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特開2025-26122転写制御因子タンパク質分解促進組成物およびそれを含むがん治療薬
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025026122
(43)【公開日】2025-02-21
(54)【発明の名称】転写制御因子タンパク質分解促進組成物およびそれを含むがん治療薬
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20250214BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250214BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250214BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20250214BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20250214BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20250214BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20250214BHJP
A61K 31/395 20060101ALI20250214BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P43/00 105
A61P35/00
A61K31/506
A61K31/519
A61K31/4709
A61K31/5377
A61K31/395
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023131505
(22)【出願日】2023-08-10
(71)【出願人】
【識別番号】505232346
【氏名又は名称】学校法人星薬科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】大竹 史明
(72)【発明者】
【氏名】森 友紀
(72)【発明者】
【氏名】秋月 慶乃
(72)【発明者】
【氏名】本田 陸斗
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZC20
4C084ZC41
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC33
4C086BC36
4C086BC46
4C086BC73
4C086CB05
4C086GA07
4C086GA09
4C086GA10
4C086GA12
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC01
4C086ZC20
(57)【要約】
【課題】転写制御因子タンパク質の分解誘導そのものを促進することができ、複数の共供与によって分解誘導の効果を高められ、また、高い治療効果を持つがん治療薬として有用である転写制御因子タンパク質分解促進組成物およびそれを用いた治療薬を提供する。
【解決手段】ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤を含み、転写制御因子タンパク質の分解を促進する、転写制御因子タンパク質分解促進組成物およびそれを用いた治療薬である。
【選択図】なし
【解決手段】ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤を含み、転写制御因子タンパク質の分解を促進する、転写制御因子タンパク質分解促進組成物およびそれを用いた治療薬である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤を含み、転写制御因子タンパク質の分解を促進する、転写制御因子タンパク質分解促進組成物。
【請求項2】
前記転写制御因子タンパク質が、ＢＲＤ、ＢＲＧ１、ＢＲＤ９、ＥＳＲ１またはＣＤＫ９である、請求項１に記載の転写制御因子タンパク質分解促進組成物。
【請求項3】
転写制御因子タンパク質のユビキチン化を介した前記転写制御因子タンパク質の分解を促進する、請求項１または２に記載の転写制御因子タンパク質分解促進組成物。
【請求項4】
ＭＺ１、ＡＲＶ７７１、ｄＢＥＴ６、ＡＣＢＩ１、ｄＢＲＤ９－ＡまたはＡＲＶ４７１を介したタンパク質分解を促進する、請求項１または２に記載の転写制御因子タンパク質分解促進組成物。
【請求項5】
前記ＰＡＲＧ阻害剤としてＰＤＤ０００１７２７３、前記ＰＥＲＫ阻害剤としてＧＳＫ２６０６４１４、ＧＳＫ２６５６１５７もしくはＡＭＧ－ＰＥＲＫ、前記ＨＳＰ９０阻害剤としてＬｕｍｉｎｅｓｐｉｂもしくは１７－ＡＡＧ、または前記ヒストンアセチル化酵素阻害剤としてＡ４８５もしくはＳＧＣ－ＣＢＰ３０を用いる、請求項１または２に記載の転写制御因子タンパク質分解促進組成物。
【請求項6】
請求項１または２に記載の転写制御因子タンパク質分解促進組成物を含む治療薬。
【請求項7】
がん治療薬である、請求項６に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＢＲＤタンパク質などの転写制御因子タンパク質の分解を促進する成分を含む転写制御因子タンパク質分解促進組成物、およびそれを含む治療薬に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞内には、疾患の原因となるタンパク質が存在し、その疾患原因タンパク質を特異的に細胞内で分解して除去することで、当該疾患の治療薬に応用することが期待される。標的タンパク質分解の原理としては、細胞内にもともと備わっているユビキチン・プロテアソーム系を利用するものが考えらえている。すなわち、細胞内で不要になったタンパク質は、小分子量のユビキチンタンパク質が複数付与され、いわゆるタグ付けが行われる機構が存在する。ユビキチン化によりタグ付けされたタンパク質は、大型のタンパク質複合体であるタンパク質分解酵素、プロテアソームによって分解される。そこで、標的とするタンパク質の特異的なユビキチン化、または標的とするタンパク質の特異的にプロテアソームによる分解を促進することができれば、標的とするタンパク質の特異的な分解を促進することができると考えられる。
例えば、標的タンパク質に結合する物質と、ユビキチン化酵素（タグ付加酵素、ユビキチンリガーゼとも呼ばれる）に結合する薬剤とを連結させたハイブリッド型の化合物を用いると、標的タンパク質とユビキチン化酵素とを近接させて強制的にユビキチン化を引きおこして分解を誘導することができる。
例えば、標的タンパク質に結合する物質と、ユビキチン化酵素（タグ付加酵素、ユビキチンリガーゼとも呼ばれる）に結合する薬剤とを連結させたハイブリッド型の化合物を用いると、標的タンパク質とユビキチン化酵素とを近接させて強制的にユビキチン化を引きおこして分解を誘導することができる。
【0003】
ここで、がん治療薬における標的タンパク質としてＢＲＤ４が注目されている。ＢＲＤ４は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤＴと共にＢＥＴファミリータンパク質として知られ、がん細胞において転写制御因子として遺伝子発現を制御し、炎症、がん細胞の増殖、腫瘍形成などに関与することが知られている。このため、ＢＲＤ４はがん、炎症性疾患や生活習慣病の治療の標的としても注目されている。
ＰＲＯＴＡＣ（標的分解誘導薬）として、前記ユビキチン化酵素のＣＲＬ２と、Ｅ３ユビキチンリガーゼ基質認識サブユニットであるＶＨＬからなるユビキチン化酵素複合体ＣＲＬ２（ＶＨＬ）を利用したハイブリッド型化合物が知られている。ＢＲＤ４を標的とするＰＲＯＴＡＣの化合物として、ＶＨＬを認識するリガンドとＢＲＤ４を認識するリガンドとを連結した化合物ＭＺ１が報告されている。
ＰＲＯＴＡＣ（標的分解誘導薬）として、前記ユビキチン化酵素のＣＲＬ２と、Ｅ３ユビキチンリガーゼ基質認識サブユニットであるＶＨＬからなるユビキチン化酵素複合体ＣＲＬ２（ＶＨＬ）を利用したハイブリッド型化合物が知られている。ＢＲＤ４を標的とするＰＲＯＴＡＣの化合物として、ＶＨＬを認識するリガンドとＢＲＤ４を認識するリガンドとを連結した化合物ＭＺ１が報告されている。
【0004】
一方、本発明者らによる非特許文献１では、細胞を分解誘導剤で処理した時に標的タンパク質としてＢＲＤ４に結合するタンパク質の探索を介し、これまで知られるＣＲＬ２（ＶＨＬ）とは別のユビキチン付加酵素であるＴＲＩＰ１２を同定している。ＴＲＩＰ１２は、ＣＲＬ２（ＶＨＬ）が標的タンパク質にユビキチンを付加した後で結合してくることを見出した。また、分解誘導剤の作用におけるＴＲＩＰ１２の役割を明らかにするために、ＴＲＩＰ１２を持たないがん細胞を作製している。ＴＲＩＰ１２を持たないがん細胞では、分解誘導剤で処理した際の標的タンパク質の分解が遅れ、さらに、この分解が引き起こすがん細胞の細胞死も抑制されることを見出した。ＴＲＩＰ１２が分解誘導剤の作用を促進する分子メカニズムをさらに検討し、ＣＲＬ２（ＶＨＬ）とＴＲＩＰ１２とでは、前記ユビキチンが複数結合したユビキチン鎖の形状が異なり、ＣＲＬ２（ＶＨＬ）とＴＲＩＰ１２の両方の働きにより特殊な形状の鎖を合成することを見出した。すなわち、ＴＲＩＰ１２はタンパク質分解に適した形状のユビキチン鎖の合成を手助けする酵素であることを見出した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｋａｉｈｏ－Ｓｏｍａ ｅｔ ａｌ．， ２０２１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１， １４１１－１４２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
従来の技術では、分解誘導に関与するＭＺ１など、個別の分解誘導薬の活性を高める研究はされているが、分解誘導そのものを促進する因子や化合物は、ほとんど知られていない。例えば、ＢＲＤ４などの特定の標的タンパク質のユビキチン化や、プロテアソームによる分解を促進する因子や、抑制因子に作用して阻害することで分解誘導を促進する因子が見つかれば、がん等の疾患に大きく関与する転写因子やクロマチン調節因子といった、標的タンパク質の分解に有効であると考えられる。例えば、既知のＰＲＯＴＡＣに用いる因子に加えてそれらの因子を加えることで、治療効果を大きく高めることが期待される。また、既知のそれらの因子にかえて用いる選択肢としても期待できる。
【0007】
本発明は上記のような事情を鑑みてなされたものであり、転写制御因子タンパク質の分解誘導そのものを促進することができ、複数の共供与によって分解誘導の効果を高められ、また、高い治療効果を持つがん治療薬として有用である転写制御因子タンパク質分解促進組成物およびそれを用いた治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を解決するため、本発明は以下の態様を有する。
本発明の第１の態様は、
ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤を含み、転写制御因子タンパク質の分解を促進する、転写制御因子タンパク質分解促進組成物である。
本発明の第１の態様は、
ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤を含み、転写制御因子タンパク質の分解を促進する、転写制御因子タンパク質分解促進組成物である。
【0009】
本発明の第２の態様は、
前記転写制御因子タンパク質が、ＢＲＤ、ＢＲＧ１、ＢＲＤ９、ＥＳＲ１またはＣＤＫ９である、第１の態様の転写制御因子タンパク質分解促進組成物である。
前記転写制御因子タンパク質が、ＢＲＤ、ＢＲＧ１、ＢＲＤ９、ＥＳＲ１またはＣＤＫ９である、第１の態様の転写制御因子タンパク質分解促進組成物である。
【0010】
本発明の第３の態様は、
転写制御因子タンパク質のユビキチン化を介した前記転写制御因子タンパク質の分解を促進する、第１または第２の態様の転写制御因子タンパク質分解促進組成物である。
転写制御因子タンパク質のユビキチン化を介した前記転写制御因子タンパク質の分解を促進する、第１または第２の態様の転写制御因子タンパク質分解促進組成物である。
【0011】
本発明の第４の態様は、
ＭＺ１、ＡＲＶ７７１、ｄＢＥＴ６、ＡＣＢＩ１、ｄＢＲＤ９－ＡまたはＡＲＶ４７１を介したタンパク質分解を促進する、第１から第３の態様のいずれかのタンパク質分解促進組成物である。
ＭＺ１、ＡＲＶ７７１、ｄＢＥＴ６、ＡＣＢＩ１、ｄＢＲＤ９－ＡまたはＡＲＶ４７１を介したタンパク質分解を促進する、第１から第３の態様のいずれかのタンパク質分解促進組成物である。
【0012】
本発明の第５の態様は、
前記ＰＡＲＧ阻害剤としてＰＤＤ０００１７２７３、前記ＰＥＲＫ阻害剤としてＧＳＫ２６０６４１４、ＧＳＫ２６５６１５７もしくはＡＭＧ－ＰＥＲＫ、前記ＨＳＰ９０阻害剤としてＬｕｍｉｎｅｓｐｉｂもしくは１７－ＡＡＧ、または前記ヒストンアセチル化酵素阻害剤としてＡ４８５もしくはＳＧＣ－ＣＢＰ３０を用いる、第１から第４の態様のいずれかの転写制御因子タンパク質分解促進組成物である。
前記ＰＡＲＧ阻害剤としてＰＤＤ０００１７２７３、前記ＰＥＲＫ阻害剤としてＧＳＫ２６０６４１４、ＧＳＫ２６５６１５７もしくはＡＭＧ－ＰＥＲＫ、前記ＨＳＰ９０阻害剤としてＬｕｍｉｎｅｓｐｉｂもしくは１７－ＡＡＧ、または前記ヒストンアセチル化酵素阻害剤としてＡ４８５もしくはＳＧＣ－ＣＢＰ３０を用いる、第１から第４の態様のいずれかの転写制御因子タンパク質分解促進組成物である。
【0013】
本発明の第６の態様は、
第１から第５のいずれかに記載の転写制御因子タンパク質分解促進組成物を含む、治療薬である。
第１から第５のいずれかに記載の転写制御因子タンパク質分解促進組成物を含む、治療薬である。
【0014】
本発明の第７の態様は、
がん治療薬である、第６の態様の治療薬である。
がん治療薬である、第６の態様の治療薬である。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、転写制御因子タンパク質タンパク質の分解誘導そのものを促進することができ、複数の共供与によって分解誘導の効果を高められ、また、高い治療効果を持つがん治療薬として有用である転写制御因子タンパク質分解促進組成物およびそれを用いた治療薬が得られる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】本実施例で用いたＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４－ＨＣＴ１１６細胞における、ＭＺ１タンパク質の添加量あたりのＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の量のグラフ図である。
【図2】本実施例の化合物スクリーニングの結果を示す模式図である。
【図3】本実施例の化合物のＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の分解効果を示すグラフ図である。
【図4】本実施例のＰＥＲＧ阻害剤を添加した細胞抽出液のウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【図5】本実施例の細胞抽出液のうち、ＢＲＤ４のタンパク質量の定量を示すグラフ図である。
【図6】本実施例の発光強度で測定できる細胞生存率の結果のグラフ図である。
【図7】本実施例のカスパーゼ３／７の活性強度で測定できるアポトーシス応答の結果のグラフ図である。
【図8】本実施例のユビキチン化されたＢＲＤ４，２のウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【図9】本実施例のＣＵＬ２のウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【図10】本実施例のＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤によるウェスタンブロッティングの結果を示す写真図である。
【図11】本実施例のＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤によるウェスタンブロッティングの結果を示す写真図である。
【図12】本実施例のＧＳＫ２６０６４１４とＳＩＭ１の添加によるＢＲＤ４とＢＲＤ２の分解を示すウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【図13】本実施例の細胞生存の測定結果のグラフ図である。
【図14】本実施例の各ヒストンアセチル化酵素阻害剤およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いたウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【図15】本実施例のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いたウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【図16】本実施例のヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰを用いたウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【図17】本実施例のヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰを用いた細胞生存の結果を示すグラフ図である。
【図18】本実施例のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いてＢＲＤ４－ＭＺ１－ＶＨＬとの関係を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【図19】本実施例のヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰを用いてＢＲＤ４－ＭＺ１－ＶＨＬとの関係を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【図20】本実施例のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いてＢＲＤ４の局在を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【図21】本実施例のヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰを用いてＢＲＤ４の局在を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明に係る転写制御因子タンパク質分解促進組成物および治療薬について、実施形態を示して説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【0018】
（転写制御因子タンパク質分解促進組成物）
本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤を含む。
本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤を含む。
【0019】
本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、転写制御因子タンパク質の分解を促進する。本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物が標的とする転写制御因子タンパク質としては、転写を制御する機能にかかわるタンパク質を広く指すが、主にＢＲＤ、ＢＲＧ１、ＢＲＤ９、ＥＳＲ１（ＥＲ－α）またはＣＤＫ９などを標的とすることができる。
ＢＲＤファミリーのタンパク質、ＢＲＧ１、ＢＲＤ９、ＣＤＫ９は、クロマチン調節因子として知られる。ＥＳＲ１はいわゆる転写因子として知られる。
ＢＲＤファミリーのタンパク質、ＢＲＧ１、ＢＲＤ９、ＣＤＫ９は、クロマチン調節因子として知られる。ＥＳＲ１はいわゆる転写因子として知られる。
【0020】
このうち、分解を促進する標的のＢＲＤタンパク質としては、ＢＲＤ、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４またはＢＲＤＴなどから選択できるが、好ましくは、後述するＭＺ１により分解が促進されるＢＲＤ２、ＢＲＤ４を標的とすることができる。ＢＲＤタンパク質としては、ＢＲＤ４がより好ましい。
ＢＲＤタンパク質は、各種動物のものであってもよく、本実施形態ではヒトＢＲＤ、特にヒトＢＲＤ４（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：２３４７６）であることが好ましい。
ＢＲＤタンパク質は、各種動物のものであってもよく、本実施形態ではヒトＢＲＤ、特にヒトＢＲＤ４（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：２３４７６）であることが好ましい。
【0021】
本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、転写制御因子タンパク質のユビキチン化を介した前記転写制御因子タンパク質の分解を促進することが好ましい。
したがって、本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物を用いる系では、ユビキチン－プロテアソーム系のタンパク質分解に必要な他の成分を含んでいることが好ましい。
例えば、ユビキチン、プロテアソーム、ＭＺ１や他に後述する分解誘導薬、または、その他の分解促進因子などが含まれる系であることが好ましい。これらを含んでいる系としては、生物内の環境、例えば細胞内が挙げられる。
または、ユビキチン－プロテアソーム系が機能する他の成分の存在下であれば、Ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境でも用いることができる。
また、本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、他のタンパク質分解に関与する成分と共に用いられてもよい。こうした成分には、標的タンパク質のユビキチン－プロテアソーム系による分解に関与する他の物質や、他のタンパク質分解系に関与する成分が含まれる。
したがって、本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物を用いる系では、ユビキチン－プロテアソーム系のタンパク質分解に必要な他の成分を含んでいることが好ましい。
例えば、ユビキチン、プロテアソーム、ＭＺ１や他に後述する分解誘導薬、または、その他の分解促進因子などが含まれる系であることが好ましい。これらを含んでいる系としては、生物内の環境、例えば細胞内が挙げられる。
または、ユビキチン－プロテアソーム系が機能する他の成分の存在下であれば、Ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境でも用いることができる。
また、本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、他のタンパク質分解に関与する成分と共に用いられてもよい。こうした成分には、標的タンパク質のユビキチン－プロテアソーム系による分解に関与する他の物質や、他のタンパク質分解系に関与する成分が含まれる。
【0022】
本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、ＢＲＤが標的である場合、ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤を含み、ＭＺ１を介した転写制御因子タンパク質の分解を促進することが好ましい。
前述したように、ＢＲＤ、特にＢＲＤ２とＢＲＤ４は、分解誘導薬ＭＺ１により分解が促進される。ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤は、ＭＺ１によるタンパク質分解を有効に促進することができる。従来、分解誘導薬ＭＺ１を用いたＰＲＯＴＡＣが知られている。
前述したように、ＢＲＤ、特にＢＲＤ２とＢＲＤ４は、分解誘導薬ＭＺ１により分解が促進される。ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤は、ＭＺ１によるタンパク質分解を有効に促進することができる。従来、分解誘導薬ＭＺ１を用いたＰＲＯＴＡＣが知られている。
【0023】
また、転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、ＡＲＶ７７１、ｄＢＥＴ６、ＡＣＢＩ１、ｄＢＲＤ９－ＡまたはＡＲＶ４７１を介したタンパク質分解を促進することも好ましい。
転写制御因子タンパク質の分解を促進する因子、すなわち分解誘導薬としては、例えばＭＺ１同様にＣＲＬ２（ＶＨＬ）を標的とするＡＲＶ７７１、ＣＲＬ４（ＣＲＢＮ）を標的とするｄＢＥＴ６を介した反応であってもよい。
また、分解の対象となる転写制御因子タンパク質がＢＲＧ１であるときは、ＰＲＯＴＡＣの分解誘導薬としてはＡＣＢＩ１を好適に用いることができる。分解の対象となる転写制御因子タンパク質がＢＲＤ９であるときは、ＰＲＯＴＡＣの分解誘導薬としてはｄＢＲＤ９－Ａを好適に用いることができる。分解の対象となる転写制御因子タンパク質がＥＳＲ１であるときは、ＰＲＯＴＡＣの分解誘導薬としてはＡＲＶ４７１を好適に用いることができる。分解の対象となる転写制御因子タンパク質がＣＤＫ９であるときは、ＰＲＯＴＡＣの分解誘導薬としてはＴｈａｌ－ＳＮＳを好適に用いることができる。
転写制御因子タンパク質の分解を促進する因子、すなわち分解誘導薬としては、例えばＭＺ１同様にＣＲＬ２（ＶＨＬ）を標的とするＡＲＶ７７１、ＣＲＬ４（ＣＲＢＮ）を標的とするｄＢＥＴ６を介した反応であってもよい。
また、分解の対象となる転写制御因子タンパク質がＢＲＧ１であるときは、ＰＲＯＴＡＣの分解誘導薬としてはＡＣＢＩ１を好適に用いることができる。分解の対象となる転写制御因子タンパク質がＢＲＤ９であるときは、ＰＲＯＴＡＣの分解誘導薬としてはｄＢＲＤ９－Ａを好適に用いることができる。分解の対象となる転写制御因子タンパク質がＥＳＲ１であるときは、ＰＲＯＴＡＣの分解誘導薬としてはＡＲＶ４７１を好適に用いることができる。分解の対象となる転写制御因子タンパク質がＣＤＫ９であるときは、ＰＲＯＴＡＣの分解誘導薬としてはＴｈａｌ－ＳＮＳを好適に用いることができる。
【0024】
本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤のいずれかを含んでいてもよく、また、複数を含んでいてもよい。本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、前記のいずれかを２以上含み、前記成分が共投与されることが特に好ましい。
例えば、ＰＡＲＧ阻害剤であるＰＤＤ０００１２２７３またはＰＥＲＫ阻害剤であるＧＳＫ２６０６４１４と、ヒストンアセチル化酵素ＣＢＰの阻害剤であるＳＧＣ－ＣＢＰ３０を共投与することで、ＢＲＤ４の分解がさらに促進される。
例えば、ＰＡＲＧ阻害剤であるＰＤＤ０００１２２７３またはＰＥＲＫ阻害剤であるＧＳＫ２６０６４１４と、ヒストンアセチル化酵素ＣＢＰの阻害剤であるＳＧＣ－ＣＢＰ３０を共投与することで、ＢＲＤ４の分解がさらに促進される。
【0025】
また、本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、
（Ａ）ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤のいずれか１以上と、
（Ｂ）ＨＳＰ９０阻害剤と、
を含むことも好ましい。
すなわち、前記（Ａ）がＭＺ１を介したＢＲＤとＭＺ１の結合、および、ＢＲＤのユビキチン化を促進すると考えられているのに対して、（Ｂ）ＨＳＰ９０阻害剤は、ユビキチン化されたＢＲＤのプロテアソーム依存性分解を促進すると考えられている。したがって、前記（Ａ）と（Ｂ）の両方を含む転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、特に標的がＢＲＤである場合に、ＢＲＤとＭＺ１の結合、ＢＲＤのユビキチン化、およびＢＲＤのプロテアソーム依存性分解がいずれも促進されるので、転写制御因子タンパク質の分解促進の効果がより高いことが期待される。
（Ａ）ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤またはヒストンアセチル化酵素阻害剤のいずれか１以上と、
（Ｂ）ＨＳＰ９０阻害剤と、
を含むことも好ましい。
すなわち、前記（Ａ）がＭＺ１を介したＢＲＤとＭＺ１の結合、および、ＢＲＤのユビキチン化を促進すると考えられているのに対して、（Ｂ）ＨＳＰ９０阻害剤は、ユビキチン化されたＢＲＤのプロテアソーム依存性分解を促進すると考えられている。したがって、前記（Ａ）と（Ｂ）の両方を含む転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、特に標的がＢＲＤである場合に、ＢＲＤとＭＺ１の結合、ＢＲＤのユビキチン化、およびＢＲＤのプロテアソーム依存性分解がいずれも促進されるので、転写制御因子タンパク質の分解促進の効果がより高いことが期待される。
【0026】
本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物が含み得るＰＡＲＧ阻害剤は、ＰＡＲＧ（ポリ（ＡＤＰ－リボース）グリコヒドロラーゼ）を阻害する化合物を広く指す。ＰＡＲＧはＤＮＡ損傷時にポリ（ＡＤＰ－リボース）を分解し、ＤＮＡ修復に関与していることが知られている。
ＰＡＲＧ阻害剤としては、例えば、ＰＤＤ０００１７２７２、ＰＤＤ０００１７２７３、ＰＤＤ０００１７２７８、ＰＤＤ０００３１７０５、ＣＯＨまたはＪＡ２１３１などが知られている。
本実施形態では、ＰＡＲＧ阻害剤としてＰＤＤ０００１７２７３（ＣＡＳ：１９４５９５０－２１－９）を用いることがより好ましい。
ＰＡＲＧ阻害剤としては、例えば、ＰＤＤ０００１７２７２、ＰＤＤ０００１７２７３、ＰＤＤ０００１７２７８、ＰＤＤ０００３１７０５、ＣＯＨまたはＪＡ２１３１などが知られている。
本実施形態では、ＰＡＲＧ阻害剤としてＰＤＤ０００１７２７３（ＣＡＳ：１９４５９５０－２１－９）を用いることがより好ましい。
【0027】
本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物が含み得るＰＥＲＫ阻害剤は、ＰＥＲＫ（パンクレアチックＥＲキナーゼまたはＰＫＲ様ＥＲキナーゼ）を阻害する化合物を広く指す。ＰＥＲＫは小胞体ストレスのセンサータンパク質のひとつで、ＰＥＲＫの活性化によって翻訳が抑制され、異常タンパク質応答関連遺伝子の転写誘導が起こることが知られている。
ＰＥＲＫ阻害剤としては、例えば、ＧＳＫ２６０６４１４、ＧＳＫ２６５６１５７、ＡＭＧ－ＰＥＲＫまたはＩＳＲＩＢ（融合ストレス応答阻害剤）トランス異性体などが知られている。
本実施形態では、ＰＥＲＫ阻害剤としてＧＳＫ２６０６４１４（ＣＡＳ：１３３７５３１－３６－８）、ＧＳＫ２６５６１５７（ＣＡＳ：１３３７５３２－２９－２）もしくはＡＭＧ－ＰＥＲＫ４４（ＣＡＳ：１８８３５４８－８４－２）を用いることがより好ましい。
ＰＥＲＫ阻害剤としては、例えば、ＧＳＫ２６０６４１４、ＧＳＫ２６５６１５７、ＡＭＧ－ＰＥＲＫまたはＩＳＲＩＢ（融合ストレス応答阻害剤）トランス異性体などが知られている。
本実施形態では、ＰＥＲＫ阻害剤としてＧＳＫ２６０６４１４（ＣＡＳ：１３３７５３１－３６－８）、ＧＳＫ２６５６１５７（ＣＡＳ：１３３７５３２－２９－２）もしくはＡＭＧ－ＰＥＲＫ４４（ＣＡＳ：１８８３５４８－８４－２）を用いることがより好ましい。
【0028】
本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物が含み得るＨＳＰ９０阻害剤は、ＨＳＰ９０（熱ショックタンパク質の分子量９０ｋＤａ類）を阻害する化合物を広く指す。ＨＳＰ９０は熱ショックタンパク質のひとつで、細胞恒常性を制御し、分子シャペロンとしても機能し、タンパク質の安定化に関わることが知られている。
ＨＳＰ９０阻害剤としては、ＣＨ５１３８３０３、ＨＳＰ９９０、ＢＩＩＢ０２１、ＫＷ－２４７８、Ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂ（ＳＴＡ－９０９０）、Ｔａｎｅｓｐｉｍｙｃｉｎ（１７－ＡＡＧ）、ＮＭＳ－Ｅ９７３、Ｌｕｍｉｎｅｓｐｉｂ（ＮＶＰ－ＡＵＹ９２２、ＶＥＲ－５２２９６）、Ｏｎａｌｅｓｐｉｂ（ＡＴ１３３８７）、ＶＥＲ－５８５８９、Ｐｉｍｉｔｅｓｐｉｂ（ＴＡＳ－１１６）、ＸＬ８８８、ＳＮＸ－２１１２、ＳＮＸ－５４２２、ＶＥＲ－４９００９、ＰＵ－Ｈ７１、ＮＶＰ－ＢＥＰ８００、Ａｌｖｅｓｐｉｍｙｃｉｎ、またはＧａｌｄｅｎａｍｙｃｉｎなどが知られている。
本実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤としてＬｕｍｉｎｅｓｐｉｂ（ＣＡＳ：７４７４１２－４９－３）、もしくは１７－ＡＡＧ（ＣＡＳ：７５７４７－１４－７）を用いることがより好ましい。
ＨＳＰ９０阻害剤としては、ＣＨ５１３８３０３、ＨＳＰ９９０、ＢＩＩＢ０２１、ＫＷ－２４７８、Ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂ（ＳＴＡ－９０９０）、Ｔａｎｅｓｐｉｍｙｃｉｎ（１７－ＡＡＧ）、ＮＭＳ－Ｅ９７３、Ｌｕｍｉｎｅｓｐｉｂ（ＮＶＰ－ＡＵＹ９２２、ＶＥＲ－５２２９６）、Ｏｎａｌｅｓｐｉｂ（ＡＴ１３３８７）、ＶＥＲ－５８５８９、Ｐｉｍｉｔｅｓｐｉｂ（ＴＡＳ－１１６）、ＸＬ８８８、ＳＮＸ－２１１２、ＳＮＸ－５４２２、ＶＥＲ－４９００９、ＰＵ－Ｈ７１、ＮＶＰ－ＢＥＰ８００、Ａｌｖｅｓｐｉｍｙｃｉｎ、またはＧａｌｄｅｎａｍｙｃｉｎなどが知られている。
本実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤としてＬｕｍｉｎｅｓｐｉｂ（ＣＡＳ：７４７４１２－４９－３）、もしくは１７－ＡＡＧ（ＣＡＳ：７５７４７－１４－７）を用いることがより好ましい。
【0029】
本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物が含み得るヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）阻害剤は、ヒストンアセチル化酵素を阻害する化合物を広く指す。ヒストンアセチル化酵素は、ＤＮＡとヒストンの複合体をアセチル化し、ＢＲＤの転写制御の機能に関係する点では、ＢＲＤ４のＢＤとアセチル化ヒストンとの結合により、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写伸長を促進することが知られている。
ヒストンアセチル化酵素阻害剤としては、Ｃ６４６、ＳＧＣ－ＣＢＰ３０、ＭＧ１４９、Ｇｉｎｋｇｏｌｉｃ Ａｃｉｄ、Ａ－４８５、ＷＭ－８０１４、ＣＰＴＨ２、ＨＡＴインヒビターＩＩ、またはＮｉｃＣｕｒなどが知られている。
本実施形態では、ヒストンアセチル化酵素阻害剤としてＡ－４８５（ＣＡＳ：１８８９２７９－１６－６）またはＳＧＣ－ＣＢＰ３０（ＣＡＳ：１６１３６９５－１４－９）を用いることがより好ましい。
ヒストンアセチル化酵素阻害剤としては、Ｃ６４６、ＳＧＣ－ＣＢＰ３０、ＭＧ１４９、Ｇｉｎｋｇｏｌｉｃ Ａｃｉｄ、Ａ－４８５、ＷＭ－８０１４、ＣＰＴＨ２、ＨＡＴインヒビターＩＩ、またはＮｉｃＣｕｒなどが知られている。
本実施形態では、ヒストンアセチル化酵素阻害剤としてＡ－４８５（ＣＡＳ：１８８９２７９－１６－６）またはＳＧＣ－ＣＢＰ３０（ＣＡＳ：１６１３６９５－１４－９）を用いることがより好ましい。
【0030】
また、本実施形態の転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、ＢＲＧ１、ＢＲＤ９、ＥＳＲ１が標的である場合は、前記ＳＧＣ－ＣＢＰを含有することが好ましい。これらの標的はＳＧＣ－ＣＢＰにより有効に分解が促進される。
また、ＣＤＫ９が標的である場合は、ＳＧＣ－ＣＢＰ，ＰＤＤ，ＧＳＫ，Ｌｕｍｉｎｅｓｐｉｂの４種のいずれかを含むことが好ましく、２種以上を含むことがさらに好ましい。ＣＤＫ９はこれらにより有効に分解が促進される。
また、ＣＤＫ９が標的である場合は、ＳＧＣ－ＣＢＰ，ＰＤＤ，ＧＳＫ，Ｌｕｍｉｎｅｓｐｉｂの４種のいずれかを含むことが好ましく、２種以上を含むことがさらに好ましい。ＣＤＫ９はこれらにより有効に分解が促進される。
【0031】
（治療薬）
本実施形態の治療薬は、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物を含む。
治療薬は、転写制御因子タンパク質を分解されることにより治療、予防または病態改善などの効果を発揮し得るものであれば、いかなる疾患にも使用することができる。具体的には、本実施形態で標的とする転写制御因子タンパク質、特にＢＲＤ４は遺伝子発現の制御、炎症、がん細胞の増殖、腫瘍形成などに関与すると考えられるため、これらが関係する疾患、例えばがん、炎症性疾患や生活習慣病の治療薬として使用できる。
本実施形態の治療薬は、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物を含む。
治療薬は、転写制御因子タンパク質を分解されることにより治療、予防または病態改善などの効果を発揮し得るものであれば、いかなる疾患にも使用することができる。具体的には、本実施形態で標的とする転写制御因子タンパク質、特にＢＲＤ４は遺伝子発現の制御、炎症、がん細胞の増殖、腫瘍形成などに関与すると考えられるため、これらが関係する疾患、例えばがん、炎症性疾患や生活習慣病の治療薬として使用できる。
【0032】
前記治療薬は、がん治療薬であることが好ましい。がんに対する治療は一般に需要が特に大きい。
【0033】
（本実施形態の効果）
本実施形態によれば、転写制御因子タンパク質の分解誘導そのものを促進することができ、複数の共供与によって分解誘導の効果を高められ、また、高い治療効果を持つがん治療薬として有用である転写制御因子タンパク質分解促進組成物およびそれを用いた治療薬が得られる。
本実施形態によれば、転写制御因子タンパク質の分解誘導そのものを促進することができ、複数の共供与によって分解誘導の効果を高められ、また、高い治療効果を持つがん治療薬として有用である転写制御因子タンパク質分解促進組成物およびそれを用いた治療薬が得られる。
【0034】
本発明者らは、がんに関連する転写制御因子タンパク質のうち、ＢＲＤタンパク質、特にＢＲＤ４タンパク質のユビキチン－プロテアソーム系での分解に関与する因子をスクリーニングし、既に性質が知られている阻害剤、ＰＡＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ヒストンアセチル化酵素阻害剤等を見出した。
これらの結果により、既に性質が知られている阻害剤の新たな用途として、該阻害剤の働きによって標的分解を促進できる機序を見出した。そして、これらの阻害剤を含む、ＢＲＤ４などのＢＲＤタンパク質、すなわち転写制御因子タンパク質の分解促進組成物を見出した。この転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、直接に標的であるタンパク質を分解する作用を用いる他に、従来知られている転写制御因子タンパク質分解機序を持つ組成物と併用することもできる。そのため、従来知られているタンパク質分解の応用法、例えばＰＲＯＴＡＣによる標的タンパク質の分解による治療法が実用化された際に、合わせて投与することで、促進剤として利用することも可能となる。
これらの結果により、既に性質が知られている阻害剤の新たな用途として、該阻害剤の働きによって標的分解を促進できる機序を見出した。そして、これらの阻害剤を含む、ＢＲＤ４などのＢＲＤタンパク質、すなわち転写制御因子タンパク質の分解促進組成物を見出した。この転写制御因子タンパク質分解促進組成物は、直接に標的であるタンパク質を分解する作用を用いる他に、従来知られている転写制御因子タンパク質分解機序を持つ組成物と併用することもできる。そのため、従来知られているタンパク質分解の応用法、例えばＰＲＯＴＡＣによる標的タンパク質の分解による治療法が実用化された際に、合わせて投与することで、促進剤として利用することも可能となる。
【0035】
（本実施形態の別の態様）
本実施形態は、別の側面として、以下のような態様も含む。
本実施形態の別の態様は、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物を用いた、治療薬の製造方法である。
本実施形態の別の態様は、治療薬を製造するための、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物の使用である。
本実施形態の別の態様は、がん治療のための、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物の使用である。
本実施形態の別の態様は、がん治療における使用のための、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物の使用である。
本実施形態の別の態様は、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物を用いた、がん治療方法である。
本実施形態は、別の側面として、以下のような態様も含む。
本実施形態の別の態様は、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物を用いた、治療薬の製造方法である。
本実施形態の別の態様は、治療薬を製造するための、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物の使用である。
本実施形態の別の態様は、がん治療のための、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物の使用である。
本実施形態の別の態様は、がん治療における使用のための、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物の使用である。
本実施形態の別の態様は、前記転写制御因子タンパク質分解促進組成物を用いた、がん治療方法である。
【実施例0036】
以下、実施例を示す。なお、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0037】
（試験例）
（スクリーニング用の細胞株）
転写制御因子タンパク質であるＢＲＤ４の分解に関与する因子をスクリーニングするため、使用する細胞株の樹立を行った。細胞としては、ＨＣＴ１１６細胞のＢＲＤ４遺伝子座に、ゲノム編集によりＨｉＢｉＴタグ（１１アミノ酸）を組み込んだＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４－ＨＣＴ１１６細胞を用いた。この細胞を細胞溶解（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ）してＬｇＢｉＴを加えると、ＢＲＤ４融合タンパク質量を発光検出することができる。
図１は、ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４－ＨＣＴ１１６細胞における、ＭＺ１タンパク質の添加量あたりのＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の量のグラフ図である。
ＢＲＤ４の分解に関与することがわかっているＭＺ１によって、ＮａＮｏＬｕｃの発光強度、すなわちＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４タンパク質量が減少していることが確認できる。すなわち、ＭＺ１添加濃度依存的にＢＲＤ４融合タンパク質の分解を検出した。
（スクリーニング用の細胞株）
転写制御因子タンパク質であるＢＲＤ４の分解に関与する因子をスクリーニングするため、使用する細胞株の樹立を行った。細胞としては、ＨＣＴ１１６細胞のＢＲＤ４遺伝子座に、ゲノム編集によりＨｉＢｉＴタグ（１１アミノ酸）を組み込んだＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４－ＨＣＴ１１６細胞を用いた。この細胞を細胞溶解（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ）してＬｇＢｉＴを加えると、ＢＲＤ４融合タンパク質量を発光検出することができる。
図１は、ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４－ＨＣＴ１１６細胞における、ＭＺ１タンパク質の添加量あたりのＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の量のグラフ図である。
ＢＲＤ４の分解に関与することがわかっているＭＺ１によって、ＮａＮｏＬｕｃの発光強度、すなわちＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４タンパク質量が減少していることが確認できる。すなわち、ＭＺ１添加濃度依存的にＢＲＤ４融合タンパク質の分解を検出した。
【0038】
（化合物のスクリーニング）
スクリーニングの対象となる化合物群として、Ｓｅｌｌｅｃｋ社の既知化合物ライブラリーの一部を使用した。９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅで、化合物各種（１０μＭ）を４時間添加後、３０ｎＭ ＭＺ１を２時間添加し、発光プレートリーダーで測定した（ｎ＝３）。
図２にスクリーニングの結果を示す。（ａ）は、ＭＺ非存在下（－）、存在下（＋）で実験を行い、それぞれ、促進化合物無し（ＤＭＳＯ添加）を基準として、分解促進（Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）／抑制（Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ）の度合いをＬｏｇ２で表し、スクリーニング対象となる化合物の分布を示した模式図である。ＭＺ１非存在下でのＢＲＤ４量変動が小さく、ＭＺ１存在下でのＢＲＤ４分解を変化させるもの（図中、Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ付近の化合物）を選んだ。（ｂ）はＭＺ非存在下（－）、存在下（＋）のプロット図である。（ｂ）の右上（分解抑制化合物）には、既知のプロテアソーム阻害剤が同定されたことから、本実験系の構築が確認できた。
スクリーニングの対象となる化合物群として、Ｓｅｌｌｅｃｋ社の既知化合物ライブラリーの一部を使用した。９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅで、化合物各種（１０μＭ）を４時間添加後、３０ｎＭ ＭＺ１を２時間添加し、発光プレートリーダーで測定した（ｎ＝３）。
図２にスクリーニングの結果を示す。（ａ）は、ＭＺ非存在下（－）、存在下（＋）で実験を行い、それぞれ、促進化合物無し（ＤＭＳＯ添加）を基準として、分解促進（Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）／抑制（Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ）の度合いをＬｏｇ２で表し、スクリーニング対象となる化合物の分布を示した模式図である。ＭＺ１非存在下でのＢＲＤ４量変動が小さく、ＭＺ１存在下でのＢＲＤ４分解を変化させるもの（図中、Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ付近の化合物）を選んだ。（ｂ）はＭＺ非存在下（－）、存在下（＋）のプロット図である。（ｂ）の右上（分解抑制化合物）には、既知のプロテアソーム阻害剤が同定されたことから、本実験系の構築が確認できた。
【0039】
このスクリーニングで特にヒットした化合物の３種類は、ＰＥＲＧ阻害剤であるＰＤＤ１７２７３、ＰＥＲＫ阻害剤であるＧＳＫ２６０６４１４、ＨＳＰ９０阻害剤であるＬｕｍｉｎｅｓｐｉｂであった。
この３種類の化合物を、前記したＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４－ＨＣＴ１１６細胞に対して、濃度を１μＭ，３μＭ，１０μＭの３段階で加え、発光の減少、すなわちＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の量を測定した。
図３はこの３種の化合物のＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の分解効果を示すグラフ図である。
ＭＺ１の存在下（ＭＺ＋）においては、３種の阻害剤はいずれも、阻害剤の濃度依存的にＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４が減少していることがわかる。すなわち、この３種の化合物は、ＢＲＤ４の分解を促進することが明らかとなった。
この３種類の化合物を、前記したＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４－ＨＣＴ１１６細胞に対して、濃度を１μＭ，３μＭ，１０μＭの３段階で加え、発光の減少、すなわちＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の量を測定した。
図３はこの３種の化合物のＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の分解効果を示すグラフ図である。
ＭＺ１の存在下（ＭＺ＋）においては、３種の阻害剤はいずれも、阻害剤の濃度依存的にＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４が減少していることがわかる。すなわち、この３種の化合物は、ＢＲＤ４の分解を促進することが明らかとなった。
【0040】
また、この結果から、本発明者らは、この３種の阻害剤の他、ＰＥＲＧ阻害剤、ＰＥＲＫ阻害剤およびＨＳＰ９０阻害剤にＢＲＤの分解を促進する化合物が含まれることも予測し、以後の試験に反映した。
【0041】
（ＰＥＲＧ阻害剤ＰＤＤ１７２７３の活性検討）
前記ＰＥＲＧ阻害剤のＰＤＤ１７２７３（ＰＤＤ）を、ＨｅＬａ細胞に３μＭ ＰＤＤ，１００ｎＭ ＭＺ１を図示した時間で添加し、細胞全抽出液を作製し、ウェスタンブロッティングを行った。なお、以下を含め、ウェスタンブロットは適切なシグナルの比較ができるよう抗体濃度等の条件を適宜調整して行った。
図４は、ＰＥＲＧ阻害剤を添加した細胞抽出液のウェスタンブロットの結果を示す写真図である。左軸は各タンパク質の抗体名を示した。ＭＺ１の軸の数値はＭＺ１添加後の時間、ＰＤＤの－、＋はＰＥＲＧ阻害剤のＰＤＤ１７２７３の添加の有無を示した。
図５は、前記細胞抽出液のうち、ＢＲＤ４のタンパク質量の定量を示した。タンパク質量は、図４のウェスタンブロットのバンド強度を定量したものである。ＭＺ１添加前を１として、バンド強度が何倍かによって測定した。
図に示すように、ＰＤＤを添加しなくともＭＺ１によってＢＲＤ４のタンパク質量は減少する。しかし、ＰＤＤの添加によって、ＢＲＤ４のタンパク質量はさらに大きく減少し、ＭＺ１添加の４時間後には顕著な差が見られた（図中、枠内）。
ＰＤＤの添加によって、ＢＲＤ４，ＢＲＤ２、ＢＲＤ３の分解に関して促進が見られた。一方、経路に関係するユビキチンリガーゼの量には変化が見られなかった。
ここで、ＢＲＤ２およびＢＲＤ３はＭＺ１による分解の程度は弱いことが知られる一方で、ＢＲＤ４はＭＺ１の標的タンパク質である。上記の結果からは、ＰＡＲＧ阻害剤であるＰＤＤ１７２７３は、ＢＲＤ４およびＢＲＤ２、ＢＲＤ３をいずれも分解を促進することが明らかとなった。
前記ＰＥＲＧ阻害剤のＰＤＤ１７２７３（ＰＤＤ）を、ＨｅＬａ細胞に３μＭ ＰＤＤ，１００ｎＭ ＭＺ１を図示した時間で添加し、細胞全抽出液を作製し、ウェスタンブロッティングを行った。なお、以下を含め、ウェスタンブロットは適切なシグナルの比較ができるよう抗体濃度等の条件を適宜調整して行った。
図４は、ＰＥＲＧ阻害剤を添加した細胞抽出液のウェスタンブロットの結果を示す写真図である。左軸は各タンパク質の抗体名を示した。ＭＺ１の軸の数値はＭＺ１添加後の時間、ＰＤＤの－、＋はＰＥＲＧ阻害剤のＰＤＤ１７２７３の添加の有無を示した。
図５は、前記細胞抽出液のうち、ＢＲＤ４のタンパク質量の定量を示した。タンパク質量は、図４のウェスタンブロットのバンド強度を定量したものである。ＭＺ１添加前を１として、バンド強度が何倍かによって測定した。
図に示すように、ＰＤＤを添加しなくともＭＺ１によってＢＲＤ４のタンパク質量は減少する。しかし、ＰＤＤの添加によって、ＢＲＤ４のタンパク質量はさらに大きく減少し、ＭＺ１添加の４時間後には顕著な差が見られた（図中、枠内）。
ＰＤＤの添加によって、ＢＲＤ４，ＢＲＤ２、ＢＲＤ３の分解に関して促進が見られた。一方、経路に関係するユビキチンリガーゼの量には変化が見られなかった。
ここで、ＢＲＤ２およびＢＲＤ３はＭＺ１による分解の程度は弱いことが知られる一方で、ＢＲＤ４はＭＺ１の標的タンパク質である。上記の結果からは、ＰＡＲＧ阻害剤であるＰＤＤ１７２７３は、ＢＲＤ４およびＢＲＤ２、ＢＲＤ３をいずれも分解を促進することが明らかとなった。
【0042】
ついで、前記ＰＤＤによる細胞死誘導の促進を調べた。
ＨｅＬａ細胞に３μＭ ＰＤＤを添加、６時間後にＭＺ１を添加、３日後に細胞生存をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｒ）２．０ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
図６に発光強度で測定できる細胞生存率の結果のグラフ図を示す。ＰＤＤの添加により、ＭＺ１による細胞死は促進されることが明らかとなった。
ＨｅＬａ細胞に３μＭ ＰＤＤを添加、６時間後にＭＺ１を添加、３日後に細胞生存をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｒ）２．０ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
図６に発光強度で測定できる細胞生存率の結果のグラフ図を示す。ＰＤＤの添加により、ＭＺ１による細胞死は促進されることが明らかとなった。
【0043】
ついで、前記ＰＤＤによるアポトーシスの促進を調べた。
ＨｅＬａ細胞に３μＭ ＰＤＤを添加、６時間後に図示した濃度のＭＺ１を添加、２４時間後にアポトーシス応答を、ＡｐｏＬｉｖｅ－Ｇｌｏ（ＴＭ）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
図７にカスパーゼ３／７の活性強度で測定できるアポトーシス応答の結果のグラフ図を示す。ＰＤＤの添加により、ＭＺ１によるアポトーシスは促進されることが明らかとなった。
ＨｅＬａ細胞に３μＭ ＰＤＤを添加、６時間後に図示した濃度のＭＺ１を添加、２４時間後にアポトーシス応答を、ＡｐｏＬｉｖｅ－Ｇｌｏ（ＴＭ）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
図７にカスパーゼ３／７の活性強度で測定できるアポトーシス応答の結果のグラフ図を示す。ＰＤＤの添加により、ＭＺ１によるアポトーシスは促進されることが明らかとなった。
【0044】
ついで、前記ＰＤＤによるユビキチン鎖形成への影響を調べた。
ＨｅＬａ細胞に３μＭ ＰＤＤを添加し、５時間後にＭＺ１を添加し、１時間後に回収した。ＴＵＢＥ２－ａｇａｒｏｓｅでユビキチン鎖を回収し、ＢＲＤ２，ＢＲＤ４の抗体でウェスタンブロッティングした。
図８にユビキチン化されたＢＲＤ４，２のウェスタンブロットの結果の写真を示す。ＴＵＢＥのレーン（ユビキチン鎖を回収したサンプル）については、ＰＤＤの添加により、ＢＲＤ４、ＢＲＤ２の抗体に反応する分子量が増大したバンドが強くなり、ＢＲＤ４、ＢＲＤ２にユビキチン鎖が結合している。未結合のバンドについては減少が見られる。すなわち、ＰＤＤの添加によりＭＺ１によるユビキチン化が促進されることが明らかとなった。
ＨｅＬａ細胞に３μＭ ＰＤＤを添加し、５時間後にＭＺ１を添加し、１時間後に回収した。ＴＵＢＥ２－ａｇａｒｏｓｅでユビキチン鎖を回収し、ＢＲＤ２，ＢＲＤ４の抗体でウェスタンブロッティングした。
図８にユビキチン化されたＢＲＤ４，２のウェスタンブロットの結果の写真を示す。ＴＵＢＥのレーン（ユビキチン鎖を回収したサンプル）については、ＰＤＤの添加により、ＢＲＤ４、ＢＲＤ２の抗体に反応する分子量が増大したバンドが強くなり、ＢＲＤ４、ＢＲＤ２にユビキチン鎖が結合している。未結合のバンドについては減少が見られる。すなわち、ＰＤＤの添加によりＭＺ１によるユビキチン化が促進されることが明らかとなった。
【0045】
ついで、前記ＰＤＤによるＢＲＤ４、ＢＲＤ２とＣＵＬ２タンパク質の相互作用に対する影響を調べた。ＢＲＤ４，２は、ＭＺ１が結合した後、ＭＺ１を介してＶＨＬタンパク質に結合する。そのＶＨＬタンパク質にＣＵＬ２タンパク質が結合し、ユビキチン化が促進されてプロテアソームによる分解に至ることが知られている。
２９３Ｔ細胞にＦＬＡＧタグを結合させたＢＲＤ４（ＦＬＡＧ－ＢＲＤ４）とＨＡタグを結合させたＶＨＬ（ＨＡ－ＶＨＬ）を発現し、ＰＤＤおよびＭＺ１を添加して４５分後に回収し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した。相互作用したＣＵＬ２をウェスタンブロッティングで検出した。
図９にＣＵＬ２のウェスタンブロットの結果の写真を示す。抗ＦＬＡＧ抗体で沈降しているので、ＦＬＡＧ－ＢＲＤ４およびそれに結合したタンパク質が示されており、たとえばＢＲＤ４，ＣＵＬ２、ＶＨＬの全ての抗体に反応しているレーンは、この３種が結合しているタンパク質が沈降されたレーンである。ＭＺ１のみを添加した細胞でもＢＲＤ４、ＣＵＬ２，ＶＨＬの結合体のバンドが見られるが、ＰＤＤを加えた場合はＣＵＬ２、ＶＨＬのバンドがさらに促進された。
これらの結果から、ＰＤＤはＭＺ１とＢＲＤ４，２の複合体形成の経路のみならず、ＢＲＤ４，２とＶＨＬ，ＣＵＬ２の複合体の形成の経路も促進し、ユビキチン化を促進することが推測された。
２９３Ｔ細胞にＦＬＡＧタグを結合させたＢＲＤ４（ＦＬＡＧ－ＢＲＤ４）とＨＡタグを結合させたＶＨＬ（ＨＡ－ＶＨＬ）を発現し、ＰＤＤおよびＭＺ１を添加して４５分後に回収し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した。相互作用したＣＵＬ２をウェスタンブロッティングで検出した。
図９にＣＵＬ２のウェスタンブロットの結果の写真を示す。抗ＦＬＡＧ抗体で沈降しているので、ＦＬＡＧ－ＢＲＤ４およびそれに結合したタンパク質が示されており、たとえばＢＲＤ４，ＣＵＬ２、ＶＨＬの全ての抗体に反応しているレーンは、この３種が結合しているタンパク質が沈降されたレーンである。ＭＺ１のみを添加した細胞でもＢＲＤ４、ＣＵＬ２，ＶＨＬの結合体のバンドが見られるが、ＰＤＤを加えた場合はＣＵＬ２、ＶＨＬのバンドがさらに促進された。
これらの結果から、ＰＤＤはＭＺ１とＢＲＤ４，２の複合体形成の経路のみならず、ＢＲＤ４，２とＶＨＬ，ＣＵＬ２の複合体の形成の経路も促進し、ユビキチン化を促進することが推測された。
【0046】
（ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤の活性検討）
ＨＣＴ１１６細胞を用いて、ＧＳＫ２６０６４１４および他のＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤Ｌｕｍｉｎｅｓｐｉｂの活性を検討した。
ＨＣＴ１１６細胞において、１０μＭの化合物ＰＥＲＫ阻害剤ＧＳＫ２６０６４１４（ＧＳＫ）、ＰＥＲＫ阻害剤ＧＳＫ２６５６１５７、ＰＥＲＫ阻害剤ＡＭＧ－ＰＥＲＫ、ＨＳＰ９０阻害剤Ｌｕｍｉｎｅｓｐｉｂ（Ｌｕｍｉ），ＨＳＰ９０阻害剤１７－ＡＡＧを添加し、４時間後にＭＺ１を添加、１～２時間後に回収し、抗ＢＲＤ４抗体および抗アクチン抗体によるウェスタンブロッティングを行った。
図１０にＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤によるウェスタンブロッティングの結果を示す。なお、左軸のＢＲＤ４（ＪＥＳＳ）は定量ウェスタンブロット装置（プロテインシンプル社）を用いたもの、Ｐｏｎｃｅａｕはポンソーを用いたタンパク質染色である。
図の結果からは、スクリーニングで得られたＧＳＫ２６０６４１４、Ｌｕｍｉｎｅｓｐｉｂの他のＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤の添加によっても、ＭＺ１のみの添加に比べてＢＲＤ４の分解の強い促進が見られた。多くのＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤によりＢＲＤ４の分解が促進する可能性が示された。
ＨＣＴ１１６細胞を用いて、ＧＳＫ２６０６４１４および他のＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤Ｌｕｍｉｎｅｓｐｉｂの活性を検討した。
ＨＣＴ１１６細胞において、１０μＭの化合物ＰＥＲＫ阻害剤ＧＳＫ２６０６４１４（ＧＳＫ）、ＰＥＲＫ阻害剤ＧＳＫ２６５６１５７、ＰＥＲＫ阻害剤ＡＭＧ－ＰＥＲＫ、ＨＳＰ９０阻害剤Ｌｕｍｉｎｅｓｐｉｂ（Ｌｕｍｉ），ＨＳＰ９０阻害剤１７－ＡＡＧを添加し、４時間後にＭＺ１を添加、１～２時間後に回収し、抗ＢＲＤ４抗体および抗アクチン抗体によるウェスタンブロッティングを行った。
図１０にＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤によるウェスタンブロッティングの結果を示す。なお、左軸のＢＲＤ４（ＪＥＳＳ）は定量ウェスタンブロット装置（プロテインシンプル社）を用いたもの、Ｐｏｎｃｅａｕはポンソーを用いたタンパク質染色である。
図の結果からは、スクリーニングで得られたＧＳＫ２６０６４１４、Ｌｕｍｉｎｅｓｐｉｂの他のＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤の添加によっても、ＭＺ１のみの添加に比べてＢＲＤ４の分解の強い促進が見られた。多くのＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤によりＢＲＤ４の分解が促進する可能性が示された。
【0047】
また、ＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤によるユビキチン化の活性を調べた。同様に薬剤を添加したＨＣＴ１１６細胞を用い、ユビキチン鎖をＴＵＢＥを用いて回収した。
図１１にＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤によるウェスタンブロッティングの結果を示す。ユビキチン鎖はＢ４Ｄ１抗体を用いて検出している。各阻害剤の添加により、ユビキチン化が促進されることが明らかとなった。
図１１にＰＥＲＫ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤によるウェスタンブロッティングの結果を示す。ユビキチン鎖はＢ４Ｄ１抗体を用いて検出している。各阻害剤の添加により、ユビキチン化が促進されることが明らかとなった。
【0048】
（ＰＥＲＫ阻害剤ＧＳＫ２６０６４１４およびＳＩＭ１の活性検討）
ＰＥＲＫ阻害剤のＧＳＫ２６０６４１４について、さらにＢＲＤ分解促進活性の検討を行った。
ＧＳＫ（ＧＳＫ２６０６４１４）と、ＢＲＤ及びＶＨＬに結合することが知られるＳＩＭ１（Nature Chemical Biology, 17 (2021), pp1157-1167）によるＢＲＤ２、４の分解について調べた。
図１２は、ＧＳＫ２６０６４１４とＳＩＭ１の添加によるＢＲＤ４とＢＲＤ２の分解を示すウェスタンブロットの結果を示す写真図である。図に示すように、ＧＳＫの添加と、ＳＩＭ１の濃度に依存してＢＲＤ４、ＢＲＤ２が分解されている。
ついで、前記ＨＣＴ１１６細胞にＧＳＫ２６０６４１４とＳＩＭ１を添加し、細胞生存を３日後のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを用いて測定した。
図１３は、細胞生存の測定結果のグラフ図である。ＳＩＭ１の濃度に依存して細胞生存率の低下が見られた。
ＰＥＲＫ阻害剤のＧＳＫ２６０６４１４について、さらにＢＲＤ分解促進活性の検討を行った。
ＧＳＫ（ＧＳＫ２６０６４１４）と、ＢＲＤ及びＶＨＬに結合することが知られるＳＩＭ１（Nature Chemical Biology, 17 (2021), pp1157-1167）によるＢＲＤ２、４の分解について調べた。
図１２は、ＧＳＫ２６０６４１４とＳＩＭ１の添加によるＢＲＤ４とＢＲＤ２の分解を示すウェスタンブロットの結果を示す写真図である。図に示すように、ＧＳＫの添加と、ＳＩＭ１の濃度に依存してＢＲＤ４、ＢＲＤ２が分解されている。
ついで、前記ＨＣＴ１１６細胞にＧＳＫ２６０６４１４とＳＩＭ１を添加し、細胞生存を３日後のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを用いて測定した。
図１３は、細胞生存の測定結果のグラフ図である。ＳＩＭ１の濃度に依存して細胞生存率の低下が見られた。
【0049】
（ヒストンアセチル化酵素阻害剤およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によるＢＲＤ分解への影響）
ＢＲＤ４とアセチル化したヒストンの結合により転写が促進されることが知られている。そこで発明者らは、ヒストンアセチル化、ヒストン脱アセチル化の酵素阻害剤が、それぞれＢＲＤ４と関与し、ＰＲＯＴＡＣの効果に関連することを予測した。そこで、ヒストンアセチル化酵素阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤のＢＲＤ４分解への関与を調べた。
ヒストンアセチル化酵素阻害剤としてはＡ４８５、ＳＧＣ－ＣＢＰを用いた。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としてはｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いた。
ＢＲＤ４とアセチル化したヒストンの結合により転写が促進されることが知られている。そこで発明者らは、ヒストンアセチル化、ヒストン脱アセチル化の酵素阻害剤が、それぞれＢＲＤ４と関与し、ＰＲＯＴＡＣの効果に関連することを予測した。そこで、ヒストンアセチル化酵素阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤のＢＲＤ４分解への関与を調べた。
ヒストンアセチル化酵素阻害剤としてはＡ４８５、ＳＧＣ－ＣＢＰを用いた。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としてはｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いた。
【0050】
図１４は、前記各阻害剤を用いたウェスタンブロットの結果を示す写真図である。前記ＨＣＴ１１６細胞に、図中に示した濃度、時間でそれぞれの阻害剤を添加し、細胞全抽出液を調製した。その後、前記試験例と同様にウェスタンブロッティングを行った。
図の結果から、Ａ４８５、ＳＧＣ－ＣＢＰ（ヒストンアセチル化酵素阻害剤）はＢＲＤ４分解を促進すること、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ（ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬、ＨＤＡＣ）はＢＲＤ４分解を阻害することが明らかとなった。
図の結果から、Ａ４８５、ＳＧＣ－ＣＢＰ（ヒストンアセチル化酵素阻害剤）はＢＲＤ４分解を促進すること、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ（ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬、ＨＤＡＣ）はＢＲＤ４分解を阻害することが明らかとなった。
【0051】
ついで、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とユビキチン鎖形成の関係について調べた。
図１５は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いたウェスタンブロットの結果を示す写真図である。前記ＨＣＴ１１６細胞に、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを６時間、ＭＺ１およびＭＧ１３２を１時間添加し、細胞抽出液を作製した。前記同様のユビキチン鎖を結合するＴＵＢＥ－アガロース複合体を用いて、ユビキチン鎖をプルダウンしたサンプルおよびプルダウン前のサンプル（ｉｎｐｕｔ）について、ウェスタンブロッティングを行った。図に示すように、ＴＵＢＥはリジン２９、４８、６３を介して結合しているユビキチン鎖にそれぞれ反応するＫ２９ＴＵＢＥ、Ｋ４８ＴＵＢＥ、Ｋ６３ＴＵＢＥを用いている。
図に示すように、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤ＶｏｒｉｎｏｓｔａｔはＭＺ１による、ＢＲＤ４のＫ２９，Ｋ４８，Ｋ６３を介したユビキチン鎖を減少させることが明らかになった。すなわち、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤はユビキチン－プロテアソーム系を介したＢＲＤ４の分解を阻害することが示唆された。
図１５は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いたウェスタンブロットの結果を示す写真図である。前記ＨＣＴ１１６細胞に、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを６時間、ＭＺ１およびＭＧ１３２を１時間添加し、細胞抽出液を作製した。前記同様のユビキチン鎖を結合するＴＵＢＥ－アガロース複合体を用いて、ユビキチン鎖をプルダウンしたサンプルおよびプルダウン前のサンプル（ｉｎｐｕｔ）について、ウェスタンブロッティングを行った。図に示すように、ＴＵＢＥはリジン２９、４８、６３を介して結合しているユビキチン鎖にそれぞれ反応するＫ２９ＴＵＢＥ、Ｋ４８ＴＵＢＥ、Ｋ６３ＴＵＢＥを用いている。
図に示すように、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤ＶｏｒｉｎｏｓｔａｔはＭＺ１による、ＢＲＤ４のＫ２９，Ｋ４８，Ｋ６３を介したユビキチン鎖を減少させることが明らかになった。すなわち、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤はユビキチン－プロテアソーム系を介したＢＲＤ４の分解を阻害することが示唆された。
【0052】
ついで、ヒストンアセチル化酵素阻害剤とユビキチン鎖形成の関係について調べた。
図１６は、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰを用いたウェスタンブロットの結果を示す写真図である。前記ＨＣＴ１１６細胞に、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを６時間、ＭＺ１およびＭＧ１３２を１時間添加し、細胞抽出液を作製した。ＴＵＢＥ－アガロース複合体（ＴＵＢＥはそれぞれ前記と同様）を用いて、ユビキチン鎖をプルダウンしたサンプルおよびプルダウン前のサンプル（ｉｎｐｕｔ）について、ウェスタンブロッティングを行った。
図に示すように、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰはＭＺ１による、ＢＲＤ４のＫ２９，Ｋ４８，Ｋ６３を介したユビキチン鎖を増加させることが明らかになった。すなわち、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤はユビキチン－プロテアソーム系を介したＢＲＤ４の分解を促進することが示唆された。
図１６は、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰを用いたウェスタンブロットの結果を示す写真図である。前記ＨＣＴ１１６細胞に、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを６時間、ＭＺ１およびＭＧ１３２を１時間添加し、細胞抽出液を作製した。ＴＵＢＥ－アガロース複合体（ＴＵＢＥはそれぞれ前記と同様）を用いて、ユビキチン鎖をプルダウンしたサンプルおよびプルダウン前のサンプル（ｉｎｐｕｔ）について、ウェスタンブロッティングを行った。
図に示すように、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰはＭＺ１による、ＢＲＤ４のＫ２９，Ｋ４８，Ｋ６３を介したユビキチン鎖を増加させることが明らかになった。すなわち、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤はユビキチン－プロテアソーム系を介したＢＲＤ４の分解を促進することが示唆された。
【0053】
図１７は、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰを用いた細胞生存の結果を示すグラフ図である。ＨＣＴ１１６細胞において、横軸に図示した濃度のＭＺ１、およびＳＧＣ－ＣＢＰの添加（＋）と無添加（－）について、３日後に細胞生存をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを用いて測定し、縦軸を発光強度としてプロットした。
図に示すように、ＣＧＣ－ＣＢＰはＭＺ１による細胞死を促進することが明らかとなった。
図に示すように、ＣＧＣ－ＣＢＰはＭＺ１による細胞死を促進することが明らかとなった。
【0054】
ついで、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔと、ＢＲＤ４－ＶＨＬ複合体形成の関係を調べた。
図１８は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いてＢＲＤ４－ＭＺ１－ＶＨＬとの関係を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。２９３Ｔ細胞においてＦＬＡＧ－ＢＲＤ４、ＨＡ－ＶＨＬを発現させ、図中に示した薬剤を添加した。ＩＰ：ＦＬＡＧは、ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降したサンプルである。ｉｎｐｕｔは免疫沈降前のサンプルを示した。
図に示すように、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔの添加により、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを添加していない場合より複合体のシグナルが低下した。Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔは、ＭＺ１によるＢＲＤ４－ＶＨＬ複合体形成を減少させることが明らかとなった。すなわち、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤ＶｏｒｉｎｏｓｔａｔはＭＺ１によるＢＲＤ４－ＶＨＬ複合体形成によるユビキチン化を阻害すると考えられた。
図１８は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いてＢＲＤ４－ＭＺ１－ＶＨＬとの関係を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。２９３Ｔ細胞においてＦＬＡＧ－ＢＲＤ４、ＨＡ－ＶＨＬを発現させ、図中に示した薬剤を添加した。ＩＰ：ＦＬＡＧは、ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降したサンプルである。ｉｎｐｕｔは免疫沈降前のサンプルを示した。
図に示すように、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔの添加により、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを添加していない場合より複合体のシグナルが低下した。Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔは、ＭＺ１によるＢＲＤ４－ＶＨＬ複合体形成を減少させることが明らかとなった。すなわち、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤ＶｏｒｉｎｏｓｔａｔはＭＺ１によるＢＲＤ４－ＶＨＬ複合体形成によるユビキチン化を阻害すると考えられた。
【0055】
ついで、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰと、ＢＲＤ４－ＶＨＬ複合体形成の関係を調べた。
図１９は、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰを用いてＢＲＤ４－ＭＺ１－ＶＨＬとの関係を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。前図と同様に、２９３Ｔ細胞においてＦＬＡＧ－ＢＲＤ４、ＨＡ－ＶＨＬを発現させ、図中に示した薬剤を添加した。ＩＰ：ＦＬＡＧは、ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降したサンプルである。ｉｎｐｕｔは免疫沈降前のサンプルを示した。
図に示すように、ＳＧＣ－ＣＢＰの添加により、ＳＧＣ－ＣＢＰを添加していない場合より複合体のシグナルは増加した。ＴＵＢＥサンプルでのＣＵＬ２の発現量では、増加は顕著となっている。
ＳＧＣ－ＣＢＰは、ＭＺ１によるＢＲＤ４－ＶＨＬ複合体形成を増加させることが明らかとなった。すなわち、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰはＭＺ１によるＢＲＤ４－ＶＨＬ複合体形成によるユビキチン化を促進すると考えられた。
図１９は、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰを用いてＢＲＤ４－ＭＺ１－ＶＨＬとの関係を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。前図と同様に、２９３Ｔ細胞においてＦＬＡＧ－ＢＲＤ４、ＨＡ－ＶＨＬを発現させ、図中に示した薬剤を添加した。ＩＰ：ＦＬＡＧは、ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降したサンプルである。ｉｎｐｕｔは免疫沈降前のサンプルを示した。
図に示すように、ＳＧＣ－ＣＢＰの添加により、ＳＧＣ－ＣＢＰを添加していない場合より複合体のシグナルは増加した。ＴＵＢＥサンプルでのＣＵＬ２の発現量では、増加は顕著となっている。
ＳＧＣ－ＣＢＰは、ＭＺ１によるＢＲＤ４－ＶＨＬ複合体形成を増加させることが明らかとなった。すなわち、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰはＭＺ１によるＢＲＤ４－ＶＨＬ複合体形成によるユビキチン化を促進すると考えられた。
【0056】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ヒストンアセチル化酵素阻害剤はＢＲＤ４のクロマチンへの結合に関与していると考えられる。そこで、これらの阻害剤のＢＲＤ４のクロマチンへの結合、離脱（核への移行）への影響について調べた。
まず、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔと、ＢＲＤ４の局在について調べた。
図２０は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いてＢＲＤ４の局在を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。前述のＨＣＴ１１６細胞において、細胞分画キット（Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ， Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて細胞を分画し、ｎｕｃｌｅｕｓ（核部）、ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（クロマチン）のそれぞれについてウェスタンブロッティングを行った。核酸修復に関する転写因子ＥＴＳの抗体による検出も行った。
図に示すように、核部ではＶｏｒｉｎｏｓｔａｔの添加によりＢＲＤ４のシグナルは減少していた。一方、クロマチンではＶｏｒｉｎｏｓｔａｔの添加によりＢＲＤ４のシグナルは増加していた。ＶｏｒｉｎｏｓｔａｔはＢＲＤ４の局在をクロマチンに移行させ、ＢＲＤがクロマチンに結合することにより分解が阻害されることが示された。
まず、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔと、ＢＲＤ４の局在について調べた。
図２０は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔを用いてＢＲＤ４の局在を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。前述のＨＣＴ１１６細胞において、細胞分画キット（Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ， Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて細胞を分画し、ｎｕｃｌｅｕｓ（核部）、ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（クロマチン）のそれぞれについてウェスタンブロッティングを行った。核酸修復に関する転写因子ＥＴＳの抗体による検出も行った。
図に示すように、核部ではＶｏｒｉｎｏｓｔａｔの添加によりＢＲＤ４のシグナルは減少していた。一方、クロマチンではＶｏｒｉｎｏｓｔａｔの添加によりＢＲＤ４のシグナルは増加していた。ＶｏｒｉｎｏｓｔａｔはＢＲＤ４の局在をクロマチンに移行させ、ＢＲＤがクロマチンに結合することにより分解が阻害されることが示された。
【0057】
図２１は、ヒストンアセチル化酵素阻害剤ＳＧＣ－ＣＢＰを用いてＢＲＤ４の局在を調査したウェスタンブロットの結果を示す写真図である。細胞の分画およびウェスタンブロットは前図と同様に行った。転写因子ｐ５３の抗体による検出も行った。
図に示すように、核部ではＳＧＣ－ＣＢＰの添加によりＢＲＤ４のシグナルは増加していた。一方、クロマチンではＳＧＣ－ＣＢＰの添加によりＢＲＤ４のシグナルは減少していた。ＳＧＣ－ＣＢＰはＢＲＤ４の局在を核部に移行させ、ＢＲＤがクロマチンから外れることにより分解が阻害されることが示された。
図に示すように、核部ではＳＧＣ－ＣＢＰの添加によりＢＲＤ４のシグナルは増加していた。一方、クロマチンではＳＧＣ－ＣＢＰの添加によりＢＲＤ４のシグナルは減少していた。ＳＧＣ－ＣＢＰはＢＲＤ４の局在を核部に移行させ、ＢＲＤがクロマチンから外れることにより分解が阻害されることが示された。
【0058】
以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【0059】
本発明によれば、転写制御因子タンパク質タンパク質の分解誘導そのものを促進することができ、複数の共供与によって分解誘導の効果を高められ、また、高い治療効果を持つがん治療薬として有用である転写制御因子タンパク質分解促進組成物およびそれを用いた治療薬が得られる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
