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特開2025-29509クラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の検出用オリゴヌクレオチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025029509
(43)【公開日】2025-03-06
(54)【発明の名称】クラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の検出用オリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/689 20180101AFI20250227BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20250227BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20250227BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/689 Z
C12N15/31 ZNA
C12M1/34 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023134233
(22)【出願日】2023-08-21
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504171134
【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】松葉 悠真
(72)【発明者】
【氏名】道渕 真史
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 広道
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B029BB20
4B029CC01
4B029FA15
4B029GA03
4B029GA08
4B029GB06
4B029GB10
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ06
4B063QQ28
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ62
4B063QR08
4B063QR33
4B063QR35
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR66
4B063QR72
4B063QR75
4B063QS03
4B063QS24
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】クラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の新規な検出手段及び方法の提供。
【解決手段】クラミジアトラコマチスのｐоｒＢ遺伝子を検出するためのプローブ；当該プローブを含む、クラミジアトラコマチスを検出するための組成物であって、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物；並びに淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブを提供する。
【選択図】なし
【解決手段】クラミジアトラコマチスのｐоｒＢ遺伝子を検出するためのプローブ；当該プローブを含む、クラミジアトラコマチスを検出するための組成物であって、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物；並びに淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブを提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
クラミジアトラコマチスのｐоｒＢ遺伝子を検出するためのプローブ。
【請求項2】
以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、請求項１に記載のプローブ。
（ａ）配列番号９で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（ａ）配列番号９で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
【請求項3】
配列番号２７～３２のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項4】
請求項１～３のいずれかに記載のプローブを含む、クラミジアトラコマチスを検出するための組成物であって、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
【請求項5】
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブが、以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有する、請求項４に記載の組成物。
（ｃ）配列番号８で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（ｃ）配列番号８で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
【請求項6】
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブが、配列番号１２～１５、５６、及び５７のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項7】
淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ｅ）及び（ｆ）の特徴を有するプローブ。
（ｅ）配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ５、又は塩基配列Ｓ５において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ６を含み、かつ、配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列の３７～４３番目の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
（ｆ）前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（ｅ）配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ５、又は塩基配列Ｓ５において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ６を含み、かつ、配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列の３７～４３番目の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
（ｆ）前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
【請求項8】
配列番号４０～４２のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項７に記載のプローブ。
【請求項9】
前記標識が蛍光色素標識である、請求項１～３、７、及び８のいずれかに記載のプローブ。
【請求項10】
前記標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１～３、７、及び８のいずれかに記載のプローブ。
【請求項11】
前記標識されている末端塩基がシトシンである、請求項１～３、７、及び８のいずれかに記載のプローブ。
【請求項12】
クラミジアトラコマチスを検出するための組成物であって、
前記組成物が以下の（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられること、及び／又は、
前記組成物が以下の（Ａ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられることを特徴とする組成物。
（Ａ－１）配列番号３３～３５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ａ－２）配列番号１６～１８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号３６～３８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
（Ｂ－２）配列番号１９～２１のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
前記組成物が以下の（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられること、及び／又は、
前記組成物が以下の（Ａ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられることを特徴とする組成物。
（Ａ－１）配列番号３３～３５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ａ－２）配列番号１６～１８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号３６～３８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
（Ｂ－２）配列番号１９～２１のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
【請求項13】
前記組成物が（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号２７～３２のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記組成物が（Ａ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、（Ｂ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブが、配列番号１２～１５、５６、及び５７のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項15】
淋菌を検出するための組成物であって、
以下の（Ｃ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｄ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ｃ－１）配列番号４３～４５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号４６～４８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
以下の（Ｃ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｄ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ｃ－１）配列番号４３～４５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号４６～４８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
【請求項16】
淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号３９～４２のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
クラミジアトラコマチス及び淋菌を検出するためのキットであって、請求項１２～１４のいずれかに記載の組成物及び請求項１５又は１６に記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（以下ＣＴと略記することがある。）及び／又は淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）を検出するためのオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【0002】
クラミジアトラコマチスは主に性器クラミジア感染症の原因菌であり、男性では尿道炎と精巣上体炎を、女性では子宮頸管炎と骨盤内炎症性疾患を発症する。これらの疾患は性行為により感染、伝播する。クラミジアは、主に泌尿器生殖器に感染し、その患者数は、すべての性感染症で最も多い（非特許文献１）。淋菌は淋菌感染症の原因菌であり、おもに男性の尿道炎、女性の子宮頸管炎を起こす。１回の性行為による感染伝達率は高く、３０％程度と考えられている（非特許文献２）。
【0003】
クラミジアトラコマチスは細胞内寄生性の病原体であり、分離培養には培養細胞が必要とされる。培養法は、淋菌が温度など環境変化に弱いため、検体の保管状況によって感度が著しく低下する（非特許文献２）。培養検査は困難を伴い、一般的な検査室では実施されない。
【0004】
その他の検査法としては抗原抗体反応を利用する方法や核酸増幅法が挙げられる。しかし抗原抗体法については感度が劣ることが指摘されている。
【0005】
現在はクラミジアトラコマチスの検査法としては核酸増幅法が主流になっており、日本国内で体外診断薬として販売されている。代表的なものとしてはＰＣＲを用いたコバス ６８００／８８００ システム ＣＴ／ＮＧ（登録商標、ロシュダイアグノスティックス製）、ＴＭＡ法を用いたアプティマ Ｃｏｍｂｏ２ クラミジア／ゴノレア（登録商標、ホロジックジャパン製）がある。
【0006】
上記の核酸増幅法はいずれも感度特異度とも優れた検査法であると言われている。しかし、いずれも検査に数時間以上かかるという問題点がある。
【0007】
迅速にクラミジアトラコマチスを検出できる核酸増幅法、該核酸増幅法に使用するためのオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブ、並びに上記核酸増幅法を実施するためのキットは特許文献１で開示されている。
【0008】
クラミジアトラコマチスを高感度に検出できる遺伝子としてはクラミジア細胞内に複数存在している内在性プラスミドが一般的である。一方で、海外ではごく少数ではあるものの非特許文献３に示されるように内在性プラスミドを有していないクラミジアトラコマチスも報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】日本性感染症学会誌 第２７巻 第１号 Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
【非特許文献2】日本性感染症学会 性感染症診断・治療ガイドライン２０２０
【非特許文献3】Ｙｅｏｗ， Ｔ．Ｃ．， Ｗｏｎｇ， Ｗ．Ｆ．， Ｓａｂｅｔ， Ｎ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ－ｂｅａｒｉｎｇ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ－ｆｒｅｅ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｗｏｍｅｎ ｗｈｏ ｖｉｓｉｔｅｄ ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｍａｌａｙｓｉａ． ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６， ４５ （２０１６）．
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】特許第６１８２８４４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明はクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の新規な検出手段及び方法を提供することが１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、クラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の新規な検出手段及び方法を見出し、さらに鋭意検討を重ねることにより本発明を完成させるに至った。
【0013】
本発明の代表的な実施形態は次の通りである。
［項１］
クラミジアトラコマチスのｐоｒＢ遺伝子を検出するためのプローブ。
［項２］
以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、項１に記載のプローブ。
（ａ）配列番号９で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項３］
配列番号２７～３２のいずれかで示される塩基配列を含む、項１又は２に記載のプローブ。
［項４］
項１～３のいずれかに記載のプローブを含む、クラミジアトラコマチスを検出するための組成物であって、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
［項５］
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブが、以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有する、項４に記載の組成物。
（ｃ）配列番号８で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項６］
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブが、配列番号１２～１５、５６、及び５７のいずれかで示される塩基配列を含む、項４又は５に記載の組成物。
［項７］
淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ｅ）及び（ｆ）の特徴を有するプローブ。
（ｅ）配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ５、又は塩基配列Ｓ５において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ６を含み、かつ、配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列の３７～４３番目の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
（ｆ）前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項８］
配列番号４０～４２のいずれかで示される塩基配列を含む、項７に記載のプローブ。
［項９］
前記標識が蛍光色素標識である、項１～８のいずれかに記載のプローブ。
［項１０］
前記標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１～９のいずれかに記載のプローブ。
［項１１］
前記標識されている末端塩基がシトシンである、項１～１０のいずれかに記載のプローブ。
［項１２］
クラミジアトラコマチスを検出するための組成物であって、
前記組成物が以下の（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられること、及び／又は、
前記組成物が以下の（Ａ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられることを特徴とする組成物。
（Ａ－１）配列番号３３～３５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ａ－２）配列番号１６～１８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号３６～３８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
（Ｂ－２）配列番号１９～２１のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
［項１３］
前記組成物が（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号２７～３２のいずれかで示される塩基配列を含む、項１２に記載の組成物。
［項１４］
前記組成物が（Ａ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、（Ｂ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブが、配列番号１２～１５、５６、及び５７のいずれかで示される塩基配列を含む、項１２又は１３に記載の組成物。
［項１５］
淋菌を検出するための組成物であって、
以下の（Ｃ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｄ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ｃ－１）配列番号４３～４５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号４６～４８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
［項１６］
淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号３９～４２のいずれかで示される塩基配列を含む、項１５に記載の組成物。
［項１７］
クラミジアトラコマチス及び淋菌を検出するためのキットであって、項１２～１４のいずれかに記載の組成物及び項１５又は１６に記載の組成物を含むキット。
［項１］
クラミジアトラコマチスのｐоｒＢ遺伝子を検出するためのプローブ。
［項２］
以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、項１に記載のプローブ。
（ａ）配列番号９で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項３］
配列番号２７～３２のいずれかで示される塩基配列を含む、項１又は２に記載のプローブ。
［項４］
項１～３のいずれかに記載のプローブを含む、クラミジアトラコマチスを検出するための組成物であって、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
［項５］
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブが、以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有する、項４に記載の組成物。
（ｃ）配列番号８で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項６］
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブが、配列番号１２～１５、５６、及び５７のいずれかで示される塩基配列を含む、項４又は５に記載の組成物。
［項７］
淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ｅ）及び（ｆ）の特徴を有するプローブ。
（ｅ）配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ５、又は塩基配列Ｓ５において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ６を含み、かつ、配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列の３７～４３番目の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
（ｆ）前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項８］
配列番号４０～４２のいずれかで示される塩基配列を含む、項７に記載のプローブ。
［項９］
前記標識が蛍光色素標識である、項１～８のいずれかに記載のプローブ。
［項１０］
前記標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１～９のいずれかに記載のプローブ。
［項１１］
前記標識されている末端塩基がシトシンである、項１～１０のいずれかに記載のプローブ。
［項１２］
クラミジアトラコマチスを検出するための組成物であって、
前記組成物が以下の（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられること、及び／又は、
前記組成物が以下の（Ａ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられることを特徴とする組成物。
（Ａ－１）配列番号３３～３５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ａ－２）配列番号１６～１８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号３６～３８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
（Ｂ－２）配列番号１９～２１のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
［項１３］
前記組成物が（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号２７～３２のいずれかで示される塩基配列を含む、項１２に記載の組成物。
［項１４］
前記組成物が（Ａ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、（Ｂ－２）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブが、配列番号１２～１５、５６、及び５７のいずれかで示される塩基配列を含む、項１２又は１３に記載の組成物。
［項１５］
淋菌を検出するための組成物であって、
以下の（Ｃ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｄ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ｃ－１）配列番号４３～４５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号４６～４８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
［項１６］
淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号３９～４２のいずれかで示される塩基配列を含む、項１５に記載の組成物。
［項１７］
クラミジアトラコマチス及び淋菌を検出するためのキットであって、項１２～１４のいずれかに記載の組成物及び項１５又は１６に記載の組成物を含むキット。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、クラミジアトラコマチ及び／又は淋菌の新規な検出手段及び方法が提供される。当該検出手段及び方法により、例えば高感度に検出を行うことができる。また、本発明によれば、核酸精製工程を経ておらず核酸増幅反応を阻害する生体由来の夾雑物を含み得るような検体試料からでも、検体試料中に含まれるクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌を高感度に検出することが可能である。さらに、本発明によれば、内在性プラスミドを有さないクラミジアトラコマチスに関しても検出することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、本明細書中に記載された非特許文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用され、その全体が明細書に組み込まれる。また、本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。本明細書中の「及び／又は」は、一部又は全部を意味する。本明細書中の「含む」は、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を包含する。
なお、本明細書中に記載された非特許文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用され、その全体が明細書に組み込まれる。また、本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。本明細書中の「及び／又は」は、一部又は全部を意味する。本明細書中の「含む」は、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を包含する。
【0016】
また、本明細書では、核酸プライマーを単にプライマーという場合があり、核酸プローブ及び標識プローブを単にプローブという場合があり、これらを総称してオリゴヌクレオチドともいう。本発明はクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー）及びオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ）、並びにこれらを用いてクラミジアトラコマチスを検出する方法及び該方法を実施するためのキットを包含する。
【0017】
本明細書では、配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、市販のソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス社）を用いて、又は全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出することができる。
【0018】
本発明の一実施形態ではクラミジアトラコマチスの内在性プラスミド、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子の部分領域及び／又は淋菌のｏｐａ遺伝子の部分領域を検出対象としている。クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの部分領域の塩基配列を配列番号１に示す。クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子の部分領域の塩基配列を配列番号２に示す。淋菌のｏｐａ遺伝子の部分領域の塩基配列を配列番号３～７に示す。
【0019】
［１］本発明のオリゴヌクレオチドプローブ
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）～（３）のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチドプローブである。
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）～（３）のいずれかに記載されるオリゴヌクレオチドプローブである。
【0020】
（１）クラミジアトラコマチスのｐоｒＢ遺伝子を検出するためのプローブ。
クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブは、好ましくは以下の（１－１）又は以下の（１－２）のものであり、より好ましくは以下の（１－２）のものである。
（１－１）以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、クラミジアトラコマチスのｐоｒＢ遺伝子を検出するためのプローブ。
（ａ）配列番号９で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（１－２）配列番号２７～３２のいずれかで示される塩基配列を含む、クラミジアトラコマチスのｐоｒＢ遺伝子を検出するためのプローブ。
塩基配列Ｓ１は、配列番号９で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する１０塩基以上、１２塩基以上、１４塩基以上、１６塩基以上、１８塩基以上、又は２０塩基以上の塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列Ｓ１は、配列番号９で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全長であってもよいが、例えば５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下、又は３０塩基以下であってもよい。
塩基配列Ｓ２は、塩基配列Ｓ１において１又は２個（例えば１個）の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列であることが好ましい。
クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブは、好ましくは以下の（１－１）又は以下の（１－２）のものであり、より好ましくは以下の（１－２）のものである。
（１－１）以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、クラミジアトラコマチスのｐоｒＢ遺伝子を検出するためのプローブ。
（ａ）配列番号９で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（１－２）配列番号２７～３２のいずれかで示される塩基配列を含む、クラミジアトラコマチスのｐоｒＢ遺伝子を検出するためのプローブ。
塩基配列Ｓ１は、配列番号９で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する１０塩基以上、１２塩基以上、１４塩基以上、１６塩基以上、１８塩基以上、又は２０塩基以上の塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列Ｓ１は、配列番号９で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全長であってもよいが、例えば５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下、又は３０塩基以下であってもよい。
塩基配列Ｓ２は、塩基配列Ｓ１において１又は２個（例えば１個）の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列であることが好ましい。
【0021】
（２）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブ
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブは、好ましくは以下の（２－１）又は以下の（２－２）のものであり、より好ましくは以下の（２－２）のものである。
（２－１）以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有するクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブ。
（ｃ）配列番号８で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（２－２）配列番号１２～１５、５６、及び５７のいずれかで示される塩基配列を含む、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブ。
塩基配列Ｓ３は、配列番号８で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する１０塩基以上、１５塩基以上、２０塩基以上、又は２５塩基以上の塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列Ｓ３は、配列番号８で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全長であってもよいが、例えば、５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、又は３５塩基以下であってもよい。
塩基配列Ｓ４は、塩基配列Ｓ３において１又は２個（例えば１個）の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列であることが好ましい。
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブは、好ましくは以下の（２－１）又は以下の（２－２）のものであり、より好ましくは以下の（２－２）のものである。
（２－１）以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有するクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブ。
（ｃ）配列番号８で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（２－２）配列番号１２～１５、５６、及び５７のいずれかで示される塩基配列を含む、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブ。
塩基配列Ｓ３は、配列番号８で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する１０塩基以上、１５塩基以上、２０塩基以上、又は２５塩基以上の塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列Ｓ３は、配列番号８で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全長であってもよいが、例えば、５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、又は３５塩基以下であってもよい。
塩基配列Ｓ４は、塩基配列Ｓ３において１又は２個（例えば１個）の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列であることが好ましい。
【0022】
（３）淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブ
淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブは、好ましくは以下の（３－１）又は以下の（３－２）のものであり、より好ましくは以下の（３－２）のものである。
（３－１）以下の（ｅ）及び（ｆ）の特徴を有する淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブ。
（ｅ）配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ５、又は塩基配列Ｓ５において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ６を含み、かつ、配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列の３７～４３番目の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
（ｆ）前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（３－２）配列番号４０～４２のいずれかで示される塩基配列を含む、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブ。
塩基配列Ｓ５は、配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する１０塩基以上、１１塩基以上、１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、又は１５塩基以上の塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列Ｓ５は、配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全長であってもよいが、例えば、５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下であってもよい。
塩基配列Ｓ６は、塩基配列Ｓ５において１又は２個（例えば１個）の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列であることが好ましい。
淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブは、好ましくは以下の（３－１）又は以下の（３－２）のものであり、より好ましくは以下の（３－２）のものである。
（３－１）以下の（ｅ）及び（ｆ）の特徴を有する淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブ。
（ｅ）配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ５、又は塩基配列Ｓ５において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ６を含み、かつ、配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列の３７～４３番目の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
（ｆ）前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（３－２）配列番号４０～４２のいずれかで示される塩基配列を含む、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブ。
塩基配列Ｓ５は、配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する１０塩基以上、１１塩基以上、１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、又は１５塩基以上の塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列Ｓ５は、配列番号１０又は配列番号１１で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全長であってもよいが、例えば、５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下であってもよい。
塩基配列Ｓ６は、塩基配列Ｓ５において１又は２個（例えば１個）の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列であることが好ましい。
【0023】
上記（１）～（３）のオリゴヌクレオチドプローブは核酸が標識されていてもよいし、標識されていなくてもよい。標識される場合、標識される核酸の数に特に制限は無い。好ましくはオリゴヌクレオチドプローブの末端の核酸、好ましくは末端のシトシン塩基が標識されている形態である。より好ましくはオリゴヌクレオチドプローブの末端の核酸のうちどちらか片方のみが標識されている形態である。標識物質にも特に制限はないが、蛍光色素であることがより好ましい。蛍光色素としては特に標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光色素が好ましく、例えばグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素が挙げられる。そのような蛍光色素としては、具体的には、フルオロセイン又はその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＰＹ（商標）シリーズ、ローダミン又はその誘導体（例えば５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））が例示できる。
【0024】
上記（１）～（３）のオリゴヌクレオチドプローブは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば上記（１）のオリゴヌクレオチドプローブは、感度を向上させるため、上記（２）のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いてもよい。クラミジアトラコマチス及び淋菌の両方を検出するため、上記（１）のオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は（２）のオリゴヌクレオチドプローブは、上記（３）のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いてもよい。
【0025】
［２］本発明のオリゴヌクレオチドプライマー
本発明の実施形態の一つは、以下の（４）～（６）に記載されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
本発明の実施形態の一つは、以下の（４）～（６）に記載されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【0026】
（４）クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプライマー
クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプライマーは、その検出が可能な限り特に限定されないが、以下の（Ａ－１）と（Ｂ－１）とを組み合わせたプライマーセットであることが好ましい。
（Ａ－１）配列番号３３～３５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号３６～３８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
第一プライマー（Ａ－１）は、配列番号３３～３５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号３３と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号３４又は配列番号３５が挙げられる。第一プライマー（Ａ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
第二プライマー（Ｂ－１）は、配列番号３６～３８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号３６と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号３７又は配列番号３８が挙げられる。第二プライマー（Ｂ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプライマーは、その検出が可能な限り特に限定されないが、以下の（Ａ－１）と（Ｂ－１）とを組み合わせたプライマーセットであることが好ましい。
（Ａ－１）配列番号３３～３５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号３６～３８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
第一プライマー（Ａ－１）は、配列番号３３～３５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号３３と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号３４又は配列番号３５が挙げられる。第一プライマー（Ａ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
第二プライマー（Ｂ－１）は、配列番号３６～３８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号３６と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号３７又は配列番号３８が挙げられる。第二プライマー（Ｂ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0027】
（５）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプライマー
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプライマーは、その検出が可能な限り特に限定されないが、以下の（Ａ－２）と（Ｂ－２）とを組み合わせたプライマーセットであることが好ましい。
（Ａ－２）配列番号１６～１８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－２）配列番号１９～２１のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
第一プライマー（Ａ－２）は、配列番号１６～１８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号１６と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号１７又は配列番号１８が挙げられる。第一プライマー（Ａ－２）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
第二プライマー（Ｂ－２）は、配列番号１９～２１のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号１９と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号２０又は配列番号２１が挙げられる。第二プライマー（Ｂ－２）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプライマーは、その検出が可能な限り特に限定されないが、以下の（Ａ－２）と（Ｂ－２）とを組み合わせたプライマーセットであることが好ましい。
（Ａ－２）配列番号１６～１８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－２）配列番号１９～２１のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
第一プライマー（Ａ－２）は、配列番号１６～１８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号１６と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号１７又は配列番号１８が挙げられる。第一プライマー（Ａ－２）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
第二プライマー（Ｂ－２）は、配列番号１９～２１のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号１９と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号２０又は配列番号２１が挙げられる。第二プライマー（Ｂ－２）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0028】
（６）淋菌を検出するためのプライマー
淋菌を検出するためのプライマーは、淋菌の検出が可能な限り特に限定されないが、以下の（Ｃ－１）と（Ｄ－１）とを組み合わせたプライマーセットであることが好ましい。
（Ｃ－１）配列番号４３～４５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号４６～４８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
第一プライマー（Ｃ－１）は、配列番号４３～４５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号４３と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号４４又は配列番号４５が挙げられる。第一プライマー（Ｃ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
第二プライマー（Ｄ－１）は、配列番号４６～４８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号４６と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号４７又は配列番号４８が挙げられる。第二プライマー（Ｄ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
淋菌を検出するためのプライマーは、淋菌の検出が可能な限り特に限定されないが、以下の（Ｃ－１）と（Ｄ－１）とを組み合わせたプライマーセットであることが好ましい。
（Ｃ－１）配列番号４３～４５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号４６～４８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
第一プライマー（Ｃ－１）は、配列番号４３～４５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号４３と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号４４又は配列番号４５が挙げられる。第一プライマー（Ｃ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
第二プライマー（Ｄ－１）は、配列番号４６～４８のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号４６と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号４７又は配列番号４８が挙げられる。第二プライマー（Ｄ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0029】
［３－（１）］本発明のクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の検出方法
本発明のクラミジアトラコマチス又は淋菌の検出方法は、以下の（１）～（３）の工程を含むことが好ましい。
（１）上記で説明したオリゴヌクレオチドプライマーセットのうち少なくとも１セットを用いて試料中に存在し得るクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌由来の核酸の増幅を行う工程。
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程。
本発明のクラミジアトラコマチス又は淋菌の検出方法は、以下の（１）～（３）の工程を含むことが好ましい。
（１）上記で説明したオリゴヌクレオチドプライマーセットのうち少なくとも１セットを用いて試料中に存在し得るクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌由来の核酸の増幅を行う工程。
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程。
【0030】
上記方法は、以下の（１Ａ）、（１Ｂ）、（２Ａ）、及び（３Ａ）に示す工程を含むことがより好ましい。
（１Ａ）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミド、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子、及び淋菌のｏｐａ遺伝子のうち少なくともいずれか一つを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを用意する工程。
（１Ｂ）被検核酸及び工程（１Ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程。
（２Ａ）工程（１Ｂ）によって得られた核酸増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３Ａ）工程（２Ａ）で得られた複合体を検出する工程。
（１Ａ）クラミジアトラコマチスの内在性プラスミド、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子、及び淋菌のｏｐａ遺伝子のうち少なくともいずれか一つを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを用意する工程。
（１Ｂ）被検核酸及び工程（１Ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程。
（２Ａ）工程（１Ｂ）によって得られた核酸増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３Ａ）工程（２Ａ）で得られた複合体を検出する工程。
【0031】
本発明における実施態様の一つとして、クラミジアトラコマチスを検出するためのプライマーセット及びプローブを組み合わせて使用してもよい。また、淋菌を検出するためのプライマーセット及びプローブを組み合わせて使用してもよい。組み合わせは原則任意であるが、好ましくは、以下（Ｉ）～（III）のいずれかである。
（Ｉ）上記（Ａ－２）の第一プライマーと上記（Ｂ－２）第二プライマーとからなる一対のプライマーセット、及び、上記（２）のオリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは配列番号８で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）の組み合わせ。
（II）上記（Ａ－１）の第一プライマー（Ａ－１）と上記（Ｂ－１）の第二プライマーとからなる一対のプライマーセット、及び、上記（１）のオリゴヌレオチドプローブ（好ましくは配列番号９で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）の組み合わせ。
（III）上記（Ｃ－１）の第一プライマーと上記（Ｄ－１）の第二プライマーとからなる一対のプライマーセット、及び、上記（３）のオリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは配列番号１０もしくは１１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）の組み合わせ。
（Ｉ）上記（Ａ－２）の第一プライマーと上記（Ｂ－２）第二プライマーとからなる一対のプライマーセット、及び、上記（２）のオリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは配列番号８で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）の組み合わせ。
（II）上記（Ａ－１）の第一プライマー（Ａ－１）と上記（Ｂ－１）の第二プライマーとからなる一対のプライマーセット、及び、上記（１）のオリゴヌレオチドプローブ（好ましくは配列番号９で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）の組み合わせ。
（III）上記（Ｃ－１）の第一プライマーと上記（Ｄ－１）の第二プライマーとからなる一対のプライマーセット、及び、上記（３）のオリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは配列番号１０もしくは１１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）の組み合わせ。
【0032】
また、本発明における実施態様の一つとして、クラミジアトラコマチスを検出するためのプライマーセット及びプローブと淋菌を検出するためのプライマーセット及びプローブとを組み合わせて、クラミジアトラコマチス及び淋菌の両方を検出するために使用してもよい。組み合わせは原則任意であるが、好ましくは上記（Ｉ）及び（III）の組合せ、上記（II）及び（III）の組合せ、又は上記（Ｉ）～（III）の組み合わせである。
【0033】
［３－（２）］被検核酸の増幅
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【0034】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、クラミジアトラコマチス及び／又は淋菌を寄生させた細胞培養試料や生体試料等の試料に含まれる核酸が挙げられる。
【0035】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、生殖器や咽頭をぬぐったスワブ、あるいは該スワブに付着したぬぐい液、尿、うがい液などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法を採用できる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法を採用できる。
【0036】
被検核酸を鋳型として、上述のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させることが好ましい。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【0037】
本発明のクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の検出方法における核酸の増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【0038】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、好ましくはα型ＤＮＡポリメラーゼである。その理由を以下に説明する。
【0039】
本発明プローブが含まれる反応系でクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌に含まれるＤＮＡを増幅する場合、核酸増幅工程中に該オリゴヌクレオチドプローブが試料のクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌に含まれるＤＮＡ遺伝子やその増幅産物と結合しうる。
【0040】
ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’－３’エキソヌクレアーゼ活性は持たず、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いればプローブの分解を防止することができ、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【0041】
ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
【0042】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型及び／又は変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡製、登録商標）」、「ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製、登録商標）」、「ＫＯＤ －Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ－（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｏｎｅ（東洋紡製、登録商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－が望ましい。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡製、登録商標）」、「ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製、登録商標）」、「ＫＯＤ －Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ－（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｏｎｅ（東洋紡製、登録商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－が望ましい。
【0043】
［３－（３）］クラミジアトラコマチス及び／又は淋菌由来の核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
本発明のクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の検出方法においては、上記で説明した被検核酸の増幅によって得られた増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめることが好ましい。
本発明のクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の検出方法においては、上記で説明した被検核酸の増幅によって得られた増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめることが好ましい。
【0044】
核酸増幅産物を含む試料にオリゴヌクレオチドプローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中及び核酸増幅反応後のいずれの反応系に添加してもよい。中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素やリン酸基を付加したりすることが好ましい。
【0045】
［３－（４）］核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
上記で得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
上記で得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
【0046】
融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【0047】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のオリゴヌクレオチドプローブに標識を付加した場合は該標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。
【0048】
標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、又は、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブが挙げられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。
【0049】
標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【0050】
前記蛍光色素は特に制限されないが、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素として、例えば、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素を挙げることができ、本発明にはこれらの蛍光消光色素が好適に使用され得る。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅは、検出波長４５０～４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５～７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹＦＬは、検出波長５１５～５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【0051】
本発明のクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌の検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【0052】
得られた増幅産物の解離、及び、解離により得られた一本鎖核酸と前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【0053】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５～９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒～１０分であり、好ましくは１秒～５分である。
【0054】
また、解離した一本鎖核酸と前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５～５０℃である。
【0055】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、前記核酸の濃度は、例えば、０．０１～１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１～１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記核酸に対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１～１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１～１０μｍｏｌ／Ｌである。
【0056】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定することが好ましい。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖核酸と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖核酸とハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（又は消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（又は消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【0057】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温～８５℃であり、好ましくは２５～７０℃であり、終了温度は、例えば、４０～１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５～２０℃／秒であり、好ましくは０．０８～５℃／秒である。
【0058】
被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナルの変動を測定することによって行いうる。具体的には、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定することが好ましい。
【0059】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖核酸と標識化プローブが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（又は消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【0060】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【0061】
［４］クラミジアトラコマチス及び／又は淋菌を検出するための組成物及びキット
別の実施形態では、上述のクラミジアトラコマチスを検出するためのプローブを含む、クラミジアトラコマチスを検出するための組成物であって、上述のクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物が提供される。
別の実施形態では、上記（Ａ－１）の第一プライマーと、上記（Ｂ－１）の第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、上述のクラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するための組成物及びキットが提供される。
別の実施形態では、上記（Ａ－２）の第一プライマーと、上記（Ｂ－２）の第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、上述のクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するための組成物及びキットが提供される。
別の実施形態では、上記（Ｃ－１）の第一プライマーと、上記（Ｄ－１）の第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するための組成物及びキットが提供される。
別の実施形態では、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するための組成物、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するための組成物、及び／又は、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するための組成物を含む、クラミジアトラコマチス及び／又は淋菌を検出するための組成物及びキットが提供される。
上記キットは、構成成分の一部又は全部を同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法等に関する情報を含む態様で提供することができる。また、上記キットは、陽性コントロール液及び／又は陰性コントロール液を含めることもできる。
別の実施形態では、上述のクラミジアトラコマチスを検出するためのプローブを含む、クラミジアトラコマチスを検出するための組成物であって、上述のクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物が提供される。
別の実施形態では、上記（Ａ－１）の第一プライマーと、上記（Ｂ－１）の第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、上述のクラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するための組成物及びキットが提供される。
別の実施形態では、上記（Ａ－２）の第一プライマーと、上記（Ｂ－２）の第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、上述のクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するための組成物及びキットが提供される。
別の実施形態では、上記（Ｃ－１）の第一プライマーと、上記（Ｄ－１）の第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するための組成物及びキットが提供される。
別の実施形態では、クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子を検出するための組成物、クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドを検出するための組成物、及び／又は、淋菌のｏｐａ遺伝子を検出するための組成物を含む、クラミジアトラコマチス及び／又は淋菌を検出するための組成物及びキットが提供される。
上記キットは、構成成分の一部又は全部を同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法等に関する情報を含む態様で提供することができる。また、上記キットは、陽性コントロール液及び／又は陰性コントロール液を含めることもできる。
【実施例0062】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0063】
［実施例１：クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの検出］
（１－１）方法
クラミジアトラコマチスを高感度に検出できる領域を探索するために、クラミジアトラコマチス不活化菌液を１反応あたり２０コピー使用し、配列番号１２～１５に示される計４個オリゴヌクレオチドプローブを用いてクラミジアトラコマチスの検出を確認した。特許文献１で報告されているクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの領域を検出の比較対象とした。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
（１－１）方法
クラミジアトラコマチスを高感度に検出できる領域を探索するために、クラミジアトラコマチス不活化菌液を１反応あたり２０コピー使用し、配列番号１２～１５に示される計４個オリゴヌクレオチドプローブを用いてクラミジアトラコマチスの検出を確認した。特許文献１で報告されているクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの領域を検出の比較対象とした。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
【0064】
（１－２）反応液
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１７、２２、及び２３のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１９、２４、及び２５のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１２～１５及び２６のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１７、２２、及び２３のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１９、２４、及び２５のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１２～１５及び２６のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
【0065】
（１－３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0066】
（１―４）結果
配列番号１２～１５に基づき設計したプローブを含む計４個のオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブのセットは比較対象と比べて低濃度試料の検出率が高く、検出系として優れていることが分かった。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。特許文献１とは異なる領域以外で内在性プラスミド検出系を構築することでクラミジアトラコマチスをより高感度に検出できる可能性を見出した。
配列番号１２～１５に基づき設計したプローブを含む計４個のオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブのセットは比較対象と比べて低濃度試料の検出率が高く、検出系として優れていることが分かった。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。特許文献１とは異なる領域以外で内在性プラスミド検出系を構築することでクラミジアトラコマチスをより高感度に検出できる可能性を見出した。
【0067】
【表1】
【0068】
［実施例２：クラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの検出］
（２―１）方法
実施例１で見出したクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの領域でより高感度クラミジアトラコマチスを検出できるプライマーセットを探索した。クラミジアトラコマチス不活化菌液を１反応あたり１０コピー使用し、配列番号１６～２１に基づき設計したオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブのセットでクラミジアトラコマチスの検出を確認した。比較対象として特許文献１で報告されているクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの領域に対してもプライマーセットの組み合わせにより高感度に検出できないか調査した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
（２―１）方法
実施例１で見出したクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの領域でより高感度クラミジアトラコマチスを検出できるプライマーセットを探索した。クラミジアトラコマチス不活化菌液を１反応あたり１０コピー使用し、配列番号１６～２１に基づき設計したオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブのセットでクラミジアトラコマチスの検出を確認した。比較対象として特許文献１で報告されているクラミジアトラコマチスの内在性プラスミドの領域に対してもプライマーセットの組み合わせにより高感度に検出できないか調査した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
【0069】
（２－２）反応液
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１６～１８及び４９～５１のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１９、２０、５２、及び５３のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１５及び５４～５７のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１６～１８及び４９～５１のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１９、２０、５２、及び５３のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１５及び５４～５７のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
【0070】
（２－３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0071】
（２―４）結果
配列番号１６～２１に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１５、５６、及び５７に基づき設計したオリゴヌクレオチドプローブのセットは比較対象と比べて低濃度試料の検出率が高く、検出系として優れていることが分かった。
配列番号１６～２１に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号１５、５６、及び５７に基づき設計したオリゴヌクレオチドプローブのセットは比較対象と比べて低濃度試料の検出率が高く、検出系として優れていることが分かった。
【0072】
【表2】
【0073】
［実施例３：クラミジアトラコマチスのｐｏｒＢ遺伝子の検出］
（３―１）方法
クラミジアトラコマチスを高感度に検出できる領域を探索するために、クラミジアトラコマチス不活化菌液を１反応あたり２０コピー使用し、配列番号３３～３８に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせたプライマーセットでクラミジアトラコマチスの検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
（３―１）方法
クラミジアトラコマチスを高感度に検出できる領域を探索するために、クラミジアトラコマチス不活化菌液を１反応あたり２０コピー使用し、配列番号３３～３８に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせたプライマーセットでクラミジアトラコマチスの検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
【0074】
（３－２）反応液
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３３～３５のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３６～３８のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３２）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３３～３５のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３６～３８のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３２）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
【0075】
（３―３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0076】
（３―４）結果
配列番号３３～３８に基づき設計した計６種のオリゴヌクレオチドプライマーの中で低濃度試料の検出感度が優れている組み合わせが分かった。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。ｐｏｒＢ遺伝子検出系を用いることにより、内在性プラスミドを有さないクラミジアトラコマチスに対しても検出できることが示された。
配列番号３３～３８に基づき設計した計６種のオリゴヌクレオチドプライマーの中で低濃度試料の検出感度が優れている組み合わせが分かった。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。ｐｏｒＢ遺伝子検出系を用いることにより、内在性プラスミドを有さないクラミジアトラコマチスに対しても検出できることが示された。
【0077】
【表3】
【0078】
［実施例４：淋菌のｏｐａ遺伝子の検出］
（４―１）方法
淋菌を高感度に検出できる領域を探索するために、淋菌のｇＤＮＡを１反応あたり５コピー使用し、配列番号４３及び４５～４７に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号３９～４２のオリゴヌクレオチドプローブのセットで淋菌の検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
（４―１）方法
淋菌を高感度に検出できる領域を探索するために、淋菌のｇＤＮＡを１反応あたり５コピー使用し、配列番号４３及び４５～４７に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号３９～４２のオリゴヌクレオチドプローブのセットで淋菌の検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
【0079】
（４－２）反応液
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４３及び４５のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４６及び４７のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３９～４２のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４３及び４５のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４６及び４７のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３９～４２のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
【0080】
（４―３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0081】
（４―４）結果
配列番号４３及び４５～４７に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号３９～４２のオリゴヌクレオチドプローブのセットの中で低濃度試料の検出感度が優れている組み合わせが分かった。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。
配列番号４３及び４５～４７に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号３９～４２のオリゴヌクレオチドプローブのセットの中で低濃度試料の検出感度が優れている組み合わせが分かった。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。
【0082】
【表4】
【0083】
［実施例５：１反応系での複数菌種の検出］
（５―１）方法
淋菌とクラミジアトラコマチスを１反応系で高感度に検出できるプライマー・プローブの組み合わせを探索するために、淋菌あるいはクラミジアトラコマチスのｇＤＮＡを１反応あたり５コピー使用し、配列番号４１～４８、１４、１５、１７～１９、２１、３１～３４、３６、及び３８に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブのセットで淋菌あるいはクラミジアトラコマチスの検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
（５―１）方法
淋菌とクラミジアトラコマチスを１反応系で高感度に検出できるプライマー・プローブの組み合わせを探索するために、淋菌あるいはクラミジアトラコマチスのｇＤＮＡを１反応あたり５コピー使用し、配列番号４１～４８、１４、１５、１７～１９、２１、３１～３４、３６、及び３８に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブのセットで淋菌あるいはクラミジアトラコマチスの検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
【0084】
（５－２）反応液
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ 淋菌ｏｐａ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４１及び４２のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ 淋菌ｏｐａ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４３～４５のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ 淋菌ｏｐａ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号４６～４８のいずれか１本）０．３μＬ
１０μＭ クラミジアトラコマチス内在性プラスミド増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１４及び１５のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ クラミジアトラコマチス内在性プラスミド増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１７及び１８のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ クラミジアトラコマチス内在性プラスミド検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１９及び２１のいずれか１本）０．３μＬ
１０μＭ クラミジアトラコマチスｐоｒＢ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３１及び３２のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ クラミジアトラコマチスｐоｒＢ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３３及び３４のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ クラミジアトラコマチスｐоｒＢ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３６及び３８のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ 淋菌ｏｐａ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４１及び４２のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ 淋菌ｏｐａ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４３～４５のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ 淋菌ｏｐａ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号４６～４８のいずれか１本）０．３μＬ
１０μＭ クラミジアトラコマチス内在性プラスミド増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１４及び１５のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ クラミジアトラコマチス内在性プラスミド増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１７及び１８のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ クラミジアトラコマチス内在性プラスミド検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１９及び２１のいずれか１本）０．３μＬ
１０μＭ クラミジアトラコマチスｐоｒＢ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３１及び３２のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ クラミジアトラコマチスｐоｒＢ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３３及び３４のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ クラミジアトラコマチスｐоｒＢ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３６及び３８のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
【0085】
（５―３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0086】
（５―４）結果
淋菌ｏｐａ遺伝子検出系、クラミジアトラコマチス内在性プラスミド検出系、クラミジアトラコマチスｐоｒＢ遺伝子検出系のオリゴヌクレオチドの組み合わせの中で低濃度試料の検出感度が優れている組み合わせが分かった。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。
淋菌ｏｐａ遺伝子検出系、クラミジアトラコマチス内在性プラスミド検出系、クラミジアトラコマチスｐоｒＢ遺伝子検出系のオリゴヌクレオチドの組み合わせの中で低濃度試料の検出感度が優れている組み合わせが分かった。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。
【0087】
【表5】
【産業上の利用可能性】
【0088】
本発明をクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌検査に利用することで、例えば迅速性及び正確性の両方に優れ、なおかつ高感度にクラミジアトラコマチス及び／又は淋菌を検出することができる。また、本発明はプライマーセットやプローブを任意に組み合わせた１反応系で複数菌種を同時に検出することができるため、クラミジアトラコマチス及び／又は淋菌を簡便に検査することが可能になる。
【配列表】