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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025020224
(43)【公開日】2025-02-12
(54)【発明の名称】培養培地での植物タンパク質相同体の利用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/415 20060101AFI20250204BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20250204BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20250204BHJP
A23L 13/00 20160101ALI20250204BHJP
【ＦＩ】
C07K14/415 ZNA
C12N1/00 G
C12N5/071
A23L13/00
C07K14/415
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024189045
(22)【出願日】2024-10-28
(62)【分割の表示】P 2022544694の分割
【原出願日】2021-01-20
(31)【優先権主張番号】62/963,808
(32)【優先日】2020-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】592024572
【氏名又は名称】イッサム・リサーチ・ディベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム・リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】522292264
【氏名又は名称】フューチャー・ミート・テクノロジーズ・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100188374
【弁理士】
【氏名又は名称】一宮 維幸
(72)【発明者】
【氏名】ナーミアス，ヤーコブ
(72)【発明者】
【氏名】コヘン，メラブ
(72)【発明者】
【氏名】カスピ，ヨナサン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】増殖又は接着因子血清成分の動物製品又は組換えタンパク質生産の望ましくない副作用を伴わない培地サプリメントを提供する。また、動物血清由来成分を本質的に欠く細胞増殖培地及び培地中で細胞を増殖させ、それにより培養肉を生産する方法を提供する。
【解決手段】動物血清由来タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む細胞培養培地サプリメント、無血清基本培地及び１つ又はそれ以上の植物ベースのタンパク質を含む細胞培養培地、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖する方法及び細胞培養培地を使用して培養肉を生産する方法を提供する。
【選択図】図１３
【解決手段】動物血清由来タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む細胞培養培地サプリメント、無血清基本培地及び１つ又はそれ以上の植物ベースのタンパク質を含む細胞培養培地、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を増殖する方法及び細胞培養培地を使用して培養肉を生産する方法を提供する。
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血清タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む細胞培養培地サプリメント。
【請求項2】
前記サプリメントが、任意の血清タンパク質を欠く、請求項１に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項3】
前記サプリメントが、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、請求項１又は２に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項4】
前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物タンパク質単離物の水溶性画分を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項5】
前記水溶性画分が、植物アルブミン及びグロブリンを含む、請求項４に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項6】
前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、血清アルブミン、血清カタラーゼ、血清スーパーオキシドジスムターゼ、血清トランスフェリン、血清フィブロネクチン、血清ビトロネクチン、血清インシュリン、血清ヘモグロビン、血清アルドラーゼ、血清リパーゼ、血清トランスアミナーゼ、血清アミノトランスフェラーゼ、血清フェチュイン、又はこれらの組合せの相同体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項7】
前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物アルブミン、植物カタラーゼ、植物スーパーオキシドジスムターゼ、植物トランスフェリン、植物フィブロネクチン、植物ビトロネクチン、植物インシュリン、植物レグヘモグロビン、植物アルドラーゼ、植物リパーゼ、植物トランスアミナーゼ、植物アミノトランスフェラーゼ、植物シスタチン、又はこれらの組合せである、請求項６に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項8】
前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物アルブミン、植物カタラーゼ、植物フィブロネクチン、及び植物インシュリンを含む、請求項７に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項9】
前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物アルブミンである、請求項７に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項10】
前記植物アルブミンが、ヒヨコマメアルブミン、ヘンプシードアルブミン、ヒラマメアルブミン、エンドウアルブミン、ダイズアルブミン、コムギアルブミン又はジャガイモアルブミンである、請求項８又は９に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項11】
前記植物アルブミンが、エンドウアルブミン又はジャガイモアルブミンである、請求項１０に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項12】
前記植物アルブミンが、植物タンパク質単離物の水溶性画分由来である、請求項９に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項13】
前記植物アルブミンが、約１３～１１０キロダルトンの分子量を有する、請求項７～１２のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項14】
前記植物アルブミンが、約１３～１７キロダルトンの分子量を有する、請求項１３に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項15】
前記植物アルブミンが、約２０～３５キロダルトンの分子量を有する、請求項１３に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項16】
前記植物アルブミンが、約５０～１１０キロダルトンの分子量を有する、請求項１３に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項17】
前記植物アルブミンが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物アルブミンが前記細胞培養培地中約０．０１重量％～約１０重量％の最終濃度を有する濃度で、前記細胞培養培地サプリメント中に存在する、請求項７～１６のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項18】
前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物カタラーゼである、請求項７に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項19】
前記植物カタラーゼが、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）カタラーゼ、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ、綿カタラーゼ、ジャガイモカタラーゼ、カボチャカタラーゼ、ホウレンソウカタラーゼ、ヒマワリカタラーゼ、タバコカタラーゼ又はトマトカタラーゼである、請求項８又は１８に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項20】
前記植物カタラーゼが、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ又はジャガイモカタラーゼである、請求項１９に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項21】
前記植物カタラーゼが、約５０～７０キロダルトンの分子量を有する、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項22】
前記植物カタラーゼが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物カタラーゼが前記細胞培養培地中約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、前記細胞培養培地サプリメント中に存在する、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項23】
前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物フィブロネクチンである、請求項７に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項24】
前記植物フィブロネクチンが、マメフィブロネクチン、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン、タバコフィブロネクチン又はコムギフィブロネクチンである、請求項８又は２３に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項25】
前記植物フィブロネクチンが、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン又はコムギフィブロネクチンである、請求項２４に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項26】
前記植物フィブロネクチンが、約４０～６０キロダルトンの分子量を有する、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項27】
前記植物フィブロネクチンが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物フィブロネクチンが前記細胞培養培地中約０．１μｇ／ｍｌ～約１００μ
ｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、前記細胞培養培地サプリメント中に存在する、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメント。
ｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、前記細胞培養培地サプリメント中に存在する、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項28】
前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物インシュリンである、請求項７に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項29】
前記植物インシュリンが、グルコキニン、チャランチン、又はコロソリン酸である、請求項８又は２８に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項30】
前記植物インシュリンが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物インシュリンが前記細胞培養培地中約０．０５μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、細胞培養培地サプリメント中に存在する、請求項２８又は２９に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項31】
前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物抽出物画分の形態又は純粋形態である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメント。
【請求項32】
無血清培地及び請求項１～３１のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメントを含む細胞培養培地であって、前記無血清培地は、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、細胞培養培地。
【請求項33】
前記無血清培地が、基本生理的緩衝液である、請求項３２に記載の細胞培養培地。
【請求項34】
請求項１～３１のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメントと、任意の動物血清由来成分を欠く無血清培地と前記細胞培養培地サプリメントを混合するための説明書とを含むキット。
【請求項35】
培養肉を生産する方法であって、請求項３２又は３３に記載の細胞培養培地中で細胞を培養するステップ、及び培養細胞から肉を生産するステップを含む方法。
【請求項36】
前記細胞が食用動物由来である、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記食用動物が、家畜、狩猟動物、家禽、魚、又は甲殻類である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記細胞が、繊維芽細胞である、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記線維芽細胞が、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法によって生産される培養肉。
【請求項41】
任意の動物タンパク質及び／又は成分を欠く細胞培養培地を生産する方法であって、無血清基本培地と請求項１～３１のいずれか一項に記載の細胞培養培地サプリメントとを混合するステップを含み、前記無血清基本培地及び細胞培養培地サプリメントは、それぞれ任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、方法。
【請求項42】
請求項４１に記載の方法によって生産される細胞培養培地。
【請求項43】
細胞培養培地サプリメント中の動物タンパク質の代わりの、動物タンパク質の植物タン
パク質相同体の使用。
パク質相同体の使用。
【請求項44】
前記動物タンパク質が血清タンパク質である、請求項４３に記載の使用。
【請求項45】
前記サプリメントが、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、請求項４３又は４４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０２０年１月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／９６３８０８号の優先権の利益を主張する。
[0001]本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０２０年１月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／９６３８０８号の優先権の利益を主張する。
【0002】
配列表
[0002]本出願の出願と同時に提出された、５５，９３０バイトを含む、２０２１年１月１９日に作成された表題１０８９１２－６７５９８０＿ＳＬ．ｔｘｔのＡＳＣＩＩファイルは参照によって本明細書に組み込まれる。これにより提出された配列表は、本出願の一部を形成する配列表と同一である。
[0002]本出願の出願と同時に提出された、５５，９３０バイトを含む、２０２１年１月１９日に作成された表題１０８９１２－６７５９８０＿ＳＬ．ｔｘｔのＡＳＣＩＩファイルは参照によって本明細書に組み込まれる。これにより提出された配列表は、本出願の一部を形成する配列表と同一である。
【0003】
技術分野 [0003]本発明は、通常、細胞増殖に関する。より詳細には、本発明は、動物血清由来成分を本質的に欠く細胞増殖培地及び培地中で細胞を増殖させ、それにより培養肉を生産する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
[0004]現在の世界人口は７０億人を超え、依然として急速に増加している。この人口増加の栄養所要量を支えるため、ますます広い土地が食料生産に割り当てられる。天然源は要求を満たすのには不十分である。これは、世界の一部の地域では食料不足をもたらす。世界の他の地域では、問題は、厳しい条件下の密集した工場式農場での動物の大規模生産によって対処されている。この大規模生産は、動物に多大な苦痛をもたらすだけでなく、食品効率を増加させ、感染を制御するために使用する有機ヒ素化合物及び抗生物質により肉製品のヒ素レベル及び薬剤耐性菌も増加させ、したがって、動物とヒトの両方で疾患の数をさらに増加させ、その結果を悪化させる。現在の食料要求を満たすためには大規模な屠殺が必要であり、結果として、ブタペスチウイルス及び狂牛病の出現など、大規模な疾患の発生をもたらし得る。これらの疾患は、ヒトの消費のための食肉の不足を生じ、したがってそもそも動物が飼育される目的を完全に否定する。
【0005】
[0005]さらに、大規模生産は、最終製品の風味を低下させる。バタリー不使用で産ませた卵及びバタリー不使用で生産された肉を供給することができるものが好まれる。味だけの問題ではなく、それにより成長ホルモンのような様々な食品添加物の消費を避ける健康上の選択もある。大量の動物生産と関連する別の問題は、動物からの莫大な排泄物によって引き起こされ、続いて環境が対応しなければならない環境問題である。さらに、他の作物の生育、住宅、レクリエーション、野生及び森林のような代替の目的のために使用できない、動物又は動物の飼料の生産に現在必要とされる広大な土地は問題である。
【0006】
[0006]当技術分野で公知の技術の主な問題の１つは、生産に長時間かかり、コストが非常に高く、製品が、家畜由来の現在の肉を置き換えることができない及び置き換えないであろう平凡な質であることである。例えば、Ｊｕｓｔ－Ｉｎｃ．は、抽出した動物細胞を培地中で増殖させてチキンナゲットを製造したが、その製造コストは、ナゲット当たり５０ドルかかる。
【0007】
[0007]ヒト又は動物への投与のための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験又はｅｘ ｖｉｖｏ培養のため、細胞、例えば哺乳動物細胞又は昆虫細胞の培養は、ヒト疾患の研究及び処置の重要な手段である。細胞培養は、様々な生物学的に活性な製品、例えばウイルスワクチン、モノクローナル抗体、ポリペプチド増殖因子、ホルモン、酵素、腫瘍特異的抗原及び食品製品の生産に広く使用される。しかしながら、細胞を培養するために使用される多くの培
地又は方法は、細胞増殖及び／又は未分化細胞培養の維持に負の効果を有し得る成分を含む。例えば、哺乳動物又は昆虫細胞培養培地は、培養中の細胞の増殖及び成長を促進する増殖因子、キャリアタンパク質、接着及び拡散因子、栄養及び微量元素を提供するため、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＢＳ）のような血液由来血清を補充することが多い。しかしながら、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）ベータ又はレチノイン酸のような、ＦＣＳ又はＦＢＳに見出される因子は、ある特定の細胞型の分化を促進する（Ｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１３７：８３３－４３，１９９０）か又は培養中の望まない細胞活性を促進する細胞の意図しない下流のシグナル伝達を開始する（Ｖｅｌｄｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１１）：１１５１－６，２００６）ことができる。
地又は方法は、細胞増殖及び／又は未分化細胞培養の維持に負の効果を有し得る成分を含む。例えば、哺乳動物又は昆虫細胞培養培地は、培養中の細胞の増殖及び成長を促進する増殖因子、キャリアタンパク質、接着及び拡散因子、栄養及び微量元素を提供するため、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＢＳ）のような血液由来血清を補充することが多い。しかしながら、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）ベータ又はレチノイン酸のような、ＦＣＳ又はＦＢＳに見出される因子は、ある特定の細胞型の分化を促進する（Ｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１３７：８３３－４３，１９９０）か又は培養中の望まない細胞活性を促進する細胞の意図しない下流のシグナル伝達を開始する（Ｖｅｌｄｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１１）：１１５１－６，２００６）ことができる。
【0008】
[0008]培養培地のコストは、培養肉生産のコストの主要因である。培養培地は、炭水化物、アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含む比較的簡単な基本培地と、アルブミン、増殖因子、酵素、接着因子及びホルモンを含むより高価な血清代替物成分から構成される。動物成分の使用を除くため、現在、産業は、細胞治療及びワクチン生産への適用のための組換えヒトタンパク質に頼っている。しかしながら、培養肉適用はヒトタンパク質の使用に限定されず、したがって、ヒトの消費に好適な材料のより容易に入手可能な供給源を利用することができる可能性がある。
【0009】
[0009]血清組成が本質的に特徴づけられていないこと及び血清のロット間のバリエーションにより、血清代替物の使用及び無血清培地中での培養が望ましい（Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ａｎｄｒｏｌ．４９（５）：３３１－４２，２００３）。さらに、細胞培養で増殖される、治療使用のための細胞、組換えタンパク質又はワクチンでは、ヒトに投与された場合、ウイルス夾雑の可能性及び／又は動物タンパク質の免疫原性効果の可能性により、動物由来成分の添加は望ましくない。
【0010】
[0010]血清代替物は、細胞培養でのＦＣＳの効果を最小限にする、並びにヒト細胞を培養するために使用される動物タンパク質の量を最小限にするために開発された。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）のような血清代替物は、血清を欠如し、細胞増殖のための基本栄養及び他のタンパク質を含有する既知の化学組成の培養培地である。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）は、この製剤での不十分な細胞接着をもたらす、接着因子の欠如により、フィーダー細胞のプレーティングにおいてＦＢＳの代替物として使用することができない。ＰＣ－１（商標）無血清培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）は、特別に改変されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地ベース中で配合された低タンパク質の無血清培地であり、既知量のインシュリン、トランスフェリン、脂肪酸及び専売タンパク質を含む完全ＨＥＰＥＳ緩衝系を含有する。
【0011】
[0011]Ｃｅｌｌｇｒｏ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０及びＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ基本培地の混合物に基づく、無血清、低タンパク質培養培地である。Ｃｅｌｌｇｒｏ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）は、インシュリン、トランスフェリン、コレステロール、増殖又は接着因子を含有しないが、微量元素及び高分子量炭水化物、余分なビタミン、非動物タンパク質源、及びウシ血清アルブミンの混合物を含む。
【0012】
[0012]動物細胞又は植物で生産された組換えタンパク質が、現在、培養培地で使用される。例えば、組換えヒトアルブミンはイネで生産されるが、組換えフィブロネクチンはマウス細胞で生産される。増殖又は接着因子血清成分の動物製品又は組換えタンパク質生産の望ましくない副作用を伴わない培地サプリメントの必要性がある。本発明は、この長年の要求を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
[0013]培養培地のコストは、培養肉生産のコストの主要因である。培養培地は、炭水化物、アミノ酸、ビタミン及びミネラルを含有する比較的簡単な基本培地と、アルブミン、増殖因子、酵素、接着因子及びホルモンを含むより高価な血清代替物成分から構成される。動物成分の使用を除くため、現在、産業は、細胞治療及びワクチン生産への適用のための組換えヒトタンパク質に頼っている。しかしながら、培養肉適用はヒトタンパク質の使用に限定されず、したがって、ヒトの消費に好適な材料のより容易に入手可能な供給源を利用することができる可能性がある。
【0014】
[0014]本開示は、一部では、血清の最も高価な成分の一部の代替物が、植物界のタンパク質相同体に見出すことができるという発見に基づく。例えば、植物アルブミン及びグロブリンは、驚くべきことに、培養培地の脂質及び増殖因子担体として血清アルブミンを置き換えることができる。カタラーゼは、過酸化水素を除去する動物血清中の重要な酵素であり、ジャガイモ、キュウリ及び他の植物にも豊富である。フィブロネクチン及びビトロネクチンのような一般的な接着因子の相同体は、植物細胞壁とそれらの膜の間に見出され得る。そのような植物ベースのタンパク質の培養培地での使用は、培養肉の生産のための培地のコストを著しく削減する。
【0015】
[0015]本開示の一態様は、血清タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む細胞培養培地サプリメントを提供する。
[0016]一部の実施形態では、細胞培養培地サプリメントは、任意の血清タンパク質を欠く。一部の実施形態では、細胞培養培地サプリメントは、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く。
[0016]一部の実施形態では、細胞培養培地サプリメントは、任意の血清タンパク質を欠く。一部の実施形態では、細胞培養培地サプリメントは、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く。
【0016】
[0017]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物タンパク質単離物の水溶性画分を含む。一部の実施形態では、水溶性画分は、植物アルブミン及びグロブリンを含む。
【0017】
[0018]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、血清アルブミン、血清カタラーゼ、血清スーパーオキシドジスムターゼ、血清トランスフェリン、血清フィブロネクチン、血清ビトロネクチン、血清インシュリン、血清ヘモグロビン、血清アルドラーゼ、血清リパーゼ、血清トランスアミナーゼ、血清アミノトランスフェラーゼ、血清フェチュイン、又はこれらの組合せの相同体である。
【0018】
[0019]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物アルブミン、植物カタラーゼ、植物スーパーオキシドジスムターゼ、植物トランスフェリン、植物フィブロネクチン、植物ビトロネクチン、植物インシュリン、植物レグヘモグロビン、植物アルドラーゼ、植物リパーゼ、植物トランスアミナーゼ、植物アミノトランスフェラーゼ、植物シスタチン、又はこれらの組合せである。
【0019】
[0020]一部の実施形態では、サプリメントは、植物アルブミン、植物カタラーゼ、植物フィブロネクチン、及び植物インシュリンを含む。
[0021]一部の実施形態では、サプリメントは、植物トランスフェリンをさらに含む。
[0021]一部の実施形態では、サプリメントは、植物トランスフェリンをさらに含む。
【0020】
[0022]一部の実施形態では、サプリメントは、植物スーパーオキシドジスムターゼをさらに含む。
[0023]一部の実施形態では、サプリメントは、植物ビトロネクチンをさらに含む。
[0023]一部の実施形態では、サプリメントは、植物ビトロネクチンをさらに含む。
【0021】
[0024]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物アルブミンである。一部の実施形態では、植物アルブミンは、ヒヨコマメアルブミン、ヘンプシードアルブミン、ヒラマメアルブミン、エンドウアルブミン、ダイズアルブミン、コムギアルブミン又はジャガイモアルブミンである。一部の実施形態では、植物アルブミンは、エンドウアルブミン又はジャガイモアルブミンである。
【0022】
[0025]一部の実施形態では、植物アルブミンは、植物タンパク質単離物の水溶性画分由来である。
[0026]一部の実施形態では、植物アルブミンは、約１３～１１０キロダルトンの分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約１３～１７キロダルトンの分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約２０～３５キロダルトンの分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約５０～１１０キロダルトンの分子量を有する。
[0026]一部の実施形態では、植物アルブミンは、約１３～１１０キロダルトンの分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約１３～１７キロダルトンの分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約２０～３５キロダルトンの分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約５０～１１０キロダルトンの分子量を有する。
【0023】
[0027]一部の実施形態では、植物アルブミンは、植物アルブミンが細胞培養培地中約０．０１重量％～約１０重量％の最終濃度を有する濃度で、細胞培養培地サプリメント中に存在する。
【0024】
[0028]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は植物カタラーゼである。
[0029]一部の実施形態では、植物カタラーゼは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）カタラーゼ、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ、綿カタラーゼ、ジャガイモカタラーゼ、カボチャカタラーゼ、ホウレンソウカタラーゼ、ヒマワリカタラーゼ、タバコカタラーゼ又はトマトカタラーゼである。一部の実施形態では、植物カタラーゼは、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ又はジャガイモカタラーゼである。
[0029]一部の実施形態では、植物カタラーゼは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）カタラーゼ、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ、綿カタラーゼ、ジャガイモカタラーゼ、カボチャカタラーゼ、ホウレンソウカタラーゼ、ヒマワリカタラーゼ、タバコカタラーゼ又はトマトカタラーゼである。一部の実施形態では、植物カタラーゼは、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ又はジャガイモカタラーゼである。
【0025】
[0030]一部の実施形態では、植物カタラーゼは、約５０～７０キロダルトンの分子量を有する。
[0031]一部の実施形態では、植物カタラーゼは、細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると植物カタラーゼが細胞培養培地中で約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、細胞培養培地サプリメント中に存在する。
[0031]一部の実施形態では、植物カタラーゼは、細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると植物カタラーゼが細胞培養培地中で約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、細胞培養培地サプリメント中に存在する。
【0026】
[0032]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物フィブロネクチンである。
[0033]一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、マメフィブロネクチン、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン、タバコフィブロネクチン又はコムギフィブロネクチンである。一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン又はコムギフィブロネクチンである。
[0033]一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、マメフィブロネクチン、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン、タバコフィブロネクチン又はコムギフィブロネクチンである。一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン又はコムギフィブロネクチンである。
【0027】
[0034]一実施形態では、前記植物フィブロネクチンは、約４０～６０キロダルトンの分子量を有する。
[0035]一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、細胞培養培地中約０．１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの最終濃度を有する。
[0035]一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、細胞培養培地中約０．１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの最終濃度を有する。
【0028】
[0036]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物インシュリンである。
[0037]一部の実施形態では、植物インシュリンは、グルコキニン、チャランチン、又はコロソリン酸である。
[0037]一部の実施形態では、植物インシュリンは、グルコキニン、チャランチン、又はコロソリン酸である。
【0029】
[0038]一部の実施形態では、植物インシュリンは、細胞培養培地中約０．０５μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの最終濃度を有する。
[0039]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物トランスフェリンである。
[0039]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物トランスフェリンである。
【0030】
[0040]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物ビトロネクチンである。
[0041]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物スーパーオキシドジスムターゼである。
[0041]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物スーパーオキシドジスムターゼである。
【0031】
[0042]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物抽出物画分の形態又は純粋形態である。
[0043]本開示のさらに別の態様は、無血清培地及び本明細書に開示の任意の細胞培養培地サプリメントを含む細胞培養培地を提供する。
[0043]本開示のさらに別の態様は、無血清培地及び本明細書に開示の任意の細胞培養培地サプリメントを含む細胞培養培地を提供する。
【0032】
[0044]一部の実施形態では、細胞培養培地は任意の動物血清タンパク質を欠く。
[0045]一部の実施形態では、細胞培養培地は、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く。
[0045]一部の実施形態では、細胞培養培地は、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く。
【0033】
[0046]一部の実施形態では、無血清培地は基本培地である。一部の実施形態では、基本培地は基本生理的緩衝液（ｂａｓｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｂｕｆｆｅｒ）である。
【0034】
[0047]本開示のさらに別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地サプリメントと、任意の動物成分及び／又は動物タンパク質を欠く無血清培地と前記サプリメントを混合するための説明書とを含むキットを提供する。
【0035】
[0048]本開示のさらに別の態様は、任意の本明細書に開示の細胞培養培地中で細胞を培養するステップによって培養肉を生産する及び培養細胞から肉を生産する方法を提供する。
【0036】
[0049]一部の実施形態では、細胞は食用動物由来である。一部の実施形態では、食用動物は家畜、狩猟動物、家禽、魚、又は甲殻類である。
[0050]一部の実施形態では、方法は培養細胞を含み、細胞は繊維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞は、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である。
[0050]一部の実施形態では、方法は培養細胞を含み、細胞は繊維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞は、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である。
【0037】
[0051]本開示のさらに別の態様は、上記及び本明細書に開示される方法によって生産された培養肉を提供する。
[0052]本開示のさらに別の態様は、任意の動物タンパク質及び／又は動物成分を欠く細胞培養培地を生産する方法を提供する。方法は、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く無血清基本培地と任意の動物血清由来成分を本質的に欠く任意の本明細書に開示の細胞培養培地サプリメントとを混合するステップを含む。
[0052]本開示のさらに別の態様は、任意の動物タンパク質及び／又は動物成分を欠く細胞培養培地を生産する方法を提供する。方法は、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く無血清基本培地と任意の動物血清由来成分を本質的に欠く任意の本明細書に開示の細胞培養培地サプリメントとを混合するステップを含む。
【0038】
[0053]本開示のさらに別の態様は、上記の方法によって生産される細胞培養培地を提供する。
[0054]本開示のさらなる態様は、細胞培養培地サプリメント中の動物タンパク質の代わりに動物タンパク質の植物タンパク質相同体の使用を提供する。一実施形態では、動物タンパク質は血清タンパク質である。一部の実施形態では、サプリメントは、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く。
[0054]本開示のさらなる態様は、細胞培養培地サプリメント中の動物タンパク質の代わりに動物タンパク質の植物タンパク質相同体の使用を提供する。一実施形態では、動物タンパク質は血清タンパク質である。一部の実施形態では、サプリメントは、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く。
【0039】
[0055]特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（複数可）を有するこの特許又は公開特許公報の副本は、特許庁からの要求及び必要経費の支払いによって提供されるであろう。
【0040】
[0056]本発明の前述の態様及び他の特徴は、添付の図面に関して以下の記載で説明される：
【図面の簡単な説明】
【0041】
【発明を実施するための形態】
【0042】
[0072]本開示の原理の理解を促進する目的のため、ここで実施形態が参照され、特定の言語がそれを記載するために使用されるであろう。しかしながら、それにより本開示の範囲の限定が意図されず、本明細書に示したように本開示のそのような変更及びさらなる改変は、本開示が関連する当業者に通常想起されるであろうと考えられる。
【0043】
[0073]本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、本発明を限定することを意図しない。
[0074]本明細書で使用される場合、用語「動物成分」又は「動物成分（複数）」は、成分が動物から由来する、得られる、産生される、又は生産される組成物を指す。成分は、それらが組換えにより生産されるか又は植物若しくは動物以外の供給源由来である場合、「動物成分」ではない。本明細書で使用される場合、「動物成分」は、組換え動物成分を含む、細胞系における培地の成分の組換え生産を含まない。また「動物成分」は、動物細胞系で生産された成分を含まない。
[0074]本明細書で使用される場合、用語「動物成分」又は「動物成分（複数）」は、成分が動物から由来する、得られる、産生される、又は生産される組成物を指す。成分は、それらが組換えにより生産されるか又は植物若しくは動物以外の供給源由来である場合、「動物成分」ではない。本明細書で使用される場合、「動物成分」は、組換え動物成分を含む、細胞系における培地の成分の組換え生産を含まない。また「動物成分」は、動物細胞系で生産された成分を含まない。
【0044】
[0075]本明細書で使用される場合、用語「動物血清由来成分」又は「動物血清由来成分（複数）」は、成分が動物血清から由来する、得られる、産生される、又は生産される組成物を指す。成分は、それらが組換えにより生産されるか又は植物若しくは動物血清以外の供給源由来である場合、「動物血清由来成分」ではない。本明細書で使用される場合、「動物血清由来成分」は、組換え動物成分を含む、細胞系における培地の成分の組換え生産を含まない。また「動物血清由来成分」は、動物細胞系で生産された成分を含まない。
【0045】
[0076]本明細書で使用される場合、「欠く（ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ）」又は「含まない（ｆｒｅｅ）」（「動物成分を含まない」のように）、「本質的に欠く（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ）」又は「本質的に含まない（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ）」は、非検出可能な、又は少量の、又はわずかな量の成分を意味する。用語「非検出可能な（ｎｏｎ－ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ）」は、本出願の時点で、当技術分野で公知の検出の標準的な方法論に基づくと理解される。一部の実施形態では、「少量（ｓｍａｌｌ ａｍｏｕｏｎｔ）」は、１重量％未満を指す。
【0046】
[0077]本明細書で使用される場合、「動物成分を含まない」、「動物成分を欠く」、又は「動物成分を本質的に欠く」は、成分が動物から由来しない、得られない、産生されない、又は生産されない組成物を指す。成分は、組換えにより生産されるか又は植物若しくは動物以外の供給源由来であるかのいずれかであると考えられる。本明細書で使用される場合、「動物成分を含まない」、「動物成分を欠く」、又は「本質的に欠く」は、動物ベ
ースの細胞系における培地の成分の組換え生産を可能にする。
ースの細胞系における培地の成分の組換え生産を可能にする。
【0047】
[0078]本明細書で使用される場合、用語「基本培地（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉａ）」、「基本培地（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）」、「基本培地（ｂａｓｅ ｍｅｄｉａ）」、「基本培地（ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ）」、「基本栄養培地（ｂａｓｅ ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）」、又は「基本栄養培地（ｂａｓｅ ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ ｍｅｄｉａ）」は、正常な細胞代謝に必須の、並びに細胞内外の浸透圧の平衡を維持する水及びある特定のバルク無機イオンを細胞に提供する、基本塩栄養（複数可）又は塩の水溶液（複数可）及び他の要素を指す。一部の実施形態では、基本培地は、エネルギー源として少なくとも１つの炭水化物、及び／又は生理学的なｐＨ範囲内に培地を維持する緩衝システムを含む。市販の基本培地の例としては、限定はされないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１０、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２、α－最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地、又はＸ－ＶＩＶＯ（Ｌｏｎｚａ）のような多能性細胞との使用のために改変された多目的培地、又は造血基本培地が挙げられる。
【0048】
[0079]本明細書で使用される場合、「Ｂ２７サプリメント」（「Ｂ２２サプリメント」としても知られている）は、例えば、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ２１１０３－０４９×２ユニット）中で集合した、２１個の成分及び１００ｇのＢＳＡ（例えば、画分Ｖ ＩｇＧ 脂肪酸不含有 低 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ３００３６５７８×１ユニット）を含有する培地サプリメントである。以下の２１個の成分はＢ２７サプリメントに存在する：１）カタラーゼ、２）還元型グルタチオン、３）ヒトインシュリン、４）スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、５）ヒトＨｏｌｏ－トランスフェリン、６）Ｔ３、７）Ｌ－カルニチン、８）エタノールアミン、９）Ｄ＋－ガラクトース、１０）プトレシン、１１）亜セレン酸ナトリウム、１２）コルチコステロン、１３）リノール酸、１４）リノレン酸、１５）プロゲステロン、１６）酢酸レチノール、１７）ＤＬ－アルファトコフェロール（ｖｉｔ Ｅ）、１８）ＤＬ－アルファ酢酸トコフェロール、１９）オレイン酸、２０）ピペコリン酸及び２１）ビオチン。Ｂ２７サプリメントは、ビタミンＡ不含Ｂ２７サプリメント：酢酸レチノールを除去、Ｔ３不含Ｂ２７サプリメント：Ｔ３（＃６）が適切な場合省かれる、抗酸化剤（ＡＯ）不含Ｂ２７サプリメント：以下の５個の抗酸化剤：＃１、＃２、＃４、＃１７、＃１８が省かれるべきであり、及びＢＳＡ不含Ｂ２７サプリメント：ＢＳＡを除去として改変される。必要であれば、ヒト組換えアルブミン又は血清アルブミンが代わりに使用され得る。
【0049】
[0080]本明細書で使用される場合、「完全培地」は、細胞増殖に貢献することができる、増殖因子、ホルモン、タンパク質、血清又は血清代替物、微量元素、糖、抗生物質、抗酸化剤等のような、添加したサプリメントをさらに含む基本培地を指す。例えば、市販の完全培地は、エタノールアミン、グルタチオン（還元）、アスコルビン酸リン酸、インシュリン、ヒトトランスフェリン、脂質リッチウシ血清アルブミン、微量塩、亜セレン酸ナトリウム、メタバナジン酸（ｍａｔａｖａｎａｄａｔｅ）アンモニウム、硫酸銅及び塩化マンガン（ＤＭＥＭ ＡＤＶＡＮＣＥＤ（商標）培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のようなサプリメントを含む。
【0050】
[0081]本明細書で使用される場合、用語「結合組織細胞」は、結合組織を作り上げる様々な細胞型を指す。例えば、結合組織細胞は、線維芽細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞及び平滑筋細胞、又は線維芽細胞から自然に分化され得る細胞型である。本明細書で使用される場合、用語「自然分化（ｎａｔｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」又は「自然分化形態（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆｏｒｍ）」は、自然に生じる分化を指すために使用され、実験室で人工的に達成され得るもののよう
な分化転換を指すためには使用されず、また脱分化ではない。線維芽細胞から自然分化され得る細胞型は、軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋線維芽細胞、筋芽細胞及び筋細胞を含む。結合組織細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又はＭＳＣ由来細胞又は多能性細胞ではない。
な分化転換を指すためには使用されず、また脱分化ではない。線維芽細胞から自然分化され得る細胞型は、軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋線維芽細胞、筋芽細胞及び筋細胞を含む。結合組織細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又はＭＳＣ由来細胞又は多能性細胞ではない。
【0051】
[0082]本明細書で使用される場合、語句「自然発生的に不死化した線維芽細胞（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）」は、不死化を引き起こす人為的な突然変異、例えば遺伝子操作に供されることなく、無制限に細胞分化、及び好ましくは細胞増殖も行うことができる線維芽細胞を指す。自然発生的に不死化した線維芽細胞は、非遺伝的に改変されている。
【0052】
[0083]本明細書で使用される場合、「液体ベース混合物」又は「ベース生理学的緩衝液混合物」は、細胞培養培地組成物を完成させるためにリポソームが懸濁される血清代替物又は培地サプリメントのベース溶液を指す。細胞培養の細胞に融合される／取り込まれる場合、リポソームが細胞へと液体ベース混合物を送達するように、液体ベース混合物をリポソームにロードすることが考えられる。本明細書では、液体ベース混合物又はベース生理学的緩衝液体混合物が、リポソーム及び／又は本明細書の他の成分と併せて使用され、血清代替物、完全培地、培地サプリメント、又は細胞凍結保存培地を形成することができる、基本培地、完全培地又は生理学的緩衝溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び他の平衡塩類溶液であることも考えられる。
【0053】
[0084]本明細書で使用される場合、「培地」又は「細胞培養培地」は、細胞の増殖、生存能、又は保存を提供する水ベース溶液を指す。本明細書で検討する培地は、１つ又はそれ以上の栄養素を補充し、所望の細胞活性、例えば培地中で培養した細胞の細胞生存能、成長、増殖、分化を促進することができる。培地は、本明細書で使用される場合、血清代替物、培地サプリメント、完全培地又は細胞凍結保存培地を含む。培養培地のｐＨは、微生物が増殖するのに好適であるはずである。ほとんどの細菌はｐＨ６．５～７．０で増殖するが、ほとんどの動物細胞はｐＨ７．２～７．４で成長する。
【0054】
[0085]本明細書で使用される場合、「培地サプリメント」は、細胞の培養の前に基本培地に添加される薬剤又は組成物を指す。培地サプリメントは、培養での細胞増殖に有益な薬剤、例えば増殖因子（複数可）、ホルモン（複数可）、タンパク質（複数可）、血清又は血清代替物、微量元素（複数可）、糖（複数可）、抗生物質（複数可）、抗酸化剤（複数可）等であり得る。典型的には、培地サプリメントは、細胞培養に適切な最終濃度に達するまで完全又は基本培地へと希釈される所望のサプリメントの濃縮溶液である。
【0055】
[0086]本明細書で使用される場合、「血清代替物」又は「血清代替物培地」は、培養中での細胞増殖及び生存を促進するために、基本培地と併せて又は完全培地として使用され得る組成物を指す。血清代替物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の培養のため、培地に特徴的に添加される任意の血清の代替物として基本又は完全培地で使用される。血清代替物は、培養中の細胞の増殖及び生存のためのタンパク質及び他の因子を含むことが考えられる。血清代替物は、細胞培養での使用の前に基本培地へと添加される。血清代替物は、血清代替物が細胞培養の無血清完全培地として有用であるように、基本培地及び、塩、アミノ酸、ビタミン、微量元素、抗酸化剤等のような基本栄養素を含み得ることがさらに考えられる。
【0056】
[0087]本開示では、特に請求項及び／又は段落では、用語、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等は、米国特許法による意味を有することができ；例えば、それらは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味す
ることができ；並びに「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のような用語は、米国特許法に帰する意味を有し、例えば明確に列挙されない要素を許容するが、先行技術に見出される、又は本発明の基本若しくは新規の特徴に影響する要素を除外することに注意されたい。
ることができ；並びに「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のような用語は、米国特許法に帰する意味を有し、例えば明確に列挙されない要素を許容するが、先行技術に見出される、又は本発明の基本若しくは新規の特徴に影響する要素を除外することに注意されたい。
【0057】
[0088]本明細書に開示されるのは、動物タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む細胞培養培地サプリメント及びそれを作製する方法である。一部の実施形態では、動物タンパク質は血清タンパク質である。また、本明細書で開示されるのは、開示された細胞培養培地サプリメント中で細胞を培養する、及び培養肉の生産のために前記培養を利用する方法である。本明細書で開示される細胞培養培地サプリメントは、細胞培養培地及びキットでも使用され得る。驚くべきことに、任意の動物タンパク質及び／又は動物成分を欠く細胞培養を可能にする方法で、植物タンパク質相同体が細胞培養で利用され得ることが発見された。培養培地中でのそのような植物ベースタンパク質の使用は、培養肉の製造のための培地のコストを著しく削減する。
【0058】
[0089]本開示の一態様は、動物タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む細胞培養培地サプリメントを提供する。動物タンパク質は、血清タンパク質であり得る。そのように、一部の実施形態では、血清タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む細胞培養培地サプリメントが提供される。サプリメントは、いずれの動物血清タンパク質も欠き得る。サプリメントは、いずれの動物血清由来成分も本質的に欠き得る。
【0059】
[0090]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、血清アルブミン、血清カタラーゼ、血清スーパーオキシドジスムターゼ、血清トランスフェリン、血清フィブロネクチン、血清ビトロネクチン、血清インシュリン、血清ヘモグロビン、血清アルドラーゼ、血清リパーゼ、血清トランスアミナーゼ、血清アミノトランスフェラーゼ、血清フェチュイン、又はこれらの組合せの相同体であり得る。
【0060】
[0091]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物アルブミン、植物カタラーゼ、植物スーパーオキシドジスムターゼ、植物トランスフェリン、植物フィブロネクチン、植物ビトロネクチン、植物インシュリン、植物レグヘモグロビン、植物アルドラーゼ、植物リパーゼ、植物トランスアミナーゼ、植物アミノトランスフェラーゼ、植物シスタチン、又はこれらの組合せである。
【0061】
[0092]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物アルブミン、植物カタラーゼ、植物フィブロネクチン、及び植物インシュリンを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物ビトロネクチンをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物スーパーオキシドジスムターゼをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は植物トランスフェリンをさらに含む。
【0062】
[0093]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物アルブミン相同体であり得る。一部の実施形態では、植物アルブミン相同体は、植物タンパク質単離物の水溶性画分由来である。植物タンパク質単離物の水溶性画分は、植物アルブミン及びグロブリンを含み得る。
【0063】
[0094]アルブミンは、球状タンパク質のファミリーであり、通常グロブリンタンパク質ファミリーに関連する。アルブミンは、水溶性タンパク質であり、濃縮した塩溶液中で適度に可溶性であり、及び熱変成を経験する。
【0064】
[0095]動物アルブミンは、一般に、血漿中に見出される。他の血液タンパク質とは異なり、それらはグリコシル化されない。最も一般的に特徴付けられた、及び医学的に使用されるアルブミンは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、６５～７０キロダルトン（Ｋｄ）である。これらの血清アルブミンは、集合して心臓型タンパク質を形成する３つの相同体ドメインを含む。各ドメインは、共通の構造モチーフを持つ２つのサブドメインの産物である。他のアルブミン型は、卵白中の保存タンパク質オボアルブミン、及び一部の植物の種子中の異なる保存アルブミンを含む。アルブミンは、細胞表面受容体アルボンジンに結合するが、ピノサイトーシスによって細胞膜に入ることもできる。
【0065】
[0096]血清アルブミンは、血液の膠質浸透圧の維持に重要な役割を果たし、脂肪酸、脂質、及び増殖因子を細胞に送達する重要な運搬タンパク質として利用される。好ましい実施形態では、アルブミン相同体は、少なくとも５０μＭのオレイン酸に結合するのに十分な濃度で使用され得る脂質担体である。
【0066】
[0097]植物アルブミンは、多くの植物、例えばエンドウ（Ｃｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９８４ Ｍａｒ １５；２１８（３）：７９５－８０３）、ヒラマメ（Ｎｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｌａｔｉｎｏａｍ Ｎｕｔｒ．１９９６ Ｓｅｐ；４６（３）：２３８－４２）、及びヘンプ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ，１８（４）：９３６－９５２）などの種子に豊富である。それらは、ジャガイモのような澱粉植物の根にも一般的である（Ｊｉｒｇｅｎｓｏｎｓ，１９４６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１（６）：４８４－４９４）。植物アルブミンは、通常、保存タンパク質として機能する。それらは、通常、４５～５５Ｋｄのホモ二量体として同定される（Ｃｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９８４ Ｍａｒ １５；２１８（３）：７９５－８０３）。
【0067】
[0098]植物保存アルブミンは、種子発芽の間に壊され、実生の発生のための窒素及び硫黄を提供する。種子成熟の間、これらのタンパク質は、翻訳後修飾、及びそれらが液胞中に大量に及び優れた安定性で堆積する前に輸送に供される（Ｍｙｌｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１（７）：６７１－６７７）。Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔａ．２０１５ Ｍａｙ；２４１（５）：１０６１－７３））は、ヘモペキシンフォールド及び血球凝集活性を持つヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）（ｃｈｉｃｋｐｅａ）由来の植物アルブミンの結晶構造を提供する。Ｄｚｉｕｂａ ｅｔ ａｌ．（Ａｃｔａ Ｓｃｉ．Ｐｏｌ．，Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｌｉｍｅｎｔ．２０１４，１３（２）：１８１－１９０）は、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ Ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）種子のアルブミン及びグロブリン画分のプロテオミクス解析を提供する。
【0068】
[0099]アルブミンは、培養中でウシ血清アルブミンを置き換える、ジャガイモ、エンドウ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オーツムギ、及びキビ中で同定及び精製された。一部の実施形態では、植物アルブミンは、ヒヨコマメアルブミン、ヘンプシードアルブミン、ヒラマメアルブミン、エンドウアルブミン、ダイズアルブミン、コムギアルブミン、ジャガイモアルブミン、又はこれらの組合せである。別の実施形態では、植物アルブミンは、エンドウアルブミン、ジャガイモアルブミン、又はこれらの組合せである。一実施形態では、植物アルブミンは、エンドウアルブミンである。一実施形態では、植物アルブミンは、ジャガイモアルブミンである。
【0069】
[00100]一部の実施形態では、植物アルブミンは、マメ科植物のアルブミンを含む。非
限定的な例としては、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｇａｒｄｅｎ ｐ
ｅａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６２９３１，Ｐ６２９３０，Ｐ６２９２７，Ｐ６２９２６，Ｐ６２９２８，Ｐ６２９２９）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（Ｂａｒｒｅｌ ｍｅｄｉｃ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｇ７ＫＨＳ２，Ｉ３ＳＷ９７，Ｉ３Ｓ２Ｙ７，Ａ０Ａ０７２Ｖ８Ｚ６，Ａ０Ａ０７２ＵＹＪ７）、ジグザグクローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｍｅｄｉｕｍ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３９２Ｍ２Ｇ９）及びヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）（Ｃｈｉｃｋｐｅａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ２Ｚ３Ｃ２）のアルブミンが挙げられる。そのようなタンパク質のアライメントは、高い配列類似性及び機能（例えば栄養保存活性）を実証するタンパク質のファミリー内の実質的な配列バリエーションを示す。参照のため、前述のタンパク質のアライメントを図１に示し、血清アルブミンの相同体である１３個のマメ科植物アルブミンの比較を示す。詳細には、Ａ２Ｕ０１＿０００１９９７（ジグザグクローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｍｅｄｉｕｍ））の７８～１２２と比較したＰ６２９２７の７１～１１３の配列にわたり、Ａ２Ｕ０１＿０００１９９７とのＰ６２９２７（マメアルブミン）のアライメントは、４３アミノ酸のうち２９が同一であり、４３アミノ酸のうち３４が同一又は保存されている。非保存領域では、本発明の相同体はよりバリエーション、例えば少なくとも９５％同一性、少なくとも９０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも６０％同一性、又は少なくとも５０％同一性を有する。アライメントは、当業者による、血清タンパク質の相同体である植物タンパク質のファミリーの同定を例示する。置換、挿入及び欠失のような突然変異に関して、アライメントは、高い配列同一性及び類似性の領域を例示する。
限定的な例としては、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｇａｒｄｅｎ ｐ
ｅａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６２９３１，Ｐ６２９３０，Ｐ６２９２７，Ｐ６２９２６，Ｐ６２９２８，Ｐ６２９２９）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（Ｂａｒｒｅｌ ｍｅｄｉｃ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｇ７ＫＨＳ２，Ｉ３ＳＷ９７，Ｉ３Ｓ２Ｙ７，Ａ０Ａ０７２Ｖ８Ｚ６，Ａ０Ａ０７２ＵＹＪ７）、ジグザグクローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｍｅｄｉｕｍ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３９２Ｍ２Ｇ９）及びヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）（Ｃｈｉｃｋｐｅａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ２Ｚ３Ｃ２）のアルブミンが挙げられる。そのようなタンパク質のアライメントは、高い配列類似性及び機能（例えば栄養保存活性）を実証するタンパク質のファミリー内の実質的な配列バリエーションを示す。参照のため、前述のタンパク質のアライメントを図１に示し、血清アルブミンの相同体である１３個のマメ科植物アルブミンの比較を示す。詳細には、Ａ２Ｕ０１＿０００１９９７（ジグザグクローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｍｅｄｉｕｍ））の７８～１２２と比較したＰ６２９２７の７１～１１３の配列にわたり、Ａ２Ｕ０１＿０００１９９７とのＰ６２９２７（マメアルブミン）のアライメントは、４３アミノ酸のうち２９が同一であり、４３アミノ酸のうち３４が同一又は保存されている。非保存領域では、本発明の相同体はよりバリエーション、例えば少なくとも９５％同一性、少なくとも９０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも６０％同一性、又は少なくとも５０％同一性を有する。アライメントは、当業者による、血清タンパク質の相同体である植物タンパク質のファミリーの同定を例示する。置換、挿入及び欠失のような突然変異に関して、アライメントは、高い配列同一性及び類似性の領域を例示する。
【0070】
[00101]一部の実施形態では、植物アルブミンは、パタチン又はパタチン相同体を含む
。パタチンは、糖タンパク質のファミリー及び主要な塊茎保存タンパク質を含む。パタチンは、ジャガイモ並びにトウガラシ、タバコ、及びトマトのようなナス属の植物に見出される。パタチンは、脂質アシルヒドラーゼ（ＬＡＨ）を含むエステラーゼ活性及びアシルトランスフェラーゼ活性を有することが示されている。植物アルブミンの非限定的な例は、ＭＳによってジャガイモ抽出物において同定され、パタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ１ＡＧＸ５、Ｑ２ＭＹＰ６、Ｑ２ＶＢＩ２、Ｑ２ＶＢＪ３、Ａ０Ａ０９７Ｈ１４９）及びパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質（ＰＮＰＬＡ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ１Ｂ３Ｗ０）が挙げられる。血清タンパク質相同体は、限定はされないが、パタチン、及び以下のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号によって記載されるアミノ酸配列を含むパタチン断片を含む：Ｍ１ＡＧＸ５、Ｐ１５４７７、Ｑ２ＭＹ５１、Ｑ２ＭＹ３７、Ｑ２ＭＹ４５、Ｑ２ＭＹ３６、Ｐ１１７６８、Ｑ３ＹＪＴ２、Ｑ２ＭＹ５２、Ｐ１５４７６、Ｑ２ＭＹ４２、Ｑ２ＭＹ４１、Ｐ０７７４５、Ｑ８ＬＰＷ４、Ｑ２ＭＹ４８、Ｑ２ＭＹ４０、Ｑ２ＭＹ４４、Ｐ１５４７８、Ｑ４２５０２、Ｑ３ＹＪＴ３、Ｑ３ＹＪＴ０、Ｑ２ＭＹ５６、Ｑ２ＭＹ５８、Ｑ２ＭＹ５４、Ｑ２ＭＹ４３、Ｑ２ＭＹ５０、Ｑ２ＭＹ６０、Ｑ２ＭＹ３９、Ｑ２ＭＹ３８、Ｑ３ＹＪＴ５、Ｑ２ＭＹ５９、Ｑ２ＭＹ５５、Ｑ４１４８７、Ｑ３ＹＪＴ４、Ｑ３ＹＪＳ９、Ｑ８ＬＳＣ１、Ｑ２ＶＢＩ５、Ａ０Ａ１Ｓ３ＹＷＸ７、Ａ０Ａ１Ｊ６ＨＸＵ４、Ａ０Ａ２Ｇ３ＤＤＫ１、Ａ０Ａ１Ｕ８ＥＸ１１、Ａ０Ａ１Ｕ８ＥＭＬ３、Ａ０Ａ２Ｇ２Ｗ４Ｉ９、Ａ０Ａ１Ｕ８ＥＭＲ５、Ａ０Ａ２Ｇ３ＤＤＬ４、Ｍ１ＢＦＪ１、Ａ０Ａ０Ｖ０ＨＳＨ３、Ａ０Ａ１Ｊ６ＫＩＷ４、Ｏ２４１５２、Ａ０Ａ１Ｊ６Ｉ２Ｈ９、Ａ０Ａ１Ｕ７ＸＦＱ０、及びＡ０Ａ１Ｓ４ＢＪＱ４。他の実施形態では、全パタチンの任意のパタチン断片は、以下のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号に記載の断片にサイズ及び位置が相当する並びに以下のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号に記載のアミノ酸配列を含み得る：Ｑ９ＡＵＨ５、Ｑ２ＶＢ１８、Ｑ２ＶＢＪ４、Ｑ９ＳＢ１８、Ｄ１ＭＩ８９、Ｑ２ＶＢＩ５、Ｉ６ＸＣＸ７、Ｑ２ＭＹＱ６、Ｑ４１４７５、Ｑ２ＭＹＧ０、Ｑ２ＶＢＩ９、Ｑ７ＤＭＶ４、Ｑ２ＶＢＪ３、Ｑ２ＶＢＩ２、及びＱ２ＭＹＰ６。例示的な実施例として、Ｑ９ＡＵＨ５に記載の５１アミノ酸（ａａ）相同体は、ａａ９２～ａａ１４２のＱ２ＭＹ４８の断片である。Ｑ２ＶＢ１９に記載の１３２ａａ断片は、ａａ２１６～ａａ３８７のＱ２ＭＹ５８の断片である。同様に、Ｑ２ＶＢＪ４に記載の１３２ａａ断片は、ａａ２１６
～ａａ３８７のＱ２ＭＹ５６の断片である。Ｑ９ＳＢ１８に記載の１８ａａ断片は、ａａ３６９～ａａ３８６のＱ８ＬＰＷ４の断片である。記載した例におよそのサイズ及び位置が相当する任意のパタチンの断片は、本発明の血清タンパク質相同体を含む。
。パタチンは、糖タンパク質のファミリー及び主要な塊茎保存タンパク質を含む。パタチンは、ジャガイモ並びにトウガラシ、タバコ、及びトマトのようなナス属の植物に見出される。パタチンは、脂質アシルヒドラーゼ（ＬＡＨ）を含むエステラーゼ活性及びアシルトランスフェラーゼ活性を有することが示されている。植物アルブミンの非限定的な例は、ＭＳによってジャガイモ抽出物において同定され、パタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ１ＡＧＸ５、Ｑ２ＭＹＰ６、Ｑ２ＶＢＩ２、Ｑ２ＶＢＪ３、Ａ０Ａ０９７Ｈ１４９）及びパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質（ＰＮＰＬＡ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ１Ｂ３Ｗ０）が挙げられる。血清タンパク質相同体は、限定はされないが、パタチン、及び以下のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号によって記載されるアミノ酸配列を含むパタチン断片を含む：Ｍ１ＡＧＸ５、Ｐ１５４７７、Ｑ２ＭＹ５１、Ｑ２ＭＹ３７、Ｑ２ＭＹ４５、Ｑ２ＭＹ３６、Ｐ１１７６８、Ｑ３ＹＪＴ２、Ｑ２ＭＹ５２、Ｐ１５４７６、Ｑ２ＭＹ４２、Ｑ２ＭＹ４１、Ｐ０７７４５、Ｑ８ＬＰＷ４、Ｑ２ＭＹ４８、Ｑ２ＭＹ４０、Ｑ２ＭＹ４４、Ｐ１５４７８、Ｑ４２５０２、Ｑ３ＹＪＴ３、Ｑ３ＹＪＴ０、Ｑ２ＭＹ５６、Ｑ２ＭＹ５８、Ｑ２ＭＹ５４、Ｑ２ＭＹ４３、Ｑ２ＭＹ５０、Ｑ２ＭＹ６０、Ｑ２ＭＹ３９、Ｑ２ＭＹ３８、Ｑ３ＹＪＴ５、Ｑ２ＭＹ５９、Ｑ２ＭＹ５５、Ｑ４１４８７、Ｑ３ＹＪＴ４、Ｑ３ＹＪＳ９、Ｑ８ＬＳＣ１、Ｑ２ＶＢＩ５、Ａ０Ａ１Ｓ３ＹＷＸ７、Ａ０Ａ１Ｊ６ＨＸＵ４、Ａ０Ａ２Ｇ３ＤＤＫ１、Ａ０Ａ１Ｕ８ＥＸ１１、Ａ０Ａ１Ｕ８ＥＭＬ３、Ａ０Ａ２Ｇ２Ｗ４Ｉ９、Ａ０Ａ１Ｕ８ＥＭＲ５、Ａ０Ａ２Ｇ３ＤＤＬ４、Ｍ１ＢＦＪ１、Ａ０Ａ０Ｖ０ＨＳＨ３、Ａ０Ａ１Ｊ６ＫＩＷ４、Ｏ２４１５２、Ａ０Ａ１Ｊ６Ｉ２Ｈ９、Ａ０Ａ１Ｕ７ＸＦＱ０、及びＡ０Ａ１Ｓ４ＢＪＱ４。他の実施形態では、全パタチンの任意のパタチン断片は、以下のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号に記載の断片にサイズ及び位置が相当する並びに以下のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号に記載のアミノ酸配列を含み得る：Ｑ９ＡＵＨ５、Ｑ２ＶＢ１８、Ｑ２ＶＢＪ４、Ｑ９ＳＢ１８、Ｄ１ＭＩ８９、Ｑ２ＶＢＩ５、Ｉ６ＸＣＸ７、Ｑ２ＭＹＱ６、Ｑ４１４７５、Ｑ２ＭＹＧ０、Ｑ２ＶＢＩ９、Ｑ７ＤＭＶ４、Ｑ２ＶＢＪ３、Ｑ２ＶＢＩ２、及びＱ２ＭＹＰ６。例示的な実施例として、Ｑ９ＡＵＨ５に記載の５１アミノ酸（ａａ）相同体は、ａａ９２～ａａ１４２のＱ２ＭＹ４８の断片である。Ｑ２ＶＢ１９に記載の１３２ａａ断片は、ａａ２１６～ａａ３８７のＱ２ＭＹ５８の断片である。同様に、Ｑ２ＶＢＪ４に記載の１３２ａａ断片は、ａａ２１６
～ａａ３８７のＱ２ＭＹ５６の断片である。Ｑ９ＳＢ１８に記載の１８ａａ断片は、ａａ３６９～ａａ３８６のＱ８ＬＰＷ４の断片である。記載した例におよそのサイズ及び位置が相当する任意のパタチンの断片は、本発明の血清タンパク質相同体を含む。
【0071】
[00102]一部の実施形態では、植物アルブミンは、種子保存アルブミン又はアルブミン
様タンパク質を含む。そのようなタンパク質は、栄養分保留、抗微生物又は抗真菌、セリン型エンドペプチダーゼ阻害剤のような活性及び機能を含み得る。非限定的な例としては、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）（Ｐｅａｎｕｔ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＰＳＵ２、Ｑ６４７Ｇ９）、ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（Ｃｏｍｍｏｎ ｂｕｃｋｗｈｅａｔ）（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ２ＰＳ０７）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（Ｃａｓｔｏｒ ｂｅａｎ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１０８９、Ｂ３ＥＷＮ４）、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ）（Ｗｈｉｔｅ ｍｕｓｔａｒｄ）（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｈｉｒｔａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１５３２２）、ノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｒｖｅｎｓｉｓ）（Ｃｈａｒｌｏｃｋ ｍｕｓｔａｒｄ）（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｋａｂｅｒ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３８０５７）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｊｕｎｃｅａ）（Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｓｔａｒｄ）（Ｓｉｎａｐｉｓ ｊｕｎｃｅａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８０２０７）、チンゲンサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（Ｐａｋ－ｃｈｏｉ）（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８４５２９）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（Ｓｏｙｂｅａｎ）（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｈｉｓｐｉｄａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１９５９４）、ヘンプ（Ｈｅｍｐ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２１９Ｄ１Ｌ６）、バーソレシア・エクセルサ（Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ ｅｘｃｅｌｓａ）（ブラジルナッツ（Ｂｒａｚｉｌ ｎｕｔ））（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０４４０３、Ｐ０Ｃ８Ｙ８）、マビンロウ（Ｃａｐｐａｒｉｓ ｍａｓａｉｋａｉ）（Ｍａｂｉｎｌａｎｇ）（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ３０２３３、Ｐ８０３５２、Ｐ８０３５１、Ｐ８０３５３）、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）（Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｓｅｓａｍｅ）（Ｓｅｓａｍｕｍ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＸＨＰ１、Ｂ３ＥＷＥ９）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）（Ｃｏｍｍｏｎ ｄａｎｄｅｌｉｏｎ）（Ｌｅｏｎｔｏｄｏｎ ｔａｒａｘａｃｕｍ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８６７８３）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（Ｒａｐｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２４５６５、Ｐ０９８９３、Ｐ１７３３３、Ｐ２７７４０、Ｐ０Ｃ８Ｙ８、Ｐ８０２０８）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）（Ｐｕｍｐｋｉｎ）（Ｗｉｎｔｅｒ ｓｑｕａｓｈ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ３９６４９）、ヘリアンサス・アナス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ（Ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ））（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２３１１０、Ｐ１５４６１）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｍｏｕｓｅ－ｅａｒ ｃｒｅｓｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＦＨ３１、Ｐ１５４５７、Ｐ１５４６０、Ｐ１５４５８）、ルピナス・アングスティフォリウス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）（Ｎａｒｒｏｗ－ｌｅａｖｅｄ ｂｌｕｅ ｌｕｐｉｎｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｆ５Ｂ８Ｗ８、Ｑ９９２３５、Ｆ５Ｂ８Ｘ０、Ｆ５Ｂ８Ｘ１）、ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）（イネ（Ｒｉｃｅ））（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２９８３５）、クサソテツ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉａ ｓｔｒｕｔｈｉｏｐｔｅｒｉｓ）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｏｓｔｒｉｃｈ ｆｅｒｎ）（Ｏｓｍｕｎｄａ ｓｔｒｕｔｈｉｏｐｔｅｒｉｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１７７１８）、トウヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）（Ｗｉｎｔｅｒ ｃｒｏｏｋｎｅｃｋ ｓｑｕａｓｈ）（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ ｖａｒ．ｍｏｓｃｈａｔａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８４５７６）、パッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）（Ｐａｓｓｉｏｎ ｆｒｕｉｔ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８４８８４）、及びカナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）（Ｗｈｉｔｅ ｓｐｒｕｃｅ）（Ｐｉｎｕｓ ｇｌａｕｃ
ａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２６９８６）が挙げられる。そのようなタンパク質のアライメントは、実質的な配列バリエーションを示すが、高度の配列類似性及び機能を実証するタンパク質のファミリー内である。例えば、前述のタンパク質の選択のアライメントは図２に示し、血清アルブミンの３０個の種子の保存アルブミン相同体の比較を示す。アライメントは、血清タンパク質の相同体である植物タンパク質のファミリーの同定を例示する。置換、挿入及び欠失のような突然変異に関して、アライメントは、高い配列同一性及び類似性の領域を例示する。
様タンパク質を含む。そのようなタンパク質は、栄養分保留、抗微生物又は抗真菌、セリン型エンドペプチダーゼ阻害剤のような活性及び機能を含み得る。非限定的な例としては、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）（Ｐｅａｎｕｔ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６ＰＳＵ２、Ｑ６４７Ｇ９）、ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（Ｃｏｍｍｏｎ ｂｕｃｋｗｈｅａｔ）（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ２ＰＳ０７）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（Ｃａｓｔｏｒ ｂｅａｎ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１０８９、Ｂ３ＥＷＮ４）、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ）（Ｗｈｉｔｅ ｍｕｓｔａｒｄ）（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｈｉｒｔａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１５３２２）、ノハラガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｒｖｅｎｓｉｓ）（Ｃｈａｒｌｏｃｋ ｍｕｓｔａｒｄ）（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｋａｂｅｒ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３８０５７）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｊｕｎｃｅａ）（Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｓｔａｒｄ）（Ｓｉｎａｐｉｓ ｊｕｎｃｅａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８０２０７）、チンゲンサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（Ｐａｋ－ｃｈｏｉ）（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８４５２９）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（Ｓｏｙｂｅａｎ）（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｈｉｓｐｉｄａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１９５９４）、ヘンプ（Ｈｅｍｐ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２１９Ｄ１Ｌ６）、バーソレシア・エクセルサ（Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ ｅｘｃｅｌｓａ）（ブラジルナッツ（Ｂｒａｚｉｌ ｎｕｔ））（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０４４０３、Ｐ０Ｃ８Ｙ８）、マビンロウ（Ｃａｐｐａｒｉｓ ｍａｓａｉｋａｉ）（Ｍａｂｉｎｌａｎｇ）（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ３０２３３、Ｐ８０３５２、Ｐ８０３５１、Ｐ８０３５３）、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）（Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｓｅｓａｍｅ）（Ｓｅｓａｍｕｍ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＸＨＰ１、Ｂ３ＥＷＥ９）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）（Ｃｏｍｍｏｎ ｄａｎｄｅｌｉｏｎ）（Ｌｅｏｎｔｏｄｏｎ ｔａｒａｘａｃｕｍ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８６７８３）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（Ｒａｐｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２４５６５、Ｐ０９８９３、Ｐ１７３３３、Ｐ２７７４０、Ｐ０Ｃ８Ｙ８、Ｐ８０２０８）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）（Ｐｕｍｐｋｉｎ）（Ｗｉｎｔｅｒ ｓｑｕａｓｈ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ３９６４９）、ヘリアンサス・アナス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ（Ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ））（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２３１１０、Ｐ１５４６１）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｍｏｕｓｅ－ｅａｒ ｃｒｅｓｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＦＨ３１、Ｐ１５４５７、Ｐ１５４６０、Ｐ１５４５８）、ルピナス・アングスティフォリウス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）（Ｎａｒｒｏｗ－ｌｅａｖｅｄ ｂｌｕｅ ｌｕｐｉｎｅ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｆ５Ｂ８Ｗ８、Ｑ９９２３５、Ｆ５Ｂ８Ｘ０、Ｆ５Ｂ８Ｘ１）、ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）（イネ（Ｒｉｃｅ））（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２９８３５）、クサソテツ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉａ ｓｔｒｕｔｈｉｏｐｔｅｒｉｓ）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｏｓｔｒｉｃｈ ｆｅｒｎ）（Ｏｓｍｕｎｄａ ｓｔｒｕｔｈｉｏｐｔｅｒｉｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１７７１８）、トウヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）（Ｗｉｎｔｅｒ ｃｒｏｏｋｎｅｃｋ ｓｑｕａｓｈ）（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ ｖａｒ．ｍｏｓｃｈａｔａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８４５７６）、パッションフルーツ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ）（Ｐａｓｓｉｏｎ ｆｒｕｉｔ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８４８８４）、及びカナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）（Ｗｈｉｔｅ ｓｐｒｕｃｅ）（Ｐｉｎｕｓ ｇｌａｕｃ
ａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２６９８６）が挙げられる。そのようなタンパク質のアライメントは、実質的な配列バリエーションを示すが、高度の配列類似性及び機能を実証するタンパク質のファミリー内である。例えば、前述のタンパク質の選択のアライメントは図２に示し、血清アルブミンの３０個の種子の保存アルブミン相同体の比較を示す。アライメントは、血清タンパク質の相同体である植物タンパク質のファミリーの同定を例示する。置換、挿入及び欠失のような突然変異に関して、アライメントは、高い配列同一性及び類似性の領域を例示する。
【0072】
[00103]植物アルブミンは、一般に、約５０～１１０Ｋｄの高分子量アルブミン、約２
０～３５Ｋｄの平均分子量アルブミン、及び約１３～１７Ｋｄの低分子量アルブミンに分類される。植物アルブミンは、通常、ホモ二量体として機能する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約１３～１１０キロダルトン（Ｋｄ）の分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約１３～１７Ｋｄの分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約２０～３５Ｋｄの分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約５０～１１０Ｋｄの分子量を有する。
０～３５Ｋｄの平均分子量アルブミン、及び約１３～１７Ｋｄの低分子量アルブミンに分類される。植物アルブミンは、通常、ホモ二量体として機能する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約１３～１１０キロダルトン（Ｋｄ）の分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約１３～１７Ｋｄの分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約２０～３５Ｋｄの分子量を有する。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約５０～１１０Ｋｄの分子量を有する。
【0073】
[00104]植物アルブミンは、培地中約０．０１％～約１０％（ｗ／ｗ）の濃度を有し得
る。一部の実施形態では、植物アルブミンは、培地中約０．０１％～約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有し得る。一部の実施形態では、植物アルブミンは、細胞培養培地中約０．０１重量％～約５重量％の濃度である。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約０．０１重量％～約０．０５重量％、約０．０１重量％～約０．０５重量％、約０．０５重量％～約０．１重量％、約０．１重量％～約０．１５重量％、約０．１５重量％～約０．２重量％、約０．２重量％～約０．２５重量％、約０．２５重量％～約０．３重量％、約０．３重量％～約０．３５重量％、約０．３５重量％～約０．４重量％、約０．４重量％～約０．４５重量％、又は約０．４５重量％～約０．５重量％の濃度である。
る。一部の実施形態では、植物アルブミンは、培地中約０．０１％～約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有し得る。一部の実施形態では、植物アルブミンは、細胞培養培地中約０．０１重量％～約５重量％の濃度である。一部の実施形態では、植物アルブミンは、約０．０１重量％～約０．０５重量％、約０．０１重量％～約０．０５重量％、約０．０５重量％～約０．１重量％、約０．１重量％～約０．１５重量％、約０．１５重量％～約０．２重量％、約０．２重量％～約０．２５重量％、約０．２５重量％～約０．３重量％、約０．３重量％～約０．３５重量％、約０．３５重量％～約０．４重量％、約０．４重量％～約０．４５重量％、又は約０．４５重量％～約０．５重量％の濃度である。
【0074】
[00105]本明細書に開示される細胞培養培地サプリメント中の所与の成分の量が、細胞
培養培地の最終重量又は容積中で所望の濃度を提供するように算出され得ることが、当業者には理解され得るだろう。例えば、細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加される場合、細胞培養培地中の植物アルブミンの最終濃度が所望の通り（例えば、最終細胞培養培地中０．０１％～約５％ ｗ／ｗ）であるように、当業者は、細胞培養培地サプリメント中に含まれる植物アルブミンの適切な濃度を決定することができる。
培養培地の最終重量又は容積中で所望の濃度を提供するように算出され得ることが、当業者には理解され得るだろう。例えば、細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加される場合、細胞培養培地中の植物アルブミンの最終濃度が所望の通り（例えば、最終細胞培養培地中０．０１％～約５％ ｗ／ｗ）であるように、当業者は、細胞培養培地サプリメント中に含まれる植物アルブミンの適切な濃度を決定することができる。
【0075】
[00106]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物カタラーゼであり得る。
[00107]過剰な過酸化水素は、ほとんど全ての細胞成分に有害であり、そのため、その
速く、効率的な除去は、好気的に生活する生物に非常に重要である。細胞は、ＦＢＳを補充された培地中で増殖及び成長する。ＦＢＳが、細胞培養の保護的役割を有し、その除去が細胞の生存能を非常に減少させることが知られるようになって久しい。Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ及びＯｖｅ（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９５８ Ｎｏｖ １；１０８（５）：６３１－７）は、生存能のこの減少が、肝臓からのタンパク質抽出物を使用してレスキューされ、酵素カタラーゼが次いでその重要な成分として同定されたことを示した。したがって、Ｂ２７サプリメント（Ｈｅｎｎａ ｌａｂからのａｋａＢ２２サプリメント）を含む、細胞の無血清培養を支持する既知組成のサプリメントは、多くのカタラーゼを含有する。
[00107]過剰な過酸化水素は、ほとんど全ての細胞成分に有害であり、そのため、その
速く、効率的な除去は、好気的に生活する生物に非常に重要である。細胞は、ＦＢＳを補充された培地中で増殖及び成長する。ＦＢＳが、細胞培養の保護的役割を有し、その除去が細胞の生存能を非常に減少させることが知られるようになって久しい。Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ及びＯｖｅ（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９５８ Ｎｏｖ １；１０８（５）：６３１－７）は、生存能のこの減少が、肝臓からのタンパク質抽出物を使用してレスキューされ、酵素カタラーゼが次いでその重要な成分として同定されたことを示した。したがって、Ｂ２７サプリメント（Ｈｅｎｎａ ｌａｂからのａｋａＢ２２サプリメント）を含む、細胞の無血清培養を支持する既知組成のサプリメントは、多くのカタラーゼを含有する。
【0076】
[00108]細胞培養中のカタラーゼは、ヒト赤血球（例えばＳｉｇｍａ ＃Ｃ３５５６）
又はウシ肝臓（例えばＳｉｇｍａ ＃Ｃ１３４５）由来であることが最も多い。カタラーゼは、単球菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）（例えばＳｉｇｍａ ＃６０６３４）若しくはコリネバクテリウム・グルタミウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（例えばＳｉｇｍａ ＃０２０７１）のような細菌から、又はクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（例えばＳｉｇｍ
ａ ＃Ｃ３５１３）のような真菌から産生されてもよい。
又はウシ肝臓（例えばＳｉｇｍａ ＃Ｃ１３４５）由来であることが最も多い。カタラーゼは、単球菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）（例えばＳｉｇｍａ ＃６０６３４）若しくはコリネバクテリウム・グルタミウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（例えばＳｉｇｍａ ＃０２０７１）のような細菌から、又はクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（例えばＳｉｇｍ
ａ ＃Ｃ３５１３）のような真菌から産生されてもよい。
【0077】
[00109]カタラーゼ（ＣＡＴ）は、ほとんど全ての生存生物で共通の抗酸化酵素である
。それは、過酸化水素の水と酸素への分解を触媒し、したがって、活性酸素種（ＲＯＳ）による酸化的損傷から細胞を保護する。カタラーゼ機能は、細菌からヒトまで進化的に保存されている（Ｚａｍｏｃｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．，２００８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１０（９）：１５２７－１５４８）。植物カタラーゼファミリーは、３つのカタラーゼを含み、それらは葉及び根に豊富に発現される（Ｓｈａｒｍａ ａｎｄ Ａｈｍａｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４－Ｃａｔａｌａｓｅ：Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｄａｍａｇｅ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２０１４，Ｐ．１３１－１４８）。活性なカタラーゼは、非常に簡単に植物から単離することができ、その保護機能は、ウシ肝臓カタラーゼがジャガイモ／キャベツカタラーゼ（Ｇｈｏｌａｍｈｏｓｅｉｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ａｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５（５）：８２７－８３１）又はキュウリカタラーゼ（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３９（３）：４０８－４１５，２０１６）と交換される無血清培養に、既知組成のサプリメントを使用して、組織培養中で試験することができる。
。それは、過酸化水素の水と酸素への分解を触媒し、したがって、活性酸素種（ＲＯＳ）による酸化的損傷から細胞を保護する。カタラーゼ機能は、細菌からヒトまで進化的に保存されている（Ｚａｍｏｃｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．，２００８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１０（９）：１５２７－１５４８）。植物カタラーゼファミリーは、３つのカタラーゼを含み、それらは葉及び根に豊富に発現される（Ｓｈａｒｍａ ａｎｄ Ａｈｍａｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４－Ｃａｔａｌａｓｅ：Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｄａｍａｇｅ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２０１４，Ｐ．１３１－１４８）。活性なカタラーゼは、非常に簡単に植物から単離することができ、その保護機能は、ウシ肝臓カタラーゼがジャガイモ／キャベツカタラーゼ（Ｇｈｏｌａｍｈｏｓｅｉｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ａｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５（５）：８２７－８３１）又はキュウリカタラーゼ（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３９（３）：４０８－４１５，２０１６）と交換される無血清培養に、既知組成のサプリメントを使用して、組織培養中で試験することができる。
【0078】
[00110]カタラーゼは、酸素に暴露されるほぼ全ての生存生物に見出される共通の水溶
性酵素である。それは、過酸化水素の水と酸素への分解を触媒する。それは、活性酸素種（ＲＯＳ）による酸化的損傷から細胞を保護するのを助ける。その代謝回転速度は、自然界で公知の最も速いものの１つである。
性酵素である。それは、過酸化水素の水と酸素への分解を触媒する。それは、活性酸素種（ＲＯＳ）による酸化的損傷から細胞を保護するのを助ける。その代謝回転速度は、自然界で公知の最も速いものの１つである。
【0079】
[00111]ヒトカタラーゼは、それぞれ５００アミノ酸長の、４つのポリペプチド鎖の四
量体である。それは、酵素を過酸化水素と反応させる４つの鉄含有ヘム基を含有する。
[00112]植物カタラーゼは、それらの成長条件に応じて、それらの最適温度及びｐＨ範
囲が異なる。それらは、それらが不均化反応を触媒する際に還元剤を必要としないことにより、ペルオキシダシンを代謝することができる他の酵素と最も明確に区別される（Ｍｈａｍｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｂｏｔａｎｙ，６１（１５）：４１９７－４２２０）。これらの酵素は、質量で５０～７０Ｋｄのポリペプチドからなり、ヘム補欠分子族を担持する各単量体により四量体に編成される（Ｒｅｇｅｌｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４０：４７９－４９０）。
量体である。それは、酵素を過酸化水素と反応させる４つの鉄含有ヘム基を含有する。
[00112]植物カタラーゼは、それらの成長条件に応じて、それらの最適温度及びｐＨ範
囲が異なる。それらは、それらが不均化反応を触媒する際に還元剤を必要としないことにより、ペルオキシダシンを代謝することができる他の酵素と最も明確に区別される（Ｍｈａｍｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｂｏｔａｎｙ，６１（１５）：４１９７－４２２０）。これらの酵素は、質量で５０～７０Ｋｄのポリペプチドからなり、ヘム補欠分子族を担持する各単量体により四量体に編成される（Ｒｅｇｅｌｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４０：４７９－４９０）。
【0080】
[00113]ヘム依存性カタラーゼの第２の型は、一部の真菌及び原核生物に見出される構
造的に異なるタンパク質である、二機能性カタラーゼ－ペルオキシダーゼである（Ｍｕｔｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，３１６：２５１－２５７；Ｒｅｇｅｌｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４０：４７９－４９０）。
造的に異なるタンパク質である、二機能性カタラーゼ－ペルオキシダーゼである（Ｍｕｔｓａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，３１６：２５１－２５７；Ｒｅｇｅｌｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４０：４７９－４９０）。
【0081】
[00114]Ｍａｒｔｉｎｓ及びＥｎｇｌｉｓｈ（ＲｅｄｏｘＢｉｏｌｏｇｙ，２０１４，
２：３０８－３１３）により、カタラーゼ活性はリッチ培養培地中でＨ２Ｏ２によって刺激され、酵母でのＨ２Ｏ２耐性及び適応に必要とされる。
２：３０８－３１３）により、カタラーゼ活性はリッチ培養培地中でＨ２Ｏ２によって刺激され、酵母でのＨ２Ｏ２耐性及び適応に必要とされる。
【0082】
[00115]カタラーゼの複数の分子形態は、異なる植物種、例えばタバコ（Ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａ ｔｏｂａｃｃｏ）（Ｈａｖｉｒ ａｎｄ ＭｃＨａｌｅ，１９８７，Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：４５０－４５５．）、綿（Ｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４９：２１９－２２２）、ニコチアナ・
プルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｌｆｏｌｉａ）（Ｗｉｌｌｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５２：７９－８３．）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ
ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：８８９－８９８）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）（Ｍｕｌｌｅｎ ａｎｄ Ｇｉｆｆｏｒｄ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：４７７－４８３）、ヒマワリ（Ｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７８：２５８－２６４）、カボチャ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５９：３１５－３２２）及びトマト（Ｇｉａｎｉｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．８９：１５７－１６４）で報告された。カタラーゼの命名は、異なる植物種でのそのアイソフォームにも基づく。Ｗｉｌｌｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：４８０６－４８１６）によって提唱された分類により、クラスＩ、クラスＩＩ及びクラスＩＩＩカタラーゼは、それぞれ光合成組織、維管束組織及び生殖組織において特異的に発現される。複数のカタラーゼアイソザイムの存在は、様々な植物種におけるカタラーゼの構造的及び機能的多様性を示唆する。様々なカタラーゼのｃＤＮＡは、遺伝子及びそれらの制御成分を理解するために、異なる植物種から単離され特徴付けられている（Ｓｃａｎｄａｌｉｏｓ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（５）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。カタラーゼのアイソザイムは、植物における発生段階及び器官特異性を示す。
ａｎａ ｔｏｂａｃｃｏ）（Ｈａｖｉｒ ａｎｄ ＭｃＨａｌｅ，１９８７，Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：４５０－４５５．）、綿（Ｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４９：２１９－２２２）、ニコチアナ・
プルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｌｆｏｌｉａ）（Ｗｉｌｌｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５２：７９－８３．）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ
ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：８８９－８９８）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）（Ｍｕｌｌｅｎ ａｎｄ Ｇｉｆｆｏｒｄ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：４７７－４８３）、ヒマワリ（Ｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７８：２５８－２６４）、カボチャ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５９：３１５－３２２）及びトマト（Ｇｉａｎｉｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．８９：１５７－１６４）で報告された。カタラーゼの命名は、異なる植物種でのそのアイソフォームにも基づく。Ｗｉｌｌｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：４８０６－４８１６）によって提唱された分類により、クラスＩ、クラスＩＩ及びクラスＩＩＩカタラーゼは、それぞれ光合成組織、維管束組織及び生殖組織において特異的に発現される。複数のカタラーゼアイソザイムの存在は、様々な植物種におけるカタラーゼの構造的及び機能的多様性を示唆する。様々なカタラーゼのｃＤＮＡは、遺伝子及びそれらの制御成分を理解するために、異なる植物種から単離され特徴付けられている（Ｓｃａｎｄａｌｉｏｓ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（５）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。カタラーゼのアイソザイムは、植物における発生段階及び器官特異性を示す。
【0083】
[00116]植物カタラーゼは、シロイヌナズナカタラーゼ、キャベツカタラーゼ、キュウ
リカタラーゼ、綿カタラーゼ、ジャガイモカタラーゼ、カボチャカタラーゼ、ホウレンソウカタラーゼ、ヒマワリカタラーゼ、タバコカタラーゼ、トマトカタラーゼ、又はこれらの組合せであってもよい。一実施形態では、植物カタラーゼは、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ、ジャガイモカタラーゼ、又はこれらの組合せである。一実施形態では、植物カタラーゼは、キュウリカタラーゼである。一実施形態では、植物カタラーゼはジャガイモカタラーゼである。
リカタラーゼ、綿カタラーゼ、ジャガイモカタラーゼ、カボチャカタラーゼ、ホウレンソウカタラーゼ、ヒマワリカタラーゼ、タバコカタラーゼ、トマトカタラーゼ、又はこれらの組合せであってもよい。一実施形態では、植物カタラーゼは、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ、ジャガイモカタラーゼ、又はこれらの組合せである。一実施形態では、植物カタラーゼは、キュウリカタラーゼである。一実施形態では、植物カタラーゼはジャガイモカタラーゼである。
【0084】
[00117]植物カタラーゼは、約５０～７０キロダルトンの分子量を有し得る。
[00118]一部の実施形態では、培地中の植物カタラーゼの濃度は、約１～約１００ｎｇ
／ｍｌ、例えば約７ｎｇ／ｍｌ、約１１ｎｇ／ｍｌ、約１４ｎｇ／ｍｌ、約１８ｎｇ／ｍｌ、約２１ｎｇ／ｍｌ、約２８ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、又は約５５ｎｇ／ｍｌの濃度であり得る。一部の実施形態では、培地中の植物カタラーゼの最終濃度は、約１ｇ／ｌ～約５ｇ／ｌ、及び有利には２．５ｇ／ｌであり得る。
[00118]一部の実施形態では、培地中の植物カタラーゼの濃度は、約１～約１００ｎｇ
／ｍｌ、例えば約７ｎｇ／ｍｌ、約１１ｎｇ／ｍｌ、約１４ｎｇ／ｍｌ、約１８ｎｇ／ｍｌ、約２１ｎｇ／ｍｌ、約２８ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、又は約５５ｎｇ／ｍｌの濃度であり得る。一部の実施形態では、培地中の植物カタラーゼの最終濃度は、約１ｇ／ｌ～約５ｇ／ｌ、及び有利には２．５ｇ／ｌであり得る。
【0085】
[00119]Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースは、ジャガイモカタラーゼ（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ
：Ｍ１ＡＬＴ０）に９０％同一性を有する少なくとも１２８タンパク質及びジャガイモカタラーゼに５０％同一性を有する少なくとも９５８タンパク質を含有する。同様に、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースは、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）カタラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ４３２０６）に９０％同一性を有する少なくとも２３タンパク質及びコムギカタラーゼに５０％同一性を有する少なくとも９５８タンパク質を含有する。本発明に従って使用した植物カタラーゼの供給源及びそれらの植物由来の例示的なカタラーゼは、限定はされないが、ダイズ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ４８５６１）、ヒヨコマメ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ２Ｙ８３５、Ｑ９ＺＲＵ４）、ペポカボチャ（Ｓｕｍｍｅｒ ｓｑｕａｓｈ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４８３５０）、リョクトウ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３２２９０）、インゲンマメ（ＵｉｎＰｒｏｔＫＢ：Ｔ２ＤＮ９６、Ｖ７ＡＱＳ４）、及び
綿（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１７５９８、Ａ０Ａ５Ｄ２Ｍ８Ｇ９、Ａ０Ａ５Ｊ５ＳＭＢ２）がさらに挙げられる。別の緑色植物データベース源は、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ、ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｐｏｒｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｅｉｎｚｅ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｃａｔａｌａｓｅｓ．Ｉｎ：Ｂａｋｅｒ Ａ．，Ｇｒａｈａｍ Ｉ．Ａ．（ｅｄｓ）Ｐｌａｎｔ Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ．）である。
：Ｍ１ＡＬＴ０）に９０％同一性を有する少なくとも１２８タンパク質及びジャガイモカタラーゼに５０％同一性を有する少なくとも９５８タンパク質を含有する。同様に、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースは、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）カタラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ４３２０６）に９０％同一性を有する少なくとも２３タンパク質及びコムギカタラーゼに５０％同一性を有する少なくとも９５８タンパク質を含有する。本発明に従って使用した植物カタラーゼの供給源及びそれらの植物由来の例示的なカタラーゼは、限定はされないが、ダイズ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ４８５６１）、ヒヨコマメ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ２Ｙ８３５、Ｑ９ＺＲＵ４）、ペポカボチャ（Ｓｕｍｍｅｒ ｓｑｕａｓｈ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４８３５０）、リョクトウ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３２２９０）、インゲンマメ（ＵｉｎＰｒｏｔＫＢ：Ｔ２ＤＮ９６、Ｖ７ＡＱＳ４）、及び
綿（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１７５９８、Ａ０Ａ５Ｄ２Ｍ８Ｇ９、Ａ０Ａ５Ｊ５ＳＭＢ２）がさらに挙げられる。別の緑色植物データベース源は、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ、ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｐｏｒｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｅｉｎｚｅ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｃａｔａｌａｓｅｓ．Ｉｎ：Ｂａｋｅｒ Ａ．，Ｇｒａｈａｍ Ｉ．Ａ．（ｅｄｓ）Ｐｌａｎｔ Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ．）である。
【0086】
[00120]本明細書に記載及び例示されるように、血清カタラーゼの植物相同体並びにフ
ァミリーのタンパク質間及び個々のメンバー間の保存及び非保存配列の領域が容易に認識される。置換、挿入及び欠失のような突然変異に関して、アライメントは、高い配列同一性及び類似性の領域に位置する。
ァミリーのタンパク質間及び個々のメンバー間の保存及び非保存配列の領域が容易に認識される。置換、挿入及び欠失のような突然変異に関して、アライメントは、高い配列同一性及び類似性の領域に位置する。
【0087】
[00121]植物カタラーゼの単離は、当業者に周知であり、液体分画、遠心分離、カラム
交換を含み、その全てが日常的な実験である。カタラーゼは、本開示において、ジャガイモで同定された。
交換を含み、その全てが日常的な実験である。カタラーゼは、本開示において、ジャガイモで同定された。
【0088】
[00122]少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物フィブロネクチン、植物ビト
ロネクチン、又はこれらの組合せであり得る。
[00123]培養中での細胞生存は、接着のために提供される表面によることが多い。Ｉｎ
ｖｉｖｏでは、基底膜の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、表面糖タンパク質のインテグリンファミリーを結合することにより、細胞を近隣組織へと接着させる。ラミニン、コラーゲンＩＶ及びヘパラン硫酸は、成体組織において基底膜タンパク質を構成し、胚組織及び再生組織はフィブロネクチンも示す。同じＥＣＭタンパク質の多くは、動物由来であるか又は組換えにより発現され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞接着及び増殖を支持する。
ロネクチン、又はこれらの組合せであり得る。
[00123]培養中での細胞生存は、接着のために提供される表面によることが多い。Ｉｎ
ｖｉｖｏでは、基底膜の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、表面糖タンパク質のインテグリンファミリーを結合することにより、細胞を近隣組織へと接着させる。ラミニン、コラーゲンＩＶ及びヘパラン硫酸は、成体組織において基底膜タンパク質を構成し、胚組織及び再生組織はフィブロネクチンも示す。同じＥＣＭタンパク質の多くは、動物由来であるか又は組換えにより発現され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞接着及び増殖を支持する。
【0089】
[00124]植物では、支持体及び足場のＥＣＭ様タンパク質の役割も認識されている。い
くつかの動物ＥＣＭ様タンパク質は、植物細胞壁で何年にもわたり発見された（Ｓｅｙｍｏｒｒ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２１（１）：１２３－１３２）。フィブロネクチン様タンパク質は、細胞壁－細胞膜接着に関与し、塩ストレス／水分欠乏の条件下で豊富であることが示されている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。Ｐｅｌｌｅｎｃ及びｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（Ｐｅｌｌｅｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３４：２０８－２１４）は、ヒト血漿からのフィブロネクチン単離のものと類似のプロトコールを使用して、植物からフィブロネクチン様タンパク質を単離することができた。
くつかの動物ＥＣＭ様タンパク質は、植物細胞壁で何年にもわたり発見された（Ｓｅｙｍｏｒｒ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２１（１）：１２３－１３２）。フィブロネクチン様タンパク質は、細胞壁－細胞膜接着に関与し、塩ストレス／水分欠乏の条件下で豊富であることが示されている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。Ｐｅｌｌｅｎｃ及びｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（Ｐｅｌｌｅｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３４：２０８－２１４）は、ヒト血漿からのフィブロネクチン単離のものと類似のプロトコールを使用して、植物からフィブロネクチン様タンパク質を単離することができた。
【0090】
[00125]ヒトビトロネクチンに免疫学的に関連するタバコタンパク質は、非適応及び塩
適応タバコ細胞の細胞壁及び膜に見出され、適応細胞に豊富である（Ｚｈｕ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．ｆｏｒ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３０ Ａｐｒ １９９３，３（５）：６３７－６４６）。タバコ細胞の５５Ｋｄのポリペプチドに特異的なＳａｎｄｅｒｓが発見した抗体は、ヒトＶｎも認識することができた（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３：６２９－６３５）。タバコミクロソーム膜の５９Ｋｄタンパク質に特異的な単一特異性抗体は、ヒトフィブロネクチンを認識する。
適応タバコ細胞の細胞壁及び膜に見出され、適応細胞に豊富である（Ｚｈｕ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．ｆｏｒ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３０ Ａｐｒ １９９３，３（５）：６３７－６４６）。タバコ細胞の５５Ｋｄのポリペプチドに特異的なＳａｎｄｅｒｓが発見した抗体は、ヒトＶｎも認識することができた（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，３：６２９－６３５）。タバコミクロソーム膜の５９Ｋｄタンパク質に特異的な単一特異性抗体は、ヒトフィブロネクチンを認識する。
【0091】
[00126]フィブロネクチンの植物相同体は、マメフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫ
Ｂ：Ｖ７Ｃ３Ｕ９、Ｖ７ＣＳＶ１、Ａ０Ａ０Ｌ９ＶＲＲ４、Ａ０Ａ１Ｓ３ＵＴ３５、Ａ０Ａ１Ｓ３ＵＶ５１）、ヒヨコマメフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ２
Ｚ０Ｒ０、Ａ０Ａ１Ｓ２ＹＤＺ６、Ａ０Ａ１Ｓ３Ｅ９Ｐ２、Ａ０Ａ１Ｓ３Ｅ９Ｋ８、Ａ０Ａ１Ｓ２ＹＥ００）、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：１ＮＸＣ４、Ａ０Ａ０Ｅ０ＪＶＭ６、Ｊ３Ｌ９Ｍ７、Ａ０Ａ０Ｅ０Ｎ９Ｚ２）、ダイズフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｉ１ＭＳＱ１、Ｉ１ＫＩＴ９、Ｋ７Ｌ４Ｕ６、Ａ０Ａ０Ｒ０ＩＫＥ０）タバコフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｊ６ＩＵ８０、Ａ０Ａ１Ｓ４Ｂ３Ｅ７、Ａ０Ａ１Ｓ４ＡＦ５２、Ａ０Ａ１Ｊ６ＨＹ８３）又はコムギフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｂ６ＮＮ９７、Ａ０Ａ３Ｂ６ＫＦ２５、Ａ０Ａ３Ｂ６ＱＢＪ６）、又はヒヨコマメ病害真菌フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１６３ＬＳＣ５、Ａ０Ａ１６３ＧＱＩ０）であり得る。
Ｂ：Ｖ７Ｃ３Ｕ９、Ｖ７ＣＳＶ１、Ａ０Ａ０Ｌ９ＶＲＲ４、Ａ０Ａ１Ｓ３ＵＴ３５、Ａ０Ａ１Ｓ３ＵＶ５１）、ヒヨコマメフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ２
Ｚ０Ｒ０、Ａ０Ａ１Ｓ２ＹＤＺ６、Ａ０Ａ１Ｓ３Ｅ９Ｐ２、Ａ０Ａ１Ｓ３Ｅ９Ｋ８、Ａ０Ａ１Ｓ２ＹＥ００）、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：１ＮＸＣ４、Ａ０Ａ０Ｅ０ＪＶＭ６、Ｊ３Ｌ９Ｍ７、Ａ０Ａ０Ｅ０Ｎ９Ｚ２）、ダイズフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｉ１ＭＳＱ１、Ｉ１ＫＩＴ９、Ｋ７Ｌ４Ｕ６、Ａ０Ａ０Ｒ０ＩＫＥ０）タバコフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｊ６ＩＵ８０、Ａ０Ａ１Ｓ４Ｂ３Ｅ７、Ａ０Ａ１Ｓ４ＡＦ５２、Ａ０Ａ１Ｊ６ＨＹ８３）又はコムギフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｂ６ＮＮ９７、Ａ０Ａ３Ｂ６ＫＦ２５、Ａ０Ａ３Ｂ６ＱＢＪ６）、又はヒヨコマメ病害真菌フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１６３ＬＳＣ５、Ａ０Ａ１６３ＧＱＩ０）であり得る。
【0092】
[00127]フィブロネクチン及びビトロネクチン様タンパク質は、いくつかの植物で同定
され、粗製の植物抽出物を使用して、細胞培養培地中での細胞の接着及び増殖を支持した。
され、粗製の植物抽出物を使用して、細胞培養培地中での細胞の接着及び増殖を支持した。
【0093】
[00128]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物フィブ
ロネクチンであり得る。一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、マメフィブロネクチン、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン、タバコフィブロネクチン、コムギフィブロネクチン又はこれらの組合せである。一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン、コムギフィブロネクチン、又はこれらの組合せである。一実施形態では、植物フィブロネクチンは、ヒラマメフィブロネクチンである。一実施形態では、植物フィブロネクチンは、イネフィブロネクチンである。一実施形態では、植物フィブロネクチンは、ダイズフィブロネクチンである。一実施形態では、植物フィブロネクチンは、コムギフィブロネクチンである。
ロネクチンであり得る。一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、マメフィブロネクチン、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン、タバコフィブロネクチン、コムギフィブロネクチン又はこれらの組合せである。一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン、コムギフィブロネクチン、又はこれらの組合せである。一実施形態では、植物フィブロネクチンは、ヒラマメフィブロネクチンである。一実施形態では、植物フィブロネクチンは、イネフィブロネクチンである。一実施形態では、植物フィブロネクチンは、ダイズフィブロネクチンである。一実施形態では、植物フィブロネクチンは、コムギフィブロネクチンである。
【0094】
[00129]植物フィブロネクチンは、約４０～６０Ｋｄの分子量を有し得る。動物血清フ
ィブロネクチンは、より大きい、約２５０Ｋｄの２つのサブユニットからなることが多い。一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、約４０～６０Ｋｄの分子量を有する。
ィブロネクチンは、より大きい、約２５０Ｋｄの２つのサブユニットからなることが多い。一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、約４０～６０Ｋｄの分子量を有する。
【0095】
[00130]一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、培地中約０．１μｇ／ｍｌ～
約１００μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、培地中約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、又は約５０μｇ／ｍｌの濃度である。
約１００μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態では、植物フィブロネクチンは、培地中約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、又は約５０μｇ／ｍｌの濃度である。
【0096】
[00131]一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物ビトロ
ネクチンであり得る。
[00132]一部の実施形態では、植物ビトロネクチンは、培地中約０．１μｇ／ｍｌ～約
１００μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態では、植物ビトロネクチンは、培地中約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、又は約５０μｇ／ｍｌの濃度である。
ネクチンであり得る。
[00132]一部の実施形態では、植物ビトロネクチンは、培地中約０．１μｇ／ｍｌ～約
１００μｇ／ｍｌの濃度である。一部の実施形態では、植物ビトロネクチンは、培地中約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、又は約５０μｇ／ｍｌの濃度である。
【0097】
[00133]植物フィブロネクチン及びビトロネクチンの単離は、当業者に周知であり、液
体分画、遠心分離、カラム交換を含み、その全てが日常的な実験である。
[00134]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物レグヘモグロビンであり得る
。
体分画、遠心分離、カラム交換を含み、その全てが日常的な実験である。
[00134]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物レグヘモグロビンであり得る
。
【0098】
[00135]一部の実施形態では、植物レグヘモグロビンは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１
００μｇ／ｍｌの濃度である。
[00136]レグヘモグロビンは、窒素固定細菌が根に定着することに応答してマメ科植物
によって産生される、マメ科植物の窒素固定根粒に見出される酸素運搬タンパク質である。レグヘモグロビンは、本発明の血清タンパク質相同体を含む。レグヘモグロビンは、限定はされないが、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｇａｒｄｅｎ ｐｅａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＬＧＢ１＿ＰＥＡ、ＬＧＢ２＿ＰＥＡ、ＬＧＢ３＿ＰＥＡ、ＬＧＢ４＿ＰＥＡ、ＬＧＢ５＿ＰＥＡ、ＬＧＢ６＿ＰＥＡ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）（Ａｌｆａｌｆａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＬＧＢ１＿ＭＥＤＳＡ、ＬＧＢ２＿ＭＥＤＳＡ、ＬＧＢ４＿ＭＥＤＳＡ、Ｑ４２９２８＿ＭＥＤＳＡ、Ｑ４３７８６＿ＭＥＤＳＡ、ハマナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｌｉｎｅａｔａ）（ハマアズキ（Ｂｅａｃｈ ｂｅａｎ））（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｌｉｎｅａｔｕｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＬＧＢ＿ＣＡＮＬＩ）、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）（Ｃｈｉｃｋｐｅａ）（Ｇａｒｂａｎｚｏ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ２ＹＺ７８、Ａ０Ａ１Ｓ２ＸＸＴ５、Ａ０Ａ１Ｓ２ＸＫＶ１、Ａ０Ａ１Ｓ２ＸＭＦ３）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ＭＡＸ）（Ｓｏｙｂｅａｎ）（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｈｉｓｐｉｄａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｒ０ＨＷ５１、Ｑ９６４２８、Ｑ４２８０１）、ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ）（Ｗｉｌｄ ｓｏｙｂｅａｎ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４４５ＩＰＸ６）、及びアルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）（Ａｌｆａｌｆａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２８０１０、１４９６２、Ｑ４２９２８、Ｑ４３７８６）を含む。
００μｇ／ｍｌの濃度である。
[00136]レグヘモグロビンは、窒素固定細菌が根に定着することに応答してマメ科植物
によって産生される、マメ科植物の窒素固定根粒に見出される酸素運搬タンパク質である。レグヘモグロビンは、本発明の血清タンパク質相同体を含む。レグヘモグロビンは、限定はされないが、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｇａｒｄｅｎ ｐｅａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＬＧＢ１＿ＰＥＡ、ＬＧＢ２＿ＰＥＡ、ＬＧＢ３＿ＰＥＡ、ＬＧＢ４＿ＰＥＡ、ＬＧＢ５＿ＰＥＡ、ＬＧＢ６＿ＰＥＡ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）（Ａｌｆａｌｆａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＬＧＢ１＿ＭＥＤＳＡ、ＬＧＢ２＿ＭＥＤＳＡ、ＬＧＢ４＿ＭＥＤＳＡ、Ｑ４２９２８＿ＭＥＤＳＡ、Ｑ４３７８６＿ＭＥＤＳＡ、ハマナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｌｉｎｅａｔａ）（ハマアズキ（Ｂｅａｃｈ ｂｅａｎ））（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｌｉｎｅａｔｕｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＬＧＢ＿ＣＡＮＬＩ）、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）（Ｃｈｉｃｋｐｅａ）（Ｇａｒｂａｎｚｏ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ２ＹＺ７８、Ａ０Ａ１Ｓ２ＸＸＴ５、Ａ０Ａ１Ｓ２ＸＫＶ１、Ａ０Ａ１Ｓ２ＸＭＦ３）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ＭＡＸ）（Ｓｏｙｂｅａｎ）（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｈｉｓｐｉｄａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｒ０ＨＷ５１、Ｑ９６４２８、Ｑ４２８０１）、ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ）（Ｗｉｌｄ ｓｏｙｂｅａｎ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４４５ＩＰＸ６）、及びアルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）（Ａｌｆａｌｆａ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２８０１０、１４９６２、Ｑ４２９２８、Ｑ４３７８６）を含む。
【0099】
[00137]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物リパーゼであり得る。
[00138]一部の実施形態では、植物リパーゼは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ
／ｍｌの濃度である。
[00138]一部の実施形態では、植物リパーゼは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ
／ｍｌの濃度である。
【0100】
[00139]血清タンパク質相同体のさらなる非限定的な例としては、以下の血清タンパク
質の相同体が挙げられる。リパーゼは、脂肪の脂肪酸及びグリセロール又は他のアルコールへの分解を触媒する酵素である。リパーゼの多くは、エンドウマメ（ｇａｒｄｅｎ ｐｅａ）（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０１５１７）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）（ｗｈｅａｔ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｄ５ＵＩＸ７、Ａ０Ａ２Ｘ０ＳＧＮ９、Ａ０Ａ３Ｂ６ＧＺＶ３、Ａ０Ａ３Ｂ６ＧＹ４３）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｍｏｕｓｅ－ｅａｒ ｃｒｅｓｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１７８ＷＢＸ６）及び多くの他のものを含む供給源からの植物間で見出すことができる。植物リパーゼ調製方法は、当業者で周知である（例えば、Ｗａｇｅｎｋｎｅｃｈｔ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９５８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３（５）：４３９－４４５；Ｂａｒｒｏｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２７（１）：１５－２９参照）。
質の相同体が挙げられる。リパーゼは、脂肪の脂肪酸及びグリセロール又は他のアルコールへの分解を触媒する酵素である。リパーゼの多くは、エンドウマメ（ｇａｒｄｅｎ ｐｅａ）（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０１５１７）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）（ｗｈｅａｔ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｄ５ＵＩＸ７、Ａ０Ａ２Ｘ０ＳＧＮ９、Ａ０Ａ３Ｂ６ＧＺＶ３、Ａ０Ａ３Ｂ６ＧＹ４３）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｍｏｕｓｅ－ｅａｒ ｃｒｅｓｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１７８ＷＢＸ６）及び多くの他のものを含む供給源からの植物間で見出すことができる。植物リパーゼ調製方法は、当業者で周知である（例えば、Ｗａｇｅｎｋｎｅｃｈｔ，Ａ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９５８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３（５）：４３９－４４５；Ｂａｒｒｏｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２７（１）：１５－２９参照）。
【0101】
[00140]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物シスタチンであり得る。
[00141]一部の実施形態では、植物シスタチンは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１００μ
ｇ／ｍｌの濃度である。
[00141]一部の実施形態では、植物シスタチンは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１００μ
ｇ／ｍｌの濃度である。
【0102】
[00142]フェチュインは、肝臓内で製造され、血流へと分泌される血液タンパク質であ
り、血清アルブミンを含む。それらは、血流中の広範な積荷物質の輸送及び利用可能性を媒介する結合タンパク質の群に属する。血清アルブミンは、成体動物の血漿中に最も豊富なタンパク質であるが、フェチュインは、胎児血液中により豊富である。フェチュインＡは、循環中における遊離脂肪酸の主要な担体タンパク質である。フェチュインＡは、細胞
接着及びシグナル伝達に役割を果たし、ある特定のがん細胞型の増殖、運動性、及び侵入を調節することが報告されている。フェチュインは、タンパク質のシスタチンスーパーファミリーに属し、遺伝子重複及び遺伝子セグメントの交換によってタンパク質シスタチンから進化した。哺乳動物では、フェチュインＡ及びフェチュインＢは、シスタチンスーパーファミリーのパラロガスな血漿タンパク質である（例えば、Ｋａｒｍｉｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１９；９：５４６参照）。多くのシスタチンは、パパイン様システインプロテイナーゼの阻害剤として同定された。フェチュインＡはプロテアーゼの阻害剤であることが公知ではないが、フェチュインＢは、ある特定のメタロプロテイナーゼを選択的に阻害する。哺乳動物シスタチンは、通常、システインプロテアーゼ阻害剤であり、全ての生体体液中に見出される。哺乳動物シスタチンＣは、分泌タンパク質であり、細胞によって内部移行され（Ｅｋｓｔｒｏｍ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，２００８，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７５：４５７１－４５８２）、細胞培養応用で使用され、ポリオ、ヘルペス単純及びコロナウイルス複製の阻害を含む、細胞内プロセスを阻害し得る。
り、血清アルブミンを含む。それらは、血流中の広範な積荷物質の輸送及び利用可能性を媒介する結合タンパク質の群に属する。血清アルブミンは、成体動物の血漿中に最も豊富なタンパク質であるが、フェチュインは、胎児血液中により豊富である。フェチュインＡは、循環中における遊離脂肪酸の主要な担体タンパク質である。フェチュインＡは、細胞
接着及びシグナル伝達に役割を果たし、ある特定のがん細胞型の増殖、運動性、及び侵入を調節することが報告されている。フェチュインは、タンパク質のシスタチンスーパーファミリーに属し、遺伝子重複及び遺伝子セグメントの交換によってタンパク質シスタチンから進化した。哺乳動物では、フェチュインＡ及びフェチュインＢは、シスタチンスーパーファミリーのパラロガスな血漿タンパク質である（例えば、Ｋａｒｍｉｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１９；９：５４６参照）。多くのシスタチンは、パパイン様システインプロテイナーゼの阻害剤として同定された。フェチュインＡはプロテアーゼの阻害剤であることが公知ではないが、フェチュインＢは、ある特定のメタロプロテイナーゼを選択的に阻害する。哺乳動物シスタチンは、通常、システインプロテアーゼ阻害剤であり、全ての生体体液中に見出される。哺乳動物シスタチンＣは、分泌タンパク質であり、細胞によって内部移行され（Ｅｋｓｔｒｏｍ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，２００８，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７５：４５７１－４５８２）、細胞培養応用で使用され、ポリオ、ヘルペス単純及びコロナウイルス複製の阻害を含む、細胞内プロセスを阻害し得る。
【0103】
[00143]ＭＥＲＯＰデータベースは、Ｉ２５ファミリーのメンバーとしてシスタチンタ
ンパク質を分類する。シスタチンファミリー（Ｉ２５と示す）は、４つのサブファミリー：Ｉ２５Ａ、Ｉ２５Ｂ、Ｉ２５Ｃ、及び未分類へと細分されたシスタチン分類を含むシステインプロテアーゼ阻害剤を含む（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：Ｄ５０３－Ｄ５０９；Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９，Ｎｏｖ；１５１（３）：１５３１－４５）。植物シスタチン（フィトシスタチンとして分類）は、Ｎ末端アルファヘリックス（植物シスタチンにのみ存在）を含み、主に種子から同定され、一部は他の植物組織で検出された。ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）及びトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）のマルチシスタチンは、液胞中及び細胞質中に見出すことができる（Ｎｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２１：８６１－８７５；Ｍａｄｕｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ５５：２０１－２０８）。
ンパク質を分類する。シスタチンファミリー（Ｉ２５と示す）は、４つのサブファミリー：Ｉ２５Ａ、Ｉ２５Ｂ、Ｉ２５Ｃ、及び未分類へと細分されたシスタチン分類を含むシステインプロテアーゼ阻害剤を含む（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：Ｄ５０３－Ｄ５０９；Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９，Ｎｏｖ；１５１（３）：１５３１－４５）。植物シスタチン（フィトシスタチンとして分類）は、Ｎ末端アルファヘリックス（植物シスタチンにのみ存在）を含み、主に種子から同定され、一部は他の植物組織で検出された。ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）及びトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）のマルチシスタチンは、液胞中及び細胞質中に見出すことができる（Ｎｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２１：８６１－８７５；Ｍａｄｕｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ５５：２０１－２０８）。
【0104】
[00144]血清タンパク質の植物相同体は、植物シスタチンを含む。１つは、Ｎ末端アル
ファヘリックスの存在であり、植物シスタチンにのみ存在する。非限定的な例としては、ササゲ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）（ｃｏｗｐｅａ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４Ｄ６ＫＬＣ０、Ａ０Ａ４Ｄ６ＮＨ５２）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ
ｍａｘ）（Ｓｏｙｂｅａｎ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｉ１Ｋ３Ｑ１、Ｐ２５９７３、Ａ０Ａ０Ｒ４Ｊ５９８、Ｉ１ＭＹＣ１）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）（Ｂａｒｌｅｙ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＬＥＩ７）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（ｒｉｃｅ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ２ＸＳ６５、Ｑ６Ｋ３０９、Ａ０Ａ１Ｓ４ＡＦ５２、Ａ０Ａ１Ｊ６ＨＹ８３）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ｐｏｔａｔｏ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３７８４２、Ｍ１Ｂ０Ｗ４、Ｍ１Ｃ６９９、Ｍ１Ｂ０Ｗ５、Ｍ１ＢＩＲ８）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（ｍａｉｚｅ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３１７２６、Ｂ６ＳＮＹ０、Ｂ６ＵＧＮ８）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（ｗｈｅａｔ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８Ｗ２５２）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（ｋｉｄｎｅｙ ｂｅａｎ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ７Ｃ６Ｑ５、Ｖ７ＢＮＴ８）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）（ｐｅａｎｕｔ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４４５ＡＢ６９、Ａ０Ａ４４５ＤＫＬ４、Ｅ５ＢＤＡ５）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１０９９２、Ｑ１０９９２３）、又はキイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）（粘菌（ｓｌｉｍｅ ｍｏｌｄ））シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６５ＹＲ７、Ｑ６５
ＹＲ８、Ｑ５Ｒ１Ｕ３）（緑色植物データベースリソースＰｈｙｔｏｚｏｍｅ及びシスタチンのＵｎｉＰｒｏｔを参照）が挙げられる。
ファヘリックスの存在であり、植物シスタチンにのみ存在する。非限定的な例としては、ササゲ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）（ｃｏｗｐｅａ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４Ｄ６ＫＬＣ０、Ａ０Ａ４Ｄ６ＮＨ５２）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ
ｍａｘ）（Ｓｏｙｂｅａｎ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｉ１Ｋ３Ｑ１、Ｐ２５９７３、Ａ０Ａ０Ｒ４Ｊ５９８、Ｉ１ＭＹＣ１）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）（Ｂａｒｌｅｙ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＬＥＩ７）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（ｒｉｃｅ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ２ＸＳ６５、Ｑ６Ｋ３０９、Ａ０Ａ１Ｓ４ＡＦ５２、Ａ０Ａ１Ｊ６ＨＹ８３）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ｐｏｔａｔｏ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３７８４２、Ｍ１Ｂ０Ｗ４、Ｍ１Ｃ６９９、Ｍ１Ｂ０Ｗ５、Ｍ１ＢＩＲ８）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（ｍａｉｚｅ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３１７２６、Ｂ６ＳＮＹ０、Ｂ６ＵＧＮ８）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（ｗｈｅａｔ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８Ｗ２５２）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（ｋｉｄｎｅｙ ｂｅａｎ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ７Ｃ６Ｑ５、Ｖ７ＢＮＴ８）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）（ｐｅａｎｕｔ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４４５ＡＢ６９、Ａ０Ａ４４５ＤＫＬ４、Ｅ５ＢＤＡ５）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１０９９２、Ｑ１０９９２３）、又はキイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）（粘菌（ｓｌｉｍｅ ｍｏｌｄ））シスタチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６５ＹＲ７、Ｑ６５
ＹＲ８、Ｑ５Ｒ１Ｕ３）（緑色植物データベースリソースＰｈｙｔｏｚｏｍｅ及びシスタチンのＵｎｉＰｒｏｔを参照）が挙げられる。
【0105】
[00145]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物アルドラーゼであり得る。
[00146]一部の実施形態では、植物アルドラーゼは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１００
μｇ／ｍｌの濃度である。
[00146]一部の実施形態では、植物アルドラーゼは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１００
μｇ／ｍｌの濃度である。
【0106】
[00147]アルドラーゼは、ある特定の糖の分解を助ける酵素であり、筋肉組織で多く見
出され、血液中で検出可能である。植物相同体の例は、フルクトース－１，６－ビスフォスフェートアルドラーゼ（ＦＢＡ）であり、解糖系、糖新生、及びカルビン回路に関与する重要な植物酵素である（Ｌｖ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８：１０３０）。別の供給源は、エンドウマメである（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０１５１７）。
出され、血液中で検出可能である。植物相同体の例は、フルクトース－１，６－ビスフォスフェートアルドラーゼ（ＦＢＡ）であり、解糖系、糖新生、及びカルビン回路に関与する重要な植物酵素である（Ｌｖ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８：１０３０）。別の供給源は、エンドウマメである（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０１５１７）。
【0107】
[00148]タンパク質の他の好適な植物相同体は、トランスアミナーゼ及びアスパラギン
酸アミノトランスフェラーゼを含む。
[00149]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物トランスアミナーゼであり得
る。トランスアミナーゼの非限定的な例としては、エンドウマメ（ｇａｒｄｅｎ Ｐｅａ）（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４９３６４、Ｑ９ＡＶＨ０、Ｏ２２４６４）及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（Ｗｈｅａｔ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８４１８８）が挙げられる。一部の実施形態では、植物トランスアミナーゼは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度である。
酸アミノトランスフェラーゼを含む。
[00149]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物トランスアミナーゼであり得
る。トランスアミナーゼの非限定的な例としては、エンドウマメ（ｇａｒｄｅｎ Ｐｅａ）（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４９３６４、Ｑ９ＡＶＨ０、Ｏ２２４６４）及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（Ｗｈｅａｔ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ８４１８８）が挙げられる。一部の実施形態では、植物トランスアミナーゼは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度である。
【0108】
[00150]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物アミノトランスフェラーゼで
あり得る。Ｍａｔｈｅｒｏｎは、エンドウマメのアミノトランスフェラーゼの精製及び特性を記載する（Ｍａｔｈｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７３，５２：６３－６７）。アスパラギン酸アミノトランスアミナーゼの非限定的な例としては、ダイズ（Ｓｏｙ）（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｉ１ＪＵＳ６）及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（Ｗｈｅａｔ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ５Ｂ１Ｆ８）が挙げられる。一部の実施形態では、植物アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度である。
あり得る。Ｍａｔｈｅｒｏｎは、エンドウマメのアミノトランスフェラーゼの精製及び特性を記載する（Ｍａｔｈｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９７３，５２：６３－６７）。アスパラギン酸アミノトランスアミナーゼの非限定的な例としては、ダイズ（Ｓｏｙ）（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｉ１ＪＵＳ６）及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（Ｗｈｅａｔ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ５Ｂ１Ｆ８）が挙げられる。一部の実施形態では、植物アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度である。
【0109】
[00151]植物起源からのインシュリン相同体は、本開示の一部のように細胞培養サプリ
メントとしても使用され得る。
[00152]一部の実施形態では、インシュリンの構造的及び機能的相同体は、細胞培養培
地サプリメントに含まれ得る。そのようなインシュリン相同体の例としては、限定はされないが、グルコキニン、チャランチン、及びコロソリン酸が挙げられる。グルコキニンは、インシュリンの構造的相同体である。チャランチンは、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ
ｃｈａｒａｎｔｉａ）植物、又はビターレモン由来である、２つのステロイド配糖体の混合物である。コロソリン酸は、バナバ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓｅ）植物に見出される５環のトリテルペン酸であり、通常バナナの葉から抽出される。
メントとしても使用され得る。
[00152]一部の実施形態では、インシュリンの構造的及び機能的相同体は、細胞培養培
地サプリメントに含まれ得る。そのようなインシュリン相同体の例としては、限定はされないが、グルコキニン、チャランチン、及びコロソリン酸が挙げられる。グルコキニンは、インシュリンの構造的相同体である。チャランチンは、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ
ｃｈａｒａｎｔｉａ）植物、又はビターレモン由来である、２つのステロイド配糖体の混合物である。コロソリン酸は、バナバ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓｅ）植物に見出される５環のトリテルペン酸であり、通常バナナの葉から抽出される。
【0110】
[00153]一部の実施形態では、植物インシュリンは、グルコキニン、チャランチン、コ
ロソリン酸、又はこれらの組合せである。一実施形態では、植物インシュリンは、グルコキニンである。一実施形態では、植物インシュリンは、チャランチンである。一実施形態では、植物インシュリンは、コロソリン酸である。
ロソリン酸、又はこれらの組合せである。一実施形態では、植物インシュリンは、グルコキニンである。一実施形態では、植物インシュリンは、チャランチンである。一実施形態では、植物インシュリンは、コロソリン酸である。
【0111】
[00154]一部の実施形態では、植物インシュリンは、約６Ｋｄの分子量を有する。一部
の実施形態では、植物インシュリンは、培地中約０．０５μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの濃度である。
の実施形態では、植物インシュリンは、培地中約０．０５μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの濃度である。
【0112】
[00155]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物スーパーオキシドジスムター
ゼ（ＳＯＤ）であり得る。一部の実施形態では、植物ＳＯＤは、約８０～８９Ｋｄの分子量を有する。一部の実施形態では、植物ＳＯＤは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌの濃度である。
ゼ（ＳＯＤ）であり得る。一部の実施形態では、植物ＳＯＤは、約８０～８９Ｋｄの分子量を有する。一部の実施形態では、植物ＳＯＤは、培地中約１μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌの濃度である。
【0113】
[00156]少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物トランスフェリンであり得る
。
[00157]本明細書で特異的に同定された血清代替タンパク質は、例示であり、限定では
ない。非動物タンパク質のオルソログ及び／又はパラログも含まれる。オルソログは、種分化イベントの結果である相同遺伝子又はタンパク質として定義されることが多い。簡単なモデルでは、種分化イベントの後、オルソログは第１及び第２の種の遺伝子又はタンパク質が分岐する時に生じる。オルソログの配列は異なってもよいが、オルソログタンパク質及びコードするヌクレオチドは、同じ又は類似の機能若しくは活性を有するか、又は異なる種で同じ役割を果たす傾向があり、種分化イベントで維持されている。パラログは、種における複製イベントの結果である相同遺伝子又はタンパク質として定義されることが多い。簡単なモデルでは、パラログは遺伝子複製イベント、及び他からの１コピーの分岐の後に生じる。パラログは、同じ種で別々に進化することができ、したがってそれらの役割がより多様である傾向があるが、それらの機能は類似していてもよい。例えば、パラログは、類似の酵素活性を有するが、異なる基質に作用してもよく、又は異なる組織で、又は異なる発生段階で発現されてもよい。オルソログとパラログの間の関係は、より複雑であり得、例えば遺伝子複製後に種分化がある。
。
[00157]本明細書で特異的に同定された血清代替タンパク質は、例示であり、限定では
ない。非動物タンパク質のオルソログ及び／又はパラログも含まれる。オルソログは、種分化イベントの結果である相同遺伝子又はタンパク質として定義されることが多い。簡単なモデルでは、種分化イベントの後、オルソログは第１及び第２の種の遺伝子又はタンパク質が分岐する時に生じる。オルソログの配列は異なってもよいが、オルソログタンパク質及びコードするヌクレオチドは、同じ又は類似の機能若しくは活性を有するか、又は異なる種で同じ役割を果たす傾向があり、種分化イベントで維持されている。パラログは、種における複製イベントの結果である相同遺伝子又はタンパク質として定義されることが多い。簡単なモデルでは、パラログは遺伝子複製イベント、及び他からの１コピーの分岐の後に生じる。パラログは、同じ種で別々に進化することができ、したがってそれらの役割がより多様である傾向があるが、それらの機能は類似していてもよい。例えば、パラログは、類似の酵素活性を有するが、異なる基質に作用してもよく、又は異なる組織で、又は異なる発生段階で発現されてもよい。オルソログとパラログの間の関係は、より複雑であり得、例えば遺伝子複製後に種分化がある。
【0114】
[00158]代替の実施形態は、置換、挿入、及び欠失を含む、突然変異を含む血清タンパ
ク質相同体を含む。特定のアミノ酸配列バリアントは、１アミノ酸、２、３、４、５～１０、１０～２０又は２０～３０アミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失によって参照配列から異なり得る。一部の実施形態では、代替の実施形態配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の残基が挿入、欠失又は置換された参照配列を含み得る。例えば、５、１０、１５、最大２０、最大３０又は最大４０残基が、挿入、欠失又は置換されてもよい。
ク質相同体を含む。特定のアミノ酸配列バリアントは、１アミノ酸、２、３、４、５～１０、１０～２０又は２０～３０アミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失によって参照配列から異なり得る。一部の実施形態では、代替の実施形態配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の残基が挿入、欠失又は置換された参照配列を含み得る。例えば、５、１０、１５、最大２０、最大３０又は最大４０残基が、挿入、欠失又は置換されてもよい。
【0115】
[00159]血清タンパク質の任意の特定の植物相同体に関し、オルソログ及びパラログを
含む非動物相同体の比較は、作製又は選択され得る突然変異のガイドとして寄与する。例えば、相同体タンパク質のどの部分が、保存度がより高いか又はより低いか、及びどの部分がより大きい又はより小さいバリエーションを含み得るかは、そのような配列アライメントから明らかである。したがって、タンパク質が好適な非動物血清タンパク質相同体であるかどうか決定する１つの方法は、本明細書で提供される相同体をアラインし、相同体のどの部分がより高いか若しくはより低い保存度又はより大きい若しくはより小さいバリエーションを含むか、又はどこに挿入及び欠失があり得るか同定し、次いで問題のタンパク質を、本明細書で提供される１つ又はそれ以上の相同体と比較することである。Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのような位置アライメントアルゴリズムを使用して、２つ又はそれ以上の相同体をアラインすることができる。そのようなアルゴリズムは、コンピューターに内蔵され、アライメントを最適化し得る。いくつかのコンピュータープログラムが利用可能であり、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いる。例えば、ＢｅｓｔＦｉｔはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用し、２つの配列間の最高の位置アライメントを見出す。他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ｐｓｉＢＬＡＳＴ又はＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｅｔ Ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５－４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８の方法を使用する）が使用されてもよい。
含む非動物相同体の比較は、作製又は選択され得る突然変異のガイドとして寄与する。例えば、相同体タンパク質のどの部分が、保存度がより高いか又はより低いか、及びどの部分がより大きい又はより小さいバリエーションを含み得るかは、そのような配列アライメントから明らかである。したがって、タンパク質が好適な非動物血清タンパク質相同体であるかどうか決定する１つの方法は、本明細書で提供される相同体をアラインし、相同体のどの部分がより高いか若しくはより低い保存度又はより大きい若しくはより小さいバリエーションを含むか、又はどこに挿入及び欠失があり得るか同定し、次いで問題のタンパク質を、本明細書で提供される１つ又はそれ以上の相同体と比較することである。Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのような位置アライメントアルゴリズムを使用して、２つ又はそれ以上の相同体をアラインすることができる。そのようなアルゴリズムは、コンピューターに内蔵され、アライメントを最適化し得る。いくつかのコンピュータープログラムが利用可能であり、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いる。例えば、ＢｅｓｔＦｉｔはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用し、２つの配列間の最高の位置アライメントを見出す。他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ｐｓｉＢＬＡＳＴ又はＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｅｔ Ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５－４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８の方法を使用する）が使用されてもよい。
【0116】
[00160]複数の配列のアライメントにより、高度に保存されたアミノ酸残基又はインバ
リアントが同定される。配列比較は、配列間で同一又はほぼ同一であり、機能のために重要でありそうなアミノ酸残基、保存又は高度に保存されているアミノ酸、及び可変的であるアミノ酸を強調する。アライメントは、１つのタンパク質から別のタンパク質へ、したがって必ずしも必要ではないタンパク質の配列の挿入又は欠失があることも示す。
リアントが同定される。配列比較は、配列間で同一又はほぼ同一であり、機能のために重要でありそうなアミノ酸残基、保存又は高度に保存されているアミノ酸、及び可変的であるアミノ酸を強調する。アライメントは、１つのタンパク質から別のタンパク質へ、したがって必ずしも必要ではないタンパク質の配列の挿入又は欠失があることも示す。
【0117】
[00161]参照として特に開示されるタンパク質のいずれか１つをとり、オルソログ、パ
ラログ及びそれらの変異体を含む、本発明の相同体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の保存置換によって、保存領域おいて参照と異なり得る。ガイドとして、開示される配列の対比較を見ることができる。保存置換は、類似の特性を有する異なるアミノ酸とのアミノ酸の置換を含む。例えば、脂肪族残基が別の脂肪族残基によって置き換えられてもよく、非極性残基が別の非極性残基によって置き換えられてもよく、酸性残基が別の酸性残基によって置き換えられてもよく、塩基性残基が別の塩基性残基によって置き換えられてもよく、極性残基が別の極性残基によって置き換えられてもよく、又は芳香族残基が別の芳香族残基によって置き換えられてもよい。
ラログ及びそれらの変異体を含む、本発明の相同体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の保存置換によって、保存領域おいて参照と異なり得る。ガイドとして、開示される配列の対比較を見ることができる。保存置換は、類似の特性を有する異なるアミノ酸とのアミノ酸の置換を含む。例えば、脂肪族残基が別の脂肪族残基によって置き換えられてもよく、非極性残基が別の非極性残基によって置き換えられてもよく、酸性残基が別の酸性残基によって置き換えられてもよく、塩基性残基が別の塩基性残基によって置き換えられてもよく、極性残基が別の極性残基によって置き換えられてもよく、又は芳香族残基が別の芳香族残基によって置き換えられてもよい。
【0118】
[00162]アミノ酸は、共通の側鎖特性にしたがって異なるクラスにグループ分けされ得
る：ａ．疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；ｂ．中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；ｅ．鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｒｙ、Ｐｈｅ。非保存置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。アミノ酸は、共通の側鎖特性にしたがって異なるクラスにグループ分けされ得る：ａ．疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；ｂ．中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；ｅ．鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｒｙ、Ｐｈｅ。非保存置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。
る：ａ．疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；ｂ．中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；ｅ．鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｒｙ、Ｐｈｅ。非保存置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。アミノ酸は、共通の側鎖特性にしたがって異なるクラスにグループ分けされ得る：ａ．疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；ｂ．中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；ｅ．鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｒｙ、Ｐｈｅ。非保存置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを必要とする。
【0119】
[00163]以下の表１に示される保存置換
【0120】
【表1】
【0121】
[00164]一部の実施形態では、同定した相同体に、少なくとも５０％、少なくとも５５
％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％配列同一性を有する相同体が含まれる。
％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％配列同一性を有する相同体が含まれる。
【0122】
[00165]一部の実施形態では、相同体は、同定した相同体と少なくとも５０％配列同一
性を有する。
[00166]一部の実施形態では、相同体は、同定された相同体と少なくとも６０％の配列
同一性を有する。
性を有する。
[00166]一部の実施形態では、相同体は、同定された相同体と少なくとも６０％の配列
同一性を有する。
【0123】
[00167]一部の実施形態では、相同体は、同定された相同体と少なくとも７０％の配列
同一性を有する。
[00168]一部の実施形態では、相同体は、同定された相同体と少なくとも８０％の配列
同一性を有する。
同一性を有する。
[00168]一部の実施形態では、相同体は、同定された相同体と少なくとも８０％の配列
同一性を有する。
【0124】
[00169]一部の実施形態では、相同体は、同定された相同体と少なくとも９０％の配列
同一性を有する。
[00170]一部の実施形態では、相同体は、同定された相同体と少なくとも９５％の配列
同一性を有する。
同一性を有する。
[00170]一部の実施形態では、相同体は、同定された相同体と少なくとも９５％の配列
同一性を有する。
【0125】
[00171]一部の実施形態は、血清タンパク質相同体の、他のタンパク質及びポリペプチ
ドへの融合を含む。融合タンパク質は、生産、活性、安定性、及び／又は標的化の増強を示し得る。血清タンパク質類似体は、単独で、又は組み合わせて評価され得る。
ドへの融合を含む。融合タンパク質は、生産、活性、安定性、及び／又は標的化の増強を示し得る。血清タンパク質類似体は、単独で、又は組み合わせて評価され得る。
【0126】
[00172]一部の実施形態では、植物タンパク質相同体は、糖鎖工学的に操作され得る。
グリコシル化は、主な翻訳後タンパク質修飾の１つである。Ｎ結合型グリコシル化は、グリカンと呼ばれることもある、いくつかの糖分子からなるオリゴ糖、炭水化物の窒素原子への結合である（タンパク質のアスパラギン（Ａｓｎ）残基のアミド窒素）。Ｏ結合型グリコシル化は、タンパク質のセリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）残基の酸素原子への糖分子の結合である。グリコシル化は、タンパク質の構造及び機能に必須であることが多い。Ｎ－及びＯ－グリカンは、タンパク質の構造、安定性、凝集、及び熱変成に重要な役割を果たすことが示されており、組換え治療タンパク質の薬力学及び薬物動態に影響することが観察されている。植物及び昆虫糖タンパク質のＮ及びＯ結合型炭水化物部分は豊富な環境免疫決定因子でもある。
グリコシル化は、主な翻訳後タンパク質修飾の１つである。Ｎ結合型グリコシル化は、グリカンと呼ばれることもある、いくつかの糖分子からなるオリゴ糖、炭水化物の窒素原子への結合である（タンパク質のアスパラギン（Ａｓｎ）残基のアミド窒素）。Ｏ結合型グリコシル化は、タンパク質のセリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）残基の酸素原子への糖分子の結合である。グリコシル化は、タンパク質の構造及び機能に必須であることが多い。Ｎ－及びＯ－グリカンは、タンパク質の構造、安定性、凝集、及び熱変成に重要な役割を果たすことが示されており、組換え治療タンパク質の薬力学及び薬物動態に影響することが観察されている。植物及び昆虫糖タンパク質のＮ及びＯ結合型炭水化物部分は豊富な環境免疫決定因子でもある。
【0127】
[00173]糖鎖工学は、グリカンの選択又はリモデリングを指す。糖鎖工学は、発現のた
めの宿主生物を選択するステップを含む。ＣＨＯのような、非ヒト哺乳動物細胞が、ヒト様グリコシル化プロファイルを有する生物製剤の生産のために主に使用されてきた。
めの宿主生物を選択するステップを含む。ＣＨＯのような、非ヒト哺乳動物細胞が、ヒト様グリコシル化プロファイルを有する生物製剤の生産のために主に使用されてきた。
【0128】
[00174]酵母及び他の真菌宿主は、組換えタンパク質の生産のための重要な生産プラッ
トフォームである。酵母株ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の細胞系は、ヒトでのグリコシル化のプロセスを模倣する一連の酵素反応を実行するように開発された。例えば米国特許第７０２９８７２号、同第７３２６６８１号、及び同第７４４９３０８号は、シアル酸付加二分岐複合体であるＮ結合型グリカンを含む、ヒトタンパク質に類似の組換え糖タンパク質を生産するための方法を記載する。糖鎖工学は、特定のグリコシル化を行うために工学的に操作された生物でタンパク質を発現するステップを含み得る。
トフォームである。酵母株ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の細胞系は、ヒトでのグリコシル化のプロセスを模倣する一連の酵素反応を実行するように開発された。例えば米国特許第７０２９８７２号、同第７３２６６８１号、及び同第７４４９３０８号は、シアル酸付加二分岐複合体であるＮ結合型グリカンを含む、ヒトタンパク質に類似の組換え糖タンパク質を生産するための方法を記載する。糖鎖工学は、特定のグリコシル化を行うために工学的に操作された生物でタンパク質を発現するステップを含み得る。
【0129】
[00175]糖鎖工学は、例えば、エンドグリコシダーゼ及びグリコシンターゼのような酵
素を用いるなど、酵素的なものであり得る。例示的なエンドグリコシダーゼとしては、限定はされないが、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＨ（Ｅｎｄｏ－Ｈ）が挙げられ、高マンノースのキトビオースコア内部及び一部のＮ結合型糖タンパク質のハイブリッドオリゴ糖内部で切断する組換えグリコシダーゼである。エンド－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＦ２（Ｅｎｄｏ－Ｆ２）は、高マンノース及び二分岐Ｎ－グリカンを切断し、エンド－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＦ３（Ｅｎｄｏ－Ｆ３）は、ペプチド及びタンパク質の三分岐及びアルファ－（１－６）－フコシル化二分岐Ｎグリカンを切断する（Ｐｌｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３５：９８－１０１，１９９６）。そのような酵素は、オリゴ糖を単一の糖単位（例えばＧｌｃＮＡｃ）に消化するために使用することができ、次いでグリコシルトランスフェラーゼによって媒介されるグリコシル化による選択のオリゴ糖によって伸長することができる。α－フコシダーゼは、アスパラギン結合末端ＧｌｃＮＡｃを脱フコシル化するために用いることができる。単一の糖単位を伸長するためのグリコシルトランスフェラーゼとしては、限定はされないが、エンド－β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる。オリゴ糖は、シアル化され得る。シアリルトランスフェラーゼを使用して、シアル酸部分のオリゴ糖アクセプターの末端部分への移行を触媒することができる。各シアリルトランスフェラーゼは、特定の糖基質に特異的である。
素を用いるなど、酵素的なものであり得る。例示的なエンドグリコシダーゼとしては、限定はされないが、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＨ（Ｅｎｄｏ－Ｈ）が挙げられ、高マンノースのキトビオースコア内部及び一部のＮ結合型糖タンパク質のハイブリッドオリゴ糖内部で切断する組換えグリコシダーゼである。エンド－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＦ２（Ｅｎｄｏ－Ｆ２）は、高マンノース及び二分岐Ｎ－グリカンを切断し、エンド－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼＦ３（Ｅｎｄｏ－Ｆ３）は、ペプチド及びタンパク質の三分岐及びアルファ－（１－６）－フコシル化二分岐Ｎグリカンを切断する（Ｐｌｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３５：９８－１０１，１９９６）。そのような酵素は、オリゴ糖を単一の糖単位（例えばＧｌｃＮＡｃ）に消化するために使用することができ、次いでグリコシルトランスフェラーゼによって媒介されるグリコシル化による選択のオリゴ糖によって伸長することができる。α－フコシダーゼは、アスパラギン結合末端ＧｌｃＮＡｃを脱フコシル化するために用いることができる。単一の糖単位を伸長するためのグリコシルトランスフェラーゼとしては、限定はされないが、エンド－β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる。オリゴ糖は、シアル化され得る。シアリルトランスフェラーゼを使用して、シアル酸部分のオリゴ糖アクセプターの末端部分への移行を触媒することができる。各シアリルトランスフェラーゼは、特定の糖基質に特異的である。
【0130】
[00176]オリゴ糖を完全に除去するため、アミダーゼであるＰＮＧａｓｅ Ｆは、最も
奥のＧｌｃＮＡｃと高マンノース、ハイブリッド、及び複合体オリゴ糖のアスパラギン残基の間を切断し、ほとんど全てのＮ結合型オリゴ糖を除去するのに有効であり、さらなる
解析のためにＮグリカンコアオリゴ糖を無傷のままにする（国際公開第２０１３／１２００６６号）。
奥のＧｌｃＮＡｃと高マンノース、ハイブリッド、及び複合体オリゴ糖のアスパラギン残基の間を切断し、ほとんど全てのＮ結合型オリゴ糖を除去するのに有効であり、さらなる
解析のためにＮグリカンコアオリゴ糖を無傷のままにする（国際公開第２０１３／１２００６６号）。
【0131】
[00177]代謝糖鎖工学（ＭＧＥ）は、グリコシル化を調節するために細胞の代謝を操作
するための技術である。ＭＧＥを使用して、天然グリカンのレベルを増加させる並びに非天然単糖を複合多糖に置換することができる（Ａｇａｔｅｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
Ｒｅｖ Ｃｈｅｍ ３：６０５－６２０（２０１９））。例えば、ＭＧＥを使用するステップは、代謝基質（例えば、ＭａｎＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ、及びＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ類似体）をシアル酸生合成経路に供給するために用いることができ、非天然のシアロシドディスプレイを生じる（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９（１２）：１３８２－４０１）。
するための技術である。ＭＧＥを使用して、天然グリカンのレベルを増加させる並びに非天然単糖を複合多糖に置換することができる（Ａｇａｔｅｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
Ｒｅｖ Ｃｈｅｍ ３：６０５－６２０（２０１９））。例えば、ＭＧＥを使用するステップは、代謝基質（例えば、ＭａｎＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ、及びＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ類似体）をシアル酸生合成経路に供給するために用いることができ、非天然のシアロシドディスプレイを生じる（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９（１２）：１３８２－４０１）。
【0132】
[00178]ある特定の非哺乳動物（例えば植物）タンパク質は、本開示の血清タンパク質
の相同体ではない。例えば、細胞培養システムはセリンプロテアーゼ阻害活性を含む成分を含み得るが、ダイズトリプシン阻害剤は、少なくとも１つの植物タンパク質相同体ではない。同様に、ダイズベースの抗酸化剤は、血清タンパク質相同体ではない。したがって、一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、トリプシン阻害剤ではない。一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、ダイズベースの抗酸化剤ではない。
の相同体ではない。例えば、細胞培養システムはセリンプロテアーゼ阻害活性を含む成分を含み得るが、ダイズトリプシン阻害剤は、少なくとも１つの植物タンパク質相同体ではない。同様に、ダイズベースの抗酸化剤は、血清タンパク質相同体ではない。したがって、一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、トリプシン阻害剤ではない。一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、ダイズベースの抗酸化剤ではない。
【0133】
[00179]植物タンパク質相同体は、多くの供給源から得ることができる。
[00180]一部の実施形態では、植物タンパク質相同体は、血清タンパク質の少なくとも
１つの植物タンパク質相同体を含む、任意の植物抽出物又は植物抽出物の画分であり得る。非限定的な例により、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物タンパク質抽出物の水溶性画分由来又はその中であり得る。植物タンパク質単離物の水溶性画分は、植物アルブミン及び植物グロブリンを含み得る。他の実施形態では、植物タンパク質単離物の水溶性画分は植物アルブミンを含み得る。植物抽出物及び画分を得る方法は、当技術分野で公知である。
[00180]一部の実施形態では、植物タンパク質相同体は、血清タンパク質の少なくとも
１つの植物タンパク質相同体を含む、任意の植物抽出物又は植物抽出物の画分であり得る。非限定的な例により、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物タンパク質抽出物の水溶性画分由来又はその中であり得る。植物タンパク質単離物の水溶性画分は、植物アルブミン及び植物グロブリンを含み得る。他の実施形態では、植物タンパク質単離物の水溶性画分は植物アルブミンを含み得る。植物抽出物及び画分を得る方法は、当技術分野で公知である。
【0134】
[00181]植物タンパク質抽出物は、１つ又はそれ以上の植物タンパク質相同体を含み得
る。例えば、一部の実施形態では、植物タンパク質単離物は、植物アルブミン及び植物グロブリンを含み得る。他の実施形態では、植物タンパク質単離物は、植物アルブミンを含み得る。
る。例えば、一部の実施形態では、植物タンパク質単離物は、植物アルブミン及び植物グロブリンを含み得る。他の実施形態では、植物タンパク質単離物は、植物アルブミンを含み得る。
【0135】
[00182]一部の実施形態では、植物タンパク質相同体は、植物抽出物から単離される。
植物タンパク質の単離は、当業者に周知であり、非限定的な例により、液体分画、遠心分離、カラム交換を含み、その全てが日常的な実験である。
植物タンパク質の単離は、当業者に周知であり、非限定的な例により、液体分画、遠心分離、カラム交換を含み、その全てが日常的な実験である。
【0136】
[00183]植物タンパク質相同体は、植物抽出物から精製され得る。したがって、一部の
実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体が純粋形態であり得る。
[00184]他の実施形態では、植物タンパク質相同体は、植物抽出物又は植物単離物から
、それらの純粋形態に精製されない。むしろ、少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む植物抽出物又は単離物は、少なくとも１つの植物タンパク質相同体の供給源として使用される。したがって、一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物抽出物画分の形態であり得る。植物画分は、単離物又はさらなる画分へとプロセス又はさらに分離され得る。一部の実施形態では、植物画分又は単離物は濃縮され得る。
実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体が純粋形態であり得る。
[00184]他の実施形態では、植物タンパク質相同体は、植物抽出物又は植物単離物から
、それらの純粋形態に精製されない。むしろ、少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む植物抽出物又は単離物は、少なくとも１つの植物タンパク質相同体の供給源として使用される。したがって、一部の実施形態では、少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、植物抽出物画分の形態であり得る。植物画分は、単離物又はさらなる画分へとプロセス又はさらに分離され得る。一部の実施形態では、植物画分又は単離物は濃縮され得る。
【0137】
[00185]一部の実施形態では、血清タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同
体は、組換えにより生産される。植物タンパク質の組換え生産の方法は、当業者に公知である。一度生産されると、一部の実施形態では、組換え植物タンパク質相同体は、当業者
に公知の方法によって単離及び／又は精製され得る。
体は、組換えにより生産される。植物タンパク質の組換え生産の方法は、当業者に公知である。一度生産されると、一部の実施形態では、組換え植物タンパク質相同体は、当業者
に公知の方法によって単離及び／又は精製され得る。
【0138】
[00186]本開示のさらに別の態様は、本明細書に開示の細胞培養培地サプリメントと、
無血清培地と前記サプリメントを混合するための説明書とを含むキットを提供する。一部の実施形態では、無血清培地は、任意の動物タンパク質を欠く。一部の実施形態では、無血清培地は、任意の動物成分を欠く。キットは、細胞培養のための追加の成分をさらに含み得る。
無血清培地と前記サプリメントを混合するための説明書とを含むキットを提供する。一部の実施形態では、無血清培地は、任意の動物タンパク質を欠く。一部の実施形態では、無血清培地は、任意の動物成分を欠く。キットは、細胞培養のための追加の成分をさらに含み得る。
【0139】
[00187]本開示のさらなる態様は、細胞培養培地サプリメント中の動物タンパク質の代
わりに動物タンパク質の植物タンパク質相同体の使用を提供する。一部の実施形態では、動物タンパク質は血清タンパク質である。一部の実施形態では、サプリメントは、任意の動物タンパク質を欠く。一部の実施形態では、サプリメントは、任意の動物成分を欠く。植物タンパク質相同体は、本明細書に開示のものの１つ又はそれ以上であり得る。
わりに動物タンパク質の植物タンパク質相同体の使用を提供する。一部の実施形態では、動物タンパク質は血清タンパク質である。一部の実施形態では、サプリメントは、任意の動物タンパク質を欠く。一部の実施形態では、サプリメントは、任意の動物成分を欠く。植物タンパク質相同体は、本明細書に開示のものの１つ又はそれ以上であり得る。
【0140】
[00188]本開示の一態様では、血清相同体の動物細胞又は組織増殖促進活性を測定する
アッセイを提供する。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、消費に望ましい任意の食用種であり、限定はされないが、家畜、家禽、魚、貝、甲殻類、及び軟体動物が挙げられる。
アッセイを提供する。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、消費に望ましい任意の食用種であり、限定はされないが、家畜、家禽、魚、貝、甲殻類、及び軟体動物が挙げられる。
【0141】
[00189]一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、家畜、例えばウシ、ヒツジ、
ブタ、ヤギ、ラム、ウマ、ロバ、ウサギ、及びラバである。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、伝統的に「狩猟動物」と考えられる動物、例えばカリブー、クマ、イノシシ、シカ、ヘラジカ、及びムースである。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、家禽、例えばニワトリ、カモ、ガン、ホロホロチョウ、ウズラ、及びシチメンチョウである。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、魚、例えばバス、コイ、ナマズ、マジェランアイナメ、タラ、カレイ、オヒョウ、マヒマヒ、アンコウ、カワカマス、パーチ、オレンジラフィー、サケ、ニシンダマシ、フエダイ、メカジキ、ティラピア、マス、及びマグロである。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、甲殻類、例えばカニ、ザリガニ、ロブスター、クルマエビ、及びシュリンプである。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、軟体動物、例えば、二枚貝、ムラサキガイ、タコ、カキ、ホタテガイ、及びイカである。
ブタ、ヤギ、ラム、ウマ、ロバ、ウサギ、及びラバである。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、伝統的に「狩猟動物」と考えられる動物、例えばカリブー、クマ、イノシシ、シカ、ヘラジカ、及びムースである。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、家禽、例えばニワトリ、カモ、ガン、ホロホロチョウ、ウズラ、及びシチメンチョウである。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、魚、例えばバス、コイ、ナマズ、マジェランアイナメ、タラ、カレイ、オヒョウ、マヒマヒ、アンコウ、カワカマス、パーチ、オレンジラフィー、サケ、ニシンダマシ、フエダイ、メカジキ、ティラピア、マス、及びマグロである。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、甲殻類、例えばカニ、ザリガニ、ロブスター、クルマエビ、及びシュリンプである。一部の実施形態では、細胞又は組織の供給源は、軟体動物、例えば、二枚貝、ムラサキガイ、タコ、カキ、ホタテガイ、及びイカである。
【0142】
[00190]一部の実施形態では、アッセイは、血清相同体が所定の培地の成分の代わりと
して機能するかどうか決定するために設計され、血清相同体は、培地の１つ又はそれ以上の所定の成分が低減、除去、又は添加されない増殖培地に添加することによって試験される。一部の実施形態では、アッセイは、所定の培地へのサプリメントとして使用される場合、血清相同体が細胞増殖及び／又は密度を増加させるかどうか決定するために設計される。
して機能するかどうか決定するために設計され、血清相同体は、培地の１つ又はそれ以上の所定の成分が低減、除去、又は添加されない増殖培地に添加することによって試験される。一部の実施形態では、アッセイは、所定の培地へのサプリメントとして使用される場合、血清相同体が細胞増殖及び／又は密度を増加させるかどうか決定するために設計される。
【0143】
[00191]一部の実施形態では、アッセイシステムは、動物細胞若しくは組織及び動物細
胞若しくは組織の増殖及び／又は発生に好適な培地を含む。一部の実施形態では、培地は、動物細胞又は組織の増殖に十分な量の成分を含む。一部の実施形態では、培地は、動物細胞又は組織の増殖に十分な量のほとんどだが全てではない成分を含む。一部の実施形態では、培地は無血清である。一部の実施形態では、培地は、ある特定の血清成分を含むが、他の血清成分を欠損する。一部の実施形態では、例えば、免疫学的（例えば抗体）手段によって、１つ又はそれ以上の血清成分が低減、差し引き又は除去される。
胞若しくは組織の増殖及び／又は発生に好適な培地を含む。一部の実施形態では、培地は、動物細胞又は組織の増殖に十分な量の成分を含む。一部の実施形態では、培地は、動物細胞又は組織の増殖に十分な量のほとんどだが全てではない成分を含む。一部の実施形態では、培地は無血清である。一部の実施形態では、培地は、ある特定の血清成分を含むが、他の血清成分を欠損する。一部の実施形態では、例えば、免疫学的（例えば抗体）手段によって、１つ又はそれ以上の血清成分が低減、差し引き又は除去される。
【0144】
[00192]一部の実施形態では、培地が無血清完全培地として使用することができるよう
に、培地又は液体ベース混合物は、本明細書に記載のように基本培地及びサプリメントの１つ又はそれ以上の要素、例えば塩、アミノ酸、ビタミン、緩衝液、ヌクレオチド、抗生
物質、微量元素、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を含み得る。
に、培地又は液体ベース混合物は、本明細書に記載のように基本培地及びサプリメントの１つ又はそれ以上の要素、例えば塩、アミノ酸、ビタミン、緩衝液、ヌクレオチド、抗生
物質、微量元素、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を含み得る。
【0145】
[00193]例示的な無機塩としては、限定はされないが、リン酸カリウム、塩化カルシウ
ム（無水）、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性、塩化スズ及び硫酸亜鉛が挙げられる。例示的な有機塩としては、限定はされないが、重炭酸ナトリウム又はＨＥＰＥＳが挙げれる。
ム（無水）、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性、塩化スズ及び硫酸亜鉛が挙げられる。例示的な有機塩としては、限定はされないが、重炭酸ナトリウム又はＨＥＰＥＳが挙げれる。
【0146】
[00194]例示的な糖としては、限定はされないが、デキストロース、グルコース、ラク
トース、ガラクトース、フルクトース及びこれらの糖の多量体が挙げられる。
[00195]例示的な抗酸化剤としては、限定はされないが、トコフェロール、トコトリエ
ノール、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、アルファ－トコフェロールキノン、トロロクス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコピン、ベータカロチン、セレン、ユビキノン、ルテイン（ｌｕｅｔｉｎ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ－アセチルシステイン、クエン酸、Ｌ－カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスタミン及びシスタチオニン（ｃｙｓｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）、並びにグリシン－グリシン－ヒスチジン（トリペプチド）が挙げられる。
トース、ガラクトース、フルクトース及びこれらの糖の多量体が挙げられる。
[00195]例示的な抗酸化剤としては、限定はされないが、トコフェロール、トコトリエ
ノール、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、アルファ－トコフェロールキノン、トロロクス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコピン、ベータカロチン、セレン、ユビキノン、ルテイン（ｌｕｅｔｉｎ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ－アセチルシステイン、クエン酸、Ｌ－カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスタミン及びシスタチオニン（ｃｙｓｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）、並びにグリシン－グリシン－ヒスチジン（トリペプチド）が挙げられる。
【0147】
[00196]例示的な微量元素としては、限定はされないが、銅、鉄、亜鉛、マンガン、ケ
イ素、モリブデン酸（ｍｏｌｙｂｄｎａｔｅ）、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズ、アルミニウム、銀、バリウム、臭素、カドミウム、コバルト、クロム、カルシウム、二価カチオン、フッ素、ゲルマニウム、ヨウ素、ルビジウム、ジルコニウム、又はセレンが挙げられる。さらなる微量元素は、国際公開第２００６／００４７２８号に開示される。
イ素、モリブデン酸（ｍｏｌｙｂｄｎａｔｅ）、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズ、アルミニウム、銀、バリウム、臭素、カドミウム、コバルト、クロム、カルシウム、二価カチオン、フッ素、ゲルマニウム、ヨウ素、ルビジウム、ジルコニウム、又はセレンが挙げられる。さらなる微量元素は、国際公開第２００６／００４７２８号に開示される。
【0148】
[00197]一部の実施形態では、培地又は液体ベース混合物は、鉄源又は鉄トランスポー
ターを含む。例示的な鉄源としては、限定はされないが、第二鉄塩及び第一鉄塩、例えば硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、第二鉄アンモニウム化合物、例えばクエン酸第二鉄アンモニウム、蓚酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウム及びコハク酸第二鉄アンモニウムが挙げられる。例示的な鉄トランスポーターとしては、限定はされないが、トランスフェリン及びラクトフェリンが挙げられる。
ターを含む。例示的な鉄源としては、限定はされないが、第二鉄塩及び第一鉄塩、例えば硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、第二鉄アンモニウム化合物、例えばクエン酸第二鉄アンモニウム、蓚酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウム及びコハク酸第二鉄アンモニウムが挙げられる。例示的な鉄トランスポーターとしては、限定はされないが、トランスフェリン及びラクトフェリンが挙げられる。
【0149】
[00198]一部の実施形態では、培地又は液体ベース混合物は、銅源又は銅トランスポー
ター（例えばＧＨＫ－Ｃｕ）をさらに含み得る。例示的な銅源としては、限定はされないが、塩化銅及び硫酸銅が挙げられる。
ター（例えばＧＨＫ－Ｃｕ）をさらに含み得る。例示的な銅源としては、限定はされないが、塩化銅及び硫酸銅が挙げられる。
【0150】
[00199]一部の実施形態では、鉄源又は銅源は、約０．０５～２５０ｎｇ／ｍｌ、０．
０５～１００ｎｇ／ｍｌ、約０．０５～５０ｎｇ／ｍｌ、約０．０５～１０ｎｇ／ｍｌ、約０．１～５ｎｇ／ｍｌ、約０．５～２．５ｎｇ／ｍｌ、又は約１～５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度で血清代替培地に添加される。鉄源又は銅源が、約０．０５、０．１、０．２５、０．３５、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｎｇ／ｍｌの血清代替物の最終濃度であることがさらに考えれる。
０５～１００ｎｇ／ｍｌ、約０．０５～５０ｎｇ／ｍｌ、約０．０５～１０ｎｇ／ｍｌ、約０．１～５ｎｇ／ｍｌ、約０．５～２．５ｎｇ／ｍｌ、又は約１～５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度で血清代替培地に添加される。鉄源又は銅源が、約０．０５、０．１、０．２５、０．３５、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｎｇ／ｍｌの血清代替物の最終濃度であることがさらに考えれる。
【0151】
[00200]一部の実施形態では、血清代替物又は培地サプリメントが基本培地に添加され
た。標準的な基本培地は、細胞培養の分野で公知であり、市販されている。基本培地の例としては、限定はされないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ Ｆ１２（１：１）、イスコフ改変ダルベッコ培地、Ｈａｍ’ｓ栄養混合物Ｆ－１０又はＦ－１２、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ＭＣＤＢ１３１、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、培地１９９、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ培地Ｅ、並びにＧｒａｃｅ’ｓ培地及びＴＮＭ－ＦＨのような昆虫培地が挙げられる。
た。標準的な基本培地は、細胞培養の分野で公知であり、市販されている。基本培地の例としては、限定はされないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ Ｆ１２（１：１）、イスコフ改変ダルベッコ培地、Ｈａｍ’ｓ栄養混合物Ｆ－１０又はＦ－１２、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ＭＣＤＢ１３１、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地、培地１９９、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ培地Ｅ、並びにＧｒａｃｅ’ｓ培地及びＴＮＭ－ＦＨのような昆虫培地が挙げられる。
【0152】
[00201]本明細書に記載される血清代替物及び培地サプリメントは、市販の無血清培養
培地での使用のためにも考えられる。例示的な無血清培地としては、限定はされないが、ＡＩＭ－Ｖ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、ＰＥＲ－Ｃ６（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｋｎｏｃｋ－Ｏｕｔ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ－Ｍｅｄｉｕｍｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．）が挙げられる。
培地での使用のためにも考えられる。例示的な無血清培地としては、限定はされないが、ＡＩＭ－Ｖ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、ＰＥＲ－Ｃ６（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｋｎｏｃｋ－Ｏｕｔ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ－Ｍｅｄｉｕｍｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．）が挙げられる。
【0153】
[00202]任意のこれらの培地は、場合により、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグ
ネシウム、及びリン酸など）、アミノ酸、ビタミン、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を供給される。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等のような培養条件は、当業者には明らかであろう。
ネシウム、及びリン酸など）、アミノ酸、ビタミン、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を供給される。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等のような培養条件は、当業者には明らかであろう。
【0154】
[00203]培地組成物は、単位形態でパッケージされることが考えられる。一実施形態で
は、培地（血清代替物、培地サプリメント、完全培地又は凍結保存培地）は、１０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、５００ｍｌ又は１Ｌの容積でパッケージされる。
は、培地（血清代替物、培地サプリメント、完全培地又は凍結保存培地）は、１０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、５００ｍｌ又は１Ｌの容積でパッケージされる。
【0155】
[00204]本開示の一態様では、本明細書に開示の細胞培地サプリメント及び／又は培地
を含む、細胞を培養する方法を提供する。
[00205]培地、例えば本明細書に記載される血清代替物、培地サプリメント、完全培地
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の培養、好ましくは、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの十分な増殖のために血清代替物又は既知組成の培地を必要とする細胞に有用である。そのような細胞は、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞のような真核細胞を含む。血清代替物、完全培地又は培地サプリメントの使用から利益を考えられる哺乳動物細胞としては、限定はされないが、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ／雄ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ及びヒト細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫（ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊（ｍｏｓｑｕｉｔｏ））、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊（ｍｏｓｑｕｉｔｏ））、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ（ｆｒｕｉｔｆｌｙ））、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）由来の細胞が挙げられる。
を含む、細胞を培養する方法を提供する。
[00205]培地、例えば本明細書に記載される血清代替物、培地サプリメント、完全培地
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の培養、好ましくは、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの十分な増殖のために血清代替物又は既知組成の培地を必要とする細胞に有用である。そのような細胞は、哺乳動物細胞、及び昆虫細胞のような真核細胞を含む。血清代替物、完全培地又は培地サプリメントの使用から利益を考えられる哺乳動物細胞としては、限定はされないが、ハムスター、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ／雄ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ及びヒト細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫（ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊（ｍｏｓｑｕｉｔｏ））、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊（ｍｏｓｑｕｉｔｏ））、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ（ｆｒｕｉｔｆｌｙ））、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）由来の細胞が挙げられる。
【0156】
[00206]血清代替物、完全培地又は培地サプリメントによって培養された細胞は、不死
化細胞（細胞系）又は非不死化（一次又は二次）細胞であり、ｉｎ ｖｉｖｏで見出される広範な細胞型のいずれかであり得ることが考えられる。例示的な細胞型としては、限定はされないが、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、卵巣細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の形成要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、軟骨細胞及び他の骨由来細胞、肝細胞、膵臓、及びこれらの体細胞型の前駆体が挙げられる。
化細胞（細胞系）又は非不死化（一次又は二次）細胞であり、ｉｎ ｖｉｖｏで見出される広範な細胞型のいずれかであり得ることが考えられる。例示的な細胞型としては、限定はされないが、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、卵巣細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の形成要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、軟骨細胞及び他の骨由来細胞、肝細胞、膵臓、及びこれらの体細胞型の前駆体が挙げられる。
【0157】
[00207]一部の実施形態では、培地による使用を考えられる細胞は、哺乳動物対象から
単離される。哺乳動物対象から単離される細胞としては、限定はされないが、多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄間質細胞、造血前駆細胞、免疫幹細胞、骨髄幹細胞、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、軟骨細胞及び他の骨由来細胞、肝細胞、膵臓細胞、体細胞型の前駆体、及び任意の癌腫又は腫瘍由来細胞が挙げられる。
単離される。哺乳動物対象から単離される細胞としては、限定はされないが、多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄間質細胞、造血前駆細胞、免疫幹細胞、骨髄幹細胞、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、軟骨細胞及び他の骨由来細胞、肝細胞、膵臓細胞、体細胞型の前駆体、及び任意の癌腫又は腫瘍由来細胞が挙げられる。
【0158】
[00208]一部の実施形態では、細胞は細胞系である。例示的な細胞系としては、限定は
されないが、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、及びＣＨＯ／－ＤＨＦＲを含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；サル腎臓ＣＶ１、ＣＯＳ－７；ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ）；ヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２；ＳＫ－Ｈｅｐ）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；Ｔ細胞系（Ｊｕｒｋａｔ）；Ｂ細胞系、マウス３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、ＨＴ１０８０、Ｌ９２９、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、及び不死化一次細胞が挙げられる。
されないが、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、及びＣＨＯ／－ＤＨＦＲを含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；サル腎臓ＣＶ１、ＣＯＳ－７；ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ）；ヒト子宮頸部癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２；ＳＫ－Ｈｅｐ）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；Ｔ細胞系（Ｊｕｒｋａｔ）；Ｂ細胞系、マウス３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、ＨＴ１０８０、Ｌ９２９、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、及び不死化一次細胞が挙げられる。
【0159】
[00209]例示的な昆虫細胞系としては、限定はされないが、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＨＩＧ
Ｈ ＦＩＶＥ．ＴＭ．、ＥＸＰＲＥＳＳＦ＋．ＲＴＭ．、Ｓ２、Ｔｎ５、ＴＮ－３６８、ＢｍＮ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２、Ｄ２、Ｃ６／３６及びＫＣ細胞が挙げられる。
Ｈ ＦＩＶＥ．ＴＭ．、ＥＸＰＲＥＳＳＦ＋．ＲＴＭ．、Ｓ２、Ｔｎ５、ＴＮ－３６８、ＢｍＮ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２、Ｄ２、Ｃ６／３６及びＫＣ細胞が挙げられる。
【0160】
[00210]さらなる細胞型及び細胞系が、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開
第２００６／００４７２８号に開示される。これらの細胞としては、限定はされないが、ＣＤ３４＋造血幹細胞及び骨髄系列の細胞、２９３胎児由来腎臓細胞、Ａ－５４９、ジャーカット、Ｎａｍａｌｗａ、Ｈｅｌａ、２９３ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞、ＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－Ｉ）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－Ｇ２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ １８０細胞、ＬＳ １７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、Ｃｌｏｎｅ Ｍ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－Ｉ細胞、Ｙ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、ＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、又はこれらの誘導体、任意の組織又は器官（限定はされないが、心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細）、リンパ組織（リンパ節、アデノイド、扁桃、骨髄、及び血液）、脾臓、線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞系）、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、ＭｉＣ１１細胞、ＣＶ－Ｉ細胞、ＣＯＳ－Ｉ細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－Ｉ１細胞、ＮＯＲ－ＩＯ細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、Ｓｔｒａｉｎ ２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ（マウスＬ）細
胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、ＮＳＯ、ＮＳ１、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔｊａｃ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、Ｊｅｎｓｅｎ細胞、ＣＯＳ細胞及びＳｐ２／０細胞、それらの模倣細胞及び／又は誘導体が挙げられる。
第２００６／００４７２８号に開示される。これらの細胞としては、限定はされないが、ＣＤ３４＋造血幹細胞及び骨髄系列の細胞、２９３胎児由来腎臓細胞、Ａ－５４９、ジャーカット、Ｎａｍａｌｗａ、Ｈｅｌａ、２９３ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞、ＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－Ｉ）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－Ｇ２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ １８０細胞、ＬＳ １７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、Ｃｌｏｎｅ Ｍ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－Ｉ細胞、Ｙ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、ＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、又はこれらの誘導体、任意の組織又は器官（限定はされないが、心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細）、リンパ組織（リンパ節、アデノイド、扁桃、骨髄、及び血液）、脾臓、線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞系）、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、ＭｉＣ１１細胞、ＣＶ－Ｉ細胞、ＣＯＳ－Ｉ細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－Ｉ１細胞、ＮＯＲ－ＩＯ細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、Ｓｔｒａｉｎ ２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ（マウスＬ）細
胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、ＮＳＯ、ＮＳ１、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔｊａｃ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、Ｊｅｎｓｅｎ細胞、ＣＯＳ細胞及びＳｐ２／０細胞、それらの模倣細胞及び／又は誘導体が挙げられる。
【0161】
[00211]本明細書で考えた細胞培養条件は、細胞を増殖させるために好適な任意の培養
基材に適用してもよい。好適な表面を有する基材としては、組織培養ウェル、培養フラスコ、ローラーボトル、ガス透過容器、平又は平行プレートバイオリアクター又は細胞工場が挙げられる。細胞が、撹拌槽の懸濁液中に維持されるマイクロキャリア又は粒子に接着される培養条件も考えられる。
基材に適用してもよい。好適な表面を有する基材としては、組織培養ウェル、培養フラスコ、ローラーボトル、ガス透過容器、平又は平行プレートバイオリアクター又は細胞工場が挙げられる。細胞が、撹拌槽の懸濁液中に維持されるマイクロキャリア又は粒子に接着される培養条件も考えられる。
【0162】
[00212]細胞培養方法は、通常、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：
Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，６．Ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍ．Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＆ Ｉ．Ｆ．Ｒａｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）、及びＥｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に記載される。他の参照テキストは、Ｃｒｅａｔｉｎｇ ａ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ａｒｏｓｅｌｌｉ，Ｈｕ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｐｒ．１９９６）及びＬｉｍｉｔｓ ｔｏ Ｇｒｏｗｔｈ（Ｄ．Ｈ．Ｍｅａｄｏｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｅ
Ｐｕｂｌ．１９７４）を含む。組織培養サプリ及び試薬は、当業者に周知であり、市販されている。
Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，６．Ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍ．Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＆ Ｉ．Ｆ．Ｒａｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）、及びＥｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に記載される。他の参照テキストは、Ｃｒｅａｔｉｎｇ ａ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ａｒｏｓｅｌｌｉ，Ｈｕ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｐｒ．１９９６）及びＬｉｍｉｔｓ ｔｏ Ｇｒｏｗｔｈ（Ｄ．Ｈ．Ｍｅａｄｏｗｓ ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｅ
Ｐｕｂｌ．１９７４）を含む。組織培養サプリ及び試薬は、当業者に周知であり、市販されている。
【0163】
[00213]血清代替物、完全培地又は培地サプリメントによって使用される特定の細胞系
又は単離した細胞型に適切な密度で細胞が培養中に置かれることが理解される。一部の実施形態では、細胞は、１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６又は５×１０６個の細胞／ｍｌで培養される。
又は単離した細胞型に適切な密度で細胞が培養中に置かれることが理解される。一部の実施形態では、細胞は、１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６又は５×１０６個の細胞／ｍｌで培養される。
【0164】
[00214]一部の実施形態では、培養細胞は、線維芽細胞である。一実施形態では、細胞
は、ウシ線維芽細胞である。一実施形態では、細胞は、ニワトリ線維芽細胞である。
[00215]ニワトリ胚線維芽細胞は、ウイルス及びワクチンの製造に広く使用される。ニ
ワトリ胚肝臓細胞と共に、それらは特定の病原体フリー（ＳＰＦ）の胚から生産され、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）及び他の会社によって販売される。ニワトリ肝臓細胞は、それらの哺乳動物相対物のように、培養で限定的な増殖を示すが、ニワトリ線維芽細胞は、腫瘍化せずに自然に不死化する前に、約２．６トンの細胞を生産する、３０を超えて集団倍加することができる。ＵＭＮＳＡＨ／ＤＦ－１（ＣＲＬ－１２２０３）のような、自然に形質転換したニワトリ線維芽細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から直接購入することができる。線維芽細胞の増殖能は優れているが、細胞は主に食べられない結合組織を形成する。
は、ウシ線維芽細胞である。一実施形態では、細胞は、ニワトリ線維芽細胞である。
[00215]ニワトリ胚線維芽細胞は、ウイルス及びワクチンの製造に広く使用される。ニ
ワトリ胚肝臓細胞と共に、それらは特定の病原体フリー（ＳＰＦ）の胚から生産され、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）及び他の会社によって販売される。ニワトリ肝臓細胞は、それらの哺乳動物相対物のように、培養で限定的な増殖を示すが、ニワトリ線維芽細胞は、腫瘍化せずに自然に不死化する前に、約２．６トンの細胞を生産する、３０を超えて集団倍加することができる。ＵＭＮＳＡＨ／ＤＦ－１（ＣＲＬ－１２２０３）のような、自然に形質転換したニワトリ線維芽細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から直接購入することができる。線維芽細胞の増殖能は優れているが、細胞は主に食べられない結合組織を形成する。
【0165】
[00216]ニワトリ胚内皮は、容易に単離され得るが、それらの増殖能が未知であり、器
官特異的であり得る。マウス微小血管細胞は、３０集団倍加することができるが、ヒト細胞はめったに１２集団倍加を超えない。ニワトリ胚筋肉細胞（筋細胞）は同様に単離され得るが、非常に限定された増殖能を有する。マウス及びヒト細胞は、めったに１２集団倍加を超えない。筋形成、新しい筋肉組織の形成は、ほとんどの種の一生の新生児期の一般的ではない経過である。小分子は、概念的に使用され、この挙動を調節することができる。
官特異的であり得る。マウス微小血管細胞は、３０集団倍加することができるが、ヒト細胞はめったに１２集団倍加を超えない。ニワトリ胚筋肉細胞（筋細胞）は同様に単離され得るが、非常に限定された増殖能を有する。マウス及びヒト細胞は、めったに１２集団倍加を超えない。筋形成、新しい筋肉組織の形成は、ほとんどの種の一生の新生児期の一般的ではない経過である。小分子は、概念的に使用され、この挙動を調節することができる。
【0166】
[00217]多くのグループが、ここ１０年にわたり、ニワトリ胚幹細胞（ｃＥＳＣ）を生
産した。細胞は、受精したニワトリ卵から単離され、本質的に不死である。ニワトリ人工多能性幹細胞（ｃｉＰＳＣ）は、再プログラム化因子ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣによりウズラ胚線維芽細胞から、より近年では、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣを使用してニワトリ線維芽細胞から生産された。細胞は、本質的に不死であるが、遺伝的に操作されている。
産した。細胞は、受精したニワトリ卵から単離され、本質的に不死である。ニワトリ人工多能性幹細胞（ｃｉＰＳＣ）は、再プログラム化因子ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣによりウズラ胚線維芽細胞から、より近年では、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、及びＣ－ＭＹＣを使用してニワトリ線維芽細胞から生産された。細胞は、本質的に不死であるが、遺伝的に操作されている。
【0167】
[00218]近年、マウス多能性幹細胞は、筋細胞、肝細胞、及び内皮細胞並びに複合胚葉
体を含む、複数の細胞型の分化を可能にする小分子を使用して線維芽細胞から誘導された。ｃｉＰＳＣの化学誘導は、線維芽細胞を他の細胞型に変換する代替の手法を提供する。
体を含む、複数の細胞型の分化を可能にする小分子を使用して線維芽細胞から誘導された。ｃｉＰＳＣの化学誘導は、線維芽細胞を他の細胞型に変換する代替の手法を提供する。
【0168】
[00219]より近年の研究では、ヒト線維芽細胞を誘導し、心筋細胞へと変化させる９つ
の化合物の組合せが同定されたが、その他はマウス細胞を形質転換する７つの化合物の組合せを使用した。多くのシグナル伝達経路が保存されていることを考慮して、比較的類似の組合せを使用して、ニワトリ線維芽細胞を筋細胞へと形質転換することができる。
の化合物の組合せが同定されたが、その他はマウス細胞を形質転換する７つの化合物の組合せを使用した。多くのシグナル伝達経路が保存されていることを考慮して、比較的類似の組合せを使用して、ニワトリ線維芽細胞を筋細胞へと形質転換することができる。
【0169】
[00220]上記のように、細胞培養培地は、接着因子、脂肪酸、増殖因子、ホルモン、及
びアルブミンを提供するウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有することが多い。ＦＢＳは、通常、トランスフェリン、インシュリン、及び脂質の多いウシ血清アルブミンに加えてアミノ酸、ビタミン、及び微量元素から構成される血清代替物（例えばＫＯ血清）と置き換えることができる。トランスフェリンとインシュリンの両方が、組換え技術を使用して細菌において生産されるが、アルブミンは通常動物由来である。しかしながら、植物及び細菌由来組換えヒトアルブミン（例えばＣｅｌｌａｓｔｉｍ（商標））は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む、いくつかの会社から入手できる。
びアルブミンを提供するウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有することが多い。ＦＢＳは、通常、トランスフェリン、インシュリン、及び脂質の多いウシ血清アルブミンに加えてアミノ酸、ビタミン、及び微量元素から構成される血清代替物（例えばＫＯ血清）と置き換えることができる。トランスフェリンとインシュリンの両方が、組換え技術を使用して細菌において生産されるが、アルブミンは通常動物由来である。しかしながら、植物及び細菌由来組換えヒトアルブミン（例えばＣｅｌｌａｓｔｉｍ（商標））は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む、いくつかの会社から入手できる。
【0170】
[00221]ニワトリ線維芽細胞培地は、伝統的には、１０％ ＦＢＳ、トリプトースリン
酸及びグルタミンを補充したＭＩ ９９培地から構成される。しかしながら、哺乳動物線維芽細胞の増殖のための無血清培地は、現在、容易に入手できる。培地は、０．５ｍｇ／ｍＬアルブミン、０．６μＭリノレン酸、０．６μｇ／ｍＬレシチン、５ｎｇ／ｎｉＬ ｂＥＧＦ、５ｎｇ／ｎｉＬ ＥＧＦ、３０ｐｇ／ｍＬ ＴＧＦｐｉ、７．５ｍＭグルタミン、１μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、及び５μｇ／ｍＬインシュリンを補充したＭＩ ９９培地から構成される。この培地ＰＳＣ－２０１－０４０は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手でき、ヒト線維芽細胞の４倍速い増殖を支持することが報告されている。ニワトリ肝細胞は、ヒト及びマウス肝細胞のために設計された無血清培養培地によって同様に支持される。培地は、アルブミン、インシュリン、トランスフェリン、及びヒドロコルチゾンを補充したＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ基本培地から構成される。
酸及びグルタミンを補充したＭＩ ９９培地から構成される。しかしながら、哺乳動物線維芽細胞の増殖のための無血清培地は、現在、容易に入手できる。培地は、０．５ｍｇ／ｍＬアルブミン、０．６μＭリノレン酸、０．６μｇ／ｍＬレシチン、５ｎｇ／ｎｉＬ ｂＥＧＦ、５ｎｇ／ｎｉＬ ＥＧＦ、３０ｐｇ／ｍＬ ＴＧＦｐｉ、７．５ｍＭグルタミン、１μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、及び５μｇ／ｍＬインシュリンを補充したＭＩ ９９培地から構成される。この培地ＰＳＣ－２０１－０４０は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手でき、ヒト線維芽細胞の４倍速い増殖を支持することが報告されている。ニワトリ肝細胞は、ヒト及びマウス肝細胞のために設計された無血清培養培地によって同様に支持される。培地は、アルブミン、インシュリン、トランスフェリン、及びヒドロコルチゾンを補充したＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ基本培地から構成される。
【0171】
[00222]ニワトリ及びウシ足場非依存性線維芽細胞は、標準的な分化プロトコールによ
って足場非依存性脂肪細胞へと分化させる。ＦＭＴ－ＳＣＦ－２（ニワトリ非接着線維芽細胞）及びＦＭＴ－ＳＢＦ－１（ウシ非接着線維芽細胞）は、ＰＰＡＲガンマアゴニストと共に２００μＭオレイン酸を含有する脂肪生成培地中で増殖させた。合成阻害剤（ロシグリタゾン）及び天然阻害剤（プリスタン酸）は両方試験された。
って足場非依存性脂肪細胞へと分化させる。ＦＭＴ－ＳＣＦ－２（ニワトリ非接着線維芽細胞）及びＦＭＴ－ＳＢＦ－１（ウシ非接着線維芽細胞）は、ＰＰＡＲガンマアゴニストと共に２００μＭオレイン酸を含有する脂肪生成培地中で増殖させた。合成阻害剤（ロシグリタゾン）及び天然阻害剤（プリスタン酸）は両方試験された。
【0172】
[00223]灌流した培養培地は、酸素担体も含み得る。ヘモグロビンベースの酸素担体は
、組換え又は化学改変のいずれかのヘモグロビン誘導体、カプセル化ヘモグロビン又は改変（例えば架橋）赤血球を含む。代替物は、Ｎａｈｍｉａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０（１４）：２５３１－２５３３）において開発されたもののような、パーフルオロカーボンベースの代替物を含む。
、組換え又は化学改変のいずれかのヘモグロビン誘導体、カプセル化ヘモグロビン又は改変（例えば架橋）赤血球を含む。代替物は、Ｎａｈｍｉａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０（１４）：２５３１－２５３３）において開発されたもののような、パーフルオロカーボンベースの代替物を含む。
【0173】
[00224]通常、一次線維芽細胞は、限定細胞分化でき、したがって、約３０集団倍加（
例えば１０継代）後に細胞性老化することに注意すべきである。不死化線維芽細胞系を生成する方法は、公知の方法を使用するテロメラーゼ遺伝子、又はＳＶ４０、又はＨＰＶＥ６／Ｅ７遺伝子の導入による遺伝子操作を含む。
例えば１０継代）後に細胞性老化することに注意すべきである。不死化線維芽細胞系を生成する方法は、公知の方法を使用するテロメラーゼ遺伝子、又はＳＶ４０、又はＨＰＶＥ６／Ｅ７遺伝子の導入による遺伝子操作を含む。
【0174】
[00225]他の鳥類の線維芽細胞、例えばカモ、ガン、及びウズラ線維芽細胞も好適であ
ることが考えられる。
[00226]本開示の別の態様は、本明細書に開示の任意の細胞培養培地中で細胞を培養す
ることによって培養肉を生産する方法及び培養細胞から肉を生産する方法を提供する。
ることが考えられる。
[00226]本開示の別の態様は、本明細書に開示の任意の細胞培養培地中で細胞を培養す
ることによって培養肉を生産する方法及び培養細胞から肉を生産する方法を提供する。
【0175】
[00227]一部の実施形態では、細胞は、食用動物由来である。一部の実施形態では、動
物は、家畜動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラム、ウマ、ロバ、ウサギ、及びラバである。一部の実施形態では、動物は、伝統的に「狩猟動物」と考えられる動物、例えばカリブー、クマ、イノシシ、シカ、ヘラジカ、及びムースである。一部の実施形態では、動物は、家禽、例えばニワトリ、カモ、ガン、ホロホロチョウ、ウズラ、及びシチメンチョウである。一部の実施形態では、動物は、魚、例えばバス、コイ、ナマズ、マジェランアイナメ、タラ、カレイ、オヒョウ、マヒマヒ、アンコウ、カワカマス、パーチ、オレンジラフィー、サケ、ニシンダマシ、フエダイ、メカジキ、ティラピア、マス、及びマグロである。一部の実施形態では、動物は、甲殻類、例えばカニ、ザリガニ、ロブスター、クルマエビ、及びシュリンプである。一部の実施形態では、動物は、軟体動物、例えば、二枚貝、ムラサキガイ、タコ、カキ、ホタテガイ、及びイカである。
物は、家畜動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラム、ウマ、ロバ、ウサギ、及びラバである。一部の実施形態では、動物は、伝統的に「狩猟動物」と考えられる動物、例えばカリブー、クマ、イノシシ、シカ、ヘラジカ、及びムースである。一部の実施形態では、動物は、家禽、例えばニワトリ、カモ、ガン、ホロホロチョウ、ウズラ、及びシチメンチョウである。一部の実施形態では、動物は、魚、例えばバス、コイ、ナマズ、マジェランアイナメ、タラ、カレイ、オヒョウ、マヒマヒ、アンコウ、カワカマス、パーチ、オレンジラフィー、サケ、ニシンダマシ、フエダイ、メカジキ、ティラピア、マス、及びマグロである。一部の実施形態では、動物は、甲殻類、例えばカニ、ザリガニ、ロブスター、クルマエビ、及びシュリンプである。一部の実施形態では、動物は、軟体動物、例えば、二枚貝、ムラサキガイ、タコ、カキ、ホタテガイ、及びイカである。
【0176】
[00228]一部の実施形態では、細胞は線維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞
としては、限定はされないが、ウシ線維芽細胞及びニワトリ線維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞は、ウシ線維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞は、ニワトリ線維芽細胞である。
としては、限定はされないが、ウシ線維芽細胞及びニワトリ線維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞は、ウシ線維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞は、ニワトリ線維芽細胞である。
【0177】
[00229]本開示のさらに別の態様は、上記の方法によって生産された培養肉を提供する
。
[00230]本開示のさらに別の態様は、任意の動物タンパク質及び／又は動物成分を欠く
細胞培養培地、及び前記細胞培養培地を生産するための方法を提供する。
。
[00230]本開示のさらに別の態様は、任意の動物タンパク質及び／又は動物成分を欠く
細胞培養培地、及び前記細胞培養培地を生産するための方法を提供する。
【0178】
[00231]細胞培養培地は、無血清培地及び少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含
む任意の本明細書に開示の細胞培養培地サプリメントを含み得る。細胞培養培地は、任意の動物成分を欠いてもよく、及び／又は任意の動物タンパク質を欠いてもよい。少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、動物タンパク質の相同体であり得る。少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、血清タンパク質の相同体であり得る。血清タンパク質のそのような植物タンパク質相同体の例は、上記及び本明細書に開示される。
む任意の本明細書に開示の細胞培養培地サプリメントを含み得る。細胞培養培地は、任意の動物成分を欠いてもよく、及び／又は任意の動物タンパク質を欠いてもよい。少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、動物タンパク質の相同体であり得る。少なくとも１つの植物タンパク質相同体は、血清タンパク質の相同体であり得る。血清タンパク質のそのような植物タンパク質相同体の例は、上記及び本明細書に開示される。
【0179】
[00232]一部の実施形態では、無血清培地は、基本生理学的緩衝液であり、動物夾雑物
、ヒト夾雑物、又は任意の抗生物質（複数可）を欠く。一部の実施形態では、無血清培地は、基本生理学的緩衝液であり、任意の動物タンパク質を欠く。一部の実施形態では、無血清培地は、基本生理学的緩衝液であり、任意の動物成分を欠く。
、ヒト夾雑物、又は任意の抗生物質（複数可）を欠く。一部の実施形態では、無血清培地は、基本生理学的緩衝液であり、任意の動物タンパク質を欠く。一部の実施形態では、無血清培地は、基本生理学的緩衝液であり、任意の動物成分を欠く。
【0180】
[00233]例示的な無血清培地としては、限定はされないが、ＡＩＭ－Ｖ（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、ＰＥＲ－Ｃ６（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｋｎｏｃｋ－Ｏｕｔ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ－Ｍｅｄｉｕｍｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．）が挙げられる。
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、ＰＥＲ－Ｃ６（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｋｎｏｃｋ－Ｏｕｔ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ－Ｍｅｄｉｕｍｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．）が挙げられる。
【0181】
[00234]任意のこれらの培地は、場合により、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグ
ネシウム、及びリン酸など）、アミノ酸、ビタミン、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を補充される。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等のような培養条件は、当業者には明らかであろう。
ネシウム、及びリン酸など）、アミノ酸、ビタミン、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を補充される。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等のような培養条件は、当業者には明らかであろう。
【0182】
[00235]一部の実施形態では、細胞培養培地が無血清完全培地として使用することがで
きるように、細胞培養培地は、本明細書に記載の基本培地の１つ又はそれ以上の要素及びサプリメント、例えば塩、アミノ酸、ビタミン、緩衝液、ヌクレオチド、抗生物質、微量元素、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を含んでもよい。
きるように、細胞培養培地は、本明細書に記載の基本培地の１つ又はそれ以上の要素及びサプリメント、例えば塩、アミノ酸、ビタミン、緩衝液、ヌクレオチド、抗生物質、微量元素、抗酸化剤及びグルコース又は等価なエネルギー源を含んでもよい。
【0183】
[00236]例示的な無機塩としては、限定はされないが、リン酸カリウム、塩化カルシウ
ム（無水）、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性、塩化スズ及び硫酸亜鉛が挙げられる。例示的な有機塩としては、限定はされないが、重炭酸ナトリウム又はＨＥＰＥＳが挙げれる。
ム（無水）、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性、塩化スズ及び硫酸亜鉛が挙げられる。例示的な有機塩としては、限定はされないが、重炭酸ナトリウム又はＨＥＰＥＳが挙げれる。
【0184】
[00237]例示的な糖としては、限定はされないが、デキストロース、グルコース、ラク
トース、ガラクトース、フルクトース及びこれらの糖の多量体が挙げられる。
[00238]例示的な抗酸化剤としては、限定はされないが、トコフェロール、トコトリエ
ノール、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、アルファ－トコフェロールキノン、トロロクス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコピン、ベータカロチン、セレン、ユビキノン、ルテイン（ｌｕｅｔｉｎ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ－アセチルシステイン、クエン酸、Ｌ－カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスタミン及びシスタチオニン（ｃｙｓｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）、並びにグリシン－グリシン－ヒスチジン（トリペプチド）が挙げられる。
トース、ガラクトース、フルクトース及びこれらの糖の多量体が挙げられる。
[00238]例示的な抗酸化剤としては、限定はされないが、トコフェロール、トコトリエ
ノール、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、アルファ－トコフェロールキノン、トロロクス（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコピン、ベータカロチン、セレン、ユビキノン、ルテイン（ｌｕｅｔｉｎ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ－アセチルシステイン、クエン酸、Ｌ－カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスタミン及びシスタチオニン（ｃｙｓｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）、並びにグリシン－グリシン－ヒスチジン（トリペプチド）が挙げられる。
【0185】
[00239]例示的な微量元素としては、限定はされないが、銅、鉄、亜鉛、マンガン、ケ
イ素、モリブデン酸（ｍｏｌｙｂｄｎａｔｅ）、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズ、アルミニウム、銀、バリウム、臭素、カドミウム、コバルト、クロム、カルシウム、二価カチオン、フッ素、ゲルマニウム、ヨウ素、ルビジウム、ジルコニウム、又はセレンが挙げられる。さらなる微量元素は、国際公開第２００６／００４７２８号に開示される。
イ素、モリブデン酸（ｍｏｌｙｂｄｎａｔｅ）、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズ、アルミニウム、銀、バリウム、臭素、カドミウム、コバルト、クロム、カルシウム、二価カチオン、フッ素、ゲルマニウム、ヨウ素、ルビジウム、ジルコニウム、又はセレンが挙げられる。さらなる微量元素は、国際公開第２００６／００４７２８号に開示される。
【0186】
[00240]一部の実施形態では、細胞培養培地は、鉄源又は鉄トランスポーターを含む。
例示的な鉄源としては、限定はされないが、第二鉄塩及び第一鉄塩、例えば硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、第二鉄アンモニウム化合物、例えばクエン酸第二鉄アンモニウム、蓚酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウム及びコハク酸第二鉄アンモニウムが挙げられる。例示的な鉄トランスポーターとしては、限定はされないが、トランスフェリン、ラクトフェリンが挙げられる。
例示的な鉄源としては、限定はされないが、第二鉄塩及び第一鉄塩、例えば硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、第二鉄アンモニウム化合物、例えばクエン酸第二鉄アンモニウム、蓚酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウム及びコハク酸第二鉄アンモニウムが挙げられる。例示的な鉄トランスポーターとしては、限定はされないが、トランスフェリン、ラクトフェリンが挙げられる。
【0187】
[00241]一部の実施形態では、細胞培養培地は、銅源又は銅トランスポーター（例えば
ＧＨＫ－Ｃｕ）をさらに含み得る。例示的な銅源としては、限定はされないが、塩化銅及び硫酸銅が挙げられる。
ＧＨＫ－Ｃｕ）をさらに含み得る。例示的な銅源としては、限定はされないが、塩化銅及び硫酸銅が挙げられる。
【0188】
[00242]一部の実施形態では、鉄源又は銅源は、約０．０５～２５０ｎｇ／ｍｌ、０．
０５～１００ｎｇ／ｍｌ、約０．０５～５０ｎｇ／ｍｌ、約０．０５～１０ｎｇ／ｍｌ、約０．１～５ｎｇ／ｍｌ、約０．５～２．５ｎｇ／ｍｌ、又は約１～５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度で細胞培養培地に添加される。
０５～１００ｎｇ／ｍｌ、約０．０５～５０ｎｇ／ｍｌ、約０．０５～１０ｎｇ／ｍｌ、約０．１～５ｎｇ／ｍｌ、約０．５～２．５ｎｇ／ｍｌ、又は約１～５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度で細胞培養培地に添加される。
【0189】
[00243]細胞培養培地は、単位形態でパッケージされることが考えられる。一実施形態
では、細胞培養培地は、１０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、５００ｍｌ又は１Ｌの容積でパッケージされる。
では、細胞培養培地は、１０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、５００ｍｌ又は１Ｌの容積でパッケージされる。
【0190】
[00244]細胞培養培地は、他の成分をさらに含んでもよく、前記成分は任意の動物成分
及び／又は動物タンパク質を欠くと考えられる。
[00245]本明細書に記載される細胞培養培地を生産する方法も開示される。細胞培養培
地を生産する方法は、無血清基本培地と細胞培養培地サプリメントを混ぜるステップを含んでもよく、細胞培養培地は任意の動物タンパク質及び／又は動物成分を欠く。細胞培養培地サプリメントは、動物タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む。一部の実施形態では、動物タンパク質は、血清タンパク質である。植物タンパク質相同体は、本明細書に開示されるものの１つ又はそれ以上であってもよい。
及び／又は動物タンパク質を欠くと考えられる。
[00245]本明細書に記載される細胞培養培地を生産する方法も開示される。細胞培養培
地を生産する方法は、無血清基本培地と細胞培養培地サプリメントを混ぜるステップを含んでもよく、細胞培養培地は任意の動物タンパク質及び／又は動物成分を欠く。細胞培養培地サプリメントは、動物タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む。一部の実施形態では、動物タンパク質は、血清タンパク質である。植物タンパク質相同体は、本明細書に開示されるものの１つ又はそれ以上であってもよい。
【0191】
[00246]例示的な無血清培地が本明細書で提供される。
[00247]一部の実施形態では、方法は、１つ又はそれ以上の追加の成分を添加するステ
ップをさらに含み、前記成分は任意の動物成分を欠くと考えられる。例示的な追加の成分は本明細書に提供される。
[00247]一部の実施形態では、方法は、１つ又はそれ以上の追加の成分を添加するステ
ップをさらに含み、前記成分は任意の動物成分を欠くと考えられる。例示的な追加の成分は本明細書に提供される。
【0192】
[00248]本開示は、本明細書に記載される細胞培養培地と使用のための説明書とを含む
キットをさらに提供する。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ラベルが貼り付けられた容器中にパッケージされるか又はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用のための組成物の使用を記載するパッケージ中に含まれる。例示的な容器としては、限定はされないが、容器、バイアル、チューブ、アンプル、ボトル、フラスコ等が挙げられる。容器は、液体又は凍結形態の培地、例えば血清代替物、培地サプリメント若しくは凍結保存培地パッケージするために適当であることがさらに考えられる。容器は、限定はされないが、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、及び他のプラスチックを含む、当技術分野で周知の材料から作製されることが考えられる。様々な態様では、組成物は、単位剤形でパッケージされる。キットは、場合により、血清代替物、培地サプリメント又は凍結保存培地を基本培地と組み合わせる、あるいは培地を追加の増殖因子と組み合わせるのに好適な装置を含む。様々な態様では、キットは、ラベル及び／又は細胞培養若しくは凍結保存のための培地の使用を記載する説明書を含有する。
キットをさらに提供する。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ラベルが貼り付けられた容器中にパッケージされるか又はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用のための組成物の使用を記載するパッケージ中に含まれる。例示的な容器としては、限定はされないが、容器、バイアル、チューブ、アンプル、ボトル、フラスコ等が挙げられる。容器は、液体又は凍結形態の培地、例えば血清代替物、培地サプリメント若しくは凍結保存培地パッケージするために適当であることがさらに考えられる。容器は、限定はされないが、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、及び他のプラスチックを含む、当技術分野で周知の材料から作製されることが考えられる。様々な態様では、組成物は、単位剤形でパッケージされる。キットは、場合により、血清代替物、培地サプリメント又は凍結保存培地を基本培地と組み合わせる、あるいは培地を追加の増殖因子と組み合わせるのに好適な装置を含む。様々な態様では、キットは、ラベル及び／又は細胞培養若しくは凍結保存のための培地の使用を記載する説明書を含有する。
【0193】
[00249]本明細書に引用した又はそれらの審査中の全ての出願及び全ての文書（「出願
に引用した文書」）並びに出願に引用した文書に引用した若しくは参照した全ての文書、並びに本明細書に引用又は参照した全ての文書（「本明細書に引用した文書」）、並びに本明細書に引用した文書に引用又は参照した全ての文書は、本明細書又は本明細書に参照によって組み込まれる任意の文書に記載される任意の製品のための任意の製造業者の説明書、記載、製品仕様、及び製品シートと共に、参照によって本明細書に組み込まれ、本発明の実施に用いられてもよい。より詳細には、全ての参照した文書は、各個々の文書が参照によって組み込まれることを特に及び個々に示されたように、同程度まで参照によって組み込まれる。
に引用した文書」）並びに出願に引用した文書に引用した若しくは参照した全ての文書、並びに本明細書に引用又は参照した全ての文書（「本明細書に引用した文書」）、並びに本明細書に引用した文書に引用又は参照した全ての文書は、本明細書又は本明細書に参照によって組み込まれる任意の文書に記載される任意の製品のための任意の製造業者の説明書、記載、製品仕様、及び製品シートと共に、参照によって本明細書に組み込まれ、本発明の実施に用いられてもよい。より詳細には、全ての参照した文書は、各個々の文書が参照によって組み込まれることを特に及び個々に示されたように、同程度まで参照によって組み込まれる。
【0194】
[00250]以下の実施例は、例示のために提示され、限定のためではない。
【実施例0195】
実施例１：植物アルブミンの単離及び精製
[00251]植物アルブミンの単離は、当業者に周知であり、液体分画、遠心分離、カラム
交換を含み、その全てが日常的な実験である。この研究では、ジャガイモの２つの種（白及び赤）を購入した。それぞれの種は、ジュースにするか（ジューサー）又はブレンドした（ブレンダー）。ジャガイモアルブミンを抽出し、生の白及び赤ジャガイモの液体画分抽出は、フルーツジューサー又は台所用ブレンダーのいずれかで行った。後に、ジャガイモを刻み、過剰な水と共にブレンダーに加えた。ブレンドした物質は、二層のガーゼを使用して篩い／濾過し、液体画分を得た。試料は、４℃で１０分間、１１０００ｒｐｍでスピンダウンし、不溶性物質を除去した。上清（アルブミン画分）を回収し、ペレットを廃棄した。
[00251]植物アルブミンの単離は、当業者に周知であり、液体分画、遠心分離、カラム
交換を含み、その全てが日常的な実験である。この研究では、ジャガイモの２つの種（白及び赤）を購入した。それぞれの種は、ジュースにするか（ジューサー）又はブレンドした（ブレンダー）。ジャガイモアルブミンを抽出し、生の白及び赤ジャガイモの液体画分抽出は、フルーツジューサー又は台所用ブレンダーのいずれかで行った。後に、ジャガイモを刻み、過剰な水と共にブレンダーに加えた。ブレンドした物質は、二層のガーゼを使用して篩い／濾過し、液体画分を得た。試料は、４℃で１０分間、１１０００ｒｐｍでスピンダウンし、不溶性物質を除去した。上清（アルブミン画分）を回収し、ペレットを廃棄した。
【0196】
[00252]上清試料は、Ｊｉｒｇｅｎｓｏｎｓ（１９４６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏ
ｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１（６）：４８４－４９４）に従ってｐＨ３に調整し、次いで再度スピンダウンして、不溶性タンパク質不純物を除去した。上清は、２０ｍＭ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、ｐＨ８に対して終夜透析した。試料中の過剰な塩を取り除くため、それぞれを緩衝液Ａ（以下参照）に対して透析した。１ ｌｉｔ １時間、次いで１ ｌｉｔ
ＯＮ（低温室、流動しながら（with strearing））。
ｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１（６）：４８４－４９４）に従ってｐＨ３に調整し、次いで再度スピンダウンして、不溶性タンパク質不純物を除去した。上清は、２０ｍＭ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、ｐＨ８に対して終夜透析した。試料中の過剰な塩を取り除くため、それぞれを緩衝液Ａ（以下参照）に対して透析した。１ ｌｉｔ １時間、次いで１ ｌｉｔ
ＯＮ（低温室、流動しながら（with strearing））。
【0197】
[00253]４つの試料を、ｐＩ～５に従って陰イオン交換カラムにロードし、アルブミン
画分を分けた。試料ローディング緩衝液は、２０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ｐＨ８であり、放出緩衝液は、２０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８であった。抽出した画分からの８μｌの試料を、タンパク質純度表示及び解析のために４～２０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし（図３Ｆ）、１％ＢＳＡを対照としてロードした。適切な画分を合わせ、それぞれ数μｇをＭＳ解析にかけ、ＢＳＡ様タンパク質含量を確認した（図３Ａ～３Ｅ）。
画分を分けた。試料ローディング緩衝液は、２０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ｐＨ８であり、放出緩衝液は、２０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８であった。抽出した画分からの８μｌの試料を、タンパク質純度表示及び解析のために４～２０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードし（図３Ｆ）、１％ＢＳＡを対照としてロードした。適切な画分を合わせ、それぞれ数μｇをＭＳ解析にかけ、ＢＳＡ様タンパク質含量を確認した（図３Ａ～３Ｅ）。
【0198】
[00254]５グラムのエンドウタンパク質単離物を、Ｎａｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａ
ｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２０１１，５９，２７５２－２７５８にしたがって、５０ｍｌの１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８中に懸濁した。試料を、３０分間室温でボルテックスし、次いで４℃で１５分間１１０００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた（図４）。
ｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２０１１，５９，２７５２－２７５８にしたがって、５０ｍｌの１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８中に懸濁した。試料を、３０分間室温でボルテックスし、次いで４℃で１５分間１１０００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた（図４）。
【0199】
[00255]５つの植物粉（デュラム、ヒヨコマメ、ヒラマメ、トウモロコシ、イネ）の粉
末及び２つの市販の植物タンパク質単離物（ヘンプ、エンドウ）を液体分画して、ＤＮＡ及びＲＮＡ由来、並びにタンパク質由来の脂質を分離する。タンパク質抽出物の水画分を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。ヒヨコマメ、トウモロコシ、ヘンプ及びエンドウ試料は、事前に報告されたアルブミンタンパク質のサイズに相当するタンパク質のバンドを含有する（図５）。四角で囲ったバンドをゲルから単離し、さらなる同定のためにＭＳ解析に送った。
末及び２つの市販の植物タンパク質単離物（ヘンプ、エンドウ）を液体分画して、ＤＮＡ及びＲＮＡ由来、並びにタンパク質由来の脂質を分離する。タンパク質抽出物の水画分を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。ヒヨコマメ、トウモロコシ、ヘンプ及びエンドウ試料は、事前に報告されたアルブミンタンパク質のサイズに相当するタンパク質のバンドを含有する（図５）。四角で囲ったバンドをゲルから単離し、さらなる同定のためにＭＳ解析に送った。
【0200】
[00256]２つのジャガイモ型（赤又は白）からの４つのジャガイモ抽出物のＭＳ解析の
結果を図６に示す。それぞれは、フルーツジューサー（Ｊ）又は水とのブレンド（Ｂ）のいずれかで液体化し、篩いにかけ、繊維画分を除去した。ＢＳＡを陽性対照として解析した。全てのジャガイモ試料は、著しい量のＢＳＡ様タンパク質を含有することが示された。バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｒｏｓｕｍ）の同定されたタンパク質は、アルブミン（パタチン）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ１ＡＧＸ５，Ｑ２ＭＹＰ６，Ｑ２ＶＢＩ２，Ｑ２ＶＢＪ３，Ａ０Ａ０９７Ｈ１４９）、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパ
ク質（ＰＮＰＬＡ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ１Ｂ３Ｗ０）、及びプロテイナーゼ阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚ－ｔｙｐｅプロテイナーゼ阻害剤群Ａ１）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｈ９Ｂ８Ｉ９）；２０ｋＤａ Ｋｕｎｉｔｚ－ｔｙｐｅプロテイナーゼ阻害剤（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｓ８Ｋ２）を含む。
結果を図６に示す。それぞれは、フルーツジューサー（Ｊ）又は水とのブレンド（Ｂ）のいずれかで液体化し、篩いにかけ、繊維画分を除去した。ＢＳＡを陽性対照として解析した。全てのジャガイモ試料は、著しい量のＢＳＡ様タンパク質を含有することが示された。バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｒｏｓｕｍ）の同定されたタンパク質は、アルブミン（パタチン）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ１ＡＧＸ５，Ｑ２ＭＹＰ６，Ｑ２ＶＢＩ２，Ｑ２ＶＢＪ３，Ａ０Ａ０９７Ｈ１４９）、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパ
ク質（ＰＮＰＬＡ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ１Ｂ３Ｗ０）、及びプロテイナーゼ阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚ－ｔｙｐｅプロテイナーゼ阻害剤群Ａ１）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｈ９Ｂ８Ｉ９）；２０ｋＤａ Ｋｕｎｉｔｚ－ｔｙｐｅプロテイナーゼ阻害剤（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｓ８Ｋ２）を含む。
【0201】
実施例２：無血清培地中での培養細胞の接着
[00257]可溶性植物ＥＣＭ様タンパク質は、血清及び動物由来ＥＣＭタンパク質の非存
在下で培養細胞の接着を支持できるであろうことが仮定された。ヒヨコマメ、ヒラマメ、デュラム及び玄米粉末からのタンパク質抽出は、それらを２４時間室温で震盪しながらＰＢＳ中に懸濁し、１３０００×ｇでスピンダウンし、０．２２μｍのシリンジフィルターを使用して濾過することにより行った。１５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した一次ニワトリ線維芽細胞をトリプシン処理し、上記タンパク質構築物の１：５０又は１：１００希釈を補充した無血清培地で洗浄及び再播種した。接着の程度は、Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎ Ｂ染色（Ｖｉｃｈａｉ ａｎｄ ｋｉｒｔｉｋａｒａ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（３）：１１１２－６）を使用して、８時間後に評価した。結果は、ダイズ、ヒヨコマメ、ヒラマメ、イネ及びコムギ抽出物において細胞接着を実証する（図７）。
[00257]可溶性植物ＥＣＭ様タンパク質は、血清及び動物由来ＥＣＭタンパク質の非存
在下で培養細胞の接着を支持できるであろうことが仮定された。ヒヨコマメ、ヒラマメ、デュラム及び玄米粉末からのタンパク質抽出は、それらを２４時間室温で震盪しながらＰＢＳ中に懸濁し、１３０００×ｇでスピンダウンし、０．２２μｍのシリンジフィルターを使用して濾過することにより行った。１５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した一次ニワトリ線維芽細胞をトリプシン処理し、上記タンパク質構築物の１：５０又は１：１００希釈を補充した無血清培地で洗浄及び再播種した。接着の程度は、Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎ Ｂ染色（Ｖｉｃｈａｉ ａｎｄ ｋｉｒｔｉｋａｒａ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（３）：１１１２－６）を使用して、８時間後に評価した。結果は、ダイズ、ヒヨコマメ、ヒラマメ、イネ及びコムギ抽出物において細胞接着を実証する（図７）。
【0202】
実施例３：完全タンパク質バルクの調製
[00258]ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の代替物として完全タンパク質バルクを調製す
るため、異なる植物源からのタンパク質粉末をまず水又は生理食塩水（ＰＢＳ）と攪拌機で混合した。異なる植物タンパク質源を測定すると、タンパク質の回収％は１０％～１５％の範囲であった。次いで、混合物は、高速でＳｏｒｖａｌを使用して遠心分離し、不溶性画分を除去し、次いでカットオフ値１０キロダルトンのセントリコン、アンプリコン、又はホローファイバーのいずれかを使用して可溶性画分を濾過及び濃縮した（図８）。その後、混合物は＋４℃で保存し、１～２ヶ月の期間で使用した。
[00258]ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の代替物として完全タンパク質バルクを調製す
るため、異なる植物源からのタンパク質粉末をまず水又は生理食塩水（ＰＢＳ）と攪拌機で混合した。異なる植物タンパク質源を測定すると、タンパク質の回収％は１０％～１５％の範囲であった。次いで、混合物は、高速でＳｏｒｖａｌを使用して遠心分離し、不溶性画分を除去し、次いでカットオフ値１０キロダルトンのセントリコン、アンプリコン、又はホローファイバーのいずれかを使用して可溶性画分を濾過及び濃縮した（図８）。その後、混合物は＋４℃で保存し、１～２ヶ月の期間で使用した。
【0203】
実施例４：ダイズタンパク質のＡｌｂｕｓｏｒｂ精製
[00259]ダイズタンパク質（水溶性画分）を精製するため、５０ｍｇのＡｌｂｕＳｏｒ
ｂ（商標）粉末をスピンチューブ／マイクロチューブに入れた。４００μｌの結合緩衝液ＢＢ１をチューブに添加し、ＡｌｂｕＳｏｒｂ（商標）粉末を調整した。３分間手動又はボルテックスのいずれかにより内容物を混合した後、チューブは、次いで３０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清は廃棄した。別の４００μｌのＢＢ１緩衝液を再度チューブに添加し、次いで混合及び遠心分離した。上清は再び廃棄した。
[00259]ダイズタンパク質（水溶性画分）を精製するため、５０ｍｇのＡｌｂｕＳｏｒ
ｂ（商標）粉末をスピンチューブ／マイクロチューブに入れた。４００μｌの結合緩衝液ＢＢ１をチューブに添加し、ＡｌｂｕＳｏｒｂ（商標）粉末を調整した。３分間手動又はボルテックスのいずれかにより内容物を混合した後、チューブは、次いで３０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清は廃棄した。別の４００μｌのＢＢ１緩衝液を再度チューブに添加し、次いで混合及び遠心分離した。上清は再び廃棄した。
【0204】
[00260]アルブミン結合の必要条件として、２５０μｌのＢＢ１緩衝液を添加し、次い
で２５μｌの血清を添加した。次いで、チューブは１０分間回転振盪機に置いた。その後、チューブは、１００００ｒｐｍで４分間遠心分離した。生じる上清は、アルブミンを含まない血清タンパク質を含有する。場合により、ペレット（ほとんどアルブミン）は２００μｌのストリッピング緩衝液（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０）により、１０分間振盪機で混合し１００００ｒｐｍで４分間遠心分離することによって溶出することができる。
で２５μｌの血清を添加した。次いで、チューブは１０分間回転振盪機に置いた。その後、チューブは、１００００ｒｐｍで４分間遠心分離した。生じる上清は、アルブミンを含まない血清タンパク質を含有する。場合により、ペレット（ほとんどアルブミン）は２００μｌのストリッピング緩衝液（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０）により、１０分間振盪機で混合し１００００ｒｐｍで４分間遠心分離することによって溶出することができる。
【0205】
[00261]上清を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。図９は、Ａｌｂｕｓｏｒｂ精製前
後のダイズタンパク質（水溶性画分）を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４～１５％）のタンパク質を観察すると、他のタンパク質がアルブミンと同じ領域に移動し、完全に分解されていない可能性がある。
後のダイズタンパク質（水溶性画分）を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４～１５％）のタンパク質を観察すると、他のタンパク質がアルブミンと同じ領域に移動し、完全に分解されていない可能性がある。
【0206】
[00262]水溶性ダイズタンパク質及びＡｌｂｕｓｏｒｂ精製ダイズタンパク質は、さら
なる同定のためＭＳ解析に送られた。図１０Ａ及び図１０Ｂは、それぞれ、Ａｌｂｕｓｏ
ｒｂ精製前後のダイズ水溶性画分の上位１０個のタンパク質群を示す。
なる同定のためＭＳ解析に送られた。図１０Ａ及び図１０Ｂは、それぞれ、Ａｌｂｕｓｏ
ｒｂ精製前後のダイズ水溶性画分の上位１０個のタンパク質群を示す。
【0207】
実施例５：ヒヨコマメタンパク質のＭＳ解析
[00263]８Ｍ尿素、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）中に溶解した１０μｇのヒヨコマメタンパク質は、室温で３０分間、５５ｍＭヨードアセトアミドによってアルキル化した。試料は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で８倍希釈した。次いで、０．３μｇトリプシン（シークエンスグレード、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから）を試料に添加し、３７℃で終夜、消化を実施した。トリプシンペプチドは、Ｃ１８ Ｓｔａｇｅ ｔｉｐ上で脱塩した（（Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ Ｊ，Ｍａｎｎ Ｍ，Ｉｓｈｉｈａｍａ Ｙ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏ－ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，ｐｒｅ－ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＳｔａｇｅＴｉｐｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（８）：１８９６－９０６）。全部で０．８μｇのペプチド（Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍにより）を解析のため、マススペクトロメトリー（ＭＳ）に注入した（図１１）。
[00263]８Ｍ尿素、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）中に溶解した１０μｇのヒヨコマメタンパク質は、室温で３０分間、５５ｍＭヨードアセトアミドによってアルキル化した。試料は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で８倍希釈した。次いで、０．３μｇトリプシン（シークエンスグレード、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから）を試料に添加し、３７℃で終夜、消化を実施した。トリプシンペプチドは、Ｃ１８ Ｓｔａｇｅ ｔｉｐ上で脱塩した（（Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ Ｊ，Ｍａｎｎ Ｍ，Ｉｓｈｉｈａｍａ Ｙ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏ－ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，ｐｒｅ－ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ＳｔａｇｅＴｉｐｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（８）：１８９６－９０６）。全部で０．８μｇのペプチド（Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍにより）を解析のため、マススペクトロメトリー（ＭＳ）に注入した（図１１）。
【0208】
[00264]ＭＳ解析は、オンラインでナノフローＵＨＰＬＣ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３
０００ Ｄｉｏｎｅｘ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と繋がったＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓマススペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。溶出したペプチドは、逆相２５ｃｍ－ロングＣ１８カラム（７５ｕｍ ＩＤ、２ｕｍ、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）ＲＳＬＣ）に０．２μｌ／分の流速で９０分勾配ランにかけ分離した。サーベイスキャン（３８０～２０００ｍ／ｚ、標的値３Ｅ６チャージ、最大イオン注入時間２００ｍｓ）を獲得し、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）ベース断片化（ノーマライズした衝突エネルギー２５）へと続いた。サーベイスキャンのために解像度７００００を使用して、最大１５個の動力学的に選択した最も豊富な前駆体イオンを断片化した（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ １．６ｍ／ｚ）。ＭＳ／ＭＳスキャンは、解像度３５０００（標的値２Ｅ５チャージ、最大イオン注入時間１２１ｍｓ）で獲得した。ダイナミックエクスクルージョンは１５秒であった。
０００ Ｄｉｏｎｅｘ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と繋がったＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓマススペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。溶出したペプチドは、逆相２５ｃｍ－ロングＣ１８カラム（７５ｕｍ ＩＤ、２ｕｍ、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）ＲＳＬＣ）に０．２μｌ／分の流速で９０分勾配ランにかけ分離した。サーベイスキャン（３８０～２０００ｍ／ｚ、標的値３Ｅ６チャージ、最大イオン注入時間２００ｍｓ）を獲得し、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）ベース断片化（ノーマライズした衝突エネルギー２５）へと続いた。サーベイスキャンのために解像度７００００を使用して、最大１５個の動力学的に選択した最も豊富な前駆体イオンを断片化した（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ １．６ｍ／ｚ）。ＭＳ／ＭＳスキャンは、解像度３５０００（標的値２Ｅ５チャージ、最大イオン注入時間１２１ｍｓ）で獲得した。ダイナミックエクスクルージョンは１５秒であった。
【0209】
[00265]ＭＳデータは、ＭａｘＱｕａｎｔ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｌａｔｆ
ｏｒｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ １．６．６．０（Ｃｏｘ，Ｊ． ＆ Ｍａｎｎ，Ｍ．ＭａｘＱｕａｎｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｒａｔｅｓ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｐ．ｐ．ｂ．－ｒａｎｇｅ ｍａｓｓ ａｃｃｕｒａｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１３６７－１３７２（２００８））を使用して処理した。ピークリストは、５７４９７エントリーを含有するＵｎｉｐｒｏｔのヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）データベースに対して検索した。検索は、固定修飾としてシステインのカルバミドメチル化並びに可変修飾としてメチオニンの酸化及びＮ末端アセチル化を含んだ。最小で７アミノ酸長を有するペプチドを検討し、必要なＦＤＲはペプチド及びタンパク質レベルで１％に設定した。タンパク質同定は、少なくとも２つのユニーク又はｒａｚｏｒペプチドを必要とした。
ｏｒｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ １．６．６．０（Ｃｏｘ，Ｊ． ＆ Ｍａｎｎ，Ｍ．ＭａｘＱｕａｎｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｒａｔｅｓ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｐ．ｐ．ｂ．－ｒａｎｇｅ ｍａｓｓ ａｃｃｕｒａｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１３６７－１３７２（２００８））を使用して処理した。ピークリストは、５７４９７エントリーを含有するＵｎｉｐｒｏｔのヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）データベースに対して検索した。検索は、固定修飾としてシステインのカルバミドメチル化並びに可変修飾としてメチオニンの酸化及びＮ末端アセチル化を含んだ。最小で７アミノ酸長を有するペプチドを検討し、必要なＦＤＲはペプチド及びタンパク質レベルで１％に設定した。タンパク質同定は、少なくとも２つのユニーク又はｒａｚｏｒペプチドを必要とした。
【0210】
実施例６：ウシ血清アルブミンを置き換える植物タンパク質
[00266]異なる植物水溶性画分タンパク質の効果は、ＢＳＡが枯渇した特別な無血清サ
プリメントを使用してニワトリ線維芽細胞で試験した。懸濁培養に適応させたニワトリ線維芽細胞は、フラスコの全容積２０ｍｌ中に３０万個／ｍｌで播種した。細胞培養フラスコは、１００ｒｐｍ、３９℃、及び５％ ＣＯ２で、震盪インキュベーター中に維持した。３日目に、各フラスコからの１ｍｌの試料は、ＡＰＯＩを使用する自動細胞計数器（Ｃ
ｅｌｌａｃａ）を使用して計数し、死細胞から生細胞を決定した。生細胞数は図１２に示す。０．１ｍｇ／ｍｌが、動物タンパク質（ＢＳＡ）を置き換えるのに十分であったことが示された。しかしながら、ヘンプ及びコムギタンパク質は、この濃度ではニワトリ線維芽細胞の増殖を支持しなかった。
[00266]異なる植物水溶性画分タンパク質の効果は、ＢＳＡが枯渇した特別な無血清サ
プリメントを使用してニワトリ線維芽細胞で試験した。懸濁培養に適応させたニワトリ線維芽細胞は、フラスコの全容積２０ｍｌ中に３０万個／ｍｌで播種した。細胞培養フラスコは、１００ｒｐｍ、３９℃、及び５％ ＣＯ２で、震盪インキュベーター中に維持した。３日目に、各フラスコからの１ｍｌの試料は、ＡＰＯＩを使用する自動細胞計数器（Ｃ
ｅｌｌａｃａ）を使用して計数し、死細胞から生細胞を決定した。生細胞数は図１２に示す。０．１ｍｇ／ｍｌが、動物タンパク質（ＢＳＡ）を置き換えるのに十分であったことが示された。しかしながら、ヘンプ及びコムギタンパク質は、この濃度ではニワトリ線維芽細胞の増殖を支持しなかった。
【0211】
実施例７：植物タンパク質及び用量依存的効果
[00267]ヒヨコマメタンパク質と有機エンドウタンパク質の両方の勾配濃度は、懸濁培
養中のニワトリ線維芽細胞で試験し、無血清培地中の動物タンパク質（ＢＳＡ）を置き換えた。懸濁培養に適応させたニワトリ線維芽細胞は、フラスコの全容積２０ｍｌ中に３０万個／ｍｌで播種した。細胞培養フラスコは、１００ｒｐｍ、３９℃、及び５％ ＣＯ２で、震盪インキュベーター中に維持した。図１３に示すように、異なる範囲のタンパク質濃度は、ほとんどＢＳＡと同様に、又はＢＳＡよりよく作用する。細胞計数は、本発明者らの計数から死細胞を除くためにＡＰＯＩ染色を使用する自動細胞計数器（Ｃｅｌｌａｃａ）を使用して３日目に行った。
[00267]ヒヨコマメタンパク質と有機エンドウタンパク質の両方の勾配濃度は、懸濁培
養中のニワトリ線維芽細胞で試験し、無血清培地中の動物タンパク質（ＢＳＡ）を置き換えた。懸濁培養に適応させたニワトリ線維芽細胞は、フラスコの全容積２０ｍｌ中に３０万個／ｍｌで播種した。細胞培養フラスコは、１００ｒｐｍ、３９℃、及び５％ ＣＯ２で、震盪インキュベーター中に維持した。図１３に示すように、異なる範囲のタンパク質濃度は、ほとんどＢＳＡと同様に、又はＢＳＡよりよく作用する。細胞計数は、本発明者らの計数から死細胞を除くためにＡＰＯＩ染色を使用する自動細胞計数器（Ｃｅｌｌａｃａ）を使用して３日目に行った。
【0212】
[00268]ヒヨコマメ又はダイズタンパク質（データは示さない）の濃度の増加は、用量
依存的な毒性を生じる（図１４）。セントリコンを使用するタンパク質混合物からの＜１０キロダルトンの画分の欠失は、この毒性を著しく取り除く。懸濁培養に適応させたニワトリ線維芽細胞は、フラスコの全容積２０ｍｌ中に３０万個／ｍｌで播種した。細胞培養フラスコは、１００ｒｐｍ、３９℃、及び５％ ＣＯ２で、震盪インキュベーター中に維持した。５日目に、各フラスコからの１ｍｌの試料は、死細胞から生細胞を決定するためにＡＯＰＩを使用する自動細胞計数器（Ｃｅｌｌａｃａ）を使用して計数した。生細胞数は図１４に示す。
依存的な毒性を生じる（図１４）。セントリコンを使用するタンパク質混合物からの＜１０キロダルトンの画分の欠失は、この毒性を著しく取り除く。懸濁培養に適応させたニワトリ線維芽細胞は、フラスコの全容積２０ｍｌ中に３０万個／ｍｌで播種した。細胞培養フラスコは、１００ｒｐｍ、３９℃、及び５％ ＣＯ２で、震盪インキュベーター中に維持した。５日目に、各フラスコからの１ｍｌの試料は、死細胞から生細胞を決定するためにＡＯＰＩを使用する自動細胞計数器（Ｃｅｌｌａｃａ）を使用して計数した。生細胞数は図１４に示す。
【0213】
[00269]勾配濃度のヒヨコマメは、カットオフ値１０キロダルトンのホローファイバー
で３回洗浄した。５ｍｇ／ｍｌのヒヨコマメは、ニワトリ細胞に毒性を示さなかった（図１５）。懸濁培養に適応させたニワトリ線維芽細胞は、フラスコの全容積２０ｍｌ中に３０万個／ｍｌで播種した。細胞培養フラスコは、１００ｒｐｍ、３９℃、及び５％ ＣＯ２で、震盪インキュベーター中に維持した。３日目～６日目に、各フラスコからの１ｍｌの試料は、死細胞から生細胞を決定するためにＡＯＰＩを使用する自動細胞計数器（Ｃｅｌｌａｃａ）を使用して計数した。生細胞数は図１５に示す。
で３回洗浄した。５ｍｇ／ｍｌのヒヨコマメは、ニワトリ細胞に毒性を示さなかった（図１５）。懸濁培養に適応させたニワトリ線維芽細胞は、フラスコの全容積２０ｍｌ中に３０万個／ｍｌで播種した。細胞培養フラスコは、１００ｒｐｍ、３９℃、及び５％ ＣＯ２で、震盪インキュベーター中に維持した。３日目～６日目に、各フラスコからの１ｍｌの試料は、死細胞から生細胞を決定するためにＡＯＰＩを使用する自動細胞計数器（Ｃｅｌｌａｃａ）を使用して計数した。生細胞数は図１５に示す。
【0214】
[00270]本発明及びその利点を詳細に記載したが、添付の請求項に規定した本発明の精
神及び範囲を逸脱することなく、様々な変更、置換及び改変が本明細書で行われ得ることは理解されるはずである。
神及び範囲を逸脱することなく、様々な変更、置換及び改変が本明細書で行われ得ることは理解されるはずである。
【0215】
[00271]当業者は、本発明が、目的を実行する、並びに記載した並びにそれらに固有の
目的及び利点を得るために十分に適応されることを容易に理解するであろう。本明細書に記載の方法に沿った本実施例は、現在、好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲の限定として意図されない。その変更及び他の使用は、当業者に想起され、それらは請求項の範囲によって規定されたように、本発明の範囲内に包含される。
目的及び利点を得るために十分に適応されることを容易に理解するであろう。本明細書に記載の方法に沿った本実施例は、現在、好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲の限定として意図されない。その変更及び他の使用は、当業者に想起され、それらは請求項の範囲によって規定されたように、本発明の範囲内に包含される。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-11-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血清タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む細胞培養培地サプリメント。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0215】
[00271]当業者は、本発明が、目的を実行する、並びに記載した並びにそれらに固有の目的及び利点を得るために十分に適応されることを容易に理解するであろう。本明細書に記載の方法に沿った本実施例は、現在、好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲の限定として意図されない。その変更及び他の使用は、当業者に想起され、それらは請求項の範囲によって規定されたように、本発明の範囲内に包含される。
発明の態様
［態様１］血清タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む細胞培養培地サプリメント。
［態様２］前記サプリメントが、任意の血清タンパク質を欠く、態様１に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３］前記サプリメントが、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、態様１又は２に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様４］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物タンパク質単離物の水溶性画分を含む、態様１～３のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様５］前記水溶性画分が、植物アルブミン及びグロブリンを含む、態様４に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様６］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、血清アルブミン、血清カタラーゼ、血清スーパーオキシドジスムターゼ、血清トランスフェリン、血清フィブロネクチン、血清ビトロネクチン、血清インシュリン、血清ヘモグロビン、血清アルドラーゼ、血清リパーゼ、血清トランスアミナーゼ、血清アミノトランスフェラーゼ、血清フェチュイン、又はこれらの組合せの相同体である、態様１～３のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様７］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物アルブミン、植物カタラーゼ、植物スーパーオキシドジスムターゼ、植物トランスフェリン、植物フィブロネクチン、植物ビトロネクチン、植物インシュリン、植物レグヘモグロビン、植物アルドラーゼ、植物リパーゼ、植物トランスアミナーゼ、植物アミノトランスフェラーゼ、植物シスタチン、又はこれらの組合せである、態様６に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様８］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物アルブミン、植物カタラーゼ、植物フィブロネクチン、及び植物インシュリンを含む、態様７に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様９］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物アルブミンである、態様７に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１０］前記植物アルブミンが、ヒヨコマメアルブミン、ヘンプシードアルブミン、ヒラマメアルブミン、エンドウアルブミン、ダイズアルブミン、コムギアルブミン又はジャガイモアルブミンである、態様８又は９に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１１］前記植物アルブミンが、エンドウアルブミン又はジャガイモアルブミンである、態様１０に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１２］前記植物アルブミンが、植物タンパク質単離物の水溶性画分由来である、態様９に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１３］前記植物アルブミンが、約１３～１１０キロダルトンの分子量を有する、態様７～１２のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１４］前記植物アルブミンが、約１３～１７キロダルトンの分子量を有する、態様１３に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１５］前記植物アルブミンが、約２０～３５キロダルトンの分子量を有する、態様１３に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１６］前記植物アルブミンが、約５０～１１０キロダルトンの分子量を有する、態様１３に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１７］前記植物アルブミンが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物アルブミンが前記細胞培養培地中約０．０１重量％～約１０重量％の最終濃度を有する濃度で、前記細胞培養培地サプリメント中に存在する、態様７～１６のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１８］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物カタラーゼである、態様７に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１９］前記植物カタラーゼが、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）カタラーゼ、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ、綿カタラーゼ、ジャガイモカタラーゼ、カボチャカタラーゼ、ホウレンソウカタラーゼ、ヒマワリカタラーゼ、タバコカタラーゼ又はトマトカタラーゼである、態様８又は１８に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２０］前記植物カタラーゼが、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ又はジャガイモカタラーゼである、態様１９に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２１］前記植物カタラーゼが、約５０～７０キロダルトンの分子量を有する、態様１８～２０のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２２］前記植物カタラーゼが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物カタラーゼが前記細胞培養培地中約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、前記細胞培養培地サプリメント中に存在する、態様１８～２１のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２３］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物フィブロネクチンである、態様７に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２４］前記植物フィブロネクチンが、マメフィブロネクチン、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン、タバコフィブロネクチン又はコムギフィブロネクチンである、態様８又は２３に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２５］前記植物フィブロネクチンが、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン又はコムギフィブロネクチンである、態様２４に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２６］前記植物フィブロネクチンが、約４０～６０キロダルトンの分子量を有する、態様２３～２５のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２７］前記植物フィブロネクチンが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物フィブロネクチンが前記細胞培養培地中約０．１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、前記細胞培養培地サプリメント中に存在する、態様２３～２６のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２８］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物インシュリンである、態様７に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２９］前記植物インシュリンが、グルコキニン、チャランチン、又はコロソリン酸である、態様８又は２８に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３０］前記植物インシュリンが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物インシュリンが前記細胞培養培地中約０．０５μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、細胞培養培地サプリメント中に存在する、態様２８又は２９に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３１］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物抽出物画分の形態又は純粋形態である、態様１～３０のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３２］無血清培地及び態様１～３１のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメントを含む細胞培養培地であって、前記無血清培地は、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、細胞培養培地。
［態様３３］前記無血清培地が、基本生理的緩衝液である、態様３２に記載の細胞培養培地。
［態様３４］態様１～３１のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメントと、任意の動物血清由来成分を欠く無血清培地と前記細胞培養培地サプリメントを混合するための説明書とを含むキット。
［態様３５］培養肉を生産する方法であって、態様３２又は３３に記載の細胞培養培地中で細胞を培養するステップ、及び培養細胞から肉を生産するステップを含む方法。
［態様３６］前記細胞が食用動物由来である、態様３５に記載の方法。
［態様３７］前記食用動物が、家畜、狩猟動物、家禽、魚、又は甲殻類である、態様３６に記載の方法。
［態様３８］前記細胞が、繊維芽細胞である、態様３５～３７のいずれかに記載の方法。
［態様３９］前記線維芽細胞が、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である、態様３８に記載の方法。
［態様４０］態様３５～３９のいずれかに記載の方法によって生産される培養肉。
［態様４１］任意の動物タンパク質及び／又は成分を欠く細胞培養培地を生産する方法であって、無血清基本培地と態様１～３１のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメントとを混合するステップを含み、前記無血清基本培地及び細胞培養培地サプリメントは、それぞれ任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、方法。
［態様４２］態様４１に記載の方法によって生産される細胞培養培地。
［態様４３］細胞培養培地サプリメント中の動物タンパク質の代わりの、動物タンパク質の植物タンパク質相同体の使用。
［態様４４］前記動物タンパク質が血清タンパク質である、態様４３に記載の使用。
［態様４５］前記サプリメントが、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、態様４３又は４４に記載の使用。
発明の態様
［態様１］血清タンパク質の少なくとも１つの植物タンパク質相同体を含む細胞培養培地サプリメント。
［態様２］前記サプリメントが、任意の血清タンパク質を欠く、態様１に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３］前記サプリメントが、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、態様１又は２に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様４］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物タンパク質単離物の水溶性画分を含む、態様１～３のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様５］前記水溶性画分が、植物アルブミン及びグロブリンを含む、態様４に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様６］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、血清アルブミン、血清カタラーゼ、血清スーパーオキシドジスムターゼ、血清トランスフェリン、血清フィブロネクチン、血清ビトロネクチン、血清インシュリン、血清ヘモグロビン、血清アルドラーゼ、血清リパーゼ、血清トランスアミナーゼ、血清アミノトランスフェラーゼ、血清フェチュイン、又はこれらの組合せの相同体である、態様１～３のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様７］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物アルブミン、植物カタラーゼ、植物スーパーオキシドジスムターゼ、植物トランスフェリン、植物フィブロネクチン、植物ビトロネクチン、植物インシュリン、植物レグヘモグロビン、植物アルドラーゼ、植物リパーゼ、植物トランスアミナーゼ、植物アミノトランスフェラーゼ、植物シスタチン、又はこれらの組合せである、態様６に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様８］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物アルブミン、植物カタラーゼ、植物フィブロネクチン、及び植物インシュリンを含む、態様７に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様９］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物アルブミンである、態様７に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１０］前記植物アルブミンが、ヒヨコマメアルブミン、ヘンプシードアルブミン、ヒラマメアルブミン、エンドウアルブミン、ダイズアルブミン、コムギアルブミン又はジャガイモアルブミンである、態様８又は９に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１１］前記植物アルブミンが、エンドウアルブミン又はジャガイモアルブミンである、態様１０に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１２］前記植物アルブミンが、植物タンパク質単離物の水溶性画分由来である、態様９に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１３］前記植物アルブミンが、約１３～１１０キロダルトンの分子量を有する、態様７～１２のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１４］前記植物アルブミンが、約１３～１７キロダルトンの分子量を有する、態様１３に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１５］前記植物アルブミンが、約２０～３５キロダルトンの分子量を有する、態様１３に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１６］前記植物アルブミンが、約５０～１１０キロダルトンの分子量を有する、態様１３に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１７］前記植物アルブミンが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物アルブミンが前記細胞培養培地中約０．０１重量％～約１０重量％の最終濃度を有する濃度で、前記細胞培養培地サプリメント中に存在する、態様７～１６のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１８］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物カタラーゼである、態様７に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様１９］前記植物カタラーゼが、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）カタラーゼ、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ、綿カタラーゼ、ジャガイモカタラーゼ、カボチャカタラーゼ、ホウレンソウカタラーゼ、ヒマワリカタラーゼ、タバコカタラーゼ又はトマトカタラーゼである、態様８又は１８に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２０］前記植物カタラーゼが、キャベツカタラーゼ、キュウリカタラーゼ又はジャガイモカタラーゼである、態様１９に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２１］前記植物カタラーゼが、約５０～７０キロダルトンの分子量を有する、態様１８～２０のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２２］前記植物カタラーゼが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物カタラーゼが前記細胞培養培地中約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、前記細胞培養培地サプリメント中に存在する、態様１８～２１のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２３］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物フィブロネクチンである、態様７に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２４］前記植物フィブロネクチンが、マメフィブロネクチン、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン、タバコフィブロネクチン又はコムギフィブロネクチンである、態様８又は２３に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２５］前記植物フィブロネクチンが、ヒヨコマメフィブロネクチン、ヒラマメフィブロネクチン、イネフィブロネクチン、ダイズフィブロネクチン又はコムギフィブロネクチンである、態様２４に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２６］前記植物フィブロネクチンが、約４０～６０キロダルトンの分子量を有する、態様２３～２５のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２７］前記植物フィブロネクチンが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物フィブロネクチンが前記細胞培養培地中約０．１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、前記細胞培養培地サプリメント中に存在する、態様２３～２６のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２８］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物インシュリンである、態様７に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２９］前記植物インシュリンが、グルコキニン、チャランチン、又はコロソリン酸である、態様８又は２８に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３０］前記植物インシュリンが、前記細胞培養培地サプリメントが細胞培養培地に添加されると前記植物インシュリンが前記細胞培養培地中約０．０５μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの最終濃度を有する濃度で、細胞培養培地サプリメント中に存在する、態様２８又は２９に記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３１］前記少なくとも１つの植物タンパク質相同体が、植物抽出物画分の形態又は純粋形態である、態様１～３０のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３２］無血清培地及び態様１～３１のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメントを含む細胞培養培地であって、前記無血清培地は、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、細胞培養培地。
［態様３３］前記無血清培地が、基本生理的緩衝液である、態様３２に記載の細胞培養培地。
［態様３４］態様１～３１のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメントと、任意の動物血清由来成分を欠く無血清培地と前記細胞培養培地サプリメントを混合するための説明書とを含むキット。
［態様３５］培養肉を生産する方法であって、態様３２又は３３に記載の細胞培養培地中で細胞を培養するステップ、及び培養細胞から肉を生産するステップを含む方法。
［態様３６］前記細胞が食用動物由来である、態様３５に記載の方法。
［態様３７］前記食用動物が、家畜、狩猟動物、家禽、魚、又は甲殻類である、態様３６に記載の方法。
［態様３８］前記細胞が、繊維芽細胞である、態様３５～３７のいずれかに記載の方法。
［態様３９］前記線維芽細胞が、ウシ線維芽細胞又はニワトリ線維芽細胞である、態様３８に記載の方法。
［態様４０］態様３５～３９のいずれかに記載の方法によって生産される培養肉。
［態様４１］任意の動物タンパク質及び／又は成分を欠く細胞培養培地を生産する方法であって、無血清基本培地と態様１～３１のいずれかに記載の細胞培養培地サプリメントとを混合するステップを含み、前記無血清基本培地及び細胞培養培地サプリメントは、それぞれ任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、方法。
［態様４２］態様４１に記載の方法によって生産される細胞培養培地。
［態様４３］細胞培養培地サプリメント中の動物タンパク質の代わりの、動物タンパク質の植物タンパク質相同体の使用。
［態様４４］前記動物タンパク質が血清タンパク質である、態様４３に記載の使用。
［態様４５］前記サプリメントが、任意の動物血清由来成分を本質的に欠く、態様４３又は４４に記載の使用。