特開 2025-23506 ＰＣＲ方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025023506

(43)【公開日】2025-02-17

(54)【発明の名称】ＰＣＲ方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20250207BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20250207BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12N15/09 Z ZNA

【審査請求】有

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023127674

(22)【出願日】2023-08-04

(11)【特許番号】

(45)【特許公報発行日】2023-12-06

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

３．ＢＲＩＪ

(71)【出願人】

【識別番号】509233699

【氏名又は名称】株式会社ゴーフォトン

(74)【代理人】

【識別番号】100105924

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 賢樹

(72)【発明者】

【氏名】三谷 康正

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS12

4B063QS25

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】血液を検体とした場合であっても、煩雑な核酸の精製作業等を行うことなく、ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号の測定を好適に行うことのできるＰＣＲ方法を提供する。
【解決手段】ＰＣＲ方法は、血液をＰＣＲ試薬に添加して試料を調製する工程（Ｓ１０）と、マイクロ流体チップの流路内で試料を繰り返し往復移動させて、試料にサーマルサイクルを付与する工程（１４）と、試料のＰＣＲの進捗を監視するために、流路内の試料から蛍光を検出する工程（Ｓ１６）と、を備える。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液をＰＣＲ試薬に添加して試料を調製する工程と、
マイクロ流体チップの流路内で前記試料を繰り返し往復移動させて、前記試料にサーマルサイクルを付与する工程と、
前記試料のＰＣＲの進捗を監視するために、前記流路内の前記試料から蛍光を検出する工程と、
を備えることを特徴とするＰＣＲ方法。

【請求項2】

前記サーマルサイクルを付与する工程において、前記流路内で前記試料を繰り返し往復移動させることにより、前記流路内において前記試料が有色の固形成分と透明溶液成分とに分離され、
前記蛍光を検出する工程において、前記透明溶液成分から発せられる蛍光を検出することを特徴とする請求項１に記載のＰＣＲ方法。

【請求項3】

前記試料における血液の添加率は０．０１％～２０％、好ましくは０．１％～１０％、より好ましくは１％～５％であることを特徴とする請求項１または２に記載のＰＣＲ方法。

【請求項4】

前記ＰＣＲ試薬は、界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のＰＣＲ方法。

【請求項5】

前記ＰＣＲ試薬は、添加剤を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のＰＣＲ方法。

【請求項6】

前記流路は、直線状流路と曲線状流路を組み合わせた蛇行状流路を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のＰＣＲ方法。

【請求項7】

前記流路は、第１温度に維持される第１温度領域と、前記第１温度と異なる第２温度に維持される第２温度領域と、前記第１温度領域と前記第２温度領域とを接続する接続流路と、を含み、
前記接続流路の断面積は、前記第１温度領域および前記第２温度領域に含まれる流路の断面積よりも大きいことを特徴とする請求項１または２に記載のＰＣＲ方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）の方法に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子検査は、各種医学分野における検査、農作物や病原性微生物の同定、食品の安全性評価、さらには病原性ウィルスや各種感染症の検査にも広く活用されている。微小量のＤＮＡを高感度に検出するために、ＤＮＡの一部を増幅して得られたものを分析する方法が知られている。中でもＰＣＲを用いた方法は、生体等から採取されたごく微量のＤＮＡのある部分を選択的に増幅する注目の技術である。

【0003】

ＰＣＲは、ＤＮＡを含む生体サンプルと、プライマーや酵素などからなるＰＣＲ試薬とを混合した試料に、所定のサーマルサイクルを与え、変性、アニーリングおよび伸長反応を繰り返し起こさせて、ＤＮＡの特定の部分を選択的に増幅させるものである。ＤＮＡを増幅させながらその蛍光信号を測定し、定量分析を行うことにより、リアルタイムでのＰＣＲ解析を行うことができる。

【0004】

ＰＣＲにおいては、対象の試料をＰＣＲチューブまたは複数の穴が形成されたマイクロプレート（マイクロウェル）などのチップに所定量入れて、サーマルサイクラーと呼ばれる装置で試料に対して温度変化を与えることが一般的である（例えば特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０２０／０６５９１７号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、上記のようなＰＣＲチューブまたはマイクロプレートを用いた従来のＰＣＲ方法では、血液をＰＣＲ試薬に直接添加した試料に対してＰＣＲを行った場合、ＰＣＲ初期の加熱変性により血液成分の褐色化が進み、試料の蛍光透過度が低下するために、ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号を正確に測定できず、リアルタイムＰＣＲ解析を適切に行うことができない虞がある。血液から核酸の抽出・精製作業を行い蛍光信号の測定を阻害する色素を除去してからＰＣＲ試薬に添加する、あるいは、血液を例えば１０倍以上希釈してから微量血液のみをＰＣＲ試薬に添加する、などの方法により、従来のＰＣＲ方法でもリアルタイムＰＣＲは可能であるが、このような作業を行うことは非常に煩雑で時間が掛かるものである。

【0007】

本発明は、こうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、血液を検体とした場合であっても、煩雑な核酸の精製作業等を行うことなく、ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号の測定を好適に行うことのできるＰＣＲ方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記課題を解決するために、本発明のある態様のＰＣＲ方法は、血液をＰＣＲ試薬に添加して試料を調製する工程と、マイクロ流体チップの流路内で試料を繰り返し往復移動させて、試料にサーマルサイクルを付与する工程と、試料のＰＣＲの進捗を監視するために、流路内の試料から蛍光を検出する工程と、を備える。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、血液を検体とした場合であっても、煩雑な核酸の精製作業等を行うことなく、ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号の測定を好適に行うことのできるＰＣＲ方法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明の実施形態に係るＰＣＲ方法に適用可能なマイクロ流体チップの第１面側を示す斜視図である。

【図2】マイクロ流体チップの第２面側を示す斜視図である。

【図3】マイクロ流体チップが備える基板の第１面の平面図である。

【図4】マイクロ流体チップが備える基板の第２面面の平面図である。

【図5】マイクロ流体チップの断面構造を説明するための概念図である。

【図6】マイクロ流体チップを利用可能なサーマルサイクルやＰＣＲを実施するためのＰＣＲ装置を説明するための概略図である。

【図7】本実施形態に係るＰＣＲ方法を説明するためのフローチャートである。

【図8】マイクロ流体チップの流路内で試料を移動させたときに、試料がどのように変化するかを説明するための図である。

【図9】マイクロ流体チップの流路内で試料を移動させたときに、試料がどのように変化するかを説明するための図である。

【図10】マイクロ流体チップの流路内で試料を移動させたときに、試料がどのように変化するかを説明するための図である。

【図11】マイクロ流体チップの流路内で試料を移動させたときに、試料がどのように変化するかを説明するための図である。

【図12】マイクロ流体チップの流路内で試料を移動させたときに、試料がどのように変化するかを説明するための図である。

【図13】マイクロ流体チップの流路内で試料を移動させたときに、試料がどのように変化するかを説明するための図である。

【図14】本発明の実施形態に係るＰＣＲ方法に適用可能な別のマイクロ流体チップの第１面の平面図である。

【図15】図１５（ａ）および図１５（ｂ）は、レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置を用いたときの増幅曲線を示す図である。

【図16】一般的なリアルタイムＰＣＲ装置を用いたときの増幅曲線を示す図である。

【図17】図１７（ａ）および図１７（ｂ）は、レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置を用いたときの増幅曲線を示す図である。

【図18】一般的なリアルタイムＰＣＲ装置を用いたときの増幅曲線を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明の実施形態について説明する。各図面に示される同一または同等の構成要素、部材、処理には、同一の符号を付するものとし、適宜重複した説明は省略する。また、実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。

【0012】

図１は、本発明の実施形態に係るＰＣＲ方法に適用可能なマイクロ流体チップ１０の第１面側を示す斜視図である。図２は、マイクロ流体チップ１０の第２面側を示す斜視図である。図３は、マイクロ流体チップ１０が備える基板１４の第１面１４ａの平面図である。図４は、マイクロ流体チップ１０が備える基板１４の第２面１４ｂ面の平面図である。図５は、マイクロ流体チップ１０の断面構造を説明するための概念図である。図５は、流路、フィルムおよびフィルタと基板との位置関係を説明するための図であり、実施のマイクロ流体チップの断面図とは異なる点に留意されたい。

【0013】

マイクロ流体チップ（「流体チップ」、「（マイクロ）流路チップ」、「反応処理チップ」、「反応処理容器」、「核酸増幅用チップ」、「ＤＮＡチップ」または「測定チップ」などとも呼ばれる）１０は、サーマルサイクルや反応に供される試料が移動する流路１２を備える。マイクロ流体チップ１０は、第１面１４ａに試料が移動する溝状の流路１２が主として形成された樹脂製の基板１４と、基板１４の第１面１４ａに貼り付けられた第１封止フィルム１６および第２封止フィルム１８と、基板の第２面１４ｂに貼り付けられた第３封止フィルム２０と、を備える。また、マイクロ流体チップ１０において、流路１２へのコンタミネーションを抑制する目的で、基板１４の流路１２の両端部近傍に、第１フィルタ２８および第２フィルタ３０を備えてもよい。

【0014】

図３に示されるように、マイクロ流体チップ１０の基板１４の第１面１４ａには、少なくとも溝状の流路１２と、流路１２の両端部に配置され、流路１２に連通し流路内を加圧または送風するポンプからの出力を取り付けるための空気連通口２４，２６と、流路１２上に設けられた室状のチャンバ３２，３４と、流路１２へのコンタミネーションを防止するためのフィルタ２８，３０を載置するフィルタスペース３６，３８と、が設けられている。溝状の流路１２は、ＰＣＲやサーマルサイクルに供される試料が移動することが予定される。

【0015】

図４に示されるように、基板１４の第２面１４ｂには、空気連通口２４，２６とフィルタスペース３６，３８を連通するための溝状のエアダクト４０，４２と、試料を流路１２に導入するための試料導入口（試料導入孔）４４が設けられている。溝状のエアダクト４０，４２は、空気連通口２４，２６に接続したポンプなどからの送風や加圧のために、主として空気が通る流路として予定されてもよい。このように流路１２やエアダクト４０，４２などを基板１４の対向する二つの主面（第１面１４ａと第２面１４ｂ）に設けることで、基板１４の主面の有効利用に役立つ。

【0016】

マイクロ流体チップ１０の基板１４は、温度変化に対して安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１４は、成形性がよく、バリア性が良好で、且つ、低い自家蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、アクリル、ポリプロピレン、シリコーンなどの樹脂、中でも環状ポリオレフィン樹脂が好適である。基板が樹脂からなる場合、金型を用いる射出成形により、大量に、かつ、高い品質で作製することが可能である。

【0017】

マイクロ流体チップ１０の基板１４の大きさは、特に限定されるものではなく、基板内に形成された流路内での化学的、物理的作用を満足するものであればその大きさは問わない。一方で、マイクロ流体チップが搭載される装置を小型にしたいという要請があるのであれば、マイクロ流体チップやそれを構成する基板についても小さくまたは薄くすることができる。マイクロ流体チップ１０の基板１４は、成形性や携帯性、取扱性のよい平行平板状であってよい。

【0018】

マイクロ流体チップ１０の基板１４の大きさは、例えば、厚みが１ｍｍ～１０ｍｍであり、好ましくは２ｍｍ～６ｍｍであり、平面視においてＷ×Ｌの矩形状であり、Ｗは１０ｍｍ～６０ｍｍであり、好ましくは２０ｍｍ～３５ｍｍであり、Ｈは４５ｍｍ～１００ｍｍであり、好ましくは６０ｍｍ～８５ｍｍである。

【0019】

また、マイクロ流体チップ１０は、透明な樹脂から構成されてもよい。マイクロ流体チップ１０は、リアルタイムＰＣＲ法により試料に含まれる核酸の増幅に用いられることが予定される。核酸を含む試料がマイクロ流体チップ１０の流路内で反応が進むとき、試料から出射される蛍光をリアルタイムで検出しモニタリングすることにより、反応の進捗や終了を知ることができる。流路内の試料からの蛍光の検出や、蛍光を起こさせる励起光の照射のような光学測定に供されるパーツとしては、マイクロ流体チップ１０は透明な材料から構成されることが好ましい。

【0020】

基板１４の第１面１４ａには溝状の流路１２が形成されている。マイクロ流体チップ１０において、流路１２の大部分は基板の第１面１４ａに露出した溝状に形成されている。また、溝状のエアダクト４０，４２は基板１４の第２面１４ｂに露出した溝状に形成されている。このような形態をとることにより、流路１２などを対向する二つの主面に備えた基板１４が、金型を用いる射出成形により容易に成形される。基板１４に形成された溝を封止して流路１２として活用するために、基板１４の各面上に流路封止フィルムが貼られる。流路１２の寸法は、例えば幅０．２ｍｍ～１．５ｍｍ、深さ０．２ｍｍ～２ｍｍ程度であり、流路１２の寸法は、幅０．７ｍｍ、深さ０．７ｍｍであってもよい。また射出成型法により基板１４を工業的により有利に生産するために、流路１２の構造は、いわゆる「抜きテーパ」と称する、基板１４の第１面１４ａ、第２面１４ｂに対して一定の角度を備える側面を含み得る。テーパの角度は１°～３０°であってもよく、３°～１５°であってもよい。

【0021】

流路１２や試料導入口４４、空気連通口２４，２６、チャンバ３２，３４、フィルタ２８，３０を封止するための封止フィルム１６，１８，２０は、一方の主面が粘着性を備えていてもよいし、押圧や紫外線などのエネルギー照射、加熱等により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１４の第１面１４ａ、第２面１４ｂと密着して一体化できる機能を備える。封止フィルム１６，１８，２０は、粘着剤も含めて低い、望ましくはほとんどゼロの自家蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィンポリマー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、封止フィルム１６，１８，２０は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、マイクロ流体チップ１０の反りや変形防止に役立つ。

【0022】

流路１２の一端近傍には、第１フィルタ２８が設けられている。流路１２の他端近傍には、第２フィルタ３０が設けられていてもよい。流路１２の両端近傍に設けられた一対の第１フィルタ２８および第２フィルタ３０は、ＰＣＲによって目的のＤＮＡの増幅やその検出を妨げないように、または目的のＤＮＡの品質が劣化しないように、流路内や試料へのコンタミネーションを防止する目的がある。第１フィルタ２８および第２フィルタ３０の寸法は、基板１４の第１面１４ａに形成されたフィルタスペース３６，３８に隙間なく収まるような寸法に形成される。

【0023】

基板１４には、第１エアダクト４０および第１フィルタ２８を介して流路１２の一端に通じる第１空気連通口２４が形成されている。同様に基板１４には、第２エアダクト４２および第２フィルタ３０を介して流路１２の他端に通じる第２空気連通口２６が形成されている。一対の第１空気連通口２４および第２空気連通口２６は、基板１４の第１面１４ａに露出するように形成されている。

【0024】

流路１２の一部は、一対の第１フィルタお２８よび第２フィルタ３０の間に、後述するＰＣＲ装置により複数水準の温度の制御が可能なサーマルサイクル領域を含む。ヒータなどを含む温度制御システムを有するＰＣＲ装置に、マイクロ流体チップ１０をセットすることにより、マイクロ流体チップ１０の流路１２の一部が温度制御システムにより加熱され、求める温度に維持される。温度は、サーマルサイクルを付与してＰＣＲなどの反応を生じさせるために必要な複数の温度に維持されるように制御される。反応は、試料に含まれる核酸が熱変性する反応や、アニーリング反応や、伸長反応を含む。流路１２の一部に制御される温度は、これらの反応を生じさせる温度であってもよい。このような、複数水準の温度が維持された反応領域を連続的に往復するように試料を移動させることにより、試料にサーマルサイクルを与えることができる。

【0025】

本実施形態において、サーマルサイクル領域は、第１温度領域４６と、第２温度領域４８とを含む。後述のＰＣＲ装置にマイクロ流体チップ１０が搭載された際に、第１温度領域４６は比較的高温（例えば約９５℃）に維持され、第２温度領域４８は、第１温度領域４６よりも低温（例えば約６０℃）に維持される。試料に含まれる核酸などが、第１温度領域４６に含まれる流路内で熱変性反応を生じてもよく、第２温度領域４８に含まれる流路内でアニーリング反応と伸長反応を生じてもよい。なお、第１温度領域４６および第２温度領域４８は、その温度の高低の観点から、それぞれ「高温領域」および「中温領域」と称してもよい。また、第１温度領域４６と第２温度領域４８は、その反応の属性の観点から、「変性領域」と「アニーリング・伸長領域」と称してもよい。

【0026】

第１温度領域４６の一端は、第１チャンバ３２に連通する。さらに、第１チャンバ３２は、第１フィルタ２８および第１エアダクト４０を介して第１空気連通口２４に連通する。第１温度領域４６の他端は、接続流路５０を介して第２温度領域４８の一端に連通する。第２温度領域４８の他端は、接続流路４１を通じて第３蛇行状流路５２の一端に連通する。第３蛇行状流路５２の他端は第２チャンバ３４に連通する。さらに、第２チャンバ３４は、第２フィルタ３０および第２エアダクト４２を介して第２空気連通口２６に連通する。

【0027】

本実施形態において、第３蛇行状流路５２は、サーマルサイクルやＰＣＲに直接関係しない流路であり、直線状流路と曲線状流路を含む。試料を流路内に導入するための試料導入口４４を第３蛇行状流路５２に連通させておく構造とすることで、ＰＣＲに供される予定の試料を待機させておくバッファ的な流路として用いてもよい。

【0028】

第１温度領域４６および第２温度領域４８はそれぞれ、曲線状流路と直線状流路とを組み合わせた連続的に折り返す第１蛇行状流路５４，第２蛇行状流路５６を含む。複数の曲線状流路を直線状流路によって接続しているともいえる。このような蛇行状流路とした場合、後述の温度制御システムを構成するヒータ等の限られた実効面積を有効に使うことができ、各温度領域内での温度のばらつきを低減することに貢献するとともに、マイクロ流体チップ１０の実体的な大きさを小さくでき、ＰＣＲ装置の小型化に貢献できるという利点がある。また、曲線状流路と直線状流路とを組み合わせることにより、例えば直線状流路のみで温度領域を構成した場合と比較して、流路を流れる試料の攪拌混合を促進することができる。これにより、後述するように試料を固形成分と透明溶液成分とに効果的に分離することができる。曲線状流路の曲率半径Ｒ２は、０．３ｍｍ～１０ｍｍであってよく、好ましくは０．５ｍｍ～６ｍｍであってよい。

【0029】

一方、第１温度領域４６と第２温度領域４８は直線状の接続流路５０により接続されている。接続流路５０には、後述のＰＣＲ装置にマイクロ流体チップ１０が搭載された際に、流路内を流れる試料から蛍光を検出するために励起光の照射を受ける領域（「蛍光検出領域」または単に「検出領域」と称する）５８が設けられてもよい。この蛍光検出領域５８に含まれる流路を検出流路５９と称する。

【0030】

接続流路５０は、試料の蛍光を検出するための蛍光検出装置の一部が配置される部分に対応する。そのため、第１温度領域４６と第２温度領域４８との間隔は、比較的長いものであってよく、例えば、第１温度領域４６と第２温度領域４８との間隔は、第１温度領域４６および／または第２温度領域４８に含まれる直線状の流路より長くてもよい。接続流路５０に配置される蛍光検出装置の一部は、所定の体積を有するので、その蛍光検出装置の一部のパーツを配置するために、当該間隔を、ある一定の距離以上とすることにメリットがある。また、第１温度領域４６と第２温度領域４８との間隔は、長いほど、両方の温度領域間の熱的な干渉を小さくできるメリットがある。温度領域間の熱的な干渉が小さい場合、装置からヒータなどの温度制御手段を通じて供される熱の有効利用が図れ、装置の省電力化に貢献できる。

【0031】

一方で、ＰＣＲ装置やマイクロ流体チップ１０の大きさを小さくするメリット（携帯性や重量など）があるので、第１温度領域４６と第２温度領域４８との間隔は、例えば、マイクロ流体チップ１０の平面図における長辺の長さＬの１／２より短くてもよい。このとき、他の要素の搭載やマージンやブランクスペースの配置などのマイクロ流体チップの設計の自由度の向上が図ることができ、ＰＣＲ装置の求める大きさや携帯性を確保しやすい。

【0032】

第１チャンバ３２は、サーマルサイクル領域と第１空気連通口２４との間に配置されている。より詳細には、第１チャンバ３２は、サーマルサイクル領域の第１温度領域４６と、第１フィルタ２８の間に配置されている。流路内の試料は、例えば、第２空気連通口２６から加圧または送風されることにより、第１温度領域４６に向かって移動する。第１チャンバ３２は、試料が過剰に押されて、または第１温度領域４６をオーバーランして、第１フィルタ２８に到達することを抑制する役割を備える。一定の体積を有する第１チャンバ３２を流路中に備えることにより、試料がサーマルサイクル領域の所定の停止予定位置を通過した場合であっても、試料が第１チャンバ３２内に留まり、停止させることができ、試料が第１空気連通口２４に向かう流れを抑制することができる。

【0033】

第１チャンバ３２は、図３に示すように、サーマルサイクル領域の第１温度領域４６から延びる流路の流路端との接続部（または開口部）である第１接続部３２ａと、第１フィルタ２８に向かう流路の流路端との接続部である第２接続部３２ｂを備える。第１チャンバ３２は、第１接続部３２ａの近傍に第１構造体３２ｃを有する。この第１構造体３２ｃは、第１接続部３２ａから第１チャンバ３２に進入した液状の試料が、直接に第２接続部３２ｂに向かうことを抑制し、第１フィルタ２８の方向への試料の進入を抑制することに貢献する。

【0034】

第２チャンバ３４は、サーマルサイクル領域と第２空気連通口２６との間に配置されている。より詳細には、第２チャンバ３４は、第３蛇行状流路５２と第２フィルタ３０との間に配置されている。流路内の試料は、例えば、第１空気連通口２４から加圧または送風されることにより、試料が、第２温度領域４８に向かって移動する。第２チャンバ３４は、試料が過剰に押されて、または第２温度領域４８や第３蛇行状流路５２をオーバーランして、第２フィルタ３０に到達することを抑制する役割を備える。

【0035】

第２チャンバ３４は、図３のように、第３蛇行状流路５２から延びる流路の流路端との接続部である第３接続部３４ａと、第２フィルタ３０に向かう流路の流路端との接続部である第４接続部３４ｂを備える。第２チャンバ３４は、第３接続部３４ａの近傍に第２構造体３４ｃを有する。この第２構造体３４ｃは、第３接続部３４ａから第２チャンバ３４に進入した液状の試料が、直接に第４接続部３４ｂに向かうことを抑制し、第２フィルタ３０の方向への試料の進入を抑制することに貢献する。

【0036】

第１チャンバ３２、第２チャンバ３４は、試料のオーバーランを防ぐ以外の機能を有していてもよい。例えば第１チャンバ３２、第２チャンバ３４は、反応用チャンバとして用いられてもよい。具体的には、第１チャンバ３２、第２チャンバ３４内にあらかじめＰＣＲ試薬を保持しておき、第１チャンバ３２、第２チャンバ３４内でＰＣＲ試薬に検体を添加した後、ＰＣＲを行ってもよい。

【0037】

図３に示すように、第１蛇行状流路５４と第１チャンバ３２との間に、第１拡幅流路６０が設けられていてもよい。第１拡幅流路６０は、第１温度領域４６に属する流路に隣接し、且つ接続流路５０から見て第１蛇行状流路５４よりも奥側に設けられている。また、第２蛇行状流路５６と第３蛇行状流路５２との間に、第２拡幅流路６２が設けられていてもよい。第２拡幅流路６２は、第２温度領域４８に属する流路に隣接し、且つ接続流路５０から見て第２温度領域４８に属する流路よりも奥側に形成されている。

【0038】

第１拡幅流路６０は、その断面積が第１蛇行状流路５４の断面積よりも大きくなるように設けられている。同様に、第２拡幅流路６２は、その断面積が第２蛇行状流路５６の断面積よりも大きくなるように設けられている。第１拡幅流路６０および第２拡幅流路６２はそれぞれ、第１蛇行状流路５４および第２蛇行状流路５６を流れる試料にブレーキ作用を及ぼす役割を有する。これは、流管通る流体の速さは、流管の断面積に反比例するとした、ベルヌーイの法則を利用したものである。試料が、第１温度領域４６ならびに第２温度領域４８を流れる場合に、試料に対して制動（ブレーキ）がかかり、第１温度領域４６および第２温度領域４８内に試料を停止させようとする機能が追加される。また、このように流路１２の一部に断面積が変化する領域を設けることにより、当該領域において試料の攪拌混合を促進することができる。これにより、後述するように試料を固形成分と透明溶液成分とに効果的に分離することができる。

【0039】

マイクロ流体チップ１０は、流路内に試料を導入するための少なくともひとつの試料導入口を有していてもよい、試料導入口は、例えば増幅対象の核酸を含む試料を、流路内に導入するためのインレットである。試料導入口は、基板１４の主面から、いずれかの流路に通じて穿孔された構造を有していれば、その形状や大きさ、配置は問わない。図３および図４では、例として、第３蛇行状流路５２に通じるように試料導入口４４が設けられている。図３および図４では、流路１２は面１４ａに、試料導入口４４は１４ｂに設けられており、互いに基板１４の対向する面に形成されているが、基板１４の同一の面に設けられていてもよい。別の実施形態に係るマイクロ流体チップは、二個の試料導入口（第１試料導入口および第２試料導入口）を備えていてもよい。

【0040】

図１に示すように、基板１４の第１面１４ａには、少なくとも流路を封止するための第１封止フィルム１６が貼り付けられる。第１封止フィルム１６は、基板１４の第１面１４ａの略全面を覆う程度の大きさのものであってよい。第１封止フィルム１６は、送液システムのポンプの吐出ポートから通じているノズルを接続するために、空気連通口２４，２６が封止されないように、空気連通口２４，２６に対応する位置には、予め孔を開けておいてもよい。第１封止フィルム１６は、空気連通口２４，２６が封止された態様でもよい。この場合、空気連通口２４，２６は、マイクロ流体チップ１０を使用するとき、流路内を加圧または送風するための送液システムに用いられるポンプの吐出ポートから通じているノズルが取り付けられるので、ノズル端に中空のニードルなどを備えていれば、ニードル先端でフィルムを穿孔したうえで、ポンプの出力ポートと空気連通口２４，２６とを連通できる。

【0041】

基板１４の第１面１４ａには、空気連通口２４，２６を除いた、流路１２やフィルタスペース３６，３８、チャンバ３２，３４を封止するための第１封止フィルム１６の使用とともに、例えば、第２空気連通口２６のみが封止されるように、粘着性の第２封止フィルム１８が貼り付けられていてもよい。このとき、第１空気連通口２４には、封止のための封止フィルムが貼られていなくてもよい。マイクロ流体チップ１０に、試料導入口４４から試料を導入するとき、第１空気連通口２４は、流路内に導入された試料の体積に対応する空気の排気ポートとしてはたらく。そして、そのまま、流路内に試料が導入されたマイクロ流体チップ１０の空気連通口２４，２６に、送液システムのポンプの出力端が接続されてもよい。このとき第２封止フィルムを剥がしてもよい。流通時には、第１空気連通口２４はオープンであるものの、第２空気連通口２６をはじめ、その他のポートは封止フィルムにより封止されているので、第１空気連通口２４から、ダストやちり、ほこりなどが入りにくく、コンタミネーシの抑制が可能である。

【0042】

図２に示すように、基板１４の第２面１４ｂには、空気連通口２４，２６とフィルタスペース３６，３８とを連通する溝状のエアダクト４０，４２と、試料を流路に導入するための試料導入口４４が設けられている。基板１４の第２面１４ｂには、溝状のエアダクト４０，４２を封止するための第３封止フィルム２０が貼り付けられていてもよい。さらに、基板１４の第２面１４ｂには、試料導入口４４を封止するための第４封止フィルムが貼り付けられていてもよい。エアダクト４０，４２と、試料導入口４４の位置が近ければ、第３封止フィルム２０によって、エアダクト４０，４２と、試料導入口４４を同時に封止してもよい。このときは、第４封止フィルムは不要である。

【0043】

図１および図２は、基板１４とこれらの各封止フィルム１６，１８，２０が貼り付けられて一体化した例を示す。図２には、エアダクト４０，４２と、試料導入口４４を同時に封止せしめる第３封止フィルム２０の態様の例が示されている。

【0044】

試料導入口４４を介して、試料を流路内に導入する例を説明する。まず、作業者は、第３封止フィルム２０を剥がして、試料導入口４４を開放する。このとき、第３封止フィルム２０は、試料導入口４４が開放される程度に剥がし、溝状のエアダクト４０，４２は封止されたままとする。

【0045】

次に、ピペットやスポイト、シリンジなどによって、計量した試料を、試料導入口４４から流路１２内に入れる。さらにピペットやスポイト、シリンジなどを操作して、試料をサーマルサイクル領域の第１温度領域４６か第２温度領域４８に達するまで推してもよい。この場合、試料の到達した位置を、ＰＣＲやサーマルサイクルの際の試料の初期位置とすることができる。導入された試料により、試料の体積と略同じ体積の空気が流路内でおされて、開放されている第１空気連通口２４よりリリースされる。このとき、第１空気連通口２４は試料導入時の排気ポートとなる。

【0046】

次に、第３封止フィルム２０を、もとに貼り戻す。第３封止フィルム２０は、複数回の貼りと剥がしのサイクルに耐えうる特性を備えることが好ましい。こうすることで、マイクロ流体チップ１０の流通時の清浄性の保持と、試料の導入作業の利便性の観点から好適となる。

【0047】

また、第２封止フィルム１８と第３封止フィルム２０は、初期状態で基板１４の主面に貼り付けられている状態から、使用時に一部を剥がしたりする（貼り戻しもありうる）作業が容易なように、フィルム端部に表裏が非粘着性のタブ１８ａ，２０ａを備えていてよい。作業者が、マイクロ流体チップ１０の試料導入口４４孔や空気連通口２４，２６をオープンな状態とする作業の利便性の向上に役立つ。

【0048】

また、第３封止フィルム２０は、図２に示すように、試料導入口４４とエアダクト４２の間に、コーナー部２０ｂを設けてもよい。このコーナー部２０ｂは、作業者が試料導入口４４だけを開放する際に、第３封止フィルム２０を剥がす限度の目安となる。またコーナー部に略円形の切り込みを設けて、目安を強調したり、フィルムを途中まで剥がすことによっても、フィルムが切れにくくしてもよい。

【0049】

図６は、マイクロ流体チップ１０を利用可能なサーマルサイクルやＰＣＲを実施するためのＰＣＲ装置（「サーマルサイクル装置」、「サーマルサイクラー」、「反応処理装置」とも呼ばれる）１００を説明するための概略図である。

【0050】

ＰＣＲ装置１００は、マイクロ流体チップ１０が設置される設置部１０１と、比較的高温に制御される流路１２の第１温度領域４６を加熱するための第１ヒータ１０２と、流路の第２温度領域４８を加熱するための第２ヒータ１０４と、各反応領域の実温度を計測するための例えば熱電対等の温度センサ（図示せず）を含む温度制御システムを備える。各ヒータは例えば抵抗加熱素子やペルチェ素子等であってよい。これらのヒータ、適切なヒータドライバ、およびマイクロコンピュータやマイクロプロセッサ、電子回路などから構成される制御装置１１０によって、マイクロ流体チップ１０の流路１２における第１温度領域４６が約９５℃、第２温度領域４８が約６０℃に維持され、ＰＣＲを実施するために必要なサーマルサイクル領域の各反応領域の温度が設定される。さらに、ＰＣＲ装置１００は、これらの各パーツを適切に稼働させるために、装置内に内蔵されるバッテリーや、外部からの電力の供給を受けるための電源ユニット（いずれも図示しない）を備える。各パーツを駆動させるためのドライバについては説明や記載を省略する。

【0051】

ＰＣＲ装置１００は、さらに、蛍光検出装置１０６を備える。試料Ｓには所定の蛍光プローブが添加されている。ＤＮＡの増幅が進むにつれ試料Ｓから発せられる蛍光信号の強度が増加するので、その蛍光信号の強度値をＰＣＲの進捗やその終結の判定材料としての指標とすることができる。

【0052】

蛍光検出装置１０６としては、非常にコンパクトな光学系で、迅速に測定でき、かつ明るい場所か暗い場所かにもかかわらず、蛍光を検出することができる日本板硝子株式会社製の光ファイバ型蛍光検出器ＦＬＥ－５１０を使用することができる。この光ファイバ型蛍光検出器は、その励起光／蛍光の波長特性を試料Ｓの発する蛍光特性に適するようにチューニングしておくことができ、様々な特性を有する試料について最適な光学・検出系を提供することが可能であり、さらに光ファイバ型蛍光検出器によってもたらされる光線の径の小ささから、流路などの小さいまたは細い領域に存在する試料からの蛍光を検出するのに適しており応答スピードも優れている。

【0053】

光ファイバ型の蛍光検出装置１０６は、光学ヘッド１０８と、蛍光検出装置本体（ドライバ含む）１１２と、光学ヘッド１０８と蛍光検出装置本体１１２とを接続する光ファイバ１１４とを備える。蛍光検出装置本体１１２には励起光用光源（ＬＥＤ、レーザその他特定の波長を出射するように調整された光源）、光ファイバ型合分波器および光電変換素子（ＰＤ，ＡＰＤ又はフォトマル等の光検出器）（いずれも図示せず）等が含まれており、これらを制御するためのドライバやマイクロコンピュータ等からなる。光学ヘッド１０８はレンズ等の光学系からなり、励起光の試料への指向性照射と試料から発せられる蛍光の集光の機能を担う。集光された蛍光は光ファイバ１１４を通じて蛍光検出器ドライバ内の光ファイバ型合分波器により励起光と分けられ、光電変換素子によって電気信号に変換される。光ファイバ型の蛍光検出器としては、特開２０１０－２７１０６０号に記載のものを使用することができる。光ファイバ型蛍光検出装置１０６は、さらに単一または複数の光学ヘッドを用いて同軸式に複数波長に係る検出が可能なようにモディファイすることもできる。複数波長に係る蛍光検出器とその信号処理については、国際公開第２０１４／００３７１４号に記載の発明を活用することができる。

【0054】

ＰＣＲ装置１００においては、検出流路５９内の試料Ｓからの蛍光を検出することができるように光学ヘッド１０８が配置される。試料Ｓは流路内でサーマルサイクル領域内を繰り返し往復移動させられることで反応が進み、試料Ｓに含まれる所定のＤＮＡが増幅するので、検出された蛍光の量の変動をモニタリングすることで、ＤＮＡの増幅の進度をリアルタイムで知ることができる（リアルタイムＰＣＲ）。また、ＰＣＲ装置１００においては、蛍光検出装置１０６からの出力値を利用して、試料Ｓの移動制御に活用する。例えば蛍光検出装置１０６からの出力値を制御装置１１０に送信して、後述の送液システム１２０の制御をする際のパラメータとして利用してもよい。蛍光検出装置１０６は、試料からの蛍光を検出する機能を発揮するものであれば光ファイバ型蛍光検出装置に限定されない。

【0055】

また蛍光検出装置１０６は、励起光／蛍光の複数のセットを設けることができる。例えば、第１蛍光検出装置は、青色の励起光を照射して試料から出射される緑色の蛍光を検出し、第２蛍光検出装置は、緑色の励起光を照射して赤色の蛍光を検出するようにセッティングされていてもよい。そのほか、検出の対象となる核酸や蛍光プローブなどの組み合わせに応じて、励起光／蛍光波長特性の組み合わせについて予めセッティングされた蛍光検出装置を配置してもよい。

【0056】

ＰＣＲ装置１００においては、蛍光検出装置１０６の光学ヘッド１０８は、サーマルサイクル領域内の接続流路５０内の試料からの蛍光を検出するように配置されている。接続流路５０は、第１温度領域４６と第２温度領域４８とを接続する流路である。上述したように、試料からの蛍光が検出されることが予定されている領域を蛍光検出領域５８と称する。また蛍光検出領域５８に属する流路を検出流路５９と称する。検出流路５９は流路が形成されている基板１４の第１面１４ａに設けられている。

【0057】

ＰＣＲ装置１００は、さらに、試料Ｓをマイクロ流体チップ１０の流路内で移動および停止させるための送液システム１２０を備える。送液システム１２０は、これに限られるものではないが、第１空気連通口２４または第２空気連通口２６を通じて、いずれか一方から空気を送り込む（送風する）ことによって、試料Ｓを流路内で一方向に移動させることができる。さらに、送液システム１２０は、流路への送風を止める、または流路内の試料Ｓの両側の圧力を等しくすることにより所定の位置で停止させることができる。

【0058】

図６に示すように、本実施形態における送液システム１２０は、送液用ポンプ１２８と、第１三方弁１２２と、第２三方弁１２４と、加圧チャンバ１２６と、を備える。さらに、送液システム１２０は、送液用ポンプ１２８の吐出ポートと空気連通口とを接続するチューブとノズルを備えていてもよい。

【0059】

加圧チャンバ１２６は、その内部に一定の体積を有する空間を形成している。加圧チャンバ１２６は、その内部空間の圧力を変化可能に構成される。加圧チャンバ１２６内の圧力は、ＰＣＲを行っている間は少なくともＰＣＲ装置１００の周辺環境の気圧より高い圧力（例えば１．０５～１．３気圧）に維持される。ＰＣＲ装置１００は、加圧チャンバ１２６内の圧力を高めるために、これらに限られないが、出力ポートが加圧チャンバ１２６内に接続されている加圧ポンプや送風ポンプ、ブロア、マイクロポンプ、シリンジポンプなど（図示しない）を含んでいてよい。ＰＣＲ装置１００の周辺環境の気圧とは、ＰＣＲ装置１００が設置されている場所、ＰＣＲ装置１００によるＰＣＲが行われる場所、又はＰＣＲ装置１００が周りから区画された場所に設置されている場合は、その区画された場所、における圧力（又は大気圧）のことを指す。加圧チャンバ１２６内の圧力は、試料が高温（９５℃程度）に繰り返し曝されても、ＰＣＲ反応処理に影響するような著しい試料の蒸発や気泡等の発生を防止できる程度に加圧すればよい。加圧チャンバ１２６内の圧力は高ければ高いほど、試料の蒸発等の影響を抑止することができるが、反面、その取扱いも含めて送液システム１２０が複雑化したり大型化したりするため、当業者は装置の用途や目的、費用、効果等を総合的に判断し、全体のシステムの設計をすることができる。

【0060】

加圧チャンバ１２６には、大気圧開放バルブ（リークバルブ）１２７が設けられている。大気圧開放バルブ１２７は、マイクロ流体チップ１０の脱着時に、送液システム１２０やマイクロ流体チップ１０の流路１２内の圧力が大気圧に等しくなるように制御される。これにより、試料Ｓの急激な移動やとびだしを防ぐことができる。

【0061】

送液用ポンプ１２８は、加圧チャンバ１２６内に配置される。送液用ポンプ１２８は、停止時に一次側（空気の吸い込み側）と二次側（空気の吐出側）の圧力が等しくなる送風機またはマイクロブロアであってよい。送液用ポンプ１２８は、空気を流路内に送り込み、その送風や圧力の高まりを受けて液状の試料が移動する役割を有していて、現に液体自体を送り込むポンプではないことに留意する。

【0062】

第１三方弁１２２の第１ポートＡは、送液用ポンプ１２８の出力ポート（吐出ポート）１２８ａと接続される。第１三方弁１２２の第２ポートＢは、加圧チャンバ１２６の内部空間と連通する。第１三方弁１２２の第３ポートＣは、第１チューブ１３０の一端に接続され、該第１チューブ１３０の他端は、送液システム１２０の第１出力ポート１３１としてマイクロ流体チップ１０の第１空気連通口２４に接続される。第１三方弁１２２は、マイクロ流体チップ１０の第１空気連通口２４が送液用ポンプ１２８の出力ポート１２８ａと連通する状態と、マイクロ流体チップ１０の第１空気連通口２４が加圧チャンバ１２６の内部空間に開放される状態とを切替可能である。マイクロ流体チップ１０の第１空気連通口２４と送液用ポンプ１２８の出力ポート１２８ａとを連通する場合、第１三方弁１２２はポートＡとポートＣとが連通する状態に制御される。一方、マイクロ流体チップ１０の第１空気連通口２４を加圧チャンバ１２６の内部空間に開放する場合、第１三方弁１２２はポートＢとポートＣとが連通する状態に制御される。

【0063】

第２三方弁１２４の第１ポートＡは、送液用ポンプ１２８の出力ポート１２８ａと接続される。第２三方弁１２４の第２ポートＢは、加圧チャンバ１２６の内部空間と連通する。第２三方弁１２４の第３ポートＣは、マイクロ流体チップ１０の第２空気連通口２６と接続される。第２三方弁１２４の第３ポートＣは、第２チューブ１３２の一端に接続され、該第２チューブ１３２の他端は、送液システム１２０の第２出力ポート１３３としてマイクロ流体チップ１０の第２空気連通口２６に接続される。第２三方弁１２４は、マイクロ流体チップ１０の第２空気連通口２６が送液用ポンプ１２８の出力ポート１２８ａと連通する状態と、マイクロ流体チップ１０の第２空気連通口２６が加圧チャンバ１２６の内部空間に開放される状態とを切替可能である。マイクロ流体チップ１０の第２空気連通口２６と送液用ポンプ１２８の出力ポート１２８ａとを連通する場合、第２三方弁１２４はポートＡとポートＣとが連通する状態に制御される。一方、マイクロ流体チップ１０の第２空気連通口２６を加圧チャンバ１２６の内部空間に開放する場合、第２三方弁１２４はポートＢとポートＣとが連通する状態に制御される。

【0064】

送液用ポンプ１２８、第１三方弁１２２および第２三方弁１２４の操作は、適切なドライバを通じて、制御装置１１０によって行わせることが可能である。特に、先述のように配置された光学ヘッド１０８が、得られた蛍光信号に基づく出力値を制御装置１１０に送信して、流路中の試料Ｓの位置やその通過を制御装置１１０に認識させることによって、送液システム１２０の制御を行うことができる。

【0065】

送液システム１２０を用いて、第１温度領域４６から第２温度領域４８に試料Ｓを移動する場合を説明する。送液用ポンプ１２８は動作状態（ＯＮ）に制御される。また、第１三方弁１２２は第１ポートＡと第３ポートＣが連通した状態、第２三方弁１２４は第２ポートＢと第３ポートＣが連通した状態に制御される。これにより、マイクロ流体チップ１０の第１空気連通口２４が送液用ポンプ１２８の出力ポート１２８ａと連通するとともに、マイクロ流体チップ１０の第２空気連通口２６が加圧チャンバ１２６の内部空間に開放される状態となる。本実施形態では送液用ポンプ１２８が加圧チャンバ１２６内に配置されているので、送液用ポンプ１２８から空気が吐出されると、マイクロ流体チップ１０の第１空気連通口２４の圧力は第２空気連通口２６よりも高くなり、試料Ｓが第１温度領域４６から第２温度領域４８に向かって移動する。試料Ｓが第２温度領域４８に到達したとき、第１三方弁１２２は第２ポートＢと第３ポートＣが連通した状態、第２三方弁１２４は第２ポートＢと第３ポートＣが連通した状態に制御される。これにより、第１空気連通口２４および第２空気連通口２６は両方とも加圧チャンバ１２６の内部空間に開放された状態となるので、試料Ｓは第２温度領域４８で停止する。逆に第２温度領域４８から第１温度領域４６に試料Ｓを移動する場合は、第１三方弁１２２と第２三方弁１２４を上記とは逆に操作すればよい。

【0066】

このように、流路１２の両側に接続された第１三方弁１２２および第２三方弁１２４を順次に、かつ、連続的に操作することにより、試料Ｓを流路内で、第１温度領域４６と第２温度領域４８の間を連続して往復移動させて、それによって試料Ｓに適切なサーマルサイクルを与えることが可能となる。

【0067】

ＰＣＲ装置１００においては、周辺環境の気圧より高い圧力（例えば１．３気圧）に設定された加圧チャンバ１２６の内部空間に送液用ポンプ１２８を配置するとともに、第１三方弁１２２および第２三方弁１２４の第２ポートＢが加圧チャンバ１２６の内部空間に開放されるよう構成されている。従って、反応処理中は、マイクロ流体チップ１０の流路１２全体が周辺環境の気圧より高い圧力に維持されている。このことは、例えば、メキシコシティなどの高地や飛行中の航空機内で、ＰＣＲ装置１００を用いることでメリットが特に享受できる。第１温度領域４６の第１温度は、９５℃またはその近傍である。高地や航空機内の圧力は１気圧より低いので、９５℃でも試料Ｓの一部が沸騰する可能性が生じる。しかし、ＰＣＲ装置１００の加圧チャンバ１２６を備える送液システム１２０を採用することによって、このような低大気圧の環境における、望ましくない試料の沸騰を抑制することが可能となる。また、ＰＣＲ装置１００は、低い大気圧の環境でなくても問題なく用いることができる。

【0068】

送液システムは、図６に示す形態以外の形態を採用してもよい。ポンプとしては、シリンジポンプ、ダイアフラムポンプ、マイクロブロアや送風機などを用いることができる。ポンプを二個用いるので、目的の温度領域に正確に停止させるために、ポンプの個体差を調整する必要の生じる場合がある。このときも、二個のポンプについて、停止時には一次側（空気の吸い込み側）と二次側（空気の吐出側）の圧力が等しくなる送風機またはマイクロブロアからなる送風用ポンプを用いることができる。試料を移動させる場合は、その方向に対応するポンプだけを動作させる。試料を停止させるときは、両方のポンプを停止させる。これによって、試料の両側の圧力がバランスされるので、試料を停止させることができる。

【0069】

流路１２を備えたマイクロ流体チップ１０を適用可能なＰＣＲ装置１００は、レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置とも呼ばれる。

【0070】

上述したように、ＰＣＲチューブまたはマイクロプレートを用いた従来のＰＣＲ方法では、血液を検体としてリアルタイムＰＣＲを行う場合、血液から核酸の抽出・精製作業を行い蛍光信号の測定を阻害する色素を除去してからＰＣＲ試薬に添加する、あるいは、血液を例えば１０倍以上希釈してから微量血液のみをＰＣＲ試薬に添加する、などの作業が必要であった。これは、従来のＰＣＲ方法では、血液をＰＣＲ試薬に直接添加した試料に対してＰＣＲを行った場合、ＰＣＲ初期の加熱変性により血液成分の褐色化が進み、試料の蛍光透過度が低下するために、ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号の強度を正確に測定できないからである。すなわち、従来のＰＣＲ方法では、試料中の血液成分の色が蛍光検出を妨げていた。

【0071】

本発明者は、様々な試料に対してリアルタイムＰＣＲの実験を行う中で、上記のような試料が流れる微細な流路１２を備えるマイクロ流体チップ１０および当該マイクロ流体チップ１０にサーマルリサイクルを付与するＰＣＲ装置１００を用いることにより、血液をＰＣＲ試薬に直接添加した試料であっても、ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号の測定を好適に行うことができることを見いだした。

【0072】

図７は、本実施形態に係るＰＣＲ方法を説明するためのフローチャートである。本実施形態に係るＰＣＲ方法は、血液を検体としたリアルタイムＰＣＲ方法である。

【0073】

本実施形態に係るＰＣＲ方法においては、まず、血液をＰＣＲ試薬に添加して試料を調製する（Ｓ１０）。ここでいう「血液」とは「全血」を意味する。本明細書では、「血液をＰＣＲ試薬に添加」とは、全血をそのままＰＣＲ試薬に直接添加することを意味しており、血液から精製された核酸をＰＣＲ試薬に添加することや、血液を簡易精製したクルードなものをＰＣＲ試薬に添加することは、血液をＰＣＲ試薬に添加する行為とは呼ばない。従来の技術文献においては、このような血液のＰＣＲ試薬への添加を「血液をＰＣＲ試薬に添加」と表現している場合があるので留意されたい。

【0074】

ＰＣＲ試薬は、プライマーおよびプローブを含む。プローブは、ＴａｑＭａｎプローブ（ＴａｑＭａｎ／タックマンはロシュ ダイアグノスティックスゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの登録商標）であってよい。

【0075】

所定量のＰＣＲ試薬に対して所定量の血液を添加して、試料を調製する。試料における血液の添加率は、０．０１％～２０％、好ましくは０．１％～１０％、より好ましくは１％～５％であってよい。例えば、ＰＣＲ試薬１９μＬに全血１μＬを添加することにより、血液添加率５％の試料２０μＬを調製できる。

【0076】

次に、マイクロ流体チップ１０を準備し、マイクロ流体チップ１０内の流路１２に調製した試料を導入する（Ｓ１２）。流路１２への試料の導入は、ピペットやスポイト、シリンジなどを用いて、マイクロ流体チップ１０の試料導入口４４から行う。

【0077】

Ｓ１０およびＳ１２では、試料を調製した後に、マイクロ流体チップ１０内に導入したが、マイクロ流体チップ１０内で試料を調製してもよい。例えば、上述したように第１チャンバ３２、第２チャンバ３４内にあらかじめＰＣＲ試薬を保持しておき、第１チャンバ３２、第２チャンバ３４内でＰＣＲ試薬に血液を添加してもよい。

【0078】

次に、マイクロ流体チップ１０の第１温度領域４６と第２温度領域４８との間で試料を繰り返し往復移動させて、試料にサーマルサイクルを付与する（Ｓ１４）。数十サイクルのサーマルサイクルを試料に付与することにより、標的核酸が増幅される。

【0079】

Ｓ１４のサーマルサイクルの間、試料のＰＣＲの進捗を監視するために、流路１２内の試料から発せられる蛍光信号を検出する（Ｓ１６）。そして、検出した蛍光信号に基づいて、リアルタイムＰＣＲ解析を行う（Ｓ１８）。リアルタイムＰＣＲ解析では、横軸をサイクル数（Ｃ）とし、縦軸を蛍光信号強度とした増幅曲線を作成する。試料に対してサーマルサイクルを付与し、試料中の標的核酸が増幅すると、蛍光信号の強度が増加する。蛍光信号強度が指数関数的に立ち上がるサイクル数はＣｔ値（スレッシュホールドサイクル数）と呼ばれ、初期の検体濃度が高くなるにつれ、Ｃｔ値は小さくなる。リアルタイムＰＣＲ解析では、Ｃｔ値を求めるために、蛍光信号強度を正確に測定することが極めて重要である。

【0080】

図８～図１３は、マイクロ流体チップ１０の流路１２内で試料Ｓを移動させたときに、試料Ｓがどのように変化するかを説明するための図である。図８～図１３は、マイクロ流体チップ１０の第１面１４ａに形成された流路１２を概略的に示す。試料Ｓは、ＰＣＲ試薬に血液を直接添加したものである。

【0081】

図８は、試料導入口４４から流路１２内に試料Ｓが導入された直後の状態を示す。導入直後の試料Ｓは、図８に示すように第３蛇行状流路５２内に位置している。導入直後の試料Ｓは、赤色透明である。

【0082】

図９は、第３蛇行状流路５２から第２温度領域４８および接続流路５０を通って、第１温度領域４６に試料Ｓを移動させた状態を示す。上述したように、空気連通口２４，２６を介して流路１２内を加圧または送風することにより、流路１２内で試料を移動させることができる。第１温度領域４６では、約９５℃で１５秒間加熱される。これにより、試料Ｓは赤色透明から、薄茶色の不透明に変化する。

【0083】

図１０は、第１温度領域４６から接続流路５０を通って第２温度領域４８に試料Ｓを移動させた状態を示す。第２温度領域４８では、約６０℃で１５秒間加熱される。これにより、試料Ｓは徐々に固形成分（沈殿物）と透明溶液成分とに分離し始める。試料Ｓをの固形成分は、薄茶色不透明であり、透明溶液成分は、淡褐色透明である。

【0084】

図１１は、第２温度領域４８から接続流路５０を通って第１温度領域４６に試料Ｓを移動させた状態を示す。第１温度領域４６では、約９５℃で１５秒間加熱される。これにより、試料Ｓの固形成分の凝集が進み、有色の固形成分と透明溶液成分との分離がさらに進行する。

【0085】

図１２は、第１温度領域４６から接続流路５０を通って第２温度領域４８に試料Ｓを移動させた状態を示す。第２温度領域４８では、約６０℃で１５秒間加熱される。これにより、試料Ｓの固形成分の凝集がさらに進み、図１２に示すように有色の固形成分と透明溶液成分の分離が明確になってくる。試料Ｓの固形成分は、薄茶色不透明から濃茶色不透明に変化する。透明溶液成分は淡褐色透明である。

【0086】

図１３は、第２温度領域４８から接続流路５０を通って第１温度領域４６に試料Ｓを移動させた状態を示す。第１温度領域４６では、約９５℃で１５秒間加熱される。これにより、試料Ｓの固形成分の凝集がさらに進み、有色の固形成分（濃茶色）と透明溶液成分（淡褐色透明）との分離がさらに進行する。

【0087】

以降同様に、第１温度領域４６と第２温度領域４８との間で試料Ｓを繰り返し（数十サイクル）往復移動させることにより、ＰＣＲが進み、標的核酸が増幅される。この間、試料Ｓは有色の固形成分（濃茶色）と透明溶液成分（淡褐色透明）とに分離されたままである。

【0088】

本発明者は、ＰＣＲ初期の第１温度領域４６と第２温度領域４８との間の数回の往復移動により、上記のように、血液を検体とする試料Ｓが不透明な有色の固形成分と透明溶液成分とに分離されることを見いだした。試薬が移動しない一般的なＰＣＲにおいては、このように血液が加熱変性後に血液成分の分離は起きないので、ＰＣＲ増幅による蛍光信号の強度を正確に測定することは困難であるが、本発明においては、試料Ｓが有色の固形成分と透明溶液成分とに分離されることにより、透明溶液成分から発せられる蛍光信号の強度を正確に測定することができるので、リアルタイムＰＣＲ解析を好適に行うことができる。

【0089】

本実施形態に係るＰＣＲ方法において、流路１２内において試料が固形成分と透明溶液成分とに分離する現象は、試料が流路１２内を移動する過程において、試料が攪拌混合されるためであると推察される。マイクロ流体チップ１０では、第１温度領域４６、第２温度領域４８は、直線状流路と曲線状流路を組み合わせた第１蛇行状流路５４、第２蛇行状流路５６を含んでいる。試料を曲線状流路に流すことにより、単に直線状流路を流すだけの場合よりも試料が攪拌混合されるので、試料の固定成分と透明溶液成分の分離作用が促進される。

【0090】

流路１２の一部の断面積が他の部分の断面積と異なるようにマイクロ流体チップを構成してもよい。この場合、断面積が変化する部分の凹凸で試料がより攪拌混合されるので、試料の固定成分と透明溶液成分の分離作用が促進される。この一例を以下に示す。

【0091】

図１４は、本発明の実施形態に係るＰＣＲ方法に適用可能な別のマイクロ流体チップ７０の第１面１４ａの平面図である。図１４に示すように、マイクロ流体チップ７０では、接続流路５０における検出流路５９の断面積が、第１蛇行状流路５４、第２蛇行状流路５６の断面積よりも大きくなっている。このような流路の断面積が変化する部分の凹凸により、試料がより攪拌混合されるので、試料の固定成分と透明溶液成分の分離作用が促進される。

【0092】

ＰＣＲ試薬は、界面活性剤を含んでもよい。ＰＣＲ試薬に界面活性剤が添加されている場合、流路１２内を流れる間に、試料を好適に混ぜることができる。界面活性剤としては、陽イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、両性イオン界面活性剤、非イオン系界面活性剤のいずれを用いることができ、高分子系のもの及び低分子系のものいずれも使用可能である。界面活性剤の例としては、純石けん分、アルファスルホ脂肪酸エステル塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、しょ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルアミノ脂肪酸塩、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシド、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩を含み、具体的には、N,N-Bis（3-D-gluconamidopropyl）cholamide［BIGCHAP］、N,N-Bis（3-D-gluconamidopropyl）deoxycholamide［Deoxy-BIGCHAP］、NIKKOL BL-9EX ［Polyoxyethylene（9）Lauryl Ether］、Octanoyl-N-methylglucamide ［MEGA-8］、Nonanoyl-N-methylglucamide ［MEGA-9］、Decanoyl-N-methylglucamide ［MEGA-10］、Polyoxyethylene（8）Octylphenyl Ether ［Triton X-114］、Polyoxyethylene（9）Octylphenyl Ether ［NP-40］、Polyoxyethylene（10）Octylphenyl Ether ［Triton X-100］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monolaurate ［Tween 20］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monopalmitate ［Tween 40］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monostearate ［Tween 60］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Monooleate ［Tween 80］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Trioleate、Polyoxyethylene（23）Lauryl Ether ［Brij35］、Polyoxyethylene（20）Cethyl Ether ［Brij58］、n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside、n-Heptyl-β-D-thioglucopyranoside、n-Octyl-β-D-glucopyranoside、n-Octyl-β-D-thioglucopyranoside、n-Nonyl-β-D-thiomaltoside、IGEPAL CA-630、Digitonin、Saponin,from Soybeans、3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonio］-2-hydroxy-1-propanesulfonate ［CHAPSO］、3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonio］-1-propanesulfonate ［CHAPS］、Sodium Dodecylsulfate ［SDS］、Lithium Dodecyl Sulfate ［LDS］、Lithium 3,5-Diiodosalicylate、Tris（hydroxymethyl）aminomethane Dodecyl Sulfate［Tris DS］、Sodium Cholate、N-Lauroylsarcosine、Sodium N-Dodecanoylsalcosinate、Cetyldimethylethylammonium Bromide、Cetyltrimethylammonium Bromide［CTAB］、Cetyltrimethylammonium Chloride、Guanidine Thiocyanateなどが用いられる。

【0093】

ＰＣＲ試薬は、添加剤を含んでもよい。ＰＣＲ試薬に添加剤が添加されている場合、流路１２内を流れる間に、試料を好適に混ぜることができる。これは、血液中のタンパクが変性し、ＰＣＲの邪魔にならないためである。本発明の増幅反応の効率、特異性を高めるために、硫酸アンモニウム、ウシ血清アルブミン、ジメチルスルフォキシド（DMSO）、ジメチルフォルムアミド（DMF）、ベタイン、フォルムアミド、ゼラチン、グリセロール、PEG6000、SDS、スペルミジン、Triton、Triton X-100、尿素などのような添加剤を適切な添加量にして添加すると効果的である。上記物質の添加に加えて、アルカリ溶液を試料に混合することにより効率よく行うことができる。アルカリ溶液としては、アルカリ金属水酸化物の溶液、例えば水酸化ナトリウム溶液及び水酸化カリウム溶液を例示できるが、これらに限定されない。アルカリ濃度（ＯＨ－１の濃度）は、０．１ｍＭ以上、又は１ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは３０ｍＭ以上とすることができる。あるいは、ｐＨ７以上、好ましくはｐＨ８以上、より好ましくはｐＨ９以上とすることができる。アルカリ濃度及びｐＨは、その後の検出または増幅ステップを阻害しない限り、任意の濃度及びｐＨで行なうことができる（例えば１０Ｍ以下）。

【0094】

以下、実施例について説明する。

【0095】

（第１実施例）
第１実施例では、レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置と、ＰＣＲチューブを用いた一般的なリアルタイムＰＣＲ装置とを用いて、血液をＰＣＲ試薬に直接添加した試料を調製し、リアルタイムＰＣＲ測定を行った。

【0096】

以下の条件で、試料を作製した。ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｅｎｖｉｒｏ ｑＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）の２ｘＰＣＲ試薬が２倍希釈になるように、マアジ遺伝子を増幅する配列番号１及び２に記載のプライマー（各０．９μＭ）、配列番号３に記載のプローブ（０．４μＭ）、配列番号４に記載の鋳型ＤＮＡ１０^５コピーを添加したＰＣＲ試薬１９μＬを調製した。そこに全血１μＬまたはｄｄＨ_２Ｏを添加し２０μＬの試料を調製し、各装置の１反応あたりの試料として用いた。以下に配列を示す。
プライマー：5'-CAGATATCGCAACCGCCTTT-3'（配列番号１）
プライマー：5'-CCGATGTGAAGGTAAATGCAAA-3'（配列番号２）
プローブ：5'-[FAM]-TATGCACGCCAACGGCGCCT-[BHQ1]-3'（配列番号３）
鋳型ＤＮＡ：5'CAGATATCGCAACCGCCTTTACATCCGTAGCACACATCTGCCGGGACGTAAACTACGGCTGACTTATTCGCAATATGCACGCCAACGGCGCCTCCTTCTTTTTCATTTGCATTTACCTTCACATCGG-3'（配列番号４）

【0097】

以下にリアルタイムＰＣＲ装置とＰＣＲ条件を示す。レシプロカルフロー式の測定チップおよびリアルタイムＰＣＲ装置は、上述したマイクロ流体チップ１０およびＰＣＲ装置１００に対応する。
（レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置とＰＣＲ条件）
測定機器：PicoGene ＰＣＲ1100（ゴーフォトン社製）
測定チップ：MCP2000 （ゴーフォトン社製）
測定条件：ＰＣＲ1100でのセット値
Hot Start 95℃,15sec.
Denature 95℃,3.5sec.
Annealing & Extension 60℃,15sec.
Cycle 50
（一般的なリアルタイムＰＣＲ装置とＰＣＲ条件）
測定機器：CFX96 Touch Deep Well（バイオラッド社製）
測定チューブ：８連チューブ
測定条件：CFX96 Touch Deep Wellの実測定値（ＰＣＲ1100と同様）
Hot Start 95℃,15sec.
Denature 95℃,3.5sec.
Annealing & Extension 60℃,15sec.
Cycle 50

【0098】

レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置を用いると、ＰＣＲ試薬に血液を添加した試料は流路１２中において９５℃の第１温度領域４６と６０℃の第２温度領域４８に交互に送液されることで、試料が攪拌混合されながら血液の凝固が進み、その固形成分と透明溶液成分が分離されて、その透明溶液成分の蛍光信号を測定することが可能となった。

【0099】

図１５（ａ）および図１５（ｂ）は、レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置を用いたときの増幅曲線を示す。図１５（ａ）は血液添加ありの試料のリアルタイム増幅曲線であり、図１５（ｂ）は血液添加なしの試料のリアルタイム増幅曲線である。図１５（ａ）および図１５（ｂ）に示すように、血液添加ありの試料と血液添加なしの試料とで同様な増幅曲線を得ることができ、そのＰＣＲ増幅の判定は非常に容易である。

【0100】

一般的なリアルタイムＰＣＲ装置では、ＰＣＲチューブを用いて測定を行った。一般的なリアルタイムＰＣＲ装置においては、ＰＣＲチューブ内に試料が静置されたままの状態でＰＣＲ反応が進む。血液添加なしの試料においては、ＰＣＲ前とＰＣＲ中の両方とも試料は透明であり、ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号を十分に測定できた。一方、血液添加ありの試料においては、ＰＣＲ前は赤色透明であったものが、ＰＣＲ中は、ＰＣＲ初期の加熱変性により血液成分の褐色化が進み、試料の蛍光透過度が下がる。そのため、ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号を十分に測定することが不可能となった。

【0101】

図１６は、一般的なリアルタイムＰＣＲ装置を用いたときの増幅曲線を示す。図１６に示すように、血液添加なしの試料の増幅曲線は、曲線の立ち上がりが明確であり、明瞭にＰＣＲ増幅を判定できる。一方、血液添加ありの試料の増幅曲線は、曲線の立ち上がりが不明確であり、ＰＣＲ増幅の判定が非常に困難である。

【0102】

（第２実施例）
第２実施例では、レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置と、ＰＣＲチューブを用いた一般的なリアルタイムＰＣＲ装置とを用いて、血液をＲＴ－ＰＣＲ試薬に直接添加した試料を調製し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ測定を行った。

【0103】

以下の条件で、試料を作製した。ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｅｎｖｉｒｏ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）の付属の逆転写酵素を所定量添加し、２ｘＰＣＲ試薬が２倍希釈になるようにしてＳＦＴＳ遺伝子を増幅する配列番号５及び６に記載のプライマー（各０．９μＭ）、配列番号７に記載のプローブ（０．３μＭ）、配列番号８に記載の鋳型ＲＮＡ１０^５コピーを添加したＲＴ-ＰＣＲ試薬１９μＬを調製した。そこに全血１μＬまたはｄｄＨ_２Ｏを添加し２０μＬの試料を調製し、各装置の１反応あたりの試料として用いた。以下に配列を示す。
プライマー：5'-ACCTGTCTCCTTCAGCTTCT-3'（配列番号５）
プライマー：5'-TGTCAGAGTGGTCCAGGATT-3'（配列番号６）
プローブ：5'-FAM-TGGAGTTTGGTGAGCAGCAGC-BHQ1-3'（配列番号７）
鋳型ＲＮＡ：5'ACCTGTCTCCTTCAGCTTCTTGATGATCAATGCAGGATCAAGGCCTTCATAGGCCAGCTCTCTCGCAAAATCTTCAAGCTCAGTCAAATTGAGCTGCTGCTCACCAAACTCCACTGCAATCCTGGACCACTCTGACA-3'（配列番号８）

【0104】

以下にリアルタイムＰＣＲ装置とＰＣＲ条件を示す。レシプロカルフロー式の測定チップおよびリアルタイムＰＣＲ装置は、上述したマイクロ流体チップ１０およびＰＣＲ装置１００に対応する。
（レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置とＰＣＲ条件）
測定機器：PicoGene ＰＣＲ1100（ゴーフォトン社製）
測定チップ：MCP2000 （ゴーフォトン社製）
測定条件：ＰＣＲ1100でのセット値
RT 50℃,5min.
Hot Start 95℃,15sec.
Denature 95℃,3.5sec.
Annealing & Extension 60℃,20sec.
Cycle 45
（一般的なリアルタイムＰＣＲ装置とＰＣＲ条件）
測定機器：CFX96 Touch Deep Well（バイオラッド社製）
測定チューブ：８連チューブ
測定条件：CFX96 Touch Deep Wellの実測定値（ＰＣＲ1100と同様）
RT 50℃,5min.
Hot Start 95℃,15sec.
Denature 95℃,3.5sec.
Annealing & Extension 60℃,20sec.
Cycle 45

【0105】

レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置を用いると、鋳型がＤＡＮのときと同様にＲＮＡにおいても、ＲＴ－ＰＣＲ試薬に血液を添加した試料は流路１２中において５０℃で５分の逆転写反応後、９５℃の第１温度領域４６と６０℃の第２温度領域４８に交互に送液されることで、試料が攪拌混合されながら血液の凝固が進み、その固形成分と透明溶液成分が分離されて、その透明溶液成分の蛍光信号を測定することが可能となった。

【0106】

図１７（ａ）および図１７（ｂ）は、レシプロカルフロー式のリアルタイムＰＣＲ装置を用いたときの増幅曲線を示す。図１７（ａ）は血液添加ありの試料のリアルタイム増幅曲線であり、図１７（ｂ）は血液添加なしの試料のリアルタイム増幅曲線である。図１７（ａ）および図１７（ｂ）に示すように、血液添加ありの試料と血液添加なしの試料とで同様な増幅曲線を得ることができ、そのＰＣＲ増幅の判定は非常に容易である。

【0107】

一方、一般的なリアルタイムＰＣＲ装置においては、ＰＣＲプローブ内に試料が静置されたままの状態でＲＴ－ＰＣＲ反応が進む。血液添加なしの試料においては、ＰＣＲ前とＰＣＲ中の両方とも試料は透明であり、ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号を十分に測定できた。血液添加ありの試料においては、ＰＣＲ前は赤色透明であったものが、ＰＣＲ中は、ＰＣＲ初期の加熱変性により血液成分の褐色化が進み、試料の蛍光透過度が下がる。そのため、ＲＴ－ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号を十分に測定することが不可能となった。

【0108】

図１８は、一般的なリアルタイムＰＣＲ装置を用いたときの増幅曲線を示す。図１８に示すように、血液添加なしの試料の増幅曲線は、曲線の立ち上がりが明確であり、明瞭にＰＣＲ増幅を判定できる。一方、血液添加ありの試料の増幅曲線は、曲線の立ち上がりが不明確であり、ＰＣＲ増幅の判定が非常に困難である。

【0109】

以上の第１実施例および第２実施例のＰＣＲ結果から、本実施形態に係るＰＣＲ方法は、血液を直接ＰＣＲ試薬に添加した試料に対して、ＰＣＲ増幅に伴う蛍光信号の測定を好適に行うことができ、リアルタイムＰＣＲ解析を適切に行うことができることが分かる。本実施形態に係るＰＣＲ方法は、血液を直接ＰＣＲ試薬に添加した試料を用いるため、煩雑な核酸の精製作業等は不要である。そのため、勘弁で迅速なリアルタイムＰＣＲが可能である。

【0110】

以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

【符号の説明】

【0111】

１０、７０ マイクロ流体チップ、 １２ 流路、 １４ 基板、 １６ 第１封止フィルム、 １８ 第２封止フィルム、 ２０ 第３封止フィルム、 ２４ 第１空気連通口、 ２６ 第２空気連通口、 ２８ 第１フィルタ、 ３０ 第２フィルタ、 ３２ 第１チャンバ、 ３４ 第２チャンバ、 ４０ 第１エアダクト、 ４２ 第２エアダクト、 ４６ 第１温度領域、 ４８ 第２温度領域、 ５４ 第１蛇行状流路、 ５６ 第２蛇行状流路、 ５８ 蛍光検出領域、 ５９ 検出流路、 ６０ 第１拡幅流路、 ６２ 第２拡幅流路、 １００ ＰＣＲ装置、 １０１ 設置部、 １０２ 第１ヒータ、 １０４ 第２ヒータ、 １０６ 蛍光検出装置、 １０８ 光学ヘッド、 １１０ 制御装置、 １２０ 送液システム、 １２２ 第１三方弁、 １２４ 第２三方弁、 １２６ 加圧チャンバ、 １２８ 送液用ポンプ。

【0112】

配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プローブ
配列番号４：鋳型ＤＮＡ
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プローブ
配列番号８：鋳型ＲＮＡ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2025023506000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2023-10-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液をＰＣＲ試薬に添加して試料を調製する工程と、
マイクロ流体チップの流路内で前記試料を繰り返し往復移動させて、前記試料にサーマルサイクルを付与する工程と、
前記試料のＰＣＲの進捗を監視するために、前記流路内の前記試料から蛍光を検出する工程と、
を備え、
前記流路は、直線状流路と曲線状流路を組み合わせた蛇行状流路を含み、
前記サーマルサイクルを付与する工程において、前記蛇行状流路を含む前記流路内で前記試料を繰り返し往復移動させることにより、前記流路内において前記試料が有色の固形成分と透明溶液成分とに分離され、
前記蛍光を検出する工程において、前記透明溶液成分から発せられる蛍光を検出することを特徴とするＰＣＲ方法。

【請求項2】

前記試料における血液の添加率は０．０１％～２０％、好ましくは０．１％～１０％、より好ましくは１％～５％であることを特徴とする請求項１に記載のＰＣＲ方法。

【請求項3】

前記ＰＣＲ試薬は、界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰＣＲ方法。

【請求項4】

前記ＰＣＲ試薬は、添加剤を含むことを特徴とする請求項１に記載のＰＣＲ方法。

【請求項5】

前記流路は、第１温度に維持される第１温度領域と、前記第１温度と異なる第２温度に維持される第２温度領域と、前記第１温度領域と前記第２温度領域とを接続する接続流路と、を含み、
前記接続流路の断面積は、前記第１温度領域および前記第２温度領域に含まれる流路の断面積よりも大きいことを特徴とする請求項１に記載のＰＣＲ方法。