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特開2025-28816疾患の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価のための方法およびキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025028816
(43)【公開日】2025-03-05
(54)【発明の名称】疾患の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価のための方法およびキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20250226BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20250226BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20250226BHJP
C12Q 1/48 20060101ALI20250226BHJP
C12Q 1/25 20060101ALI20250226BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20250226BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/6851 Z
C12Q1/48 Z
C12Q1/25
C12Q1/6806 Z
C12Q1/6876 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024116884
(22)【出願日】2024-07-22
(31)【優先権主張番号】102023000016836
(32)【優先日】2023-08-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(71)【出願人】
【識別番号】524274875
【氏名又は名称】イマジナ バイオテクノロジー ソシエタ レスポンサビリタ リミタータ
(74)【代理人】
【識別番号】100113376
【弁理士】
【氏名又は名称】南条 雅裕
(74)【代理人】
【識別番号】100179394
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬田 あや子
(74)【代理人】
【識別番号】100185384
【弁理士】
【氏名又は名称】伊波 興一朗
(74)【代理人】
【識別番号】100137811
【弁理士】
【氏名又は名称】原 秀貢人
(72)【発明者】
【氏名】デル ピアーノ アレッシア
(72)【発明者】
【氏名】ケックマン ティー
(72)【発明者】
【氏名】クラメール マッシミリアーノ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】特定の疾患に関連する分子マーカーを同定および定量して、疾患の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を促進するための、包括的な方法を提供する。
【解決手段】対象における疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を、前記対象の生物学的試料中に包含される前記疾患または状態の少なくとも１の分子マーカーを検出することおよび定量することによって行う、インビトロまたはエクスビボ方法であって、前記少なくとも１の分子マーカーは、３′リン酸または２′／３′環状リン酸を含むＲＮＡ断片である方法、および脊髄性筋萎縮症および皮膚扁平上皮癌を診断するためのキット。
【選択図】図１３
【解決手段】対象における疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を、前記対象の生物学的試料中に包含される前記疾患または状態の少なくとも１の分子マーカーを検出することおよび定量することによって行う、インビトロまたはエクスビボ方法であって、前記少なくとも１の分子マーカーは、３′リン酸または２′／３′環状リン酸を含むＲＮＡ断片である方法、および脊髄性筋萎縮症および皮膚扁平上皮癌を診断するためのキット。
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を、前記対象の生物学的試料中に包含される前記疾患または状態の少なくとも１の分子マーカーを検出することおよび定量することによって行う、インビトロまたはエクスビボ方法であって、
前記少なくとも１の分子マーカーは、３′リン酸または２′／３′環状リン酸を含むＲＮＡ断片（３′Ｐ ＲＮＡ）であり、
前記方法は、以下の各ステップ：
（ａ′）前記生物学的試料中に包含される前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの５′末端をリン酸化して、少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片を得るステップ；
（ｂ′）前記少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片の３′末端を、ＲＮＡベースのアダプターの５′末端にライゲートし、少なくとも１の第１のライゲーション生成物を得るステップ；
ここで前記ＲＮＡベースのアダプターは、式（Ｉａ）を有し：
５′ＯＨ－Ｅ１－Ａｚ－Ｅ２－ＯＨ ３′ （Ｉａ）
ここで
－ Ｅ１は、長さが１５～３０の間である、第１のオリゴリボヌクレオチド配列であり、
－ Ａは、脱塩基部位またはレトロ転写酵素（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）活性の阻止を可能にするスペーサーであり、
－ ｚは、１～５の整数であり、
－ Ｅ２は、長さが１５～３０の間である、第２のオリゴリボヌクレオチド配列である；
（ｃ′）前記少なくとも１の第１のライゲーション生成物を自己ライゲートし、少なくとも１の環状ＲＮＡ分子を形成するステップ；
（ｄ′）前記少なくとも１の環状ＲＮＡ分子の逆転写を行い、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を含む、少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子を得るステップ；
ここで前記逆転写は、式（ＩＩａ）を有する逆転写プライマーを使用して行われ：
５′ＯＨ－Ｇ－Ｆ１－ＯＨ ３′ （ＩＩａ）
ここで
－ Ｆ１は、Ｅ１の逆相補デオキシオリゴリボヌクレオチドであり、ここでＦ１のＥ１に対する相補性は、６０％～１００％の間であり、
および
－ Ｇは、長さが１０～３０の間である、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチドである；
（ｅ′）前記少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子の第１および第２のｑＰＣＲ増幅を並行して行い、第１および第２の増幅生成物を得るステップ；
ここで：
－ 前記第１のｑＰＣＲ増幅は、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の少なくとも一部にアニーリングする第１のプライマー対を使用して行われ、
前記第１のプライマー対は、プライマー対セット１、セット２、およびセット３から選択され、
ここで各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
前記プライマー対セット１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ）および（ＩＶａ）に示される配列を有し、
前記プライマー対セット２のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ′）および（ＩＶａ′）に示される配列を有し、
および
前記プライマー対セット３のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ″）および（ＩＶａ″）に示される配列を有し：
セット１
５′ＯＨ－Ｈ２－Ｎ－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ）
５′ＯＨ－Ｈ１－Ｍ－ＯＨ ３′ （ＩＶａ）
セット２
５′ＯＨ－Ｈ２－Ｎ－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ′）
５′ＯＨ－Ｈ１－ＯＨ ３′ （ＩＶａ′）
セット３
５′ＯＨ－Ｈ２－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ″）
５′ＯＨ－Ｈ１－Ｍ－ＯＨ ３′ （ＩＶａ″）
ここで、
◆ Ｈ１は、Ｅ１にアニーリングする第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＨ１のＥ１に対する相補性は、３０％～１００％の間であり、
および
◆ Ｍは、長さが６～３０の間であり、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の３′末端の少なくとも６ヌクレオチドにアニーリングする、第３のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、
◆ Ｈ２は、Ｅ２にアニーリングする第４のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＨ２のＥ２に対する相補性は、３０％～１００％の間であり、
および
◆ Ｎは、長さが６～３０の間であり、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の５′末端の少なくとも６ヌクレオチドにアニーリングする、第５のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり；
－ 前記第２のｑＰＣＲ増幅は、前記ＲＮＡベースのアダプター配列にアニーリングする第２のプライマー対を使用して行われ、
前記第２のプライマー対は、それぞれ式（Ｖａ）および（ＶＩａ）を有する、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含み：
５′ＯＨ－Ｈ２－ＯＨ ３′ （Ｖａ）
５′ＯＨ－Ｉ１－ＯＨ ３′ （ＶＩａ）
ここで、
◆ Ｈ２は、上記に示された意味を有し、
および
◆ Ｉ１は、Ｇにアニーリングする第６のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＩ１のＧに対する相補性は、６０％～１００％の間である；
および
（ｆ′）ステップ（ａ′）から（ｅ′）を、少なくとも１の対照試料に対して繰り返すステップ；
ここで前記対照試料は、健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、生物学的試料である；
（ｇ′）前記生物学的試料および前記対照試料のいずれかについて、前記第１および第２の増幅生成物において、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの、および前記ＲＮＡベースのアダプターの、Ｃｔ値を決定するステップ；
（ｈ′）ステップ（ｇ′）において決定された前記Ｃｔ値の３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を、以下の等式に従って計算するステップ：
ここで
－ Ｃｔ（Ａ）３′Ｐは、前記生物学的試料で決定された前記３′Ｐ ＲＮＡの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）３′Ｐは、前記対照試料で決定された前記３′Ｐ ＲＮＡの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ａ）ａｄｐは、前記生物学的試料で決定された前記ＲＮＡベースのアダプターの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）ａｄｐは、前記対照試料で決定された前記ＲＮＡベースのアダプターの前記Ｃｔ値であり；
ここで３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化値≧２または≦０．５は、前記疾患または状態の前記診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を示す；
を含む、
方法。
前記少なくとも１の分子マーカーは、３′リン酸または２′／３′環状リン酸を含むＲＮＡ断片（３′Ｐ ＲＮＡ）であり、
前記方法は、以下の各ステップ：
（ａ′）前記生物学的試料中に包含される前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの５′末端をリン酸化して、少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片を得るステップ；
（ｂ′）前記少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片の３′末端を、ＲＮＡベースのアダプターの５′末端にライゲートし、少なくとも１の第１のライゲーション生成物を得るステップ；
ここで前記ＲＮＡベースのアダプターは、式（Ｉａ）を有し：
５′ＯＨ－Ｅ１－Ａｚ－Ｅ２－ＯＨ ３′ （Ｉａ）
ここで
－ Ｅ１は、長さが１５～３０の間である、第１のオリゴリボヌクレオチド配列であり、
－ Ａは、脱塩基部位またはレトロ転写酵素（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）活性の阻止を可能にするスペーサーであり、
－ ｚは、１～５の整数であり、
－ Ｅ２は、長さが１５～３０の間である、第２のオリゴリボヌクレオチド配列である；
（ｃ′）前記少なくとも１の第１のライゲーション生成物を自己ライゲートし、少なくとも１の環状ＲＮＡ分子を形成するステップ；
（ｄ′）前記少なくとも１の環状ＲＮＡ分子の逆転写を行い、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を含む、少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子を得るステップ；
ここで前記逆転写は、式（ＩＩａ）を有する逆転写プライマーを使用して行われ：
５′ＯＨ－Ｇ－Ｆ１－ＯＨ ３′ （ＩＩａ）
ここで
－ Ｆ１は、Ｅ１の逆相補デオキシオリゴリボヌクレオチドであり、ここでＦ１のＥ１に対する相補性は、６０％～１００％の間であり、
および
－ Ｇは、長さが１０～３０の間である、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチドである；
（ｅ′）前記少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子の第１および第２のｑＰＣＲ増幅を並行して行い、第１および第２の増幅生成物を得るステップ；
ここで：
－ 前記第１のｑＰＣＲ増幅は、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の少なくとも一部にアニーリングする第１のプライマー対を使用して行われ、
前記第１のプライマー対は、プライマー対セット１、セット２、およびセット３から選択され、
ここで各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
前記プライマー対セット１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ）および（ＩＶａ）に示される配列を有し、
前記プライマー対セット２のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ′）および（ＩＶａ′）に示される配列を有し、
および
前記プライマー対セット３のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ″）および（ＩＶａ″）に示される配列を有し：
セット１
５′ＯＨ－Ｈ２－Ｎ－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ）
５′ＯＨ－Ｈ１－Ｍ－ＯＨ ３′ （ＩＶａ）
セット２
５′ＯＨ－Ｈ２－Ｎ－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ′）
５′ＯＨ－Ｈ１－ＯＨ ３′ （ＩＶａ′）
セット３
５′ＯＨ－Ｈ２－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ″）
５′ＯＨ－Ｈ１－Ｍ－ＯＨ ３′ （ＩＶａ″）
ここで、
◆ Ｈ１は、Ｅ１にアニーリングする第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＨ１のＥ１に対する相補性は、３０％～１００％の間であり、
および
◆ Ｍは、長さが６～３０の間であり、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の３′末端の少なくとも６ヌクレオチドにアニーリングする、第３のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、
◆ Ｈ２は、Ｅ２にアニーリングする第４のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＨ２のＥ２に対する相補性は、３０％～１００％の間であり、
および
◆ Ｎは、長さが６～３０の間であり、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の５′末端の少なくとも６ヌクレオチドにアニーリングする、第５のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり；
－ 前記第２のｑＰＣＲ増幅は、前記ＲＮＡベースのアダプター配列にアニーリングする第２のプライマー対を使用して行われ、
前記第２のプライマー対は、それぞれ式（Ｖａ）および（ＶＩａ）を有する、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含み：
５′ＯＨ－Ｈ２－ＯＨ ３′ （Ｖａ）
５′ＯＨ－Ｉ１－ＯＨ ３′ （ＶＩａ）
ここで、
◆ Ｈ２は、上記に示された意味を有し、
および
◆ Ｉ１は、Ｇにアニーリングする第６のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＩ１のＧに対する相補性は、６０％～１００％の間である；
および
（ｆ′）ステップ（ａ′）から（ｅ′）を、少なくとも１の対照試料に対して繰り返すステップ；
ここで前記対照試料は、健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、生物学的試料である；
（ｇ′）前記生物学的試料および前記対照試料のいずれかについて、前記第１および第２の増幅生成物において、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの、および前記ＲＮＡベースのアダプターの、Ｃｔ値を決定するステップ；
（ｈ′）ステップ（ｇ′）において決定された前記Ｃｔ値の３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を、以下の等式に従って計算するステップ：
－ Ｃｔ（Ａ）３′Ｐは、前記生物学的試料で決定された前記３′Ｐ ＲＮＡの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）３′Ｐは、前記対照試料で決定された前記３′Ｐ ＲＮＡの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ａ）ａｄｐは、前記生物学的試料で決定された前記ＲＮＡベースのアダプターの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）ａｄｐは、前記対照試料で決定された前記ＲＮＡベースのアダプターの前記Ｃｔ値であり；
ここで３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化値≧２または≦０．５は、前記疾患または状態の前記診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を示す；
を含む、
方法。
【請求項2】
請求項１に記載された方法であって、
ステップ（ｈ′）において、前記３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化の３′Ｐ－ｑＰＣＲ ｐ値を計算するステップをさらに含み；
ここで３′Ｐ－ｑＰＣＲ ｐ値＜０．５は、前記疾患または状態の前記診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を示す；
方法。
ステップ（ｈ′）において、前記３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化の３′Ｐ－ｑＰＣＲ ｐ値を計算するステップをさらに含み；
ここで３′Ｐ－ｑＰＣＲ ｐ値＜０．５は、前記疾患または状態の前記診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を示す；
方法。
【請求項3】
請求項１～２のいずれか一項に記載された方法であって、
式（Ｉａ）の前記ＲＮＡベースのアダプターは、長さが５０～１００ヌクレオチド（ｎｔ）の間である、
方法。
式（Ｉａ）の前記ＲＮＡベースのアダプターは、長さが５０～１００ヌクレオチド（ｎｔ）の間である、
方法。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載された方法であって、
式（ＩＩａ）の前記逆転写プライマーは、長さが１０～１００ヌクレオチドの間である、
方法。
式（ＩＩａ）の前記逆転写プライマーは、長さが１０～１００ヌクレオチドの間である、
方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載された方法であって、
ステップ（ｅ′）の２つの前記ｑＰＣＲ増幅において使用される前記プライマーは、以下の特徴のうちの少なくとも１つ：
－ それらは、１～２０の修飾ヌクレオチドを包含する；
－ それらは、長さが１５～２５ヌクレオチドの間である；
－ それらは、最小自由エネルギーが－３～－１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌの間である；
－ それらは、強いまたは中程度の二次構造を包含せず、および／またはダイマーを形成しない；
－ それらは、融解温度が５７～７０℃の間である；
－ それらは、前記対のフォワードプライマーとリバースプライマーとの間の融解温度差が３℃以下である；
を有する、
方法。
ステップ（ｅ′）の２つの前記ｑＰＣＲ増幅において使用される前記プライマーは、以下の特徴のうちの少なくとも１つ：
－ それらは、１～２０の修飾ヌクレオチドを包含する；
－ それらは、長さが１５～２５ヌクレオチドの間である；
－ それらは、最小自由エネルギーが－３～－１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌの間である；
－ それらは、強いまたは中程度の二次構造を包含せず、および／またはダイマーを形成しない；
－ それらは、融解温度が５７～７０℃の間である；
－ それらは、前記対のフォワードプライマーとリバースプライマーとの間の融解温度差が３℃以下である；
を有する、
方法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載された方法であって、
ここで、ステップ（ｅ′）の前記第１のｑＰＣＲ増幅において使用される、前記第１のプライマー対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、それぞれ３′末端および５′末端で、前記３′Ｐ ＲＮＡの少なくとも６、好ましくは１０ヌクレオチドにアニーリングする、
方法。
ここで、ステップ（ｅ′）の前記第１のｑＰＣＲ増幅において使用される、前記第１のプライマー対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、それぞれ３′末端および５′末端で、前記３′Ｐ ＲＮＡの少なくとも６、好ましくは１０ヌクレオチドにアニーリングする、
方法。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載された方法であって、
前記生物学的試料は、尿、全血、唾液、血漿、皮膚、線維芽細胞、神経細胞、肝臓、筋肉、初代細胞株、不死化細胞株、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、非ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から選択される、
方法。
前記生物学的試料は、尿、全血、唾液、血漿、皮膚、線維芽細胞、神経細胞、肝臓、筋肉、初代細胞株、不死化細胞株、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、非ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から選択される、
方法。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載された方法であって、
前記疾患は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）であり、
および
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の前記少なくとも１の分子マーカーは、配列番号１～８３、２０８～２１７のいずれかに示される配列、または配列番号１～８３、２０８～２１７のいずれかに対して９０％以上の、好ましくは９５％以上の同一性を有する配列を有する、３′Ｐ ＲＮＡから選択される、
方法。
前記疾患は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）であり、
および
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の前記少なくとも１の分子マーカーは、配列番号１～８３、２０８～２１７のいずれかに示される配列、または配列番号１～８３、２０８～２１７のいずれかに対して９０％以上の、好ましくは９５％以上の同一性を有する配列を有する、３′Ｐ ＲＮＡから選択される、
方法。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載された方法であって、
前記疾患は、皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）であり、
および
皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）の前記少なくとも１の分子マーカーは、配列番号８４～１７２、２１８～２２１のいずれかに示される配列、または配列番号８４～１７２、２１８～２２１のいずれかに対して９０％以上の、好ましくは９５％以上の同一性を有する配列を有する、３′Ｐ ＲＮＡから選択される、
方法。
前記疾患は、皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）であり、
および
皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）の前記少なくとも１の分子マーカーは、配列番号８４～１７２、２１８～２２１のいずれかに示される配列、または配列番号８４～１７２、２１８～２２１のいずれかに対して９０％以上の、好ましくは９５％以上の同一性を有する配列を有する、３′Ｐ ＲＮＡから選択される、
方法。
【請求項10】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価のためのキットであって：
（ａ′）配列番号１８５に示される配列を有する、ＲＮＡベースのアダプター；
（ｂ′）配列番号１８６に示される配列を有する、逆転写プライマー；
（ｃ′）第１のｑＰＣＲ増幅を行うための７つの第１のプライマー対であって、前記７つのプライマー対の第１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、以下の配列対に示される配列を有する：配列番号１８７および１８８、配列番号１８７および１８９、配列番号１９０および１９１、配列番号１９２および１９３、および配列番号１９８および１９９、配列番号２００および２０１、配列番号２０２および２０３；
および
（ｄ′）第２のｑＰＣＲ増幅を行うための第２のプライマー対であって、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、それぞれ配列番号２０４および２０５に示される配列を有する；
を含む、
キット。
（ａ′）配列番号１８５に示される配列を有する、ＲＮＡベースのアダプター；
（ｂ′）配列番号１８６に示される配列を有する、逆転写プライマー；
（ｃ′）第１のｑＰＣＲ増幅を行うための７つの第１のプライマー対であって、前記７つのプライマー対の第１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、以下の配列対に示される配列を有する：配列番号１８７および１８８、配列番号１８７および１８９、配列番号１９０および１９１、配列番号１９２および１９３、および配列番号１９８および１９９、配列番号２００および２０１、配列番号２０２および２０３；
および
（ｄ′）第２のｑＰＣＲ増幅を行うための第２のプライマー対であって、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、それぞれ配列番号２０４および２０５に示される配列を有する；
を含む、
キット。
【請求項11】
皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価のためのキットであって：
（ａ′）配列番号１８５に示される配列を有する、ＲＮＡベースのアダプター、
（ｂ′）配列番号１８６に示される配列を有する、逆転写プライマー、
（ｃ′）第１のｑＰＣＲ増幅を行うための４つの第１のプライマー対であって、前記２つのプライマー対の第１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ以下の配列対に示される配列を有する：配列番号１９４および１９５、配列番号１９６および１９７、配列番号２２２および２２３、配列番号２２４および２２５、
および
（ｄ′）第２のｑＰＣＲ増幅を行うための第２のプライマー対であって、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、それぞれ配列番号２０４および２０５に示される配列を有する；
を含む、
キット。
（ａ′）配列番号１８５に示される配列を有する、ＲＮＡベースのアダプター、
（ｂ′）配列番号１８６に示される配列を有する、逆転写プライマー、
（ｃ′）第１のｑＰＣＲ増幅を行うための４つの第１のプライマー対であって、前記２つのプライマー対の第１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ以下の配列対に示される配列を有する：配列番号１９４および１９５、配列番号１９６および１９７、配列番号２２２および２２３、配列番号２２４および２２５、
および
（ｄ′）第２のｑＰＣＲ増幅を行うための第２のプライマー対であって、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、それぞれ配列番号２０４および２０５に示される配列を有する；
を含む、
キット。
【請求項12】
請求項１０または請求項１１に記載されたキットであって、
前記キットは、以下のうちの少なくとも１つ：
（ｅ′）生物学的試料からのＲＮＡ抽出および単離のための、試薬；
（ｆ′）ＰＮＫ酵素；
（ｇ′）第１のリガーゼ酵素；
（ｈ′）第２のリガーゼ酵素；
（ｉ′）逆転写酵素（ＲＴ）；
（ｊ′）ｑＰＣＲマスターミックス；
（ｋ′）ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを検証するための、陽性および陰性対照。
（ｌ′）ヌクレアーゼフリー水；
（ｍ′）反応チューブおよびプレート；
（ｎ′）使用説明書およびプロトコル；
をさらに含む、
キット。
前記キットは、以下のうちの少なくとも１つ：
（ｅ′）生物学的試料からのＲＮＡ抽出および単離のための、試薬；
（ｆ′）ＰＮＫ酵素；
（ｇ′）第１のリガーゼ酵素；
（ｈ′）第２のリガーゼ酵素；
（ｉ′）逆転写酵素（ＲＴ）；
（ｊ′）ｑＰＣＲマスターミックス；
（ｋ′）ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを検証するための、陽性および陰性対照。
（ｌ′）ヌクレアーゼフリー水；
（ｍ′）反応チューブおよびプレート；
（ｎ′）使用説明書およびプロトコル；
をさらに含む、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書は、疾患の分子マーカーとして、３′リン酸または２′／３′環状リン酸を含むＲＮＡ断片を検出することおよび定量することによって行う、疾患の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価のための、方法およびキットに関係する。
【背景技術】
【0002】
バイオマーカーとは、その測定が疾患の存在または進行および治療の効果に関する有意義な情報を提供する、生体分子である１，２。ＲＮＡベースのバイオマーカーは、癌、神経変性疾患、および感染症を含む、様々な状態における疾患の診断、予後、および治療モニタリングの目的のための非常に有望な候補として、多様な分子マーカーの中で際立つ３。バイオマーカーの開発を洗練させるために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、および環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を含む、様々なＲＮＡタイプの調査のために、広範な研究が行われてきた４－６。ＲＮＡは、タンパク質ベースのバイオマーカーと比較して、それが通常豊富に存在し、費用対効果の高い方法を通じて検出が容易であり、および広範囲の生体液（例えば、尿、血液、唾液）内にそれが存在することを含む、いくつかの重要な利点を、この目的のために提供する７。この他に、ＲＮＡは、健康状態と比較して、多くの病理学的条件で異なる発現パターンを示し３，８、特有の疾患マーカーとしての可能性を強調する。加えて、ＲＮＡ分子は、大きな転写後修飾を受けることで９、器官、組織、および細胞タイプに特異的な、その一意性をさらに高める１０－１２。既知の修飾の中でも、ＲＮＡ分子上の３′リン酸または２′／３′環状リン酸基（３′Ｐ ＲＮＡと称される）の存在は、ＲＮＡ処理事象から、すなわち主にｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｔＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡの酵素的切断からだけでなく、タンパク質をコードするＲＮＡの選択的分解からも生じる１３，１４。この処理により、長さ１０～２００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ断片が生成され、疾患特異的マーカーの膨大なコレクションを提供する。残念ながら、これらＲＮＡ生成物の真の可能性は、ポリアデニル化またはライゲーションなどの後続の処理ステップのために、３′ＯＨ基の存在に依存するという、現在の検出方法の限界のせいで、多くの場合見過ごされている。複雑で時間のかかる手法を使用することにより、予備的研究は、細胞内または生体液内で作用することによる１７、不可欠な生物学的過程の特有のマーカーとしての３′Ｐ ＲＮＡの重要性を、明らかにし始めている１５，１６。特定の３′Ｐ ＲＮＡ断片の発現の変化は、癌、ウイルス感染、および神経変性において観察されている１８，１９。この新たな理解は、ヒトの健康および疾患におけるそれらの役割を探求する重要性を強調する。試料のタイプによっては、全体の３′Ｐ ＲＮＡの５％～５０％が、ｔＲＮＡ断片（ｔＲＦ）であり、成熟ｔＲＮＡの切断に由来する断片を意味する。例えば、アンギオゲニン（リボヌクレアーゼＡスーパーファミリーに属するヌクレアーゼ）によって切断されたｔＲＮＡの特定のサブセットが、神経細胞から分泌されて、筋萎縮性側索硬化症患者の血清試料中に発見され、強い予後的価値を持つことが最近見出された２０。さらに、特定のｔＲＮＡ断片は、異常タンパク質合成を抑制し、骨髄異形成症候群における白血病の進行を予測することが最近発見されており２１、疾患の潜在的なマーカーとしての３′Ｐ ｔＲＮＡ断片の役割を示唆している２２－２５。
【0003】
今日まで多大な努力が費やされたにもかかわらず、本分野では、３′Ｐ ＲＮＡ断片を効果的にスクリーニングおよび定量するための、信頼性が高く、簡易かつ正確な方法が、依然として欠如している。このような頑強なスクリーニング技術の欠如は、このタイプのＲＮＡ分子の同定における大きな障害となっており、疾患の診断、予後、および治療モニタリングなどの重要な目的における、その利用可能性を制限する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本開示の目的は、特定の疾患に関連する分子マーカーを同定および定量して、疾患の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を促進するための、包括的な方法を提供することである。具体的には、３′末端でリン酸化されるＲＮＡ断片により表される分子マーカーに焦点を当てる。革新的な手法を活用することにより、より正確かつ信頼性の高い診断、予後、治療モニタリング、および結果予測評価を可能にすることが目的である。
【0005】
本開示のさらなる目的は、疾患の分子マーカーを同定するための方法を実施するための、およびそれらを診断、結果予測、予後、および治療モニタリングにおいて使用するための、キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明によれば、上記の目的は、以下の特許請求の範囲に具体的に記載された内容によって達成され、これらは形成するものと理解される。
【0007】
本発明は、請求項１に規定される、疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価のためのインビトロまたはエクスビボ方法、および請求項１０および１１に規定される、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）および皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）を診断するためのキットに関係する。
【0008】
［図面の簡単な説明］
本発明は、純粋に例示であり非限定的な例として、添付の図面を参照しながら、ここで詳細に説明される。図面において：
本発明は、純粋に例示であり非限定的な例として、添付の図面を参照しながら、ここで詳細に説明される。図面において：
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】翻訳開始部位および翻訳終止周辺のＰ部位の頻度を示す、メタプロファイル。ライブラリは、３′Ｐリボソーム保護断片のＣＨＯ細胞ペレットからのリボソーム精製および抽出後に、Ｄａｒｔ－ＲＮＡシーケンシングにより生成された。
【図2】マウス肝組織のＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析。マウスの対照およびＳＭＡ肝組織のリード長分布。
【図3】様々なトランスクリプトタイプへのリードマッピングの百分率。
【図4】対照（黒線）およびＳＭＡ（灰色線）マウス肝組織における、３′Ｐ－ｔＲＦｓ＿Ｖａｌ＿ＡＡＣの塩基ごとのカバレッジ。
【図5】対照およびＳＭＡ肝組織における、ｔＲＮＡ＿Ｖａｌ＿ＡＡＣにアライメントするリードの５′開始端および３′末端に関連する切断の頻度を示す、ヒートマップ。
【図6】Ｕ２偽遺伝子の全長トランスクリプトの二次構造の模式図。濃い黒でＳｍ結合部位と３′Ｐ Ｇｍ２２９７３断片がマッピングされる領域とが強調される。各ステムループに関連する名称が、参考として記載される。
【図7】Ａ．対照およびＳＭＡ肝組織における、３′Ｐ－ｔＲＦｓ＿Ｖａｌ＿ＡＡＣ／ＣＡＣおよび３′Ｐ－ｔＲＦｓ＿Ｖａｌ＿ＴＡＣの、３′Ｐ－ｑＰＣＲ発現解析。結果は、相対的なｌｏｇ２倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）として示される。 Ｂ．対照およびＳＭＡ肝組織からの、総全長ｔＲＮＡ Ｖａｌ ＡＡＣ（上）および総３′ＰｔＲＦ＿Ｖａｌ＿ＡＡＣ断片（下）の、ノーザンブロット解析の代表的な画像（左）。右側には、ゲル中のバンドの定量に基づいた、３′Ｐ－ｔＲＦｓ＿Ｖａｌ＿ＡＡＣの相対発現（倍率変化）を示すヒストグラムが、右側に表示される。データは、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表される。２群間の比較は、スチューデントのｔ検定を使用して行われた；ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５、およびｎ．ｓ．：有意差なし。
【図8】Ａ．対照およびＳＭＡ肝組織における、３′Ｐ－Ｇｍ２２９７３断片の、３′Ｐ－ｑＰＣＲ発現解析。 Ｂ．対照およびＳＭＡ肝組織における、全長Ｇｍ２２９７３トランスクリプトの、３′Ｐ－ｑＰＣＲ発現解析。 Ｃ．対照およびＳＭＡ肝組織における、３′Ｐ－Ｕ２の、３′Ｐ－ｑＰＣＲ発現解析の結果を示す、ヒストグラム。 Ｄ．対照およびＳＭＡ肝組織における、Ｕ２ ｓｎＲＮＡトランスクリプトの、全長ｑＰＣＲ発現解析を示す、棒グラフ。データは、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表される。群間の比較は、スチューデントのｔ検定を使用して行われた；Ｎ＝３；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、およびｎ．ｓ．：有意差なし。
【図9】不死化ヒトケラチノサイト（ＨＫＣ）およびＳＣＣ細胞株のｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析における、異なるトランスクリプトタイプへのリードマッピングの百分率。
【図10】ＨＫＣおよびＳＣＣ試料から得られたＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ結果の、主成分分析（ＰＣＡ）。
【図11】Ａ．ケラチノサイト（ＨＫＣ）およびｃＳＣＣにおける、５′＿ｔＲＦｓ＿Ｇｌｕ＿ＣＴＣの、３′Ｐ－ｑＰＣＲ解析および相対発現。 Ｂ．ケラチノサイトおよびｃＳＣＣにおける、３′＿ｔＲＦｓ＿Ａｓｐ＿ＧＴＣの、３′Ｐ－ｑＰＣＲ解析および相対発現。データは、平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表される。２群間の比較は、スチューデントのｔ検定を使用して行われた；ｎ＝３；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図12】Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ法の模式図。 Ａ．Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ２ステップＰＣＲ。 Ｂ．Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ １ステップＰＣＲ。
【図13】３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイの模式図。
【発明を実施するための形態】
【0010】
［定義］
「３′Ｐ ＲＮＡ」とは、３′リン酸または２′／３′環状リン酸を含むＲＮＡ断片を意味する。
「３′Ｐ ＲＮＡ」とは、３′リン酸または２′／３′環状リン酸を含むＲＮＡ断片を意味する。
【0011】
「Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析（Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ａｎａｌｙｓｉｓ）」とは、本発明者によって開発され本明細書において開示される、生物学的試料中の疾患または病的状態の分子マーカーとして、３′Ｐ ＲＮＡを同定するための方法を意味する。
【0012】
「３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイ（３′Ｐ－ｑＰＣＲ ａｓｓａｙ）」とは、本発明者によって開発され本明細書において開示される、生物学的試料中の３′Ｐ ＲＮＡにより表される分子マーカーのプロファイルを決定することにより、疾患または状態を、診断し、発症するリスクを評価し、または予後判断する方法を意味する。
【0013】
「ＰＣＲ」すなわち「ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」とは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を選択的に増幅することを意味する。ＰＣＲ中に、短い一本鎖（ｓｓ）合成オリゴヌクレオチドまたはプライマーが、標的テンプレート上で、熱変性、プライマーアニーリング、およびプライマー伸長の繰り返しサイクルを使用して、伸長される。
【0014】
「ｑＰＣＲ」すなわち「定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」とは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の増幅と、反応中のそのＤＮＡ／ＲＮＡ種の濃度の定量とを組み合わせる、ＰＣＲベースの技術を意味する。この方法により、開始テンプレート濃度の計算が可能になる。
【0015】
「シーケンシングプラットフォームアダプター構造（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ａｄａｐｔｅｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」とは、市販のシーケンシングプラットフォーム、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｇ（商標）、ＭｉＳｅｇ（商標）、およびＮｏｖａＳｅｑ（商標）シーケンシングシステム）；Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）（例えば、ＡＶＩＴＩ（商標）シーケンシングシステム用ＬｏｏｐＳｅｑ）；Ｓｉｎｇｕｌａｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ（例えば、Ｇ４システム）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬＤシーケンシングシステム）；Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋および／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシーケンシングシステム）；ＭＧＩ（例えば、Ｅ２５、Ｇ４００、Ｇ９９、Ｇ５０、およびＴ７、Ｔ１０、Ｔ２０システム）などによって利用される、核酸構造を意味する。
【0016】
シーケンシングプラットフォームアダプター構造には、１または複数の核酸ドメインを含む。
【0017】
「核酸ドメイン（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｏｍａｉｎ）」とは、目的のシーケンシングプラットフォームに適する長さおよび配列を有するオリゴヌクレオチド分子を意味し、すなわち、目的のシーケンシングプラットフォームにより使用されるポリヌクレオチドが核酸ドメインへ特異的に結合できることを意味する。
【0018】
核酸ドメインは、４～２００ヌクレオチド（ｎｔ）、４～１００ヌクレオチド、６～７５、８～５０、または１０～４０ヌクレオチドの長さを有しうる。
【0019】
目的のシーケンシングプラットフォームでのシーケンシングに有用な核酸ドメインのヌクレオチド配列は、経時的に変動および／または変化しうる。アダプター配列は典型的には、シーケンシングプラットフォームの製造者によって提供される（例えば、シーケンシングシステムに付属する技術文書内および／または製造者のウェブサイト上で入手可能）。そのような情報に基づいて、アダプター、逆転写プライマー、および／または増幅プライマーの配列は、１または複数の核酸ドメインの全体または一部を含むように設計されてもよく、目的のプラットフォーム上で解析対象である核酸インサート（本例では３′Ｐ ＲＮＡ）のシーケンシングが可能な構成とされる。
【0020】
核酸ドメインは、以下から選択されうる：表面付着シーケンシングプラットフォームオリゴヌクレオチド（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングシステムにおいて、フローセルの表面に付着した、Ｐ５またはＰ７オリゴヌクレオチド）に特異的に結合する「キャプチャードメイン（ｃａｐｔｕｒｅ ｄｏｍａｉｎ）」。；「シーケンシングプライマー結合ドメイン（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのＲｅａｄ １またはＲｅａｄ ２プライマーが結合しうるドメイン）；「バーコードドメイン（ｂａｒｃｏｄｅ ｄｏｍａｉｎ）」（例えば、シーケンシングされている核酸の試料源を一意に同定して、所与の試料からの各分子に特定のバーコードまたは「タグ（ｔａｇ）」を用いてマーク付けすることにより、試料を多重化することを可能にするドメイン）；「バーコードシーケンシングプライマー結合ドメイン（ｂａｒｃｏｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」（バーコードをシーケンシングするために使用されるプライマーが結合するドメイン）；「分子同定ドメイン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）」（例えば、４、６、または他の数のヌクレオチドのランダム化されたタグなどの、分子インデックスタグ）で、目的の分子を一意にマーク付けして、ユニークタグがシーケンシングされる事例数に基づいて、発現レベルを決定するためのもの；または、そのようなドメインの任意の組合せ。ある態様において、バーコードドメイン（例えば、試料インデックスタグ）およびユニーク分子同定（ＵＭＩ）ドメイン（例えば、分子インデックスタグ）が、同じ核酸ドメイン内に含まれうる。
【0021】
「レトロ転写酵素活性の阻止を可能にするスペーサー（ｓｐａｃｅｒ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ａｒｒｅｓｔ ｏｆ ａ ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、脱プリン化または他のメカニズムによって生じる、自然発生する脱塩基部位の存在を模倣するために使用されうる、化学修飾を意味する。修飾には、デオキシリボース糖を２′－ヒドロキシル基を欠く修飾糖分子で置換することを含む。この修飾により、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド間の正常な塩基対形成および水素結合相互作用が妨げられる。それは、１，２′－ジデオキシリボース修飾（以下の化学構造
を有するｄＳｐａｃｅｒ、脱塩基部位としても知られる）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、または脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）部位の中から選択されうる。あるいは、それは、ビオチン化遮断スペーサー、「ＩｎｔビオチンｄＴ」、すなわちビオチン分子と共役したデオキシチミジン（ｄＴ）であってもよく、以下の構造を有する。
【0022】
「核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」、「窒素塩基（ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ ｂａｓｅ）」、または単に「塩基（ｂａｓｅ）」とは、ヌクレオシドを形成する窒素含有生物学的化合物を意味し、これはさらにヌクレオチドの構成要素である。
【0023】
「ｐ値（ｐ－ｖａｌｕｅ）」とは、結果または観測の有意性の統計的尺度を意味する。ｐ値は、様々な統計的パラメータによって決定されうる。最もよく知られた統計的パラメータは帰無仮説であり、これは変数間に影響が無いまたは関係が無いことを表す。ｐ値は、帰無仮説に反する証拠を評価するのに役立ち、それを棄却するか棄却しないかの決定を助ける。具体的には、ｐ値は、帰無仮説が真であると仮定した場合に、データで観測された統計量と同じか、またはそれよりも極端な検定統計量を得る確率を表す。ｐ値が非常に小さい場合（典型的には０．０５または０．０１など、予め定められた有意水準未満）、観測されたデータが帰無仮説のみの下で発生した可能性が低いことを示唆する。そのような場合、帰無仮説に反する証拠が強いと見なされ、帰無仮説は棄却され、対立仮説が支持される。逆に、ｐ値が相対的に大きい場合（選択された有意水準、通常は０．０５を超える）、観測されたデータが帰無仮説の下で異常または極端ではないことを示す。この状況では、帰無仮説を棄却するのに十分な証拠がなく、帰無仮説は維持される。
【0024】
ｐ値を定義する他の統計的パラメータが当業者に知られており、以下のものがある：
－ 検定統計量：検定統計量は、検定される仮説を評価するために使用されるデータの数値的な要約である。検定統計量の選択は、データの性質および研究課題に依存する。一般的に使用される検定統計量の例には、ｔ統計量、カイ二乗統計量、Ｆ統計量、およびｚスコアを含む。
－ 対立仮説：対立仮説は、帰無仮説の反対を表し、研究者が検出しようとする影響または関係を反映する。それは典型的には、特定の効果量または群間の差異を表す文として定式化される。
－ 有意水準：有意水準は、一般にα（アルファ）として表され、統計的有意性を判断するために予め決められた閾値である。これは、帰無仮説が真である場合にそれを棄却する最大許容確率を表す。一般的に使用される有意水準は、０．０５（５％）および０．０１（１％）である。
－ 検定統計量：検定統計量は、検定される仮説を評価するために使用されるデータの数値的な要約である。検定統計量の選択は、データの性質および研究課題に依存する。一般的に使用される検定統計量の例には、ｔ統計量、カイ二乗統計量、Ｆ統計量、およびｚスコアを含む。
－ 対立仮説：対立仮説は、帰無仮説の反対を表し、研究者が検出しようとする影響または関係を反映する。それは典型的には、特定の効果量または群間の差異を表す文として定式化される。
－ 有意水準：有意水準は、一般にα（アルファ）として表され、統計的有意性を判断するために予め決められた閾値である。これは、帰無仮説が真である場合にそれを棄却する最大許容確率を表す。一般的に使用される有意水準は、０．０５（５％）および０．０１（１％）である。
【0025】
様々な統計ソフトウェアパッケージおよびライブラリが、様々な検定に対するｐ値を計算するための組み込み関数を提供し、研究者にとって処理をより平易にしている。ｐ値は、効果量、信頼区間、および他の関連する尺度と組み合わせて解釈され、手元のデータおよび研究課題について十分な結論を導くべきである。
【0026】
３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイとＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析法では、ｐ値の計算方法および解釈方法に違いがある。
【0027】
３′Ｐ－ｑＰＣＲでは、ｐ値は典型的には、スチューデントのｔ検定または分散分析（ＡＮＯＶＡ）などの統計検定を使用して計算される。３′Ｐ－ｑＰＣＲのｐ値は、２群間（例えば、処理と対照）の観測されたＲＮＡ発現の差が偶然のみによって生じた可能性を評価する。低いｐ値は、観測されたＲＮＡ発現の差が統計的に有意であることを示し、比較されている群間に実際の差があることを示唆する。有意性の閾値（通常アルファ、αとして表される）は、典型的には０．０５に設定される。ｐ値がこの閾値未満の場合、結果は統計的に有意と見なされる。
【0028】
Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析法では、ｐ値は通常、発現差異解析に関連付けられ、これは２つの条件または群間で発現に有意な変化を示す遺伝子を同定することを目的とする。ｐ値は、通常ｅｄｇｅＲ、ＤＥＳｅｑ２、またはｌｉｍｍａのような統計手法を使用して計算され、これらはカウントベースのモデルを使用し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）データに内在する変動を考慮する。ｐ値は、観測されたＲＮＡ発現差異が、ランダムな変動のみによるものである確率を表す。低いｐ値は、観測された発現差異が統計的に有意であることを示し、比較される条件間に真の差があることを示唆する。ｐ値の有意性閾値（α）はまた、通常０．０５以下に設定され、発現差異が統計的に有意であると判断する。
【0029】
重要なのは、３′Ｐ－ｑＰＣＲおよびＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析におけるｐ値の計算および解釈は、使用される具体的な統計手法およびアルゴリズムに依存することである。加えて、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析データにおける大規模データセットを解析する際には、多重検定補正（例えば、ボンフェローニ補正）などの他の要因を考慮して、偽発見率を制御することが重要である。
【0030】
明確にするために、３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイにおいてｐ値が計算される場合は、「３′Ｐ－ｑＰＣＲ ｐ値」と名付け、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析においてｐ値が計算される場合は、「Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値」と名付けた。
【0031】
「マルチマッピングスコア（ｍｕｌｔｉｍａｐｐｉｎｇ ｓｃｏｒｅ）」とは、アライメントの曖昧さまたはリードがマッピングされる可能性のあるトランスクリプトーム位置の数を定量化する、計量を意味する。これは、所与のリードに関連する不確実性または複数マッピング可能性のレベルを評価する。シーケンシングデータ解析において（Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析と同様）、リードは、ＲＮＡ分子のシーケンシングされた断片から得られた短い配列である。目的は、これらのリードをリファレンストランスクリプトームにアライメントまたはマッピングして、その起源または位置を決定することである。しかしながら、トランスクリプトームにおけるリードの長さ、反復領域、または類似性の高い配列など様々な要因により、いくつかのリードは、同じまたは類似したアライメントスコアで、複数の位置にマッピングされうる。マルチマッピングスコアは、リードマッピングに関連する曖昧さの尺度を提供する。これは、リードが類似したアライメントスコアでマッピングされる可能性のある、トランスクリプトーム位置の数を示す。マルチマッピングスコアが高いほど曖昧さのレベルが高いことを意味し、リードが複数のトランスクリプトーム領域または同等のアライメント品質を有する転写産物から由来しうることを示す。マルチマッピングスコアは、シーケンシングデータ解析パイプラインにおいて、リードマッピング結果の信頼性を評価するために、およびマッピングが過度に曖昧なリードを除外するために、一般に使用される。マルチマッピングスコアを考慮することで、リードアライメントの信頼性およびそれに続く下流解析について、当業者は適切な判断を行うことができる。
【0032】
「シーケンシング深度に基づく正規化カウント（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄｅｐｔｈ）」または「カウント数に基づく正規化パラメータ（ａ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｏｕｎｔｓ）」とは、試料間のシーケンシング深度およびライブラリサイズの違いに対し、リードカウントデータを試料間で比較可能にして、有意義な統計解析を可能にするための、カウントを意味する。これは、各遺伝子または転写産物の生のリードカウントを正規化係数で割ることにより計算され、正規化係数は典型的には、試料中のリードの総数またはデータセット内の全試料にわたるリードカウントの中央値に基づく。正規化は、試料間の正確な比較、および発現差異遺伝子または転写産物の同定を可能にするため、シーケンシングデータ解析において重要である。正規化しない場合、シーケンシング深度およびライブラリサイズの違いにより、結果が偏り、真の生物学的変化を技術的変動から区別することが難しくなりうる。正規化カウントは典型的には、発現差異遺伝子解析、経路解析、およびクラスタリングなどの下流解析のために使用される。正規化は、以下によって行われる：（ｉ）１０００塩基あたり１００万マッピングリードあたりのリード（ＲＰＫＭ）を計算すること、これは遺伝子長および試料中のマッピングされたリードの総数によりリードカウントを正規化し、結果を遺伝子長１０００塩基あたり１００万マッピングリードあたりのリード数として表す；または（ｉｉ）１００万あたりの転写産物（ＴＰＭ）を計算すること、これはＲＰＫＭと同様に、遺伝子長およびマッピングされたリードの総数によりリードカウントを正規化するが、各遺伝子のアイソフォームまたは転写産物バリアントの数も考慮に入れる。シーケンシングデータ解析には他の正規化方法も利用でき、例えば「Ｍ値のトリム平均（ｔｒｉｍｍｅｄ ｍｅａｎ ｏｆ Ｍ－ｖａｌｕｅｓ）」（ＴＭＭ）、「クオンタイル正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）」、または「ＤＥＳｅｑ正規化（ＤＥＳｅｑ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）」がある。正規化方法の選択は、具体的な解析パイプライン、データ特性、および目的に依存しうる。
【0033】
「Ｃｔ値（Ｃｔ ｖａｌｕｅ）」とは、標的ＲＮＡの蛍光信号が検出可能な閾値レベルに達する、サイクル数を意味する。
【0034】
「倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）」とは、２つの条件または試料間での遺伝子発現レベルにおける、相対的な変化の尺度を意味する。言い換えれば、具体的な処置、条件、または実験設定に応じた、標的ＲＮＡのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの尺度である。これにより、ＲＮＡ発現レベルにおける相対的な差異を理解し、実験変数がＲＮＡ発現パターンに与える影響を評価するのに役立つ。
【0035】
倍率変化は、通常２つの条件または試料（多くの場合「処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）」群と称される）間で、標的ＲＮＡの発現レベルを比較することによって計算される。
【0036】
重要なのは、倍率変化の計算にはまた、技術的変動を補正し、試料または条件間で比較可能なデータにするための、正規化ステップを含みうることである。具体的な正規化方法は、３′Ｐ－ｑＰＣＲとＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析実験との間で異なりうる。全体として、両方法は遺伝子発現変化についての情報を提供する一方、倍率変化の計算および解釈は、それぞれの原理およびデータ出力形式が異なるため、これらの方法間で異なりうる。
【0037】
明確にするために、３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイにおいて倍率変化（ＦＣ）が計算される場合は、「３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化」と名付け、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑデータ解析において倍率変化（ＦＣ）が計算される場合は、「Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ倍率変化」と名付けた。
【0038】
３′Ｐ－ｑＰＣＲにおいて、倍率変化は、以下の等式に従って計算されうる：
ここで
Ｃｔ（対照）標的は、対照試料で決定された標的ＲＮＡのＣｔ値であり、
Ｃｔ（処理）標的は、生物学的試料で決定された標的ＲＮＡのＣｔ値であり、
Ｃｔ（対照）ｒｅｆは、対照試料で決定されたリファレンスのＣｔ値であり、
Ｃｔ（処理）ｒｅｆは、生物学的試料で決定されたリファレンスのＣｔ値である。
Ｃｔ（対照）標的は、対照試料で決定された標的ＲＮＡのＣｔ値であり、
Ｃｔ（処理）標的は、生物学的試料で決定された標的ＲＮＡのＣｔ値であり、
Ｃｔ（対照）ｒｅｆは、対照試料で決定されたリファレンスのＣｔ値であり、
Ｃｔ（処理）ｒｅｆは、生物学的試料で決定されたリファレンスのＣｔ値である。
【0039】
３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化を計算するための、当業者に知られる別の数学的方法もある。以下はいくつかの例である：
【0040】
－ 効率補正法（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ）：この方法は、３′Ｐ ＲＮＡ（標的遺伝子）とＲＮＡベースのアダプター（リファレンス遺伝子）との間の、ＰＣＲ増幅効率の差を考慮する。これは、各ＲＮＡの相対的な増幅効率（Ｅ）を計算し、それを使用して倍率変化を計算する前にＣｔ値を補正することを含む。この方法による倍率変化の決定式は、以下のとおりである：
倍率変化＝（Ｅ＿標的）＾（Ｃｔ（リファレンス）－Ｃｔ（標的））
ここで：
Ｅ＝増幅効率＝１０＾－１／傾き、
傾き＝標準曲線の傾き、ｙ軸はＣｔ、ｘ軸はｌｏｇ（量）を用いてプロットされる。
倍率変化＝（Ｅ＿標的）＾（Ｃｔ（リファレンス）－Ｃｔ（標的））
ここで：
Ｅ＝増幅効率＝１０＾－１／傾き、
傾き＝標準曲線の傾き、ｙ軸はＣｔ、ｘ軸はｌｏｇ（量）を用いてプロットされる。
【0041】
－ 標準曲線法（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｕｒｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ）：この方法は、一連の既知のテンプレート濃度から生成された標準曲線を利用して、標的遺伝子の相対的な発現を決定する。各試料における標的遺伝子のＣｔ値は、標準曲線上に補間され、対応するテンプレート濃度（ｇ／Ｌ）を得る。テンプレートは、処理または対照条件でありうる。「標準曲線に基づく倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）」はその後、処理条件と対照条件との間のテンプレート濃度を、以下の等式に従って比較することにより計算される２６：
標準曲線に基づく倍率変化＝（処理条件のｇ／Ｌ）／（対照条件のｇ／Ｌ）。
標準曲線に基づく倍率変化＝（処理条件のｇ／Ｌ）／（対照条件のｇ／Ｌ）。
【0042】
－ 比較Ｃｔ法（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ Ｍｅｔｈｏｄ）：２＾－ΔＣｔ法としても知られ、この手法は、リファレンス遺伝子を使用せずに、標的遺伝子のＣｔ値を直接比較する。各条件／試料における標的遺伝子のＣｔ値は、校正試料に、典型的にはリファレンス条件または対照試料に、正規化される。倍率変化は、２＾（－ΔＣｔ）として計算され、ΔＣｔは各条件／試料のＣｔ値と校正試料のＣｔ値との差を表す。
【0043】
－ 相対発現ソフトウェアツール（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｔｏｏｌ）（ＲＥＳＴ）２７：ＲＥＳＴは、ＰＣＲ効率およびＣｔ値に基づく倍率変化を計算する、広く使用されるソフトウェアツールである。これは数学モデルを使用して倍率変化を推定し、信頼区間およびｐ値を含む統計解析を提供する。
【0044】
Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析において、倍率変化は、２つの条件または試料間で、遺伝子のリードカウントまたは発現レベルを比較することにより計算される。倍率変化は、処理群における遺伝子の発現レベルと対照群における遺伝子の発現レベルの比を、以下の等式に従って計算することにより、決定される：
ここで
ｎカウント処理は、生物学的試料中で決定される標的遺伝子の「カウント数に基づく正規化パラメータ」であり、
ｎカウント対照は、対照試料中で決定される標的遺伝子の「カウント数に基づく正規化パラメータ」である。
ｎカウント処理は、生物学的試料中で決定される標的遺伝子の「カウント数に基づく正規化パラメータ」であり、
ｎカウント対照は、対照試料中で決定される標的遺伝子の「カウント数に基づく正規化パラメータ」である。
【0045】
Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析における発現レベルは、転写産物１０００塩基あたり１００万マッピングリードあたりのリード（ＲＰＫＭ）、または転写産物１０００塩基あたり１００万マッピングリードあたりの断片（ＦＰＫＭ）として表される、「カウント数に基づく正規化パラメータ」に、多くの場合基づく。Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ倍率変化値は、ｌｏｇ２倍率変化またはｌｏｇ１０倍率変化など、通常は対数変換される。対数変換された倍率変化値が、変化の大きさをよりよく表現するため、およびデータ分布を線形化するために、一般に使用される。
【0046】
「ヌクレアーゼ耐性を与える修飾核酸塩基を有するリボヌクレオチド（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｈａｖｉｎｇ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」とは、安定性が向上し、ヌクレアーゼ活性に対する耐性を備えた、リボヌクレオチドを意味する。リボヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を与えるために、様々な修飾が開発されてきた。これらの修飾は、特定の官能基の追加または特定の原子の置換など、核酸塩基構造への化学的改変を伴いうる。ヌクレアーゼ耐性を与える修飾核酸塩基の例には、以下を含むが、これらに限定されない：
【0047】
－ ２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）リボヌクレオチド：この修飾では、リボース糖の２′－ヒドロキシル基が、メチル基で置換される。この修飾により、ＲＮＡの折り畳みまたは機能に大きな影響を与えることなく、ヌクレアーゼ耐性および安定性が向上する。
【0048】
－ ２′－フルオロ（２′－Ｆ）リボヌクレオチド：この修飾では、リボース糖の２′－ヒドロキシル基が、フッ素原子で置換される。これにより、ヌクレアーゼへの耐性が改善し、ＲＮＡ安定性が向上する。
【0049】
－ ロック（Ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）：ＬＮＡは、リボース糖の２′酸素と４′炭素との間にメチレン架橋を導入することで、リボースをＣ３′－ｅｎｄｏ配座に効果的に「ロックする（ｌｏｃｋｉｎｇ）」。ＬＮＡは、ヌクレアーゼ耐性を改善し、また相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ配列への結合親和性も向上させる。
【0050】
－ ホスホロチオエート結合：この修飾では、ホスホジエステル骨格の非架橋酸素原子の１つが、硫黄原子で置換される。この修飾は、キラル中心を導入し、骨格の配座を変化させることにより、ヌクレアーゼ耐性を向上させる。
【0051】
－ ペプチド核酸（ＰＮＡ）：ＰＮＡは、糖－リン酸骨格がペプチド様骨格で置換される、合成核酸アナログである。ＰＮＡは、その非イオン性および独自の骨格構造により、優れたヌクレアーゼ耐性を示す。
【0052】
－ ２′－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２′－ＭＯＥ）リボヌクレオチド：この修飾では、２′－ヒドロキシル基が２－メトキシエチル基で置換される。これにより、ヌクレアーゼ耐性が向上し、安定性が改善される一方で、ＲＮＡのハイブリダイゼーション特性を維持する。
【0053】
「５－メチルシトシン（５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）」（５ｍＣ）とは、修飾リボヌクレオチドを意味し、この修飾では、シトシンの５位にメチル基が付加される。
【0054】
「マイナーグルーブバインダー（Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ）」またはＭＧＢとは、ＤＮＡの副溝（ＤＮＡらせんの浅い溝）へ非共有結合的に選択的に結合する、三日月形分子を意味する。
【0055】
「スペーサー分子（Ｓｐａｃｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、２つの目的分子を連結させるために使用される、柔軟な分子または一続きの分子を意味する。
【0056】
［発明の詳細な説明］
以下の説明において、多数の具体的な詳細が、実施形態の十分な理解を提供するために与えられる。実施形態は、１または複数の具体的な詳細が無くとも、または他の方法、構成要素、材料などを用いても、実行されうる。場合によっては、周知の構造、材料、または操作は、実施形態の態様が不明瞭になるのを避けるために、詳細に示されず説明されない。
以下の説明において、多数の具体的な詳細が、実施形態の十分な理解を提供するために与えられる。実施形態は、１または複数の具体的な詳細が無くとも、または他の方法、構成要素、材料などを用いても、実行されうる。場合によっては、周知の構造、材料、または操作は、実施形態の態様が不明瞭になるのを避けるために、詳細に示されず説明されない。
【0057】
本明細書全体を通して「一実施形態」または「ある実施形態」という表現は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１の実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書を通して様々な箇所で現れる「一実施形態において」または「ある実施形態において」という表現は、必ずしも全て同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１または複数の実施形態において任意の適切な形で組み合わされうる。
【0058】
本明細書に記載される見出しは、便宜上のものであり、実施形態の範囲また意味を解釈するものではない。
【0059】
ＲＮＡバイオマーカーの開発における主要な問題は、頑強な候補を同定する技術と、それらを検出するための簡易かつ費用対効果の高い技術の欠如にある２８。バイオマーカーの発見を促進するために、本発明者らはある方法（「Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ」と名付けられた）を開発し、３′Ｐ ＲＮＡを疾患バイオマーカーとして同定することを可能にし、続いて標的定量ＰＣＲアッセイ（「３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイ」と名付けられた）によって、バイオマーカーを正確に同定し、目的の疾患を診断し、発症リスクを評価し、または予後判断するための方法となることを確認した。
【0060】
図１２に模式的に示されるＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ法は、本質的に以下を必要とする：
ａ．３′Ｐ ＲＮＡの５′リン酸化；
ｂ．前記３′Ｐ ＲＮＡとＲＮＡベースのアダプターとの、第１のライゲーション。場合によっては、前記ＲＮＡベースのアダプターは、シーケンシングプラットフォームアダプター構造の１つの核酸ドメインの少なくとも一部を含み、および、特定の源（すなわち、ユニークタイプの細胞または単一細胞）からの各３′Ｐ ＲＮＡをマーク付けするための、ユニーク分子識別子または他のバーコードを含んでもよい；
ｃ．第２のライゲーションステップであって、分子内環状化と呼ばれ、環状ＲＮＡを得る；
ｄ．単一ステップのレトロ転写であって、前記ＲＮＡベースのアダプター配列の一部にアニーリングするＤＮＡプライマーを用い、前記環状ＲＮＡのｃＤＮＡコピーを得る。これは、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の核酸ドメインを、包含しなくてもよく、または少なくとも１つ包含してもよい；
ｅ．１ステップ（図１２のパネルＢ参照）で、または２つの連続するステップ（図１２のパネルＡ参照）で、行われるＰＣＲ増幅であって、ここで：
－ 前記１ステップのＰＣＲは、前記ＲＮＡベースのアダプター配列の少なくとも一部にアニーリングし、および前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記核酸ドメインの全てを包含する、プライマーを用いてなされ、
－ 前記２つの連続するステップは、以下を含む：
第１のＰＣＲステップは、前記ＲＮＡベースのアダプター配列の少なくとも一部にアニーリングし（前記環状ＲＮＡの前記ｃＤＮＡコピーを増幅するため）、および前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の１または複数の核酸ドメインを包含する、プライマーを用いて行われ、
および
第２のＰＣＲステップは、前記第１のＰＣＲプライマー配列にアニーリングし、および前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の１または複数の核酸ドメインを包含する、プライマーを用いて行われる；
ｆ．前記増幅生成物をシーケンシングするステップ；
ｇ．健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、対照としての少なくとも１の生物学的試料に対して、ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップ；
ｈ．少なくとも１つの３′Ｐ ＲＮＡ分子を、疾患の分子マーカーとして、いくつかの特定の条件および閾値を満たすことを決定することにより、同定するステップ。
ａ．３′Ｐ ＲＮＡの５′リン酸化；
ｂ．前記３′Ｐ ＲＮＡとＲＮＡベースのアダプターとの、第１のライゲーション。場合によっては、前記ＲＮＡベースのアダプターは、シーケンシングプラットフォームアダプター構造の１つの核酸ドメインの少なくとも一部を含み、および、特定の源（すなわち、ユニークタイプの細胞または単一細胞）からの各３′Ｐ ＲＮＡをマーク付けするための、ユニーク分子識別子または他のバーコードを含んでもよい；
ｃ．第２のライゲーションステップであって、分子内環状化と呼ばれ、環状ＲＮＡを得る；
ｄ．単一ステップのレトロ転写であって、前記ＲＮＡベースのアダプター配列の一部にアニーリングするＤＮＡプライマーを用い、前記環状ＲＮＡのｃＤＮＡコピーを得る。これは、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の核酸ドメインを、包含しなくてもよく、または少なくとも１つ包含してもよい；
ｅ．１ステップ（図１２のパネルＢ参照）で、または２つの連続するステップ（図１２のパネルＡ参照）で、行われるＰＣＲ増幅であって、ここで：
－ 前記１ステップのＰＣＲは、前記ＲＮＡベースのアダプター配列の少なくとも一部にアニーリングし、および前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記核酸ドメインの全てを包含する、プライマーを用いてなされ、
－ 前記２つの連続するステップは、以下を含む：
第１のＰＣＲステップは、前記ＲＮＡベースのアダプター配列の少なくとも一部にアニーリングし（前記環状ＲＮＡの前記ｃＤＮＡコピーを増幅するため）、および前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の１または複数の核酸ドメインを包含する、プライマーを用いて行われ、
および
第２のＰＣＲステップは、前記第１のＰＣＲプライマー配列にアニーリングし、および前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の１または複数の核酸ドメインを包含する、プライマーを用いて行われる；
ｆ．前記増幅生成物をシーケンシングするステップ；
ｇ．健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、対照としての少なくとも１の生物学的試料に対して、ステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップ；
ｈ．少なくとも１つの３′Ｐ ＲＮＡ分子を、疾患の分子マーカーとして、いくつかの特定の条件および閾値を満たすことを決定することにより、同定するステップ。
【0061】
３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイは、図１３に模式的に示され、配列特異的３′Ｐ ＲＮＡ疾患マーカー（複数可）の増幅、検出、および評価のための、ハイブリッドプライマーの最適設計に基づく。３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイは、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析のために記載されたステップ「ａ～ｅ」を必要とするが、ＲＮＡベースのアダプター配列およびＰＣＲプライマーのタイプが異なる。具体的には、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析のステップ「ｅ」が、並行して行われる２つのｑＰＣＲ増幅で置換され、ここで第１のｑＰＣＲは、定義されたＲＮＡベースのアダプター配列および３′Ｐ ＲＮＡに部分的にアニーリングするプライマー対を使用して行われ、第２のプライマー対は、ＲＮＡベースのアダプターにアニーリングする。第１のｑＰＣＲのフォワードプライマーまたはリバースプライマーのうちの少なくとも１つが、ＲＮＡベースのアダプターと３′Ｐ ＲＮＡとの間の接合部にマッピングされているため、本アッセイは、３′Ｐ ＲＮＡの３′および５′末端に対して強い特異性を有し、３′および５′アニーリング配列上でヌクレオチド単位の分解能を有する。ｑＰＣＲ増幅後、３′Ｐ ＲＮＡのいくつかのパラメータが評価され、いくつかの特定の閾値と比較されるが、これは疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を決定するためである。３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイは、他の蛍光および抗体ベースの方法、およびシーケンシング方法と比較して、時間および費用を削減できる利点を有する。さらに、本アッセイは、標準的な９６ウェルプレート上で、特定の３′Ｐ ＲＮＡマーカーに対して様々な試料をスクリーニングすることにより、または特定の試料に対して３′Ｐ ＲＮＡマーカーのパネルを試験することにより、ハイスループット実験のために設計されうる。
【0062】
本発明は、疾患に罹患している対象の生物学的試料に包含される、３′リン酸または２′／３′環状リン酸を含む少なくとも１のＲＮＡ断片（３′Ｐ ＲＮＡ）を、疾患の分子マーカーとして、同定するための方法を開示し、
前記方法は、以下の各ステップを含む：
（ａ）前記生物学的試料中に包含される前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡを、５′末端でリン酸化して、少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片を得るステップ（図１２のステップ１）；
（ｂ）前記少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片の３′末端を、ＲＮＡベースのアダプターの５′末端にライゲートし、少なくとも１の第１のライゲーション生成物を得るステップ（図１２のステップ２）；
ここで前記ＲＮＡベースのアダプターは、式（Ｉ）を有し：
５′ＯＨ－Ｎｘ－Ｃ１－Ｌ１－Ａｚ－ＰＲ１－Ｎｙ－Ｃ２－Ｂ－ＯＨ ３′ （Ｉ）
ここで
－ Ｎは、リボヌクレオチドであり、
－ ｘおよびｙは、独立に１～２０から選択される整数であり、
－ Ｌ１は、長さが１５～３０の間である、オリゴリボヌクレオチド配列であり、
－ Ａは、脱塩基部位またはレトロ転写酵素活性の阻止を可能にするスペーサーであり、
－ ｚは、１～５の整数であり、
－ ＰＲ１は、長さが１０～８０の間である、シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第１の核酸ドメインの第１の部分であり、
－ Ｂは、無いか、または２′フルオロ塩基を有するリボヌクレオチドか、またはヌクレアーゼ耐性を与える修飾核酸塩基を有するリボヌクレオチドであり、
および
－ Ｃ１およびＣ２は、無いか、または最大２０ヌクレオチドを含むバーコード配列であり、但しＣ１とＣ２の少なくとも一方が無い；
（ｃ）前記少なくとも１の第１のライゲーション生成物を自己ライゲートし、少なくとも１の環状ＲＮＡ分子を形成するステップ（図１２のステップ３）；
（ｄ）前記少なくとも１の環状ＲＮＡ分子の逆転写を行い、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を含む、少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子を得るステップ（図１２のステップ４）；
ここで前記逆転写は、式（ＩＩ）を有する逆転写プライマーを使用して行われ：
５′ＯＨ－Ｒ２－Ｎｚ－Ｄ１－ＯＨ ３′ （ＩＩ）
ここで
－ Ｄ１は、Ｌ１の逆相補デオキシオリゴリボヌクレオチドであり、ここでＤ１のＬ１に対する相補性は、６０％～１００％の間であり、
－ Ｎは、リボヌクレオチドであり、
－ ｚは、１～２０の整数であり、
および
－ Ｒ２は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第２の核酸ドメインである；
（ｅ）前記少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅を行い、少なくとも１の増幅生成物を得るステップ；
ここで前記ＰＣＲ増幅は、以下のいずれかで行われる：
（ｉ）２つの連続するステップ（図１２Ａのステップ５および６）であり、ここで：
－ 第１のＰＣＲ増幅は、第１のプライマー対を使用して行われ、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を有し：
５′ＯＨ－Ｔ１－Ｔ２－ＯＨ ３′ （ＩＩＩ）
５′ＯＨ－Ｔ３－ＯＨ ３′ （ＩＶ）
ここで
◆ Ｔ１は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの第２の部分であり、
◆ Ｔ２は、長さが１０～３０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの前記第１の部分の少なくとも一部にアニーリングする、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり（式ＩのＰＲ１）、
および
◆ Ｔ３は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメインの少なくとも一部にアニーリングする、第２のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり（式ＩＩのＲ２）；
－ 第２のＰＣＲ増幅は、第２のプライマー対を使用して行われ、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、それぞれ式（Ｖ）および（ＶＩ）を有し：
５′ＯＨ－Ｑ１－Ｑ２－Ｑ３－ＯＨ ３′ （Ｖ）
５′ＯＨ－Ｑ４－Ｑ５－Ｑ６－ＯＨ ３′ （ＶＩ）
ここで
◆ Ｑ１は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第３の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ２は、長さが６～２０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第４の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ３は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの少なくとも一部にアニーリングする、第３のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり（式ＩおよびＩＩＩのＴ１＋ＰＲ１）、
◆ Ｑ４は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第５の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ５は、長さが６～２０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第６の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ６は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメインの少なくとも一部にアニーリングする、第４のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列である（式ＩＩのＲ２）；
または
（ｉｉ）第３のプライマー対を使用する１つの単一ステップ（図１２Ｂのステップ５）であり、第３のフォワードプライマーおよび第３のリバースプライマーは、それぞれ式（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）を有し；
５′ＯＨ－Ｑ１－Ｑ２－Ｑ７－ＯＨ ３′ （ＶＩＩ）
５′ＯＨ－Ｑ４－Ｑ５－Ｑ６－ＯＨ ３′ （ＶＩＩＩ）
ここで
◆ Ｑ１、Ｑ２、Ｑ４、Ｑ５、およびＱ６は、上記に示された意味を有し、
および
◆ Ｑ７は、長さが１０～５０の間であり、５′末端に前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの第２の部分（式（ＩＩＩ）のＴ１に対応する）を含み、および３′末端で前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの前記第１の部分（式（Ｉ）のＰＲ１）の少なくとも一部にアニーリングする、ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列である；
（ｆ）前記少なくとも１の増幅生成物をシーケンシングし、前記少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子中に含まれる、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を得るステップ；
（ｇ）ステップ（ａ）から（ｆ）を、少なくとも１の対照試料に対して繰り返すステップ；
ここで前記対照試料は、健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、生物学的試料である；
（ｈ）前記生物学的試料および前記対照試料から得られた前記増幅生成物中に包含される、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡについて、以下を計算するステップ：（ｉ）カウント数、（ｉｉ）Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値、（ｉｉｉ）切断パターン、および（ｉｖ）以下の等式に従った、前記生物学的試料と前記対照試料との比較におけるカウント数に基づく正規化パラメータのＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ倍率変化：
ここで
－ ｎカウント処理は、前記生物学的試料中で決定される前記３′Ｐ ＲＮＡのカウント数に基づく正規化パラメータであり；
－ ｎカウント対照は、前記対照試料中で決定される前記３′Ｐ ＲＮＡのカウント数に基づく正規化パラメータであり；
ここで前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡは、以下の場合における前記疾患の前記少なくとも１の分子マーカーであり：
－ カウント数が、＞２００であり、
－ 前記Ｄａｒｔ ＲＮＡｓｅｑ ｐ値が、≦０．０５であり、
－ 前記切断パターンは、前記３′Ｐ ＲＮＡの長さに沿った１塩基あたりの切断頻度が≦４０％であり、前記３′Ｐ ＲＮＡの５′および３′末端における１塩基あたりの切断頻度が≧６０％であり、
および
－ 前記Ｄａｒｔ ＲＮＡｓｅｑ倍率変化が、≧２または≦０．５である。
前記方法は、以下の各ステップを含む：
（ａ）前記生物学的試料中に包含される前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡを、５′末端でリン酸化して、少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片を得るステップ（図１２のステップ１）；
（ｂ）前記少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片の３′末端を、ＲＮＡベースのアダプターの５′末端にライゲートし、少なくとも１の第１のライゲーション生成物を得るステップ（図１２のステップ２）；
ここで前記ＲＮＡベースのアダプターは、式（Ｉ）を有し：
５′ＯＨ－Ｎｘ－Ｃ１－Ｌ１－Ａｚ－ＰＲ１－Ｎｙ－Ｃ２－Ｂ－ＯＨ ３′ （Ｉ）
ここで
－ Ｎは、リボヌクレオチドであり、
－ ｘおよびｙは、独立に１～２０から選択される整数であり、
－ Ｌ１は、長さが１５～３０の間である、オリゴリボヌクレオチド配列であり、
－ Ａは、脱塩基部位またはレトロ転写酵素活性の阻止を可能にするスペーサーであり、
－ ｚは、１～５の整数であり、
－ ＰＲ１は、長さが１０～８０の間である、シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第１の核酸ドメインの第１の部分であり、
－ Ｂは、無いか、または２′フルオロ塩基を有するリボヌクレオチドか、またはヌクレアーゼ耐性を与える修飾核酸塩基を有するリボヌクレオチドであり、
および
－ Ｃ１およびＣ２は、無いか、または最大２０ヌクレオチドを含むバーコード配列であり、但しＣ１とＣ２の少なくとも一方が無い；
（ｃ）前記少なくとも１の第１のライゲーション生成物を自己ライゲートし、少なくとも１の環状ＲＮＡ分子を形成するステップ（図１２のステップ３）；
（ｄ）前記少なくとも１の環状ＲＮＡ分子の逆転写を行い、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を含む、少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子を得るステップ（図１２のステップ４）；
ここで前記逆転写は、式（ＩＩ）を有する逆転写プライマーを使用して行われ：
５′ＯＨ－Ｒ２－Ｎｚ－Ｄ１－ＯＨ ３′ （ＩＩ）
ここで
－ Ｄ１は、Ｌ１の逆相補デオキシオリゴリボヌクレオチドであり、ここでＤ１のＬ１に対する相補性は、６０％～１００％の間であり、
－ Ｎは、リボヌクレオチドであり、
－ ｚは、１～２０の整数であり、
および
－ Ｒ２は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第２の核酸ドメインである；
（ｅ）前記少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅を行い、少なくとも１の増幅生成物を得るステップ；
ここで前記ＰＣＲ増幅は、以下のいずれかで行われる：
（ｉ）２つの連続するステップ（図１２Ａのステップ５および６）であり、ここで：
－ 第１のＰＣＲ増幅は、第１のプライマー対を使用して行われ、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を有し：
５′ＯＨ－Ｔ１－Ｔ２－ＯＨ ３′ （ＩＩＩ）
５′ＯＨ－Ｔ３－ＯＨ ３′ （ＩＶ）
ここで
◆ Ｔ１は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの第２の部分であり、
◆ Ｔ２は、長さが１０～３０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの前記第１の部分の少なくとも一部にアニーリングする、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり（式ＩのＰＲ１）、
および
◆ Ｔ３は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメインの少なくとも一部にアニーリングする、第２のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり（式ＩＩのＲ２）；
－ 第２のＰＣＲ増幅は、第２のプライマー対を使用して行われ、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、それぞれ式（Ｖ）および（ＶＩ）を有し：
５′ＯＨ－Ｑ１－Ｑ２－Ｑ３－ＯＨ ３′ （Ｖ）
５′ＯＨ－Ｑ４－Ｑ５－Ｑ６－ＯＨ ３′ （ＶＩ）
ここで
◆ Ｑ１は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第３の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ２は、長さが６～２０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第４の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ３は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの少なくとも一部にアニーリングする、第３のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり（式ＩおよびＩＩＩのＴ１＋ＰＲ１）、
◆ Ｑ４は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第５の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ５は、長さが６～２０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第６の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ６は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメインの少なくとも一部にアニーリングする、第４のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列である（式ＩＩのＲ２）；
または
（ｉｉ）第３のプライマー対を使用する１つの単一ステップ（図１２Ｂのステップ５）であり、第３のフォワードプライマーおよび第３のリバースプライマーは、それぞれ式（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）を有し；
５′ＯＨ－Ｑ１－Ｑ２－Ｑ７－ＯＨ ３′ （ＶＩＩ）
５′ＯＨ－Ｑ４－Ｑ５－Ｑ６－ＯＨ ３′ （ＶＩＩＩ）
ここで
◆ Ｑ１、Ｑ２、Ｑ４、Ｑ５、およびＱ６は、上記に示された意味を有し、
および
◆ Ｑ７は、長さが１０～５０の間であり、５′末端に前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの第２の部分（式（ＩＩＩ）のＴ１に対応する）を含み、および３′末端で前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの前記第１の部分（式（Ｉ）のＰＲ１）の少なくとも一部にアニーリングする、ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列である；
（ｆ）前記少なくとも１の増幅生成物をシーケンシングし、前記少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子中に含まれる、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を得るステップ；
（ｇ）ステップ（ａ）から（ｆ）を、少なくとも１の対照試料に対して繰り返すステップ；
ここで前記対照試料は、健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、生物学的試料である；
（ｈ）前記生物学的試料および前記対照試料から得られた前記増幅生成物中に包含される、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡについて、以下を計算するステップ：（ｉ）カウント数、（ｉｉ）Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値、（ｉｉｉ）切断パターン、および（ｉｖ）以下の等式に従った、前記生物学的試料と前記対照試料との比較におけるカウント数に基づく正規化パラメータのＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ倍率変化：
－ ｎカウント処理は、前記生物学的試料中で決定される前記３′Ｐ ＲＮＡのカウント数に基づく正規化パラメータであり；
－ ｎカウント対照は、前記対照試料中で決定される前記３′Ｐ ＲＮＡのカウント数に基づく正規化パラメータであり；
ここで前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡは、以下の場合における前記疾患の前記少なくとも１の分子マーカーであり：
－ カウント数が、＞２００であり、
－ 前記Ｄａｒｔ ＲＮＡｓｅｑ ｐ値が、≦０．０５であり、
－ 前記切断パターンは、前記３′Ｐ ＲＮＡの長さに沿った１塩基あたりの切断頻度が≦４０％であり、前記３′Ｐ ＲＮＡの５′および３′末端における１塩基あたりの切断頻度が≧６０％であり、
および
－ 前記Ｄａｒｔ ＲＮＡｓｅｑ倍率変化が、≧２または≦０．５である。
【0063】
ステップ（ｈ）は、以下の操作のうちの少なくとも１つをさらに含み：
－ 前記生物学的試料および前記対照試料から得られた前記増幅生成物中に包含される、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を、リファレンスゲノムまたはトランスクリプトーム上にマッピングし、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡのマルチマッピングスコアを計算するステップ、
－ 前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの長さを計算するステップ、
および
－ 前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡのシーケンシング深度に基づく正規化カウントを計算するステップ；
ここで、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡは、以下の場合における前記疾患の前記少なくとも１の分子マーカーである：
－ 前記長さが、＞１５および＜２００ヌクレオチドである、
または
－ シーケンシング深度に基づく前記正規化カウントが、＞５である、
または
－ 前記マルチマッピングスコアが、≦１００である。
－ 前記生物学的試料および前記対照試料から得られた前記増幅生成物中に包含される、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を、リファレンスゲノムまたはトランスクリプトーム上にマッピングし、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡのマルチマッピングスコアを計算するステップ、
－ 前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの長さを計算するステップ、
および
－ 前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡのシーケンシング深度に基づく正規化カウントを計算するステップ；
ここで、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡは、以下の場合における前記疾患の前記少なくとも１の分子マーカーである：
－ 前記長さが、＞１５および＜２００ヌクレオチドである、
または
－ シーケンシング深度に基づく前記正規化カウントが、＞５である、
または
－ 前記マルチマッピングスコアが、≦１００である。
【0064】
フェーズ（ｅ）の最後で得られた増幅生成物は、図１２Ａまたは図１２Ｂに示される組成を有する、少なくとも１のＤＮＡ分子を包含する。ＤＮＡ分子のセンス鎖は、５′末端から３′末端までに、以下の要素を含む：シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第３の（Ｑ１）、第４の（Ｑ２）、第１の（Ｔ１＋ＰＲ１）核酸ドメイン（第１の核酸ドメインは、第１のＰＲ１部分と第２のＴ１部分との組み合わせにより与えられる）、ｙ個のデオキシリボヌクレオチド（Ｎｙ）、バーコード配列または無し（Ｃ２）、無しまたはデオキシリボヌクレオチド（Ｂ）、３′Ｐ ＲＮＡの配列、ｘ個のデオキシリボヌクレオチド（Ｎｘ）、無しまたはバーコード配列（Ｃ１）、デオキシリボヌクレオチド（Ｄ１）、ｚ個のデオキシリボヌクレオチド（Ｎｚ）、シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第２の（Ｒ２）、第６の（Ｑ５）、および第５の（Ｑ４）核酸ドメイン。
【0065】
前記シーケンシングプラットフォームは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（例えば、ＨｉＳｅｇ（商標）、ＭｉＳｅｇ（商標）、およびＮｏｖａＳｅｑ（商標）シーケンシングシステム）；Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（例えば、ＡＶＩＴＩ（商標）シーケンシングシステム用ＬｏｏｐＳｅｑ）；Ｓｉｎｇｕｌａｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ（例えば、Ｇ４システム）；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、ＳＯＬＤシーケンシングシステム）；Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸ＋および／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒシーケンシングシステム）；ＭＧＩ（例えば、Ｅ２５、Ｇ４００、Ｇ９９、Ｇ５０、およびＴ７、Ｔ１０、Ｔ２０システム）によって、市販されるものから選択される。好ましくは、前記シーケンシングプラットフォームは、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって市販されるものから選択される。
【0066】
シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第３の（Ｑ１）、第４の（Ｑ２）、第１の（Ｔ１＋ＰＲ１）核酸ドメインの組合せは、以下から選択される配列を有する：（ｉ）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる、Ｐ１アダプター（「Applied Biosystems SOLiDTM 4 System Library Preparation Guide」にて報告、２０１０年４月、
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/SOLiD4_Library_Preparation_man.pdf）、（ｉｉ）Ｒｏｃｈｅによる、ＧＳアダプターＡ（「GS FLX Titanium General Library Preparation Method Manual」にて報告、２００９年４月、USM-00048.B、
https://dna.uga.edu/wp-content/uploads/sites/51/2013/12/GS-FLX-Titanium-General-Library-Preparation-Method-Manual-Roche.pdf）、および（ｉｉｉ）ＭＧＩによる、ＭＧＩ ５′アダプター（「MGIEasy RNA Directional Library Prep Set User Manual」にて報告、カタログ番号：１０００００６３８５（１６ＲＸＮ）、１０００００６３８６（９６ＲＸＮ）、キットバージョン：Ｖ２．１、マニュアルバージョン：５．０）。
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/SOLiD4_Library_Preparation_man.pdf）、（ｉｉ）Ｒｏｃｈｅによる、ＧＳアダプターＡ（「GS FLX Titanium General Library Preparation Method Manual」にて報告、２００９年４月、USM-00048.B、
https://dna.uga.edu/wp-content/uploads/sites/51/2013/12/GS-FLX-Titanium-General-Library-Preparation-Method-Manual-Roche.pdf）、および（ｉｉｉ）ＭＧＩによる、ＭＧＩ ５′アダプター（「MGIEasy RNA Directional Library Prep Set User Manual」にて報告、カタログ番号：１０００００６３８５（１６ＲＸＮ）、１０００００６３８６（９６ＲＸＮ）、キットバージョン：Ｖ２．１、マニュアルバージョン：５．０）。
【0067】
シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第２の（Ｒ２）、第６の（Ｑ５）、および第５の（Ｑ４）核酸ドメインの組合せは、以下から選択される配列を有する：（ｉ）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる、Ｐ２アダプター（「Applied Biosystems SOLiDTM 4 System Library Preparation Guide」にて報告、２０１０年４月、
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/SOLiD4_Library_Preparation_man.pdf）、（ｉｉ）Ｒｏｃｈｅによる、ＧＳアダプターＢ（「GS FLX Titanium General Library Preparation Method Manual」にて報告、２００９年４月、USM-00048.B、
https://dna.uga.edu/wp-content/uploads/sites/51/2013/12/GS-FLX-Titanium-General-Library-Preparation-Method-Manual-Roche.pdf）、および（ｉｉｉ）ＭＧＩによる、ＭＧＩ ３′アダプター（「MGIEasy RNA Directional Library Prep Set User Manual」にて報告、カタログ番号：１０００００６３８５（１６ＲＸＮ）、１０００００６３８６（９６ＲＸＮ）、キットバージョン：Ｖ２．１、マニュアルバージョン：５．０）。
https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/SOLiD4_Library_Preparation_man.pdf）、（ｉｉ）Ｒｏｃｈｅによる、ＧＳアダプターＢ（「GS FLX Titanium General Library Preparation Method Manual」にて報告、２００９年４月、USM-00048.B、
https://dna.uga.edu/wp-content/uploads/sites/51/2013/12/GS-FLX-Titanium-General-Library-Preparation-Method-Manual-Roche.pdf）、および（ｉｉｉ）ＭＧＩによる、ＭＧＩ ３′アダプター（「MGIEasy RNA Directional Library Prep Set User Manual」にて報告、カタログ番号：１０００００６３８５（１６ＲＸＮ）、１０００００６３８６（９６ＲＸＮ）、キットバージョン：Ｖ２．１、マニュアルバージョン：５．０）。
【0068】
当該分野の専門家が、市販されるシーケンシングプラットフォームにより使用されるシーケンシングプラットフォームアダプター構造の配列を「切り貼り」し、ＲＮＡベースのアダプター、逆転写プライマー、およびＰＣＲプライマーの（および結果として、上記で同定された様々な核酸ドメインの）配列を適切な形で生成する方法を知っていることは、確かに明らかであり、その結果、ステップ（ｅ）の最後で得られるＤＮＡ分子は、図１２に示される配列を有し、専門家が利用可能なものから選択したシーケンシングプラットフォームによって、シーケンシングされうる。
【0069】
前記シーケンシング（ステップｆ）が、Ｉｌｌｕｍｉｎａによるシーケンシングプラットフォーム上で行われる場合：
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第１の核酸ドメインＰＲ１＋Ｔ１の配列は、配列ＳＰ１から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメインＲ２は、配列ＳＰ２から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第３の核酸ドメインＱ１は、配列Ｐ５であり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第４の核酸ドメインＱ２は、配列ｉ５（すなわちインデックス５）から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第５の核酸ドメインＱ４は、配列Ｐ７であり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第６の核酸ドメインＱ５は、配列ｉ７（すなわちインデックス７）から選択される。
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第１の核酸ドメインＰＲ１＋Ｔ１の配列は、配列ＳＰ１から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメインＲ２は、配列ＳＰ２から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第３の核酸ドメインＱ１は、配列Ｐ５であり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第４の核酸ドメインＱ２は、配列ｉ５（すなわちインデックス５）から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第５の核酸ドメインＱ４は、配列Ｐ７であり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第６の核酸ドメインＱ５は、配列ｉ７（すなわちインデックス７）から選択される。
【0070】
配列ＳＰ１、ＳＰ２、ｉ５、ｉ７、Ｐ５、およびＰ７は、当業者の一般的な知識の一部であり、「Illumina Adapter Sequences」にて完全に開示されている。文献番号１００００００００２６９４ ｖ１１、２０１９年５月；
https://www.science.smith.edu/cmbs/wp-content/uploads/sites/36/2020/01/illumina-adapter-sequences-1000000002694-11.pdf。
https://www.science.smith.edu/cmbs/wp-content/uploads/sites/36/2020/01/illumina-adapter-sequences-1000000002694-11.pdf。
【0071】
前記シーケンシング（ステップｆ）が、Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるシーケンシングプラットフォーム上で行われる場合：
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第１の核酸ドメインＰＲ１＋Ｔ１の配列は、配列リードプライマー１から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメインＲ２は、配列リードプライマー２から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第３の核酸ドメインＱ１は、配列アウターアダプターであり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第４の核酸ドメインＱ２は、配列インデックス２から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第５の核酸ドメインＱ４は、配列アウターアダプターであり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第６の核酸ドメインＱ５は、配列アダプターから選択される。
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第１の核酸ドメインＰＲ１＋Ｔ１の配列は、配列リードプライマー１から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメインＲ２は、配列リードプライマー２から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第３の核酸ドメインＱ１は、配列アウターアダプターであり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第４の核酸ドメインＱ２は、配列インデックス２から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第５の核酸ドメインＱ４は、配列アウターアダプターであり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第６の核酸ドメインＱ５は、配列アダプターから選択される。
【0072】
配列アウターアダプター、インデックス２、リードプライマー１、リードプライマー２、アダプター、およびアウターアダプターは、当業者の一般的な知識の一部であり、「Amplicon LoopSeqTM for AVITITM」文献番号ＭＡ－０００２３ Ｒｅｖ．Ｃ、２０２３年６月、
go.elementbiosciences.com/amplicon-loopseq-aviti-workflow-guide、および「Element ElevateTM Library Prep」文献番号ＭＡ－００００４ Ｒｅｖ．Ｂ、２０２３年６月、
go.elementbiosciences.com/elevate-library-prep-workflow-guideにて完全に開示されている。
go.elementbiosciences.com/amplicon-loopseq-aviti-workflow-guide、および「Element ElevateTM Library Prep」文献番号ＭＡ－００００４ Ｒｅｖ．Ｂ、２０２３年６月、
go.elementbiosciences.com/elevate-library-prep-workflow-guideにて完全に開示されている。
【0073】
前記シーケンシング（ステップｆ）が、Ｓｉｎｇｕｌａｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによるシーケンシングプラットフォーム上で行われる場合：
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第１の核酸ドメインＰＲ１＋Ｔ１の配列は、配列ＳＰ１から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメインＲ２は、配列ＳＰ２から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第３の核酸ドメインＱ１は、配列Ｓ１であり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第４の核酸ドメインＱ２は、配列インデックス１から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第５の核酸ドメインＱ４は、Ｓ２であり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第６の核酸ドメインＱ５は、配列インデックス２から選択される。
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第１の核酸ドメインＰＲ１＋Ｔ１の配列は、配列ＳＰ１から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメインＲ２は、配列ＳＰ２から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第３の核酸ドメインＱ１は、配列Ｓ１であり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第４の核酸ドメインＱ２は、配列インデックス１から選択され；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第５の核酸ドメインＱ４は、Ｓ２であり；
－ 前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第６の核酸ドメインＱ５は、配列インデックス２から選択される。
【0074】
配列Ｓ１、Ｓ２、ＳＰ１、ＳＰ２、インデックス１、およびインデックス２は、当業者の一般的な知識の一部であり、「ADAPTING LIBRARIES FOR THE G4TM ― INSERT ONLY」文献番号６０００２４ Ｒｅｖ．０、２０２３年５月、
https://singulargenomics.com/wp-content/uploads/2023/06/Adapting-Library-Insert-600024.pdfにて完全に開示されている。
https://singulargenomics.com/wp-content/uploads/2023/06/Adapting-Library-Insert-600024.pdfにて完全に開示されている。
【0075】
前記第１および第２のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列Ｔ２およびＴ３は、それぞれ前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの前記第１の部分（ＰＲ１）および第２の核酸ドメイン（Ｒ２）の、少なくとも６ヌクレオチドにアニーリングする。
【0076】
前記第３および第４のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列Ｑ３およびＱ６は、それぞれ前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの前記第２の部分（Ｔ１）および前記第２の核酸ドメイン（Ｒ２）の、少なくとも６ヌクレオチドにアニーリングする。
【0077】
ステップ（ａ）を行う前に、前記生物学的試料および／または前記対照試料が、スモールＲＮＡ濃縮操作を受け、すなわち、２００ヌクレオチド未満（好ましくは１０～２００ヌクレオチド）の全てのＲＮＡ断片が、当業者に既知の任意の方法（例えば、シリカカラムベースの方法）を用いてサイズ選別される。
【0078】
前記生物学的試料は、尿、全血、唾液、血漿、皮膚、線維芽細胞、神経細胞、肝臓、筋肉、初代および不死化細胞株、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、非ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から選択される。
【0079】
リン酸化ステップ（ａ）は、Ｔ４ ＰＮＫ ３′ｍｉｎｕｓ、Ｔ４ ＰＮＫ、および組換え型のＴ４ ＰＮＫ（例えば、Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ（商標））から選択される、リン酸化酵素を使用して、行われる。
【0080】
ライゲーションステップ（ｂ）は、ＲｔｃＢ、アーキアーゼ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｔｈａｌｉａｎａ）ｔＲＮＡリガーゼ、および真核生物ｔＲＮＡリガーゼから選択される、第１のリガーゼ酵素を使用して、行われる。
【0081】
自己ライゲーションステップ（ｃ）は、Ｔ４ Ｒｎｌ１、Ｔ４ Ｒｎｌ２、Ｔ４ Ｒｎｌ２ｔｒ、Ｔ４ Ｒｎｌ２ Ｋ２２７Ｑ、Ｍｔｈ Ｒｎｌ、および分子内ライゲーションを触媒するＡＴＰ非依存性リガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩ（商標））から選択される、第２のリガーゼ酵素を使用して、行われる。
【0082】
逆転写ステップ（ｄ）は、改変Ｍ ＭＬＶ－ＲＴ酵素（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）およびＡＭＶ－ＲＴ酵素（トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｏｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素）から選択される、好ましくはＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ（商標）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｉ－ＩＩ－ＩＩＩ－ＩＶ、Ｓｕｎｓｃｒｉｐｔ（商標）から選択される、逆転写酵素（ＲＴ）を使用して、行われる。
【0083】
ＰＣＲ増幅ステップ（ｅ）は、改変Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは高忠実度活性を有するもの（例えば、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ）から選択される、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用して、行われる。
【0084】
上記のＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析法は、脊髄性筋萎縮症および皮膚扁平上皮癌のいくつかの分子マーカーの同定を可能にし；脊髄性筋萎縮症の３′Ｐ ＲＮＡマーカーは、配列番号１～８３に示される配列を有し；皮膚扁平上皮癌の３′Ｐ ＲＮＡマーカーは、配列番号８４～１７２に示される配列を有する。
【0085】
本発明はまた、少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡを疾患の分子マーカーとして同定するための、上記のＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析法を実施するのに適したキットを開示し、
前記キットは、以下を含む：
（ａ）式（Ｉ）を有する、少なくとも１のＲＮＡベースのアダプター：
５′ＯＨ－Ｎｘ－Ｃ１－Ｌ１－Ａｚ－ＰＲ１－Ｎｙ－Ｃ２－Ｂ－ＯＨ ３′ （Ｉ）
ここで
－ Ｎは、リボヌクレオチドであり、
－ ｘおよびｙは、独立に１～２０から選択される整数であり、
－ Ｌ１は、長さが１５～３０の間である、オリゴリボヌクレオチド配列であり、
－ Ａは、脱塩基部位またはレトロ転写酵素活性の阻止を可能にするスペーサーであり、
－ ｚは、１～５の整数であり、
－ ＰＲ１は、長さが１０～８０の間である、シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第１の核酸ドメインの一部分であり、
－ Ｂは、無いか、２′フルオロ塩基を有するリボヌクレオチドか、またはヌクレアーゼ耐性を与える修飾核酸塩基を有するリボヌクレオチドであり、
および
－ Ｃ１およびＣ２は、無いか、または最大２０ヌクレオチドを含むバーコード配列であり、但しＣ１とＣ２の少なくとも一方が無い；
（ｂ）式（ＩＩ）を有する、逆転写プライマー：
５′ＯＨ－Ｒ２－Ｎｚ－Ｄ１－ＯＨ ３′ （ＩＩ）
ここで
－ Ｄ１は、Ｌ１の逆相補デオキシオリゴリボヌクレオチドであり、ここでＤ１のＬ１に対する相補性は、６０％～１００％の間であり、
および
－ Ｒ２は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第２の核酸ドメインであり、
－ Ｎは、リボヌクレオチドであり、
－ ｚは、独立に１～２０から選択される整数である；
および以下のいずれか一方、
（ｃ）第１および第２のプライマー対であって、ここで
－ 前記第１のプライマー対は、それぞれ式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を有する、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含み：
５′ＯＨ－Ｔ１－Ｔ２－ＯＨ ３′ （ＩＩＩ）
５′ＯＨ－Ｔ３－ＯＨ ３′ （ＩＶ）
ここで
◆ Ｔ１は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの第２の部分であり、
◆ Ｔ２は、長さが１０～３０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの第１の部分（ＰＲ１）の少なくとも一部にアニーリングする、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり、
および
◆ Ｔ３は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の（Ｒ２）核酸ドメインの少なくとも一部にアニーリングする、第２のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり；
－ 前記第２のプライマー対は、それぞれ式（Ｖ）および（ＶＩ）を有する、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含み：
５′ＯＨ－Ｑ１－Ｑ２－Ｑ３－ＯＨ ３′ （Ｖ）
５′ＯＨ－Ｑ４－Ｑ５－Ｑ６－ＯＨ ３′ （ＶＩ）
ここで
◆ Ｑ１は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第３の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ２は、長さが６～２０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第４の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ３は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメイン（Ｔ１＋ＰＲ１）の少なくとも一部にアニーリングする、第３のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり、
◆ Ｑ４は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第５の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ５は、長さが６～２０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第６の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ６は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメイン（Ｒ２）の少なくとも一部にアニーリングする、第４のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列である；
または
（ｄ）少なくとも１のプライマー対であって、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）を有し：
５′ＯＨ－Ｑ１－Ｑ２－Ｑ７－ＯＨ ３′ （ＶＩＩ）
５′ＯＨ－Ｑ４－Ｑ５－Ｑ６－ＯＨ ３′ （ＶＩＩＩ）
ここで
◆ Ｑ１、Ｑ２、Ｑ４、Ｑ５、およびＱ６は、上記に示された意味を有し、
および
◆ Ｑ７は、長さが１０～５０の間であり、５′末端に前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの第２の部分（Ｔ１）を含み、および３′末端で前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの前記第１の部分（式（Ｉ）のＰＲ１）の少なくとも一部にアニーリングする、ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列である。
前記キットは、以下を含む：
（ａ）式（Ｉ）を有する、少なくとも１のＲＮＡベースのアダプター：
５′ＯＨ－Ｎｘ－Ｃ１－Ｌ１－Ａｚ－ＰＲ１－Ｎｙ－Ｃ２－Ｂ－ＯＨ ３′ （Ｉ）
ここで
－ Ｎは、リボヌクレオチドであり、
－ ｘおよびｙは、独立に１～２０から選択される整数であり、
－ Ｌ１は、長さが１５～３０の間である、オリゴリボヌクレオチド配列であり、
－ Ａは、脱塩基部位またはレトロ転写酵素活性の阻止を可能にするスペーサーであり、
－ ｚは、１～５の整数であり、
－ ＰＲ１は、長さが１０～８０の間である、シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第１の核酸ドメインの一部分であり、
－ Ｂは、無いか、２′フルオロ塩基を有するリボヌクレオチドか、またはヌクレアーゼ耐性を与える修飾核酸塩基を有するリボヌクレオチドであり、
および
－ Ｃ１およびＣ２は、無いか、または最大２０ヌクレオチドを含むバーコード配列であり、但しＣ１とＣ２の少なくとも一方が無い；
（ｂ）式（ＩＩ）を有する、逆転写プライマー：
５′ＯＨ－Ｒ２－Ｎｚ－Ｄ１－ＯＨ ３′ （ＩＩ）
ここで
－ Ｄ１は、Ｌ１の逆相補デオキシオリゴリボヌクレオチドであり、ここでＤ１のＬ１に対する相補性は、６０％～１００％の間であり、
および
－ Ｒ２は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第２の核酸ドメインであり、
－ Ｎは、リボヌクレオチドであり、
－ ｚは、独立に１～２０から選択される整数である；
および以下のいずれか一方、
（ｃ）第１および第２のプライマー対であって、ここで
－ 前記第１のプライマー対は、それぞれ式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を有する、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含み：
５′ＯＨ－Ｔ１－Ｔ２－ＯＨ ３′ （ＩＩＩ）
５′ＯＨ－Ｔ３－ＯＨ ３′ （ＩＶ）
ここで
◆ Ｔ１は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの第２の部分であり、
◆ Ｔ２は、長さが１０～３０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの第１の部分（ＰＲ１）の少なくとも一部にアニーリングする、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり、
および
◆ Ｔ３は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の（Ｒ２）核酸ドメインの少なくとも一部にアニーリングする、第２のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり；
－ 前記第２のプライマー対は、それぞれ式（Ｖ）および（ＶＩ）を有する、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含み：
５′ＯＨ－Ｑ１－Ｑ２－Ｑ３－ＯＨ ３′ （Ｖ）
５′ＯＨ－Ｑ４－Ｑ５－Ｑ６－ＯＨ ３′ （ＶＩ）
ここで
◆ Ｑ１は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第３の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ２は、長さが６～２０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第４の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ３は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメイン（Ｔ１＋ＰＲ１）の少なくとも一部にアニーリングする、第３のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列であり、
◆ Ｑ４は、長さが１０～５０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第５の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ５は、長さが６～２０の間である、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の第６の核酸ドメインであり、
◆ Ｑ６は、長さが１０～５０の間であり、前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第２の核酸ドメイン（Ｒ２）の少なくとも一部にアニーリングする、第４のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列である；
または
（ｄ）少なくとも１のプライマー対であって、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）を有し：
５′ＯＨ－Ｑ１－Ｑ２－Ｑ７－ＯＨ ３′ （ＶＩＩ）
５′ＯＨ－Ｑ４－Ｑ５－Ｑ６－ＯＨ ３′ （ＶＩＩＩ）
ここで
◆ Ｑ１、Ｑ２、Ｑ４、Ｑ５、およびＱ６は、上記に示された意味を有し、
および
◆ Ｑ７は、長さが１０～５０の間であり、５′末端に前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの第２の部分（Ｔ１）を含み、および３′末端で前記シーケンシングプラットフォームアダプター構造の前記第１の核酸ドメインの前記第１の部分（式（Ｉ）のＰＲ１）の少なくとも一部にアニーリングする、ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列である。
【0086】
前記キットは、以下を含む：
（ａ）配列番号１７３～１７７に示される配列から選択される配列を有する、少なくとも１のＲＮＡベースのアダプター；
（ｂ）配列番号１７８に示される配列を有する、逆転写プライマー；
および以下のいずれか一方、
（ｃ）それぞれ配列番号１７９および１８０に示される配列を有する、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含む、１つの第１のプライマー対、およびそれぞれ式（ＩＸ）および（Ｘ）を有する、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含む、少なくとも１つの第２のプライマー対：
５′ＯＨ－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（ｉ５）ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－ＯＨ ３′ （ＩＸ）
５′ＯＨ－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（ｉ７）ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－ＯＨ ３′ （Ｘ）
ここで
（ｉ５）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる配列ｉ５（すなわちインデックス５）から選択され、
および
（ｉ７）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる配列ｉ７（すなわちインデックス７）から選択される；
または
（ｄ）上記に示される式（ＩＸ）および（Ｘ）を有する、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、少なくとも１つのプライマー対。
（ａ）配列番号１７３～１７７に示される配列から選択される配列を有する、少なくとも１のＲＮＡベースのアダプター；
（ｂ）配列番号１７８に示される配列を有する、逆転写プライマー；
および以下のいずれか一方、
（ｃ）それぞれ配列番号１７９および１８０に示される配列を有する、第１のフォワードプライマーおよび第１のリバースプライマーを含む、１つの第１のプライマー対、およびそれぞれ式（ＩＸ）および（Ｘ）を有する、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含む、少なくとも１つの第２のプライマー対：
５′ＯＨ－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（ｉ５）ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－ＯＨ ３′ （ＩＸ）
５′ＯＨ－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（ｉ７）ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－ＯＨ ３′ （Ｘ）
ここで
（ｉ５）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる配列ｉ５（すなわちインデックス５）から選択され、
および
（ｉ７）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる配列ｉ７（すなわちインデックス７）から選択される；
または
（ｄ）上記に示される式（ＩＸ）および（Ｘ）を有する、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、少なくとも１つのプライマー対。
【0087】
前記キットは、以下のうちの少なくとも１つをさらに含む：
【0088】
（ｅ）前記生物学的試料からのＲＮＡ抽出および単離のための、試薬。これらには、汚染を最小限に抑えながら２００ヌクレオチド未満のＲＮＡを効率的に抽出するための、溶解緩衝液、シリカベースのスピンカラム、および回収チューブを含む。溶解緩衝液の例は、以下の通りである：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）：１０ｍＭ；ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）：０ｍＭ～１ｍＭ；塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）：１０ｍＭ～０．５Ｍ；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）：０．５％；ドデシルコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）：０％～０．５％；プロテイナーゼＫ：０μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌ；ＨＥＰＥＳ：０ｎＭ～１００ｍＭ。
【0089】
（ｆ）ＰＮＫ酵素（３′Ｐ ＲＮＡの５′末端のリン酸化のため、および任意選択でＰＮＫ溶液および緩衝液）。
【0090】
（ｇ）第１のリガーゼ酵素（例えばＲｔｃＢ）（第１のライゲーション反応を行うために必要であり、および任意選択でライゲーション溶液および緩衝液）。
【0091】
（ｈ）第２のリガーゼ酵素（例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼ）（第１のライゲーション生成物の分子内環状化のため、および任意選択でライゲーション溶液および緩衝液）。
【0092】
（ｉ）逆転写酵素（ＲＴ）、および任意選択でヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、溶液、および緩衝液。
【0093】
本キットで使用可能なＲＴ酵素の例は、以下の通りである：
－ モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）（この酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素であり、逆転写の過程中にＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成を触媒する。これは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とリボヌクレアーゼＨ活性の両方を有する）；
－ トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴ）（この酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス由来の、別のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである）；
－ ＨＩＶ－１逆転写酵素（この酵素は、ヒト免疫不全ウイルス１型に由来する）；
－ Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（この酵素は、改変型のＭ－ＭＬＶ ＲＴであり、高温での安定性と活性の向上を示す）；
－ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（この酵素は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって開発された独自の酵素である。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩを含む、いくつかのバリエーションが入手可能である。これらの酵素は、熱安定性の向上、ｃＤＮＡ収量の増加、およびリボヌクレアーゼＨ活性の低減のために、改変されている）；
－ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素（この酵素は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製の逆転写酵素である。これは、高い熱安定性を示し、高温で行われる逆転写反応に適している）。
－ モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）（この酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素であり、逆転写の過程中にＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成を触媒する。これは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とリボヌクレアーゼＨ活性の両方を有する）；
－ トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴ）（この酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス由来の、別のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである）；
－ ＨＩＶ－１逆転写酵素（この酵素は、ヒト免疫不全ウイルス１型に由来する）；
－ Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（この酵素は、改変型のＭ－ＭＬＶ ＲＴであり、高温での安定性と活性の向上を示す）；
－ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（この酵素は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって開発された独自の酵素である。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩを含む、いくつかのバリエーションが入手可能である。これらの酵素は、熱安定性の向上、ｃＤＮＡ収量の増加、およびリボヌクレアーゼＨ活性の低減のために、改変されている）；
－ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素（この酵素は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製の逆転写酵素である。これは、高い熱安定性を示し、高温で行われる逆転写反応に適している）。
【0094】
（ｊ）ＰＣＲマスターミックス：ＰＣＲ増幅に必要な全ての構成要素を含有する、すぐに使用できる混合物。これには、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および反応緩衝液を含む。ＰＣＲマスターミックスはまた、安定剤、増強剤、およびＰＣＲ性能を向上させる他の添加物も含有しうる。
－ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｏＴａｑ ＧｒｅｅｎおよびＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ。通常は、反応セットアップ中は不活性のままであり、最初の変性ステップ中に活性化される、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼである。
－ ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）：４つのヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）全ての混合物であり、各々の濃度は約２００～４００μＭである。
－ 緩衝液：使用される特定のＤＮＡポリメラーゼに最適化された反応緩衝液。典型的には、最適な酵素活性および反応条件を維持するための、塩類および安定剤を含有する。
－ ＭｇＣｌ２：濃度が約１．５～５ｍＭの塩化マグネシウムであり、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の補因子として働く。
－ プライマー：目的のＤＮＡ領域を標的とする、特定のフォワードプライマーおよびリバースプライマー。各プライマーの濃度は変動しうるが、典型的には２００～９００ｎＭの範囲である。
－ 安定剤および増強剤：ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはグリセロールなどの様々な添加物が含まれてもよく、ｑＰＣＲ反応の安定性および性能を向上させる。
－ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｏＴａｑ ＧｒｅｅｎおよびＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ。通常は、反応セットアップ中は不活性のままであり、最初の変性ステップ中に活性化される、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼである。
－ ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）：４つのヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）全ての混合物であり、各々の濃度は約２００～４００μＭである。
－ 緩衝液：使用される特定のＤＮＡポリメラーゼに最適化された反応緩衝液。典型的には、最適な酵素活性および反応条件を維持するための、塩類および安定剤を含有する。
－ ＭｇＣｌ２：濃度が約１．５～５ｍＭの塩化マグネシウムであり、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の補因子として働く。
－ プライマー：目的のＤＮＡ領域を標的とする、特定のフォワードプライマーおよびリバースプライマー。各プライマーの濃度は変動しうるが、典型的には２００～９００ｎＭの範囲である。
－ 安定剤および増強剤：ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはグリセロールなどの様々な添加物が含まれてもよく、ｑＰＣＲ反応の安定性および性能を向上させる。
【0095】
（ｋ）ヌクレアーゼフリー水。これは、ＲＮＡを分解しうる、または反応を妨げうるヌクレアーゼが含まれていない、分子グレードの水である。これは、凍結乾燥成分の再構成、試料の希釈、および対照反応の準備のために、使用される。
【0096】
（ｌ）反応チューブおよびプレート。これらのチューブまたはプレートは、最適な熱伝導性、および使用されているｑＰＣＲ装置との適合性を提供するように、設計される。
【0097】
（ｍ）使用説明書およびプロトコル。ステップごとのプロトコル、反応条件を最適化するためのガイドライン、およびデータ解析のための推奨事項を含む。
【0098】
一実施形態において、本明細書は、対象における疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を、前記対象の生物学的試料中に包含される前記疾患または状態の少なくとも１の分子マーカーを検出することおよび定量することによって行う、インビトロまたはエクスビボ方法に関係し（前記方法の模式図を示す、図１３参照）、ここで前記少なくとも１の分子マーカーは、３′リン酸または２′／３′環状リン酸を含むＲＮＡ断片（３′Ｐ ＲＮＡ）であり、
前記方法は、以下の各ステップを含む：
（ａ′）前記生物学的試料中に包含される前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの５′末端をリン酸化して、少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片を得るステップ（図１３のステップ１）；
（ｂ′）前記少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片の３′末端を、ＲＮＡベースのアダプターの５′末端にライゲートし、少なくとも１の第１のライゲーション生成物を得るステップ（図１３のステップ２）；
ここで前記ＲＮＡベースのアダプターは、式（Ｉａ）を有し：
５′ＯＨ－Ｅ１－Ａｚ－Ｅ２－ＯＨ ３′ （Ｉａ）
ここで
－ Ｅ１は、長さが１５～３０の間である、第１のオリゴリボヌクレオチド配列であり、
－ Ａは、脱塩基部位またはレトロ転写酵素活性の阻止を可能にするスペーサーであり、
－ ｚは、１～５の整数であり、
－ Ｅ２は、長さが１５～３０の間である、第２のオリゴリボヌクレオチド配列である；
（ｃ′）前記少なくとも１の第１のライゲーション生成物を自己ライゲートし、少なくとも１の環状ＲＮＡ分子を形成するステップ（図１３のステップ３）；
（ｄ′）前記少なくとも１の環状ＲＮＡ分子の逆転写を行い、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を含む、少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子を得るステップ（図１３のステップ４）；
ここで前記逆転写は、式（ＩＩａ）を有する逆転写プライマーを使用して行われ：
５′ＯＨ－Ｇ－Ｆ１－ＯＨ ３′ （ＩＩａ）
ここで
－ Ｆ１は、Ｅ１の逆相補デオキシオリゴリボヌクレオチドであり、ここでＦ１のＥ１に対する相補性は、６０％～１００％の間であり、
および
－ Ｇは、長さが１０～３０の間である、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチドである；
（ｅ′）前記少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子の、第１および第２のｑＰＣＲ増幅を並行して行い、第１および第２の増幅生成物を得るステップ（図１３のステップ５）；
ここで：
－ 前記第１のｑＰＣＲ増幅は、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の少なくとも一部にアニーリングする第１のプライマー対を使用して行われ、前記第１のプライマー対は、プライマー対セット１、セット２、およびセット３から選択され、ここで各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記プライマー対セット１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ）および（ＩＶａ）に示される配列を有し、前記プライマー対セット２のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ′）および（ＩＶａ′）に示される配列を有し、および前記プライマー対セット３のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ″）および（ＩＶａ″）に示される配列を有し：
セット１
５′ＯＨ－Ｈ２－Ｎ－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ）
５′ＯＨ－Ｈ１－Ｍ－ＯＨ ３′ （ＩＶａ）
セット２
５′ＯＨ－Ｈ２－Ｎ－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ′）
５′ＯＨ－Ｈ１－ＯＨ ３′ （ＩＶａ′）
セット３
５′ＯＨ－Ｈ２－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ″）
５′ＯＨ－Ｈ１－Ｍ－ＯＨ ３′ （ＩＶａ″）
ここで、
◆ Ｈ１は、Ｅ１にアニーリングする第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＨ１のＥ１に対する相補性は、３０％～１００％の間であり、
および
◆ Ｍは、長さが６～３０の間であり、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の３′末端の少なくとも６ヌクレオチドにアニーリングする、第３のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、
◆ Ｈ２は、Ｅ２にアニーリングする第４のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＨ２のＥ２に対する相補性は、３０％～１００％の間であり、
および
◆ Ｎは、長さが６～３０の間であり、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の５′末端の少なくとも６ヌクレオチドにアニーリングする、第５のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり；
－ 前記第２のｑＰＣＲ増幅は、前記ＲＮＡベースのアダプター配列にアニーリングする第２のプライマー対を使用して行われ、前記第２のプライマー対は、それぞれ式（Ｖａ）および（ＶＩａ）を有する、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含み：
５′ＯＨ－Ｈ２－ＯＨ ３′ （Ｖａ）
５′ＯＨ－Ｉ１－ＯＨ ３′ （ＶＩａ）
ここで、
◆ Ｈ２は、上記に示された意味を有し、
および
◆ Ｉ１は、Ｇにアニーリングする第６のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＩ１のＧに対する相補性は、６０％～１００％の間である；
および
（ｆ′）ステップ（ａ′）から（ｅ′）を、少なくとも１の対照試料に対して繰り返すステップ；
ここで前記対照試料は、健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、生物学的試料である；
（ｇ′）前記生物学的試料および前記対照試料のいずれかについて、前記第１および第２の増幅生成物において、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの、および前記ＲＮＡベースのアダプターの、Ｃｔ値を決定するステップ；
（ｈ′）ステップ（ｇ′）において決定された前記Ｃｔ値の３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化を、以下の等式に従って計算するステップ：
ここで
－ Ｃｔ（Ａ）３′Ｐは、前記生物学的試料で決定された前記３′Ｐ ＲＮＡの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）３′Ｐは、前記対照試料で決定された前記３′Ｐ ＲＮＡの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ａ）ａｄｐは、前記生物学的試料で決定された前記ＲＮＡベースのアダプターの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）ａｄｐは、前記対照試料で決定された前記ＲＮＡベースのアダプターの前記Ｃｔ値であり；
ここで３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化値≧２または≦０．５は、前記疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を示す。
前記方法は、以下の各ステップを含む：
（ａ′）前記生物学的試料中に包含される前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの５′末端をリン酸化して、少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片を得るステップ（図１３のステップ１）；
（ｂ′）前記少なくとも１のリン酸化ＲＮＡ断片の３′末端を、ＲＮＡベースのアダプターの５′末端にライゲートし、少なくとも１の第１のライゲーション生成物を得るステップ（図１３のステップ２）；
ここで前記ＲＮＡベースのアダプターは、式（Ｉａ）を有し：
５′ＯＨ－Ｅ１－Ａｚ－Ｅ２－ＯＨ ３′ （Ｉａ）
ここで
－ Ｅ１は、長さが１５～３０の間である、第１のオリゴリボヌクレオチド配列であり、
－ Ａは、脱塩基部位またはレトロ転写酵素活性の阻止を可能にするスペーサーであり、
－ ｚは、１～５の整数であり、
－ Ｅ２は、長さが１５～３０の間である、第２のオリゴリボヌクレオチド配列である；
（ｃ′）前記少なくとも１の第１のライゲーション生成物を自己ライゲートし、少なくとも１の環状ＲＮＡ分子を形成するステップ（図１３のステップ３）；
（ｄ′）前記少なくとも１の環状ＲＮＡ分子の逆転写を行い、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を含む、少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子を得るステップ（図１３のステップ４）；
ここで前記逆転写は、式（ＩＩａ）を有する逆転写プライマーを使用して行われ：
５′ＯＨ－Ｇ－Ｆ１－ＯＨ ３′ （ＩＩａ）
ここで
－ Ｆ１は、Ｅ１の逆相補デオキシオリゴリボヌクレオチドであり、ここでＦ１のＥ１に対する相補性は、６０％～１００％の間であり、
および
－ Ｇは、長さが１０～３０の間である、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチドである；
（ｅ′）前記少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子の、第１および第２のｑＰＣＲ増幅を並行して行い、第１および第２の増幅生成物を得るステップ（図１３のステップ５）；
ここで：
－ 前記第１のｑＰＣＲ増幅は、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の少なくとも一部にアニーリングする第１のプライマー対を使用して行われ、前記第１のプライマー対は、プライマー対セット１、セット２、およびセット３から選択され、ここで各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、前記プライマー対セット１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ）および（ＩＶａ）に示される配列を有し、前記プライマー対セット２のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ′）および（ＩＶａ′）に示される配列を有し、および前記プライマー対セット３のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ式（ＩＩＩａ″）および（ＩＶａ″）に示される配列を有し：
セット１
５′ＯＨ－Ｈ２－Ｎ－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ）
５′ＯＨ－Ｈ１－Ｍ－ＯＨ ３′ （ＩＶａ）
セット２
５′ＯＨ－Ｈ２－Ｎ－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ′）
５′ＯＨ－Ｈ１－ＯＨ ３′ （ＩＶａ′）
セット３
５′ＯＨ－Ｈ２－ＯＨ ３′ （ＩＩＩａ″）
５′ＯＨ－Ｈ１－Ｍ－ＯＨ ３′ （ＩＶａ″）
ここで、
◆ Ｈ１は、Ｅ１にアニーリングする第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＨ１のＥ１に対する相補性は、３０％～１００％の間であり、
および
◆ Ｍは、長さが６～３０の間であり、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の３′末端の少なくとも６ヌクレオチドにアニーリングする、第３のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、
◆ Ｈ２は、Ｅ２にアニーリングする第４のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＨ２のＥ２に対する相補性は、３０％～１００％の間であり、
および
◆ Ｎは、長さが６～３０の間であり、前記３′Ｐ ＲＮＡ配列の５′末端の少なくとも６ヌクレオチドにアニーリングする、第５のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり；
－ 前記第２のｑＰＣＲ増幅は、前記ＲＮＡベースのアダプター配列にアニーリングする第２のプライマー対を使用して行われ、前記第２のプライマー対は、それぞれ式（Ｖａ）および（ＶＩａ）を有する、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーを含み：
５′ＯＨ－Ｈ２－ＯＨ ３′ （Ｖａ）
５′ＯＨ－Ｉ１－ＯＨ ３′ （ＶＩａ）
ここで、
◆ Ｈ２は、上記に示された意味を有し、
および
◆ Ｉ１は、Ｇにアニーリングする第６のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、ここでＩ１のＧに対する相補性は、６０％～１００％の間である；
および
（ｆ′）ステップ（ａ′）から（ｅ′）を、少なくとも１の対照試料に対して繰り返すステップ；
ここで前記対照試料は、健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、生物学的試料である；
（ｇ′）前記生物学的試料および前記対照試料のいずれかについて、前記第１および第２の増幅生成物において、前記少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの、および前記ＲＮＡベースのアダプターの、Ｃｔ値を決定するステップ；
（ｈ′）ステップ（ｇ′）において決定された前記Ｃｔ値の３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化を、以下の等式に従って計算するステップ：
－ Ｃｔ（Ａ）３′Ｐは、前記生物学的試料で決定された前記３′Ｐ ＲＮＡの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）３′Ｐは、前記対照試料で決定された前記３′Ｐ ＲＮＡの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ａ）ａｄｐは、前記生物学的試料で決定された前記ＲＮＡベースのアダプターの前記Ｃｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）ａｄｐは、前記対照試料で決定された前記ＲＮＡベースのアダプターの前記Ｃｔ値であり；
ここで３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化値≧２または≦０．５は、前記疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を示す。
【0099】
一実施形態において、前記方法は、ステップ（ｈ′）において、前記３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化の３′Ｐ－ｑＰＣＲ ｐ値を計算するステップをさらに含み、ここで３′Ｐ－ｑＰＣＲ ｐ値＜０．５は、前記疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価を示す。
【0100】
一実施形態において、式（Ｉａ）のＲＮＡベースのアダプターは、長さが５０～１００ヌクレオチドの間である。
【0101】
一実施形態において、式（Ｉａ）のＲＮＡベースのアダプターに包含されるスペーサーＡは、１，２′－ジデオキシリボース修飾（ｄＳｐａｃｅｒ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）部位、またはビオチン化遮断スペーサーから選択される。
【0102】
一実施形態において、式（ＩＩａ）の逆転写プライマーは、長さが１０～１００ヌクレオチドの間である。
【0103】
一実施形態において、２つのｑＰＣＲ増幅に使用されるプライマー（第１および第２のプライマー対の両方）は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：
－ それらは、１～２０の修飾ヌクレオチドを包含する；好ましくは、修飾は、ホスホロチオエート修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）、２′－Ｏ－メチル修飾、５－メチルシトシン修飾、マイナーグルーブバインダー、スペーサー分子、ＰＮＡのうちの１つを包含する。これらの修飾は、プライマー特異性、安定性、および融解温度を含むプライマー性能を最適化するために、単独でまたは組み合わせて使用されうる。
－ それらは、長さが１５～２５ヌクレオチドの間である；
－ それらは、最小自由エネルギーが－３～－１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌの間である；
－ それらは、強いまたは中程度の二次構造を包含せず、および／またはダイマーを形成しない；
－ それらは、融解温度が５７～７０℃の間である；
－ それらは、前記対のフォワードプライマーとリバースプライマーとの間の融解温度差が３℃以下である。
－ それらは、１～２０の修飾ヌクレオチドを包含する；好ましくは、修飾は、ホスホロチオエート修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）、２′－Ｏ－メチル修飾、５－メチルシトシン修飾、マイナーグルーブバインダー、スペーサー分子、ＰＮＡのうちの１つを包含する。これらの修飾は、プライマー特異性、安定性、および融解温度を含むプライマー性能を最適化するために、単独でまたは組み合わせて使用されうる。
－ それらは、長さが１５～２５ヌクレオチドの間である；
－ それらは、最小自由エネルギーが－３～－１５０ｋｃａｌ／ｍｏｌの間である；
－ それらは、強いまたは中程度の二次構造を包含せず、および／またはダイマーを形成しない；
－ それらは、融解温度が５７～７０℃の間である；
－ それらは、前記対のフォワードプライマーとリバースプライマーとの間の融解温度差が３℃以下である。
【0104】
一実施形態において、第１のｑＰＣＲ増幅において使用される、第１のプライマー対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、それぞれ３′末端および５′末端で、３′Ｐ ＲＮＡの少なくとも６、好ましくは１０ヌクレオチドにアニーリングする。
【0105】
一実施形態において、リン酸化ステップ（ａ′）は、Ｔ４ ＰＮＫ ３′ｍｉｎｕｓ、Ｔ４ ＰＮＫ、および組換え型のＴ４ ＰＮＫ（例えば、Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ（商標））から選択される、リン酸化酵素を使用して、行われる。
【0106】
一実施形態において、ライゲーションステップ（ｂ′）は、ＲｔｃＢ、アーキアーゼ、シロイヌナズナｔＲＮＡリガーゼ、および真核生物ｔＲＮＡリガーゼから選択される、第１のリガーゼ酵素を使用して、行われる。
【0107】
一実施形態において、自己ライゲーションステップ（ｃ′）は、Ｔ４ Ｒｎｌ１、Ｔ４ Ｒｎｌ２、Ｔ４ Ｒｎｌ２ｔｒ、Ｔ４ Ｒｎｌ２ Ｋ２２７Ｑ、Ｍｔｈ Ｒｎｌ、および分子内ライゲーションを触媒するＡＴＰ非依存性リガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｌｉｇａｓｅ（商標）、ＣｉｒｃＬｌｉｇａｓｅＩＩ（商標））から選択される、第２のリガーゼ酵素を使用して、行われる。
【0108】
一実施形態において、逆転写ステップ（ｄ′）は、改変Ｍ ＭＬＶ－ＲＴ酵素（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）およびＡＭＶ－ＲＴ酵素（トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｏｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｖｉｒｕｓ）逆転写酵素）から選択される、好ましくはＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｍｉｎｕｓ（商標）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｉ－ＩＩ－ＩＩＩ－ＩＶ、Ｓｕｎｓｃｒｉｐｔ（商標）から選択される、逆転写酵素（ＲＴ）を使用して、行われる。
【0109】
一実施形態において、ｑＰＣＲ増幅ステップ（ｅ′）は、改変Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素から選択される、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用して行われ、これらは好ましくは、反応セットアップ中は不活性のままであり、最初の変性ステップ中に活性化される。
【0110】
３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイにおいて使用可能なＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素の例は、以下の通りである：Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｏＴａｑ ＧｒｅｅｎおよびＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ。
【0111】
一実施形態において、疾患は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）または皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）である。
【0112】
一実施形態において、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の少なくとも１つの分子マーカーは、配列番号１～８３に示される配列を有する３′Ｐ ＲＮＡから選択される。
【0113】
一実施形態において、皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）の少なくとも１つの分子マーカーは、配列番号８４～１７２に示される配列を有する３′Ｐ ＲＮＡから選択される。
【0114】
一実施形態において、本明細書は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）および皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価のためのキットに関係する。
【0115】
一実施形態において、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価のためのキットであって、以下を含む：
（ａ′）配列番号１８５に示される配列を有する、ＲＮＡベースのアダプター；
（ｂ′）配列番号１８６に示される配列を有する、逆転写プライマー；
（ｃ′）第１のｑＰＣＲ増幅を行うための７つの第１のプライマー対であって、７つのプライマー対の第１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、以下の配列対に示される配列を有する：配列番号１８７および１８８、配列番号１８７および１８９、配列番号１９０および１９１、配列番号１９２および１９３、および配列番号１９８および１９９、配列番号２００および２０１、配列番号２０２および２０３；
（ｄ′）第２のｑＰＣＲ増幅を行うための第２のプライマー対であって、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、それぞれ配列番号２０４および２０５に示される配列を有する。
（ａ′）配列番号１８５に示される配列を有する、ＲＮＡベースのアダプター；
（ｂ′）配列番号１８６に示される配列を有する、逆転写プライマー；
（ｃ′）第１のｑＰＣＲ増幅を行うための７つの第１のプライマー対であって、７つのプライマー対の第１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、以下の配列対に示される配列を有する：配列番号１８７および１８８、配列番号１８７および１８９、配列番号１９０および１９１、配列番号１９２および１９３、および配列番号１９８および１９９、配列番号２００および２０１、配列番号２０２および２０３；
（ｄ′）第２のｑＰＣＲ増幅を行うための第２のプライマー対であって、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、それぞれ配列番号２０４および２０５に示される配列を有する。
【0116】
一実施形態において、皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）の診断、予後、治療モニタリング、または結果予測評価のためのキットであって、以下を含む：
（ａ′）配列番号１８５に示される配列を有する、ＲＮＡベースのアダプター、
（ｂ′）配列番号１８６に示される配列を有する、逆転写プライマー、
（ｃ′）第１のｑＰＣＲ増幅を行うための２つの第１のプライマー対であって、２つのプライマー対の第１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ以下の配列対に示される配列を有する：配列番号１９４および１９５、配列番号１９６および１９７、
（ｄ′）第２のｑＰＣＲ増幅を行うための第２のプライマー対であって、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、それぞれ配列番号２０４および２０５に示される配列を有する。
（ａ′）配列番号１８５に示される配列を有する、ＲＮＡベースのアダプター、
（ｂ′）配列番号１８６に示される配列を有する、逆転写プライマー、
（ｃ′）第１のｑＰＣＲ増幅を行うための２つの第１のプライマー対であって、２つのプライマー対の第１のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ以下の配列対に示される配列を有する：配列番号１９４および１９５、配列番号１９６および１９７、
（ｄ′）第２のｑＰＣＲ増幅を行うための第２のプライマー対であって、第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマーは、それぞれ配列番号２０４および２０５に示される配列を有する。
【0117】
一実施形態において、前記キットは、以下のうちの少なくとも１つをさらに含む：
【0118】
（ｅ′）前記生物学的試料からのＲＮＡ抽出および単離のための、試薬。これらには、汚染を最小限に抑えながら２００ヌクレオチド未満のＲＮＡを効率的に抽出するための、溶解緩衝液、シリカベースのスピンカラム、および回収チューブを含む。溶解緩衝液の例は、以下の通りである：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）：１０ｍＭ；ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）：０ｍＭ～１ｍＭ；塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）：１０ｍＭ～０．５Ｍ；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）：０．５％；ドデシルコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）：０％～０．５％；プロテイナーゼＫ：０μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌ；ＨＥＰＥＳ：０ｎＭ～１００ｍＭ。
【0119】
（ｆ′）ＰＮＫ酵素（３′Ｐ ＲＮＡの５′末端のリン酸化のため）、および任意選択でＰＮＫ溶液および緩衝液。
【0120】
（ｇ′）第１のリガーゼ酵素（例えばＲｔｃＢ）（第１のライゲーション反応を行うために必要）、および任意選択でライゲーション溶液および緩衝液。
【0121】
（ｈ′）第２のリガーゼ酵素（例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼ）（第１のライゲーション生成物の分子内環状化のため）、および任意選択でライゲーション溶液および緩衝液。
【0122】
（ｉ′）逆転写酵素（ＲＴ）、および任意選択でヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、溶液、および緩衝液。
【0123】
本キットで使用可能なＲＴ酵素の例は、以下の通りである：
－ モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）（この酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素であり、逆転写の過程中にＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成を触媒する。これは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とリボヌクレアーゼＨ活性の両方を有する）；
－ トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴ）（この酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス由来の、別のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである）；
－ ＨＩＶ－１逆転写酵素（この酵素は、ヒト免疫不全ウイルス１型に由来する）；
－ Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（この酵素は、改変型のＭ－ＭＬＶ ＲＴであり、高温での安定性と活性の向上を示す）；
－ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（この酵素は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって開発された独自の酵素である。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩを含む、いくつかのバリエーションが入手可能である。これらの酵素は、熱安定性の向上、ｃＤＮＡ収量の増加、およびリボヌクレアーゼＨ活性の低減のために、改変されている）；
－ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素（この酵素は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製の逆転写酵素である。これは、高い熱安定性を示し、高温で行われる逆転写反応に適している）。
－ モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ ＲＴ）（この酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素であり、逆転写の過程中にＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成を触媒する。これは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とリボヌクレアーゼＨ活性の両方を有する）；
－ トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴ）（この酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス由来の、別のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである）；
－ ＨＩＶ－１逆転写酵素（この酵素は、ヒト免疫不全ウイルス１型に由来する）；
－ Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（この酵素は、改変型のＭ－ＭＬＶ ＲＴであり、高温での安定性と活性の向上を示す）；
－ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（この酵素は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって開発された独自の酵素である。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩを含む、いくつかのバリエーションが入手可能である。これらの酵素は、熱安定性の向上、ｃＤＮＡ収量の増加、およびリボヌクレアーゼＨ活性の低減のために、改変されている）；
－ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素（この酵素は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製の逆転写酵素である。これは、高い熱安定性を示し、高温で行われる逆転写反応に適している）。
【0124】
（ｊ′）ｑＰＣＲマスターミックス：ＰＣＲ増幅に必要な全ての構成要素を含有する、すぐに使用できる混合物。これには、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、反応緩衝液、および増幅をリアルタイムで検出するための蛍光色素またはプローブを含む。ｑＰＣＲマスターミックスはまた、安定剤、増強剤、およびＰＣＲ性能を向上させる他の添加物も含有しうる。
ｑＰＣＲマスターミックスには従って、以下のものを含みうる：
－ 以下から選択される、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｏＴａｑ ＧｒｅｅｎおよびＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ。通常は、反応セットアップ中は不活性のままであり、最初の変性ステップ中に活性化される、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼである。
－ ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）：４つのヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）全ての混合物であり、各々の濃度は約２００～４００μＭである。
－ 緩衝液：使用される特定のＤＮＡポリメラーゼに最適化された反応緩衝液。典型的には、最適な酵素活性および反応条件を維持するための、塩類および安定剤を含有する。
－ ＭｇＣｌ２：濃度が約１．５～５ｍＭの塩化マグネシウムであり、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の補因子として働く。
－ プライマー：目的のＤＮＡ領域を標的とする、特定のフォワードプライマーおよびリバースプライマー。各プライマーの濃度は変動しうるが、典型的には２００～９００ｎＭの範囲である。
－ 安定剤および増強剤：ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはグリセロールなどの様々な添加物が含まれてもよく、ｑＰＣＲ反応の安定性および性能を向上させる。
ｑＰＣＲマスターミックスには従って、以下のものを含みうる：
－ 以下から選択される、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｏＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｏＴａｑ ＧｒｅｅｎおよびＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ。通常は、反応セットアップ中は不活性のままであり、最初の変性ステップ中に活性化される、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼである。
－ ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）：４つのヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）全ての混合物であり、各々の濃度は約２００～４００μＭである。
－ 緩衝液：使用される特定のＤＮＡポリメラーゼに最適化された反応緩衝液。典型的には、最適な酵素活性および反応条件を維持するための、塩類および安定剤を含有する。
－ ＭｇＣｌ２：濃度が約１．５～５ｍＭの塩化マグネシウムであり、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の補因子として働く。
－ プライマー：目的のＤＮＡ領域を標的とする、特定のフォワードプライマーおよびリバースプライマー。各プライマーの濃度は変動しうるが、典型的には２００～９００ｎＭの範囲である。
－ 安定剤および増強剤：ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはグリセロールなどの様々な添加物が含まれてもよく、ｑＰＣＲ反応の安定性および性能を向上させる。
【0125】
（ｋ′）ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを検証するための、陽性および陰性対照。陽性対照は、既知の量の標的３′Ｐ ＲＮＡを包含して、アッセイ感度を決定し、標準曲線を確立することを可能にする。陰性対照は、汚染または非特異的増幅がないことを確認する。
【0126】
（ｌ′）ヌクレアーゼフリー水。これは、ＲＮＡを分解しうる、または反応を妨げうるヌクレアーゼが含まれていない、分子グレードの水である。これは、凍結乾燥成分の再構成、試料の希釈、および対照反応の準備のために、使用される。
【0127】
（ｍ′）反応チューブおよびプレート。これらのチューブまたはプレートは、最適な熱伝導性、および使用されているｑＰＣＲ装置との適合性を提供するように、設計される。
【0128】
（ｎ′）使用説明書およびプロトコル。ステップごとのプロトコル、反応条件を最適化するためのガイドライン、およびデータ解析のための推奨事項を含む。
【0129】
以下に、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームに適用されるＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析法および３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイを行うための、プロトコルの説明が提供される。
【0130】
［Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析の概略説明］
［スモールＲＮＡの濃縮］
Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析を開始する前に、カラムベースまたはビーズベースの手法を使用して、スモールＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）の濃縮が行われる。Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析のための供給源として、細胞株、急速凍結組織、および全血が使用されうる。
［スモールＲＮＡの濃縮］
Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析を開始する前に、カラムベースまたはビーズベースの手法を使用して、スモールＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）の濃縮が行われる。Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析のための供給源として、細胞株、急速凍結組織、および全血が使用されうる。
【0131】
ｓｍＲＮＡの濃縮のために、ｍｉｒＶａｎａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ｍｉＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ）、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ）などの、いくつかの市販キットが使用されうる。
【0132】
［ステップ（ａ）．リン酸化］
スモールＲＮＡの濃縮（＜２００ヌクレオチド）後すぐに、３′Ｐ ＲＮＡは、表１に示されるプロトコルに従って、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ ３′Ｍｉｎｕｓ）による５′リン酸化を受ける。
スモールＲＮＡの濃縮（＜２００ヌクレオチド）後すぐに、３′Ｐ ＲＮＡは、表１に示されるプロトコルに従って、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ ３′Ｍｉｎｕｓ）による５′リン酸化を受ける。
【0133】
【0134】
３７℃で１時間、サーマルサイクラーで反応をインキュベートする。
【0135】
ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５キットを通じて、スモールＲＮＡ用のプロトコルに従って反応を精製し、６μＬのヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）中で最終溶出を行う。
【0136】
［ステップ（ｂ）．ライゲーション］
両末端でリン酸化された３′Ｐ ＲＮＡは、２～３つの脱塩基部位、８つの縮退ヌクレオチド、３′末端にフルオロウリジン、および部分的なＳＰ１配列を包含するＲＮＡベースのアダプター（配列番号１７３～１７７から選択される配列を有する）に、ＲｔｃＢリガーゼを介してライゲートされる。
両末端でリン酸化された３′Ｐ ＲＮＡは、２～３つの脱塩基部位、８つの縮退ヌクレオチド、３′末端にフルオロウリジン、および部分的なＳＰ１配列を包含するＲＮＡベースのアダプター（配列番号１７３～１７７から選択される配列を有する）に、ＲｔｃＢリガーゼを介してライゲートされる。
【0137】
ＲＮＡベースのアダプターは、上記に開示された式（Ｉ）を有する。式（Ｉ）を構成する要素は、以下のように対応する：
－ 配列番号１７３は、以下の通りである：Ｎｘ：１～４ヌクレオチド；Ｌ１：５～２８ヌクレオチド；Ａｚ：２９～３１；ＰＲ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメイン）：３２～５１ヌクレオチド；Ｎｙ：５２～５５ヌクレオチド；Ｂ：５６ヌクレオチド；
－ 配列番号１７４は、以下の通りである：Ｎｘ：１～４ヌクレオチド；Ｌ１：５～２８ヌクレオチド；Ａｚ：２９～３１；ＰＲ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメインの第１の部分）：３２～５１ヌクレオチド；Ｎｙ：５２～５５ヌクレオチド；Ｃ２：５６～６３；Ｂ：６４ヌクレオチド；
－ 配列番号１７５は、以下の通りである：Ｎｘ：１～４ヌクレオチド；Ｌ１：５～２８ヌクレオチド；Ａｚ：２９～３１；ＰＲ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメインの第１の部分）：３２～５１ヌクレオチド；Ｎｙ：５２～５５ヌクレオチド；Ｃ２：５６～６３；Ｂ：６４ヌクレオチド；
－ 配列番号１７６は、以下の通りである：Ｎｘ：１～４ヌクレオチド；Ｃ１：５～１２ヌクレオチド；Ｌ１：１３～３６ヌクレオチド；Ａｚ：３７～３９；ＰＲ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメインの第１の部分）：４０～５９ヌクレオチド；Ｎｙ：６０～６３ヌクレオチド；Ｂ：６４ヌクレオチド；
－ 配列番号１７７は、以下の通りである：Ｎｘ：１～４ヌクレオチド；Ｃ１：５～１２ヌクレオチド；Ｌ１：１３～３６ヌクレオチド；Ａｚ：３７～３９；ＰＲ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメインの第１の部分）：４０～５９ヌクレオチド；Ｎｙ：６０～６３ヌクレオチド；Ｂ：６４ヌクレオチド。
－ 配列番号１７３は、以下の通りである：Ｎｘ：１～４ヌクレオチド；Ｌ１：５～２８ヌクレオチド；Ａｚ：２９～３１；ＰＲ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメイン）：３２～５１ヌクレオチド；Ｎｙ：５２～５５ヌクレオチド；Ｂ：５６ヌクレオチド；
－ 配列番号１７４は、以下の通りである：Ｎｘ：１～４ヌクレオチド；Ｌ１：５～２８ヌクレオチド；Ａｚ：２９～３１；ＰＲ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメインの第１の部分）：３２～５１ヌクレオチド；Ｎｙ：５２～５５ヌクレオチド；Ｃ２：５６～６３；Ｂ：６４ヌクレオチド；
－ 配列番号１７５は、以下の通りである：Ｎｘ：１～４ヌクレオチド；Ｌ１：５～２８ヌクレオチド；Ａｚ：２９～３１；ＰＲ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメインの第１の部分）：３２～５１ヌクレオチド；Ｎｙ：５２～５５ヌクレオチド；Ｃ２：５６～６３；Ｂ：６４ヌクレオチド；
－ 配列番号１７６は、以下の通りである：Ｎｘ：１～４ヌクレオチド；Ｃ１：５～１２ヌクレオチド；Ｌ１：１３～３６ヌクレオチド；Ａｚ：３７～３９；ＰＲ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメインの第１の部分）：４０～５９ヌクレオチド；Ｎｙ：６０～６３ヌクレオチド；Ｂ：６４ヌクレオチド；
－ 配列番号１７７は、以下の通りである：Ｎｘ：１～４ヌクレオチド；Ｃ１：５～１２ヌクレオチド；Ｌ１：１３～３６ヌクレオチド；Ａｚ：３７～３９；ＰＲ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメインの第１の部分）：４０～５９ヌクレオチド；Ｎｙ：６０～６３ヌクレオチド；Ｂ：６４ヌクレオチド。
【0138】
ＲｔｃＢリガーゼは、ＲＮＡベースのアダプターの５′ＯＨ末端を、存在する場合スモールＲＮＡの３′Ｐ／３′ｃＰ末端へ、表２に示されるプロトコルに従って結合させる。
【0139】
【0140】
ＲＮＡベースのアダプターの量は、開始材料のｓｍＲＮＡの量に依存し、以下の表３に示される通りである。
【0141】
【0142】
３７℃で１時間、サーマルサイクラーでインキュベートする。
【0143】
ヌクレアーゼフリー水を加えて最終体積を５０μＬにし、その後ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５キットを通じて、スモールＲＮＡ用のプロトコルに従って反応を精製し、８μＬのヌクレアーゼフリー水中で最終溶出を行う。
【0144】
［ステップ（ｃ）．環状化］
ＲｔｃＢライゲーション生成物は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１による５′Ｐ末端と３′ＯＨ末端のライゲーションを通じて、環状化を受ける。反応条件は、表４に示される。
ＲｔｃＢライゲーション生成物は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１による５′Ｐ末端と３′ＯＨ末端のライゲーションを通じて、環状化を受ける。反応条件は、表４に示される。
【0145】
【0146】
２５℃で２時間インキュベートする。
【0147】
ヌクレアーゼフリー水を加えて最終体積を５０μＬにし、その後ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５キットを通じて、スモールＲＮＡ用のプロトコルに従って反応を精製し、１０μＬのヌクレアーゼフリー水中で最終溶出を行う。任意停止点（－８０℃で保存）。
【0148】
［ステップ（ｄ）．逆転写（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）］
一本鎖ｃＤＮＡの生成のために、逆転写反応は、上記に開示された式（ＩＩ）を有する逆転写プライマー（配列番号１７８）を使用して行われる。式（ＩＩ）を構成する要素は、以下のように配列番号１７８に対応する：Ｒ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第２の核酸ドメイン）：１～３４ヌクレオチド；Ｎｚ：３５～３８；Ｄ１：３９～５９ヌクレオチド。
一本鎖ｃＤＮＡの生成のために、逆転写反応は、上記に開示された式（ＩＩ）を有する逆転写プライマー（配列番号１７８）を使用して行われる。式（ＩＩ）を構成する要素は、以下のように配列番号１７８に対応する：Ｒ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第２の核酸ドメイン）：１～３４ヌクレオチド；Ｎｚ：３５～３８；Ｄ１：３９～５９ヌクレオチド。
【0149】
試薬は、以下の表５に示される量で混合される。
【0150】
【0151】
環状ＲＮＡプライマー混合物を７０℃で５分間加熱し、その後氷上で少なくとも１分間インキュベートする。アニーリングされたＲＮＡに、表６に示される量の試薬を加える。
【0152】
【0153】
５０℃で４０分間インキュベートし、その後混合物を８０℃で５分間加熱する。
【0154】
［ステップ（ｅ）．ＰＣＲ増幅］
［第１のＰＣＲ］
ＫＡＰＡマスターミックスまたはＰｈｕｓｉｏｎマスターミックスが、使用されうる。第１のＰＣＲ増幅は、上記に開示された式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を有する第１のプライマー対（配列番号１７９および１８０）を使用して、行われる。式（ＩＩＩ）を構成する要素は、以下のように配列番号１７９に対応する：Ｔ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメインの第２の部分）：１～１３ヌクレオチド；Ｔ２：１４～３３ヌクレオチド。式（ＩＶ）の要素Ｔ３は、配列番号１８０の配列全体に対応する。
［第１のＰＣＲ］
ＫＡＰＡマスターミックスまたはＰｈｕｓｉｏｎマスターミックスが、使用されうる。第１のＰＣＲ増幅は、上記に開示された式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を有する第１のプライマー対（配列番号１７９および１８０）を使用して、行われる。式（ＩＩＩ）を構成する要素は、以下のように配列番号１７９に対応する：Ｔ１（Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第１の核酸ドメインの第２の部分）：１～１３ヌクレオチド；Ｔ２：１４～３３ヌクレオチド。式（ＩＶ）の要素Ｔ３は、配列番号１８０の配列全体に対応する。
【0155】
試薬は、表７に示される量で混合され、表８に示される反応条件を適用する。
【0156】
【0157】
【0158】
Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズを１．６倍の比率で使用して、反応を精製する。最終生成物は、総体積４０μＬのヌクレアーゼフリー水中に溶出される。
【0159】
［第２のＰＣＲ］
ＫＡＰＡマスターミックスまたはＰｈｕｓｉｏｎマスターミックスが、使用されうる。第２のＰＣＲ増幅は、それぞれ上述した式（ＩＸ）および式（Ｘ）を有する第２のプライマー対を使用して、行われる。式（ＩＸ）を構成する要素は、好ましくは以下のものである：Ｑ１は、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第３の核酸ドメインであり、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列を有する；Ｑ２は、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第４の核酸ドメインであり、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる配列ｉ５（１０ヌクレオチド）から選択される配列を有する；Ｑ３は、配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列を有する。式（Ｘ）を構成する要素は、好ましくは以下のものである：Ｑ４は、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第５の核酸ドメインであり、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列を有する；Ｑ５は、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第６の核酸ドメインであり、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる配列ｉ７（１０ヌクレオチド）から選択される配列を有する；Ｑ６は、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列を有する。
ＫＡＰＡマスターミックスまたはＰｈｕｓｉｏｎマスターミックスが、使用されうる。第２のＰＣＲ増幅は、それぞれ上述した式（ＩＸ）および式（Ｘ）を有する第２のプライマー対を使用して、行われる。式（ＩＸ）を構成する要素は、好ましくは以下のものである：Ｑ１は、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第３の核酸ドメインであり、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列を有する；Ｑ２は、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第４の核酸ドメインであり、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる配列ｉ５（１０ヌクレオチド）から選択される配列を有する；Ｑ３は、配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列を有する。式（Ｘ）を構成する要素は、好ましくは以下のものである：Ｑ４は、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第５の核酸ドメインであり、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列を有する；Ｑ５は、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター構造の第６の核酸ドメインであり、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる配列ｉ７（１０ヌクレオチド）から選択される配列を有する；Ｑ６は、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列を有する。
【0160】
試薬は、表９に示される量で混合され、表１０に示される反応条件を適用する。
【0161】
【0162】
【0163】
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＸＰビーズ（１．６倍の比率）またはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ ＣｌｅａｎＵｐキットを使用して、１００μｌのＰＣＲ反応全体を精製する。
【0164】
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＸＰビーズ：製造者の指示に従い、試料を４０μｌのヌクレアーゼフリー水中に溶出する。
【0165】
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌカラム：製造マニュアルの第５．１節の標準プロトコルに従う。各試料を２０μｌのＮＦＷ中に溶出する。最終ＰＣＲをネイティブ１０％アクリルアミドゲル上で泳動し、約２００ヌクレオチドでのバンドを切り取る（図８）。
【0166】
最終ライブラリの質は、バイオアナライザーまたは同様のもの（例えば、ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ、ＱＩＡｘｃｅｌ）でチェックされ、ＰＣＲ生成物の長さ分布をテストし、およびライブラリの平均長さを定義し、それは１９０ヌクレオチド～３００ヌクレオチドの間でなければならない。
【0167】
ライブラリの最終濃度は、Ｐ５（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ － 配列番号２０６）およびＰ７プライマー（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ － 配列番号２０７）を用いたｑＰＣＲによって、テストされる。濃度は、０．５ｎＭよりも高くなければならない。
【0168】
ライブラリの品質チェックは、以下のように行われる：
【0169】
１．１ Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｋｉｔを使用して、サイズ選別された各ライブラリを評価する。
【0170】
１．２ ライブラリプロファイルの結果を使用して、各試料がシーケンシングに適するかを決定する。成功したライブラリ生成は、～２００ｂｐに主要ピークを生じるはずである。
【0171】
１．３ 各最終Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑライブラリに対してＰ５およびＰ７プライマーを使用して、ｑＰＣＲ解析を行う。成功したライブラリ生成は、少なくとも０．１ｎＭの最終濃度を生じるはずである。
【0172】
［ステップ（ｆ）．増幅生成物のシーケンシング］
増幅された生成物のシーケンシングは、以下の各ステップによって説明されるが、これに限定されない：
増幅された生成物のシーケンシングは、以下の各ステップによって説明されるが、これに限定されない：
【0173】
１． ライブラリ変性およびクラスター生成：このステップにおいて、ライブラリは、２本のＤＮＡ鎖を分離するように変性されて、その後フローセルまたはシーケンシングチップ上にロードされる。ライブラリ分子は固定され、ブリッジ増幅または他のクラスター生成方法を通じて、クラスターに増幅される。各クラスターは、同一のＤＮＡ断片のクラスターを表す。
【0174】
２． 実際のシーケンシング：クラスターが形成されると、シーケンシングが行われる。具体的なシーケンシング方法は、使用されるプラットフォームに依存しうる（本件ではＩｌｌｕｍｉｎａ）。蛍光標識されたヌクレオチドが順次追加され、その取り込みが検出される、シーケンシング・バイ・シンセシス法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ）が、一般的に使用される。
【0175】
３． ベースコーリングおよび画像解析：シーケンシング中に、蛍光信号または他の検出信号が捕捉され、ベースコールに変換される。ベースコールは、ＤＮＡテンプレートのヌクレオチド配列を表す。画像解析ソフトウェアが生データを処理して、各クラスターのベースコールを生成する。
【0176】
４． データ処理および解析：シーケンシング後、生データは、シーケンシングエラー、アダプター配列、および低品質リードを除去するために処理される。得られた高品質リードはその後、リファレンストランスクリプトームにアライメントされ、最終的な配列情報が生成される。
【0177】
５． データ解釈：最終ステップでは、シーケンシングされたデータを解釈し、意味のある生物学的情報を抽出する。これは、「材料および方法」節の「ＮＧＳデータ解析」に記載されているように行われる。
【0178】
［ステップ（ｇ）．対照］
ステップ（ａ）から（ｆ）が、少なくとも１の対照試料に対して行われ、ここで対照試料は、健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、生物学的試料である。
ステップ（ａ）から（ｆ）が、少なくとも１の対照試料に対して行われ、ここで対照試料は、健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、生物学的試料である。
【0179】
［ステップ（ｈ）．疾患バイオマーカーとしての３′Ｐ ＲＮＡの同定］
疾患バイオマーカーとしての３′Ｐ ＲＮＡの同定は、以下のように行われる：
ａ． 疾患を持つまたは治療を受けている対象の生物学的試料および対照から得られた増幅生成物中に包含される、少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を、リファレンスゲノムまたはトランスクリプトーム上にマッピングするステップ；および
ｂ． 生物学的試料および対照試料から得られた増幅生成物中に包含される、少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡについて、以下を計算するステップ：（ｉ）カウント数、（ｉｉ）Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値、（ｉｉｉ）カウント数のＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ倍率変化、または生物学的試料と対照試料との比較におけるカウント数に基づく正規化パラメータのＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ倍率変化、（ｉｖ）切断パターン、（ｖ）シーケンシング深度に基づく正規化カウント、（ｖｉ）マルチマッピングスコア、および（ｖｉｉ）３′Ｐ ＲＡ配列の長さ。
疾患バイオマーカーとしての３′Ｐ ＲＮＡの同定は、以下のように行われる：
ａ． 疾患を持つまたは治療を受けている対象の生物学的試料および対照から得られた増幅生成物中に包含される、少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡの配列を、リファレンスゲノムまたはトランスクリプトーム上にマッピングするステップ；および
ｂ． 生物学的試料および対照試料から得られた増幅生成物中に包含される、少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡについて、以下を計算するステップ：（ｉ）カウント数、（ｉｉ）Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値、（ｉｉｉ）カウント数のＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ倍率変化、または生物学的試料と対照試料との比較におけるカウント数に基づく正規化パラメータのＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ倍率変化、（ｉｖ）切断パターン、（ｖ）シーケンシング深度に基づく正規化カウント、（ｖｉ）マルチマッピングスコア、および（ｖｉｉ）３′Ｐ ＲＡ配列の長さ。
【0180】
疾患を持つ対象の生物学的試料の増幅生成物中に包含される３′Ｐ ＲＮＡが、以下の条件を満たす場合、３′Ｐ ＲＮＡは疾患の分子マーカーである：
－ カウント数＞２００、
－ Ｄａｒｔ ＲＮＡｓｅｑ ｐ値：≦０．０５、
－ Ｄａｒｔ ＲＮＡｓｅｑ倍率変化≧２または≦０．５、および
－ 切断パターンは、３′Ｐ ＲＮＡの長さに沿った１塩基あたりの切断頻度が≦４０％であり、３′Ｐ ＲＮＡの５′および３′末端における１塩基あたりの切断頻度が≧６０％である。
－ カウント数＞２００、
－ Ｄａｒｔ ＲＮＡｓｅｑ ｐ値：≦０．０５、
－ Ｄａｒｔ ＲＮＡｓｅｑ倍率変化≧２または≦０．５、および
－ 切断パターンは、３′Ｐ ＲＮＡの長さに沿った１塩基あたりの切断頻度が≦４０％であり、３′Ｐ ＲＮＡの５′および３′末端における１塩基あたりの切断頻度が≧６０％である。
【0181】
３′Ｐ ＲＮＡが疾患の分子マーカーであるかを決定するために有用なさらなる条件は、以下の通りである：
－ シーケンシング深度に基づく正規化カウント＞５、
－ マルチマッピングスコア≦１００、
－ 長さ＞１５および＜２００ヌクレオチド。
－ シーケンシング深度に基づく正規化カウント＞５、
－ マルチマッピングスコア≦１００、
－ 長さ＞１５および＜２００ヌクレオチド。
【0182】
［３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイの概略説明］
［ステップ（ａ′）．スモールＲＮＡリン酸化］
スモールＲＮＡの濃縮（＜２００ヌクレオチド）後すぐに、３′Ｐ ＲＮＡは、表１１に示されるプロトコルに従って、Ｔ４ ＰＮＫ ３′Ｍｉｎｕｓによる５′リン酸化を受ける。
［ステップ（ａ′）．スモールＲＮＡリン酸化］
スモールＲＮＡの濃縮（＜２００ヌクレオチド）後すぐに、３′Ｐ ＲＮＡは、表１１に示されるプロトコルに従って、Ｔ４ ＰＮＫ ３′Ｍｉｎｕｓによる５′リン酸化を受ける。
【0183】
【0184】
３７℃で１時間、サーマルサイクラーで反応をインキュベートする。
【0185】
ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５キットを通じて、スモールＲＮＡ用のプロトコルに従って反応を精製し、６μＬのヌクレアーゼフリー水（ＮＦＷ）中で最終溶出を行う。
【0186】
［ステップ（ｂ′）．３′Ｐライゲーション］
５′末端でリン酸化されたスモールＲＮＡは、上記に開示された式（Ｉａ）を有し３つの脱塩基部位を有するＲＮＡベースのアダプター（配列番号１８５）に、ＲｔｃＢリガーゼを介してライゲートされる。式（Ｉａ）を構成する要素は、以下のように配列番号１８５に対応する：Ｅ１：１～２４ヌクレオチド、Ａｚ：２５～２７、Ｅ２：２８～４８ヌクレオチド。ＲｔｃＢリガーゼは、ＲＮＡベースのアダプターの５′ＯＨ末端を、存在する場合スモールＲＮＡの３′Ｐ／３′ｃＰ末端へ、表１２に示されるプロトコルに従って結合させる。
５′末端でリン酸化されたスモールＲＮＡは、上記に開示された式（Ｉａ）を有し３つの脱塩基部位を有するＲＮＡベースのアダプター（配列番号１８５）に、ＲｔｃＢリガーゼを介してライゲートされる。式（Ｉａ）を構成する要素は、以下のように配列番号１８５に対応する：Ｅ１：１～２４ヌクレオチド、Ａｚ：２５～２７、Ｅ２：２８～４８ヌクレオチド。ＲｔｃＢリガーゼは、ＲＮＡベースのアダプターの５′ＯＨ末端を、存在する場合スモールＲＮＡの３′Ｐ／３′ｃＰ末端へ、表１２に示されるプロトコルに従って結合させる。
【0187】
【0188】
ＲＮＡベースのアダプター（Ｌｉｎｋｅｒ＿ｑＰＣＲ、配列番号１８５）の量は、ｓｍＲＮＡ開始材料に依存し、以下の表１３に示される通りである。
【0189】
【0190】
３７℃で１時間、サーマルサイクラーでインキュベートする。
【0191】
ヌクレアーゼフリー水を加えて最終体積を５０μＬにし、その後ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５キットを通じて、スモールＲＮＡ用のプロトコルに従って反応を精製し、８μＬのヌクレアーゼフリー水中で最終溶出を行う。
【0192】
［ステップ（ｃ′）．環状化］
ＲｔｃＢライゲーション生成物は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１による５′Ｐ末端と３′ＯＨ末端のライゲーションを通じて、環状化を受ける。反応条件は、表１４に示される。
ＲｔｃＢライゲーション生成物は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１による５′Ｐ末端と３′ＯＨ末端のライゲーションを通じて、環状化を受ける。反応条件は、表１４に示される。
【0193】
【0194】
インキュベーション：２５℃で２時間。
【0195】
ヌクレアーゼフリー水を加えて最終体積を５０μＬにし、その後ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５キットを通じて、スモールＲＮＡ用のプロトコルに従って反応を精製し、１０μＬのヌクレアーゼフリー水中で最終溶出を行う。任意停止点（－８０℃で保存）。
【0196】
［ステップ（ｄ′）．逆転写（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）］
一本鎖ｃＤＮＡの生成のために、試薬は表１５に示される量で混合される。逆転写プライマー（配列番号１８６）は、上記に開示された式（ＩＩａ）を有する。式（ＩＩａ）を構成する要素は、以下のように配列番号１８６に対応する：Ｇ：１～１９ヌクレオチド、Ｆ１＝２０～３５ヌクレオチド。
一本鎖ｃＤＮＡの生成のために、試薬は表１５に示される量で混合される。逆転写プライマー（配列番号１８６）は、上記に開示された式（ＩＩａ）を有する。式（ＩＩａ）を構成する要素は、以下のように配列番号１８６に対応する：Ｇ：１～１９ヌクレオチド、Ｆ１＝２０～３５ヌクレオチド。
【0197】
【0198】
環状ＲＮＡプライマー混合物を７０℃で５分間加熱し、その後氷上で少なくとも１分間インキュベートする。アニーリングされたＲＮＡに、表１６に示される量の試薬を加える。
【0199】
【0200】
５０℃で４０分間インキュベートし、その後混合物を８０℃で５分間加熱する。
【0201】
［ステップ（ｅ′）．３′Ｐ－ｑＰＣＲ］
少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子の、第１および第２のｑＰＣＲ増幅が、並行して行われ、ここで：
（ｉ）第１のｑＰＣＲ増幅は、セット１、セット２、およびセット３から選択される第１のプライマー対を使用して、行われる。式（ＩＩＩａ、ＩＩＩａ′、ＩＩＩａ″、ＩＶａ、ＩＶａ′、およびＩＶａ″）の要素Ｈ１およびＨ２は、調査中の疾患とは無関係に固定された配列を有する一方、要素ＭおよびＮは、解析中の３′Ｐ ＲＮＡマーカーにアニーリングする特定の配列を有さねばならない；
（ｉｉ）第２のｑＰＣＲ増幅は、それぞれ式（Ｖａ）および（ＶＩａ）を有する第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマー（配列番号２０４および２０５）を含む、第２のプライマー対を使用して行われる。
少なくとも１の一本鎖ｃＤＮＡ分子の、第１および第２のｑＰＣＲ増幅が、並行して行われ、ここで：
（ｉ）第１のｑＰＣＲ増幅は、セット１、セット２、およびセット３から選択される第１のプライマー対を使用して、行われる。式（ＩＩＩａ、ＩＩＩａ′、ＩＩＩａ″、ＩＶａ、ＩＶａ′、およびＩＶａ″）の要素Ｈ１およびＨ２は、調査中の疾患とは無関係に固定された配列を有する一方、要素ＭおよびＮは、解析中の３′Ｐ ＲＮＡマーカーにアニーリングする特定の配列を有さねばならない；
（ｉｉ）第２のｑＰＣＲ増幅は、それぞれ式（Ｖａ）および（ＶＩａ）を有する第２のフォワードプライマーおよび第２のリバースプライマー（配列番号２０４および２０５）を含む、第２のプライマー対を使用して行われる。
【0202】
ｑＰＣＲ増幅は、全てのｑＰＣＲ増幅ステップに対して、ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックスによって行われた。
【0203】
【0204】
【0205】
融解温度は、増幅に使用される特定のプライマーに応じて調整されねばならない。
【0206】
［ステップ（ｆ′）．対照］
ステップ（ａ′）から（ｅ′）が、少なくとも１の対照試料に対して行われ、ここで対照試料は、健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、生物学的試料である。
ステップ（ａ′）から（ｅ′）が、少なくとも１の対照試料に対して行われ、ここで対照試料は、健康な、治療を受けている、または未治療の対象の、生物学的試料である。
【0207】
［ステップ（ｇ′）．Ｃｔ値の決定］
ｑＰＣＲの定量解析は、ｑＰＣＲ装置によって与えられるサイクル値（Ｃｔすなわち閾値サイクル）の定量化の分析を通じて得られる。サイクル値（Ｃｔ）が増加するにつれて、検出される蛍光も増加する。蛍光が任意のラインを超えるときに、装置はその時までのサイクル値を記録し、これがＣｔ値として知られる。所与の試料中の３′Ｐ ＲＮＡの量はその後、相対定量または比較定量を使用して決定される。
ｑＰＣＲの定量解析は、ｑＰＣＲ装置によって与えられるサイクル値（Ｃｔすなわち閾値サイクル）の定量化の分析を通じて得られる。サイクル値（Ｃｔ）が増加するにつれて、検出される蛍光も増加する。蛍光が任意のラインを超えるときに、装置はその時までのサイクル値を記録し、これがＣｔ値として知られる。所与の試料中の３′Ｐ ＲＮＡの量はその後、相対定量または比較定量を使用して決定される。
【0208】
少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡのＣｔ値は、各生物学的試料の第１および第２の増幅生成物において決定される。
【0209】
［ステップ（ｈ′）．３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化の計算］
相対定量または比較定量では、生物学的試料および対照試料における３′Ｐ ＲＮＡの濃度の差の決定要素として、Ｃｔの差を使用する。
相対定量または比較定量では、生物学的試料および対照試料における３′Ｐ ＲＮＡの濃度の差の決定要素として、Ｃｔの差を使用する。
【0210】
少なくとも１の３′Ｐ ＲＮＡのＣｔ値の３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化の計算は、以下の式に従って行われ：
ここで
－ Ｃｔ（Ａ）３′Ｐは、生物学的試料で決定された３′Ｐ ＲＮＡのＣｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）３′Ｐは、対照試料で決定された３′Ｐ ＲＮＡのＣｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ａ）ａｄｐは、生物学的試料で決定されたＲＮＡベースのアダプターのＣｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）ａｄｐは、対照試料で決定されたＲＮＡベースのアダプターのＣｔ値であり；
３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化値≧２または≦０．５は、疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、結果予測評価を示す。
－ Ｃｔ（Ａ）３′Ｐは、生物学的試料で決定された３′Ｐ ＲＮＡのＣｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）３′Ｐは、対照試料で決定された３′Ｐ ＲＮＡのＣｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ａ）ａｄｐは、生物学的試料で決定されたＲＮＡベースのアダプターのＣｔ値であり、
－ Ｃｔ（Ｂ）ａｄｐは、対照試料で決定されたＲＮＡベースのアダプターのＣｔ値であり；
３′Ｐ－ｑＰＣＲ倍率変化値≧２または≦０．５は、疾患または状態の診断、予後、治療モニタリング、結果予測評価を示す。
【実施例0211】
バイオマーカーとして可能性がある３′Ｐ ＲＮＡ断片を詳しく調査するために、発明者らは２つのケーススタディに注目した：（ｉ）脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）および（ｉｉ）皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）。本開示において開示される具体的な実施形態は、本出願の保護の範囲を制限するものとして解釈されるべきではなく、これは本明細書において開示される方法が、様々な疾患の分子マーカーを同定するために、および様々な疾患を診断し、予測し、モニタリングするために、使用されうるためである。
【0212】
ＳＭＡの診断は、ＳＭＮ１突然変異およびＳＭＮ１タンパク質欠失の遺伝学的検出を通じて、十分に確立されている；しかし、これまでに３つの薬物治療が承認されているものの、疾患の進行および治療効果に関するマーカーは非常に乏しい２９。
【0213】
ＳＭＡに関しては、初期症状を示すＳＭＡマウスモデルからの肝組織のＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析により、３′Ｐ ＲＮＡの全体的なダウンレギュレーションが明らかとなり、その多くがｔＲＮＡ断片（ｔＲＦ）として分類された。以前の報告では、ｔＲＦは、癌および神経疾患を含む様々な疾患のバイオマーカーとしての可能性を有することが、見出された５，１９，３０～３２。概念の実証として、本手法を用いて、３′Ｐを有するｔＲＦの亜集団のみをスクリーニングすることで、この特定カテゴリーの断片に対してより良い解像度を確保した。その中で、３′Ｐ－ｔＲＦｓ＿Ｖａｌは、対照群と比較してＳＭＡ肝臓において３倍の減少を示し、アンチコドンループおよびＣＣＡ ｔＲＮＡ末端で明確な切断部位を有し、３′ｔＲＮＡハーフとしても知られる３９ヌクレオチドの断片を形成した３３。アップレギュレーションしたＲＮＡとして、３′Ｐ Ｇｍ２２９７３が同定されたが、これはＧｍ２２９７３トランスクリプトから生じる断片であり、マウストランスクリプトームではＵ２ ｓｎＲＮＡ偽遺伝子としても知られる。興味深いことに、ＳＭＡ病態におけるＳＭＮタンパク質の機能喪失は、ｓｎＲＮＰ集合の変化と関連しており、ＳＭＡと３′Ｐ－Ｇｍ２２９７３断片の過剰発現との間の相関を示唆する。
【0214】
皮膚扁平上皮癌は、扁平上皮細胞の異常な増殖を特徴とする。ほとんどのｃＳＣＣは、手術により治療されうるが、その一部は再発および転移し、高い確率（＞５０％）で死亡に至る。ｃＳＣＣの発症率は年々増加しているが、癌の進行、再発、および転移の信頼できる分子マーカーは、いまだ存在しない３４。ここでは、低インプット３′Ｐ ＲＮＡ次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法を、標的３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイと組み合わせて、３′Ｐ ＲＮＡ断片のプロファイリングおよび定量化を行うことを目指す。
【0215】
ｃＳＣＣに関しては、不死化扁平上皮癌細胞および健康なケラチノサイト細胞が、解析された。ｃＳＣＣに特異的な３′Ｐ ＲＮＡ断片の発現が、調査された。
【0216】
ｔＲＮＡグルタミン酸の５′末端（５′_ｔＲＦｓ＿Ｇｌｕ＿ＣＴＣ）およびｔＲＮＡアスパラギン酸＿ＧＴＣの３′末端（３′_ｔＲＦｓ＿Ａｓｐ＿ＧＴＣ）に由来する３′Ｐ ｔＲＦが、潜在的な疾患マーカーとして同定された。全体として、３′Ｐ－ｑＰＣＲによって発明者は、選択されたｃＳＣＣ標的試料においてＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑデータを確認することに成功し、また高度に保存されたｔＲＮＡ配列間の識別もできた。
【0217】
結論として、本明細書は、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析と３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイとの組み合わせが、潜在的な新しい疾患マーカーをスクリーニングし、同定し、検証するために有用であり、３′Ｐ ＲＮＡ－オミクスが疾患のバイオマーカーとして明らかにならないことを示す。
【0218】
［結果］
［脊髄性筋萎縮症における３′Ｐ ＲＮＡ断片］
バイオマーカー研究に必要な低インプット要件に対応するために、我々はＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑと名付けられた方法を設計した。この方法は、以前に開発されたｃｉｒｃＡＩＤ技術（３′Ｐ ＲＮＡナノポアシーケンシング用プロトコルに基づく３５）から、２つの主な改良を導入することにより、進化させたものである。１つめは、以下を包含する特定のアダプターを用いた、ライゲーションステップである：（ｉ）内部レトロ転写停止部位、（ｉｉ）ＰＣＲ重複識別のためのユニーク分子識別子（ＵＭＩ）としての、１２ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）１回の実行で複数の試料をプールするための、バーコード配列（８ヌクレオチド）。２つめは、２ステップＰＣＲと組み合わせたレトロ転写であり、これによりワークフローはＮＧＳシーケンシングに理想的なものとなる。この手法により、トランスクリプトーム全体にわたる３′Ｐ ＲＮＡのシーケンシングおよびプロファイリングが可能となる。我々は、外因性ヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＩ）をＣＨＯ細胞ライセートの粗細胞ライセートへ加え、その後リボソーム分離およびＲＮＡ抽出を行うことにより、このワークフローをテストした。この手順は、リボソームプロファイリングと呼ばれ、リボソームフットプリント（ＲＰＦ）を同定するために使用される３６。我々の結果では、リボソームＰ部位の明確な３ヌクレオチド周期性を有するコーディング配列における、ＲＰＦの濃縮が確認され、リボヌクレアーゼＩの酵素的切断により生成された３′Ｐ ＲＮＡをシーケンシングする、本方法の能力が確認された（図１）。我々は、この方法をＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑと名付けた。
［脊髄性筋萎縮症における３′Ｐ ＲＮＡ断片］
バイオマーカー研究に必要な低インプット要件に対応するために、我々はＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑと名付けられた方法を設計した。この方法は、以前に開発されたｃｉｒｃＡＩＤ技術（３′Ｐ ＲＮＡナノポアシーケンシング用プロトコルに基づく３５）から、２つの主な改良を導入することにより、進化させたものである。１つめは、以下を包含する特定のアダプターを用いた、ライゲーションステップである：（ｉ）内部レトロ転写停止部位、（ｉｉ）ＰＣＲ重複識別のためのユニーク分子識別子（ＵＭＩ）としての、１２ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）１回の実行で複数の試料をプールするための、バーコード配列（８ヌクレオチド）。２つめは、２ステップＰＣＲと組み合わせたレトロ転写であり、これによりワークフローはＮＧＳシーケンシングに理想的なものとなる。この手法により、トランスクリプトーム全体にわたる３′Ｐ ＲＮＡのシーケンシングおよびプロファイリングが可能となる。我々は、外因性ヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＩ）をＣＨＯ細胞ライセートの粗細胞ライセートへ加え、その後リボソーム分離およびＲＮＡ抽出を行うことにより、このワークフローをテストした。この手順は、リボソームプロファイリングと呼ばれ、リボソームフットプリント（ＲＰＦ）を同定するために使用される３６。我々の結果では、リボソームＰ部位の明確な３ヌクレオチド周期性を有するコーディング配列における、ＲＰＦの濃縮が確認され、リボヌクレアーゼＩの酵素的切断により生成された３′Ｐ ＲＮＡをシーケンシングする、本方法の能力が確認された（図１）。我々は、この方法をＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑと名付けた。
【0219】
バイオマーカーのスクリーニングに適した出発材料を同定するために、我々は公開されているＲＮＡシーケンシングデータセットを解析した。ＳＭＡモデルのＲＮＡシーケンシングデータセット３７をスクリーニングした結果、初期症状を示す（Ｐ５）ＳＭＡマウスの肝臓が、３′Ｐ ｔＲＦを形成する周知の酵素であるアンギオゲニン３８，３９のレベル上昇を示すことを、我々は観測した。Ｐ５ ＳＭＡおよび健康な肝臓のＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析は、５００ｎｇのサイズ選別されたスモールＲＮＡ（＜２００ヌクレオチド長）から出発して行われた。全ＲＮＡ断片のシーケンシングアウトプットのリード長分布は、１５～７０ヌクレオチドの範囲であり、２つの主要なピークを２０および３５ヌクレオチド付近に有する（図２）。リードの大部分は、ノンコーディングＲＮＡ上にマッピングされ、主にｒＲＮＡ（対照群で２５％、ＳＭＡ群で２３％）およびｔＲＮＡ（対照群で２９％、ＳＭＡ群で２５％）であった（図３）。
【0220】
驚くべきことに、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑの発現差異解析（ＳＭＡ対対照）は、Ｐ５肝臓における３′Ｐ ＲＮＡの全体的な減少を、対照と比較して示し（表１９－検出されたアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた３′Ｐ ＲＮＡ断片数）、アンギオゲニンの過剰発現が、これらの試料中の３′Ｐ ＲＮＡ断片の主な原因ではないことを示唆するが、他のヌクレアーゼも関与しているはずである。表で強調される全ての３′Ｐ ＲＮＡ断片は、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｌｏｇ２ＦＣ＞１またはｌｏｇ２ＦＣ＜－１、およびＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値＜０．０５で、フィルタリングされる。
【0221】
【0222】
より具体的には、我々は５０のダウンレギュレーションされた３′Ｐ ＲＮＡ（ｐ値＜０．０５；Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｌｏｇ２ＦＣ＜－１）を見出し、そのうち３８はｔＲＮＡ断片であった。対照的に、アップレギュレーションされたのは、３つの断片だけであった（Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値＜０．０５；Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｌｏｇ２ＦＣ＞１）。さらなる調査のため最も頑強なヒットを選択するために、我々は以下に基づくより厳密なフィルタリングステップを適用した：（ｉ）リードカウント（＞３００）、（ｉｉ）Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ倍率変化（ｌｏｇ２ＦＣ＞２またはｌｏｇ２ＦＣ＜－２）、（ｉｉｉ）Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値＜０．０５、および（ｉｖ）断片の長さ＞１５ヌクレオチド、（ｉｖ）切断パターンの形状。最後のパラメータを測定するために、各断片のリードカウントを、ヌクレオチド位置の関数としてプロットした。全長に沿った１塩基あたりの切断頻度が４０％未満であり、かつ５′および３′末端における１塩基あたりの切断頻度が少なくとも６０％の断片（図５）だけが考慮された。解析には、１５ヌクレオチドより長く、標的上に一意にマッピングされるか、または低いマルチマッピングスコア（≦１００マルチマッピングリード－「材料および方法」を参照）を有する断片のみを含めた。我々は、３つのダウンレギュレーションされた断片（全てｔＲＮＡバリン（ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＡＡＣ、ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＣＡＣ、およびｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＴＡＣ）に由来する）、および１つのアップレギュレーションされた断片（Ｇｍ２２９７３（Ｕ２ ｓｎＲＮＡ偽遺伝子）に由来する）を標的とした。特に、ｔＲＦｓ Ｖａｌは、アンチコドンループのヌクレオチド３７で明確な切断を示す唯一の断片であり（図４）、ＣＣＡテールのヌクレオチド７５で終了する３９ヌクレオチドの断片を生成し、３′ｔＲＮＡハーフとして規定される３３。Ｇｍ２２９７３断片は、全長Ｇｍ２２９７３トランスクリプトから生じる。興味深いことに、検出された３′Ｐ ＲＮＡ断片は、Ｓｍタンパク質結合ＲＮＡ結合部位にアライメントされている（図６）。Ｓｍタンパク質は、ｓｎＲＮＡと結合してスプライシングに関与する核内低分子リボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＰ）を形成する、一群のタンパク質である。注目すべきは、ＳＭＮが、Ｓｍタンパク質をリクルートし組み立ててｓｎＲＮＰにするのに関与し、ＳＭＮタンパク質の欠損が、ＳＭＡにおいて集合体の変化を引き起こすことである４０。
【0223】
特定の５′および３′末端を有する３′Ｐ ＲＮＡ断片を正確に定量するために、アダプターライゲーション、環状化、および選択的増幅に基づく専用の３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイを、我々は設計した。アダプターおよび最終的なｑＰＣＲステップは、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑにおいて使用されるものとは異なる特徴を有する（「方法」を参照）。我々は、アダプターと断片との接合部にプライマーを設計し、それは目的の断片の両端で、少なくとも６ヌクレオチドで標的配列にアニーリングする。ダウンレギュレーションされたバリンのアイソデコーダー（３′Ｐ ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＡＡＣ、ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＣＡＣ、およびｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＴＡＣ）は、同一の切断パターンを有し、最初の検証として良い候補として選ばれた。我々は、３つの選ばれた候補（３′Ｐ ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＡＡＣ／ＣＡＣ、３′Ｐ ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＴＡＣから）の各々に対して、アダプター－断片接合部でプライマーを設計した。この過程で、我々は３′Ｐ ｔＲＦｓ Ｖａｌ ＴＡＣを識別することができた。予想通り、両断片の５′および３′末端で最後の１０ヌクレオチドが完全に同一であるため、我々は３′Ｐ ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＡＡＣとｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＣＡＣを識別できなかった。３′Ｐ－ｑＰＣＲの後、我々はＳＭＡ肝組織において、対照と比較して３′Ｐ ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＡＡＣ／ＣＡＣの２倍のダウンレギュレーションを観察し（図７Ａ）、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑデータと一致した。逆に、３′Ｐ ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＴＡＣでは、有意なダウンレギュレーションは観察されず、特定の断片の評価には標的ｑＰＣＲ手法が必要であることが明らかになった。我々の結果をさらに検証するために、我々はノーザンブロット解析を行った。ゲル中の３′Ｐ ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＡＡＣ／ＣＡＣ断片バンドは、健康なマウス肝臓と比較して、ＳＭＡマウスの肝臓試料において２倍低い強度を示し、３′Ｐ－ｑＰＣＲの結果を確認した（図７Ｂ）。総合的に、我々のデータは、３′Ｐ ｔＲＦｓ Ｖａｌ ＡＡＣ／ＣＡＣが、検討中の生物学的モデルの中で、良い疾患マーカーであることを示唆する。
【0224】
次に我々は、シーケンシングによって同定されたＧｍ２２９７３由来の断片を検証しようとした。このＲＮＡは、ＳＭＡ肝臓試料においてアップレギュレーションされ、我々のシーケンシングアウトプットに存在しＵ２トランスクリプト上にマッピングする別の断片と比較して、位置１５に１点だけ変異を示すが、その断片は対照とＳＭＡ試料との間で有意な変化はない。注目すべきは、Ｕ２由来の断片が、偽遺伝子由来の断片と比較して、はるかに豊富であることである（Ｕ２断片のカウント：２４０００；Ｇｍ２２９７３断片のカウント：６００。いずれもＳＭＡ試料における平均カウント）。２種類の断片を識別するために（これらは１ヌクレオチドだけが異なる）、我々は２組のプライマーを設計した。フォワードプライマーは、アダプター－断片接合部に配置され、２つの断片に共通である一方、リバースプライマーは、３′末端で最後のヌクレオチドだけ異なり、それがＧｍ２２９７３由来の断片とＵ２由来の断片との間のミスマッチの位置にマッピングする。我々は、Ｇｍ２２９７３特異的プライマーで４倍の増加を観察したが、Ｕ２由来の断片では変化が見られなかった（図８ＡおよびＣ）。これは、我々の３′Ｐ－ｑＰＣＲ手法が、目的とする特定の３′Ｐ ＲＮＡ断片を検出する際に、１ヌクレオチドの分解能を有することを示す。
【0225】
我々はさらに、ＳＭＡ試料における豊富な増加が、全長偽遺伝子トランスクリプトの変化を反映するのか、または特定の断片にのみ関連するのかを評価しようとした。そのために我々は、全長Ｇｍ２２９７３およびＵ２トランスクリプトに対して、標準的なｑＰＣＲを行った。我々は、Ｇｍ２２９７３断片の増加もまた、ＳＭＡ試料における全長偽遺伝子の高発現を反映する（図８Ｂ）が、全長Ｕ２トランスクリプトは減少する（図８Ｄ）ことを観察した。我々のデータを総合すると、全長Ｇｍ２２９７３トランスクリプトおよび派生断片生成物が、潜在的な疾患マーカーであることが示唆された。
【0226】
マウス試料に適用された方法が、ヒト由来のＳＭＡ細胞にも使用されうるかをさらに調査するため、我々はＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑを、ＳＭＡ Ｉ型患者、ＳＭＡ ＩＩ型患者、および健常者から得られたヒト線維芽細胞に適用した。
【0227】
発現差異解析の後、我々は、健常者対ＳＭＡ１、健常者対ＳＭＡ２、およびＳＭＡ１対ＳＭＡ２の間で発現差異のある、３′Ｐ ＲＮＡのリストを同定した（表２０）。その中で我々は、マウスのデータと比較して異なる断片配列を有するものの、ｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＡＡＣ／ＣＡＣを標的として確認した。
【0228】
我々の結果は、本方法の種を超えた頑強さを確認し、ＳＭＡのバイオマーカーとしてのｔＲＦｓ Ｖａｌ－ＡＡＣ／ＣＡＣおよび他の３′Ｐ ＲＮＡ（表２０に記載）の可能性を強調した。
【0229】
【0230】
最後に我々は、ＳＭＮ２遺伝子を調節し、ＳＭＮタンパク質産生を増加させるよう設計された２つの薬物、リスジプラムおよびヌシネルセンを用いた治療後の、３′Ｐ ＲＮＡプロファイルの変化を評価した。この解析は、これらの治療が３′Ｐ ＲＮＡ発現をどのように変化させるかを明らかにし、それにより分子効果関する洞察および３′Ｐ ＲＮＡが治療反応のマーカーとして役立つ可能性を提供することを目的とした。
【0231】
同定された治療反応の３′Ｐ ＲＮＡ分子マーカーは、以下の表２１に記載される。
【0232】
【0233】
［皮膚扁平上皮癌における３′Ｐ ＲＮＡ断片］
悪性皮膚病変の潜在的な分子マーカーを同定するために、我々はまず、ヒト皮膚扁平上皮癌細胞株であるＨＳＣ－１の４つの複製試料に対して、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析を行い、その結果をケラチノサイトの４つの対照試料から得られたものと比較した。Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑを適用した結果、ＳＭＡ試料で得られたものと同様のマッピング結果が示された。リードの大部分は、ノンコーディングＲＮＡ上にマッピングされ、そのうち２５％がｔＲＮＡであった（図９）。３′Ｐ ｔＲＦに基づく主成分分析（ＰＣＡ）により、ｃＳＣＣおよびケラチノサイト試料が、明確にクラスター化され（図１０）、３′Ｐ ＲＮＡのこのサブグループが、疾患状態の指標として使用されうることを示唆した。正常試料対腫瘍試料の発現差異解析は、１９３０ヒットのうち１０５のｔＲＮＡ断片が有意にダウンレギュレーションされ、１１０８のｔＲＮＡ断片のうち７７が有意にアップレギュレーションされたことを示す。興味深いことに、ｔＲＦは、コードされるアミノ酸の電荷に従って、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされ（すなわち、ダウンレギュレーションされた３′Ｐ ｔＲＦは陰性アミノ酸をコードし、アップレギュレーションされたものは陽性アミノ酸をコードする）、対照細胞と比較してｃＳＣＣにおいてコドン使用の選好がある可能性を示唆した。ｔＲＦの種類を確認したところ、我々は５′および３′の長いｔＲＦの明確なダウンレギュレーションを観察した一方で、３′Ｐの短いｔＲＦは、主にアップレギュレーションされた（表２２－アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた合計３′Ｐ ｔＲＮＡ断片数（ｔＲＦ、レーン１）およびｔＲＦサブタイプごとに報告された数（レーン２～レーン６））。表で強調される全ての３′Ｐ ｔＲＮＡ断片は、ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｌｏｇ２ＦＣ＞１またはｌｏｇ２ＦＣ＜－１、およびＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値＜０．０５で、フィルタリングされる。
悪性皮膚病変の潜在的な分子マーカーを同定するために、我々はまず、ヒト皮膚扁平上皮癌細胞株であるＨＳＣ－１の４つの複製試料に対して、Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析を行い、その結果をケラチノサイトの４つの対照試料から得られたものと比較した。Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑを適用した結果、ＳＭＡ試料で得られたものと同様のマッピング結果が示された。リードの大部分は、ノンコーディングＲＮＡ上にマッピングされ、そのうち２５％がｔＲＮＡであった（図９）。３′Ｐ ｔＲＦに基づく主成分分析（ＰＣＡ）により、ｃＳＣＣおよびケラチノサイト試料が、明確にクラスター化され（図１０）、３′Ｐ ＲＮＡのこのサブグループが、疾患状態の指標として使用されうることを示唆した。正常試料対腫瘍試料の発現差異解析は、１９３０ヒットのうち１０５のｔＲＮＡ断片が有意にダウンレギュレーションされ、１１０８のｔＲＮＡ断片のうち７７が有意にアップレギュレーションされたことを示す。興味深いことに、ｔＲＦは、コードされるアミノ酸の電荷に従って、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされ（すなわち、ダウンレギュレーションされた３′Ｐ ｔＲＦは陰性アミノ酸をコードし、アップレギュレーションされたものは陽性アミノ酸をコードする）、対照細胞と比較してｃＳＣＣにおいてコドン使用の選好がある可能性を示唆した。ｔＲＦの種類を確認したところ、我々は５′および３′の長いｔＲＦの明確なダウンレギュレーションを観察した一方で、３′Ｐの短いｔＲＦは、主にアップレギュレーションされた（表２２－アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた合計３′Ｐ ｔＲＮＡ断片数（ｔＲＦ、レーン１）およびｔＲＦサブタイプごとに報告された数（レーン２～レーン６））。表で強調される全ての３′Ｐ ｔＲＮＡ断片は、ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｌｏｇ２ＦＣ＞１またはｌｏｇ２ＦＣ＜－１、およびＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値＜０．０５で、フィルタリングされる。
【0234】
【0235】
３′Ｐ－ｑＰＣＲを用いたさらなる調査のための最良のヒットは、前述したフィルタリングステップに基づいて選択された：（ｉ）リードカウント（＞２００）、（ｉｉ）Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ倍率変化（ｌｏｇ２ＦＣ＞１またはｌｏｇ２Ｆｃ＜－１）、（ｉｉｉ）Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値＜０．０５、および（ｉｖ）鋭い切断パターン。最初の検証として、我々は、ｔＲＮＡグルタミン酸の５′末端（５′_ｔＲＦｓ＿Ｇｌｕ＿ＣＴＣ）およびｔＲＮＡアスパラギン酸＿ＧＴＣの３′末端（３′_ｔＲＦｓ＿Ａｓｐ＿ＧＴＣ）由来の３′Ｐ ｔＲＦに対して、プライマーを設計した。３′Ｐ－ｑＰＣＲアッセイによって我々は、ｃＳＣＣ細胞株における両方のｔＲＦのダウンレギュレーションを、健康なケラチノサイトと比較して確認した（図１１）。同定されたｃＳＣＣの３′Ｐ ＲＮＡ分子マーカーは、表２３に記載される。
【0236】
【0237】
３′Ｐ ｔＲＦがｃＳＣＣインビトロモデルにおいて発現差異があることを確認した後、我々はヒト血漿試料中のそれらの存在を調査した。この目的のために、我々はＤａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑによって、９人の健康なドナーおよび９人のｃＳＣＣ患者からの血漿試料を解析した。同定された血漿中のｃＳＣＣの３′Ｐ ＲＮＡ分子マーカーは、以下の表２４に記載される。
【0238】
【0239】
［材料および方法］
［マウス肝組織］
肝組織は、重度ＳＭＡの「台湾型」マウスモデルから、初期症状の時（生後５日目－Ｐ５）に採取された。表現型が正常な同腹仔（Ｓｍｎ±；ＳＭＮ２ｔｇ／０）が対照として使用された。解剖後、肝組織は急速凍結され、使用まで－８０°Ｃで保存された。
［マウス肝組織］
肝組織は、重度ＳＭＡの「台湾型」マウスモデルから、初期症状の時（生後５日目－Ｐ５）に採取された。表現型が正常な同腹仔（Ｓｍｎ±；ＳＭＮ２ｔｇ／０）が対照として使用された。解剖後、肝組織は急速凍結され、使用まで－８０°Ｃで保存された。
【0240】
［細胞株］
ヒト皮膚の扁平上皮癌の細胞株（ＨＳＣ－１、アクセッション番号ＪＣＲＢ１０１５）は、ＪＲＢ（https://cellbank.nibiohn.go.jp/english/）から購入され、２０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中の１０ｃｍプレート内で培養された。細胞は、０．０２％ＥＤＴＡおよび０．０５％トリプシンを用いて３分間；大気９５％、二酸化炭素５％（ＣＯ２）下で処理した後に、収穫された。細胞を２週間ごとに継代培養する。
ヒト皮膚の扁平上皮癌の細胞株（ＨＳＣ－１、アクセッション番号ＪＣＲＢ１０１５）は、ＪＲＢ（https://cellbank.nibiohn.go.jp/english/）から購入され、２０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中の１０ｃｍプレート内で培養された。細胞は、０．０２％ＥＤＴＡおよび０．０５％トリプシンを用いて３分間；大気９５％、二酸化炭素５％（ＣＯ２）下で処理した後に、収穫された。細胞を２週間ごとに継代培養する。
【0241】
ヒト表皮ケラチノサイトは、ＡＴＣＣ（カタログ番号 ＰＣＳ－２００－０１１）から購入された。ヒト表皮ケラチノサイトは、供給者の指示に従って培養された。
【0242】
ＳＭＡ実験のためのヒト由来線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入され（下表２５参照）、供給者の指示に従って培養された。線維芽細胞は、ヌシネルセン（Ｂｉｏｇｅｎ）またはリスジプラム（Ｓａｎｂｉｏ、カタログ番号２９０２８－１）を用いて処理された。ヌシネルセンおよびリスジプラムを用いた処理は、７５～８０％のコンフルエンシーで行われた。ヌシネルセン処理では、薬剤は最終濃度１０ｎＭで使用され、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸ ＲｅａｇｅｎｔおよびＰＬＵＳ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１２６２１）を用いて、製造者の推奨に従いトランスフェクトされた。リスジプラム処理では、細胞は最終濃度０．５μＭで処理された。処理は２４時間ごとに２回繰り返された。
【0243】
【0244】
［ヒト血漿］
患者血漿は、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ，Ｉｎｃ． カリフォルニア州、米国）で購入された。全ての血液製品は、認定採血技師（ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｉｓｔｓ）によってＩＲＢ承認の下で採取され、血液処理は厳格な標準作業手順（機密文書は要請に応じて入手可能）の下で行われる。以下に、健康なドナーおよびＳＣＣ患者のリストを示す。
患者血漿は、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ，Ｉｎｃ． カリフォルニア州、米国）で購入された。全ての血液製品は、認定採血技師（ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｉｓｔｓ）によってＩＲＢ承認の下で採取され、血液処理は厳格な標準作業手順（機密文書は要請に応じて入手可能）の下で行われる。以下に、健康なドナーおよびＳＣＣ患者のリストを示す。
【0245】
【0246】
［ＲＮＡ抽出］
全ＲＮＡおよびスモールＲＮＡ濃縮は、ＭｉｒＶａｎａ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号ＡＭ１５６１）によって、製造業者の指示に従って行われた。簡単に言えば、マウス肝組織は、乳鉢とすり棒を使用して液体窒素下で粉砕された。粉末はその後、１．５ｍＬチューブ中に移され、そこで細胞は、ＭｉｒＶａｎａ溶解緩衝液およびｍｉＲＮＡ添加剤を加えることにより破壊され、その後カラム精製した。細胞株は、ＭｉｒＶａｎａ Ｋｉｔの仕様に従って溶解され処理された。ＲＮＡ精製後、全ＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより定量され、スモールＲＮＡ分画は、ＱｕＢｉｔ ｍｉＲＮＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号Ｑ３２８８０）により定量された。ＲＮＡの完全性は、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡナノチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ カタログ番号５０６７－１５１１）により確認された。
全ＲＮＡおよびスモールＲＮＡ濃縮は、ＭｉｒＶａｎａ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号ＡＭ１５６１）によって、製造業者の指示に従って行われた。簡単に言えば、マウス肝組織は、乳鉢とすり棒を使用して液体窒素下で粉砕された。粉末はその後、１．５ｍＬチューブ中に移され、そこで細胞は、ＭｉｒＶａｎａ溶解緩衝液およびｍｉＲＮＡ添加剤を加えることにより破壊され、その後カラム精製した。細胞株は、ＭｉｒＶａｎａ Ｋｉｔの仕様に従って溶解され処理された。ＲＮＡ精製後、全ＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより定量され、スモールＲＮＡ分画は、ＱｕＢｉｔ ｍｉＲＮＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号Ｑ３２８８０）により定量された。ＲＮＡの完全性は、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡナノチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ カタログ番号５０６７－１５１１）により確認された。
【0247】
［Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析］
［５′リン酸化およびアダプターライゲーション］
スモールＲＮＡ分画が、ライブラリ調製のためのインプットとして使用された。具体的には、５００ｎｇのスモールＲＮＡが、Ｔ４ ＰＮＫ ３′マイナス（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２３６Ｓ）用いて、製造者の指示に従って、５′リン酸化を受けた。スモールＲＮＡは、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５カラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｒ１０１３）を使用して精製され、ＲｔｃＢ（ＮＥＢ カタログ番号Ｍ０４５８Ｓ）を介して以下の条件に従って、ＲＮＡアダプターにライゲートされた：５００ｎｇのスモールＲＮＡ、０．７ｐｍｏｌのアダプター、１５ｐｍｏｌのＲｔｃＢ、１×ＲｔｃＢ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ）、１５０μＭ ＧＴＰ、１．８ｍＭ ｍＭ ＭｎＣｌ２、最終体積１０μＬ。反応は３７℃で１時間インキュベートされ、その後ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５カラムによって精製された。ＲＮＡベースのアダプター（表２４に記載されるＲＮＡベースのアダプター）には、以下を含む：（ｉ）Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに必要な、ＳＰ１配列の一部、（ｉｉ）ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）として使用される、８つの縮退ヌクレオチド、（ｉｉｉ）ＲＴ酵素の停止および一本鎖ｃＤＮＡの生成を可能にする、３つの脱塩基部位、および（ｉｖ）リボヌクレアーゼ分解を防ぐ、末端フルオロウリジン。
［５′リン酸化およびアダプターライゲーション］
スモールＲＮＡ分画が、ライブラリ調製のためのインプットとして使用された。具体的には、５００ｎｇのスモールＲＮＡが、Ｔ４ ＰＮＫ ３′マイナス（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２３６Ｓ）用いて、製造者の指示に従って、５′リン酸化を受けた。スモールＲＮＡは、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５カラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｒ１０１３）を使用して精製され、ＲｔｃＢ（ＮＥＢ カタログ番号Ｍ０４５８Ｓ）を介して以下の条件に従って、ＲＮＡアダプターにライゲートされた：５００ｎｇのスモールＲＮＡ、０．７ｐｍｏｌのアダプター、１５ｐｍｏｌのＲｔｃＢ、１×ＲｔｃＢ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ）、１５０μＭ ＧＴＰ、１．８ｍＭ ｍＭ ＭｎＣｌ２、最終体積１０μＬ。反応は３７℃で１時間インキュベートされ、その後ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５カラムによって精製された。ＲＮＡベースのアダプター（表２４に記載されるＲＮＡベースのアダプター）には、以下を含む：（ｉ）Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに必要な、ＳＰ１配列の一部、（ｉｉ）ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）として使用される、８つの縮退ヌクレオチド、（ｉｉｉ）ＲＴ酵素の停止および一本鎖ｃＤＮＡの生成を可能にする、３つの脱塩基部位、および（ｉｖ）リボヌクレアーゼ分解を防ぐ、末端フルオロウリジン。
【0248】
［環状化］
アダプターがライゲートされたＲＮＡ（ＲＮＡ：アダプター）の環状化は、２５℃で２時間、１０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０４Ｌ）、１×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）、２０％ＰＥＧ８０００、５０μＭ ＡＴＰを包含する総体積２０μｌ中で、行われた。環状ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５カラム（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｒ１０１３）を使用することにより精製された。
アダプターがライゲートされたＲＮＡ（ＲＮＡ：アダプター）の環状化は、２５℃で２時間、１０ＵのＴ４ ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０４Ｌ）、１×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）、２０％ＰＥＧ８０００、５０μＭ ＡＴＰを包含する総体積２０μｌ中で、行われた。環状ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５カラム（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｒ１０１３）を使用することにより精製された。
【0249】
［ＲＴおよびＰＣＲ増幅］
一本鎖ｃＤＮＡの生成のために、環状ＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ カタログ番号１８０８００９３）を使用して、以下の条件に従って逆転写を受けた：２００ｕＭ ｄＮＴＰ混合物、１０ｕＭ ＲＴプライマー（表２５に記載）、１×ＲＴ緩衝液、５ｍＭ ＤＴＴ。ＲＴプライマーには、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに必要な全長ＳＰ２配列、およびＵＭＩのための４つの縮退ヌクレオチドを含む。混合物は、環状ＲＮＡ変性を可能にするために７０℃で５分間インキュベートされ、その後氷上で２分間、５０℃で４０分間、およびＲＴ酵素を熱失活させるために８０℃で５分間加熱した。直鎖一本鎖ｃＤＮＡの形成後、ＲＴ反応混合物は、２ステップのＰＣＲによって増幅された。第１のＰＣＲ増幅では、ｃＤＮＡ増幅およびフォワードプライマーによる全長ＳＰ１配列の導入が行われた。第２のＰＣＲ増幅ステップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに必要な、ユニークデュアルインデックス（ＵＤＩ）アダプターの統合のために必要である。
一本鎖ｃＤＮＡの生成のために、環状ＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ カタログ番号１８０８００９３）を使用して、以下の条件に従って逆転写を受けた：２００ｕＭ ｄＮＴＰ混合物、１０ｕＭ ＲＴプライマー（表２５に記載）、１×ＲＴ緩衝液、５ｍＭ ＤＴＴ。ＲＴプライマーには、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに必要な全長ＳＰ２配列、およびＵＭＩのための４つの縮退ヌクレオチドを含む。混合物は、環状ＲＮＡ変性を可能にするために７０℃で５分間インキュベートされ、その後氷上で２分間、５０℃で４０分間、およびＲＴ酵素を熱失活させるために８０℃で５分間加熱した。直鎖一本鎖ｃＤＮＡの形成後、ＲＴ反応混合物は、２ステップのＰＣＲによって増幅された。第１のＰＣＲ増幅では、ｃＤＮＡ増幅およびフォワードプライマーによる全長ＳＰ１配列の導入が行われた。第２のＰＣＲ増幅ステップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに必要な、ユニークデュアルインデックス（ＵＤＩ）アダプターの統合のために必要である。
【0250】
簡単に言えば、第１のＰＣＲステップは、以下の条件に従って行われた：２０ｕＬのＲＴ反応、０．８ｕＭ ＳＰ１フォワードプライマーおよび０．８ ＳＰ２リバースプライマー、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｆ５３１Ｓ）、最終体積１００ｕＬ。ＰＣＲ混合物は、サーマルサイクラー内の０．２チューブ中で、以下のように増幅された：９８℃で１分間、その後９８℃で３０秒間、６１℃で３０秒間、７２℃で１０秒間を８サイクル。反応はその後、１．６倍量のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ、カタログ番号Ａ６３８８２）によって、製造者の指示に従って精製された。
【0251】
精製されたＤＮＡが、第２のＰＣＲステップのために使用された：４０ｕＬのＰＣＲ１、１．５ｕＭ ＵＤＩアダプター（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、セット番号４８／１）、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ高忠実度マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｆ５３１Ｓ）、最終体積１００ｕＬ。ＰＣＲ混合物は、サーマルサイクラー内の０．２チューブ中で、以下のように増幅された：９８℃で１分間、その後９８℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１０秒間を６サイクル。反応はその後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ ＣｌｅａｎＵｐキットによって精製された。Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑライブラリ調製に使用された全ての配列は、表２４（配列番号１７３～１８４）に記載されている。
【0252】
［ライブラリのゲル精製およびシーケンシング］
最終ライブラリは、１０％ＴＢＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＥＣ６２７５ＢＯＸ）上にロードされ、２００Ｖで１時間泳動され、Ｓｙｂｒ（商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）を用いて染色され、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）を使用してスキャンされた。アダプターダイマー汚染を除去するために、２００ヌクレオチドでの正しいバンドがゲルから分離され、Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｉｍｍａｇｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｒｌ、カタログ番号＃ＫＧＥ００２）中に、室温で一定の回転のもと、砕かれて一晩浸漬された。水溶性ゲル破片は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ＭＣチューブを用いて濾過され、その後イソプロパノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ９５１６）を用いて、－８０℃で２時間または一晩沈殿された。沈殿後、試料は１２０００ｇ、４℃で３０分間、遠心分離された。ペレットは７０％エタノールを用いて１回洗浄され、１２０００ｇ、４℃で５分間遠心分離され、空気乾燥され、１２ｕＬのヌクレアーゼフリー水中に再懸濁された。正しい長さを評価するために、サイズ選別された各ライブラリは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒによってＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｋｉｔを使用して確認され、一方、Ｐ５およびＰ７プライマーを使用したｑＰＣＲは、高精度のライブラリ定量に使用された。最終プールは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ上の１００サイクルのシングルリードを用いて、シーケンシングされた。
最終ライブラリは、１０％ＴＢＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＥＣ６２７５ＢＯＸ）上にロードされ、２００Ｖで１時間泳動され、Ｓｙｂｒ（商標）Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ１１４９４）を用いて染色され、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）を使用してスキャンされた。アダプターダイマー汚染を除去するために、２００ヌクレオチドでの正しいバンドがゲルから分離され、Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｉｍｍａｇｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｒｌ、カタログ番号＃ＫＧＥ００２）中に、室温で一定の回転のもと、砕かれて一晩浸漬された。水溶性ゲル破片は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ＭＣチューブを用いて濾過され、その後イソプロパノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ９５１６）を用いて、－８０℃で２時間または一晩沈殿された。沈殿後、試料は１２０００ｇ、４℃で３０分間、遠心分離された。ペレットは７０％エタノールを用いて１回洗浄され、１２０００ｇ、４℃で５分間遠心分離され、空気乾燥され、１２ｕＬのヌクレアーゼフリー水中に再懸濁された。正しい長さを評価するために、サイズ選別された各ライブラリは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒによってＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｋｉｔを使用して確認され、一方、Ｐ５およびＰ７プライマーを使用したｑＰＣＲは、高精度のライブラリ定量に使用された。最終プールは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ上の１００サイクルのシングルリードを用いて、シーケンシングされた。
【0253】
［ＮＧＳデータ解析］
細胞株またはマウス肝組織から得られたＮＧＳデータは、Ｃｕｔａｄａｐｔを用いて、３′末端アダプターを除去することによりトリミングされた。ＵＭＩは、ＵＭＩ－ｔｏｏｌｓ ｅｘｔｒａｃｔ（Smith, 2017）を使用して抽出された。１０ヌクレオチド未満の長さのトリミングされたリードは、破棄された。残ったリードはその後、対応するゲノムにアライメントされた。ｔＲＡＸパイプライン（Holmes AD et al 2022）を使用して後続の解析に使用される、生成されたＢＡＭファイルは、ｂｉｏＲｘｉｖ（生命科学における未発表プレプリントのための、無料オンラインアーカイブおよび配信サービス）上に発表された。発現差異解析は、ＤＥｓｅｑ２を使用して行われた４１。
細胞株またはマウス肝組織から得られたＮＧＳデータは、Ｃｕｔａｄａｐｔを用いて、３′末端アダプターを除去することによりトリミングされた。ＵＭＩは、ＵＭＩ－ｔｏｏｌｓ ｅｘｔｒａｃｔ（Smith, 2017）を使用して抽出された。１０ヌクレオチド未満の長さのトリミングされたリードは、破棄された。残ったリードはその後、対応するゲノムにアライメントされた。ｔＲＡＸパイプライン（Holmes AD et al 2022）を使用して後続の解析に使用される、生成されたＢＡＭファイルは、ｂｉｏＲｘｉｖ（生命科学における未発表プレプリントのための、無料オンラインアーカイブおよび配信サービス）上に発表された。発現差異解析は、ＤＥｓｅｑ２を使用して行われた４１。
【0254】
発現差異解析からのヒットは、以下のフィルターに従って選択された：
－ リードカウント：≧２００カウント
－ Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ Ｌｏｇ２ ＦＣ：アップレギュレーションでは≧１、ダウンレギュレーションでは≦－１、対照または未処理試料と比較。
－ Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値：≦０．０５、または試料間での統計的に頑強な閾値を保証する、任意の統計パラメータ。
－ 切断パターン：目的の断片は、明確な切断部位を示さねばならず、すなわち、断片長に沿った１塩基あたりの切断頻度が≦４０％であり、断片の５′および３′末端における１塩基あたりの切断頻度≧６０％である。
－ マルチマッピングスコア：
○ （全ての断片に対して）：≦１００マルチマップの断片のみが、受け入れられる
○ （ｔＲＮＡ断片に対して）：≦１００マルチマップの断片のみが、受け入れられる。これらのうち、我々はｔＲＦを、以下のようにさらに分類する：
・ トランスクリプト特異的（対応するｔＲＮＡトランスクリプト配列に一意にマッピングされるリード）；
・ アイソデコーダー特異的（対応するアンチコドンを有するトランスクリプトに一意にマッピングされるリード）；
・ アイソタイプ特異的（対応するｔＲＮＡアイソタイプのトランスクリプトにのみマッピングされるリード）；
・ アミノ特異的でない（複数のｔＲＮＡアイソタイプにマッピングされるリード）；
・ 具体的には以下のｔＲＦが好ましい：トランスクリプト特異的＞アイソデコーダー特異的＞アイソタイプ特異的。アミノ特異的でないものは、考慮されない。
－ リードカウント：≧２００カウント
－ Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ Ｌｏｇ２ ＦＣ：アップレギュレーションでは≧１、ダウンレギュレーションでは≦－１、対照または未処理試料と比較。
－ Ｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ ｐ値：≦０．０５、または試料間での統計的に頑強な閾値を保証する、任意の統計パラメータ。
－ 切断パターン：目的の断片は、明確な切断部位を示さねばならず、すなわち、断片長に沿った１塩基あたりの切断頻度が≦４０％であり、断片の５′および３′末端における１塩基あたりの切断頻度≧６０％である。
－ マルチマッピングスコア：
○ （全ての断片に対して）：≦１００マルチマップの断片のみが、受け入れられる
○ （ｔＲＮＡ断片に対して）：≦１００マルチマップの断片のみが、受け入れられる。これらのうち、我々はｔＲＦを、以下のようにさらに分類する：
・ トランスクリプト特異的（対応するｔＲＮＡトランスクリプト配列に一意にマッピングされるリード）；
・ アイソデコーダー特異的（対応するアンチコドンを有するトランスクリプトに一意にマッピングされるリード）；
・ アイソタイプ特異的（対応するｔＲＮＡアイソタイプのトランスクリプトにのみマッピングされるリード）；
・ アミノ特異的でない（複数のｔＲＮＡアイソタイプにマッピングされるリード）；
・ 具体的には以下のｔＲＦが好ましい：トランスクリプト特異的＞アイソデコーダー特異的＞アイソタイプ特異的。アミノ特異的でないものは、考慮されない。
【0255】
［３′Ｐ－ｑＰＣＲ］
３′Ｐ－ｑＰＣＲは、レトロ転写までのｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析の全てのステップが共通するが、異なるＲＮＡベースのアダプターを使用する。テストされたスモールＲＮＡインプット材料の最小量は、１００ｎｇであった（ＱｕＢｉｔ ｍｉＲＮＡアッセイによって定量）。３′Ｐ－ｑＰＣＲに使用された特異的ＲＮＡベースのアダプターおよびＲＴプライマーは、表２７に示される。３′Ｐ－ｑＰＣＲ増幅のために、各プライマー対は以下のルールに従って設計された：
－ フォワードおよびリバースプライマーは、１５～２３ヌクレオチドの範囲の長さを有し、３′Ｐ ＲＮＡの５′および３′末端での特異性を維持するために、アダプターと目的の３′Ｐ ＲＮＡとの間の接合部に設計されねばならない。
－ フォワードおよびリバースプライマーは、配列特異性を与えるために、目的の３′Ｐ ＲＮＡと少なくとも６ヌクレオチドでアニーリングすべきである。
－ 融解温度は５８℃～６３℃の範囲にすべきであり、各プライマー対のフォワードおよびリバースプライマーの間の差は、最大１．５℃である。
－ フォワードおよびリバースプライマーは、最小限の二次構造を有し、ヘテロおよびホモダイマー形成の可能性がないようにすべきである。
３′Ｐ－ｑＰＣＲは、レトロ転写までのｄａｒｔ－ＲＮＡｓｅｑ解析の全てのステップが共通するが、異なるＲＮＡベースのアダプターを使用する。テストされたスモールＲＮＡインプット材料の最小量は、１００ｎｇであった（ＱｕＢｉｔ ｍｉＲＮＡアッセイによって定量）。３′Ｐ－ｑＰＣＲに使用された特異的ＲＮＡベースのアダプターおよびＲＴプライマーは、表２７に示される。３′Ｐ－ｑＰＣＲ増幅のために、各プライマー対は以下のルールに従って設計された：
－ フォワードおよびリバースプライマーは、１５～２３ヌクレオチドの範囲の長さを有し、３′Ｐ ＲＮＡの５′および３′末端での特異性を維持するために、アダプターと目的の３′Ｐ ＲＮＡとの間の接合部に設計されねばならない。
－ フォワードおよびリバースプライマーは、配列特異性を与えるために、目的の３′Ｐ ＲＮＡと少なくとも６ヌクレオチドでアニーリングすべきである。
－ 融解温度は５８℃～６３℃の範囲にすべきであり、各プライマー対のフォワードおよびリバースプライマーの間の差は、最大１．５℃である。
－ フォワードおよびリバースプライマーは、最小限の二次構造を有し、ヘテロおよびホモダイマー形成の可能性がないようにすべきである。
【0256】
３′Ｐ ＲＮＡ断片の検証に使用されたプライマーのリストは、表２８に記載される。全てのｑＰＣＲ増幅は、ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号４３０９１５５）によって行われた。各３′Ｐ ＲＮＡのＣｔ値は、ＲＮＡベースのアダプターの総量を使用して正規化される。正規化のためのプライマーは、表２８に記載される。
【0257】
【0258】
【0259】
［参考文献一覧］
１． Slamon, D. J. et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 344, 783-92 (2001).
２． Goossens, N., Nakagawa, S., Sun, X. & Hoshida, Y. Cancer biomarker discovery and validation. Transl Cancer Res 4, 256-269 (2015).
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４． Wang, K. et al. Circular RNA mediates cardiomyocyte death via miRNA- dependent upregulation of MTP18 expression. Cell Death Differ 24, 1111-1120 (2017).
５． Honda, S. et al. Sex hormone-dependent tRNA halves enhance cell proliferation in breast and prostate cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences 112, E3816-E3825 (2015).
６． Tang, J. et al. A novel biomarker Linc00974 interacting with KRT19 promotes proliferation and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis 5, e1549-e1549 (2014).
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８． Paik, S. et al. Gene Expression and Benefit of Chemotherapy in Women With Node-Negative, Estrogen Receptor-Positive Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology 24, 3726-3734 (2006).
９． Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T. & He, C. Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. Cell 169, 1187-1200 (2017).
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【配列表】
【外国語明細書】