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特開2025-2112抗ウイルス評価用組成物、抗ウイルス評価用インジケーター、抗ウイルス評価方法及び洗浄条件の探索方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025002112
(43)【公開日】2025-01-09
(54)【発明の名称】抗ウイルス評価用組成物、抗ウイルス評価用インジケーター、抗ウイルス評価方法及び洗浄条件の探索方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20241226BHJP
A61B 90/70 20160101ALI20241226BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241226BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20241226BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20241226BHJP
C12Q 1/22 20060101ALI20241226BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70
A61B90/70
G01N33/569 G
C12N7/00
C12M1/34 B
C12Q1/22
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023102045
(22)【出願日】2023-06-21
(71)【出願人】
【識別番号】591040557
【氏名又は名称】太平化学産業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】倉本 恭行
(72)【発明者】
【氏名】島田 太一
(72)【発明者】
【氏名】山内 朝夫
(72)【発明者】
【氏名】渡辺 嘉
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029BB13
4B029CC02
4B029CC03
4B029CC08
4B029FA05
4B063QA05
4B063QA06
4B063QQ03
4B063QQ10
4B063QQ17
4B063QR72
4B063QR79
4B063QR82
4B063QS39
4B063QX01
4B065AA96X
4B065AA98X
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】安全かつ短期間でＨＢＶそのものの除去性を評価できる方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む抗ウイルス評価用組成物である。前記生体由来の夾雑物は、血清タンパク質を含むことが好ましい。また、本発明は上記抗ウイルス評価用組成物を基材表面に有する抗ウイルス評価用インジケーターも含み、この抗ウイルス評価用インジケーターを、体液で汚染された医療用具とともに洗浄し、洗浄後の前記抗ウイルス評価用インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記エンベロープ型バクテリオファージ量を測定することで、前記医療用具の抗ウイルス評価を行う医療用具の抗ウイルス評価方法もまた本発明に含まれる。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む抗ウイルス評価用組成物である。前記生体由来の夾雑物は、血清タンパク質を含むことが好ましい。また、本発明は上記抗ウイルス評価用組成物を基材表面に有する抗ウイルス評価用インジケーターも含み、この抗ウイルス評価用インジケーターを、体液で汚染された医療用具とともに洗浄し、洗浄後の前記抗ウイルス評価用インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記エンベロープ型バクテリオファージ量を測定することで、前記医療用具の抗ウイルス評価を行う医療用具の抗ウイルス評価方法もまた本発明に含まれる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む抗ウイルス評価用組成物。
【請求項2】
前記生体由来の夾雑物は、血清タンパク質を含む請求項１に記載の抗ウイルス評価用組成物。
【請求項3】
請求項１または２に記載の抗ウイルス評価用組成物を基材表面に有する抗ウイルス評価用インジケーター。
【請求項4】
請求項３に記載の抗ウイルス評価用インジケーターを、体液で汚染された医療用具とともに洗浄し、洗浄後の前記抗ウイルス評価用インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記エンベロープ型バクテリオファージ量を測定することで、前記医療用具の抗ウイルス評価を行う医療用具の抗ウイルス評価方法。
【請求項5】
請求項３に記載の抗ウイルス評価用インジケーターを洗浄し、洗浄後の前記抗ウイルス評価用インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記エンベロープ型バクテリオファージ量を測定する工程を、洗浄条件を変えて繰り返す、洗浄条件の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗ウイルス評価用組成物、抗ウイルス評価用インジケーター、抗ウイルス評価方法及び洗浄条件の探索方法に関する。
【背景技術】
【0002】
医療機関で用いられる医療用具には、血液などの体液や、組織片等の生体由来の汚れが付着する可能性がある。ウイルスや細菌等の感染を防ぐため、使用後の医療用具は洗浄してから再使用され、再使用にあたっては洗浄の度合いを確認する必要がある。
【0003】
例えば、特許文献１には、シート基材の表面に、疑似汚染物としての植物性蛋白質を含む塗膜が形成されてなる医療器材洗浄評価用インジケーターが開示されている。特許文献１では、シート基材表面の塗膜に含まれる疑似汚染物である植物性蛋白質が、洗浄によってどの程度除去されているかを評価し、これにより洗浄に関する多くのパラメーターが洗浄装置に正常に反映されているかを判断している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２００９－０３９１９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
生体由来の汚れに含まれるウイルスの中でも、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）は、感染リスクが極めて高いことが知られており、ＨＢＶを含む生体由来の汚れが付着したものが、医療行為に起因して、または傷を介するなどして感染する恐れがある。外科的処置や歯科処置などの観血処置が多い場面では、患者の血液や飛沫で医療用具または医療機器類が汚染される可能性が高く、また医療現場のみならず、食品工場、介護施設、公共施設（トイレなど）などでもＨＢＶ感染リスクを評価できることが望ましい。洗浄評価を行う汚染モデルやインジケーターはいくつか提案されているが、上記特許文献１で示されるようにタンパク質などの擬似汚染物の除去性をもって洗浄の評価を行っており、ウイルスそのものの除去性は評価されていない。
【0006】
また、ＨＢＶを用いて抗ウイルス評価を行った例もいくつか報告されているが、評価時の感染リスクを抑えるため特別な設備が必要であるとともに、評価期間も長期に亘るという欠点がある。
【0007】
そこで、本発明は、安全かつ短期間でＨＢＶそのものの除去性を評価できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を達成した本発明は以下の通りである。
［１］エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む抗ウイルス評価用組成物。
［２］前記生体由来の夾雑物は、血清タンパク質を含む［１］に記載の抗ウイルス評価用組成物。
［３］［１］または［２］に記載の抗ウイルス評価用組成物を基材表面に有する抗ウイルス評価用インジケーター。
［４］［３］に記載の抗ウイルス評価用インジケーターを、体液で汚染された医療用具とともに洗浄し、洗浄後の前記抗ウイルス評価用インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記エンベロープ型バクテリオファージ量を測定することで、前記医療用具の抗ウイルス評価を行う医療用具の抗ウイルス評価方法。
［５］［３］に記載の抗ウイルス評価用インジケーターを洗浄し、洗浄後の前記抗ウイルス評価用インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記エンベロープ型バクテリオファージ量を測定する工程を、洗浄条件を変えて繰り返す、洗浄条件の探索方法。
［１］エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む抗ウイルス評価用組成物。
［２］前記生体由来の夾雑物は、血清タンパク質を含む［１］に記載の抗ウイルス評価用組成物。
［３］［１］または［２］に記載の抗ウイルス評価用組成物を基材表面に有する抗ウイルス評価用インジケーター。
［４］［３］に記載の抗ウイルス評価用インジケーターを、体液で汚染された医療用具とともに洗浄し、洗浄後の前記抗ウイルス評価用インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記エンベロープ型バクテリオファージ量を測定することで、前記医療用具の抗ウイルス評価を行う医療用具の抗ウイルス評価方法。
［５］［３］に記載の抗ウイルス評価用インジケーターを洗浄し、洗浄後の前記抗ウイルス評価用インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記エンベロープ型バクテリオファージ量を測定する工程を、洗浄条件を変えて繰り返す、洗浄条件の探索方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、バクテリオファージを用いているため、ＨＢＶに感染するリスクを排除して、かつ短期間でＨＢＶの除去性を代替評価することができる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明者らが検討した結果、ＨＢＶと同じ膜形質でありながら、ヒトに対する病原性が低いバクテリオファージと、生体由来の夾雑物を含む組成物が、ＨＢＶの除去性の代替評価に用いることができることを見出して本発明を完成した。
【0011】
（１）バクテリオファージ
本発明では、ＨＢＶの洗浄による除去評価の代替として、エンベロープ型バクテリオファージを用いる。バクテリオファージは、細菌に感染するウイルスであり、また限定的な細菌にしか感染しないため、ヒトに対する病原性が低いウイルスである。ＨＢＶは、エンベロープを有するウイルスであるため、同様の構造を有するエンベロープ型バクテリオファージを用いることで、ヒトへの安全性を確保しつつ、ＨＢＶが洗浄によりどの程度除去できるか（以下、抗ウイルス効果と呼ぶ場合がある）を代替して評価できる。バクテリオファージとしては、φ６ファージを用いることがより好ましい。
本発明では、ＨＢＶの洗浄による除去評価の代替として、エンベロープ型バクテリオファージを用いる。バクテリオファージは、細菌に感染するウイルスであり、また限定的な細菌にしか感染しないため、ヒトに対する病原性が低いウイルスである。ＨＢＶは、エンベロープを有するウイルスであるため、同様の構造を有するエンベロープ型バクテリオファージを用いることで、ヒトへの安全性を確保しつつ、ＨＢＶが洗浄によりどの程度除去できるか（以下、抗ウイルス効果と呼ぶ場合がある）を代替して評価できる。バクテリオファージとしては、φ６ファージを用いることがより好ましい。
【0012】
（２）生体由来の夾雑物
医療用具等にＨＢＶが付着する際、通常はＨＢＶと共に生体由来の夾雑物が存在している。従って、エンベロープ型バクテリオファージと共に生体由来の夾雑物を用いることで、医療用具等におけるＨＢＶの実際の存在状態を忠実に模擬でき、ＨＢＶ除去性の代替評価ができる。
医療用具等にＨＢＶが付着する際、通常はＨＢＶと共に生体由来の夾雑物が存在している。従って、エンベロープ型バクテリオファージと共に生体由来の夾雑物を用いることで、医療用具等におけるＨＢＶの実際の存在状態を忠実に模擬でき、ＨＢＶ除去性の代替評価ができる。
【0013】
生体由来の夾雑物（以下、単に夾雑物と呼ぶ場合がある）とは、例えば血液由来の夾雑物であることが好ましく、血清タンパク質を含む夾雑物であることがより好ましく、アルブミンを含む夾雑物であることが更に好ましい。生体由来の夾雑物として、具体的には、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）、ヒツジ全血液などを用いることができる。生体由来の夾雑物は、例えばウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、マウスなどの動物から常法により適宜入手することができるが、市販品を用いることもできる。
【0014】
（３）抗ウイルス評価用組成物
抗ウイルス評価用組成物は、上記したエンベロープ型バクテリオファージと、夾雑物を含む。後述の実施例で示す通り、同一の洗浄剤を同一の希釈倍率で用いて、本発明の抗ウイルス評価用組成物と、実際のＨＢＶを含む血清を、それぞれ混合して、混合前後のバクテリオファージ量を比較した抗バクテリオファージ活性値及び混合前後のＨＢＶ量を比較した抗ＨＢＶ活性値を求め、抗バクテリオファージ活性値及び抗ＨＢＶ活性値が２．０以上を抗ウイルス効果があると評価し、２．０未満を抗ウイルス効果が不十分であると評価するとき、両者の抗ウイルス評価はよく一致している。したがって、本発明の抗ウイルス評価用組成物は、ＨＢＶの抗ウイルス評価に好適に用いることができる。
抗ウイルス評価用組成物は、上記したエンベロープ型バクテリオファージと、夾雑物を含む。後述の実施例で示す通り、同一の洗浄剤を同一の希釈倍率で用いて、本発明の抗ウイルス評価用組成物と、実際のＨＢＶを含む血清を、それぞれ混合して、混合前後のバクテリオファージ量を比較した抗バクテリオファージ活性値及び混合前後のＨＢＶ量を比較した抗ＨＢＶ活性値を求め、抗バクテリオファージ活性値及び抗ＨＢＶ活性値が２．０以上を抗ウイルス効果があると評価し、２．０未満を抗ウイルス効果が不十分であると評価するとき、両者の抗ウイルス評価はよく一致している。したがって、本発明の抗ウイルス評価用組成物は、ＨＢＶの抗ウイルス評価に好適に用いることができる。
【0015】
抗ウイルス評価用組成物は、通常、水などの液体を含んでいる。抗ウイルス評価用組成物中の、エンベロープ型バクテリオファージの濃度は、１０5～１０９ＰＦＵ／ｍＬであることが好ましく、１０7～１０９ＰＦＵ／ｍＬであることがより好ましい。抗ウイルス評価用組成物が水を含む場合、組成物１００質量％中の水の量は、例えば０．０１体積／体積％以上、９９．９９体積／体積％以下である。
【0016】
夾雑物は、１種のみが含まれていてもよいし、２種以上が含まれていてもよい。夾雑物は好ましい態様において血清タンパク質を含んでおり、そのような場合のタンパク質量は、抗ウイルス評価用組成物全体の容量に対して、１０～１３０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、４０～１２０ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【0017】
夾雑物が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である場合には、抗ウイルス評価用組成物全体の容量に対して、２０～８０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。夾雑物が、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である場合には、抗ウイルス評価用組成物全体の容量に対して、０．６～０．９ｍＬ／ｍＬであることが好ましく、タンパク質量で２０～７０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。更に、夾雑物がヒツジ全血液である場合には、抗ウイルス評価用組成物全体の容量に対して、０．２～０．９ｍＬ／ｍＬであることが好ましく、タンパク質量で１０～１３０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、４０～１２０ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【0018】
抗ウイルス評価用組成物は、エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を、混合することにより得られ、必要に応じて水も混合することが好ましい。エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物は、これらを含む水性の液（水溶液または水懸濁液）をそれぞれ用意してから混合してもよい。また、抗ウイルス評価用組成物には他の成分が含まれていてもよく、特に市販の夾雑物を用いる場合、本発明の組成物は、塩化ナトリウム、アジ化ナトリウム、グリシンなどが含まれていてもよいし、ヘパリン酸ナトリウムなどの抗凝固剤が含まれた血液を用いる場合などには、硫酸プロタミン、プロタミン塩酸塩などの抗凝固剤の拮抗剤が含まれていてもよい。これら他の成分、すなわちエンベロープ型バクテリオファージ、生体由来の夾雑物及び水以外の成分は、組成物中、合計で１質量／体積％以下であることが好ましく、０．５質量／体積％以下であることがより好ましい。
【0019】
抗ウイルス評価用組成物は、後述するように基材に塗布し固化させてインジケーターを作製して、評価対象物とともに、洗浄装置に投入して抗ウイルス評価を行う態様で用いることができる他、洗浄装置によらない洗浄を行う場合にも使用可能である。すなわち洗浄剤を、体液で汚染された洗浄対象箇所にスプレー、かけ流し、ロールなどにより塗布する工程、水洗及び／又は拭き取りする工程を含む洗浄操作において、前記洗浄対象箇所とは異なる場所に本発明の組成物を塗布し固化させ、本発明の組成物固化物に同様の洗浄操作を行った後、本発明の組成物固化物の洗浄箇所をこすり取って培養して評価するという使い方も可能である。
【0020】
（４）抗ウイルス評価用インジケーター
抗ウイルス評価用インジケーターは、上記したエンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む抗ウイルス評価用組成物を基材表面に有する。具体的には、エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む液を基材に塗布し、固化させることで抗ウイルス評価用インジケーターを作製することができる。固化は、通常、前記液を塗布した基材を乾燥させることで行われ、室温で１～２４時間程度静置すればよい。エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む組成物（好ましくは水を含む液組成物）の塗布量は、基材１ｃｍ２あたり、例えば容量で１～２７μＬであることが好ましく、質量で１～２７ｍｇであることが好ましい。
抗ウイルス評価用インジケーターは、上記したエンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む抗ウイルス評価用組成物を基材表面に有する。具体的には、エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む液を基材に塗布し、固化させることで抗ウイルス評価用インジケーターを作製することができる。固化は、通常、前記液を塗布した基材を乾燥させることで行われ、室温で１～２４時間程度静置すればよい。エンベロープ型バクテリオファージ及び生体由来の夾雑物を含む組成物（好ましくは水を含む液組成物）の塗布量は、基材１ｃｍ２あたり、例えば容量で１～２７μＬであることが好ましく、質量で１～２７ｍｇであることが好ましい。
【0021】
基材の材質は特に限定されず、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル樹脂、シリコーン樹脂、フッ素樹脂等の樹脂、ステンレス、アルミニウム、チタンなどの金属、アルミナ、ジルコニア等のセラミックス、またはガラスなどであってもよいが、金属であることが好ましく、特にステンレスであることがより好ましい。また、基材の形状も限定されないが、板状、棒状などが挙げられ、板状である場合の大きさは、短辺の長さが１～４ｃｍ、長辺の長さが５～１０ｃｍ、厚みが０．１～２ｍｍ程度であればよい。
【0022】
（５）抗ウイルス評価方法
上記インジケーターを、体液で汚染された医療用具とともに洗浄し、洗浄後の前記インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記バクテリオファージ量を測定することで、体液で汚染された医療用具の抗ウイルス効果の評価を行うことができる。
上記インジケーターを、体液で汚染された医療用具とともに洗浄し、洗浄後の前記インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記バクテリオファージ量を測定することで、体液で汚染された医療用具の抗ウイルス効果の評価を行うことができる。
【0023】
インジケーターは、洗浄装置にそのまま投入してもよいし、ホルダーに挿入して投入してもよいし、また洗浄装置に固定しても固定しなくてもよいが、これらの条件について洗浄対象の医療用具と同様の配置状態とすることが好ましい。
【0024】
洗浄は、公知または市販の装置で実施される洗浄方法を適用できる。用いられる洗浄剤は、ＨＢＶを不活化可能な公知または市販の洗浄剤を用いることができ、例えば、太平化学産業株式会社製のライザー４、タイフレッシュ・エースＮＥＯなどを挙げることができる。また、洗浄方式も特に限定されず、浸漬洗浄、超音波洗浄、ウォッシャーディスインフェクター、用手洗浄などが挙げられる。
【0025】
体液には、血液、リンパ液、唾液、分泌液、組織液、その他の体液が含まれる。医療用具としては、手術、検査、治療等に用いられるものであれば特に限定されず、例えば、鑷子、鉗子、剪刀、吸引管、内視鏡、カテーテル、注射針等が挙げられる他、手術着や検査着などの衣服も含まれる。
【0026】
宿主菌とバクテリオファージを混ぜて、宿主菌が増殖できる寒天平板培地上で培養してバクテリオファージを増殖させると、宿主菌がバクテリオファージによって溶菌し、透明な溶菌斑（プラーク）が観察されるため、このプラーク数（Ｐｌａｑｕｅ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ、ＰＦＵ）をカウントすることで、バクテリオファージ量を評価できる。より具体的な手順は例えば以下の通りである。まず、洗浄後のインジケーター表面をスワブで回収し、回収物をＳＣＤＬＰ（Ｓｏｙｂｅａｎ－Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ ｗｉｔｈ Ｌｅｃｉｔｈｉｎ ＆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）液体培地に溶出させる。溶出液の一部を、更にＳＣＤＬＰ液体培地と混合するという操作を繰り返して、ＳＣＤＬＰ液体培地により体積基準で１０－５まで希釈し、希釈液と同体積の宿主菌を混合後、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）液体培地に混和させ、ＬＢ寒天平板培地で培養を行えばよい。培養条件は、例えば２５～３０℃で２０～３０時間行うことが好ましい。洗浄剤に代えて水を用いること以外は同様の方法で洗浄した後のインジケーターについても、前記手順でバクテリオファージ量を測定し、下記式で算出される抗バクテリオファージ活性値を求め、この活性値が２．０以上であれば、ＨＢＶの抗ウイルス効果ありと評価でき、２．０未満であれば、ＨＢＶの抗ウイルス効果なしと評価できる。
抗バクテリオファージ活性値＝ｌｏｇ１０｛水での洗浄後の板上残存ファージ数（ＰＦＵ）／洗浄剤での洗浄後の板上残存ファージ数（ＰＦＵ）｝
抗バクテリオファージ活性値＝ｌｏｇ１０｛水での洗浄後の板上残存ファージ数（ＰＦＵ）／洗浄剤での洗浄後の板上残存ファージ数（ＰＦＵ）｝
【0027】
（６）洗浄条件の探索方法
上記インジケーターを洗浄し、洗浄後の前記インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記バクテリオファージ量を測定する工程を、洗浄条件を変えて繰り返すことで、洗浄条件を探索することができる。
上記インジケーターを洗浄し、洗浄後の前記インジケーター表面の残存物を回収して培養し、前記バクテリオファージ量を測定する工程を、洗浄条件を変えて繰り返すことで、洗浄条件を探索することができる。
【0028】
上記探索方法におけるバクテリオファージ量の測定は、上記した抗ウイルス評価方法において具体的に説明した手順を採用すればよい。
【0029】
本発明によれば、体液で汚染された箇所の抗ＨＢＶ評価を安全にかつ迅速に行うことができ、医療現場、食品工場、介護施設、公共施設等で有用に用いることができる。
【実施例0030】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって制限を受けるものではなく、前記、後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【0031】
（１）抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）活性値の測定
評価には、ヒト肝細胞キメラマウス（ＰＸＢマウス）から分離した新鮮ヒト肝細胞であるＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ（登録商標、ドナー：Ｈｉｓｐａｎｉｃ，１Ｙ，女児）を使用した。不活化（抗ウイルス）効果の検討には、器具用防錆清浄液（洗浄剤）として、太平化学産業株式会社製のタイフレッシュ・エースＮＥＯ及びライザー４を用いた。ＨＢＶを含む血清（ＨＢＶ量は５ＧＥｑ／ｃｅｌｌ、タンパク量は３５～７５ｍｇ／ｍＬ程度）を感染源として各洗浄剤と混合し（ＨＢＶを含む血清と洗浄剤との混合割合は体積比率で１：１）、室温にて３０分間反応を行った後に、ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓに接種した。接種１２日後に培養上清中及び細胞中のＨＢＶ関連パラメーター（ＨＢｓＡｇ）を、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）にて測定し抗ＨＢＶ活性値を算出した。抗ＨＢＶ活性値の算出方法は下記式の通りである。
抗ＨＢＶ活性値＝ｌｏｇ１０｛洗浄剤無添加の上清中ＨＢｓＡｇ量(ＩＵ／ｍＬ)／洗浄剤添加の上清中ＨＢｓＡｇ量（ＩＵ／ｍＬ）｝
評価には、ヒト肝細胞キメラマウス（ＰＸＢマウス）から分離した新鮮ヒト肝細胞であるＰＸＢ－ｃｅｌｌｓ（登録商標、ドナー：Ｈｉｓｐａｎｉｃ，１Ｙ，女児）を使用した。不活化（抗ウイルス）効果の検討には、器具用防錆清浄液（洗浄剤）として、太平化学産業株式会社製のタイフレッシュ・エースＮＥＯ及びライザー４を用いた。ＨＢＶを含む血清（ＨＢＶ量は５ＧＥｑ／ｃｅｌｌ、タンパク量は３５～７５ｍｇ／ｍＬ程度）を感染源として各洗浄剤と混合し（ＨＢＶを含む血清と洗浄剤との混合割合は体積比率で１：１）、室温にて３０分間反応を行った後に、ＰＸＢ－ｃｅｌｌｓに接種した。接種１２日後に培養上清中及び細胞中のＨＢＶ関連パラメーター（ＨＢｓＡｇ）を、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）にて測定し抗ＨＢＶ活性値を算出した。抗ＨＢＶ活性値の算出方法は下記式の通りである。
抗ＨＢＶ活性値＝ｌｏｇ１０｛洗浄剤無添加の上清中ＨＢｓＡｇ量(ＩＵ／ｍＬ)／洗浄剤添加の上清中ＨＢｓＡｇ量（ＩＵ／ｍＬ）｝
【0032】
各洗浄剤の抗ＨＢＶ活性値を表１に示す。
【0033】
【表1】
【0034】
上述の抗ＨＢＶ活性値は、値が大きいほど洗浄剤無添加時のウイルス量に対して洗浄剤添加時のウイルス量の方が十分に低減しており、抗ウイルス効果が良好であることを意味する。表１に示す通り、ライザー４の２倍希釈の抗ＨＢＶ活性値は２．８、タイフレッシュ・エースＮＥＯの１０倍希釈の抗ＨＢＶ活性値は３．１で両者とも抗ＨＢＶ活性値２．０以上であったため抗ウイルス効果ありと判断した。一方、ライザー４の１０倍希釈の抗ＨＢＶ活性値は０、タイフレッシュ・エースＮＥＯの１００倍希釈の抗ＨＢＶ活性値は０．１で両者とも抗ＨＢＶ活性値２．０未満であったため抗ウイルス効果なしと判断した。
【0035】
（２）抗ウイルス評価用組成物による抗バクテリオファージ活性値の測定
実施例１－１、実施例１－２
まず、φ６バクテリオファージ液、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）液を以下の手順で調製した。
バクテリオファージ液の調製方法は以下の通りである。ファージ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅφ６ （ＮＢＲＣ Ｎｏ．１０５８９９））を、事前にＬＢ液体培地で培養していた宿主菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｙｒｉｎｇａｅ（ＮＢＲＣ Ｎｏ．１４０８４））液に添加し、２７℃で４時間振とう培養を行った後、培養液を４℃で２４時間静置する。この培養液を１００００Ｇで２０分間遠心し、上澄み液を０．４５μｍのフィルター（Ｐｏｌｙ Ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ）に通し、バクテリオファージの水懸濁液を得た。
上述の手順で調製したφ６バクテリオファージ液２０μＬ及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）液１８０μＬの混合液と、器具用防錆清浄液（洗浄剤）２００μＬ（太平化学産業株式会社製のライザー４またはタイフレッシュ・エースＮＥＯ）を滅菌チューブ内で混和し、３０分間２７℃で反応させた。φ６の終濃度（バクテリオファージ液、ＢＳＡ液及び洗浄剤の混合液に対する濃度）は、１０７～１０９ＰＦＵ／ｍＬであり、上記１８０μＬのＢＳＡ液は、ＢＳＡ（ナカライテスク（株） 牛血清アルブミン（脂肪酸フリー）、型番：０１２－６６）８００ｍｇを１０ｍＬとなるようメスアップし、８．０質量／体積％のＢＳＡ水溶液を調製し、このＢＳＡ水溶液１００μＬを滅菌水８０μＬに溶解させたもの（ＢＳＡの終濃度が２質量／体積％）または、８．０質量／体積％のＢＳＡ水溶液１５０μＬを滅菌水３０μＬに溶解させたもの（ＢＳＡの終濃度が３質量／体積％）を用いた。またライザー４については、終濃度２倍希釈または１０倍希釈となるように調製したものを用い、タイフレッシュ・エースＮＥＯについては、終濃度１０倍希釈または１００倍希釈となるように調製したものを用いた。
３０分反応させた後の液を１００μＬ採取し、ＳＣＤＬＰ培地９００μＬに添加して１０－１希釈液を調製した。この操作を繰り返して行い、１０－５まで段階希釈した。希釈液１００μＬと宿主菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｙｒｉｎｇａｅ）１００μＬを混合後、軟寒天培地（ＬＢ培地）３．５ｍＬに混和させ平板培地に全量撒き２７℃で２４時間培養を行った。培養後形成したプラークを測定し得られたファージ数から抗バクテリオファージ活性値を算出した。抗バクテリオファージ活性値の算出方法は下記式の通りである。
抗バクテリオファージ活性値＝ｌｏｇ１０｛初期ファージ数（ＰＦＵ／ｍＬ）／洗浄剤との反応後ファージ数（ＰＦＵ／ｍＬ）｝
上記式で算出された抗バクテリオファージ活性値が２．０以上であれば抗ウイルス効果あり、抗バクテリオファージ活性値が２．０未満であれば抗ウイルス効果なしと判断した。
実施例１－１、実施例１－２
まず、φ６バクテリオファージ液、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）液を以下の手順で調製した。
バクテリオファージ液の調製方法は以下の通りである。ファージ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅφ６ （ＮＢＲＣ Ｎｏ．１０５８９９））を、事前にＬＢ液体培地で培養していた宿主菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｙｒｉｎｇａｅ（ＮＢＲＣ Ｎｏ．１４０８４））液に添加し、２７℃で４時間振とう培養を行った後、培養液を４℃で２４時間静置する。この培養液を１００００Ｇで２０分間遠心し、上澄み液を０．４５μｍのフィルター（Ｐｏｌｙ Ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ）に通し、バクテリオファージの水懸濁液を得た。
上述の手順で調製したφ６バクテリオファージ液２０μＬ及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）液１８０μＬの混合液と、器具用防錆清浄液（洗浄剤）２００μＬ（太平化学産業株式会社製のライザー４またはタイフレッシュ・エースＮＥＯ）を滅菌チューブ内で混和し、３０分間２７℃で反応させた。φ６の終濃度（バクテリオファージ液、ＢＳＡ液及び洗浄剤の混合液に対する濃度）は、１０７～１０９ＰＦＵ／ｍＬであり、上記１８０μＬのＢＳＡ液は、ＢＳＡ（ナカライテスク（株） 牛血清アルブミン（脂肪酸フリー）、型番：０１２－６６）８００ｍｇを１０ｍＬとなるようメスアップし、８．０質量／体積％のＢＳＡ水溶液を調製し、このＢＳＡ水溶液１００μＬを滅菌水８０μＬに溶解させたもの（ＢＳＡの終濃度が２質量／体積％）または、８．０質量／体積％のＢＳＡ水溶液１５０μＬを滅菌水３０μＬに溶解させたもの（ＢＳＡの終濃度が３質量／体積％）を用いた。またライザー４については、終濃度２倍希釈または１０倍希釈となるように調製したものを用い、タイフレッシュ・エースＮＥＯについては、終濃度１０倍希釈または１００倍希釈となるように調製したものを用いた。
３０分反応させた後の液を１００μＬ採取し、ＳＣＤＬＰ培地９００μＬに添加して１０－１希釈液を調製した。この操作を繰り返して行い、１０－５まで段階希釈した。希釈液１００μＬと宿主菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｙｒｉｎｇａｅ）１００μＬを混合後、軟寒天培地（ＬＢ培地）３．５ｍＬに混和させ平板培地に全量撒き２７℃で２４時間培養を行った。培養後形成したプラークを測定し得られたファージ数から抗バクテリオファージ活性値を算出した。抗バクテリオファージ活性値の算出方法は下記式の通りである。
抗バクテリオファージ活性値＝ｌｏｇ１０｛初期ファージ数（ＰＦＵ／ｍＬ）／洗浄剤との反応後ファージ数（ＰＦＵ／ｍＬ）｝
上記式で算出された抗バクテリオファージ活性値が２．０以上であれば抗ウイルス効果あり、抗バクテリオファージ活性値が２．０未満であれば抗ウイルス効果なしと判断した。
【0036】
実施例２－１、実施例２－２
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）液１８０μＬの代わりに、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（（株）ニチレイバイオサイエンス ＦＥＴＡＬ ＢＯＶＩＮＥ ＳＥＲＵＭ 型番：１７１０１２）１６０μＬと水２０μＬを混合したＦＢＳ水溶液１８０μＬまたは前記ウシ胎児血清１８０μＬ（ＦＢＳ終濃度、すなわちバクテリオファージ液、ＦＢＳ水溶液及び洗浄剤の混合液に対する濃度は４０体積／体積％または４５体積／体積％）を用いたこと以外は、実施例１－１と同様にして培養後形成したプラークを測定し得られたファージ数から抗バクテリオファージ活性値を算出した。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）液１８０μＬの代わりに、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（（株）ニチレイバイオサイエンス ＦＥＴＡＬ ＢＯＶＩＮＥ ＳＥＲＵＭ 型番：１７１０１２）１６０μＬと水２０μＬを混合したＦＢＳ水溶液１８０μＬまたは前記ウシ胎児血清１８０μＬ（ＦＢＳ終濃度、すなわちバクテリオファージ液、ＦＢＳ水溶液及び洗浄剤の混合液に対する濃度は４０体積／体積％または４５体積／体積％）を用いたこと以外は、実施例１－１と同様にして培養後形成したプラークを測定し得られたファージ数から抗バクテリオファージ活性値を算出した。
【0037】
実施例３－１～実施例３－４
まず、硫酸プロタミン１００ｍｇを１０ｍＬとなるようにメスアップし、１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液を調製した。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）液１８０μＬの代わりに、ヒツジ全血液（（株）ジャパン・バイオシーラム ヒツジヘパリンＮａ全血液 型番：０２７－Ｈ００４３）と１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液を容量比１０：１で混和した液１８０μＬを、当該混和液の終濃度が、２０体積／体積％、３０体積／体積％、４０体積／体積％、または４５体積／体積％となるように用いたこと以外は、実施例１－１と同様にして培養後形成したプラークを測定し得られたファージ数から抗バクテリオファージ活性値を算出した。
前記ヒツジ全血液と１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液を混和した液１８０μＬの内訳はそれぞれ以下の通りである。
終濃度２０体積／体積％の時：１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液７．３μＬ、ヒツジ全血液７２．７μＬ、滅菌水１００μＬ
終濃度３０体積／体積％の時：１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液１０．９μＬ、ヒツジ全血液１０９．１μＬ、滅菌水６０μＬ
終濃度４０体積／体積％の時：１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液１４．５μＬ、ヒツジ全血液１４５．５μＬ、滅菌水２０μＬ
終濃度４５体積／体積％の時：１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液１６．４μＬ、ヒツジ全血液１６３．６μＬ
まず、硫酸プロタミン１００ｍｇを１０ｍＬとなるようにメスアップし、１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液を調製した。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）液１８０μＬの代わりに、ヒツジ全血液（（株）ジャパン・バイオシーラム ヒツジヘパリンＮａ全血液 型番：０２７－Ｈ００４３）と１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液を容量比１０：１で混和した液１８０μＬを、当該混和液の終濃度が、２０体積／体積％、３０体積／体積％、４０体積／体積％、または４５体積／体積％となるように用いたこと以外は、実施例１－１と同様にして培養後形成したプラークを測定し得られたファージ数から抗バクテリオファージ活性値を算出した。
前記ヒツジ全血液と１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液を混和した液１８０μＬの内訳はそれぞれ以下の通りである。
終濃度２０体積／体積％の時：１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液７．３μＬ、ヒツジ全血液７２．７μＬ、滅菌水１００μＬ
終濃度３０体積／体積％の時：１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液１０．９μＬ、ヒツジ全血液１０９．１μＬ、滅菌水６０μＬ
終濃度４０体積／体積％の時：１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液１４．５μＬ、ヒツジ全血液１４５．５μＬ、滅菌水２０μＬ
終濃度４５体積／体積％の時：１．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液１６．４μＬ、ヒツジ全血液１６３．６μＬ
【0038】
比較例
実施例１－１及び１－２と同じφ６バクテリオファージ液２０μＬ（φ６の終濃度は１０７～１０９ＰＦＵ／ｍＬ）及びファージ希釈用液１８０μＬ（１０ｍｇ／Ｌポリペプトンおよび０．８５ｍｇ／Ｌ塩化ナトリウムを含む水性の液）の混合液と、器具用防錆清浄液２００μＬ（太平化学産業株式会社製のライザー４またはタイフレッシュ・エースＮＥＯ）を滅菌チューブ内で混和し、３０分間２７℃で反応させたこと以外は、実施例１－１と同様にして抗バクテリオファージ活性値を計算した。
実施例１－１及び１－２と同じφ６バクテリオファージ液２０μＬ（φ６の終濃度は１０７～１０９ＰＦＵ／ｍＬ）及びファージ希釈用液１８０μＬ（１０ｍｇ／Ｌポリペプトンおよび０．８５ｍｇ／Ｌ塩化ナトリウムを含む水性の液）の混合液と、器具用防錆清浄液２００μＬ（太平化学産業株式会社製のライザー４またはタイフレッシュ・エースＮＥＯ）を滅菌チューブ内で混和し、３０分間２７℃で反応させたこと以外は、実施例１－１と同様にして抗バクテリオファージ活性値を計算した。
【0039】
実施例１－１、実施例１－２、実施例２－１、実施例２－２、実施例３－１～実施例３－４及び比較例の結果を表２に示す。なお、表２中、「ｗ／ｖ％」は、質量／体積％を意味し、「ｖ／ｖ％」は、体積／体積％を意味する。
【0040】
【表2】
【0041】
実施例１－１、実施例１－２、実施例２－１、実施例２－２及び実施例３－１～実施例３－４のいずれについても、ライザー４の２倍希釈にて抗ウイルス効果あり（抗バクテリオファージ活性値が２．０以上）、ライザー４の１０倍希釈にて抗ウイルス効果なし（抗バクテリオファージ活性値が２．０未満）であり、またタイフレッシュ・エースＮＥＯの１０倍希釈にて抗ウイルス効果あり（抗バクテリオファージ活性値が２．０以上）、タイフレッシュ・エースＮＥＯの１００倍希釈にて抗ウイルス効果なし（抗バクテリオファージ活性値が２．０未満）との結果であり、これらは上記表１で示したＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の抗ウイルス効果の評価と一致していた。
一方、夾雑物を含まなかった比較例では、ライザー４の１０倍希釈及びタイフレッシュ・エースＮＥＯの１００倍希釈にて上記表１で示したＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の抗ウイルス効果の評価と一致しなかった。
一方、夾雑物を含まなかった比較例では、ライザー４の１０倍希釈及びタイフレッシュ・エースＮＥＯの１００倍希釈にて上記表１で示したＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の抗ウイルス効果の評価と一致しなかった。
【0042】
比較例に示す通り、ファージは夾雑物が共存していない場合には表２のいずれの洗浄剤の条件においても良好に除去されている。しかし、実際のＨＢＶ汚染の現場では血清などの夾雑物が共存しており、そのような条件ではライザー４の１０倍希釈や、タイフレッシュ・エースＮＥＯの１００倍希釈の場合に、十分な抗ウイルス効果が得られないというのが現状である（表１）。実施例に示す通り、エンベロープ型バクテリオファージと共に夾雑物を含む組成物を用いて、該組成物と洗浄剤を混合した後のファージの抗バクテリオファージ活性値を評価する本発明の方法は、ＨＢＶの抗ウイルス効果の評価と一致しており、すなわちＨＢＶ汚染される実際の状況を忠実に模擬できていると言え、ＨＢＶの抗ウイルス評価の代替方法として適しており、安全かつ簡便に短期間でＨＢＶの抗ウイルス評価を行うことができる。
【0043】
なお、表２に示した実施例２－１及び実施例２－２、並びに実施例３－１～実施例３－４のタンパク質量は、それぞれ、ウシ胎児血清及びヒツジ全血液のタンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定することによって求めた。２ｍｇ／ｍＬ標準ＢＳＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＰｉｅｒｃｅＴＭ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｍｐｕｌｅｓ, ２ｍｇ／ｍＬ 型番：２３２０９）に滅菌水を加え、検量線作成用標準溶液を調製した。この検量線作成用標準溶液２０μＬおよびプロテインアッセイブラッドフォード試薬（富士フィルム和光純薬(株) 型番：１６８－２５９１１）３８０μＬをテストチューブにて混和し１０分間室温で静置した。１０分間室温で静置後混和液を、分光光度計（日立（株） 型番：Ｕ－３３１０）を用いて５９５ｎｍの波長で吸光度を測定し検量線を得た。ウシ胎児血清またはヒツジ全血液２０μＬとプロテインアッセイブラッドフォード試薬３８０μＬをテストチューブにて混和し同様の操作で吸光度を測定し、作成していた検量線よりタンパク質量を算出した。ウシ胎児血清１ｍＬ中の蛋白質量は６６．４ｍｇであり、ヒツジ全血液１ｍＬ中のタンパク質量は１３０ｍｇであった。
【0044】
（３）抗ウイルス評価用インジケーターによる抗バクテリオファージ活性値の測定
実施例４
まず、硫酸プロタミン２００ｍｇを１０ｍＬとなるようメスアップし、２．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液を調製した。
次に、２．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液と、実施例１－１及び１－２と同じφ６バクテリオファージ液を、容量比１：１で混和して、硫酸プロタミン濃度が１質量／体積％である混和液（硫酸プロタミン水溶液とφ６バクテリオファージ液の混和液）９．１μＬを得た。この混和液９．１μＬと、実施例３－１～３－４で用いたのと同じヘパリン酸Ｎａ処理ヒツジ全血液９０．９μＬを混和した液（容量比１：１０）をＳＵＳ板に１００μＬ塗布し室温にて２時間乾燥させた。ＳＵＳ板に塗布した液における、硫酸プロタミンの終濃度は１質量／体積％であり、φ６バクテリオファージの終濃度は１０７～１０８ＰＦＵ／ｍＬである。この試験片を器具用防錆清浄液（ライザー４の２倍希釈液、１０倍希釈液、タイフレッシュ・エースＮＥＯの１０倍希釈液、または１００倍希釈液）に３０分間浸漬後、板表面をスワブで回収し、ＳＣＤＬＰ培地１ｍＬ中に溶出させた。溶出液１００μＬをＳＣＤＬＰ培地９００μＬに添加し１０－１希釈液を調製した。これを繰り返し行い１０－５まで段階希釈した。希釈液１００μＬと宿主菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｙｒｉｎｇａｅ）１００μＬを混合後、軟寒天培地（ＬＢ液体培地）３．５ｍＬに混和させ平板培地（ＬＢ寒天培地）に全量撒き２７℃で２４時間培養を行った。培養後形成したプラークを測定し、前記洗浄剤に代えて水に浸漬した試験も行い、同様にファージ数を測定し、これらファージ数から抗バクテリオファージ活性値を算出した。抗バクテリオファージ活性値の算出方法は下記式の通りである。
抗バクテリオファージ活性値＝ｌｏｇ１０｛水に浸漬後の板上残存ファージ数（ＰＦＵ）／各洗浄剤浸漬後の板上残存ファージ数（ＰＦＵ）｝
実施例４
まず、硫酸プロタミン２００ｍｇを１０ｍＬとなるようメスアップし、２．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液を調製した。
次に、２．０質量／体積％の硫酸プロタミン水溶液と、実施例１－１及び１－２と同じφ６バクテリオファージ液を、容量比１：１で混和して、硫酸プロタミン濃度が１質量／体積％である混和液（硫酸プロタミン水溶液とφ６バクテリオファージ液の混和液）９．１μＬを得た。この混和液９．１μＬと、実施例３－１～３－４で用いたのと同じヘパリン酸Ｎａ処理ヒツジ全血液９０．９μＬを混和した液（容量比１：１０）をＳＵＳ板に１００μＬ塗布し室温にて２時間乾燥させた。ＳＵＳ板に塗布した液における、硫酸プロタミンの終濃度は１質量／体積％であり、φ６バクテリオファージの終濃度は１０７～１０８ＰＦＵ／ｍＬである。この試験片を器具用防錆清浄液（ライザー４の２倍希釈液、１０倍希釈液、タイフレッシュ・エースＮＥＯの１０倍希釈液、または１００倍希釈液）に３０分間浸漬後、板表面をスワブで回収し、ＳＣＤＬＰ培地１ｍＬ中に溶出させた。溶出液１００μＬをＳＣＤＬＰ培地９００μＬに添加し１０－１希釈液を調製した。これを繰り返し行い１０－５まで段階希釈した。希釈液１００μＬと宿主菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｙｒｉｎｇａｅ）１００μＬを混合後、軟寒天培地（ＬＢ液体培地）３．５ｍＬに混和させ平板培地（ＬＢ寒天培地）に全量撒き２７℃で２４時間培養を行った。培養後形成したプラークを測定し、前記洗浄剤に代えて水に浸漬した試験も行い、同様にファージ数を測定し、これらファージ数から抗バクテリオファージ活性値を算出した。抗バクテリオファージ活性値の算出方法は下記式の通りである。
抗バクテリオファージ活性値＝ｌｏｇ１０｛水に浸漬後の板上残存ファージ数（ＰＦＵ）／各洗浄剤浸漬後の板上残存ファージ数（ＰＦＵ）｝
【0045】
上記式で算出された抗バクテリオファージ活性値が２．０以上であれば抗ウイルス効果あり、２．０未満であれば効果なしと判断した。結果を表３に示す。
【0046】
【表3】
【0047】
表３によれば、夾雑物とエンベロープ型バクテリオファージを表面に有するインジケーターを用いて、洗浄後のインジケーター上のファージ量を評価する方法でも、上記表１で示したＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の抗ウイルス効果の評価が一致していた。
【0048】
また、本実施例では板上および浸漬液に溶出したタンパク質量をＢＳＡ換算でＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。結果を表４に示す。
【0049】
【表4】
【0050】
表４によれば、洗浄後でも板上にタンパク質が残存していることが分かる。従来の洗浄評価（インジケーター）は、器具に付着したタンパク質を洗浄により完全に除去することで感染性のウイルスも完全に除去することができているという考え方であり、タンパク質を所定以下に低減することをもって、ウイルスも所定以下に除去できたと判断されていた。しかし、臨床においてタンパク質を完全に除去することは難しく、洗浄評価判定ガイドライン２０１２年８月（（一社）日本医療機器学会・滅菌技士認定委員会）ではウォッシャーディスインフェクターや超音波洗浄後の洗浄物に残存するタンパク質の許容値（２００μｇ／機械）と目標値（１００μｇ／機械）を設定しており、許容値および目標値以下のタンパク質量であってもわずかに残存するタンパク質内に感染性のウイルスが存在している可能性があった。本評価方法によればタンパク質の残存量ではなく、ウイルスの不活化効果を直接評価することができるので、例えば外科処置後の器材表面や環境表面（仮にタンパク質が残っていたとしても）にウイルスが残存または減少しているか確認することができる。