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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025028515
(43)【公開日】2025-03-03
(54)【発明の名称】がん細胞株
(51)【国際特許分類】
C12N 5/09 20100101AFI20250221BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250221BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20250221BHJP
【ＦＩ】
C12N5/09
C12N5/10
C12N15/86 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023133367
(22)【出願日】2023-08-18
(71)【出願人】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】西山 明宏
(72)【発明者】
【氏名】竹内 伸司
(72)【発明者】
【氏名】南條 成輝
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065BA22
4B065BA25
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】皮下腫瘍を容易に形成することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療実験を容易に行うことのできるがん細胞株を提供する。
【解決手段】 皮下腫瘍を形成でき、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である、がん細胞株である。また、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来であるがん細胞株である。また、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６として寄託されたがん細胞株である。また、ルシフェラーゼ遺伝子をさらに導入したがん細胞株である。
【選択図】図３
【解決手段】 皮下腫瘍を形成でき、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である、がん細胞株である。また、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来であるがん細胞株である。また、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６として寄託されたがん細胞株である。また、ルシフェラーゼ遺伝子をさらに導入したがん細胞株である。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
皮下腫瘍を形成でき、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である、がん細胞株。
【請求項2】
ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来であり、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である、がん細胞株。
【請求項3】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６として寄託された細胞株である、請求項１または２に記載のがん細胞株。
【請求項4】
ルシフェラーゼ遺伝子をさらに導入した、請求項１または２に記載のがん細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬効の検討などの試験に有用ながん細胞株に関する。
【背景技術】
【0002】
がん細胞株を用いたがんの病態の研究や薬効の研究は広く行われている。ヒトから樹立したがん細胞株として、例えば、特許文献１には、ヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌に由来する細胞株が開示されている。この技術は、特にヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌に対する癌治療薬剤又はその候補物質の治療効果判定、あるいは予後の予測に関連する因子の探索ならびに開発に利用することができる細胞株を得ようとするものである。
【0003】
一方、がん遺伝子として知られる遺伝子に、ＲＥＴ融合遺伝子がある。正常細胞に存在する正常ＲＥＴ遺伝子と、別の遺伝子とが融合し、ＲＥＴ融合遺伝子が形成されると、細胞の腫瘍化を引き起こし、甲状腺がん、肺がんなどを発症するという機序が知られている。ＲＥＴ融合遺伝子に関して研究を進めることで、甲状腺がん、肺がんの病態の研究や、薬効の検討が可能になると考えられている。
【0004】
ＲＥＴ融合遺伝子の研究に用いることができる細胞株として、ＲＥＴ融合遺伝子肺がん細胞株である、ＬＣ－２／ａｄが知られている。ＬＣ－２／ａｄは、現在、購入が可能なＲＥＴ融合遺伝子肺がん細胞株として知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０１３－２４４０１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ここで、病態や薬効の研究には、マウスなどの実験動物が用いられる。しかしながら、ＬＣ－２／ａｄ細胞株は、免疫不全マウスの皮下で生着困難であり、皮下腫瘍を形成することができないという問題が従来、指摘されている。
すなわち、ＬＣ－２／ａｄ細胞株を用いると、マウスを用いて腫瘍を形成させ、がんについての病態や薬効などの検討に用いることができない。そのため、ＬＣ－２／ａｄ細胞株は実験では扱いづらい問題があった。
すなわち、ＬＣ－２／ａｄ細胞株を用いると、マウスを用いて腫瘍を形成させ、がんについての病態や薬効などの検討に用いることができない。そのため、ＬＣ－２／ａｄ細胞株は実験では扱いづらい問題があった。
【0007】
このため、ＲＥＴ融合遺伝子陽性がん細胞株であって、皮下腫瘍を容易に形成できる、例えばマウスの皮下などに容易に生着し腫瘍を形成することができる細胞株が強く求められている。
【0008】
本発明は上記のような事情を鑑みてなされたものであり、その目的は、皮下腫瘍を容易に形成することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療実験を容易に行うことのできるがん細胞株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記課題を解決するため、本発明は以下の態様を有する。
本発明の態様１は、
皮下腫瘍を形成でき、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である、がん細胞株である。
本発明の態様１は、
皮下腫瘍を形成でき、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である、がん細胞株である。
【0010】
本実施形態の態様２は、
ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来であり、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である、がん細胞株である。
ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来であり、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である、がん細胞株である。
【0011】
本実施形態の態様３は、
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６として寄託された細胞株である、態様１または２に記載のがん細胞株である。
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６として寄託された細胞株である、態様１または２に記載のがん細胞株である。
【0012】
本実施形態の態様４は、
ルシフェラーゼ遺伝子をさらに導入した、態様１または２に記載のがん細胞株である。
ルシフェラーゼ遺伝子をさらに導入した、態様１または２に記載のがん細胞株である。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、皮下腫瘍を容易に形成することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療実験を容易に行うことのできるがん細胞株が得られる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本実施例のＰＢ３０２ｐ細胞株についてのｍＲＮＡ－ｓｅｑの解析結果を示す概略図である。
【図2】本実施例のＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞を移植した髄膜がん腫症モデルのマウスのうち１匹の１～２８日の状態を示す写真図である。
【図3】本実施例のＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞を皮下に移植したマウスの写真図である。
【図4】本実施例のＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞を顕微鏡で観察した写真図である。
【図5】本実施例のＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞に対する選択的ＲＥＴ阻害剤の効果を検証するＭＴＴ ａｓｓａｙの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明に係るがん細胞株について、実施形態を示して説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【0016】
（がん細胞株）
本実施形態のがん細胞株は、皮下腫瘍を形成でき、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である。
皮下腫瘍を形成できるとは、皮下腫瘍状の組織を形成できることを広く指す。さらには、各種の動物の皮下に注射して数十日以内、好ましくは１～２８日で、皮下腫瘍、すなわち皮下での腫瘍状組織を形成できることが好ましい。
ここで動物は、各種動物を適宜使用できるが、哺乳動物、特にマウス、ラット又はウサギ等の実験動物が好適に用いられる。これらの動物では、免疫不全動物、特に免疫不全マウスが好ましいが、これらに限らない。
ここで免疫不全動物は、Ｔ細胞やＢ細胞等の機能に障害が生じ、免疫不全状態にある動物である。これらの動物としては、例えばヌードマウスやＳＣＩＤマウスなどを用いることができる。
本実施形態のがん細胞株は、皮下腫瘍を形成でき、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である。
皮下腫瘍を形成できるとは、皮下腫瘍状の組織を形成できることを広く指す。さらには、各種の動物の皮下に注射して数十日以内、好ましくは１～２８日で、皮下腫瘍、すなわち皮下での腫瘍状組織を形成できることが好ましい。
ここで動物は、各種動物を適宜使用できるが、哺乳動物、特にマウス、ラット又はウサギ等の実験動物が好適に用いられる。これらの動物では、免疫不全動物、特に免疫不全マウスが好ましいが、これらに限らない。
ここで免疫不全動物は、Ｔ細胞やＢ細胞等の機能に障害が生じ、免疫不全状態にある動物である。これらの動物としては、例えばヌードマウスやＳＣＩＤマウスなどを用いることができる。
【0017】
本実施形態のがん細胞株は、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来であってもよい。
ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来であるとは、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られた細胞、又はそこから誘導されて得られた細胞（ＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん細胞）であることを指す。そこから誘導されて得られた細胞とは、例えば前記胸水から得られた細胞に対して遺伝子導入を行った細胞や、スクリーニングにより一定の性質（例えば、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性以外の性質や、生育性など。生育性としては、前記皮下腫瘍の形成能が高いなど）を有する細胞を選択し、株化したものであってもよい。
細胞の株化には、従来知られた方法を用いることができる。例えば、分離した細胞株を公知の組織培養培地で培養し、安定的に増殖するまで定期的に培地を交換し、その後、一年間以上あるいは数十の継代にわたり安定的に増殖する細胞株を選択し、これを候補株としてもよい。
ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来であるとは、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られた細胞、又はそこから誘導されて得られた細胞（ＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん細胞）であることを指す。そこから誘導されて得られた細胞とは、例えば前記胸水から得られた細胞に対して遺伝子導入を行った細胞や、スクリーニングにより一定の性質（例えば、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性以外の性質や、生育性など。生育性としては、前記皮下腫瘍の形成能が高いなど）を有する細胞を選択し、株化したものであってもよい。
細胞の株化には、従来知られた方法を用いることができる。例えば、分離した細胞株を公知の組織培養培地で培養し、安定的に増殖するまで定期的に培地を交換し、その後、一年間以上あるいは数十の継代にわたり安定的に増殖する細胞株を選択し、これを候補株としてもよい。
【0018】
なお、例えば、前記ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られたがん細胞株より、上述した、皮下腫瘍を形成できる細胞株を得ることができる。
具体的には、皮下腫瘍を形成できる細胞株は、前記胸水から得られた細胞をもとに誘導し、スクリーニングや継続培養等により得ることができる。スクリーニングとしては、例えばｉｎ ｖｉｖоスクリーニングを用いることができる。例えば、胸水から得られた細胞を株化した細胞をマウスなどの実験動物に皮下移植し、皮下腫瘍の形成能が高い細胞を摘出し、培養、株化してもよい。
具体的には、皮下腫瘍を形成できる細胞株は、前記胸水から得られた細胞をもとに誘導し、スクリーニングや継続培養等により得ることができる。スクリーニングとしては、例えばｉｎ ｖｉｖоスクリーニングを用いることができる。例えば、胸水から得られた細胞を株化した細胞をマウスなどの実験動物に皮下移植し、皮下腫瘍の形成能が高い細胞を摘出し、培養、株化してもよい。
【0019】
後述する本実施例では、前記ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られたＲＥＴ融合遺伝子陽性のがん細胞株（後述の実施例では、ＰＢ３０２ｐ）は、皮下腫瘍を形成できるＲＥＴ融合遺伝子陽性のがん細胞株（ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ）及び、皮下腫瘤を形成できるＲＥＴ融合遺伝子陽性のがん細胞株（ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ（ＰＢ３０２））を誘導して得るために用いることができる。これらの誘導された細胞株もいずれも、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来の細胞株である。
【0020】
本実施形態のがん細胞株は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６として寄託された細胞株であってもよい。
実施例において後述するように、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６として寄託された細胞株（後述の実施例においては、ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞株、又は、単にＰＢ３０２細胞株）は、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来であり、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である。
この細胞株はまた、皮下腫瘍を形成できる。すなわち、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水から得られたＲＥＴ融合遺伝子陽性をスクリーニングし、皮下腫瘍を形成できる細胞株を樹立する工程を経て得られている。この細胞株はまた、ルシフェラーゼ遺伝子が導入されている。この細胞株はまた、動物の皮下に移植した際に皮下腫瘍を形成できる。
実施例において後述するように、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６として寄託された細胞株（後述の実施例においては、ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞株、又は、単にＰＢ３０２細胞株）は、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水由来であり、ＲＥＴ融合遺伝子陽性である。
この細胞株はまた、皮下腫瘍を形成できる。すなわち、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者胸水から得られたＲＥＴ融合遺伝子陽性をスクリーニングし、皮下腫瘍を形成できる細胞株を樹立する工程を経て得られている。この細胞株はまた、ルシフェラーゼ遺伝子が導入されている。この細胞株はまた、動物の皮下に移植した際に皮下腫瘍を形成できる。
【0021】
本実施形態のがん細胞株は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６として寄託された細胞株と、同等の生物学的性質を有する細胞株であってもよい。
【0022】
本実施形態の細胞株、特にＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞株の特徴としては、コンフルエント状態（目安として、１．０～５．０×１０５個／ｃｍ２）では小円形細胞を呈している。
【0023】
本実施形態のがん細胞株は、他の遺伝子をさらに導入したものであってもよい。
他の遺伝子を導入する方法としては、例えば前記遺伝子を導入したウィルスベクターをがん細胞株に感染させることにより導入することができる。ウィルスベクターをがん細胞株に感染させる方法としては、従来のウィルスベクターを感染させる方法を適宜用いることができる。
導入することのできる遺伝子としては、ルシフェラーゼなどが挙げられる。
他の遺伝子を導入する方法としては、例えば前記遺伝子を導入したウィルスベクターをがん細胞株に感染させることにより導入することができる。ウィルスベクターをがん細胞株に感染させる方法としては、従来のウィルスベクターを感染させる方法を適宜用いることができる。
導入することのできる遺伝子としては、ルシフェラーゼなどが挙げられる。
【0024】
本実施形態のがん細胞株は、ルシフェラーゼ遺伝子をさらに導入したものであることがさらに好ましい。
ルシフェラーゼは発光アッセイのための遺伝子として広く用いられており、ルシフェラーゼの発現、すなわち発光を調べることで本実施形態のがん細胞株の位置を容易に確認することができるので、生物学的な検討に有用である。
ルシフェラーゼは発光アッセイのための遺伝子として広く用いられており、ルシフェラーゼの発現、すなわち発光を調べることで本実施形態のがん細胞株の位置を容易に確認することができるので、生物学的な検討に有用である。
【0025】
本実施形態のがん細胞株は、腫瘤を形成できるものであってもよい。腫瘤を容易に形成できるとは、例えば、前記動物に細胞株を移植して数日、好ましくは１～１０日で腫瘤が形成されることである。皮下腫瘤については、特に、皮下に細胞株を移植し、４日以内に皮下腫瘤を形成できるものであってもよい。
腫瘤を容易に形成できる細胞株は、前記ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られた細胞から、スクリーニングや継続培養等により得ることができる。例えば、胸水から得られた細胞を株化した細胞をマウスなどの実験動物に皮下移植し、皮下腫瘍の形成能が高かった組織から細胞を摘出し、株化することなどによって得ることができる。
腫瘤を容易に形成できる細胞株は、前記ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られた細胞から、スクリーニングや継続培養等により得ることができる。例えば、胸水から得られた細胞を株化した細胞をマウスなどの実験動物に皮下移植し、皮下腫瘍の形成能が高かった組織から細胞を摘出し、株化することなどによって得ることができる。
【0026】
本実施形態のがん細胞株は、ＫＩＦ５Ｂ及びＲＥＴ遺伝子を有することが好ましい。
特に、ゲノム上に、ＫＩＦ５Ｂ及びＲＥＴ遺伝子が融合した配列を有することが好ましい。
ＫＩＦ５Ｂは、がん組織、例えば非小細胞肺がんにおけるＲＥＴ遺伝子との融合パートナーとして知られるうち、パートナーとなる頻度が高い因子として知られる。本実施形態の癌細胞は、ＲＥＴ遺伝子のパートナーとなる頻度が高い遺伝子を有することで、がんの機序の解析に関する試験に特に好適に用いることができる。
細胞株が有する遺伝子については、例えばｍＲＮＡ－ｓｅｑなどによって確認することができる。
特に、ゲノム上に、ＫＩＦ５Ｂ及びＲＥＴ遺伝子が融合した配列を有することが好ましい。
ＫＩＦ５Ｂは、がん組織、例えば非小細胞肺がんにおけるＲＥＴ遺伝子との融合パートナーとして知られるうち、パートナーとなる頻度が高い因子として知られる。本実施形態の癌細胞は、ＲＥＴ遺伝子のパートナーとなる頻度が高い遺伝子を有することで、がんの機序の解析に関する試験に特に好適に用いることができる。
細胞株が有する遺伝子については、例えばｍＲＮＡ－ｓｅｑなどによって確認することができる。
【0027】
本実施形態のがん細胞株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用するためのがん細胞株であってもよい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験は、従来知られたものを適宜使用できる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ実験としては、動物を用いた試験などが挙げられる。動物を用いた試験としては、本実施形態のがん細胞株を動物の組織に移植し、がん組織の発達や転移などを調べるための試験研究に主に用いることができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験は、従来知られたものを適宜使用できる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ実験としては、動物を用いた試験などが挙げられる。動物を用いた試験としては、本実施形態のがん細胞株を動物の組織に移植し、がん組織の発達や転移などを調べるための試験研究に主に用いることができる。
【0028】
がんについてのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験には、例えば薬剤のがんに対する影響を調べる使用マーカーを使用することができる。腫瘍マーカーとして血清ＡＦＰ、ＧＰＣ３等の濃度や、細胞株の増殖率、遊走能、浸潤能を測定することで、がん治療薬剤候補物質のがん細胞増殖抑制効果を判定することができる。
【0029】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験、例えば薬剤をスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングとして用いることのできる細胞株の培養方法、がん治療薬剤候補物質と接触させる方法は、当業者であれば対象候補物質に応じて適宜至適条件を設定することができる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングにおける腫瘍マーカーの測定は、上述の手法を用いることができる。
【0030】
ｉｎ ｖｉｖｏ実験、例えば薬剤をスクリーニングするｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングとしては、例えば、がん治療薬剤候補物質を本実施形態のがん細胞株を移植した非ヒト哺乳動物に投与して、がん細胞増殖抑制効果を試験する工程を含むｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングに用いることができる。このとき、前記腫瘍マーカーを指標とし、又は腫瘍の組織学的所見をもとに、がん治療薬剤候補物質のがん細胞増殖抑制効果を判定することができる。
【0031】
ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングにおける癌治療薬剤候補物質の投与方法は、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射もしくは、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に投与するなど、当業者であれば適宜選択することができる。また、 ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングにおける腫瘍マーカーの測定は、上述の手法を用いることができる。組織学的所見に関しても、常法により行うことができる。
【0032】
本実施形態のがん細胞株は、皮下で腫瘍または腫瘤を形成できるものである場合、これらの発達（成長、縮小、その他の変形）によってがん細胞の機序を容易に確認することができるので、特に有用である。
【0033】
本実施形態のがん細胞株は、中枢神経モデルの形成に使用することができることが好ましい。中枢神経モデルとしては、髄膜癌腫症、脳腫瘍などの疾患のモデルが挙げられる。
【0034】
本実施形態のがん細胞株は、ＲＥＴ阻害剤を投与することによって、前記腫瘍または腫瘤が小さくなるものであることが好ましい。
ＲＥＴ阻害剤の投与によって腫瘍または腫瘤が小さくなる性質を有することで、がん治療薬や診断薬などの選択、薬効検討などの試験全般に有用に用いることができる。
例えばＩｎ ｖｉｔｒｏにおける選択的ＲＥＴ阻害薬の効果は、ＭＴＴ ａｓｓａｙなどを用いて効果を確認することができる。
ＲＥＴ阻害剤の投与によって腫瘍または腫瘤が小さくなる性質を有することで、がん治療薬や診断薬などの選択、薬効検討などの試験全般に有用に用いることができる。
例えばＩｎ ｖｉｔｒｏにおける選択的ＲＥＴ阻害薬の効果は、ＭＴＴ ａｓｓａｙなどを用いて効果を確認することができる。
【0035】
（本実施形態のがん細胞株の使用）
本実施形態のがん細胞株は、各種の疾患のモデルをマウス等を用いて作製する際に使用可能である。例えば、前記ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られた細胞（例えばＰＢ３０２ｐ）およびルシフェラーゼを導入した細胞（例えばＰＢ３０２／ｌｕｃ）は、脳転移モデル、髄膜がん腫症モデルなどの中枢神経モデルの作製に使用することができる。皮下腫瘍を形成可能な細胞（例えばＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ）および皮下腫瘤を形成可能な細胞（例えばＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ）は、それらのモデルに加えて、皮下腫瘍形成、胸腔移植、肺移植のモデルの作製に使用することができる。
本実施形態のがん細胞株は、各種の疾患のモデルをマウス等を用いて作製する際に使用可能である。例えば、前記ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られた細胞（例えばＰＢ３０２ｐ）およびルシフェラーゼを導入した細胞（例えばＰＢ３０２／ｌｕｃ）は、脳転移モデル、髄膜がん腫症モデルなどの中枢神経モデルの作製に使用することができる。皮下腫瘍を形成可能な細胞（例えばＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ）および皮下腫瘤を形成可能な細胞（例えばＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ）は、それらのモデルに加えて、皮下腫瘍形成、胸腔移植、肺移植のモデルの作製に使用することができる。
【0036】
例えば、中枢神経モデルとして、マウスのがん細胞株の脳内移植モデルは、以下のように作成することができる。マウスを麻酔し、保定して両耳の間の皮膚を切開し、右頭蓋骨を露出し、滑膜を除去してから頭蓋骨に穴をあけ、シリンジ等で前記細胞の懸濁液を注入する。切開した皮膚を針縫合する。細胞懸濁液の注入量は、通常のマウスの大きさの場合、細胞数１～５×１０５、懸濁液の容積は１～２μＬ程度が適切である。
【0037】
また、中枢神経モデルとして、マウスのがん細胞株の髄腔投与による髄膜がん腫症モデルは、以下のように作成することができる。マウスを麻酔し、保定して、頭蓋骨下端と脊柱上端の間隙に針を刺し、前記細胞の懸濁液を注入する。細胞懸濁液の注入量は、通常のマウスの大きさの場合、細胞数１～５×１０５、容積は２０～１００μＬ程度とするのが適切である。
【0038】
また、マウスのがん細胞株の骨移植モデルは、以下のように作成することができる。マウスの足などの注射箇所を除毛し、マウスを麻酔する。ひざを曲げて膝関節の白くなっている部分に注射針つきのシリンジで５ｍｍほどの孔を一度設ける。注射針を抜き、そのまま開けた穴にマイクロシリンジ挿入し、細胞懸濁液を注入する。細胞個数は１～５×１０５、容積は１～５μＬ程度とするのが適切である。
【0039】
（本実施形態の効果）
本実施形態のがん細胞株によれば、皮下腫瘍を容易に形成することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療実験を容易に行うことができる。
本実施形態のがん細胞株は、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られたＲＥＴ融合遺伝子陽性のがん細胞株（ＰＢ３０２ｐ）を含み、そこから誘導され株化された、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水由来のがん細胞株（ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ又はＰＢ３０２）はルシフェラーゼ遺伝子が導入され、皮下に生着して皮下腫瘍を形成することができ、また、動物に移植された際に皮下腫瘤を容易に形成できる。
本実施形態のがん細胞株によれば、皮下腫瘍を容易に形成することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療実験を容易に行うことができる。
本実施形態のがん細胞株は、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られたＲＥＴ融合遺伝子陽性のがん細胞株（ＰＢ３０２ｐ）を含み、そこから誘導され株化された、ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水由来のがん細胞株（ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ又はＰＢ３０２）はルシフェラーゼ遺伝子が導入され、皮下に生着して皮下腫瘍を形成することができ、また、動物に移植された際に皮下腫瘤を容易に形成できる。
【0040】
ヒトＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん罹患者の胸水から得られたＰＢ３０２ｐ、及びそこから誘導されたＰＢ３０２を含む細胞株は、クロモソーム１０にＫＩＦ５ＢおよびＲＥＴ遺伝子を有している。
ＫＩＦ５Ｂは、がん組織、例えば非小細胞肺がんにおけるＲＥＴ遺伝子との融合パートナーとして知られているが、頻度として６０～９０％に及ぶことがあり、他のパートナー（例えば、ＥＭＬ４、ＴＲＩＭ３３など）と比べると、きわめてパートナーとなる頻度の高い因子である。
ＫＩＦ５Ｂは、がん組織、例えば非小細胞肺がんにおけるＲＥＴ遺伝子との融合パートナーとして知られているが、頻度として６０～９０％に及ぶことがあり、他のパートナー（例えば、ＥＭＬ４、ＴＲＩＭ３３など）と比べると、きわめてパートナーとなる頻度の高い因子である。
【0041】
従来、ＲＥＴ融合遺伝子肺がん細胞株として市販されていたＬＣ－２／Ａｄ細胞株は、パートナー遺伝子としては頻度が比較的高いＣＣＤＣ６とＲＥＴ遺伝子が融合されていたが、皮下に生着することができず、皮下腫瘍モデルをはじめとして実験に用いることが困難であった。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＥＴ阻害薬の効果は不安定であり、ＲＥＴ阻害薬を用いたがんの検証の実験には用いることが困難であった。
融合パートナーとしてＥＭＬ４、ＴＲＩＭ３３の遺伝子を有する細胞株は見出されているが（それぞれＣＵＴＯ４２細胞株、ＥＣＬＣ５Ｂ細胞株）これらはＲＥＴの融合パートナーとして頻度が低い。
融合パートナーとして頻度の高いＫＩＦＢの遺伝子を有する細胞株（ＣＵＴＯ２２など）が、コロラド大学で樹立されているが、これらは皮下での生着しないもの、又はＲＥＴ阻害薬の効果が無いものであり、いずれも実験に用いることは困難であった。
また、これらの従来知られていたＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん細胞株は、いずれも他の転移モデルの検討は行われていない。
融合パートナーとしてＥＭＬ４、ＴＲＩＭ３３の遺伝子を有する細胞株は見出されているが（それぞれＣＵＴＯ４２細胞株、ＥＣＬＣ５Ｂ細胞株）これらはＲＥＴの融合パートナーとして頻度が低い。
融合パートナーとして頻度の高いＫＩＦＢの遺伝子を有する細胞株（ＣＵＴＯ２２など）が、コロラド大学で樹立されているが、これらは皮下での生着しないもの、又はＲＥＴ阻害薬の効果が無いものであり、いずれも実験に用いることは困難であった。
また、これらの従来知られていたＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん細胞株は、いずれも他の転移モデルの検討は行われていない。
【0042】
これに対して、本実施形態のがん細胞株（ＰＢ３０２）は、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＲＥＴ阻害薬の効果を確認、（２）ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合遺伝子陽性でマウス皮下に生着、（３）中枢神経モデルの作製に成功、という特徴を有する。これらの３条件を満たす細胞株は、発明者らが樹立したもののみである。
本実施形態のがん細胞株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ｉｎ ｖｉｖｏの治療実験で、頭蓋外の薬効をリーズナブルに確認できるため、従来知られているＬＣ－２／ａｄなどのＲＥＴ融合遺伝子肺がん細胞株に置き換わる細胞株として、製薬方面でも注目される可能性がある。
本実施形態のがん細胞株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ｉｎ ｖｉｖｏの治療実験で、頭蓋外の薬効をリーズナブルに確認できるため、従来知られているＬＣ－２／ａｄなどのＲＥＴ融合遺伝子肺がん細胞株に置き換わる細胞株として、製薬方面でも注目される可能性がある。
【実施例0043】
以下、実施例を示す。なお、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0044】
（細胞の培養、保存等の条件）
細胞の培養の操作は、後述するそれぞれの培地に５．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上で播種し、５～８日程度で継代を行った。ＰＢＳで２回洗浄後、０．０５％ トリプシンＥＤＴＡ（２５３０００５４， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を３分間３７℃で暴露し、継代を行った。
細胞の保存の操作は、保護剤としてセルバンカー（カタログ番号 ＣＢ０２１、ロット番号 ２２０２０８）を添加し、－１６０℃のフリーザーで冷凍した。
保存した細胞の溶解は、３７℃ウォーターバスにて融解し、１５－４０ｍＬの前記培地に懸濁して遠心洗浄した。
細胞の培養の操作は、後述するそれぞれの培地に５．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上で播種し、５～８日程度で継代を行った。ＰＢＳで２回洗浄後、０．０５％ トリプシンＥＤＴＡ（２５３０００５４， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を３分間３７℃で暴露し、継代を行った。
細胞の保存の操作は、保護剤としてセルバンカー（カタログ番号 ＣＢ０２１、ロット番号 ２２０２０８）を添加し、－１６０℃のフリーザーで冷凍した。
保存した細胞の溶解は、３７℃ウォーターバスにて融解し、１５－４０ｍＬの前記培地に懸濁して遠心洗浄した。
【0045】
（ヒト由来細胞の寄託条件）
以下で用いるヒト由来細胞は、ＪＣＲＢ細胞バンク寄託条件をクリアしているものを用いた。ＪＣＲＢ細胞バンク研究倫理クリアランス（ヒト由来培養細胞研究資源寄託）として、科学技術庁による「ヒトゲノム研究に関する基本原則（２０００．Ａｐｒ．１１）、第９項」ならびに厚生省の「遺伝子解析研究に付随する倫理問題等に対応するための指針（２０００．Ｆｅｂ．４）、第６項、第７項」に基づき、細胞バンクに寄託できるヒト由来細胞として、満たすことが義務付けられている次の２条件を満たすものを用いた。（１）匿名化されたうえで試料提供者個人を特定できない（アンリンク）細胞であること（Ｃｏｄｅｄ Ｕｎｌｉｎｋｅｄ Ｓａｍｐｌｅ）。（２）生体試料採取時に試料提供者から研究利用への承諾を文書で得ていること。
以下で用いるヒト由来細胞は、ＪＣＲＢ細胞バンク寄託条件をクリアしているものを用いた。ＪＣＲＢ細胞バンク研究倫理クリアランス（ヒト由来培養細胞研究資源寄託）として、科学技術庁による「ヒトゲノム研究に関する基本原則（２０００．Ａｐｒ．１１）、第９項」ならびに厚生省の「遺伝子解析研究に付随する倫理問題等に対応するための指針（２０００．Ｆｅｂ．４）、第６項、第７項」に基づき、細胞バンクに寄託できるヒト由来細胞として、満たすことが義務付けられている次の２条件を満たすものを用いた。（１）匿名化されたうえで試料提供者個人を特定できない（アンリンク）細胞であること（Ｃｏｄｅｄ Ｕｎｌｉｎｋｅｄ Ｓａｍｐｌｅ）。（２）生体試料採取時に試料提供者から研究利用への承諾を文書で得ていること。
【0046】
［試験例１］
（ＰＢ３０２ｐ細胞株の樹立）
ＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん患者の同意を得て、該患者の胸水をＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ （ＬＭＳ）（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， ＬＯＴ ＮＯ． Ｓ８６５８）を用いてがん細胞を分離した。
具体的には、１５ｍｌのチューブにＬＭＳを４ｍｌまず入れ、その上より胸水１０ｍｌを入れる。遠心条件を４００ｇ、１５分間として、遠心後はチューブの中間に見られる細胞層を１０００μｌのピペットマンを用いて吸い込み、培養液を入れた１０ｃｍ ｄｉｓｈに入れる。
該がん細胞を、ＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１８７５０９３）５００ｍＬに１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン・ストレプトマイシンを加えた培地で培養、増殖を行った。この細胞の継代を重ね、安定的に増殖する細胞株を選択した。
この細胞株を、ＰＢ３０２ｐ細胞株とした。
（ＰＢ３０２ｐ細胞株の樹立）
ＲＥＴ融合遺伝子陽性肺がん患者の同意を得て、該患者の胸水をＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ （ＬＭＳ）（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， ＬＯＴ ＮＯ． Ｓ８６５８）を用いてがん細胞を分離した。
具体的には、１５ｍｌのチューブにＬＭＳを４ｍｌまず入れ、その上より胸水１０ｍｌを入れる。遠心条件を４００ｇ、１５分間として、遠心後はチューブの中間に見られる細胞層を１０００μｌのピペットマンを用いて吸い込み、培養液を入れた１０ｃｍ ｄｉｓｈに入れる。
該がん細胞を、ＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１８７５０９３）５００ｍＬに１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン・ストレプトマイシンを加えた培地で培養、増殖を行った。この細胞の継代を重ね、安定的に増殖する細胞株を選択した。
この細胞株を、ＰＢ３０２ｐ細胞株とした。
【0047】
得られたＰＢ３０２ｐ細胞株について、真核生物ｍＲＮＡ－ｓｅｑを解析した。解析は概略としては、ＦａｓｔＱＣによるシーケンスリードの品質確認、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃによるシーケンスリードのトリミング、ＳＴＡＲによるシーケンスリードのマッピング、ａｒｒｉｂａによる融合遺伝子の検出及びＦｉｇｕｒｅの作製、の順で行った。
【0048】
図１に、ＰＢ３０２ｐ細胞株についてのｍＲＮＡ－ｓｅｑの解析結果を示した。クロモソーム１０に、ＫＩＦ５ＢとＲＥＴ遺伝子が融合していることが明らかとなった。
すなわち、ＰＢ３０２ｐ細胞株は、ＲＥＴ遺伝子と融合してがん遺伝子となる融合パートナーとして知られている、ＫＩＦ５Ｂと、ＲＥＴの融合遺伝子を有する。
すなわち、ＰＢ３０２ｐ細胞株は、ＲＥＴ遺伝子と融合してがん遺伝子となる融合パートナーとして知られている、ＫＩＦ５Ｂと、ＲＥＴの融合遺伝子を有する。
【0049】
［試験例２］
（ＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞株の作製）
前記ＰＢ３０２ｐ細胞株にウィルスベクターを感染させ、ルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞株を作成した。
（ＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞株の作製）
前記ＰＢ３０２ｐ細胞株にウィルスベクターを感染させ、ルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞株を作成した。
【0050】
試薬として、
・感染させるがん細胞株：ＰＢ３０２ｐ
・予備検討に用いた細胞：２９３Ｔ 細胞株（ヒト胎児腎細胞）
・Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｒ）ＬＴＸ ＆ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ １５３３８－１００）
・ベクター （ＭａＲＸＴＭ ＩＶｆ ｐｕｒｏ－ＥＧＦＰ－ＥＬｕｃ）
・Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ Ａｍｐｈｏ （ＴａＫａＲａ ＃６１６１）
・８ｍｇ／ｍＬ Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ ［別名 Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ］ （ＳＩＧＭＡ ＃９２６８）
・ＰＥＧ－ｉｔＴＭ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃａｔ ＬＶ８１０Ａ－１）
・１０ｍｇ／ｍＬ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ
を用いた。
・感染させるがん細胞株：ＰＢ３０２ｐ
・予備検討に用いた細胞：２９３Ｔ 細胞株（ヒト胎児腎細胞）
・Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｒ）ＬＴＸ ＆ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ １５３３８－１００）
・ベクター （ＭａＲＸＴＭ ＩＶｆ ｐｕｒｏ－ＥＧＦＰ－ＥＬｕｃ）
・Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ Ａｍｐｈｏ （ＴａＫａＲａ ＃６１６１）
・８ｍｇ／ｍＬ Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ ［別名 Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ］ （ＳＩＧＭＡ ＃９２６８）
・ＰＥＧ－ｉｔＴＭ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃａｔ ＬＶ８１０Ａ－１）
・１０ｍｇ／ｍＬ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ
を用いた。
【0051】
２９３Ｔ細胞を用いた予備検討として、後述するように、
・感染させるがん細胞の Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ に対する感受性 （２４ ｈ）
（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ． ０， １， ２， ４， ８， １６ μｇ／ｍＬ）
・感染させるがん細胞のＰｕｒｏｍｙｃｉｎに対する感受性 ＭＴＴ ａｓｓａｙ （７２～９６ ｈ）
（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ． ０， ０．０３， ０．１， ０．３， １， ３， １０μｇ／ｍＬ）
を行った。
・感染させるがん細胞の Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ に対する感受性 （２４ ｈ）
（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ． ０， １， ２， ４， ８， １６ μｇ／ｍＬ）
・感染させるがん細胞のＰｕｒｏｍｙｃｉｎに対する感受性 ＭＴＴ ａｓｓａｙ （７２～９６ ｈ）
（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ． ０， ０．０３， ０．１， ０．３， １， ３， １０μｇ／ｍＬ）
を行った。
【0052】
感染の操作は以下のように行った。
１日目：細胞を２．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ ｉｎ １０ｃｍ ｄｉｓｈ ２枚に播き（１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ Ｐ／Ｓ［＋］）、３７℃で一晩培養した。
２～３日目：培地を除去、新鮮な培地 （１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ Ｐ／Ｓ［－］） ９ｍＬ を加えた。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ－Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ ２ｍＬ にＭａＲＸＴＭ ＩＶｆ ｐｕｒｏ－ＥＧＦＰ－ＥＬｕｃ （１５μｇ）、ｐＧＰ ｖｅｃｔｏｒ （７．５μｇ） （Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ Ａｍｐｈｏに付属）、ｐＥ－ａｍｐｈｏ ｖｅｃｔｏｒ （７．５μｇ） （Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ Ａｍｐｈｏに付属）を加えた。
ＰＬＵＳ ｒｅａｇｅｎｔ ３０μＬ を加え撹拌し、室温で５ｍｉｎ 静置、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ７５μＬ を加えた。数回ピペッティングして、室温で ３０ｍｉｎ 静置した。細胞が播かれたディッシュに１ｍＬの調製した溶液を添加（１ｍＬ ｘ ２枚）、３７℃にて培養した。６～８ｈ後に１０ｍＬの新鮮な培地に交換（１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ Ｐ／Ｓ［＋］）し、３７℃にて４８ｈ培養し、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの蛍光を確認した。
４日目：ここから先廃棄物は全て Ｐ２ 対応とした。培養上清 （２０ｍＬ） を ５０ｍＬ のＦａｌｃｏｎ チューブに回収した （細胞は廃棄）。２０ｍＬ の培養上清を ０．４４μｍ フィルターに通し、新しい５０ｍＬチューブに回収した。ＰＥＧ－ｉｔＴＭ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５ｍＬ を添加した。数回撹拌し、４℃にて一晩静置した。
５日目：１，５００ｇ×３０ｍｉｎで遠心分離し、沈殿を回収し、上清は廃棄した。沈殿を１ｍＬ の１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ Ｐ／Ｓ［＋］に懸濁し、エッペンドルフチューブに回収した。この溶液を２０倍濃縮のウイルス溶液とし、－８０℃で保存した。
１日目：細胞を２．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬ ｉｎ １０ｃｍ ｄｉｓｈ ２枚に播き（１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ Ｐ／Ｓ［＋］）、３７℃で一晩培養した。
２～３日目：培地を除去、新鮮な培地 （１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ Ｐ／Ｓ［－］） ９ｍＬ を加えた。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ－Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ ２ｍＬ にＭａＲＸＴＭ ＩＶｆ ｐｕｒｏ－ＥＧＦＰ－ＥＬｕｃ （１５μｇ）、ｐＧＰ ｖｅｃｔｏｒ （７．５μｇ） （Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ Ａｍｐｈｏに付属）、ｐＥ－ａｍｐｈｏ ｖｅｃｔｏｒ （７．５μｇ） （Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ Ａｍｐｈｏに付属）を加えた。
ＰＬＵＳ ｒｅａｇｅｎｔ ３０μＬ を加え撹拌し、室温で５ｍｉｎ 静置、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ７５μＬ を加えた。数回ピペッティングして、室温で ３０ｍｉｎ 静置した。細胞が播かれたディッシュに１ｍＬの調製した溶液を添加（１ｍＬ ｘ ２枚）、３７℃にて培養した。６～８ｈ後に１０ｍＬの新鮮な培地に交換（１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ Ｐ／Ｓ［＋］）し、３７℃にて４８ｈ培養し、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの蛍光を確認した。
４日目：ここから先廃棄物は全て Ｐ２ 対応とした。培養上清 （２０ｍＬ） を ５０ｍＬ のＦａｌｃｏｎ チューブに回収した （細胞は廃棄）。２０ｍＬ の培養上清を ０．４４μｍ フィルターに通し、新しい５０ｍＬチューブに回収した。ＰＥＧ－ｉｔＴＭ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５ｍＬ を添加した。数回撹拌し、４℃にて一晩静置した。
５日目：１，５００ｇ×３０ｍｉｎで遠心分離し、沈殿を回収し、上清は廃棄した。沈殿を１ｍＬ の１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ Ｐ／Ｓ［＋］に懸濁し、エッペンドルフチューブに回収した。この溶液を２０倍濃縮のウイルス溶液とし、－８０℃で保存した。
【0053】
がん細胞への感染実験は以下のように行った。
１日目：２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの６ｗｅｌｌに細胞（ＰＢ３０２ｐ）を２×１０４ｃｅｌｌ／１ｍＬ播き、３７℃で一晩培養した。
２日目：培地を除去し、新鮮な培地１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ Ｐ／Ｓ（＋）を０．４ｍＬずつ加えた。各ウェルに、非感染、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅのみ添加、ｘ１、ｘ２．５、ｘ５、ｘ１０倍濃縮となるように上述のウイルス溶液と、残りに上記培地を加えて６００μＬとした。Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅの濃度は２４ｈの培養で細胞毒性の無い濃度をあらかじめ予備検討し決定したもので、非感染のウェル以外に１μＬずつ加えた。３７℃にて一晩培養した。
３日目：上清を除去し、新鮮な培地１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ Ｐ／Ｓ（＋）を１ｍＬ加え、３７℃で２４～４８ｈ培養した。
４～５日目：顕微鏡下で最適なウェルを選択し、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ入りの培地で培養開始した。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎの濃度は、親株が９０％程度の増殖阻害が認められる濃度を予備検討で決定した。
１日目：２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの６ｗｅｌｌに細胞（ＰＢ３０２ｐ）を２×１０４ｃｅｌｌ／１ｍＬ播き、３７℃で一晩培養した。
２日目：培地を除去し、新鮮な培地１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ Ｐ／Ｓ（＋）を０．４ｍＬずつ加えた。各ウェルに、非感染、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅのみ添加、ｘ１、ｘ２．５、ｘ５、ｘ１０倍濃縮となるように上述のウイルス溶液と、残りに上記培地を加えて６００μＬとした。Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅの濃度は２４ｈの培養で細胞毒性の無い濃度をあらかじめ予備検討し決定したもので、非感染のウェル以外に１μＬずつ加えた。３７℃にて一晩培養した。
３日目：上清を除去し、新鮮な培地１０％ＦＣＳ－ＲＰＭＩ Ｐ／Ｓ（＋）を１ｍＬ加え、３７℃で２４～４８ｈ培養した。
４～５日目：顕微鏡下で最適なウェルを選択し、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ入りの培地で培養開始した。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎの濃度は、親株が９０％程度の増殖阻害が認められる濃度を予備検討で決定した。
【0054】
本実施例では、上記感染操作で、上述の２０倍濃縮のウイルス溶液を用いた。がん細胞に×１０倍濃縮の状態でウイルスを感染させ、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ入り培地で培養し、ルシフェラーゼ遺伝子の導入を確認した。
ウィルスベクターの感染によりルシフェラーゼ遺伝子が導入されたＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞株を得た。
ウィルスベクターの感染によりルシフェラーゼ遺伝子が導入されたＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞株を得た。
【0055】
得られたＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞株は、皮下で腫瘍を形成せず、胸腔移植および肺移植を行うも生着しなかった。一方で、脳転移モデル、髄膜がん腫症モデルに用いることができる性質を有していた。この性質は、既存の樹立細胞株のような性質であった。
【0056】
［試験例３］
（ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ細胞株の作製）
ＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞株を用いて３匹の髄膜がん腫症モデルのマウスを以下の操作を経て作製した。
（ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ細胞株の作製）
ＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞株を用いて３匹の髄膜がん腫症モデルのマウスを以下の操作を経て作製した。
【0057】
髄膜がん腫症モデルのマウスは、免疫不全マウスから以下の操作を経て作成した。
マウスをイソフルレン吸入麻酔により眠らせた。左手でマウスの鼻と頭を伸ばすように把持し一直線になるように固定した。頭蓋骨下端と脊柱上端に間隙があるので、そこから２７Ｇ針を４５度の角度で穿刺し、脊柱に潜り込ませるように針を進めた。このとき、針によってマウスの体が持ち上がった状態となるようにした。濃度は１×１０５／５０μＬのＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞を、注入量５０μＬで注入した。
マウスをイソフルレン吸入麻酔により眠らせた。左手でマウスの鼻と頭を伸ばすように把持し一直線になるように固定した。頭蓋骨下端と脊柱上端に間隙があるので、そこから２７Ｇ針を４５度の角度で穿刺し、脊柱に潜り込ませるように針を進めた。このとき、針によってマウスの体が持ち上がった状態となるようにした。濃度は１×１０５／５０μＬのＰＢ３０２／ｌｕｃ細胞を、注入量５０μＬで注入した。
【0058】
この髄膜がん腫症モデルのマウスにて、髄腔で細胞が生着したことを確認した（図２）。
図２に、髄膜がん腫症モデルのマウスが時間経過で腫瘍が進展する様子を示す（合計３匹、Ｄａｙ２８の２匹は枠で囲んでいる１匹とは別）。写真中の発光はＰＢ３０２／ｌｕｃのルシフェラーゼのシグナルをマウス腹腔内にルシフェリンを投与し、ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて検出したものである。
ついで、マウスを解剖し発光している箇所（腫瘍）を取り出し、１０ｃｍ ｄｉｓｈにてＲＰＭＩで培養した。腫瘍から細胞株化（ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ）したことを確認し、免疫不全マウスを用いて皮下腫瘍の形成試験も行った。
１５ｃｍ ｄｉｓｈ 複数枚に細胞が８０％コンフルエントになるように培養した。メディウムを除去し、ＰＢＳ で洗浄した。０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ溶液を加えて、細胞がはがれるまで３７℃インキュベーターに静置し、１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩを加えてＴｒｙｐｓｉｎを中和し、５０ｍＬチューブに細胞懸濁液を回収した。２０ｍＬのメディウムでｄｉｓｈを洗浄し、洗浄液を回収した。１，１００ｒｐｍ×５ｍｉｎ 遠心細胞ペレットを５０ｍＬのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で懸濁し、５０ｍＬチューブ一本にまとめた。
細胞数をカウントし、１，１００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心して得た細胞ペレットを３～５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＨＢＳＳで懸濁した。マウス体側皮下に２７Ｇ注射針付きシリンジを用いて０．１ｍＬ／ｈｅａｄ（３～５×１０６ｃｅｌｌｓ）移植した。
図２に、髄膜がん腫症モデルのマウスが時間経過で腫瘍が進展する様子を示す（合計３匹、Ｄａｙ２８の２匹は枠で囲んでいる１匹とは別）。写真中の発光はＰＢ３０２／ｌｕｃのルシフェラーゼのシグナルをマウス腹腔内にルシフェリンを投与し、ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて検出したものである。
ついで、マウスを解剖し発光している箇所（腫瘍）を取り出し、１０ｃｍ ｄｉｓｈにてＲＰＭＩで培養した。腫瘍から細胞株化（ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ）したことを確認し、免疫不全マウスを用いて皮下腫瘍の形成試験も行った。
１５ｃｍ ｄｉｓｈ 複数枚に細胞が８０％コンフルエントになるように培養した。メディウムを除去し、ＰＢＳ で洗浄した。０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ溶液を加えて、細胞がはがれるまで３７℃インキュベーターに静置し、１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩを加えてＴｒｙｐｓｉｎを中和し、５０ｍＬチューブに細胞懸濁液を回収した。２０ｍＬのメディウムでｄｉｓｈを洗浄し、洗浄液を回収した。１，１００ｒｐｍ×５ｍｉｎ 遠心細胞ペレットを５０ｍＬのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で懸濁し、５０ｍＬチューブ一本にまとめた。
細胞数をカウントし、１，１００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心して得た細胞ペレットを３～５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＨＢＳＳで懸濁した。マウス体側皮下に２７Ｇ注射針付きシリンジを用いて０．１ｍＬ／ｈｅａｄ（３～５×１０６ｃｅｌｌｓ）移植した。
【0059】
図３に、前記の皮下に移植したマウスを示す。ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭはマウス皮下に腫瘍を形成することが認められた。なお、皮下腫瘤形成までに約２か月間を要した。
【0060】
［試験例４］
（ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞株（ＰＢ３０２）の作製）
このマウスに形成された皮下腫瘍から、取り出し、試験例１と同様の条件で培養と継代を行って株化し、ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞株(本明細書では、単にＰＢ３０２細胞株とも呼ぶ)とした。
なお、ＰＢ３０２ｐへのウイルスの感染からＰＢ３０２の樹立までは、合計５～１０回程度の継代を行っており、ＰＢ３０２にはウイルスは残存していないと考えられた。
（ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞株（ＰＢ３０２）の作製）
このマウスに形成された皮下腫瘍から、取り出し、試験例１と同様の条件で培養と継代を行って株化し、ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞株(本明細書では、単にＰＢ３０２細胞株とも呼ぶ)とした。
なお、ＰＢ３０２ｐへのウイルスの感染からＰＢ３０２の樹立までは、合計５～１０回程度の継代を行っており、ＰＢ３０２にはウイルスは残存していないと考えられた。
【0061】
ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ-ＳＣ細胞株を、免疫不全マウスの皮下に移植し、皮下腫瘍を形成させた。皮下腫瘍を形成させる条件は試験例３と同様に行い、移植４日目に腫瘤形成することを確認した。また２週間で８．０６ｍｍ×７．６６ｍｍのサイズのサイズになることも確認した。
【0062】
図４に、ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞をディッシュ上で観察した写真図を示した。観察条件は位相差顕微鏡で倍率１００倍である。
このＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞は、コンフルエント状態では小円形細胞を呈していた。
このＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞は、コンフルエント状態では小円形細胞を呈していた。
【0063】
このＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞株（ＰＢ３０２細胞株）を、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センターに寄託した（受領日：２０２３年７月３日、受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６、細胞名「ＰＢ３０２」）。
【0064】
得られたＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞を、さらに別のマウスに移植し、腫瘍を形成させた。皮下腫瘍を形成させる条件は試験例３と同様に行った。
ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞を皮下に移植したマウスについて、移植４日目に、腫瘤の形成を確認することができた。皮下腫瘤は、前記細胞を移植した３匹中３匹すべてに生じていた。腫瘤の大きさは、２週間目では８．０６ｍｍ×７．６６ｍｍとなった。
これらの結果より、ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞株を用いると、再現性をもって皮下腫瘤を形成することができた。
本実施例の細胞株を用いて、皮下腫瘍、皮下腫瘤を再現性をもって容易に形成することができるので、ｉｎ ｖｉｖｏを含めたがんの治療実験を行うために有用と考えられる。
ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞を皮下に移植したマウスについて、移植４日目に、腫瘤の形成を確認することができた。皮下腫瘤は、前記細胞を移植した３匹中３匹すべてに生じていた。腫瘤の大きさは、２週間目では８．０６ｍｍ×７．６６ｍｍとなった。
これらの結果より、ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ細胞株を用いると、再現性をもって皮下腫瘤を形成することができた。
本実施例の細胞株を用いて、皮下腫瘍、皮下腫瘤を再現性をもって容易に形成することができるので、ｉｎ ｖｉｖｏを含めたがんの治療実験を行うために有用と考えられる。
【0065】
［試験例５］
（ＲＥＴ阻害薬の効果の検証）
ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ（ＰＢ３０２）細胞に対するＩｎ ｖｉｔｒｏにおける選択的ＲＥＴ阻害薬の効果を、ＭＴＴ ａｓｓａｙを用いて検証した。
１０ｃｍディッシュにてコンフルエントになったＰＢ３０２を剥がし、マイクロプレート（組織培養グレード、９６ウェル、平底）に１００μlの培地の細胞（２～３×１０４細胞／ウェル）に播種した（Ｄａｙ１）。細胞培養を３７℃、５～６．５％ＣＯ２の条件下で２４時間インキュベートし、Ｄａｙ２に各ウェルの薬剤濃度が０．００１～１０μｍоｌ／ＬになるＲＥＴ阻害薬（ｓｅｒｐｅｒｃａｔｉｎｉｂ又はｐｒａｌｓｅｔｉｎｉｂ）を含んだ培地を１００μｌ注入した。それらを３７℃、５～６．５％ＣＯ２の条件下で７２時間インキュベートしたＤａｙ５に、各ウェル２００μｌの培地を吸引し新たな１００μｌの培地に入れ替え、さらにＭＴＴ標識試薬（３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに５０μｌ加えた。それらを５～６．５％ ＣＯ２の条件下で１時間インキュベートし、各ウェルの培地を吸引し、ＤＭＳＯを１００μｌを注入した。プレート内を目視で観察して紫色ホルマザン結晶が完全に可溶化されていることを確認し、マイクロプレート（ＥＬＩＳＡ）リーダーを使用してサンプルの吸光度を測定した。ホルマザン生成物の吸光度を測定する波長は、５５０～６００ｎｍ、リファレンス波長は６５０ｎｍ以上とした。
（ＲＥＴ阻害薬の効果の検証）
ＰＢ３０２／ｌｕｃ ｉｖｓ ＬＭ－ＳＣ（ＰＢ３０２）細胞に対するＩｎ ｖｉｔｒｏにおける選択的ＲＥＴ阻害薬の効果を、ＭＴＴ ａｓｓａｙを用いて検証した。
１０ｃｍディッシュにてコンフルエントになったＰＢ３０２を剥がし、マイクロプレート（組織培養グレード、９６ウェル、平底）に１００μlの培地の細胞（２～３×１０４細胞／ウェル）に播種した（Ｄａｙ１）。細胞培養を３７℃、５～６．５％ＣＯ２の条件下で２４時間インキュベートし、Ｄａｙ２に各ウェルの薬剤濃度が０．００１～１０μｍоｌ／ＬになるＲＥＴ阻害薬（ｓｅｒｐｅｒｃａｔｉｎｉｂ又はｐｒａｌｓｅｔｉｎｉｂ）を含んだ培地を１００μｌ注入した。それらを３７℃、５～６．５％ＣＯ２の条件下で７２時間インキュベートしたＤａｙ５に、各ウェル２００μｌの培地を吸引し新たな１００μｌの培地に入れ替え、さらにＭＴＴ標識試薬（３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに５０μｌ加えた。それらを５～６．５％ ＣＯ２の条件下で１時間インキュベートし、各ウェルの培地を吸引し、ＤＭＳＯを１００μｌを注入した。プレート内を目視で観察して紫色ホルマザン結晶が完全に可溶化されていることを確認し、マイクロプレート（ＥＬＩＳＡ）リーダーを使用してサンプルの吸光度を測定した。ホルマザン生成物の吸光度を測定する波長は、５５０～６００ｎｍ、リファレンス波長は６５０ｎｍ以上とした。
【0066】
図５に、ＭＴＴアッセイの結果を示した。（ａ）にｓｐｅｌｐｅｒｃａｔｉｎｉｂ、（ｂ）にｐｒａｌｓｅｔｉｎｉｂのＲＥＴ阻害薬の各濃度における細胞生存率、すなわちＲＥＴ阻害薬の効果を示している。いずれのＲＥＴ阻害薬も濃度に応じて細胞生存率の低下が見られ、ＰＢ３０２細胞におけるＲＥＴ阻害薬の効果が明らかとなった。ＰＢ３０２ではＩｎ ｖｉｔｒｏでＲＥＴ阻害剤によって細胞生存率が減少するので、ｉｎ ｖｉｖｏでもＰＢ３０２細胞による腫瘍・腫瘤の細胞が減少するという試験、診断に使用することができると期待される。
【0067】
［参考例１］
（がん細胞株の脳内移植モデル）
本実施形態の各がん細胞株は、脳内移植モデルの製造にも使用可能である。以下の操作で、脳内移植モデルの製造を行った。
がん細胞株の１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ ｉｎ ＨＢＳＳの懸濁液を準備した。マウスをイソフルレン吸入麻酔により眠らせた。マウスをうつ伏せにし、両腕、両足を固定し、両耳の間の皮膚を正中に沿って５ｍｍ程度切開した。切開した部分を広げ、右頭蓋骨を露出し、滑膜をピンセットでこそぎ、マイクロドリルで頭蓋骨に穴をあけた。このとき、穴が開く瞬間いきおいで脳を損傷しないように留意しつつ行った。マイクロシリンジ（１０μＬ）を脳内に５ｍｍ刺し、１．５μＬ（１．５×１０５ｃｅｌｌｓ）の細胞懸濁液を３０ｓｅｃかけて注入した。注射針を抜き、脱脂綿で傷口を軽く抑えた。切開した皮膚を６－０ｖｉｃｒｙｌを用いて２～３針縫合した。
（がん細胞株の脳内移植モデル）
本実施形態の各がん細胞株は、脳内移植モデルの製造にも使用可能である。以下の操作で、脳内移植モデルの製造を行った。
がん細胞株の１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ ｉｎ ＨＢＳＳの懸濁液を準備した。マウスをイソフルレン吸入麻酔により眠らせた。マウスをうつ伏せにし、両腕、両足を固定し、両耳の間の皮膚を正中に沿って５ｍｍ程度切開した。切開した部分を広げ、右頭蓋骨を露出し、滑膜をピンセットでこそぎ、マイクロドリルで頭蓋骨に穴をあけた。このとき、穴が開く瞬間いきおいで脳を損傷しないように留意しつつ行った。マイクロシリンジ（１０μＬ）を脳内に５ｍｍ刺し、１．５μＬ（１．５×１０５ｃｅｌｌｓ）の細胞懸濁液を３０ｓｅｃかけて注入した。注射針を抜き、脱脂綿で傷口を軽く抑えた。切開した皮膚を６－０ｖｉｃｒｙｌを用いて２～３針縫合した。
【0068】
［参考例２］
（がん細胞株の髄膜がん腫症モデル作製）
本実施形態の各がん細胞株は、髄膜がん腫症モデルの製造にも使用可能である。以下の操作で、がん細胞株の髄腔投与による髄膜がん腫症モデルの製造を行った。この操作は、Ａ９２５Ｌ／ＥＬｕｃ細胞株で行う際の手法を参照して行った。
がん細胞株１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ ｉｎ ＨＢＳＳの懸濁液を準備した。マウスの左足（特に膝関節）を除毛クリームで除毛した。マウスをアバチン麻酔により眠らせた。左手でマウス左足のかかとを支え、ひざを９０℃曲げた状態にした。膝関節の白くなっている部分より、２７Ｇ注射針付きシリンジで脛骨に５ｍｍほど確実に孔を設けた。このとき、シリンジを離し、シリンジが立っていれば、脛骨にしっかりささっていることが確認できる。逆に手を離した際にシリンジが倒れてしまう場合は脛骨ではなく、筋肉や皮膚に刺さってしまっている状態であるため適切でない。注射針を抜き、そのまま開けた穴にマイクロシリンジ（１０μＬ）を５ｍｍ挿入した。このときは、前記設けた孔を広げないよう留意した。細胞懸濁液を４μＬ（４×１０５ｃｅｌｌｓ）注入した。
（がん細胞株の髄膜がん腫症モデル作製）
本実施形態の各がん細胞株は、髄膜がん腫症モデルの製造にも使用可能である。以下の操作で、がん細胞株の髄腔投与による髄膜がん腫症モデルの製造を行った。この操作は、Ａ９２５Ｌ／ＥＬｕｃ細胞株で行う際の手法を参照して行った。
がん細胞株１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ ｉｎ ＨＢＳＳの懸濁液を準備した。マウスの左足（特に膝関節）を除毛クリームで除毛した。マウスをアバチン麻酔により眠らせた。左手でマウス左足のかかとを支え、ひざを９０℃曲げた状態にした。膝関節の白くなっている部分より、２７Ｇ注射針付きシリンジで脛骨に５ｍｍほど確実に孔を設けた。このとき、シリンジを離し、シリンジが立っていれば、脛骨にしっかりささっていることが確認できる。逆に手を離した際にシリンジが倒れてしまう場合は脛骨ではなく、筋肉や皮膚に刺さってしまっている状態であるため適切でない。注射針を抜き、そのまま開けた穴にマイクロシリンジ（１０μＬ）を５ｍｍ挿入した。このときは、前記設けた孔を広げないよう留意した。細胞懸濁液を４μＬ（４×１０５ｃｅｌｌｓ）注入した。
【0069】
以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【0070】
本発明によれば、皮下腫瘍を容易に形成することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療実験を容易に行うことのできるがん細胞株が得られる。
【受託番号】
【0071】
ＮＩＴＥ Ｐ－０３９３６
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】