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特開2025-27465ソーセージの発酵品質を向上させる複合スターター及び応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025027465
(43)【公開日】2025-02-27
(54)【発明の名称】ソーセージの発酵品質を向上させる複合スターター及び応用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20250219BHJP
A23L 13/60 20160101ALI20250219BHJP
A23L 33/135 20160101ALN20250219BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
A23L13/60 A
A23L33/135
【審査請求】有
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024135150
(22)【出願日】2024-08-13
(31)【優先権主張番号】202311019298.6
(32)【優先日】2023-08-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202311409381.4
(32)【優先日】2023-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】517062562
【氏名又は名称】合肥工▲業▼大学
【氏名又は名称原語表記】ＨｅＦｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１９３， Ｔｕｎｘｉ Ｒｏａｄ， Ｂａｏｈｅ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， ＨｅＦｅｉ， Ａｎｈｕｉ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110004440
【氏名又は名称】弁理士法人ソシデア知的財産事務所
(72)【発明者】
【氏名】徐 宝才
(72)【発明者】
【氏名】鄭 莎莎
(72)【発明者】
【氏名】王 淳玉
(72)【発明者】
【氏名】楊 柳
【テーマコード（参考）】
4B018
4B042
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B018LB06
4B018LE01
4B018MD85
4B018ME09
4B018ME13
4B018MF13
4B042AD03
4B042AG03
4B042AH01
4B042AK16
4B042AP27
4B065AA01X
4B065AA53X
4B065AC20
4B065BA24
4B065BB23
4B065BC31
4B065CA42
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ソーセージの発酵品質を向上させる複合スターター及び応用を提供する。
【解決手段】複合スターターであって、ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８を含み、前記複合スターターは液体菌剤であり、ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の有効生菌数の比率は１：１：２～４：２～４である。従来の発酵ソーセージと比較して、ソーセージのｐＨ値を著しくかつ迅速に低下させ、腐敗菌の増殖を抑制し、製品の安全性を確保できる。
【選択図】図３
【解決手段】複合スターターであって、ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８を含み、前記複合スターターは液体菌剤であり、ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の有効生菌数の比率は１：１：２～４：２～４である。従来の発酵ソーセージと比較して、ソーセージのｐＨ値を著しくかつ迅速に低下させ、腐敗菌の増殖を抑制し、製品の安全性を確保できる。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ソーセージの発酵品質を向上させる複合スターターであって、ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８を含み、
前記ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７はＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、菌株の寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０３であり、
前記ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８はＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０６であり、
前記スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２２１３０５であり、
前記スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０４であることを特徴とする複合スターター。
前記ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７はＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、菌株の寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０３であり、
前記ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８はＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０６であり、
前記スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２２１３０５であり、
前記スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０４であることを特徴とする複合スターター。
【請求項2】
前記複合スターターは液体菌剤であり、ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の有効生菌数の比率は１：１：２～４：２～４であることを特徴とする請求項１に記載の複合スターター。
【請求項3】
発酵肉製品の製造における請求項１又は２に記載の複合スターターの応用。
【請求項4】
前記発酵肉製品は発酵ソーセージであることを特徴とする請求項３に記載の発酵肉製品の製造における複合スターターの応用。
【請求項5】
前記発酵ソーセージの製造方法は、
原料肉に調味料及び補助材料を加えて塩漬けにし、前発酵肉を得るステップ（１）と、
請求項１又は２に記載の複合スターターを、発酵肉に接種して均一に混合して、ソーセージを詰めるステップ（２）と、
２５～３５℃、ＲＨ８０～９０％条件下で２０～４０時間発酵させる発酵ステップ（３）と、
１０～２０℃、ＲＨ４０～５０％条件下で１０～２０日間発酵させる風乾ステップ（４）と、を含むことを特徴とする請求項４に記載の発酵肉製品の製造における複合スターターの応用。
原料肉に調味料及び補助材料を加えて塩漬けにし、前発酵肉を得るステップ（１）と、
請求項１又は２に記載の複合スターターを、発酵肉に接種して均一に混合して、ソーセージを詰めるステップ（２）と、
２５～３５℃、ＲＨ８０～９０％条件下で２０～４０時間発酵させる発酵ステップ（３）と、
１０～２０℃、ＲＨ４０～５０％条件下で１０～２０日間発酵させる風乾ステップ（４）と、を含むことを特徴とする請求項４に記載の発酵肉製品の製造における複合スターターの応用。
【請求項6】
前記複合スターターは液体菌剤であり、其中，ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の有効生菌数の比率は１：１：２～４：２～４であることを特徴とする請求項５に記載の発酵肉製品の製造における複合スターターの応用。
【請求項7】
前記ステップ（１）において、前記原料肉は、新鮮な豚もも赤身及び背脂表面の筋膜や腱部位を取り除いて洗い流し、肉を粉砕した後、豚もも赤身と背脂の割合を１～４：９～６に合わせて混合して得られたものであることを特徴とする請求項６に記載の発酵肉製品の製造における複合スターターの応用。
【請求項8】
前記ステップ（１）において、塩漬け温度は３～８℃であることを特徴とする請求項７に記載の発酵肉製品の製造における複合スターターの応用。
【請求項9】
前記ステップ（１）において、調味料及び補助材料は、塩２．５％、ブドウ糖０．７％、亜硝酸塩０．０１％、ガーリックパウダー０．０１５％、フェンネルパウダー０．０５％、黒胡椒パウダー０．０５％、ソーセージフレーバー０．２２５％という原料肉に対する質量パーセントに従って添加されることを特徴とする請求項８に記載の発酵肉製品の製造における複合スターターの応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、肉類スターターの技術分野に関し、具体的にはソーセージの発酵品質を向上させる複合スターター及び応用に関する。
【背景技術】
【0002】
発酵ソーセージは、人工的な制御または自然環境条件下で微生物発酵を使用して独特の風味を生み出す一種の肉製品を指す。従来の発酵ソーセージは、生産環境中の微生物による自然発酵が主であり、製品の品質が不安定であった。純粋な微生物培養物の人工接種を使用して発酵を制御すると、製品の品質と安全性が大幅に向上できる。したがって、工業生産を達成するために、純粋な微生物培養物または調製物（すなわち、発酵肉製品スターター）を肉製品に人工的に接種することが一般的な慣行となっている。
【0003】
乳酸菌とブドウ球菌は発酵肉製品に最も一般的な微生物であり、発酵肉製品のスターターとしてもよく使用される。乳酸菌を接種すると、炭水化物を素早く代謝して酸を生成し、ｐＨを下げ、腐敗や病原性微生物の増殖を抑制し、製品の安全性を向上させることができ、ブドウ球菌は、発酵肉製品の風味と色の品質に重要な役割を果たしており、一般的にタンパク質加水分解酵素、脂肪加水分解酵素、硝酸還元酵素活性を持っており、製品の風味特性に影響を与え、成熟した肉製品の乾燥プロセスを促進し、質感を改善し、同時にニトロソミオグロビンの形成を促進し、肉製品の良好な色の形成と安定性に有利である。発酵肉製品には風味の違いに応じて異なる微生物が必要であり、その用途は通常単一菌株に限定されず、単一菌株の単調さを補うために複数の菌株を組み合わせて使用される。
【0004】
菌株を標的的に接種した発酵肉製品は、食感と質感を確保しながら自然発酵に依存する不安定性を解決し、製品の安全性と品質の信頼性を大幅に向上させることができ、また、乳酸菌とブドウ球菌の複合接種の効果は単一接種よりも優れている。
【0005】
現在、国内生産に使用されるスターターは、ドイツのＣｈｒ Ｈａｎｓｅｎ社のＢａｃｔｏｆｅｒｍＴＭＦ－１など、主に欧米企業によって生産されているが、まだ国内株を使用して生産されていない。したがって、発酵性と増殖性に優れた乳酸菌やコアグラーゼ陰性ブドウ球菌をスクリーニングし、発酵ソーセージに適用することは、ソーセージや肉製品の加工にとって非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ソーセージの発酵品質を向上させる複合スターター及び応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を提供する。
ソーセージの発酵品質を向上させる複合スターターであって、ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８を含み、
前記ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７はＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、菌株の寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０３であり、
前記ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８はＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０６であり、
前記スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２２１３０５であり、
前記スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０４である。
ソーセージの発酵品質を向上させる複合スターターであって、ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８を含み、
前記ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７はＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、菌株の寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０３であり、
前記ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８はＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０６であり、
前記スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０２２１３０５であり、
前記スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託日は２０２２年８月１８日、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０４である。
【0008】
さらに、前記複合スターターは液体菌剤であり、ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリの有効生菌数の比率は１：１：２～４：２～４である。
【0009】
本発明に記載の複合スターターは、発酵肉製品の製造に使用することができる。
【0010】
ここで、前記発酵肉製品は発酵ソーセージである。
【0011】
発酵ソーセージの製造方法は、
原料肉に調味料及び補助材料を加えて塩漬けにし、前発酵肉を得るステップ（１）と、
請求項１又は２に記載の複合スターターを、発酵肉に接種して均一に混合して、ソーセージを詰めるステップ（２）と、
２５～３５℃、ＲＨ８０～９０％条件下で２０～４０時間発酵させる発酵ステップ（３）と、
１０～２０℃、ＲＨ４０～５０％条件下で１０～２０日間発酵させる風乾ステップ（４）と、を含む。
原料肉に調味料及び補助材料を加えて塩漬けにし、前発酵肉を得るステップ（１）と、
請求項１又は２に記載の複合スターターを、発酵肉に接種して均一に混合して、ソーセージを詰めるステップ（２）と、
２５～３５℃、ＲＨ８０～９０％条件下で２０～４０時間発酵させる発酵ステップ（３）と、
１０～２０℃、ＲＨ４０～５０％条件下で１０～２０日間発酵させる風乾ステップ（４）と、を含む。
【0012】
前記複合スターターは液体菌剤であり、其中，ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリの有効生菌数の比率は１：１：２～４：２～４である。
【0013】
そのうち、前記ステップ（１）において、前記原料肉は、新鮮な豚もも赤身及び背脂表面の筋膜や大きい腱等の部位を取り除いて洗い流し、肉を粉砕した後、豚もも赤身と背脂の割合を１～４：９～６に合わせて混合して得られたものである。
【0014】
そのうち、前記ステップ（１）において、塩漬け温度は３～８℃である。
【0015】
そのうち、前記ステップ（１）において、調味料及び補助材料は、塩２．５％、ブドウ糖０．７％、亜硝酸塩０．０１％、ガーリックパウダー０．０１５％、フェンネルパウダー０．０５％、黒胡椒パウダー０．０５％、ソーセージフレーバー０．２２５％という原料肉に対する質量パーセントに従って添加される。
【発明の効果】
【0016】
従来技術と比較して、本発明の有益効果は次のとおりである。
（１）伝統的な発酵ソーセージと比較して、本発明の複合スターターを使用して製造された発酵ソーセージは、本発明のラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の複合スターターを接種すると、ソーセージのｐＨ値を著しくかつ迅速に低下させ、腐敗菌の増殖を抑制し、製品の安全性を確保できる。
（２）本発明のラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の複合スターターを使用してソーセージを発酵すると、自然発酵に比べて発酵ソーセージにおけるヒトの必須アミノ酸の含有量が大幅に増加し、栄養価が向上する。
（３）本発明のラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の複合スターターによって発酵されたソーセージは、官能評価後、消費者の間でより人気がある。
（１）伝統的な発酵ソーセージと比較して、本発明の複合スターターを使用して製造された発酵ソーセージは、本発明のラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の複合スターターを接種すると、ソーセージのｐＨ値を著しくかつ迅速に低下させ、腐敗菌の増殖を抑制し、製品の安全性を確保できる。
（２）本発明のラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の複合スターターを使用してソーセージを発酵すると、自然発酵に比べて発酵ソーセージにおけるヒトの必須アミノ酸の含有量が大幅に増加し、栄養価が向上する。
（３）本発明のラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の複合スターターによって発酵されたソーセージは、官能評価後、消費者の間でより人気がある。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の電気泳動図である。
【図2】ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７、ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８、スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４、スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８の系統樹である。
【図3】発酵プロセス中の発酵ソーセージのさまざまなグループのｐＨ値の図である。
【0018】
生物寄託の説明
ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＹＲ０７）はＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託アドレスは湖北省武漢市武昌区八一路２９９号武漢大学校内であり、寄託機構の略称はＣＣＴＣＣであり、寄託日は２０２２年８月１８日、生物寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０３である。
ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８（Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ Ｌ．４８）は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託アドレスは湖北省武漢市武昌区八一路２９９号武漢大学校内であり、寄託機構の略称はＣＣＴＣＣであり、寄託日は２０２２年８月１８日、生物寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０６である。
スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ Ｓ．１４）は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託アドレスは湖北省武漢市武昌区八一路２９９号武漢大学校内であり、寄託機構の略称はＣＣＴＣＣであり、寄託日は２０２２年８月１８日、生物寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０５である。
スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８（Ｍａｍｍａｌｉｉｃｏｃｃｕｓ ｓｃｉｕｒｉ Ｓ．１８）は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託アドレスは湖北省武漢市武昌区八一路２９９号武漢大学校内であり、寄託機構の略称はＣＣＴＣＣであり、寄託日は２０２２年８月１８日、生物寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０４である。
ラクチプランティバチルス・プランタルムＹＲ０７（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＹＲ０７）はＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託アドレスは湖北省武漢市武昌区八一路２９９号武漢大学校内であり、寄託機構の略称はＣＣＴＣＣであり、寄託日は２０２２年８月１８日、生物寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０３である。
ラチラクトバチルス・サケイＬ．４８（Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ Ｌ．４８）は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託アドレスは湖北省武漢市武昌区八一路２９９号武漢大学校内であり、寄託機構の略称はＣＣＴＣＣであり、寄託日は２０２２年８月１８日、生物寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０６である。
スタフィロコッカス・キシローサスＳ．１４（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ Ｓ．１４）は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託アドレスは湖北省武漢市武昌区八一路２９９号武漢大学校内であり、寄託機構の略称はＣＣＴＣＣであり、寄託日は２０２２年８月１８日、生物寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０５である。
スタフィロコッカス・スキウリＳ．１８（Ｍａｍｍａｌｉｉｃｏｃｃｕｓ ｓｃｉｕｒｉ Ｓ．１８）は、Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託アドレスは湖北省武漢市武昌区八一路２９９号武漢大学校内であり、寄託機構の略称はＣＣＴＣＣであり、寄託日は２０２２年８月１８日、生物寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２２１３０４である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下に本発明の実施例における図面を参照して本発明の実施例における技術的解決策を明確かつ完全に説明する。明らかに、説明した実施例は本発明の実施例の一部にすぎず、すべての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、創造的な努力なしに当業者によって得られる他のすべての実施例は、本発明の保護の範囲内に含まれる。
【0020】
特に指定しない限り、以下の実施例に記載の試薬または材料はすべて市販されている。
【0021】
実施例１ 伝統的な発酵肉製品の収集及び乳酸菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の分離、精製、スクリーニング
１．乳酸菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の分離
隴西ベーコン、蘇式ソーセージ、恩施ハム、▲トン▼族酸肉、建甌塩辛鴨、貴州ベーコンなどを全国から集め、サンプル１０．０ｇを無菌条件下で秤量し、無菌生理食塩水９０ｍＬを加えて均質化した後、希釈した。
サンプル希釈液１．０ｍＬを２％軽質炭酸カルシウムを含むＭＲＳ固体培地に注ぎ、３７℃で４８時間培養し、純粋なコロニーが得られるまで溶存カルシウムリングを有し、異なる形状のコロニーを選択し、ＭＲＳ固体培地での画線培養を３～４回繰り返した。
サンプル希釈液を０．１ｍＬ取り、ＭＳＡ固体培地に塗布し、３７℃で２４時間培養し、純粋なコロニーが得られるまで異なる形状のコロニーを選択し、ＭＳＡ固体培地での画線培養を３～４回繰り返した。
２．乳酸菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌のスクリーニング
精製菌株に対してグラム染色顕微鏡検査とカタラーゼ試験を実施し、グラム染色陽性菌株とカタラーゼ陰性菌株をスクリーニングした。得られた菌株について、粘液産生試験、溶血試験、ブドウ糖ガス産生試験、Ｈ２Ｓ産生試験、アルギニンアンモニア産生試験、アミノ酸脱炭酸酵素試験を行い、スクリーニングした乳酸菌の抗菌特性をオックスフォードカップ拡散平板法により測定した。安全で発酵性能に優れた乳酸菌ＹＲ０７（ラクチプランティバチルス・プランタルム）、Ｌ．４８（ラチラクトバチルス・サケイ）の２株をスクリーニングした。
１．乳酸菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の分離
隴西ベーコン、蘇式ソーセージ、恩施ハム、▲トン▼族酸肉、建甌塩辛鴨、貴州ベーコンなどを全国から集め、サンプル１０．０ｇを無菌条件下で秤量し、無菌生理食塩水９０ｍＬを加えて均質化した後、希釈した。
サンプル希釈液１．０ｍＬを２％軽質炭酸カルシウムを含むＭＲＳ固体培地に注ぎ、３７℃で４８時間培養し、純粋なコロニーが得られるまで溶存カルシウムリングを有し、異なる形状のコロニーを選択し、ＭＲＳ固体培地での画線培養を３～４回繰り返した。
サンプル希釈液を０．１ｍＬ取り、ＭＳＡ固体培地に塗布し、３７℃で２４時間培養し、純粋なコロニーが得られるまで異なる形状のコロニーを選択し、ＭＳＡ固体培地での画線培養を３～４回繰り返した。
２．乳酸菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌のスクリーニング
精製菌株に対してグラム染色顕微鏡検査とカタラーゼ試験を実施し、グラム染色陽性菌株とカタラーゼ陰性菌株をスクリーニングした。得られた菌株について、粘液産生試験、溶血試験、ブドウ糖ガス産生試験、Ｈ２Ｓ産生試験、アルギニンアンモニア産生試験、アミノ酸脱炭酸酵素試験を行い、スクリーニングした乳酸菌の抗菌特性をオックスフォードカップ拡散平板法により測定した。安全で発酵性能に優れた乳酸菌ＹＲ０７（ラクチプランティバチルス・プランタルム）、Ｌ．４８（ラチラクトバチルス・サケイ）の２株をスクリーニングした。
【0022】
【表1】
【0023】
精製菌株に対してグラム染色顕微鏡検査とカタラーゼ試験を実施し、グラム染色陽性菌株とカタラーゼ陽性菌株をスクリーニングした。得られた菌株について、タンパク質と脂肪分解酵素の試験、亜硝酸還元酵素試験、粘液産生および溶血試験、ブドウ糖ガス産生試験、Ｈ２Ｓ産生試験、アルギニンアンモニア産生試験、およびアミノ酸脱炭酸酵素試験を行った。安全で、発酵性能が良好で、発色機能を有するブドウ球菌Ｓ．１４（スタフィロコッカス・キシローサス）、Ｓ．１８（スタフィロコッカス・スキウリ）がスクリーニングされた。
【0024】
【表2】
【0025】
実施例２ 乳酸菌及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の同定
細菌ゲノムＤＮＡ抽出キットを使用して乳酸菌の遺伝子を抽出し、２７Ｆ（５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’）及び１４９２Ｒ（５’－ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴ－ＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’）上下のプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－２に示す）を使用して、抽出された１６Ｓ ｒＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で３４サイクル（９５℃ ３０秒、５６℃ ３０秒、７０℃ ６５秒）２０ｍｉｎの初期変性及び７２℃ １０ｍｉｎの最終鎖伸長であった。得られたＰＣＲ産物に対してアガロースゲル電気泳動を行い、電気泳動結果をゲルイメージングシステムで観察した結果を図１に示した。
配列決定結果に対して、米国国家バイオテクノロジー情報センター（ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータ内でローカル配列アラインメントのための基本的な検索ツール（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ、ＢＬＡＳＴ）を使用して比較及び検索を行い、相同性の高いモデル菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を選択した。系統樹を構築し、結果を図２に示すように、菌株ＹＲ０７はＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、つまりラクチプランティバチルス・プランタルムとして同定され、菌株Ｌ．４８は、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、つまりラチラクトバチルス・サケイとして同定され、菌株Ｓ．１４は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ、つまりスタフィロコッカス・キシローサスとして同定され、菌株Ｓ．１８は、Ｍａｍｍａｌｉｉｃｏｃｃｕｓ ｓｃｉｕｒｉ、つまりスタフィロコッカス・スキウリとして同定された。
細菌ゲノムＤＮＡ抽出キットを使用して乳酸菌の遺伝子を抽出し、２７Ｆ（５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’）及び１４９２Ｒ（５’－ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴ－ＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’）上下のプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－２に示す）を使用して、抽出された１６Ｓ ｒＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で３４サイクル（９５℃ ３０秒、５６℃ ３０秒、７０℃ ６５秒）２０ｍｉｎの初期変性及び７２℃ １０ｍｉｎの最終鎖伸長であった。得られたＰＣＲ産物に対してアガロースゲル電気泳動を行い、電気泳動結果をゲルイメージングシステムで観察した結果を図１に示した。
配列決定結果に対して、米国国家バイオテクノロジー情報センター（ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータ内でローカル配列アラインメントのための基本的な検索ツール（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ、ＢＬＡＳＴ）を使用して比較及び検索を行い、相同性の高いモデル菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を選択した。系統樹を構築し、結果を図２に示すように、菌株ＹＲ０７はＬａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、つまりラクチプランティバチルス・プランタルムとして同定され、菌株Ｌ．４８は、Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、つまりラチラクトバチルス・サケイとして同定され、菌株Ｓ．１４は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ、つまりスタフィロコッカス・キシローサスとして同定され、菌株Ｓ．１８は、Ｍａｍｍａｌｉｉｃｏｃｃｕｓ ｓｃｉｕｒｉ、つまりスタフィロコッカス・スキウリとして同定された。
【0026】
実施例３ 発酵ソーセージの製造
１．複合スターターの製造
乳酸菌ＹＲ０７、Ｌ．４８を活性化した後、１％の接種量で採取し、ＭＲＳ液体培地に接種し、１２時間培養し、８０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、沈殿を収集し、生理食塩水で３回洗浄した。ブドウ球菌Ｓ．１４、Ｓ．１８を活性化した後、ＭＳＡ液体培地に１％を接種し、１２時間培養し、８０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、沈殿を収集し、生理食塩水で３回洗浄した。菌体の最終濃度を１：１：２：２の比率に従って１×１０７ＣＦＵ／ｇに調整し、体積を１ｍｌとして使用に備える。
２．発酵ソーセージの製造
豚もも肉を、脂肪と赤身の比率が３：７になるように粉砕して混合し、添加される補助材料の割合は、２．５％塩、０．７％ブドウ糖、０．０１％亜硝酸塩、０．０１５％ガーリックパウダー、０．０５％フェンネルパウダー、０．０５％黒胡椒パウダー、０．２２５％ソーセージフレーバー、１ｍＬ細菌懸濁液である。詰め中にはソーセージ本体がぷりぷりで気泡がないことを確保した。その後、恒温恒湿箱に吊るし、３０℃、相対湿度８５％で２４時間発酵させ、次に、１５℃、相対湿度４５％で１５日間風乾して、完成品を得た。試験群は、ブランク対照群（ＣＫ群）、商業発酵群（ＣＳ群）および複合スターター接種群（ＣＨ群）であった。
１．複合スターターの製造
乳酸菌ＹＲ０７、Ｌ．４８を活性化した後、１％の接種量で採取し、ＭＲＳ液体培地に接種し、１２時間培養し、８０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、沈殿を収集し、生理食塩水で３回洗浄した。ブドウ球菌Ｓ．１４、Ｓ．１８を活性化した後、ＭＳＡ液体培地に１％を接種し、１２時間培養し、８０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、沈殿を収集し、生理食塩水で３回洗浄した。菌体の最終濃度を１：１：２：２の比率に従って１×１０７ＣＦＵ／ｇに調整し、体積を１ｍｌとして使用に備える。
２．発酵ソーセージの製造
豚もも肉を、脂肪と赤身の比率が３：７になるように粉砕して混合し、添加される補助材料の割合は、２．５％塩、０．７％ブドウ糖、０．０１％亜硝酸塩、０．０１５％ガーリックパウダー、０．０５％フェンネルパウダー、０．０５％黒胡椒パウダー、０．２２５％ソーセージフレーバー、１ｍＬ細菌懸濁液である。詰め中にはソーセージ本体がぷりぷりで気泡がないことを確保した。その後、恒温恒湿箱に吊るし、３０℃、相対湿度８５％で２４時間発酵させ、次に、１５℃、相対湿度４５％で１５日間風乾して、完成品を得た。試験群は、ブランク対照群（ＣＫ群）、商業発酵群（ＣＳ群）および複合スターター接種群（ＣＨ群）であった。
【0027】
実施例４ 発酵ソーセージ指標の測定
１、発酵ソーセージのｐＨ値の測定
実施例３のＣＫ群、ＣＳ群、ＣＨ群のソーセージをそれぞれ詰めた後１日間発酵し、１日間風乾し、５日間風乾し、１０日間風乾し、１５日間風乾した後にｐＨ値を測定した。サンプル１０．０ｇを正確に量り、細く切って、１００ｍＬの蒸留水を加え、サンプルと十分で均一に混合し、８０００×ｇで３０秒間均質化し、濾過した後、上清を取り、ｐＨ計で測定し、３回繰返して平均を取った。
結果を図３に示すように、発酵前の３つの群のｐＨは類似し、１日発酵した後、ＣＳ及びＣＨ群のｐＨは５．０以下に低下し、１日風乾した後、値は４．６～４．７の最低点まで下がり、その後ゆっくりと上昇し、ＣＫ群のｐＨは常に５．０以上であるが、市販のスターターや複合スターターを添加したｐＨはより速く低下し、スターターを添加すると、酸を素早く生成し、ソーセージの発酵時間を短縮し、雑菌の増殖を抑制する効果があることがわかった。
２、発酵ソーセージ中のアミノ酸含有量の測定
国家標準《ＧＢ５００９．１２４－２０１６－アミノ酸の測定》の方法に従って測定し、少し修正した。発酵ソーセージを適量量り、細かく切った後、凍結乾燥させ、凍結乾燥後のサンプル０．１ｇを正確に量り、４％スルホサリチル酸溶液４ｍＬを加え、３０分間超音波抽出した後、１０分間静置した。分層後、上清を１．５ｍＬ取り、１２０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清１ｍＬを採取し、０．２２μｍ水相濾過膜で濾過し、全自動アミノ酸分析装置により遊離アミノ酸の測定を行った。
１、発酵ソーセージのｐＨ値の測定
実施例３のＣＫ群、ＣＳ群、ＣＨ群のソーセージをそれぞれ詰めた後１日間発酵し、１日間風乾し、５日間風乾し、１０日間風乾し、１５日間風乾した後にｐＨ値を測定した。サンプル１０．０ｇを正確に量り、細く切って、１００ｍＬの蒸留水を加え、サンプルと十分で均一に混合し、８０００×ｇで３０秒間均質化し、濾過した後、上清を取り、ｐＨ計で測定し、３回繰返して平均を取った。
結果を図３に示すように、発酵前の３つの群のｐＨは類似し、１日発酵した後、ＣＳ及びＣＨ群のｐＨは５．０以下に低下し、１日風乾した後、値は４．６～４．７の最低点まで下がり、その後ゆっくりと上昇し、ＣＫ群のｐＨは常に５．０以上であるが、市販のスターターや複合スターターを添加したｐＨはより速く低下し、スターターを添加すると、酸を素早く生成し、ソーセージの発酵時間を短縮し、雑菌の増殖を抑制する効果があることがわかった。
２、発酵ソーセージ中のアミノ酸含有量の測定
国家標準《ＧＢ５００９．１２４－２０１６－アミノ酸の測定》の方法に従って測定し、少し修正した。発酵ソーセージを適量量り、細かく切った後、凍結乾燥させ、凍結乾燥後のサンプル０．１ｇを正確に量り、４％スルホサリチル酸溶液４ｍＬを加え、３０分間超音波抽出した後、１０分間静置した。分層後、上清を１．５ｍＬ取り、１２０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清１ｍＬを採取し、０．２２μｍ水相濾過膜で濾過し、全自動アミノ酸分析装置により遊離アミノ酸の測定を行った。
【0028】
表３から、本発明の実施例３で製造した複合スターターで発酵させたソーセージの総アミノ酸含有量が最も高く、ヒトの８種の必須アミノ酸の含有量も自然発酵群と商業発酵群より高いことが分かる。
【0029】
【表3】
３、発酵ソーセージ中の揮発性化合物の含有量の測定
実施例３のＣＫ群、ＣＳ群、ＣＨ群のソーセージ完成品の揮発性化合物の含有量を測定した。ヘッドスペース固相マイクロ抽出－ガスクロマトグラフ質量分析法を使用して、発酵ソーセージ中の揮発性風味物質を分析した。細く切ったソーセージサンプル（２．０ｇ）を２０ｍＬヘッドスペースサンプルバイアルに入れ、内部標準として２，４，６トリメチルピリジン（濃度：０．１ｇ／Ｌ）１０μＬを添加した。ヘッドスペースサンプルバイアルを６０℃の温度で５分間平衡化した後、エージング済みの７５μｍ複合式ＣＡＲ／ＰＤＭＳ抽出針を挿入して３０分間吸着させ、次に、すぐに抽出ヘッドをガスクロマトグラフ質量分析サンプル注入口に挿入し、５分間分析した。
揮発性化合物は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）システム（５９７７Ｂ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して測定され、ガスクロマトグラフィー条件：ＤＢ－ＷＡＸ（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）、サンプル注入口温度は２５０℃で、サンプルはスプリットレスモードで注入され、キャリアとしてヘリウムを使用し、流速は１ｍＬ／ｍｉｎであり、プログラムされた温度上昇：カラムの初期温度は４０℃で、５分間維持され、その後２℃／ｍｉｎで９０℃まで昇温し、保持せず、５℃／ｍｉｎで１８０℃まで昇温し、保持せず、１０℃／ｍｉｎで２３０℃まで昇温し、８分間保持した。質量分析条件：イオン源温度は２３０℃、質量走査範囲は３０～５５０ｍ／ｚであった。
揮発性化合物の同定は、ＮＩＳＴ ２０質量スペクトルライブラリを比較し、８０％より大きい類似性を同定結果として採用した。揮発性化合物は、ｎ－ヘキサンに溶解した２，４，６－トリメチルピリジン溶液を内部標準物質として使用し、内部標準法により定量し、定量的結果はμｇ／ｋｇで表され、重要な揮発性物質の評価方法に関する参考文献：（劉登勇、周光宏、徐幸蓮、食品中の重要な風味化合物を特定する新しい方法：「ＲＯＡＶ」法［Ｊ］．食品科学，２００８，３４４（７）：３７０－３７４．）、相対臭気活性値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｏｄｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｖａｌｕｅ、ＲＯＡＶ）分析法を使用して、サンプルの重要な揮発性物質を特定する。
結果を表４に示すように、相対臭気活性値によってソーセージ中の合計２５種の重要な揮発性物質が特定され、そのうちＣＨ群には重要な揮発性物質が多く含まれており、その含有量は２１６．２８μｇ／ｋｇであり、３－ヒドロキシ－２－ブタノンは、心地よいクリーミーな味を持つ特別な風味化合物であり、ＣＨ群の中で最も多く含有されている。対照群および商業発酵群と比較して、複合スターターの接種は発酵ソーセージ中の特徴的な風味物質の含有量を大幅に増加させることができるため、複合スターターの接種は発酵ソーセージの風味を改善することができる。
【0030】
【表4】
【0031】
４、発酵ソーセージの官能評価
評価委員は、選別された食品を専攻する男女半数の大学院生１０名で構成されている。ソーセージを２０分茹で、２０ｍｍの厚さに切った。官能評価は二重盲検法を用いて行われ、評価員同士はコミュニケーションが取れず、異なるサンプルを評価する前に清水で口をすすぐ必要があった。採点は１０点法に基づき、サンプルの外観、組織の状態、色、風味、および全体的な受け入れ可能性という５つの側面を評価し、評価基準を表５に示す。
評価委員は、選別された食品を専攻する男女半数の大学院生１０名で構成されている。ソーセージを２０分茹で、２０ｍｍの厚さに切った。官能評価は二重盲検法を用いて行われ、評価員同士はコミュニケーションが取れず、異なるサンプルを評価する前に清水で口をすすぐ必要があった。採点は１０点法に基づき、サンプルの外観、組織の状態、色、風味、および全体的な受け入れ可能性という５つの側面を評価し、評価基準を表５に示す。
【0032】
表６から、本発明における複合スターターの接種は、ソーセージの外観の完全性を改善し、発酵ソーセージの風味を高め、発酵ソーセージの質感を改善し、発酵ソーセージの全体的な受け入れ可能性を改善することが分かる。
【0033】
【表5】
【0034】
【表6】
【0035】
５、発酵ソーセージ中の生体アミン含有量の測定
ａ．サンプルの調製
実施例３のＣＫ群、ＣＳ群、ＣＨ群のソーセージ完成品の生体アミン含有量を測定した。ソーセージサンプル２．５ｇを量り、細かく切り、内部標準液（１００ｍｇ／Ｌ）１２５Ｌを加え、十分で均一に混合し、その後、０．６ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸溶液１０ｍＬを加えて抽出し、８０００ｒｐｍで３０秒間均質化し、２回繰返し、４℃、８０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を取り、沈殿した部分に対して上記の抽出プロセスを繰り返し、上清を合わせて２５ｍＬに定量した。
ｂ．標準溶液の調製
ヒスタミン、チラミン、プトレシン、カダベリン、トリプタミン、スペルミン、アニリン標準品を適量秤量し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液でそれぞれ１．０ｇ／Ｌ標準原液に調製した。それぞれ標準原液１ｍＬをとり、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて１００ｍｇ／Ｌの標準混合液を調製し、連続希釈を行って、最終濃度１．０、５．０、１０．０、２０．０、１００．０ｍｇ／ｍＬの混合標準使用溶液が得られた。
ｃ．サンプル及び標準溶液のプレカラム誘導体化
サンプルの誘導：試料溶液０．２ｍＬを移送し、２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液４０μＬを加えてｐＨを調整し、次に、６０μＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液と４００μＬの誘導体化剤（１０ｍｇ／ｍＬアセトン）を加え、ボルテックスして均一に混合した。暗所で、４０℃の水浴に４５分間浸し、アンモニア水を２０μＬ加え、均一に混合した後、暗所に３０分間静置して反応を中止した。アセトニトリルを加えて最終体積を１ｍＬにし、０．２２μｍ濾過膜で濾過し、サンプルのロードと検出を待った。標準の誘導：生体アミン標準シリーズ溶液０．２ｍＬをそれぞれ移送し、内部標準液（１００ｍｇ／Ｌ）５０μＬを順次加え、以下の操作は、試料溶液の誘導ステップと同じである。
ｄ．クロマトグラフィー条件
クロマトグラフィーカラムはＷａｔｅｒｓ－ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）、カラム温度は３５℃、ＵＶ検出波長は２５４ｎｍ、サンプル注入量は１０μＬ、流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａはアセトニトリル、Ｂは水であり、勾配溶出を使用し、溶出手順を表７に示す。
ａ．サンプルの調製
実施例３のＣＫ群、ＣＳ群、ＣＨ群のソーセージ完成品の生体アミン含有量を測定した。ソーセージサンプル２．５ｇを量り、細かく切り、内部標準液（１００ｍｇ／Ｌ）１２５Ｌを加え、十分で均一に混合し、その後、０．６ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸溶液１０ｍＬを加えて抽出し、８０００ｒｐｍで３０秒間均質化し、２回繰返し、４℃、８０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を取り、沈殿した部分に対して上記の抽出プロセスを繰り返し、上清を合わせて２５ｍＬに定量した。
ｂ．標準溶液の調製
ヒスタミン、チラミン、プトレシン、カダベリン、トリプタミン、スペルミン、アニリン標準品を適量秤量し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液でそれぞれ１．０ｇ／Ｌ標準原液に調製した。それぞれ標準原液１ｍＬをとり、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて１００ｍｇ／Ｌの標準混合液を調製し、連続希釈を行って、最終濃度１．０、５．０、１０．０、２０．０、１００．０ｍｇ／ｍＬの混合標準使用溶液が得られた。
ｃ．サンプル及び標準溶液のプレカラム誘導体化
サンプルの誘導：試料溶液０．２ｍＬを移送し、２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液４０μＬを加えてｐＨを調整し、次に、６０μＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液と４００μＬの誘導体化剤（１０ｍｇ／ｍＬアセトン）を加え、ボルテックスして均一に混合した。暗所で、４０℃の水浴に４５分間浸し、アンモニア水を２０μＬ加え、均一に混合した後、暗所に３０分間静置して反応を中止した。アセトニトリルを加えて最終体積を１ｍＬにし、０．２２μｍ濾過膜で濾過し、サンプルのロードと検出を待った。標準の誘導：生体アミン標準シリーズ溶液０．２ｍＬをそれぞれ移送し、内部標準液（１００ｍｇ／Ｌ）５０μＬを順次加え、以下の操作は、試料溶液の誘導ステップと同じである。
ｄ．クロマトグラフィー条件
クロマトグラフィーカラムはＷａｔｅｒｓ－ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）、カラム温度は３５℃、ＵＶ検出波長は２５４ｎｍ、サンプル注入量は１０μＬ、流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａはアセトニトリル、Ｂは水であり、勾配溶出を使用し、溶出手順を表７に示す。
【0036】
【表7】
【0037】
結果を表８に示すように、複合スターターを接種したソーセージ中のカダベリン、チラミンおよびスペルミンの含有量は、対照群および商業発酵群より低く、アニリンやヒスタミンは検出されず、対照群および商業発酵群と比較して、複合スターター群の生体アミンの総量は大幅に減少した（Ｐ＜０．０５）。したがって、複合スターターの接種により、発酵ソーセージ中の生体アミンの生成を効果的に減らすことができる。
【0038】
【表8】
【0039】
本発明の実施例を図示し説明してきたが、当業者であれば、本発明の原理および精神から逸脱することなく、これらの実施例に対して様々な変更、修正、置換および変形を行うことができることを理解するであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】