Ａ７－Ｆａｂ／Ｓタンパク質複合体構造とフィッティングしたクライオ－ＥＭマップを示す。重鎖、濃い緑色；軽鎖、薄い緑色；ＲＢＤ、赤色；ＮＴＤ、オレンジ色；Ｓ１の残り、薄い灰色；Ｓ２、濃い灰色；Ｎ－グリカン、青色。（Ｊ）ＲＢＤ－ｍ３１Ａ７境界面の拡大図を示す。星印は、ｍ３１Ａ７軽鎖とＮ１６５－グリカンの間の近傍をマークしている。
【図8-6】（Ｋ）～（Ｌ）。ＳＭＧワクチン接種によって誘発された抗体ｍ３１Ａ７の機能的、予防的、及び構造的特性決定は交差中和能力を示唆している。（Ｋ）以前に報告されているｍＡｂ Ｓ２Ｅ１２（マゼンタ色）、ＣＯＶ２５３（ピンク色）、及びＢ１－１８２．１（水色）（ＰＤＢ ７ＢＥＮ、７Ｋ４Ｎ、及び７ＭＬＺ）のｍ３１Ａ７結合ＲＢＤ（灰色）への重ね合わせ。受容体結合モチーフ及びＲＢＤ先端を強調表示している。（Ｌ）ＲＢＤ（灰色）上のＣＯＶ２５３（ピンク色）及びｍ３１Ａ７（緑色）のフットプリント比較は類似性を示し、ＶＯＣの残基を赤い球体として示し描いている。
【図9-1】（Ａ）～（Ｂ）。デルタＳＭＧワクチン接種はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントシュードウイルスに対するより多くの中和抗体を誘発した。（Ａ）ワクチン接種のスキーム。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、デルタＳＦＧワクチン又はＳＭＧワクチンで０週目及び２週目に２回免疫した。６週目に血清を採取し、続いてシュードウイルスアッセイを使用して中和能力を試験した。（Ｂ）野生型（ＷＨ０１）を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントシュードウイルス、並びにアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ及びオミクロンを含む懸念されるバリアント（ＶＯＣ）に対する血清の５０％逆数中和力価（ｐＮＴ５０）。データは平均（各棒の上に表示）±ＳＥＭとして示し、２つの実験群を比較するために両側マン・ホイットニーＵ検定により分析した。＊Ｐ＜０．０５。
【図9-2】（Ｃ）。デルタＳＭＧワクチン接種はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントシュードウイルスに対するより多くの中和抗体を誘発した。（Ｃ）異なる希釈の血清によって提供されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントシュードウイルス細胞感染の阻害（％）。データを平均±ＳＥＭとして示し、曲線はＧｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍ ９．０を使用した非線形回帰によりフィッティングさせた。
【図10】（Ａ）～（Ｂ）。デルタ又はＷＴ ＳＭＧワクチン接種は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロンバリアントシュードウイルスに対するより多くの中和抗体を誘発した。（Ａ）ワクチン接種のスキーム。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、デルタ／ＷＴ ＳＦＧ又はＳＭＧワクチンで０週目及び２週目に２回免疫した。血清を６週目に採取し、続いてシュードウイルスアッセイを使用して中和能力を試験した。（Ｂ）異なる希釈の血清によって提供されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントシュードウイルス細胞感染の阻害（％）。データを平均±ＳＥＭとして示し、曲線はＧｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍ ９．０を使用した非線形回帰によりフィッティングさせた。
【図11-1】（Ａ）～（Ｂ）。デルタＳＭＧタンパク質は、溶液又は粉末中で室温にて保存することができる。（Ａ）～（Ｂ）２つのアミノ酸（ｐｂｓ－ａａ）、５０ｍＭのＬ－アルギニン及び５０ｍＭのＬ－グルタミン酸を含むリン酸緩衝生理食塩水添加剤中のデルタＳＭＧタンパク質を、０．２２μｍフィルターを用いて濾過し、室温（ＲＴ）又は４℃で保存した。タンパク質を、３日、７日、１４日、２１日、及び３ヶ月を含む様々な時点で回収した。回収した試料を５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅと混合し、１００℃で５分間加熱し、ゲル泳動するまで４℃で保存した。
【図11-2】（Ｃ）。デルタＳＭＧタンパク質は、溶液又は粉末中で室温にて保存することができる。（Ｃ）異なる緩衝液及び凍結乾燥条件におけるデルタＳＭＧタンパク質の保存試験。５０ｍＭのＬ－アルギニン及び５０ｍＭのＬ－グルタミン酸含有又は非含有のＰＢＳを、デルタＳＨＭ又はＳＭＧ（最初の３レーン）の４℃での保存について試験した。デルタＳＭＧを、賦形剤含有又は非含有で凍結乾燥試験を行い、ＲＴで２週間以上保存した（最後の２レーン）。
【図12】Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタペプチドリピート配列１（ＨＲ１）、ヘプタペプチドリピート配列２（ＨＲ２）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、細胞質ドメイン（ＣＤ）、及びＳ２サブユニットを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に存在する高度に保存されたエピトープ（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７）（配列番号４１－４７）の模式図を示す。
【図13】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のヘプタペプチドリピート配列２（ＨＲ２）に存在する高度に保存されたエピトープ（Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２）（配列番号４８－５２）の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本開示の実施形態の以下の詳細な説明では、同様の参照が同様の要素を示し、本開示が実施され得る特定の実施形態を例示として示す、添付の図面を参照する。これらの実施形態は、当業者が本開示を実施することができるように十分詳細に説明されており、また、他の実施形態を利用することができ、論理的、構造的、機能的、及び他の変更を本開示の範囲から逸脱することなく行うことができることを理解されたい。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味でとらえられるべきではない。
【0031】
本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、以下で特段の定義がされない限り、当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有することを意図する。本明細書で使用される技術への言及は、当業者に明らかと予想されるそれらの技術の変形又は同等若しくは後で開発された技術の代替を含めた、当技術分野において一般的に理解されている技術を指すことを意図している。さらに本発明である主題をより明確かつ簡潔に説明するために、以下の定義が本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語について提供される。
【0032】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに特段の指示をしない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、１つのタンパク質又はそのようなタンパク質の混合物を指すことができ、「方法」への言及は、当業者に公知の同等のステップ及び／又は方法などの言及を含む。
【0033】
本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、ウイルスのゲノム（遺伝子コード）における単一の変化を指す。変異は頻繁に起こるが、ウイルスの特性はたまにしか変化しない。
【0034】
本明細書で使用される場合、「系列」という用語は、共通の祖先を有する密接に関連したウイルスの群を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は多くの系列を有する。すべてがＣＯＶＩＤ－１９を引き起こす。
【0035】
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、１つ以上の変異を含み得るウイルスゲノム（遺伝子コード）を指す。いくつかの場合には、系列又は系列の群などの類似の遺伝的変化を有するバリアントの群は、公衆衛生上の措置を必要とし得る共通の属性及び特性により、懸念されるバリアント（ＶＯＣ）又は関心のあるバリアント（ＶＯＩ）として公衆衛生機関によって指定され得る。
【0036】
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫原と組み合わせて使用した場合に、免疫原に対して誘導される免疫応答を増強又は変化又は改変する化合物を指す。免疫応答の改変には、抗体及び細胞性免疫応答のいずれか又は両方の特異性の強化又は拡大が含まれる場合がある。
【0037】
本明細書で使用される場合、数値の前にある「約」又は「およそ」という用語は、その数値にプラス１０％又はマイナス１０％の範囲を示す。例えば、「約１００」は、９０及び１１０を包含する。
【0038】
本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」とは、組成物の対象への投与により、抗原に対する体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を対象において発達させる抗原を含む組成物である。
【0039】
本明細書に記載される場合、「スパイクタンパク質」及び「スパイク糖タンパク質」及び「コロナウイルススパイクタンパク質」という用語は、交換可能に使用される。
【0040】
本明細書で使用される「実質的に均質な」という用語は、組成物中に存在する糖タンパク質の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％が、１つの所望のグリコフォーム（例えば、モノ－ＧｌｃＮＡｃ－修飾）によって表され、組成物中に微量の望ましくないグリコフォームが存在することを意味することを意図する。「微量」とは、糖タンパク質組成物中に存在する任意の所与の望ましくないグリコフォームが、総糖タンパク質の５％未満、好ましくは４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、さらには０．５％未満、さらには０．１％未満で存在することを意図する。
【0041】
「処置する」、「処置」、及び「処置する」という用語は、本明細書で使用される場合、有益な又は所望の結果、例えば臨床結果を得るためのアプローチを指す。本開示の目的のために、有益な又は望ましい結果は、感染若しくは疾患の発症若しくは進行を阻害若しくは抑制すること；感染症若しくは疾患の症状を改善すること、若しくはその発症を軽減すること；又はそれらの組合せを含み得る。
【0042】
「予防する」及び「予防」という用語は、本明細書で使用される場合、「発症予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」と交換可能に使用され、感染症の完全な予防、若しくはその感染症の症状の発生の予防；感染症又はその症状の発症の遅延；又は、その後に発生した感染症若しくはその症状の重症度の低下を意味し得る。
【0043】
本明細書で使用される場合、「有効量」とは、病原体感染の少なくとも１つの症状を軽減する免疫応答を誘導するのに十分な免疫原の量を指す。有効用量又は有効量は、例えば、中和分泌抗体及び／又は血清抗体の量を測定することによって、例えば、プラーク中和、補体固定、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、又はマイクロ中和アッセイによって決定することができる。
【0044】
本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、コロナウイルス由来の免疫原などの免疫原性組成物（アジュバントの有無を問わない）を意味し、これは防御免疫（例えば、コロナウイルスによる感染から対象を保護する免疫及び／又はコロナウイルスによる感染によって引き起こされる状態の重症度を低減する免疫）を提供するコロナウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用される。防御免疫応答は、抗体の形成及び／又は細胞性応答を含み得る。文脈に応じて、「ワクチン」という用語はまた、防御免疫を生成するために対象に投与される免疫原の懸濁液又は溶液を指し得る。
【0045】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語には、ヒト及び他の動物が含まれる。典型的には、対象はヒトである。例えば、対象は、成人、１０代、子供（２歳～１４歳）、幼児（誕生～２歳）、又は新生児（２ヶ月まで）であってよい。特定の態様では、対象は、生後４ヶ月以下、又は生後６ヶ月以下である。一部の態様では、成人は、約６５歳以上、又は約６０歳以上の高齢者である。一部の態様では、対象は、妊婦又は妊娠を希望する女性である。他の態様では、対象はヒトではない。例えば、ヒト以外の霊長類であり、例えば、ヒヒ、チンパンジー、ゴリラ、マカクである。ある特定の態様では、対象は、ペットであり、例えば、イヌ又はネコであり得る。
【0046】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、米国連邦政府又は州政府の規制機関によって承認されているか、米国薬局方、欧州薬局方、又は哺乳動物、より詳しくはヒトにおいて使用するために一般に認められている他の薬局方にリストされていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチン及び／又は抗原組成物として有用であり得る。
【0047】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす、エンベロープ型ポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルス粒子には、ＲＮＡ遺伝物質及び宿主細胞の侵入に必要な構造タンパク質が含まれている。細胞内に入ると、感染性ＲＮＡは、ウイルス粒子を構成する構造タンパク質、ウイルスのアセンブリ、転写、複製、宿主制御を指示する非構造タンパク質、及び機能が決定されていないアクセサリータンパク質をコードするために使用される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質には、エンベロープタンパク質（Ｅ）、スパイク又は表面糖タンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）、及びヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）が含まれる。スパイク糖タンパク質はウイルス粒子の外側で確認されており、コロナウイルスウイルスに王冠様の外観を与える。この糖タンパク質は、ウイルス粒子の付着及び宿主細胞への侵入を媒介する。
【0048】
肺上皮細胞により生成されるＳタンパク質は、感染力の増加に関連するグリコフォームを有する。完全にグリコシル化されたＳタンパク質と比較して、モノＧｌｃＮＡｃ装飾状態（ＳＭＧ）にトリミングされたＮ－グリカンを有するＳタンパク質で免疫すると、より強い免疫応答が誘発され、懸念されるバリアント（ＶＯＣ）に対するヒトアンギオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）トランスジェニックマウスのより良好な保護が誘導された。さらに、広範中和モノクローナル抗体が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＶＯＣをサブピコモル効力で中和することができるＳＭＧ免疫マウスから同定された。
【0049】
本開示の糖鎖改変型スパイクタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するバリアント、又はそのアミノ酸配列若しくはバリアントの免疫学的に活性な断片を含む。配列番号１のアミノ酸配列を以下に示す。
【0050】
【化1】
【0051】
一実施形態では、本開示の糖鎖改変型スパイクタンパク質は、以下の配列番号２に示したアミノ酸を有するポリペプチドを含む。
配列番号２
配列番号２
【0052】
【化2】
【0053】
本明細書に記載されているように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の糖鎖改変型スパイクタンパク質又はそのバリアントは、（ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列と実質的に同一である（例えば、配列番号２などの配列番号１と少なくとも９０％、９５％又は９７％同一である）；及び（ｉｉ）本明細書に記載のスパイクタンパク質をコードする任意の核酸配列に少なくとも中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるか、又は同義のコドン（例えば、同一のヌクレオチド配列を有していないが、同一のアミノ酸をコードするコドン）を使用するために、本明細書に記載のスパイクタンパク質をコードする任意の核酸配列に少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされる、アミノ酸配列を含むものを含み得る。
【0054】
細胞特異的グリコフォーム分布、配列保存、グリカンシールド、及びそれらの相互相関の分析によって、本質的にすべてのグリカンシールドが除去されたＳＭＧワクチンを設計するに至った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のグリコシル化は、ウイルス感染、タンパク質の完全性、及び免疫応答に大きな影響を及ぼす。肺上皮細胞由来のＳタンパク質は、受容体結合を促進するためにより多くシアリル化された複合型グリカンを含み、グリコサイトＮ８０１及びＮ１１９４は、Ｓタンパク質のフォールディング及びウイルス感染に必須であることが示された。これにより、保存されたエピトープが免疫系に対してより良好に露出されることになり、より効果的で広範な防御性のＢ細胞及びＴ細胞応答がウイルス及びバリアントに対して引き出され得る。
【0055】
本開示の糖鎖改変型コロンウイルススパイクタンパク質は、Ｓタンパク質外部ドメイン全体、特にグリカンによりシールドされた保存ドメインを標的とし、ＲＢＤ及び非ＲＢＤ中和抗体の両方の誘発と交差防御に重要なＣＤ８ Ｔ細胞応答を刺激する。
【0056】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の免疫原を含むワクチン又は医薬組成物を提供する。本開示はまた、コロナウイルス感染症を処置又は予防する方法であって、有効量の本明細書に記載の免疫原、医薬組成物、又はワクチンを、それを必要とする対象（例えば哺乳動物）に投与することを含む、方法を提供する。
【0057】
一実施形態では、ワクチンはアジュバントを含み得る。例示的なアジュバントには、限定するものではないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、スクアレン、ミョウバン、アルハイドロゲル、ＭＦ５９、ＱＳ－２１、ＣｐＧ １０１８、ＡＳ０３、ＡＳ３７、Ｍａｔｒｉｘ－Ｍ、又はそれらの組合せが含まれる。
【0058】
ワクチン又は医薬組成物は、任意の適切な方法を使用して製剤化され得る。標準的な薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いる製剤化は、製薬技術における通常の方法を使用して実施することができる。製剤の正確な性質は、投与されるワクチン及び所望する投与経路を含めたいくつかの要因によって決まる。製剤の適切なタイプは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｅｒｎ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡに十分に記載されている。
【0059】
本明細書に記載のワクチン又は医薬組成物は、任意の経路により投与することができる。そのような方法は、例えば非経口的な適用、例えば皮膚への又は皮膚を介した、例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜、粘膜下、又は皮下のすべての注射経路による適用を含む。また、それらは、滴剤、スプレー剤、ゲル剤、又は軟膏として、目、鼻、口、肛門、若しくは膣の粘膜上皮、又は身体の任意の部分の外皮の表皮に局所適用により適用することができる。他の可能性のある適用の経路は、気道を介した吸入によるスプレー剤、エアロゾル剤、又は粉末剤の適用によるものである。あるいは、適用は、消化器経路を介してされ得る。ワクチン組成物の有効量は、限定するものではないが、種、血統、サイズ、身長、体重、年齢、患者の全体的な健康状態、製剤の種類、又は投与の様式若しくは方法を含む、任意の数の不確定要素に依存し得る。適切な有効量は、日常的な最適化技術、及び当業者の熟練した情報に基づいた判断、及び当業者に明白な他の要因を使用して、当業者によって日常的に決定することができる。
【0060】
一実施形態では、組成物は、追加の治療剤、例えば抗ウイルス剤などを含むことができる。提供される医薬組成物は、コロナウイルス感染症の処置に有用である。追加の抗ウイルス剤の例には、限定するものではないが、リバビリン、ペンシクロビル、ニタゾキサニド、ナファモスタット、クロロキン、レムデシビル（ＧＳ－５７３４）及びファビピラビル（Ｔ－７０５）、インターフェロン、アデホビル、テノホビル、アシクロビル、ブリブジン、シドホビル、フォミビルセン、フォスカルネット、ガンシクロビル、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、レムデシビル、モルヌピラビル、及びパクスロビドが含まれる。
【0061】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾のある場合は、定義を含め、本明細書に従う。さらに、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
【実施例0062】
［実施例１］ 遺伝子構築物
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク配列は、ＧＩＳＡＩＤデータベースからダウンロードした遺伝子配列に基づいて設計した。すべての入手可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の総計１，１１７，４７４個のＳタンパク質配列を、ＧＩＳＡＩＤ（鳥インフルエンザデータの共有についてのグローバルイニシアチブ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ））データベース（バージョン：２０２１年４月１８日）から抽出した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク配列は、ＧＩＳＡＩＤデータベースからダウンロードした遺伝子配列に基づいて設計した。すべての入手可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の総計１，１１７，４７４個のＳタンパク質配列を、ＧＩＳＡＩＤ（鳥インフルエンザデータの共有についてのグローバルイニシアチブ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ））データベース（バージョン：２０２１年４月１８日）から抽出した。
【0063】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ／ＷＨ０１／２０１９及びデルタバリアント由来のスパイクタンパク質のＤＮＡ配列をヒト細胞発現に最適化したコドンで合成した。フリン切断部位をＧＳＡＧ（配列番号９）で置換し、２Ｐ置換はタンパク質が融合前状態を維持するように設計した。膜貫通ドメインは、トロンビン切断部位、ｆｏｌｄｏｎ、及びスパイクのＣ末端のヒスチジンタグで置き換えた。改変されたＨＡ配列をｐＴＴベクターにクローニングし、タンパク質を発現し精製した。
【0064】
［実施例２］ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質の発現及び精製
分泌型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクをコードするプラスミドを、トランスフェクション試薬（ポリエチレンイミン又はＦｅｃｔｏＰＲＯのいずれか）を使用することによって、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１０８５２）又はＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ－細胞のいずれかのヒト胎児腎臓細胞株にトランスフェクトし、０．５％ウシ血清を補充したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養した。上清をトランスフェクションの５日後に回収し、遠心分離により清澄化した。次に、スパイクタンパク質をニッケルキレートクロマトグラフィーで精製し、溶出画分をミリポア・アミコンウルトラフィルター（１００ｋＤａ）により濃縮し、トリスベースの緩衝液（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのグルタミン酸、５０ｍＭのアルギニン）で予め平衡化したｓｕｐｅｒｐｏｓｅ（商標）６ゲル濾過カラム（１０／３００ ＧＬ；ＧＥ社）上にロードし、対応する三量体画分を収集した。精製したＳＨＭをＥｎｄｏ Ｈ（ＮＥＢ）で一晩室温にて処理し、グリコシル化部位に単一ＧｌｃＮＡｃを有するスパイクタンパク質、スパイクｍｇを生成した。Ｅｎｄｏ Ｈを除去するため、ミリポア・アミコンウルトラフィルター（１００ｋＤａ）を使用した緩衝液交換によりＳＭＧをさらに精製した。発現及び精製方法は、ＰＮＡＳに公表されている研究室の既存の研究から変更している。
分泌型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクをコードするプラスミドを、トランスフェクション試薬（ポリエチレンイミン又はＦｅｃｔｏＰＲＯのいずれか）を使用することによって、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１０８５２）又はＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ－細胞のいずれかのヒト胎児腎臓細胞株にトランスフェクトし、０．５％ウシ血清を補充したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養した。上清をトランスフェクションの５日後に回収し、遠心分離により清澄化した。次に、スパイクタンパク質をニッケルキレートクロマトグラフィーで精製し、溶出画分をミリポア・アミコンウルトラフィルター（１００ｋＤａ）により濃縮し、トリスベースの緩衝液（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのグルタミン酸、５０ｍＭのアルギニン）で予め平衡化したｓｕｐｅｒｐｏｓｅ（商標）６ゲル濾過カラム（１０／３００ ＧＬ；ＧＥ社）上にロードし、対応する三量体画分を収集した。精製したＳＨＭをＥｎｄｏ Ｈ（ＮＥＢ）で一晩室温にて処理し、グリコシル化部位に単一ＧｌｃＮＡｃを有するスパイクタンパク質、スパイクｍｇを生成した。Ｅｎｄｏ Ｈを除去するため、ミリポア・アミコンウルトラフィルター（１００ｋＤａ）を使用した緩衝液交換によりＳＭＧをさらに精製した。発現及び精製方法は、ＰＮＡＳに公表されている研究室の既存の研究から変更している。
【0065】
（図１Ｄ）における糖鎖改変型シュードウイルスの生成は、以前の研究に従った（Ｙ． Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｊ． Ｄ． Ａｌｌｅｎ、Ｄ． Ｗｒａｐｐ、Ｊ． Ｓ． ＭｃＬｅｌｌａｎ、Ｍ． Ｃｒｉｓｐｉｎ、Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９、３３０～３３３頁（２０２０）；Ｑ． Ｙａｎｇ、Ｔ． Ａ． Ｈｕｇｈｅｓ、Ａ． Ｋｅｌｋａｒ、Ｘ． Ｙｕ， Ｋ． Ｃｈｅｎｇ、Ｓ． Ｐａｒｋ、Ｗ．－Ｃ． Ｈｕａｎｇ、Ｊ． Ｆ． Ｌｏｖｅｌｌ、Ｓ． Ｎｅｅｌａｍｅｇｈａｍ、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖｉｒａｌ ｅｎｔｒｙ ｕｐｏｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｎ－ａｎｄ Ｏ－ｇｌｙｃａｎ ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ． ｅＬｉｆｅ ９、ｅ６１５５２ （２０２０））。グリコサイト特異的Ｓ変異体シュードウイルス（図１Ｆ）を生成するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各グリコサイトに変異を有するｐＶａｘ－ｎＣｏＶ－ＳΔ１９構築物とルシフェラーゼ発現ＨＩＶ－１ゲノムプラスミド（ｐＮＬ４－３．ｌｕｃ．ＲＥ）を一過的にトランスフェクトした。
【0066】
［実施例３］ ＳＭＧタンパク質の特性決定
ＳＭＧタンパク質を特性決定するため、トリスベースの緩衝液（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのグルタミン酸、５０ｍＭのアルギニン）で予め平衡化したＥＮｒｉｃｈ（商標）ＳＥＣ ６５０（１０×３００カラム；Ｂｉｏｒａｄ社）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。次いで、タンパク質試料の純度を確認するため、試料をローディング緩衝液と合わせ、７．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブリリアントブルー－プラス（ＥＢＬ）で染色した。
ＳＭＧタンパク質を特性決定するため、トリスベースの緩衝液（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのグルタミン酸、５０ｍＭのアルギニン）で予め平衡化したＥＮｒｉｃｈ（商標）ＳＥＣ ６５０（１０×３００カラム；Ｂｉｏｒａｄ社）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。次いで、タンパク質試料の純度を確認するため、試料をローディング緩衝液と合わせ、７．５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブリリアントブルー－プラス（ＥＢＬ）で染色した。
【0067】
［実施例４］ 質量分析によるグリコペプチド分析
２つの生物学的複製物からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の２つの２０μｇアリコートを、１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンを含有する５０ｍＭの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液中、５５℃で１時間変性させた。次いで、スパイクタンパク質を、１８ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を添加することによって還元及びアルキル化し、暗所で３０分間インキュベートした。アルキル化Ｅｎｖタンパク質は、１：１０（ｗ／ｗ）の割合のキモトリプシン若しくはアルファ溶解性プロテアーゼ、又は１：２０（ｗ／ｗ）の割合のトリプシンの異なる組合せを使用して別々に消化した。（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｇｒａｄｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）。一晩消化した後、試料をＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器で乾燥させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定のために処理した。グリカンの分類は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．０．０によって検出及び可視化された組成に基づき以前の研究に従った。
２つの生物学的複製物からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の２つの２０μｇアリコートを、１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンを含有する５０ｍＭの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液中、５５℃で１時間変性させた。次いで、スパイクタンパク質を、１８ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を添加することによって還元及びアルキル化し、暗所で３０分間インキュベートした。アルキル化Ｅｎｖタンパク質は、１：１０（ｗ／ｗ）の割合のキモトリプシン若しくはアルファ溶解性プロテアーゼ、又は１：２０（ｗ／ｗ）の割合のトリプシンの異なる組合せを使用して別々に消化した。（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｇｒａｄｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）。一晩消化した後、試料をＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器で乾燥させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定のために処理した。グリカンの分類は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．０．０によって検出及び可視化された組成に基づき以前の研究に従った。
【0068】
［実施例５］ ワクチン接種実験及び抗原負荷実験
メスの６～７週齢のゴールデンシリアン・ハムスター（ｎ＝５）を、水酸化アルミニウム２５０μｇと混合した２５μｇの精製ＳＦＧ又はＳＭＧタンパク質で０日目及び１４日目に筋肉内免疫した。初回免疫から２８日後、４２日後に血液を採取し、各ハムスターから血清試料を回収した。ハムスターは、２回目のワクチン接種の４週間後に、１×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＣＤＣ＃４（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／４／２０２０、ＧＩＳＡＩＤ登録ＩＤ：ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１１９２７）をハムスターあたり１００μＬの量で経鼻的に抗原負荷した。各ハムスターの体重を、感染後、毎日記録した。抗原負荷後３日目に、ハムスターを二酸化炭素により安楽死させた。右肺をウイルス負荷決定（ＴＣＩＤ５０アッセイ）のために回収した。左肺を病理組織学的検査するため、４％パラホルムアルデヒドで固定した。すべての動物実験は、中央研究院（Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により評価及び承認された。
メスの６～７週齢のゴールデンシリアン・ハムスター（ｎ＝５）を、水酸化アルミニウム２５０μｇと混合した２５μｇの精製ＳＦＧ又はＳＭＧタンパク質で０日目及び１４日目に筋肉内免疫した。初回免疫から２８日後、４２日後に血液を採取し、各ハムスターから血清試料を回収した。ハムスターは、２回目のワクチン接種の４週間後に、１×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＣＤＣ＃４（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／４／２０２０、ＧＩＳＡＩＤ登録ＩＤ：ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１１９２７）をハムスターあたり１００μＬの量で経鼻的に抗原負荷した。各ハムスターの体重を、感染後、毎日記録した。抗原負荷後３日目に、ハムスターを二酸化炭素により安楽死させた。右肺をウイルス負荷決定（ＴＣＩＤ５０アッセイ）のために回収した。左肺を病理組織学的検査するため、４％パラホルムアルデヒドで固定した。すべての動物実験は、中央研究院（Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により評価及び承認された。
【0069】
あるいは、２回投与スケジュールによるマウスワクチン接種のため、メスの６～８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、水酸化アルミニウム（５０μｇ）と混合した１０μｇの精製ＳＦＧ、ＳＨＭ、又はＳＭＧで０日目及び１４日目に筋肉内免疫した。抗Ｓ ＩｇＧ量、ＩｇＧサブタイプ、中和力価を評価するため（補足資料及び方法に記載）、血清を初回ワクチン接種後２８日目に採取した。Ｔ細胞応答分析のため（補足資料及び方法に記載）、ＳＦＧ又はＳＭＧ免疫化マウスのリンパ節を初回ワクチン接種後２１日目に回収した。Ｂ細胞レパートリー分析及びバリアントに対する血清力価については、メスの６～８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、水酸化アルミニウム（２０μｇ）と混合した２０μｇの精製ＳＦＧ又はＳＭＧで０、１４、及び５６日目に筋肉内免疫した。マウスを８４日目に安楽死させ、抗Ｓ ＩｇＧ及び中和力価を評価するために全血を採取し、Ｓタンパク質特異的Ｂ細胞を選別するための脾臓を採取した（補足資料及び方法に記載）。
【0070】
ハムスターワクチン接種及びウイルス抗原負荷を研究するため、オスの６～７週齢のゴールデンシリアンハムスター（ｎ＝５）を、水酸化アルミニウム（２５０μｇ）と混合した２５μｇの精製ＳＦＧ又はＳＭＧで０日目及び１４日目に筋肉内免疫した。２回目の免疫から４週間後、各ハムスターに、１００μｌのＰＢＳ中の１×１０４ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／４／２０２０）を経鼻的に抗原負荷した。体重を感染後に毎日記録した。抗原負荷後の３日目に、ハムスターを二酸化炭素により安楽死させた。左肺の上葉を組織病理学的検査のために１０％パラホルムアルデヒドで固定し、残りの肺をウイルス量測定（ＴＣＩＤ５０アッセイ）のために回収した。
【0071】
トランスジェニックマウスのワクチン接種及びウイルス抗原負荷研究については、オスの６～８週齢のＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス又はオスの１２週齢のＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入）に、水酸化アルミニウム（５０μｇ）と混合した１０μｇの精製ＳＦＧ又はＳＭＧを０日目及び１４日目に筋肉内免疫した。ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスに、２回目の免疫の４週間後に１×１０３ＴＣＩＤ５０のＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を経鼻的に抗原負荷した。第１の試験（ｎ＝３）では、左肺の上葉の組織病理学的検査のため、すべてのマウスを７ｄｐｉで安楽死させた。第２の試験（ｎ＝７）では、肺ウイルス力価のため３匹のマウスを４ｄｐｉで安楽死させ、生存分析のため４匹のマウスを１４ｄｐｉまで保持した。血清は、ウイルス抗原負荷の１日前に採取した。
【0072】
ＶＯＣを使用した抗原負荷の研究については、ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２マウスを、マウスあたりＰＢＳ ５０μｌ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファバリアント（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／７９２／２０２０）（ｎ＝５）又はガンマバリアント（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／９０６／２０２１）の１×１０３ＴＣＩＤ５０で抗原負荷した。さらに、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスは、マウスあたりＰＢＳ ５０μｌ中のデルタＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／１１４４／２０２１）（ｎ＝４）１×１０４ＴＣＩＤ５０で、２回目の免疫の４週間後に経鼻的に抗原負荷した。すべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの抗原負荷モデルについて、各マウスの体重を１４ｄｐｉまで毎日記録した。
【0073】
抗体の予防的防御試験については、オスの８週齢Ｋ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ｎ＝３）に、ｍ３１Ａ７（１５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳを腹腔内注射し、その後１×１０３ＴＣＩＤ５０のＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／４／２０２０）を経鼻的に抗原負荷した。体重及び体温を５ｄｐｉまで毎日記録した。すべての動物実験は、中央研究院の動物実験委員会によって評価及び承認された（承認番号２１－１０－１７１６、１８－１２－１２７２、及び２０－１０－１５２２）。
【0074】
［実施例６］ 組織学及び免疫組織化学（ＩＨＣ）染色
３ｄｐｉのハムスター肺を直ちに回収し、１０％中性緩衝ホルマリン固定に２４時間置いた後、７０％エタノールに７２時間移した。パラフィン包埋した肺組織を５ｍｍの厚さに切り取った。組織学的染色については、組織をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色については、切片化した組織をキシレンで脱パラフィンし、エタノール勾配で再水和した。抗原賦活化は、スライドを１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で１０分間、９５℃に電子レンジで加熱することにより実施した。室温で冷却し、ＰＢＳで洗浄した後、３％のＨ２Ｏ２を適用して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。切片化した組織を１Ｘ ＰＢＳＴ中の５％正常ヤギ血清及び１％のＢＳＡで１時間ブロッキングし、続いて１：５０希釈のウサギ抗Ｎ及び抗Ｓ一次抗体（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリクローナル抗体）と一晩４℃でインキュベートした。次いで、組織を１：５００希釈のヤギ抗ウサギＨＲＰ二次抗体と１時間インキュベートし、３，３－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質とインキュベートすることにより可視化し、ヘマトキシリンで対比染色した。
３ｄｐｉのハムスター肺を直ちに回収し、１０％中性緩衝ホルマリン固定に２４時間置いた後、７０％エタノールに７２時間移した。パラフィン包埋した肺組織を５ｍｍの厚さに切り取った。組織学的染色については、組織をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色については、切片化した組織をキシレンで脱パラフィンし、エタノール勾配で再水和した。抗原賦活化は、スライドを１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で１０分間、９５℃に電子レンジで加熱することにより実施した。室温で冷却し、ＰＢＳで洗浄した後、３％のＨ２Ｏ２を適用して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。切片化した組織を１Ｘ ＰＢＳＴ中の５％正常ヤギ血清及び１％のＢＳＡで１時間ブロッキングし、続いて１：５０希釈のウサギ抗Ｎ及び抗Ｓ一次抗体（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリクローナル抗体）と一晩４℃でインキュベートした。次いで、組織を１：５００希釈のヤギ抗ウサギＨＲＰ二次抗体と１時間インキュベートし、３，３－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質とインキュベートすることにより可視化し、ヘマトキシリンで対比染色した。
【0075】
［実施例７］ 免疫蛍光（ＩＦ）染色
免疫蛍光染色については、抗原賦活化ステップの後、組織をＰＢＳ中のトリトンＸ－１００で透過処理した。切片化した組織を１Ｘ ＰＢＳＴ中の５％の正常ヤギ血清及び１％のＢＳＡで１時間ブロッキングした。次いで、自家蛍光クエンチャーで５分間インキュベートした。続いて、試料を１：５０希釈のウサギ抗Ｎ及び抗Ｓ一次抗体（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリクローナル抗体）と一晩４℃でインキュベートし、二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）と室温で１時間インキュベートし、核色素の４，６－ジアミジノ－２フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と３分間、室温でインキュベートした。カバースリップを顕微鏡スライドにマウントし、ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ２１０ｘ／１．４０レンズ（Ｌｅｉｃａ社、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を取り付けたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８Ｘ共焦点顕微鏡で画像化した。
免疫蛍光染色については、抗原賦活化ステップの後、組織をＰＢＳ中のトリトンＸ－１００で透過処理した。切片化した組織を１Ｘ ＰＢＳＴ中の５％の正常ヤギ血清及び１％のＢＳＡで１時間ブロッキングした。次いで、自家蛍光クエンチャーで５分間インキュベートした。続いて、試料を１：５０希釈のウサギ抗Ｎ及び抗Ｓ一次抗体（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリクローナル抗体）と一晩４℃でインキュベートし、二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）と室温で１時間インキュベートし、核色素の４，６－ジアミジノ－２フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と３分間、室温でインキュベートした。カバースリップを顕微鏡スライドにマウントし、ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ２１０ｘ／１．４０レンズ（Ｌｅｉｃａ社、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を取り付けたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８Ｘ共焦点顕微鏡で画像化した。
【0076】
［実施例８］ トランスジェニックマウスのワクチン接種実験及び抗原負荷実験
オスの８週齢ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ｎ＝３）に、水酸化アルミニウム５０μｇと混合した精製ＳＦＧ又はＳＭＧタンパク質１０μｇで０日目及び１４日目に筋肉内免疫した。血液を初回免疫後の２８日目及び４２日目に回収し、血清試料を各トランスジェニックマウスから採取した。ハムスターに、１×１０３ ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＣＤＣ＃４（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／４／２０２０、ＧＩＳＡＩＤアクセッションＩＤ：ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１１９２７）をマウスあたり１００μＬの量で、２回目のワクチン接種の６週間後に経鼻的に抗原負荷した。各トランスジェニックマウスについて体重及び生存率を感染後毎日記録した。抗原負荷後の７日目に、すべてのトランスジェニックマウスを二酸化炭素で安楽死させた。肺を組織病理学的検査のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。すべての動物実験は、中央研究院の動物実験委員会によって評価及び承認された。
オスの８週齢ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウス（ｎ＝３）に、水酸化アルミニウム５０μｇと混合した精製ＳＦＧ又はＳＭＧタンパク質１０μｇで０日目及び１４日目に筋肉内免疫した。血液を初回免疫後の２８日目及び４２日目に回収し、血清試料を各トランスジェニックマウスから採取した。ハムスターに、１×１０３ ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＣＤＣ＃４（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／４／２０２０、ＧＩＳＡＩＤアクセッションＩＤ：ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１１９２７）をマウスあたり１００μＬの量で、２回目のワクチン接種の６週間後に経鼻的に抗原負荷した。各トランスジェニックマウスについて体重及び生存率を感染後毎日記録した。抗原負荷後の７日目に、すべてのトランスジェニックマウスを二酸化炭素で安楽死させた。肺を組織病理学的検査のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。すべての動物実験は、中央研究院の動物実験委員会によって評価及び承認された。
【0077】
［実施例９］ 細胞培養感染アッセイによる肺組織中のウイルス力価の定量化（ＴＣＩＤ５０）
ハムスターの中肺葉、下肺葉、及び後肺葉を、ホモジナイザーを使用して、２％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭの６００μｌ中でホモジナイズした。組織ホモジネートを１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を生ウイルス力価測定のために回収した。簡単に説明すると、各試料の１０倍連続希釈物を４つの組でＶｅｒｏ Ｅ６細胞単層に添加し、４日間インキュベートした。次いで、細胞を１０％ホルムアルデヒドで固定し、０．５％のクリスタルバイオレットで２０分間染色した。プレートを水道水で洗浄し、感染についてスコア化した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬは、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ法によって算出した。
ハムスターの中肺葉、下肺葉、及び後肺葉を、ホモジナイザーを使用して、２％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭの６００μｌ中でホモジナイズした。組織ホモジネートを１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を生ウイルス力価測定のために回収した。簡単に説明すると、各試料の１０倍連続希釈物を４つの組でＶｅｒｏ Ｅ６細胞単層に添加し、４日間インキュベートした。次いで、細胞を１０％ホルムアルデヒドで固定し、０．５％のクリスタルバイオレットで２０分間染色した。プレートを水道水で洗浄し、感染についてスコア化した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬは、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ法によって算出した。
【0078】
［実施例１０］ マウスワクチン接種研究
メスの６～８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に、水酸化アルミニウム２０μｇと混合した精製ＳＦＧ又はＳＭＧタンパク質２０μｇで０日目、１４日目及び５６日目に筋肉内免疫した。第３回の免疫後１４日目に血液を採取し、各マウスから血清試料を回収した。すべての動物実験は、中央研究院の動物実験委員会によって評価及び承認された。
メスの６～８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に、水酸化アルミニウム２０μｇと混合した精製ＳＦＧ又はＳＭＧタンパク質２０μｇで０日目、１４日目及び５６日目に筋肉内免疫した。第３回の免疫後１４日目に血液を採取し、各マウスから血清試料を回収した。すべての動物実験は、中央研究院の動物実験委員会によって評価及び承認された。
【0079】
［実施例１１］ 血清抗体価の評価
血清ＩｇＧ価を決定するために抗Ｓ ＥＬＩＳＡを使用した。プレートを５％スキムミルクでブロッキングし、マウスポリクローナル抗Ｓ一次抗体及びＨＲＰ結合二次抗体を順次添加した。ペルオキシダーゼ基質溶液（ＴＭＢ）及び１ＭのＨ２ＳＯ４停止溶液を使用し、吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダーにより読み取った。試験した株には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型、バリアントＢ．１．１．７及びＢ．１．１３５）、ＲｎＧＴ１３、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１が含まれていた。
血清ＩｇＧ価を決定するために抗Ｓ ＥＬＩＳＡを使用した。プレートを５％スキムミルクでブロッキングし、マウスポリクローナル抗Ｓ一次抗体及びＨＲＰ結合二次抗体を順次添加した。ペルオキシダーゼ基質溶液（ＴＭＢ）及び１ＭのＨ２ＳＯ４停止溶液を使用し、吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダーにより読み取った。試験した株には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型、バリアントＢ．１．１．７及びＢ．１．１３５）、ＲｎＧＴ１３、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１が含まれていた。
【0080】
ｍ３１Ａ７抗体をシングルＢ細胞スクリーニングアッセイにより単離し、次いで、特性決定した。プライマーは、以前の刊行物に基づいて設計した（Ｔ． Ｔｉｌｌｅｒ、Ｃ． Ｅ． Ｂｕｓｓｅ、Ｈ． Ｗａｒｄｅｍａｎｎ、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ Ｉｇ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ Ｂ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５０、１８３～１９３頁（２００９））。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を５０℃で３０分間、９５℃で１５分間実施し、続いて９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間のインキュベーションを４０サイクル行い、７２℃で１０分間、最終伸長を行った。セミネステッドセカンドラウンド（Ｓｅｍｉｎｅｓｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄ－ｒｏｕｎｄ）ＰＣＲは、ＫＯＤ Ｏｎｅ ＰＣＲマスターミックス（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用し、１μｌの未精製のファーストラウンドＰＣＲ産物で、９８℃で２分間実施し、続いて９８℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、６８℃で１０秒間の４５サイクルのインキュベーションを行い、６８℃で１分間、最終伸長を行った。次いで、ＰＣＲ産物を電気泳動及びシーケンシングによって分析した。Ｉｇ Ｖ及びＬ遺伝子は、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｉｎｐｕｔ）により同定した。次いで、ヒトＩｇＨ又はＩｇＬ発現バックボーンを含むベクターにクローニングするための制限部位を含む単一遺伝子特異的Ｖ及びＬ遺伝子プライマーを用いて、セカンドラウンドＰＣＲ産物から遺伝子を増幅した。キメラＩｇＨ及びＩｇＬ発現構築物を抗体産生用のＥｘｐｉ２９３にコトランスフェクトした。ｍ３１Ａ７を単離した後、続いて、抗体をＥＬＩＳＡ及び蛍光活性化セルソーティング、シュードウイルス中和効力、結合速度、エピトープマッピング、及び構造決定によってＳタンパク質結合について評価した。
【0081】
［実施例１２］ シュードウイルス中和アッセイ
シュードタイプのレンチウイルスベクターの感染単位を決定するため、本発明者らは、感染の１日前に、９６ウェル（ウェルあたり１００μＬ）組織培養プレートに２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を適切な密度で播種した。一晩インキュベートした後（３７℃、５％ＣＯ２）、１００ｍＬの３種のプレミックスしたシュードウイルス上清、及び免疫化マウス血清の４倍連続希釈液を播種した細胞に添加した。細胞を４８時間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートし、ナノルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現させた。ルシフェラーゼ活性は、ＥＬＩＳＡリーダーによって測定した。阻害パーセントは、次式１００＊［１－（ＲＬＵ試料／ＲＬＵ偽性－処置）］によって算出した。データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して分析し、ｐＮＴ５０値はすべての試料について５０％阻害濃度値を取得することにより算出した。
シュードタイプのレンチウイルスベクターの感染単位を決定するため、本発明者らは、感染の１日前に、９６ウェル（ウェルあたり１００μＬ）組織培養プレートに２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を適切な密度で播種した。一晩インキュベートした後（３７℃、５％ＣＯ２）、１００ｍＬの３種のプレミックスしたシュードウイルス上清、及び免疫化マウス血清の４倍連続希釈液を播種した細胞に添加した。細胞を４８時間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートし、ナノルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現させた。ルシフェラーゼ活性は、ＥＬＩＳＡリーダーによって測定した。阻害パーセントは、次式１００＊［１－（ＲＬＵ試料／ＲＬＵ偽性－処置）］によって算出した。データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して分析し、ｐＮＴ５０値はすべての試料について５０％阻害濃度値を取得することにより算出した。
【0082】
［実施例１３］ プラーク減少アッセイ
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、感染の１日前に２４ウェル培養プレートに１０％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＤＭＥＭで播種した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を抗体と３７℃で１時間インキュベートした後、細胞単層にさらに１時間加えた。その後、ウイルス－抗体混合物を除去し、細胞単層をＰＢＳで１回洗浄した後、１％メチルセルロース含有培地で５～７日間覆った。細胞を１０％ホルムアルデヒドで一晩固定した。オーバーレイ培地を除去した後、細胞を０．７％クリスタルバイオレットで染色し、プラークをカウントした。阻害のパーセンテージは［１－（ＶＤ／ＶＣ）］×１００％として算出され、式中、ＶＤ及びＶＣは、それぞれ血清の存在下及び非存在下におけるウイルス力価を指す。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、感染の１日前に２４ウェル培養プレートに１０％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＤＭＥＭで播種した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を抗体と３７℃で１時間インキュベートした後、細胞単層にさらに１時間加えた。その後、ウイルス－抗体混合物を除去し、細胞単層をＰＢＳで１回洗浄した後、１％メチルセルロース含有培地で５～７日間覆った。細胞を１０％ホルムアルデヒドで一晩固定した。オーバーレイ培地を除去した後、細胞を０．７％クリスタルバイオレットで染色し、プラークをカウントした。阻害のパーセンテージは［１－（ＶＤ／ＶＣ）］×１００％として算出され、式中、ＶＤ及びＶＣは、それぞれ血清の存在下及び非存在下におけるウイルス力価を指す。
【0083】
ＣＰＥベースの中和アッセイについては、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を２×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに一晩で９０％コンフルエンスになるようプレーティングした。血清とウイルスを混合した後、単層にさらに１時間加えた。プレートを室温で３０分間固化させ、次いで３７℃で細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されるまでインキュベートする。
【0084】
統計分析：すべてのデータは、平均±平均の標準誤差として表される。すべての分析において、Ｐ値は、スチューデントｔ検定（対応、両側）を使用した曲線比較を除き、スチューデントｔ検定（対応なし、両側）から取得した。すべてのグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍのバージョン９．０．０ソフトウェアで作成した。
【0085】
［実施例１４］ 糖鎖改変型モノ－ＧｌｃＮＡｃ修飾スパイク（ＳＭＧ）タンパク質ワクチンの設計及び特性決定
元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株（ｈＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ／ＷＨ０１／２０１９）からの配列（アミノ酸１４～１２０９）を有する組換えネイティブは、ヒト細胞発現用に最適化されたコドンであり、元のフリン切断部位を置き換えるＧＳＡＧ（配列番号９）残基と、スパイクネイティブを融合前状態で固定する２個のプロリン変異を有し、そのＣ末端にフォルドン三量体化配列及びＨｉｓタグが付加され、ヒトＨＥＫ２９３Ｓ細胞で発現される（図１）。分岐記号で示した（図１ａ）すべてのＮ－グリカンがＭａｎ５ Ｎ－グリカンである、中間体高マンノース型スパイク組換えネイティブ（ＳＨＭ）が最初に得られ、精製した。次いで、エンドグリコシラーゼＥｎｄｏＨを使用し、過剰のグリカンを除去し、最終生成物のモノグリコシル化スパイクネイティブを生成した（図１ｂ）。精製ＳＭＧは、溶液中の見かけの分子量が約５２０ｋＤａで、高純度三量体である（図１ｃ及び図１ｄ）。Ｎ－グリカンの除去によるサイズの縮小は、通常のＳＦＧ及び中間体ＳＨＭと比較し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した（図１ｄ）。ＳＭＧの質量分析からは、ほとんどのＮ－グリコシル化部位は、ＧｌｃＮＡｃが９０％を超えるＮ６０３及びＮ１１９４を除き、ほぼ１００％の単糖、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含むことが示された（図１ｆ）。反対に、元の完全グリコシル化スパイクネイティブは、複合型、ハイブリッド型などを含むすべてのそのＮ－グリコシル化部位に異種性Ｎ－グリカンを有する。
元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株（ｈＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ／ＷＨ０１／２０１９）からの配列（アミノ酸１４～１２０９）を有する組換えネイティブは、ヒト細胞発現用に最適化されたコドンであり、元のフリン切断部位を置き換えるＧＳＡＧ（配列番号９）残基と、スパイクネイティブを融合前状態で固定する２個のプロリン変異を有し、そのＣ末端にフォルドン三量体化配列及びＨｉｓタグが付加され、ヒトＨＥＫ２９３Ｓ細胞で発現される（図１）。分岐記号で示した（図１ａ）すべてのＮ－グリカンがＭａｎ５ Ｎ－グリカンである、中間体高マンノース型スパイク組換えネイティブ（ＳＨＭ）が最初に得られ、精製した。次いで、エンドグリコシラーゼＥｎｄｏＨを使用し、過剰のグリカンを除去し、最終生成物のモノグリコシル化スパイクネイティブを生成した（図１ｂ）。精製ＳＭＧは、溶液中の見かけの分子量が約５２０ｋＤａで、高純度三量体である（図１ｃ及び図１ｄ）。Ｎ－グリカンの除去によるサイズの縮小は、通常のＳＦＧ及び中間体ＳＨＭと比較し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した（図１ｄ）。ＳＭＧの質量分析からは、ほとんどのＮ－グリコシル化部位は、ＧｌｃＮＡｃが９０％を超えるＮ６０３及びＮ１１９４を除き、ほぼ１００％の単糖、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含むことが示された（図１ｆ）。反対に、元の完全グリコシル化スパイクネイティブは、複合型、ハイブリッド型などを含むすべてのそのＮ－グリコシル化部位に異種性Ｎ－グリカンを有する。
【0086】
［実施例１５］ ＳＭＧワクチンはインビボでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びバリアントに対して優れた防御を提供する
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＳＭＧワクチンのインビボでの防御効果を評価するために、本発明者らは、まず、ＳＭＧ又はＳＦＧをワクチン接種したシリアンハムスターでＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原負荷を実施した（図２Ａ）。ＳＭＧをワクチン接種したハムスター（ｎ＝５）は、ＳＦＧ群及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）群と比較して体重の減少が少ないことが観察されたが（図２Ｂ）、ＳＦＧ及びＳＭＧの両方のワクチン接種した両ハムスターの肺で同様のウイルス力価が減少することが観察された（図２Ｃ）。さらに、組織病理学的染色及び抗ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質免疫染色データによると、免疫したハムスターの肺では病変がより少ないことが観察された（図２Ｄ）。ハムスターがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の際に軽度～中等度の病態しか示さなかったので、本発明者らは、その後、重症疾患モデルの高感受性ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２（Ｃ．－Ｙ． Ｔｓａｉ、Ｃ．－Ｙ． Ｃｈｅｎ、Ｊ．－Ｔ． Ｊａｎ、Ｙ．－Ｃ． Ｃｈｏｕ、Ｍ．－Ｌ． Ｃｈａｎｇ、Ｌ． Ａ． Ｌｕ、Ｐ．－Ｙ． Ｈｕａｎｇ、Ｍ． Ｆ． Ｃ． Ｃｈｕｌ、Ｔ．－Ｔ． Ｈｓｕ、Ｙ．－Ｐ． Ｈｓｕｅｈ、Ｓｅｘ－ｂｉａｓｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｄｅｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ、２０２１）又はＫ１８－ｈＡＣＥ２（Ｅ． Ｓ． Ｗｉｎｋｌｅｒ、Ａ． Ｌ． Ｂａｉｌｅｙ、Ｎ． Ｍ． Ｋａｆａｉ、Ｓ． Ｎａｉｒ、Ｂ． Ｔ． ＭｃＣｕｎｅ、Ｊ． Ｙｕ、Ｊ． Ｍ． Ｆｏｘ、Ｒ． Ｅ． Ｃｈｅｎ、Ｊ． Ｔ． Ｅａｒｎｅｓｔ、Ｓ． Ｐ． Ｋｅｅｌｅｒ、Ｊ． Ｈ． Ｒｉｔｔｅｒ、Ｌ．－Ｉ． Ｋａｎｇ、Ｓ． Ｄｏｒｔ、Ａ． Ｒｏｂｉｃｈａｕｄ、Ｒ． Ｈｅａｄ、Ｍ． Ｊ． Ｈｏｌｔｚｍａｎ、Ｍ． Ｓ． Ｄｉａｍｏｎｄ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｃａｕｓｅｓ ｓｅｖｅｒｅ ｌｕｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１、１３２７～１３３５頁（２０２０）トランスジェニックマウスを使用した（図２Ｅ）。ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２マウスにおける抗Ｓ ＩｇＧ結合力価、中和力価、抗ＳサブタイプＩｇＧ、及びＩｇＧ２ｃ：ＩｇＧ１比の分析（図２、Ｆ～Ｉ）は、すべてＢＡＬＢ／ｃマウス（図６、Ｃ～Ｇ）と同様の結果を示した。ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を経鼻的に抗原負荷した後、ウイルスは、感染後７日目の抗Ｎ染色（ｄｐｉ）（図２Ｊ）又は４ｄｐｉでの中央組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって（図Ｋ）、ＳＦＧ及びＳＭＧワクチン接種されたＣＡＧ－ｈＡＣＥ２マウス（ｎ＝３）の両肺で検出されなかったが、ＴＣＩＤ５０が１，０００を超えるウイルス力価が対照群で観察された（図２Ｋ）。ＳＭＧ群（ｎ＝４）は、１４ｄｐｉでＳＦＧ（５０％）よりも良好な生存率（７５％）を示した（図２、Ｌ及びＭ）。次いで、本発明者らは、ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２マウス（ｎ＝５）においてアルファバリアントによる抗原負荷に対するＳＭＧワクチン接種により付与された防御の程度を評価した。本発明者らは、ＳＭＧワクチン接種により１４ｄｐｉまで１００％の生存率が得られることを確認した（図２、Ｎ及びＯ）。またＳＭＧワクチン接種したマウスは、ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２マウス（ｎ＝５）のガンマバリアント抗原負荷で６０％の生存率を示し（図２２Ｐ及びＱ）、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスのデルタバリアント抗原負荷で７５％の生存率を示したが（ｎ＝４）（図４Ｒ及びＳ）、５０％未満のＳＦＧワクチン接種したマウスは、ガンマバリアント及びデルタバリアントの抗原負荷で１４ｄｐｉまで生存した（図２、Ｑ～Ｓ）。ＳＭＧワクチン接種によって付与されたインビボ防御における改善は、免疫原からグリカンシールドを除去することが優れた免疫応答を誘発する有利な戦略であるということのさらなる証拠を提供している。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＳＭＧワクチンのインビボでの防御効果を評価するために、本発明者らは、まず、ＳＭＧ又はＳＦＧをワクチン接種したシリアンハムスターでＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原負荷を実施した（図２Ａ）。ＳＭＧをワクチン接種したハムスター（ｎ＝５）は、ＳＦＧ群及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）群と比較して体重の減少が少ないことが観察されたが（図２Ｂ）、ＳＦＧ及びＳＭＧの両方のワクチン接種した両ハムスターの肺で同様のウイルス力価が減少することが観察された（図２Ｃ）。さらに、組織病理学的染色及び抗ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質免疫染色データによると、免疫したハムスターの肺では病変がより少ないことが観察された（図２Ｄ）。ハムスターがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の際に軽度～中等度の病態しか示さなかったので、本発明者らは、その後、重症疾患モデルの高感受性ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２（Ｃ．－Ｙ． Ｔｓａｉ、Ｃ．－Ｙ． Ｃｈｅｎ、Ｊ．－Ｔ． Ｊａｎ、Ｙ．－Ｃ． Ｃｈｏｕ、Ｍ．－Ｌ． Ｃｈａｎｇ、Ｌ． Ａ． Ｌｕ、Ｐ．－Ｙ． Ｈｕａｎｇ、Ｍ． Ｆ． Ｃ． Ｃｈｕｌ、Ｔ．－Ｔ． Ｈｓｕ、Ｙ．－Ｐ． Ｈｓｕｅｈ、Ｓｅｘ－ｂｉａｓｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｄｅｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ、２０２１）又はＫ１８－ｈＡＣＥ２（Ｅ． Ｓ． Ｗｉｎｋｌｅｒ、Ａ． Ｌ． Ｂａｉｌｅｙ、Ｎ． Ｍ． Ｋａｆａｉ、Ｓ． Ｎａｉｒ、Ｂ． Ｔ． ＭｃＣｕｎｅ、Ｊ． Ｙｕ、Ｊ． Ｍ． Ｆｏｘ、Ｒ． Ｅ． Ｃｈｅｎ、Ｊ． Ｔ． Ｅａｒｎｅｓｔ、Ｓ． Ｐ． Ｋｅｅｌｅｒ、Ｊ． Ｈ． Ｒｉｔｔｅｒ、Ｌ．－Ｉ． Ｋａｎｇ、Ｓ． Ｄｏｒｔ、Ａ． Ｒｏｂｉｃｈａｕｄ、Ｒ． Ｈｅａｄ、Ｍ． Ｊ． Ｈｏｌｔｚｍａｎ、Ｍ． Ｓ． Ｄｉａｍｏｎｄ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｃａｕｓｅｓ ｓｅｖｅｒｅ ｌｕｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１、１３２７～１３３５頁（２０２０）トランスジェニックマウスを使用した（図２Ｅ）。ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２マウスにおける抗Ｓ ＩｇＧ結合力価、中和力価、抗ＳサブタイプＩｇＧ、及びＩｇＧ２ｃ：ＩｇＧ１比の分析（図２、Ｆ～Ｉ）は、すべてＢＡＬＢ／ｃマウス（図６、Ｃ～Ｇ）と同様の結果を示した。ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を経鼻的に抗原負荷した後、ウイルスは、感染後７日目の抗Ｎ染色（ｄｐｉ）（図２Ｊ）又は４ｄｐｉでの中央組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって（図Ｋ）、ＳＦＧ及びＳＭＧワクチン接種されたＣＡＧ－ｈＡＣＥ２マウス（ｎ＝３）の両肺で検出されなかったが、ＴＣＩＤ５０が１，０００を超えるウイルス力価が対照群で観察された（図２Ｋ）。ＳＭＧ群（ｎ＝４）は、１４ｄｐｉでＳＦＧ（５０％）よりも良好な生存率（７５％）を示した（図２、Ｌ及びＭ）。次いで、本発明者らは、ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２マウス（ｎ＝５）においてアルファバリアントによる抗原負荷に対するＳＭＧワクチン接種により付与された防御の程度を評価した。本発明者らは、ＳＭＧワクチン接種により１４ｄｐｉまで１００％の生存率が得られることを確認した（図２、Ｎ及びＯ）。またＳＭＧワクチン接種したマウスは、ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２マウス（ｎ＝５）のガンマバリアント抗原負荷で６０％の生存率を示し（図２２Ｐ及びＱ）、Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスのデルタバリアント抗原負荷で７５％の生存率を示したが（ｎ＝４）（図４Ｒ及びＳ）、５０％未満のＳＦＧワクチン接種したマウスは、ガンマバリアント及びデルタバリアントの抗原負荷で１４ｄｐｉまで生存した（図２、Ｑ～Ｓ）。ＳＭＧワクチン接種によって付与されたインビボ防御における改善は、免疫原からグリカンシールドを除去することが優れた免疫応答を誘発する有利な戦略であるということのさらなる証拠を提供している。
【0087】
［実施例１６］ ＳＭＧワクチン接種はトランスジェニックｈＡＣＥ２マウスにおいて致死量ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対してより良好な防御を提供する
ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した場合、重篤な疾患を発症し、死亡し得る。ＳＦＧ、ＳＭＧのワクチン、又はアジュバントのみを０日目及び１４日目に筋肉内に２回投与し、２８日目及び４２日目に血清を採取し、１×１０３ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を使用し、各マウスに経鼻的に感染させた（図３ａ）。ＳＭＧ免疫したマウスのスパイク特異的抗体ＩｇＧ力価は、ＳＦＧ群よりも１．９倍高く（４０，０００対２０，０００）、ＳＭＧの中和力価は、ＳＦＧ群よりも２．８倍高い（図３ｂ及び図３ｃ）。驚いたことに、この重症疾患モデルにおいては、体重の急速な減少及びウイルス感染後７日目までにすべてのモデルが死亡したことからわかるように、ＳＦＧワクチン接種はＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスを重症疾患から防御することはできなかった。ＳＦＧワクチン接種群の疾患進行は、アジュバントのみの群よりもわずかに良好であった（図３ｄ及び図３ｅ）。反対に、ＳＭＧワクチン接種した群は、わずかな体重減少を示し、すべてがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染で生存する。この結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２重症疾患トランスジェニックマウスモデルにおけるＳＭＧワクチン接種の優位性を示している。
ＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した場合、重篤な疾患を発症し、死亡し得る。ＳＦＧ、ＳＭＧのワクチン、又はアジュバントのみを０日目及び１４日目に筋肉内に２回投与し、２８日目及び４２日目に血清を採取し、１×１０３ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を使用し、各マウスに経鼻的に感染させた（図３ａ）。ＳＭＧ免疫したマウスのスパイク特異的抗体ＩｇＧ力価は、ＳＦＧ群よりも１．９倍高く（４０，０００対２０，０００）、ＳＭＧの中和力価は、ＳＦＧ群よりも２．８倍高い（図３ｂ及び図３ｃ）。驚いたことに、この重症疾患モデルにおいては、体重の急速な減少及びウイルス感染後７日目までにすべてのモデルが死亡したことからわかるように、ＳＦＧワクチン接種はＣＡＧ－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスを重症疾患から防御することはできなかった。ＳＦＧワクチン接種群の疾患進行は、アジュバントのみの群よりもわずかに良好であった（図３ｄ及び図３ｅ）。反対に、ＳＭＧワクチン接種した群は、わずかな体重減少を示し、すべてがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染で生存する。この結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２重症疾患トランスジェニックマウスモデルにおけるＳＭＧワクチン接種の優位性を示している。
【0088】
［実施例１７］ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する結合及び中和の幅及び効力を増強するためにマウスにおいてＳＭＧワクチンにより誘導された抗体
次いで、本発明者らは、懸念される新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを中和する能力に関して、武漢株由来のスパイクネイティブ配列を有するＳＦＧ又はＳＭＧのいずれかのワクチン接種から誘発される抗体応答に差異があるかどうかを分析した（図４）。ＳＦＧと比較して、ＳＭＧ免疫化は、ＷＴ（武漢株）由来のスパイクネイティブだけでなく、バリアントＤ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、ｂａｔ ＣｏＶ ＲｎＧＴ１３、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１にも結合する優れたスパイク特異的抗体ＩｇＧを誘発した（図４ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのシュードウイルスを使用し、ワクチンで免疫した血清から感染を中和する能力を測定した。繰り返すと、ＳＭＧ免疫からの血清は、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７、及びＢ．１．３５１のシュードウイルスに対して優れた中和能力を持ち、それぞれ、ＳＦＧ誘導血清よりも１．４倍、２．７倍、及び１．５倍優れている（図４ｃ及び図４ｄ）。最後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２実在ウイルスＤ６１４Ｇ及びＢ．１．１．７をプラーク減少中和アッセイで使用した（図４ｅ及び図４ｆ）。ＳＭＧワクチン接種は、ＳＦＧワクチン接種と比較して、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．１．７バリアントに対する良好な中和抗体応答を誘発し、それぞれ２．０倍及び１．４倍良好である。
次いで、本発明者らは、懸念される新たに出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを中和する能力に関して、武漢株由来のスパイクネイティブ配列を有するＳＦＧ又はＳＭＧのいずれかのワクチン接種から誘発される抗体応答に差異があるかどうかを分析した（図４）。ＳＦＧと比較して、ＳＭＧ免疫化は、ＷＴ（武漢株）由来のスパイクネイティブだけでなく、バリアントＤ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、ｂａｔ ＣｏＶ ＲｎＧＴ１３、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１にも結合する優れたスパイク特異的抗体ＩｇＧを誘発した（図４ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのシュードウイルスを使用し、ワクチンで免疫した血清から感染を中和する能力を測定した。繰り返すと、ＳＭＧ免疫からの血清は、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７、及びＢ．１．３５１のシュードウイルスに対して優れた中和能力を持ち、それぞれ、ＳＦＧ誘導血清よりも１．４倍、２．７倍、及び１．５倍優れている（図４ｃ及び図４ｄ）。最後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２実在ウイルスＤ６１４Ｇ及びＢ．１．１．７をプラーク減少中和アッセイで使用した（図４ｅ及び図４ｆ）。ＳＭＧワクチン接種は、ＳＦＧワクチン接種と比較して、Ｄ６１４Ｇ及びＢ．１．１．７バリアントに対する良好な中和抗体応答を誘発し、それぞれ２．０倍及び１．４倍良好である。
【0089】
［実施例１８］ グリコシル化はいくつかの細胞型上のＡＣＥ２と相互作用するシュードウイルスＳタンパク質に影響する
グリコシル化の重要性を理解するため、本発明者らは、感染の主要細胞である肺上皮細胞からＳタンパク質を発現させ、Ｓタンパク質のシアリル化が受容体への高いアビディティに必要であることを見出した（図５Ａ）。同様のパターンは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で生成されたＳタンパク質でも観察され（図５Ｂ）、アビディティはまた、高マンノース型グリカンのみを含むＳタンパク質の場合に、又はすべてのＮ－グリカンが単一Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にトリミングされたグリコフォームの形態で低下した（図５Ｃ）。そのグリコシル化の影響を、ヒトアンギオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのシュードウイルス感染によりさらに試験し、同量のウイルスが適用された場合、一貫した傾向が見られた（図５Ｄ）。このことから、複合型グリカン及びシアリル化がＳタンパク質媒介型の感染力にとって機能的に重要であると結論付けることができた。ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ－Ｅ６、並びに３つのヒト肺細胞株、Ａ５４９細胞、Ｃａｌｕ－１細胞、及びＣａｌｕ－３細胞を含む５つのｈＡＣＥ２発現細胞株におけるウイルス侵入効率を評価するため、２４種のレンチウイルスベースのシュードウイルスバリアント（２２種のＮ－グリコサイト及び２種のＯ－グリコサイトを含む）の完全なパネルも作製した（図５、Ｅ～Ｇ）。これらのシュードウイルスは、Ｃ末端の１９アミノ酸が欠失したＳ構築物をベースにしており、最も高いウイルス力価を示した。シュードウイルス産生をｐ２４イムノアッセイにより定量し、結果を各変異株の力価に対して正規化した（図５Ｆ）。Ｎ－グリコサイトのアスパラギン（Ａｓｎ）をすべてグルタミン（Ｇｌｎ）に置換し、それらの化学的な類似性という理由によって構造への影響を最小限にし、各Ｏ－グリコサイトスレオニン（Ｔｈｒ）又はセリン（Ｓｒｎ）はアラニン（Ａｌａ）に置換した。変異誘発によってアミノ酸が変化したので、結果として生じる感染力の変化は、受容体結合に影響を及ぼすグリコシル化関連の構造シフト、並びにタンパク質の発現、フォールディング、輸送により影響を受けるＳタンパク質の表面存在量を含む、複合的要因から生じる。結果から、Ｓタンパク質グリコシル化の破壊により感染力が低下することが明らかであった。受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の２つの変異、Ｎ３３１Ｑ及びＮ３４３Ｑ、並びに２つのＯ－グリコサイトの変異（Ｔ３２３Ａ及びＳ３２５Ａ）での実質的な低下が、後者の占有率が低いにもかかわらず、観察された（図５Ｇ）。さらに、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）のＮ１２２グリコシル化の欠失により、感染力が低下し、タンパク質発現が低下した（図５Ｇ）。２つのＮＴＤ変異、Ｎ１４９Ｑ及びＮ１６５Ｑは、それぞれ、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞及びＣａｌｕ－１細胞で感染力を増加したが、他の細胞では感染力の低下が観察された（図５Ｇ）。このＮ１６５残基に結合したグリカンは、三量体Ｓタンパク質において隣接するＲＢＤに構造的に近位にあり、おそらくＲＢＤの「ダウン」状態への構造シフトへの理由によって、その変異がＡＣＥ２結合を低下させることに留意されたい。本発明者らは、５つの細胞すべてでウイルス感染力を普遍的に消失させた、Ｎ８０１Ｑ及びＮ１１９４Ｑの２つの変異体を同定した（図５Ｆ）。グリコサイトＮ８０１は融合ペプチド近位領域（ＦＰＰＲ）近くに位置しており、Ｎ１１９４はヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ヘリックスの中心近くにあり、膜貫通ドメインに先行する最後のＮ－グリコサイトである（図５Ｅ）。これらの変異体は、両方とも低収量発現を引き起こした。Ｎ８０１Ｑ変異体はより分解されやすく、Ｎ１１９４Ｑ変異体はＳタンパク質の三量体化を阻害し、これらの変異を持つシュードウイルスによる感染力の低下を説明する一因であり得る。
グリコシル化の重要性を理解するため、本発明者らは、感染の主要細胞である肺上皮細胞からＳタンパク質を発現させ、Ｓタンパク質のシアリル化が受容体への高いアビディティに必要であることを見出した（図５Ａ）。同様のパターンは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で生成されたＳタンパク質でも観察され（図５Ｂ）、アビディティはまた、高マンノース型グリカンのみを含むＳタンパク質の場合に、又はすべてのＮ－グリカンが単一Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にトリミングされたグリコフォームの形態で低下した（図５Ｃ）。そのグリコシル化の影響を、ヒトアンギオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのシュードウイルス感染によりさらに試験し、同量のウイルスが適用された場合、一貫した傾向が見られた（図５Ｄ）。このことから、複合型グリカン及びシアリル化がＳタンパク質媒介型の感染力にとって機能的に重要であると結論付けることができた。ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ－Ｅ６、並びに３つのヒト肺細胞株、Ａ５４９細胞、Ｃａｌｕ－１細胞、及びＣａｌｕ－３細胞を含む５つのｈＡＣＥ２発現細胞株におけるウイルス侵入効率を評価するため、２４種のレンチウイルスベースのシュードウイルスバリアント（２２種のＮ－グリコサイト及び２種のＯ－グリコサイトを含む）の完全なパネルも作製した（図５、Ｅ～Ｇ）。これらのシュードウイルスは、Ｃ末端の１９アミノ酸が欠失したＳ構築物をベースにしており、最も高いウイルス力価を示した。シュードウイルス産生をｐ２４イムノアッセイにより定量し、結果を各変異株の力価に対して正規化した（図５Ｆ）。Ｎ－グリコサイトのアスパラギン（Ａｓｎ）をすべてグルタミン（Ｇｌｎ）に置換し、それらの化学的な類似性という理由によって構造への影響を最小限にし、各Ｏ－グリコサイトスレオニン（Ｔｈｒ）又はセリン（Ｓｒｎ）はアラニン（Ａｌａ）に置換した。変異誘発によってアミノ酸が変化したので、結果として生じる感染力の変化は、受容体結合に影響を及ぼすグリコシル化関連の構造シフト、並びにタンパク質の発現、フォールディング、輸送により影響を受けるＳタンパク質の表面存在量を含む、複合的要因から生じる。結果から、Ｓタンパク質グリコシル化の破壊により感染力が低下することが明らかであった。受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の２つの変異、Ｎ３３１Ｑ及びＮ３４３Ｑ、並びに２つのＯ－グリコサイトの変異（Ｔ３２３Ａ及びＳ３２５Ａ）での実質的な低下が、後者の占有率が低いにもかかわらず、観察された（図５Ｇ）。さらに、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）のＮ１２２グリコシル化の欠失により、感染力が低下し、タンパク質発現が低下した（図５Ｇ）。２つのＮＴＤ変異、Ｎ１４９Ｑ及びＮ１６５Ｑは、それぞれ、Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞及びＣａｌｕ－１細胞で感染力を増加したが、他の細胞では感染力の低下が観察された（図５Ｇ）。このＮ１６５残基に結合したグリカンは、三量体Ｓタンパク質において隣接するＲＢＤに構造的に近位にあり、おそらくＲＢＤの「ダウン」状態への構造シフトへの理由によって、その変異がＡＣＥ２結合を低下させることに留意されたい。本発明者らは、５つの細胞すべてでウイルス感染力を普遍的に消失させた、Ｎ８０１Ｑ及びＮ１１９４Ｑの２つの変異体を同定した（図５Ｆ）。グリコサイトＮ８０１は融合ペプチド近位領域（ＦＰＰＲ）近くに位置しており、Ｎ１１９４はヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ヘリックスの中心近くにあり、膜貫通ドメインに先行する最後のＮ－グリコサイトである（図５Ｅ）。これらの変異体は、両方とも低収量発現を引き起こした。Ｎ８０１Ｑ変異体はより分解されやすく、Ｎ１１９４Ｑ変異体はＳタンパク質の三量体化を阻害し、これらの変異を持つシュードウイルスによる感染力の低下を説明する一因であり得る。
【0090】
［実施例１９］ 肺上皮細胞由来のＳタンパク質は、より多くのシアリル化複合型グリカンを含み、Ｓタンパク質中の高度に保存されたエピトープはグリカンによって大部分がシールドされている
Ｓタンパク質のグリカンのプロファイル分析の結果、ヒト腎臓上皮細胞株ＨＥＫ２９３Ｔで産生されるＳタンパク質（それぞれ、６１％及び２３％）と比較して（図６Ｂ）、ヒト肺上皮細胞株ＢＥＡＳ－２Ｂでは、Ｓタンパク質の複合型グリカンがより多く生成され（７８％）、ハイブリッド型グリカンの生成は少なかった（１％未満）（図６Ａ）。高マンノース型グリカンのうち、Ｎ－結合型マンノース－５グリカン（ｍａｎ５）は、ＨＥＫ２９３Ｔ発現Ｓタンパク質全体に見られる優勢な種類であったが、ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞のＮ６１部位にのみ見られた。さらに、ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞のＮ７４、Ｎ１４９、Ｎ２８２、及びＮ１１９４部位の複合型グリカンは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものよりも多様に処理された（複数のアンテナ、ガラクトシル化、フコシル化、又はシアリル化）。反対に、Ｎ１２２、Ｎ３３１、Ｎ１０９８、及びＮ１１３４の部位のグリカンは、それほど多様ではなかった。さらに、Ｎ１４９及びＮ１７は、コアフコースをＢＥＡＳ－２Ｂで有していなかった。本発明者らは、ＢＥＡＳ－２Ｂの２２種のＮ－グリコサイトすべてでのシアリル化（５３％）が、ＨＥＫ２９３Ｔ（３５％）、ＨＥＫ２９３Ｅ（２６％）、又は以前に報告されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（１５％）（Ｙ． Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｊ． Ｄ． Ａｌｌｅｎ、Ｄ． Ｗｒａｐｐ、Ｊ． Ｓ． ＭｃＬｅｌｌａｎ、Ｍ． Ｃｒｉｓｐｉｎ、Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９、３３０～３３３頁（２０２０））のシアリル化よりも全体的に高程度であることを観察した。特に、ＲＢＤの２つのＮ－グリコサイト（Ｎ３３１及びＮ３４３）は、ＨＥＫ２９３Ｔ（４９％及び１５％）よりも、ＢＥＡＳ－２Ｂ（９９％及び３９％）でよりシアリル化されている。違いはあるものの、すべての細胞型のＳタンパク質は、Ｓ２ドメインの中央部分付近に位置する非複合型グリカンベルトを含み（図６Ｃ）、ここで、Ｎ－グリコサイトＮ８０１は感染において重要であり（図５Ｇ）、Ｎ１０７４は多様なグリカンを含み、Ｎ７１７はＳタンパク質発現に必須である。
Ｓタンパク質のグリカンのプロファイル分析の結果、ヒト腎臓上皮細胞株ＨＥＫ２９３Ｔで産生されるＳタンパク質（それぞれ、６１％及び２３％）と比較して（図６Ｂ）、ヒト肺上皮細胞株ＢＥＡＳ－２Ｂでは、Ｓタンパク質の複合型グリカンがより多く生成され（７８％）、ハイブリッド型グリカンの生成は少なかった（１％未満）（図６Ａ）。高マンノース型グリカンのうち、Ｎ－結合型マンノース－５グリカン（ｍａｎ５）は、ＨＥＫ２９３Ｔ発現Ｓタンパク質全体に見られる優勢な種類であったが、ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞のＮ６１部位にのみ見られた。さらに、ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞のＮ７４、Ｎ１４９、Ｎ２８２、及びＮ１１９４部位の複合型グリカンは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のものよりも多様に処理された（複数のアンテナ、ガラクトシル化、フコシル化、又はシアリル化）。反対に、Ｎ１２２、Ｎ３３１、Ｎ１０９８、及びＮ１１３４の部位のグリカンは、それほど多様ではなかった。さらに、Ｎ１４９及びＮ１７は、コアフコースをＢＥＡＳ－２Ｂで有していなかった。本発明者らは、ＢＥＡＳ－２Ｂの２２種のＮ－グリコサイトすべてでのシアリル化（５３％）が、ＨＥＫ２９３Ｔ（３５％）、ＨＥＫ２９３Ｅ（２６％）、又は以前に報告されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（１５％）（Ｙ． Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｊ． Ｄ． Ａｌｌｅｎ、Ｄ． Ｗｒａｐｐ、Ｊ． Ｓ． ＭｃＬｅｌｌａｎ、Ｍ． Ｃｒｉｓｐｉｎ、Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９、３３０～３３３頁（２０２０））のシアリル化よりも全体的に高程度であることを観察した。特に、ＲＢＤの２つのＮ－グリコサイト（Ｎ３３１及びＮ３４３）は、ＨＥＫ２９３Ｔ（４９％及び１５％）よりも、ＢＥＡＳ－２Ｂ（９９％及び３９％）でよりシアリル化されている。違いはあるものの、すべての細胞型のＳタンパク質は、Ｓ２ドメインの中央部分付近に位置する非複合型グリカンベルトを含み（図６Ｃ）、ここで、Ｎ－グリコサイトＮ８０１は感染において重要であり（図５Ｇ）、Ｎ１０７４は多様なグリカンを含み、Ｎ７１７はＳタンパク質発現に必須である。
【0091】
モデル化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質構造とＢＥＡＳ－２Ｂ細胞からのグリカンのプロファイルから、本発明者らは、タンパク質表面領域上のグリカンカバレッジの構造解析を行い、１，１１７，４７４個のＳタンパク質配列を使用してマルチプルアラインメント結果を重ね合わせた（Ｓ． Ｅｌｂｅ、Ｇ． Ｂｕｃｋｌａｎｄ－Ｍｅｒｒｅｔｔ， Ｄａｔａ， ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｄｉｐｌｏｍａｃｙ： ＧＩＳＡＩＤ’ｓ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｇｌｏｂａｌ ｈｅａｌｔｈ． Ｇｌｏｂａｌ Ｃｈａｌｌ．１、３３～４６頁（２０１７））。ＲＢＤの下部側面、非複合型グリカンベルトを含むＳ２ステム領域、並びに接続ドメイン（ＣＤ）及びＨＲ２が関与するＳ２のＣ末端部分を含む、高度に保存されているがグリカンによってシールドされている、いくつかの領域が明らかになった（図６、Ｄ及びＥ）。一次配列レベルでは、これらの領域は保存されたエピトープとして示された。配列保存分析はまた、ほとんどのグリコサイト領域が高度に保存されていることを示し、最も保存されているもの（変異率が０．０２％未満）には、ＮＴＤ（Ｎ６１、Ｎ１２２、Ｎ１６５、及びＮ２３４）、ＲＢＤ（Ｓ３２５、Ｎ３３１、及びＮ３４３）、サブドメイン１／２（ＳＤ１／２）（Ｎ６０３及びＮ６５７）、サブユニット２（Ｓ２）のステム領域（Ｎ７０９、Ｎ１０９８、Ｎ１１３４、Ｎ１１５８、Ｎ１１７３、及びＮ１１９４）、並びにＦＰＰＲ近くのＮ８０１のものが含まれていた。これらの領域のほとんどは、約２０～４０％の保存された表面残基を含み、そのうち、ＲＢＤでは３６％、他の領域では約５０％の、ある一定の割合の残基がグリカンによってシールドされていた。Ｎ－グリコサイトを有していないが、ＨＲ１領域は、隣接するドメインに由来するグリカンによって覆われている６９％の保存された表面残基を有していた。これらの結果から、構造的にも進化的にもＳタンパク質グリコシル化の重要性が強調され、グリカンでシールドされた保存領域の露出により、保存されたエピトープに対する免疫応答が誘発される可能性があるという考えが得られた。（１２個の保存されたエピトープをワクチンの標的として説明することがより重要である。１２個のエピトープのうち１０個はグリカンによってシールドされている。シールドされたグリカンを除去することにより、保存されたエピトープが露出し、広範な防御反応が誘発される。）
【0092】
［実施例２０］ ＳＭＧはワクチンとして開発され、ＳＭＧワクチンは異なる抗体サブクラスを使用してより良好な免疫応答を誘発した
複数のグリコサイトを変異させる本発明者らの最初の試みは、Ｓタンパク質の発現を著しく低下させるに至った。しかし、本発明者らがＧｎＴＩ ＨＥＫ２９３Ｓ細胞からそれを発現させた場合、高マンノース型グリコフォームＳタンパク質（ＳＨＭ）を良好な収率及び純度で生成することができた。次いで、本発明者らはエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）を使用してグリカンを各Ｎ－グリコサイトで単一ＧｌｃＮＡｃにトリミングし、本発明者がＳＭＧと称する可溶性トリマーモノ－ＧｌｃＮＡｃ修飾Ｓタンパク質を生成した（図７Ａ）。ＳＭＧは、質量分析により、すべてのＮ－グリコサイトが単一ＧｌｃＮＡｃでほとんど占有されていることが確認され、未処理のＯ－グリカンの占有率は低すぎて検出されなかった。この改変ＳＭＧ、ＳＨＭ、及び元の完全グリコシル化Ｓタンパク質（ＳＦＧ）を、アジュバントとして水酸化アルミニウム（ミョウバン）と混合し、次いで、筋肉内注射によりＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を免疫するために使用した（図７Ｂ）。この研究で比較に使用したＳＦＧは、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞により発現され、多様なグリカンを含んでいた。これは、Ｓａｎｏｆｉ社及びＮｏｖａｖａｘ社の昆虫細胞発現Ｓタンパク質ワクチン（Ｐ． Ｊ． Ｋｌａｓｓｅ、Ｄ． Ｆ． Ｎｉｘｏｎ、Ｊ． Ｐ． Ｍｏｏｒｅ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ． Ｓｃｉ． Ａｄｖ．７、ｅａｂｅ８０６５（２０２１））、Ｍｅｄｉｇｅｎ社のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発現組換えＳワクチン（Ｔ．－Ｙ． Ｋｕｏ、Ｍ．－Ｙ． Ｌｉｎ、Ｒ． Ｌ． Ｃｏｆｆｍａｎ、Ｊ． Ｄ． Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｐ． Ｔｒａｑｕｉｎａ、Ｙ．－Ｊ． Ｌｉｎ、Ｌ． Ｔ．－Ｃ． Ｌｉｕ、Ｊ． Ｃｈｅｎｇ、Ｙ．－Ｃ． Ｗｕ、Ｃ．－Ｃ． Ｗｕ、Ｗ．－Ｈ． Ｔａｎｇ、Ｃ．－Ｇ． Ｈｕａｎｇ、Ｋ．－Ｃ． Ｔｓａｏ、Ｃ． Ｃｈｅｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＣｐＧ－ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｓｔａｂｌｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｓ ａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ＣＯＶＩＤ－１９．Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．１０、２００８５（２０２０））、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ社及びＪｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ社のアデノウイルスベースのワクチン、並びにＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ社及びＭｏｄｅｒｎａ社のｍＲＮＡワクチン（Ｐ． Ｊ． Ｋｌａｓｓｅ、Ｄ． Ｆ． Ｎｉｘｏｎ、Ｊ． Ｐ． Ｍｏｏｒｅ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ． Ｓｃｉ． Ａｄｖ．７、ｅａｂｅ８０６５（２０２１））を含めた、承認済み又は臨床試験中の多くの現行のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンで使用されている免疫原に似ている。ＳＦＧタンパク質及びＳＭＧタンパク質の両方とも、ネガティブ染色分析により、溶液中で本質的に同じ三量体構造を示す。
複数のグリコサイトを変異させる本発明者らの最初の試みは、Ｓタンパク質の発現を著しく低下させるに至った。しかし、本発明者らがＧｎＴＩ ＨＥＫ２９３Ｓ細胞からそれを発現させた場合、高マンノース型グリコフォームＳタンパク質（ＳＨＭ）を良好な収率及び純度で生成することができた。次いで、本発明者らはエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）を使用してグリカンを各Ｎ－グリコサイトで単一ＧｌｃＮＡｃにトリミングし、本発明者がＳＭＧと称する可溶性トリマーモノ－ＧｌｃＮＡｃ修飾Ｓタンパク質を生成した（図７Ａ）。ＳＭＧは、質量分析により、すべてのＮ－グリコサイトが単一ＧｌｃＮＡｃでほとんど占有されていることが確認され、未処理のＯ－グリカンの占有率は低すぎて検出されなかった。この改変ＳＭＧ、ＳＨＭ、及び元の完全グリコシル化Ｓタンパク質（ＳＦＧ）を、アジュバントとして水酸化アルミニウム（ミョウバン）と混合し、次いで、筋肉内注射によりＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を免疫するために使用した（図７Ｂ）。この研究で比較に使用したＳＦＧは、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞により発現され、多様なグリカンを含んでいた。これは、Ｓａｎｏｆｉ社及びＮｏｖａｖａｘ社の昆虫細胞発現Ｓタンパク質ワクチン（Ｐ． Ｊ． Ｋｌａｓｓｅ、Ｄ． Ｆ． Ｎｉｘｏｎ、Ｊ． Ｐ． Ｍｏｏｒｅ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ． Ｓｃｉ． Ａｄｖ．７、ｅａｂｅ８０６５（２０２１））、Ｍｅｄｉｇｅｎ社のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞発現組換えＳワクチン（Ｔ．－Ｙ． Ｋｕｏ、Ｍ．－Ｙ． Ｌｉｎ、Ｒ． Ｌ． Ｃｏｆｆｍａｎ、Ｊ． Ｄ． Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｐ． Ｔｒａｑｕｉｎａ、Ｙ．－Ｊ． Ｌｉｎ、Ｌ． Ｔ．－Ｃ． Ｌｉｕ、Ｊ． Ｃｈｅｎｇ、Ｙ．－Ｃ． Ｗｕ、Ｃ．－Ｃ． Ｗｕ、Ｗ．－Ｈ． Ｔａｎｇ、Ｃ．－Ｇ． Ｈｕａｎｇ、Ｋ．－Ｃ． Ｔｓａｏ、Ｃ． Ｃｈｅｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＣｐＧ－ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｓｔａｂｌｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｓ ａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ＣＯＶＩＤ－１９．Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．１０、２００８５（２０２０））、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ社及びＪｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ社のアデノウイルスベースのワクチン、並びにＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ社及びＭｏｄｅｒｎａ社のｍＲＮＡワクチン（Ｐ． Ｊ． Ｋｌａｓｓｅ、Ｄ． Ｆ． Ｎｉｘｏｎ、Ｊ． Ｐ． Ｍｏｏｒｅ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ． Ｓｃｉ． Ａｄｖ．７、ｅａｂｅ８０６５（２０２１））を含めた、承認済み又は臨床試験中の多くの現行のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンで使用されている免疫原に似ている。ＳＦＧタンパク質及びＳＭＧタンパク質の両方とも、ネガティブ染色分析により、溶液中で本質的に同じ三量体構造を示す。
【0093】
ＳＭＧで免疫したマウスは、ＳＦＧと比較して、１．４４倍の有意に高いＳタンパク質に対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）力価で（エンドポイント力価：ＳＦＧ、３９，４０８±１，６１９；ＳＭＧ、５６，９５７±５，０９１；Ｐ＝０．００７９）（図７Ｃ）、また３．６倍の強いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードウイルス感染の阻害に基づいた抗体中和効力で（半値逆数中和力価ｐＮＴ５０：ＳＦＧ、１３４６±２８５；ＳＭＧ、４７９１±７６７；Ｐ＝０．０１５９）（図６Ｄ）で、２回目の免疫後に優れた体液性免疫応答が誘導され、一方、ＳＨＭ免疫群は、ＳＦＧ群と比較して、同様の抗Ｓ ＩｇＧ力価（３９，０８６±１１，６５４）を示し、ｐＮＴ５０力価に差はなかった。ＩｇＧサブタイプ力価及び濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞によるインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）又はインターロイキン－４（ＩＬ－４）産生の分析から、ＳＭＧワクチンは、ＳＦＧ及びＳＨＭワクチン接種群と比較して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＴヘルパー１細胞（ＴＨ１）リンパ球のマーカーであるＩｇＧ２ａをより多く誘導し、よりバランスのとれたＴＨ１／ＴＨ２応答を誘導し、より多くのＩＦＮ－γ発現Ｔｆｈ細胞を誘導したことが確認された（図７、Ｅ～Ｊ）。さらに、ＳＭＧワクチンは、より高頻度のＩＬ－２１＋Ｔｆｈ細胞を誘導し（図７Ｋ）、グランザイムＢ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の上昇を誘導した（図７Ｌ）。これらのデータにより、ＳＦＧによって誘導されるものと比較して、より強力な体液性及び細胞性適応免疫応答がＳＭＧによって誘発されることが示唆された。次いで、本発明者らは、ＳＦＧ又はＳＭＧの３回目投与後に免疫されたマウスの脾臓から得たＳタンパク質特異的Ｂ細胞（ＣＤ３－ＣＤ１９＋Ｓ＋）の頻度を試験したところ（図６Ａ）、ＳＭＧで免疫したマウスは、より多くのＳタンパク質特異的Ｂ細胞を生成することが確認された（図６Ｍ）。ＳＦＧで免疫したマウス及びＳＭＧで免疫したマウス（ｎ＝５）からのＢ細胞レパートリー分析からは、ＳＦＧ群におけるものと比較して、ＳＭＧ群ではより多くのラムダ軽鎖遺伝子が使用されたことが示された（ＳＦＧ、１．９２％；ＳＭＧ、９．６８％）（図７Ｎ）。さらに、Ｉｇ重鎖可変領域（ＩＧＨＶ）（図７Ｏ）及びＩｇカッパ鎖可変領域（ＩＧＫＶ）遺伝子（図７Ｐ）、特にＩＧＨＶ１－１８遺伝子（図７Ｏ）のいくつかの特定の遺伝子座に由来する抗体は、ＳＦＧ群よりもＳＭＧ群においてより多く示された。この発見は、Ｂ細胞エピトープがこれら２つの群において異なってプロセッシングされる可能性があることを示唆しており、この違いが免疫学的に有益であるかどうか、またなぜそうであるのかについてさらに調査する必要がある。さらに、３回ＳＭＧワクチン接種は、野生型（ＷＴ）Ｓタンパク質に対する２回ワクチン接種よりも高いエンドポイント力価ＩｇＧを誘発した（エンドポイント力価：ＳＦＧ、２０８，９１１±５０，０９２；ＳＭＧ、３７６，４１０±８０，８７３）。本発明者らは、アルファ（Ｂ．１．１．７；Ｐ＝０．０４８８）、ベータ（Ｂ．１．３５１；Ｐ＝０．００１０）、ガンマ（Ｐ．１；Ｐ＝０．００６８）、及びデルタ（Ｂ．１．６１７．２；Ｐ＝０．００６８）を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＯＣ由来のＳタンパク質に対する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した血清ＩｇＧ結合曲線において、ＳＭＧ群とＳＦＧ群の間の差異を観察したが（Ｐ． Ｒ． Ｋｒａｕｓｅ、Ｔ． Ｒ． Ｆｌｅｍｉｎｇ、Ｉ． Ｍ． Ｌｏｎｇｉｎｉ、Ｒ． Ｐｅｔｏ、Ｓ． Ｂｒｉａｎｄ、Ｄ． Ｌ． Ｈｅｙｍａｎｎ、Ｖ． Ｂｅｒａｌ、Ｍ． Ｄ． Ｓｎａｐｅ、Ｈ． Ｒｅｅｓ、Ａ．－Ｍ． Ｒｏｐｅｒｏ、Ｒ． Ｄ． Ｂａｌｉｃｅｒ、Ｊ． Ｐ． Ｃｒａｍｅｒ、Ｃ． Ｍｕｎｏｚ－Ｆｏｎｔｅｌａ、Ｍ． Ｇｒｕｂｅｒ、Ｒ． Ｇａｓｐａｒ、Ｊ． Ａ． Ｓｉｎｇｈ、Ｋ． Ｓｕｂｂａｒａｏ、Ｍ． Ｄ． Ｖａｎ Ｋｅｒｋｈｏｖｅ、Ｓ． Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ、Ｍ． Ｊ． Ｒｙａｎ、Ａ．－Ｍ． Ｈｅｎａｏ－Ｒｅｓｔｒｅｐｏ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ ３８５、１７９～１８６頁（２０２１））、エンドポイントの力価分析においては、統計的差異はなかった（図７Ｑ）。アルファ（Ｐ＝０．０１５６）、ベータ（Ｐ＝０．０１５６）、及びデルタ（Ｐ＝０．００７８）を含む、シュードウイルス中和曲線によるＶＯＣに対する中和抗体応答の差異もまた確認されたが、シュードウイルス又は真正ウイルスの中和のｐＮＴ５０力価値（図７、Ｒ及びＳ）には、ＳＦＧと比較して差異は確認されなかった。
【0094】
［実施例２１］ 広範な中和抗体がＳＭＧで免疫したマウスのＢ細胞から単離された
ＳＭＧで免疫したマウスからのＳタンパク質特異的Ｂ細胞の選別により、ＳＭＧで免疫したＢ細胞レパートリーに特有的に豊富なサブセット、ＩＧＨＶ１－１８増幅クローンからのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｍ３１Ａ７が同定された（図８Ｏ）。このｍＡｂは、全長Ｓタンパク質、Ｓ１、及びＲＢＤと相互作用するが、Ｓ２とは相互作用せず（図８Ａ）、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント由来のＳタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合する（図８Ｂ）。さらに、ｍ３１Ａ７は、報告されているヒトｍＡｂ ＥＹ６Ａよりも最高で１０００倍高いｐＭ以下の半数阻害濃度（ＩＣ５０）であり、様々なシュードウイルスバリアント（ＷＴ、Ｄ６１４Ｇ、アルファ、ベータ、及びデルタ）を中和することが示された（図８Ｃ）。また予防研究では、ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で抗原負荷したＫ１８－ｈＡＣＥ２マウス（ｎ＝３）においても、ｍ３１Ａ７の良好なインビボ効力が実証された（図８Ｄ）。予防的に処置されたマウスは、体重及び体温ともに維持された（図８、Ｅ及びＦ）。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析を使用し、Ｓタンパク質に結合するｍ３１Ａ７及びそのＦａｂの解離定数をそれぞれ７０．ｐＭ及び４．６６ｎＭで測定した（図８Ｇ）。水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によるエピトープマッピングにより、ＲＢＤ上のその結合可能性領域が明らかになり（図８Ｈ）、これは、ｍ３１Ａ７－Ｆａｂとの複合体でのＲＢＤの結晶構造で観察されたエピトープと重なっていた。クライオ電子顕微鏡（ＥＭ）構造からは、ｍ３１Ａ７が「アップ（ｕｐ）」状態のＲＢＤにのみ結合し（図８Ｉ）、隣接するＮＴＤからのＮ１６５－グリカンがＲＢＤ－ｍ３１Ａ７境界面の近くにある（図８Ｊ）ことがさらに明らかになった。ＲＢＤ上のｍ３１Ａ７のフットプリントは、ヒトＶＨ１－５８クラスｍＡｂのフットプリントと似ているが（図８Ｋ）、異なる角度からＲＢＤに接近し、先端ループ上の局所的接触領域をシフトさせ、Ｅ４８４及びＫ４１７などのＶＯＣの主要な変異残基のほとんどをバイパスするが、Ｔ４７８はバイパスしない（図８Ｌ）。詳しいＲＢＤ－ｍ３１Ａ７境界面及びこのＳＭＧ誘発ｍＡｂの阻害メカニズムは、現在さらに調査されている。
ＳＭＧで免疫したマウスからのＳタンパク質特異的Ｂ細胞の選別により、ＳＭＧで免疫したＢ細胞レパートリーに特有的に豊富なサブセット、ＩＧＨＶ１－１８増幅クローンからのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｍ３１Ａ７が同定された（図８Ｏ）。このｍＡｂは、全長Ｓタンパク質、Ｓ１、及びＲＢＤと相互作用するが、Ｓ２とは相互作用せず（図８Ａ）、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント由来のＳタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合する（図８Ｂ）。さらに、ｍ３１Ａ７は、報告されているヒトｍＡｂ ＥＹ６Ａよりも最高で１０００倍高いｐＭ以下の半数阻害濃度（ＩＣ５０）であり、様々なシュードウイルスバリアント（ＷＴ、Ｄ６１４Ｇ、アルファ、ベータ、及びデルタ）を中和することが示された（図８Ｃ）。また予防研究では、ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で抗原負荷したＫ１８－ｈＡＣＥ２マウス（ｎ＝３）においても、ｍ３１Ａ７の良好なインビボ効力が実証された（図８Ｄ）。予防的に処置されたマウスは、体重及び体温ともに維持された（図８、Ｅ及びＦ）。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析を使用し、Ｓタンパク質に結合するｍ３１Ａ７及びそのＦａｂの解離定数をそれぞれ７０．ｐＭ及び４．６６ｎＭで測定した（図８Ｇ）。水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によるエピトープマッピングにより、ＲＢＤ上のその結合可能性領域が明らかになり（図８Ｈ）、これは、ｍ３１Ａ７－Ｆａｂとの複合体でのＲＢＤの結晶構造で観察されたエピトープと重なっていた。クライオ電子顕微鏡（ＥＭ）構造からは、ｍ３１Ａ７が「アップ（ｕｐ）」状態のＲＢＤにのみ結合し（図８Ｉ）、隣接するＮＴＤからのＮ１６５－グリカンがＲＢＤ－ｍ３１Ａ７境界面の近くにある（図８Ｊ）ことがさらに明らかになった。ＲＢＤ上のｍ３１Ａ７のフットプリントは、ヒトＶＨ１－５８クラスｍＡｂのフットプリントと似ているが（図８Ｋ）、異なる角度からＲＢＤに接近し、先端ループ上の局所的接触領域をシフトさせ、Ｅ４８４及びＫ４１７などのＶＯＣの主要な変異残基のほとんどをバイパスするが、Ｔ４７８はバイパスしない（図８Ｌ）。詳しいＲＢＤ－ｍ３１Ａ７境界面及びこのＳＭＧ誘発ｍＡｂの阻害メカニズムは、現在さらに調査されている。
【0095】
［実施例２２］ デルタＳＭＧワクチン接種は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントシュードウイルスに対してより多くの中和抗体を誘発した
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタバリアントのＳＭＧタンパク質発現構築物
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタバリアントのＳＭＧタンパク質発現構築物
【0096】
配列番号３
【0097】
【化3】
【0098】
Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１））由来のシグナルペプチド：ＭＫＶＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＧＴ（配列番号４）
トロンビン切断部位：ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）
Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ：ＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧ（配列番号６）
ＨＲＶ３Ｃ切断部位：ＧＳＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号７）
Ｈｉｓタグ：ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８）
トロンビン切断部位：ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）
Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ：ＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧ（配列番号６）
ＨＲＶ３Ｃ切断部位：ＧＳＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号７）
Ｈｉｓタグ：ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８）
【0099】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）をデルタＳＦＧ又はＳＭＧワクチンで０週目及び２週目に２回免疫した。血清を６週目に採取し、続いてシュードウイルスアッセイを使用して中和能力を試験した（図９Ａ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタバリアントのシュードウイルスを使用し、ワクチンで免疫した血清から感染を中和する能力を測定した。繰り返すが、ＳＭＧ免疫の血清は、ＷＴ、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、及びオミクロンシュードウイルスに対して優れた中和能力を有する。デルタＳＦＧ対ＳＭＧのそれらのそれぞれの力価（ｐＮＴ５０、高いほど良好）は、それぞれ、１０１８対３３３６（ＷＴシュードウイルスに対して）、１３９６対２６８０（アルファシュードウイルスに対して）、３３７対２２８２（ベータシュードウイルスに対して）、８１４対４４２４（ガンマシュードウイルスに対して）、１１３８対６６８０（デルタシュードウイルスに対して）、及び１４４対２６２８（オミクロンシュードウイルスに対して）である。
【0100】
［実施例２３］ デルタ又はＷＴ ＳＭＧワクチン接種は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２オミクロンバリアントシュードウイルスに対するより多くの中和抗体を誘発した
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、デルタ／ＷＴ ＳＦＧ又はＳＭＧワクチンで０週目及び２週目に２回免疫した。血清を６週目に採取し、続いてシュードウイルスアッセイを使用して中和能力を試験した（図１０Ａ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロンバリアントのシュードウイルスを使用し、ＷＴ ＳＦＧ／ＳＭＧ又はデルタＳＦＧ／ＳＭＧのいずれかからのワクチン免疫血清から感染を中和する能力を測定した。ＷＴ ＳＦＧワクチン接種は、オミクロンシュードウイルスに対する中和を誘発しないが、ＷＴ ＳＭＧはわずかに防御を提供する。同様に、デルタＳＦＧワクチン接種は、オミクロンシュードウイルス感染に対してほとんど中和を誘発しないが、デルタＳＭＧは優れた中和を提供する。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、デルタ／ＷＴ ＳＦＧ又はＳＭＧワクチンで０週目及び２週目に２回免疫した。血清を６週目に採取し、続いてシュードウイルスアッセイを使用して中和能力を試験した（図１０Ａ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロンバリアントのシュードウイルスを使用し、ＷＴ ＳＦＧ／ＳＭＧ又はデルタＳＦＧ／ＳＭＧのいずれかからのワクチン免疫血清から感染を中和する能力を測定した。ＷＴ ＳＦＧワクチン接種は、オミクロンシュードウイルスに対する中和を誘発しないが、ＷＴ ＳＭＧはわずかに防御を提供する。同様に、デルタＳＦＧワクチン接種は、オミクロンシュードウイルス感染に対してほとんど中和を誘発しないが、デルタＳＭＧは優れた中和を提供する。
【0101】
［実施例２４］ デルタＳＭＧタンパク質は、溶液中又は粉末中で室温にて保存することができる
２種のアミノ酸、５０ｍＭのＬ－アルギニン及び５０ｍＭのＬ－グルタメートを含むリン酸緩衝生理食塩水添加物（ｐｂｓ－ａａ）中のデルタＳＭＧタンパク質を０．２２μｍフィルターで濾過し、室温（ＲＴ）又は４℃で保存した。タンパク質は、３日、７日、１４日、２１日、及び３ヶ月を含む様々な時点で回収した。回収した試料を５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅと混合し、１００℃で５分間加熱し、ゲル泳動まで４℃で保存した（図１１Ａ及びＢ）。５０ｍＭのＬ－アルギニン及び５０ｍＭのＬ－グルタミン酸含有又は非含有ＰＢＳを、デルタＳＨＭ又はＳＭＧ（最初の３レーン）の４℃での保存について試験した。デルタＳＭＧを、賦形剤の有無による凍結乾燥試験を行い、ＲＴで２週間以上保存した（最後の２レーン）（図１１Ｃ）。安定性試験は、デルタＳＭＧタンパク質が溶液中で保存することができ、室温又は４℃で少なくとも２１日間安定であることを示している。さらに、デルタＳＭＧは凍結乾燥し、ＲＴで保存することができ、少なくとも３ヶ月間安定を維持する。
２種のアミノ酸、５０ｍＭのＬ－アルギニン及び５０ｍＭのＬ－グルタメートを含むリン酸緩衝生理食塩水添加物（ｐｂｓ－ａａ）中のデルタＳＭＧタンパク質を０．２２μｍフィルターで濾過し、室温（ＲＴ）又は４℃で保存した。タンパク質は、３日、７日、１４日、２１日、及び３ヶ月を含む様々な時点で回収した。回収した試料を５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅと混合し、１００℃で５分間加熱し、ゲル泳動まで４℃で保存した（図１１Ａ及びＢ）。５０ｍＭのＬ－アルギニン及び５０ｍＭのＬ－グルタミン酸含有又は非含有ＰＢＳを、デルタＳＨＭ又はＳＭＧ（最初の３レーン）の４℃での保存について試験した。デルタＳＭＧを、賦形剤の有無による凍結乾燥試験を行い、ＲＴで２週間以上保存した（最後の２レーン）（図１１Ｃ）。安定性試験は、デルタＳＭＧタンパク質が溶液中で保存することができ、室温又は４℃で少なくとも２１日間安定であることを示している。さらに、デルタＳＭＧは凍結乾燥し、ＲＴで保存することができ、少なくとも３ヶ月間安定を維持する。
【0102】
配列
配列番号１
配列番号１
【0103】
【化4】
【0104】
配列番号２
【0105】
【化5】
【0106】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタバリアントのＳＭＧタンパク質発現構築物
【0107】
配列番号：３
【0108】
【化6】
【0109】
Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）から改変されたシグナルペプチド
ＭＫＶＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＧＴ（配列番号４）
ＭＫＶＫＬＬＶＬＬＣＴＦＴＡＴＹＡＧＴ（配列番号４）
【0110】
トロンビン切断部位
ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）
ＬＶＰＲＧＳ（配列番号５）
【0111】
Ｔ４ ｆｏｌｄｏｎ
ＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧ（配列番号６）
ＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧ（配列番号６）
【0112】
ＨＲＶ３Ｃ切断部位
ＧＳＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号７）
ＧＳＧＳＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号７）
【0113】
Ｈｉｓタグ
ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８）
ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８）
【0114】
元のフリン切断部位を置換する残基
ＧＳＡＧ（配列番号９）
ＧＳＡＧ（配列番号９）
【0115】
高度に保存されたエピトープ
【0116】
【化7】
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図2-7】
【図2-8】
【図2-9】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図4-6】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図7-5】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図8-5】
【図8-6】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-11-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト細胞発現用に最適化されたコドンを有する組換えネイティブ株（組換えネイティブＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株／ｈＣｏＶ／Ｗｕｈａｎ／ＷＨ０１／２０１９）を合成し、フリン切断部位はＧＳＡＧ（配列番号９）で置換されている工程；
２個のプロリン変異（Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ）を改変し、組換えネイティブ株を融合前状態で固定する工程；
スパイクタンパク質のＣ末端にフォルドン三量体化配列（配列番号６）及びＨｉｓタグ（配列番号８）を付加し、中間体高マンノース型スパイク組換えネイティブ（Ｓ ＨＭ ）を得る工程；
エンドグリコシラーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）を使用してＳ ＨＭ のグリカンを各Ｎ－グリコサイトで単一Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にトリミングし、可溶性トリマーモノ－ＧｌｃＮＡｃ修飾スパイクタンパク質（Ｓ ＭＧ ）を生成する工程；
を含む免疫原を調製するための方法であって、
ここで、前記Ｓ ＭＧ は、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するそのバリアントからなる、方法。
２個のプロリン変異（Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ）を改変し、組換えネイティブ株を融合前状態で固定する工程；
スパイクタンパク質のＣ末端にフォルドン三量体化配列（配列番号６）及びＨｉｓタグ（配列番号８）を付加し、中間体高マンノース型スパイク組換えネイティブ（Ｓ ＨＭ ）を得る工程；
エンドグリコシラーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）を使用してＳ ＨＭ のグリカンを各Ｎ－グリコサイトで単一Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にトリミングし、可溶性トリマーモノ－ＧｌｃＮＡｃ修飾スパイクタンパク質（Ｓ ＭＧ ）を生成する工程；
を含む免疫原を調製するための方法であって、
ここで、前記Ｓ ＭＧ は、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するそのバリアントからなる、方法。
【請求項2】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）又はそのバリアントに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘発するための免疫原性組成物であって、約１０μｇから約２５μｇの範囲の有効量の免疫原及びアジュバントを含み、ここで、前記免疫原が、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するそのバリアントからなるモノ－ＧｌｃＮＡｃ修飾スパイクタンパク質（Ｓ
ＭＧ
）を含む、免疫原性組成物。
【請求項3】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、スクアレン、ミョウバン、アルヒドロゲル、ＭＦ５９、ＱＳ－２１、ＣｐＧ １０１８、ＡＳ０３、ＡＳ３７、及びＭａｔｒｉｘ－Ｍからなる群から選択される、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項4】
前記アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項5】
水酸化アルミニウムのアジュバントが、約２０μｇから約２５０μｇの範囲の有効量である、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項6】
治療剤をさらに含む、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項7】
前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項8】
前記抗ウイルス剤がリバビリン、ペンシクロビル、ニタゾキサニド、ナファモスタット、クロロキン、レムデシビル（ＧＳ－５７３４）及びファビピラビル（Ｔ－７０５）、インターフェロン、アデホビル、テノホビル、アシクロビル、ブリブジン、シドホビル、フォミビルセン、フォスカルネット、ガンシクロビル、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、レムデシビル、モルヌピラビル、又はパクスロビドである、請求項７に記載の免疫原性組成物。