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特開2025-29510膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウム検出用オリゴヌクレオチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025029510
(43)【公開日】2025-03-06
(54)【発明の名称】膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウム検出用オリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6893 20180101AFI20250227BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20250227BHJP
C12N 15/30 20060101ALN20250227BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6893 Z ZNA
C12Q1/689 Z
C12N15/30
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023134234
(22)【出願日】2023-08-21
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504171134
【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】松葉 悠真
(72)【発明者】
【氏名】道渕 真史
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 広道
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ43
4B063QQ50
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの新規な検出手段及び方法の提供。
【解決手段】膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ａ）の特徴を有するプローブを提供する。
（ａ）特定の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチドであって、５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
また、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブを提供する。
【選択図】なし
【解決手段】膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ａ）の特徴を有するプローブを提供する。
（ａ）特定の塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチドであって、５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
また、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブを提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有するプローブ。
（ａ）配列番号５で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（ａ）配列番号５で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
【請求項2】
配列番号９又は１０で示される塩基配列を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項3】
マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有するプローブ。
（ｃ）配列番号６～８及び３０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（ｃ）配列番号６～８及び３０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
【請求項4】
配列番号２０～２２のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項３に記載のプローブ。
【請求項5】
前記標識が蛍光色素標識である、請求項１～４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項6】
前記標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１～４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項7】
前記標識されている末端塩基がシトシンである、請求項１～４のいずれかに記載のプローブ。
【請求項8】
膣トリコモナスを検出するための組成物であって、
以下の（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ａ－１）配列番号１１～１４のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号１５～１９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
以下の（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ａ－１）配列番号１１～１４のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号１５～１９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
【請求項9】
膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号９又は１０で示される塩基配列を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
マイコプラズマジェニタリウムを検出するための組成物であって、
以下の（Ｃ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｄ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ｃ－１）配列番号２３～２５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号２６～２９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
以下の（Ｃ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｄ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ｃ－１）配列番号２３～２５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号２６～２９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
【請求項11】
マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号２０～２２のいずれかで示される塩基配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
膣トリコモナス及びマイコプラズマジェニタリウムを検出するためのキットであって、請求項８又は９に記載の組成物及び請求項１０又は１１に記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及び／又はマイコプラズマジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇeｎｉｔａｌｉｕｍ）を検出するためのオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【0002】
性感染症は性的接触によって感染する病気であり、無症状や自覚しない軽症の場合も多く、感染がいつの間にか広がってしまうという問題がある。性感染症を引き起こす原因微生物としては、クラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎeｉｓｓeｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏeａe）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ）、マイコプラズマジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇeｎｉｔａｌｉｕｍ）が代表例として挙げられる。更に、その他の原因微生物として、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕｒeａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ、Ｕｒeａｐｌａｓｍａ ｕｒeａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｒeｐｏｎeｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ等も知られている。
【0003】
これらの性感染症を引き起こす原因微生物のうち、トリコモナス原虫は膣炎、尿道炎、膀胱炎等を引き起こすことが報告されており、これを簡便、迅速、高感度に検出することは臨床診断上重要である。トリコモナス原虫の検査方法としては、これまでに顕微鏡検査、培養検査、遺伝子検査が開発されている。これらの検査方法のうち、顕微鏡検査が最も主流とされているが、検査の精度は鏡検者のスキルと機器の品質に依存するという問題がある。また、最近では顕微鏡検査では感度が不足していることも懸念されている。それに対して、遺伝子検査はトリコモナス原虫を迅速に感度よく検査でき、作業者のスキルの影響を受けにくい特徴がある（非特許文献１）。
【0004】
男性尿道炎の主な原因微生物として、クラミジアトラコマチスや淋菌が広く知られている。一方で、非淋菌尿道炎患者の１４～１６％からマイコプラズマジェニタリウムが検出されることもあり、マイコプラズマジェニタリウム尿道炎と診断される。また、マイコプラズマジェニタリウムは尿道炎だけでなく、子宮頸管炎等を引き起こすことも報告されている（非特許文献２）。これを簡便、迅速、高感度に検出することは臨床診断上重要である。マイコプラズマジェニタリウムの検査法としては核酸増幅法が主流になっており、日本国内で体外診断薬として販売されている。代表的なものとしてはＰＣＲを用いたコバス ６８００／８８００ システムＴＶ／ＭＧ（登録商標、ロシュダイアグノスティックス製）がある。研究用試薬としてはＴＭＡ法を用いたアプティマ マイコプラズマ ジェニタリウムＡｓｓａｙ（登録商標、ホロジックジャパン製）がある。
【0005】
上記の核酸増幅法はいずれも感度特異度とも優れた検査法であると言われている。しかし、いずれにも検査時間が数時間以上かかるという問題点がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｉｓｓａ，Ｒ．Ｍ．eｔ ａｌ．，Ｉｒａｎｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆeｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓeａｓeｓ，２００６；１（４）：１７１－１７５
【非特許文献2】日本性感染症学会 性感染症診断・治療ガイドライン２０２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの新規な検出手段及び方法を提供することが１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの新規な検出手段及び方法を見出し、さらに鋭意検討を重ねることにより本発明を完成させるに至った。
【0009】
本発明の代表的な実施形態は次の通りである。
［項１］
膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有するプローブ。
（ａ）配列番号５で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項２］
配列番号９又は１０で示される塩基配列を含む、項１に記載のプローブ。
［項３］
マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有するプローブ。
（ｃ）配列番号６～８及び３０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項４］
配列番号２０～２２のいずれかで示される塩基配列を含む、項３に記載のプローブ。
［項５］
前記標識が蛍光色素標識である、項１～４のいずれかに記載のプローブ。
［項６］
前記標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、項１～５のいずれかに記載のプローブ。
［項７］
前記標識されている末端塩基がシトシンである、項１～６のいずれかに記載のプローブ。
［項８］
膣トリコモナスを検出するための組成物であって、
以下の（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ａ－１）配列番号１１～１４のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号１５～１９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
［項９］
膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号９又は１０で示される塩基配列を含む、項８に記載の組成物。
［項１０］
マイコプラズマジェニタリウムを検出するための組成物であって、
以下の（Ｃ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｄ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ｃ－１）配列番号２３～２５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号２６～２９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
［項１１］
マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号２０～２２のいずれかで示される塩基配列を含む、項１０に記載の組成物。
［項１２］
膣トリコモナス及びマイコプラズマジェニタリウムを検出するためのキットであって、項８又は９に記載の組成物及び項１０又は１１に記載の組成物を含むキット。
［項１］
膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有するプローブ。
（ａ）配列番号５で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項２］
配列番号９又は１０で示される塩基配列を含む、項１に記載のプローブ。
［項３］
マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブであって、以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有するプローブ。
（ｃ）配列番号６～８及び３０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項４］
配列番号２０～２２のいずれかで示される塩基配列を含む、項３に記載のプローブ。
［項５］
前記標識が蛍光色素標識である、項１～４のいずれかに記載のプローブ。
［項６］
前記標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、項１～５のいずれかに記載のプローブ。
［項７］
前記標識されている末端塩基がシトシンである、項１～６のいずれかに記載のプローブ。
［項８］
膣トリコモナスを検出するための組成物であって、
以下の（Ａ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｂ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ａ－１）配列番号１１～１４のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号１５～１９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
［項９］
膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号９又は１０で示される塩基配列を含む、項８に記載の組成物。
［項１０］
マイコプラズマジェニタリウムを検出するための組成物であって、
以下の（Ｃ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第一プライマーと、以下の（Ｄ－１）に示す中から選択される少なくとも１つの第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物。
（Ｃ－１）配列番号２３～２５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号２６～２９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
［項１１］
マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブが、配列番号２０～２２のいずれかで示される塩基配列を含む、項１０に記載の組成物。
［項１２］
膣トリコモナス及びマイコプラズマジェニタリウムを検出するためのキットであって、項８又は９に記載の組成物及び項１０又は１１に記載の組成物を含むキット。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの新規な検出手段及び方法が提供される。当該検出手段及び方法により、例えば高感度に検出を行うことができる。また、本発明によれば、核酸精製工程を経ておらず核酸増幅反応を阻害する生体由来の夾雑物を含み得るような検体試料からでも、検体試料中に含まれる膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムを高感度に検出することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、本明細書中に記載された非特許文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用され、その全体が明細書に組み込まれる。また、本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。本明細書中の「及び／又は」は、一部又は全部を意味する。本明細書中の「含む」は、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を包含する。
なお、本明細書中に記載された非特許文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用され、その全体が明細書に組み込まれる。また、本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。本明細書中の「及び／又は」は、一部又は全部を意味する。本明細書中の「含む」は、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を包含する。
【0012】
また、本明細書では、核酸プライマーを単にプライマーという場合があり、核酸プローブ及び標識プローブを単にプローブという場合があり、これらを総称してオリゴヌクレオチドともいう。本発明は膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー）及びオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ）、並びにこれらを用いて膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムを検出する方法及び該方法を実施するためのキットを包含する。
【0013】
本明細書では、配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、市販のソフトウェアＧEＮEＴＹＸ（株式会社ゼネティックス社）を用いて、又は全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍeｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出することができる。
【0014】
本発明の一実施形態では膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子領域及び／又はマイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子の部分領域を検出対象としている。膣トリコモナスの５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の部分領域の塩基配列を配列番号１に示す。マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子の部分領域の塩基配列を配列番号２～４に示す。
【0015】
［１］本発明のオリゴヌクレオチドプローブ
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）及び（２）に記載されるオリゴヌクレオチドプローブである。
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）及び（２）に記載されるオリゴヌクレオチドプローブである。
【0016】
（１）膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブ
膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブは、好ましくは以下の（１－１）又は以下の（１－２）のものであり、より好ましくは以下の（１－２）のものである。
（１－１）以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブ。
（ａ）配列番号５で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（１－２）配列番号９又は１０で示される塩基配列を含む、膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブ。
塩基配列Ｓ１は、配列番号５で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する１０塩基以上、１１塩基以上、１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、又は１５塩基以上の塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列Ｓ１は、配列番号５で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全長であってもよいが、例えば５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下であってもよい。
塩基配列Ｓ２は、塩基配列Ｓ１において１又は２個（例えば１個）の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列であることが好ましい。
膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブは、好ましくは以下の（１－１）又は以下の（１－２）のものであり、より好ましくは以下の（１－２）のものである。
（１－１）以下の（ａ）及び（ｂ）の特徴を有する、膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブ。
（ａ）配列番号５で示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ１、又は塩基配列Ｓ１において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ２を含むオリゴヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（１－２）配列番号９又は１０で示される塩基配列を含む、膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブ。
塩基配列Ｓ１は、配列番号５で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する１０塩基以上、１１塩基以上、１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、又は１５塩基以上の塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列Ｓ１は、配列番号５で示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全長であってもよいが、例えば５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下であってもよい。
塩基配列Ｓ２は、塩基配列Ｓ１において１又は２個（例えば１個）の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列であることが好ましい。
【0017】
（２）マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブ
マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブは、好ましくは以下の（２－１）又は以下の（２－２）のものであり、より好ましくは以下の（２－２）のものである。
（２－１）以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有するマイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブ。
（ｃ）配列番号６～８及び３０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（２－２）配列番号２０～２２のいずれかで示される塩基配列を含む、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブ。
塩基配列Ｓ３は、配列番号６～８及び３０のいずれかで示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する１０塩基以上、１１塩基以上、１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、又は１５塩基以上の塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列Ｓ３は、配列番号６～８のいずれかで示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全長であってもよいが、例えば５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下であってもよい。
塩基配列Ｓ４は、塩基配列Ｓ３において１又は２個（例えば１個）の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列であることが好ましい。
マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブは、好ましくは以下の（２－１）又は以下の（２－２）のものであり、より好ましくは以下の（２－２）のものである。
（２－１）以下の（ｃ）及び（ｄ）の特徴を有するマイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブ。
（ｃ）配列番号６～８及び３０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列Ｓ３、又は塩基配列Ｓ３において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列Ｓ４を含むオリゴヌクレオチド。
（ｄ）前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
（２－２）配列番号２０～２２のいずれかで示される塩基配列を含む、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブ。
塩基配列Ｓ３は、配列番号６～８及び３０のいずれかで示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列において連続する１０塩基以上、１１塩基以上、１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、又は１５塩基以上の塩基配列であることが好ましい。また、塩基配列Ｓ３は、配列番号６～８のいずれかで示される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の全長であってもよいが、例えば５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下であってもよい。
塩基配列Ｓ４は、塩基配列Ｓ３において１又は２個（例えば１個）の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列であることが好ましい。
【0018】
配列番号５で示される塩基配列は配列番号１で示される塩基配列の一部分である。配列番号５の塩基配列は膣トリコモナスに特異的である。従って、配列番号５で示される塩基配列の一部又は全部をオリゴヌクレオチドプローブとすることで、膣トリコモナスのみを特異的に検出することが可能である。
【0019】
配列番号６で示される塩基配列は配列番号２～４のいずれかで示される塩基配列の一部分ではないが、ｍｇＰａ遺伝子はマルチコピーの遺伝子であるためマイコプラズマジェニタリウムのゲノム中に複数のコピー数の保存領域を有しており、それらの保存領域は互いに同一の核酸配列を有することもあれば、１～数塩基（例えば１～３塩基）の核酸が置換、欠失、挿入若しくは付加された核酸配列を有することもあるため、このような保存領域のうちの１つの核酸配列と同一でありうる。配列番号６の塩基配列はマイコプラズマジェニタリウムに特異的である。従って、配列番号６で示される塩基配列の一部又は全部をオリゴヌクレオチドプローブとすることで、マイコプラズマジェニタリウムのみを特異的に検出することが可能である。
【0020】
配列番号７で示される塩基配列は配列番号３で示される塩基配列の一部分である。配列番号７の塩基配列はマイコプラズマジェニタリウムに特異的である。従って、配列番号７で示される塩基配列の一部又は全部をオリゴヌクレオチドプローブとすることで、マイコプラズマジェニタリウムのみを特異的に検出することが可能である。
【0021】
配列番号８で示される塩基配列は配列番号４で示される塩基配列の一部分である。配列番号８の塩基配列はマイコプラズマジェニタリウムに特異的である。従って、配列番号８で示される塩基配列の一部又は全部をオリゴヌクレオチドプローブとすることで、マイコプラズマジェニタリウムのみを特異的に検出することが可能である。
【0022】
配列番号３０で示される塩基配列は配列番号４で示される塩基配列の一部分である。配列番号３０の塩基配列はマイコプラズマジェニタリウムに特異的である。従って、配列番号３０で示される塩基配列の一部又は全部をオリゴヌクレオチドプローブとすることで、マイコプラズマジェニタリウムのみを特異的に検出することが可能である。
【0023】
上記（１）及び（２）のオリゴヌクレオチドプローブは核酸が標識されていてもよいし、標識されていなくてもよい。標識される場合、標識される核酸の数に特に制限は無い。好ましくはオリゴヌクレオチドプローブの末端の核酸、好ましくは末端のシトシン塩基が標識されている形態である。より好ましくはオリゴヌクレオチドプローブの末端の核酸のうちどちらか片方のみが標識されている形態である。標識物質にも特に制限はないが、蛍光色素であることがより好ましい。蛍光色素としては特に標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光色素が好ましく、例えばグアニンとの相互作用により消光する蛍光色素が挙げられる。そのような蛍光色素としては、具体的には、フルオロセイン又はその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＰＹ（商標）シリーズ、ローダミン又はその誘導体（例えば５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））が例示できる。
【0024】
上記（１）及び（２）のオリゴヌクレオチドプローブは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば上記（１）のオリゴヌクレオチドプローブは、上記（２）のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いてもよい。
【0025】
［２］本発明のオリゴヌクレオチドプライマー
本発明の実施形態の一つは、以下の（３）及び（４）に記載されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
本発明の実施形態の一つは、以下の（３）及び（４）に記載されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【0026】
（３）膣トリコモナスを検出するためのプライマー
膣トリコモナスを検出するためのプライマーは、その検出が可能な限り特に限定されないが、以下の（Ａ－１）と（Ｂ－１）とを組み合わせたプライマーセットであることが好ましい。
（Ａ－１）配列番号１１～１４のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号１５～１９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
第一プライマー（Ａ－１）は、配列番号１１～１４のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号１１と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４が挙げられる。第一プライマー（Ａ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
第二プライマー（Ｂ－１）は、配列番号１５～１９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号１５と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８又は配列番号１９が挙げられる。第二プライマー（Ｂ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
膣トリコモナスを検出するためのプライマーは、その検出が可能な限り特に限定されないが、以下の（Ａ－１）と（Ｂ－１）とを組み合わせたプライマーセットであることが好ましい。
（Ａ－１）配列番号１１～１４のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｂ－１）配列番号１５～１９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
第一プライマー（Ａ－１）は、配列番号１１～１４のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号１１と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４が挙げられる。第一プライマー（Ａ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
第二プライマー（Ｂ－１）は、配列番号１５～１９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号１５と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８又は配列番号１９が挙げられる。第二プライマー（Ｂ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0027】
（４）マイコプラズマジェニタリウムを検出するためのプライマー
マイコプラズマジェニタリウムを検出するためのプライマーは、その検出が可能な限り特に限定されないが、以下の（Ｃ－１）と（Ｄ－１）とを組み合わせたプライマーセットであることが好ましい。
（Ｃ－１）配列番号２３～２５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号２６～２９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
第一プライマー（Ｃ－１）は、配列番号２３～２５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号２３と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号２４又は配列番号２５が挙げられる。第一プライマー（Ｃ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
第二プライマー（Ｄ－１）は、配列番号２６～２９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号２６と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号２７、配列番号２８又は配列番号２９が挙げられる。第２プライマー（Ｄ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
マイコプラズマジェニタリウムを検出するためのプライマーは、その検出が可能な限り特に限定されないが、以下の（Ｃ－１）と（Ｄ－１）とを組み合わせたプライマーセットであることが好ましい。
（Ｃ－１）配列番号２３～２５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第一プライマー。
（Ｄ－１）配列番号２６～２９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す塩基配列からなる第二プライマー。
第一プライマー（Ｃ－１）は、配列番号２３～２５のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号２３と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号２４又は配列番号２５が挙げられる。第一プライマー（Ｃ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
第二プライマー（Ｄ－１）は、配列番号２６～２９のいずれかで示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を示す限り特に制限されず、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の同一性を示す塩基配列からなるものであってもよい。配列番号２６と少なくとも９０％以上の同一性を示すものとしては、例えば配列番号２７、配列番号２８又は配列番号２９が挙げられる。第２プライマー（Ｄ－１）は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0028】
［３－（１）］本発明の膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの検出方法
本発明の膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの検出方法は、以下の（１）～（３）の工程を含むことが好ましい。
（１）上記で説明したオリゴヌクレオチドプライマーセットのうち少なくとも１セットを用いて試料中に存在し得る膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウム由来の核酸の増幅を行う工程。
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程。
本発明の膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの検出方法は、以下の（１）～（３）の工程を含むことが好ましい。
（１）上記で説明したオリゴヌクレオチドプライマーセットのうち少なくとも１セットを用いて試料中に存在し得る膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウム由来の核酸の増幅を行う工程。
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程。
【0029】
上記方法は、以下の（１Ａ）、（１Ｂ）、（２Ａ）、及び（３Ａ）に示す工程を含むことがより好ましい。
（１Ａ）膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子及びマイコプラズマジェニタリウムのｍｇPａ遺伝子のうち少なくともいずれか一つを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを用意する工程。
（１Ｂ）被検核酸及び工程（１Ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程。
（２Ａ）工程（１Ｂ）によって得られた核酸増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３Ａ）工程（２Ａ）で得られた複合体を検出する工程。
（１Ａ）膣トリコモナスの５.８ＳｒＲＮＡ遺伝子及びマイコプラズマジェニタリウムのｍｇPａ遺伝子のうち少なくともいずれか一つを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを用意する工程。
（１Ｂ）被検核酸及び工程（１Ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程。
（２Ａ）工程（１Ｂ）によって得られた核酸増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（３Ａ）工程（２Ａ）で得られた複合体を検出する工程。
【0030】
本発明における実施様態の一つとして、膣トリコモナスを検出するためのプライマーセット及びプローブを組み合わせて使用してもよい。また、マイコプラズマジェニタリウムを検出するためのプライマーセット及びプローブを組み合わせて使用してもよい。組み合わせは、原則任意であるが、好ましくは、以下（Ｉ）及び（II）のいずれかである。
（Ｉ）上記（Ａ－１）の第一プライマーと上記（Ｂ－１）の第二プライマーとからなる一対のプライマーセット、及び、上記（１）のオリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは配列番号５で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）の組み合わせ。
（II）上記（Ｃ－１）の第一プライマーと上記（Ｄ－１）の第二プライマーとからなる一対のプライマーセット、及び、上記（２）のオリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは配列番号６～８及び３０のいずれかで示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）の組み合わせ。
（Ｉ）上記（Ａ－１）の第一プライマーと上記（Ｂ－１）の第二プライマーとからなる一対のプライマーセット、及び、上記（１）のオリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは配列番号５で示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）の組み合わせ。
（II）上記（Ｃ－１）の第一プライマーと上記（Ｄ－１）の第二プライマーとからなる一対のプライマーセット、及び、上記（２）のオリゴヌクレオチドプローブ（好ましくは配列番号６～８及び３０のいずれかで示される塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも８塩基以上の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）の組み合わせ。
【0031】
また、本発明における実施様態の一つとして、膣トリコモナスを検出するためのプライマーセット及びプローブとマイコプラズマジェニタリウムを検出するためのプライマーセット及びプローブとを組み合わせて、膣トリコモナス及びマイコプラズマジェニタリウムの両方を検出するために使用してもよい。組み合わせは原則任意であるが、好ましくは上記（Ｉ）と（II）の組み合わせである。
【0032】
［３－（２）］被検核酸の増幅
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【0033】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムを寄生させた細胞培養試料や生体試料等の試料に含まれる核酸が挙げられる。
【0034】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、生殖器や咽頭をぬぐったスワブ、あるいは該スワブに付着したぬぐい液、尿、うがい液などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法を採用できる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法を採用できる。
【0035】
被検核酸を鋳型として、上述のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させることが好ましい。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【0036】
本発明の膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの検出方法における核酸の増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｍeｄｉａｔeｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等が挙げられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【0037】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、好ましくはα型ＤＮＡポリメラーゼである。その理由を以下に説明する。
【0038】
本発明プローブが含まれる反応系で膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムに含まれるＤＮＡを増幅する場合、核酸増幅工程中に該オリゴヌクレオチドプローブが試料の膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムに含まれるＤＮＡ遺伝子やその増幅産物と結合しうる。
【0039】
ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈeｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａeｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’－３’エキソヌクレアーゼ活性は持たず、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いればプローブの分解を防止することができ、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【0040】
ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍeｒａｓeはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
【0041】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型及び／又は変異型の組み合わせにより、当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍeｒａｓe以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡製、登録商標）」、「ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製、登録商標）」、「ＫＯＤ －Ｍｕｌｔｉ＆Eｐｉ－（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｏｎe（東洋紡製、登録商標）」、ＰｒｉｍeＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－が望ましい。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍeｒａｓe以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡製、登録商標）」、「ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製、登録商標）」、「ＫＯＤ －Ｍｕｌｔｉ＆Eｐｉ－（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｏｎe（東洋紡製、登録商標）」、ＰｒｉｍeＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－が望ましい。
【0042】
［３－（３）］膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウム由来の核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
本発明の膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの検出方法においては、上記で説明した被検核酸の増幅によって得られた増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめることが好ましい。
本発明の膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの検出方法においては、上記で説明した被検核酸の増幅によって得られた増幅産物と、上記で説明したオリゴヌクレオチドプローブのうち少なくとも１本とをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめることが好ましい。
【0043】
核酸増幅産物を含む試料にオリゴヌクレオチドプローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中及び核酸増幅反応後のいずれの反応系に添加してもよい。中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素やリン酸基を付加したりすることが好ましい。
【0044】
［３－（４）］核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
上記で得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
上記で得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
【0045】
融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【0046】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のオリゴヌクレオチドプローブに標識を付加した場合は該標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明の膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの検出方法に用いるオリゴヌクレオチドプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。
【0047】
標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、又は、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブが挙げられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。
【0048】
標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂe（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【0049】
前記蛍光色素は特に制限されないが、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素として、例えば、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕe）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素を挙げることができ、本発明にはこれらの蛍光消光色素が好適に使用され得る。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕeは、検出波長４５０～４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５～７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹＦＬは、検出波長５１５～５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【0050】
本発明の膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムの検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【0051】
得られた増幅産物の解離、及び、解離により得られた一本鎖核酸と前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【0052】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５～９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒～１０分であり、好ましくは１秒～５分である。
【0053】
また、解離した一本鎖核酸と前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５～５０℃である。
【0054】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、前記核酸の濃度は、例えば、０．０１～１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１～１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記核酸に対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１～１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１～１０μｍｏｌ／Ｌである。
【0055】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定することが好ましい。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖核酸と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖核酸とハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（又は消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（又は消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【0056】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温～８５℃であり、好ましくは２５～７０℃であり、終了温度は、例えば、４０～１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５～２０℃／秒であり、好ましくは０．０８～５℃／秒である。
【0057】
被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。具体的には、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定することが好ましい。
【0058】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（又は消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【0059】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【0060】
［４］膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムを検出するための組成物及びキット
別の実施形態では、上述の膣トリコモナスを検出するためのプローブを含む、膣トリコモナスを検出するための組成物であって、上述の膣トリコモナスを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物が提供される。
別の実施形態では、上記（Ａ－１）の第一プライマーと、上記（Ｂ－１）の第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、上述の膣トリコモナスの５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる、膣トリコモナスの５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出するための組成物及びキットが提供される。
別の実施形態では、上記（Ｃ－１）の第一プライマーと、上記（Ｄ－１）の第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するための組成物及びキットが提供される。
別の実施形態では、膣トリコモナスの５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出するための組成物、及び／又は、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するための組成物を含む、膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムを検出するための組成物及びキットが提供される。
上記キットは、構成成分の一部又は全部を同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法等に関する情報を含む態様で提供することができる。また、上記キットは、陽性コントロール液及び／又は陰性コントロール液を含めることもできる。
別の実施形態では、上述の膣トリコモナスを検出するためのプローブを含む、膣トリコモナスを検出するための組成物であって、上述の膣トリコモナスを検出するためのプローブと組み合わせて用いられる組成物が提供される。
別の実施形態では、上記（Ａ－１）の第一プライマーと、上記（Ｂ－１）の第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、上述の膣トリコモナスの５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる、膣トリコモナスの５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出するための組成物及びキットが提供される。
別の実施形態では、上記（Ｃ－１）の第一プライマーと、上記（Ｄ－１）の第二プライマーとの組み合わせからなるプライマーセットを含み、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するためのプローブと組み合わせて用いられる、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するための組成物及びキットが提供される。
別の実施形態では、膣トリコモナスの５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出するための組成物、及び／又は、マイコプラズマジェニタリウムのｍｇＰａ遺伝子を検出するための組成物を含む、膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムを検出するための組成物及びキットが提供される。
上記キットは、構成成分の一部又は全部を同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法等に関する情報を含む態様で提供することができる。また、上記キットは、陽性コントロール液及び／又は陰性コントロール液を含めることもできる。
【実施例0061】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0062】
［実施例１：膣トリコモナスの検出］
（１―１）方法
膣トリコモナスを高感度に検出できるプライマー及びプローブの組み合わせを探索した。膣トリコモナス原虫を１反応あたり１００（測定試料１）、２５（測定試料２）、又は５（測定試料３）個使用し、配列番号９～１１、１３～１５、及び１９に基づき設計したオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブのセットで膣トリコモナスの検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
（１―１）方法
膣トリコモナスを高感度に検出できるプライマー及びプローブの組み合わせを探索した。膣トリコモナス原虫を１反応あたり１００（測定試料１）、２５（測定試料２）、又は５（測定試料３）個使用し、配列番号９～１１、１３～１５、及び１９に基づき設計したオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブのセットで膣トリコモナスの検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
【0063】
（１－２）反応液
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１１、１３、及び１４のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５及び１９のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号９及び１０のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１１、１３、及び１４のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５及び１９のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号９及び１０のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
【0064】
（１－３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0065】
（１―４）結果
配列番号９～１１、１３～１５、及び１９に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブのセットは低濃度試料を高感度に検出できた。そのなかでも特に配列番号１１／１５／１０の組み合わせは低濃度試料の検出率が高く、検出系として優れていることが分かった。
配列番号９～１１、１３～１５、及び１９に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブのセットは低濃度試料を高感度に検出できた。そのなかでも特に配列番号１１／１５／１０の組み合わせは低濃度試料の検出率が高く、検出系として優れていることが分かった。
【0066】
【表1】
【0067】
［実施例２：マイコプラズマジェニタリウムの検出］
（２―１）方法
マイコプラズマジェニタリウムを高感度に検出できる領域を探索するために、マイコプラズマジェニタリウム不活化菌液を１反応あたり１０コピー（測定試料１）及び５コピー（測定試料２）使用し、配列番号２０～２９に示されるオリゴヌクレオチドプローブとオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせてマイコプラズマジェニタリウムの検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
（２―１）方法
マイコプラズマジェニタリウムを高感度に検出できる領域を探索するために、マイコプラズマジェニタリウム不活化菌液を１反応あたり１０コピー（測定試料１）及び５コピー（測定試料２）使用し、配列番号２０～２９に示されるオリゴヌクレオチドプローブとオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせてマイコプラズマジェニタリウムの検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
【0068】
（２－２）反応液
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２３～２５のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２６～２９のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２０～２２のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２３～２５のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２６～２９のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２０～２２のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
【0069】
（２－３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0070】
（２―４）結果
配列番号２０～２５に基づき設計したオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブのセットは低濃度試料を高感度に検出することができた。そのなかでも、配列番号２３／２７／２０と２５／２８／２２の組み合わせは他の組み合わせより検出感度が優れていた。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。マイコプラズマジェニタリウムを高感度に検出できる検出系を見出した。
配列番号２０～２５に基づき設計したオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブのセットは低濃度試料を高感度に検出することができた。そのなかでも、配列番号２３／２７／２０と２５／２８／２２の組み合わせは他の組み合わせより検出感度が優れていた。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。マイコプラズマジェニタリウムを高感度に検出できる検出系を見出した。
【0071】
【表2】
【0072】
［実施例３：１反応系での複数菌種の検出］
（３―１）方法
膣トリコモナスとマイコプラズマジェニタリウムを１反応系で高感度に検出できるプライマー・プローブの組み合わせを探索するために、膣トリコモナスのｇＤＮＡを１反応あたり５個とマイコプラズマジェニタリウムのｇＤＮＡを１反応あたり５コピー使用し、配列番号９、１０、１３～１５、及び１９～２８に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブのセットで膣トリコモナスあるいはマイコプラズマジェニタリウムの検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
（３―１）方法
膣トリコモナスとマイコプラズマジェニタリウムを１反応系で高感度に検出できるプライマー・プローブの組み合わせを探索するために、膣トリコモナスのｇＤＮＡを１反応あたり５個とマイコプラズマジェニタリウムのｇＤＮＡを１反応あたり５コピー使用し、配列番号９、１０、１３～１５、及び１９～２８に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブのセットで膣トリコモナスあるいはマイコプラズマジェニタリウムの検出を確認した。非特異増幅の有無に関しては、陰性試料として精製水を測定に使用した。
【0073】
（３－２）反応液
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１１、１４、及び２３～２５のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５、１９、及び２６～２８のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号９、１０、及び２０～２２のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ジーンキューブテストベーシック（東洋紡製）を使用して以下に示される成分を含む反応液を調製した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせについては表１に記載した。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１１、１４、及び２３～２５のいずれか一本）０．４μＬ
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１５、１９、及び２６～２８のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号９、１０、及び２０～２２のいずれか１本）０．３μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
【0074】
（３－３）反応
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いて、前記反応液を以下の温度サイクルで反応させ、融解曲線解析により増幅の有無を確認した。
９４℃ ３０秒
（以上１サイクル）
９７℃ １秒
５８℃ ５秒
６８℃ ５秒
（以上５０サイクル）
９４℃ ３０秒
３９℃ ３０秒
３９～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【0075】
（３―４）結果
配列番号２５／２８／２２と１１／１５／１０の組み合わせは他の組み合わせより検出感度が優れていた。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。
配列番号２５／２８／２２と１１／１５／１０の組み合わせは他の組み合わせより検出感度が優れていた。また、陰性試料として精製水を使用して非特異増幅の確認を行ったところ、いずれのプライマーとプローブを用いた場合でも非特異増幅の発生は認められなかった。
【0076】
【表3】
【産業上の利用可能性】
【0077】
本発明を膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウム検査に利用することで、例えば迅速性及び正確性の両方に優れ、なおかつ高感度に膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムを検出することができる。また、本発明ではプライマーセットやプローブを任意に組み合わせることで、１反応系で複数菌種を同時に検出することができるため、膣トリコモナス及び／又はマイコプラズマジェニタリウムを簡便に検査することが可能になる。
【配列表】