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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025029653
(43)【公開日】2025-03-07
(54)【発明の名称】魚類の感染症予防治療剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7016 20060101AFI20250228BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20250228BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20250228BHJP
A61K 31/702 20060101ALI20250228BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20250228BHJP
A23K 20/163 20160101ALI20250228BHJP
A23K 50/80 20160101ALI20250228BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7016
A61P31/00 171
A61P31/04 ZNA
A61K31/702
A61P1/00
A23K20/163
A23K50/80
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023134396
(22)【出願日】2023-08-22
(71)【出願人】
【識別番号】000125381
【氏名又は名称】学校法人藤田学園
(71)【出願人】
【識別番号】511045475
【氏名又は名称】株式会社農
(71)【出願人】
【識別番号】313014608
【氏名又は名称】ウェルネオシュガー株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】590002389
【氏名又は名称】静岡県
(74)【代理人】
【識別番号】110000590
【氏名又は名称】弁理士法人 井手・小野国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】廣岡 芳樹
(72)【発明者】
【氏名】舩坂 好平
(72)【発明者】
【氏名】渡辺 彩子
(72)【発明者】
【氏名】藤井 匡
(72)【発明者】
【氏名】栃尾 巧
(72)【発明者】
【氏名】吉川 昌之
(72)【発明者】
【氏名】朝比奈 学之
(72)【発明者】
【氏名】原 和志
(72)【発明者】
【氏名】近藤 修啓
(72)【発明者】
【氏名】平林 克樹
(72)【発明者】
【氏名】山川 早紀
【テーマコード（参考）】
2B005
2B150
4C086
【Ｆターム（参考）】
2B005GA02
2B005MB07
2B150AA08
2B150AB10
2B150DC13
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA01
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA69
4C086ZB31
4C086ZB35
4C086ZC61
(57)【要約】 （修正有）
【特許請求の範囲】
【請求項1】
スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分として含有する魚類用感染症予防又は治療剤。
【請求項2】
感染症が、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及び／又はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の感染に起因するものである請求項１記載の魚類用感染症予防又は治療剤。
【請求項3】
魚類が淡水魚である請求項１又は２記載の魚類用感染症予防又は治療剤。
【請求項4】
スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分として含有する魚類用整腸剤。
【請求項5】
魚類の腸内におけるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖作用に基づくものである請求項４記載の魚類用整腸剤。
【請求項6】
魚類の腸内におけるＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及び／又はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の減少作用に基づくものである請求項４記載の魚類用整腸剤。
【請求項7】
魚類が淡水魚である請求項４～６のいずれかの項記載の魚類用整腸剤。
【請求項8】
スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分として含有する魚類の腸内におけるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖剤。
【請求項9】
スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分として含有する魚類の腸内におけるＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及び／又はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌増殖抑制剤。
【請求項10】
スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分として含有する飼料効率向上剤。
【請求項11】
スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分として含有するＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖剤。
【請求項12】
スクロース及び／又は１－ケストースを魚類に投与することを特徴とする感染症予防又は治療方法。
【請求項13】
感染症が、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及び／又はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の感染に起因するものである請求項１２記載の魚類用感染症予防又は治療方法。
【請求項14】
魚類が淡水魚である請求項１２又は１３記載の魚類用感染症予防又は治療方法。
【請求項15】
スクロース及び／又は１－ケストースを魚類に投与することを特徴とする魚類の腸内環境改善方法。
【請求項16】
魚類の腸内におけるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌を増殖させるものである請求項１５記載の魚類の腸内環境改善方法。
【請求項17】
魚類の腸内におけるＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及び／又はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌を減少させるものである請求項１５又は１６記載の魚類の腸内環境改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、魚類の感染症予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、世界的に水産物の需要が拡大しているが、水産資源量には限界があり、漁船漁業による生産量の増加は見込めないことから、養殖漁業への転換が進められている。しかし、養殖漁業では、高密度養殖に伴う魚病の発生が避けられず、ブリ、フグ、ウナギを始めとする商業魚では魚病により多くの被害が生じており、被害額はブリ類で最も大きく約４０億円にも及び、全体では年間約１００億～１１０億円もの損害が発生している。したがって養殖漁業の持続的な発展のために魚病対策が重要な課題とされている。
【0003】
養殖魚に大きな被害をもたらす疾病は、主にウイルスや細菌による感染症であるが、その多くは細菌による感染症である。例えば、エドワジエラ症は、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌を原因菌とする感染症であり、ウナギのほか、ヒラメ、マダイなどの海産魚にも感染し、大きな経済損失をもたらしている。ウナギではパラコロ病と呼ばれ、シラスウナギから成鰻に至るまで罹病し、発症すると、肛門付近の発赤、拡大突出、前腹部の発赤腫脹がみられ、肝臓、腎臓等で膿瘍や潰瘍が多数形成される。また冷水病はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ（フラボバクテリウム サイクロフィラム）を原因とする疾病であり、アユ、ニジマス、コイ等の淡水魚に感染し、尾柄部に現れるびらんや潰瘍などの病変が特徴とされる。ウナギにおいては、類似のフラボバクテリウムが引き起こすＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅが原因となるカラムナリス病という疾患が報告されている。
【0004】
このような細菌感染症の治療・予防のために抗生物質が使用されている。しかし、抗生物質の使用による薬剤耐性菌の出現や魚類体内への残留による安全性の問題も指摘されている。一方、ワクチンの開発も行われているが、投与するための作業時間やコストの負担が大きく、普及の障害となっている。そのため、抗生物質等に依存しない安全で簡便な感染症に対する予防治療方法の確立が求められている。
【0005】
これに対し、乳糖果糖オリゴ糖や大豆オリゴ糖を魚類に投与する感染症の予防治療方法が提案されている（特許文献１及び２）。しかし、上記細菌性感染症に対する予防治療効果については具体的な開示はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開平１０－４５６０５号公報
【特許文献2】特開２０２２－１２０８４０号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Yaqiu Liu et al.,Front.Microbiol.,09 August 2022 Vol.13
【非特許文献2】Yibin Yang et al., Front.Immunol.,03 June 2022 Vol.13
【非特許文献3】Jiamin Li et al., Front.Nutr.19 October 2022 Vol9
【非特許文献4】Hao-Jun Zhu et al., MicrobiologyOpen Vol.9,Isuue 5 2020
【非特許文献5】Chunling Wang et al., Fish & Shellfish Immunology Vol.106,November 2020
【非特許文献6】Xiaolin Ye et al., Frontieres in Endocrinology, December 2021 vol.12
【非特許文献7】Sytze de Roock et al., Clinical Nutrition, December 2011 vol.30
【非特許文献8】Yi Liu et al., Multiple Sclerosis and Related Disorders Vol. 72, April 2023
【非特許文献9】Sage J B Dunham et al., mBio, 2022 Volume 13 Issue 6
【非特許文献10】Pagakrong Wanapaisan et al.,Neurodegenerative Diseases, 2022;22(2):43-54.
【非特許文献11】Honggang Yin et al., FEMS Microbiology Letters, Volume 370, 2023
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、安全で簡便な魚類の感染症予防治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、スクロース又は１－ケストースを魚類に摂取させることにより、腸内の有用菌であるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌を増殖させるとともに、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌等の病原性細菌の増殖を抑制し、これらの病原性細菌を原因とする感染症を治療・予防し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち本発明は、スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分として含有する魚類用感染症予防又は治療剤である。
【0011】
また本発明は、スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分として含有する魚類用整腸剤である。
【0012】
また本発明は、スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分として含有する魚類の腸内におけるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖剤、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及び／又はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌増殖抑制剤である。
【0013】
また本発明は、スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分として含有する飼料効率向上剤である。
【0014】
また本発明は、スクロース及び／又は１－ケストースを魚類に投与することを特徴とする感染症予防又は治療方法である。
【0015】
また本発明は、スクロース及び／又は１－ケストースを魚類に投与することを特徴とする魚類の腸内環境改善方法である。
【発明の効果】
【0016】
本発明により、腸内の有用菌であるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌を増殖させるとともに、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌等の病原性細菌の増殖を抑制し、これらを原因とする感染症を治療ないし予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】実施例１における試験区と対照区でのウナギ腸内細菌叢のＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の相対占有率を示すグラフである。
【図2】実施例１における試験区と対照区でのウナギ腸内の乳酸と酢酸濃度を示すグラフである。
【図3】実施例４における試験区と対照区でのＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明の感染症予防又は治療剤（以下、「感染症予防治療剤」という）の対象となる魚類としては、特に制限されるものではないが、例えば、ウナギ、ニジマス、アユ、ティラピア、コイ、フナ、ナマズ等の淡水魚やヒラメ、マダイ、ブリ、シマアジ、ギンザケ等の海水魚が挙げられ、これらの中でもウナギ、ニジマス、アユ、ティラピア、コイ、ヒラメ、マダイ等に対し好適に用いられる。
【0019】
本発明の感染症予防治療剤の有効成分は、スクロース及び／又は１－ケストースである。これらの中でも、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖効果、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌等の病原性細菌に対する増殖抑制効果等により優れることから１－ケストースが好ましい。
【0020】
本発明の感染症予防治療剤の対象となる感染症は、特に限定されるものではないが、エドワジエラ症、ウナギのパラコロ病及びカラムナリス病、冷水病、せっそう病、α溶血性レンサ球菌病、ビブリオ病、ノカルジア病、細菌性鰓病、滑走細菌症、β溶血性レンサ球菌症等の細菌性感染症が挙げられ、これらの中でもＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及び／又はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の感染に起因する感染症に対し好適に用いられる。Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の感染に起因する感染症としては、エドワジエラ症、ウナギのパラコロ病等が挙げられ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の感染に起因する感染症としては、冷水病、ウナギのカラムナリス病等が挙げられる。
【0021】
本発明の感染症予防治療剤の投与量は、特に制限されるものではなく、適用対象の魚類の種類、感染症の種類、症状等により適宜設定することができるが、各種オリゴ糖の添加率は魚介体重の０．１％～１０％とし、魚種、大きさによって適宜調整すると良い。例えば１日当たり１，２８０ｍｇ／ｋｇ魚体重程度の投与量とする例などが挙げられる。
【0022】
本発明の感染症予防治療剤の適用方法は特に制限されるものではないが、経口投与が好ましく、上記有効成分を経口剤として製剤化するか、魚類の飼料に添加して給餌することにより経口投与することができる。製剤の剤型としては特に限定されず、顆粒剤、錠剤、等任意の剤型とすることができ、公知の調製方法に従って製剤化することができる。本発明の感染症予防治療剤を添加した飼料も、常法に従って調製することができ、魚粉、小麦粉、デンプン、リン酸カルシウム等の原料飼料に、スクロース及び／又は１－ケストースを、例えば全飼料中３．５～４．０質量％程度になるように配合し、モイストペレット、ドライペレット等任意の形態とすることができる。
【0023】
本発明の感染症予防治療剤を魚類に投与することにより、魚類の腸内細菌環境が改善され、感染症に対する予防治療効果が得られる。すなわち、エドワジエラ病の原因菌であるＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌や冷水病の原因菌であるＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌など、細菌性感染症の病原菌の多くは、環境水中や腸内に常在している条件性病原菌であるが、本発明の感染症予防治療剤を投与することにより、魚類の腸内において、有用菌であるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌を増殖させる一方で（非特許文献６～７）、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌やＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌などの病原菌の増殖を抑制することにより、これらを原因とする感染症を予防ないし治療することが可能となる。有用菌であるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌は、広く魚類の腸内に常在菌として存在することが知られており、例えば、ウナギ、ティアピア、ニシン、フナ、ナマズ、ミント蟹等で常在菌として存在することが報告されている（非特許文献１～５）。さらに、スクロース及び／又は１－ケストースを投与することにより、魚類の成長が促進されるため、飼料効率を向上することができる。したがって、本発明には、スクロース及び／又は１－ケストースを有効成分とする魚類用感染症予防治療剤に加え、魚類用整腸剤、魚類の腸内におけるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖剤、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌増殖抑制剤、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌増殖抑制剤、飼料効率向上剤及びこれらの方法が包含される。
【0024】
本発明の感染症予防治療剤等は、エドワジエラ症、パラコロ病、冷水病等の細菌性感染症予防治療、整腸、腸内環境改善、腸内におけるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及び／又はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌増殖抑制等の用途に用いられる旨の表示を付した態様をとり得るものであり、例えば、製品の本体、容器、包装、説明書、添付文書などにこれらの用途を表示したり、パンフレット、ポスター等の広告、販促資料、ウェビナーやＳＮＳの画面等にその旨表示する態様が包含される。
【0025】
またＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌は、様々な動物の腸内にも常在しているため、動物を投与対象とすることも可能であり、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、牛、馬、羊等の哺乳動物等が挙げられる。ヒトでは、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌が様々な疾患・生理機能に関与することが知られており、例えば、糖尿病、脱髄性視神経炎、アルツハイマー、血管内皮機能改善等とＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌との関連性が報告されている（非特許文献８～１１）。したがって、本発明のスクロース及び／または１－ケストースを有効成分として含有するＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖剤は、糖尿病、脱髄性視神経炎、アルツハイマーや、血管内皮機能低下に関連する高血圧、脂質異常症、肥満、メタボリックシンドローム、動脈硬化等の疾患を予防ないし改善し得る。
【0026】
本発明のＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖剤は、上記有効成分に、必要に応じ、薬学的に許容される担体と組み合わせて製剤化できる。薬学的に許容される担体としては、例えば、グルコース、乳糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。さらに必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。その剤型は特に限定されないが、液剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等が例示され、常法に従って製造することができる。本発明のＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖剤の用量は特に制限されるものではないが、例えば、成人１日の用量として体重１ｋｇ当たり０．１～５ｇ程度であり、好ましくは０．５～１ｇ程度である。
【0027】
本発明のＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌増殖剤は飲食品の形態とすることもでき、上記有効成分に、公知の食品添加物及び／又は食品素材を配合し、常法に従って調製され、その形態も特に制限されるものではなく、例えば、パン、ビスケット、ホットケーキ、麺、錠菓等のデンプンを主体とする食品、ガム、キャンディー、和菓子等の菓子類、ハム、ソーセージ等の畜肉食品、ちくわ、かまぼこ等の魚肉食品、魚介類食品、ドレッシング、醤油、ジャム、ふりかけ等の調味料、茶、ジュース、清涼飲料、酒類等の飲料等が挙げられる。
【実施例0028】
以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例により限定されるものではない。
【0029】
実施例１
１－ケストース投与によるウナギの腸内細菌叢への影響
ウナギにｉＫｅｓファイバー（１－ケストース含量４５．０％以上、伊藤忠製糖製）を経口投与し、ウナギの腸内細菌叢、ならびに全長・体重に及ぼす影響を調べた。２００尾ずつ収容された水槽を対照区と試験区とした。飼料はウナギ用配合飼料（マッシュ、日本農産工業株式会社製）を用い、給餌率は収容総魚体重の０．５～１．５質量％とした。給餌は配合飼料：タラ肝油：水＝１：０．１：１．３で混合して練り、柔らかい餅状にして行った。試験区の飼料は、水にｉＫｅｓファイバー１０質量％と乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＦＭ８，株式会社農）２×１０１１個／ｇを０．３質量％懸濁させたのち、配合飼料およびタラ肝油と混合して調製した。給餌は一日一回平日の９時に行った。１ヶ月飼育したのち、対照区・試験区それぞれから全個体を取り上げ、全長と体重を測定した。その中からそれぞれ２０尾（平均値に近いサイズの個体１０尾と平均値より大きいサイズの個体１０尾）を解剖に供し、腸管内容物を採取し、－８０℃で保存した。
凍結腸管内容物を氷上で解凍し、各サンプルを４Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０），４０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁し、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１００Ａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）を用いてジルコニアビーズで粉砕した。ビーズ処理した懸濁液からＱＩＡ ＱＵＢＥを用いてＤＮＡを抽出した。ＥｘＴａｇ ＨＳ（ＴａＫａＲａ）を用いてユニバーサルＰＣＲプライマー（Ｆ：３Ｖ４ｆ＿ＭＩＸ：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－ＮＮＮＮＮ－ＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ，Ｒ：Ｖ３Ｖ４ｒ＿ＭＩＸ：ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ－ＮＮＮＮＮ－ＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ）を用いて細菌および古細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列のＶ３－Ｖ４領域を増幅させた。増幅させたＰＣＲ産物について、ＭｉＳｅｑによるシークエンスを実施し、その結果をＱＩＩＭＥ２（ｖｅｒｓｉｏｎ ２０２２．２）で解析し、属レベルで各細菌の相対占有率を算出した。また短鎖脂肪酸の測定は、採取した腸管内容物サンプルに氷冷したＰＢＳを１ｍＬ加え、ボルテックスミキサーで良く撹拌し遠心分離によって上清を分析サンプルとして回収した。回収した上清はＹＭＣ社製の長鎖・短鎖脂肪酸分析ラベル化試薬（製品番号ＸＡＲＦＡＲ０２）前処理を行い、ＨＰＬＣにて分析を実施した。用いた分析カラムはＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ×１５０ｍｍを使用し、溶媒はアセトニトリル：メタノール：水＝２４：１２：６４の割合で調整し、希塩酸でｐＨを４～５に調整したものを用いた。対照区および試験区における各細菌の相対占有率および短鎖脂肪酸濃度はＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔを用いて比較し、ｐ＜０．１を有意とした。その結果を図１（細菌の相対占有率）及び図２（短鎖脂肪酸濃度）に示す。また表１に対照区及び試験区における増重量に基づき算出した飼料効率を示す。
１－ケストース投与によるウナギの腸内細菌叢への影響
ウナギにｉＫｅｓファイバー（１－ケストース含量４５．０％以上、伊藤忠製糖製）を経口投与し、ウナギの腸内細菌叢、ならびに全長・体重に及ぼす影響を調べた。２００尾ずつ収容された水槽を対照区と試験区とした。飼料はウナギ用配合飼料（マッシュ、日本農産工業株式会社製）を用い、給餌率は収容総魚体重の０．５～１．５質量％とした。給餌は配合飼料：タラ肝油：水＝１：０．１：１．３で混合して練り、柔らかい餅状にして行った。試験区の飼料は、水にｉＫｅｓファイバー１０質量％と乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＦＭ８，株式会社農）２×１０１１個／ｇを０．３質量％懸濁させたのち、配合飼料およびタラ肝油と混合して調製した。給餌は一日一回平日の９時に行った。１ヶ月飼育したのち、対照区・試験区それぞれから全個体を取り上げ、全長と体重を測定した。その中からそれぞれ２０尾（平均値に近いサイズの個体１０尾と平均値より大きいサイズの個体１０尾）を解剖に供し、腸管内容物を採取し、－８０℃で保存した。
凍結腸管内容物を氷上で解凍し、各サンプルを４Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０），４０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁し、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１００Ａ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）を用いてジルコニアビーズで粉砕した。ビーズ処理した懸濁液からＱＩＡ ＱＵＢＥを用いてＤＮＡを抽出した。ＥｘＴａｇ ＨＳ（ＴａＫａＲａ）を用いてユニバーサルＰＣＲプライマー（Ｆ：３Ｖ４ｆ＿ＭＩＸ：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－ＮＮＮＮＮ－ＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ，Ｒ：Ｖ３Ｖ４ｒ＿ＭＩＸ：ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ－ＮＮＮＮＮ－ＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ）を用いて細菌および古細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列のＶ３－Ｖ４領域を増幅させた。増幅させたＰＣＲ産物について、ＭｉＳｅｑによるシークエンスを実施し、その結果をＱＩＩＭＥ２（ｖｅｒｓｉｏｎ ２０２２．２）で解析し、属レベルで各細菌の相対占有率を算出した。また短鎖脂肪酸の測定は、採取した腸管内容物サンプルに氷冷したＰＢＳを１ｍＬ加え、ボルテックスミキサーで良く撹拌し遠心分離によって上清を分析サンプルとして回収した。回収した上清はＹＭＣ社製の長鎖・短鎖脂肪酸分析ラベル化試薬（製品番号ＸＡＲＦＡＲ０２）前処理を行い、ＨＰＬＣにて分析を実施した。用いた分析カラムはＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ×１５０ｍｍを使用し、溶媒はアセトニトリル：メタノール：水＝２４：１２：６４の割合で調整し、希塩酸でｐＨを４～５に調整したものを用いた。対照区および試験区における各細菌の相対占有率および短鎖脂肪酸濃度はＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔを用いて比較し、ｐ＜０．１を有意とした。その結果を図１（細菌の相対占有率）及び図２（短鎖脂肪酸濃度）に示す。また表１に対照区及び試験区における増重量に基づき算出した飼料効率を示す。
【0030】
【表1】
【0031】
図１に示すように、対照区と比較して試験区でＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌が有意に増加した。一方、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌は有意に減少した。また図２から、腸内の乳酸と酢酸濃度が試験区において有意に増加することが確認された。これらの結果より、１－ケストースをウナギに投与することにより、ウナギの腸内では有用菌であるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属が増加し、酢酸や乳酸をはじめとした短鎖脂肪酸が増加することが分かった。一方でパラコロ病の原因菌であるＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌及びカラムナリス病の原因菌であるＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の減少が認められた。
【0032】
実施例２
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌およびＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌に対する各種糖質による増殖作用
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌及びＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の各種糖質に対する資化性を調べた。
ハイポリペプトン（ニッスイ製薬）４．０ｇ、酵母エキス（ＢＤ）４．０ｇ、塩化ナトリウム（富士フィルム和光純薬工業）０．２ｇ、リン酸水素二カリウム（富士フィルム和光純薬工業）０．０８ｇ、リン酸二水素カリウム（富士フィルム和光純薬工業）０．０８ｇ、硫酸マグネシウム７水和物（富士フィルム和光純薬工業）０．０２ｇ、塩化カルシウム２水和物（富士フィルム和光純薬工業）０．０２ｇ、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業）４．０ｇ、胆汁粉末（富士フィルム和光純薬工業）１．０ｇ、Ｔｗｅｅｎ（東京化成工業）４．０ｇ、ビタミンＫ（東京化成工業）２０ｕＬ、ヘミン（富士フィルム和光純薬工業）０．０１ｇ、レザスリンナトリウム塩（東京化成工業）１ｍｇ、システイン塩酸塩１．０ｇ（東京化成工業）を１Ｌの水に溶解し、基礎培地とした。
炭素源となる糖質として、スクロース（Ｓｕｃ，富士フィルム和光純薬工業）、ケストース（Ｋｅｓ，伊藤忠製糖）、ガラクトオリゴ糖（Ｇｏｓ，富士フィルム和光純薬工業）、イヌリン（シグマアルドリッチ）、ファイバリクサ（ＦＲＸ，林原）、ラフィノース（東京化成工業）、ＣＩ－デキストリン（ＣＩ－ｄｅｘ，日新製糖）を５０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。基礎培地５００μＬと調整した各種糖質液５００μＬとを混合したもの培養液として用いた。培養に用いる菌はＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｉｓｉｓ（ＪＣＭ１４０４株）と、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ（ＮＢＲＣ １０５６８８株）を用いた。これらについてＧＡＭ培地（ニッスイ製薬）で前培養を行った後、２０ｕＬを培養液に植菌した。植菌前の培地の吸光度６６０ｎｍにおける濁度を培養スタート時の濁度とし、植菌後２４時間経過時点での濁度を測定した。濁度の測定はプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）を用いて行った。また培地のｐＨについても２４時間経過時点において測定した。その結果を表２に示す。
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌およびＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌に対する各種糖質による増殖作用
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌及びＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の各種糖質に対する資化性を調べた。
ハイポリペプトン（ニッスイ製薬）４．０ｇ、酵母エキス（ＢＤ）４．０ｇ、塩化ナトリウム（富士フィルム和光純薬工業）０．２ｇ、リン酸水素二カリウム（富士フィルム和光純薬工業）０．０８ｇ、リン酸二水素カリウム（富士フィルム和光純薬工業）０．０８ｇ、硫酸マグネシウム７水和物（富士フィルム和光純薬工業）０．０２ｇ、塩化カルシウム２水和物（富士フィルム和光純薬工業）０．０２ｇ、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業）４．０ｇ、胆汁粉末（富士フィルム和光純薬工業）１．０ｇ、Ｔｗｅｅｎ（東京化成工業）４．０ｇ、ビタミンＫ（東京化成工業）２０ｕＬ、ヘミン（富士フィルム和光純薬工業）０．０１ｇ、レザスリンナトリウム塩（東京化成工業）１ｍｇ、システイン塩酸塩１．０ｇ（東京化成工業）を１Ｌの水に溶解し、基礎培地とした。
炭素源となる糖質として、スクロース（Ｓｕｃ，富士フィルム和光純薬工業）、ケストース（Ｋｅｓ，伊藤忠製糖）、ガラクトオリゴ糖（Ｇｏｓ，富士フィルム和光純薬工業）、イヌリン（シグマアルドリッチ）、ファイバリクサ（ＦＲＸ，林原）、ラフィノース（東京化成工業）、ＣＩ－デキストリン（ＣＩ－ｄｅｘ，日新製糖）を５０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。基礎培地５００μＬと調整した各種糖質液５００μＬとを混合したもの培養液として用いた。培養に用いる菌はＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｉｓｉｓ（ＪＣＭ１４０４株）と、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ（ＮＢＲＣ １０５６８８株）を用いた。これらについてＧＡＭ培地（ニッスイ製薬）で前培養を行った後、２０ｕＬを培養液に植菌した。植菌前の培地の吸光度６６０ｎｍにおける濁度を培養スタート時の濁度とし、植菌後２４時間経過時点での濁度を測定した。濁度の測定はプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）を用いて行った。また培地のｐＨについても２４時間経過時点において測定した。その結果を表２に示す。
【0033】
【表2】
【0034】
表２に示すようにＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌はスクロース、１－ケストースを資化して増殖し、培地のｐＨを減少させることが確認された。一方で、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌はグルコースを炭素源とした場合この培地組成で増殖することを確認しているが（実施例３参照）、表２に示すいずれのオリゴ糖でも増殖は確認されず、また培地のｐＨの減少も確認できなかった。この結果から、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌はスクロース、１－ケストースを効率よく資化し培地ｐＨを減少させるが、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａはいずれの糖質も利用できないことが明らかとなった。
【0035】
実施例３
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ 属細菌とＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の培地ｐＨによる生育比較
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌を培養することで低下する培地のｐＨが、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育にどのように影響するかを評価した。Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌が利用可能な炭素源としてグルコースを用いた。実施例２と同じ組成の基礎培地と、５０ｍｇ／ｍＬのグルコース溶液をそれぞれ５００ｕＬずつ混合し培地を調製した。培地に酢酸をそれぞれ終濃度が０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭになるように添加し調整した。Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓ（ＪＣＭ１４０４株）とＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ（ＮＢＲＣ １０５６８８株）をＧＡＭ培地（ニッスイ製薬）で前培養を行った後、２０ｕＬを培養液に植菌した。植菌前の培地の吸光度６６０ｎｍにおける濁度を培養スタート時の濁度とし、植菌後２４時間経過時点での濁度を測定した。また培地のｐＨについても培養スタート時（０ｈ）と植菌後２４時間経過時点（２４ｈ）において測定した。
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ 属細菌とＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の培地ｐＨによる生育比較
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌を培養することで低下する培地のｐＨが、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育にどのように影響するかを評価した。Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌が利用可能な炭素源としてグルコースを用いた。実施例２と同じ組成の基礎培地と、５０ｍｇ／ｍＬのグルコース溶液をそれぞれ５００ｕＬずつ混合し培地を調製した。培地に酢酸をそれぞれ終濃度が０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭになるように添加し調整した。Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓ（ＪＣＭ１４０４株）とＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ（ＮＢＲＣ １０５６８８株）をＧＡＭ培地（ニッスイ製薬）で前培養を行った後、２０ｕＬを培養液に植菌した。植菌前の培地の吸光度６６０ｎｍにおける濁度を培養スタート時の濁度とし、植菌後２４時間経過時点での濁度を測定した。また培地のｐＨについても培養スタート時（０ｈ）と植菌後２４時間経過時点（２４ｈ）において測定した。
【0036】
【表3】
【0037】
表３に示すとおり、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌は、酢酸濃度２０ｍＭにおいて若干の増殖鈍化がみられるが、いずれの酢酸濃度においても生育が確認された。培養初期（植菌直後）のｐＨと比較すると、７．５～６．３程あるｐＨが、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ増殖が進むにつれて酢酸を生産し、培地のｐＨを５．５付近まで減少させることが分かった。
これに対し、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌は、酢酸濃度０～１０ｍＭにおいては酢酸の影響を受けずに生育するが、２０ｍＭにおいては生育が鈍化することが分かった。つまり、培養初期のｐＨが５．５以下の状態では、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の増殖が抑制されることが示唆された。
以上より、魚類生体内においてＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌の増殖に伴って産生される酢酸によって周囲のｐＨの低下がおこり、その影響によってＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育が抑制されるものと推定された。すなわち実施例２及び３より、スクロース及び１－ケストースがＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌によって効率的に利用されることにより、魚類の腸内では酢酸の産生が進行しｐＨが低下し、相対的にＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａの生育が抑えられることが明らかになった。
これに対し、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌は、酢酸濃度０～１０ｍＭにおいては酢酸の影響を受けずに生育するが、２０ｍＭにおいては生育が鈍化することが分かった。つまり、培養初期のｐＨが５．５以下の状態では、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の増殖が抑制されることが示唆された。
以上より、魚類生体内においてＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌の増殖に伴って産生される酢酸によって周囲のｐＨの低下がおこり、その影響によってＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育が抑制されるものと推定された。すなわち実施例２及び３より、スクロース及び１－ケストースがＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌によって効率的に利用されることにより、魚類の腸内では酢酸の産生が進行しｐＨが低下し、相対的にＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａの生育が抑えられることが明らかになった。
【0038】
実施例４
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌の培養上清を用いたＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の培養試験
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌を培養することで生産される酢酸を始めとする有機酸により、直接的にＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育が抑制されるかを検証するために以下の試験を行った。
まず実施例２と同じ基礎培地１０ｍＬに、５０ｍｇ／ｍＬで調整したグルコースを２ｍＬ、滅菌水を２ｍＬ加えた培地を調整した。その後１８００μＬずつ３本分注し、２本にはそれぞれにＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓ（ＪＣＭ１４０４株）の生菌を植菌、またコントロールとして１本にはＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓの死菌を植菌した。死菌の調整は、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓの培養液を１００℃のヒートブロックにて１５分加熱することで行った。植菌量は３６μＬ植菌し、３７℃、嫌気条件下にて培養を行った。生菌を植菌した直後（培養０日）、および培養１日後の培養液を回収、死菌を植菌した直後の培養液も回収し、遠心分離機で１５０００ｒｐｍ、３分間遠心することで菌体を沈殿させ、遠心上澄み液を０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過し、培養上清として回収し、ｐＨを測定した。
これらＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓの培養上清を用いて、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の培養に用いた。
すなわち生菌および死菌の培養０日の培養上清９５０μＬに対し蒸留水５０μＬを加え１ｍＬに調整、また生菌で培養１日後の培養上清９５０μＬに対し５０ｍｇ／ｍＬのグルコース５０μＬを加え１ｍＬに調整し、そこへＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ（ＮＢＲＣ １０５６８８株）を２０μＬ植菌し３７℃、嫌気条件下にて培養を行った。結果を図３に示す。
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌の培養上清を用いたＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の培養試験
Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌を培養することで生産される酢酸を始めとする有機酸により、直接的にＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育が抑制されるかを検証するために以下の試験を行った。
まず実施例２と同じ基礎培地１０ｍＬに、５０ｍｇ／ｍＬで調整したグルコースを２ｍＬ、滅菌水を２ｍＬ加えた培地を調整した。その後１８００μＬずつ３本分注し、２本にはそれぞれにＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓ（ＪＣＭ１４０４株）の生菌を植菌、またコントロールとして１本にはＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓの死菌を植菌した。死菌の調整は、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓの培養液を１００℃のヒートブロックにて１５分加熱することで行った。植菌量は３６μＬ植菌し、３７℃、嫌気条件下にて培養を行った。生菌を植菌した直後（培養０日）、および培養１日後の培養液を回収、死菌を植菌した直後の培養液も回収し、遠心分離機で１５０００ｒｐｍ、３分間遠心することで菌体を沈殿させ、遠心上澄み液を０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過し、培養上清として回収し、ｐＨを測定した。
これらＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓの培養上清を用いて、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の培養に用いた。
すなわち生菌および死菌の培養０日の培養上清９５０μＬに対し蒸留水５０μＬを加え１ｍＬに調整、また生菌で培養１日後の培養上清９５０μＬに対し５０ｍｇ／ｍＬのグルコース５０μＬを加え１ｍＬに調整し、そこへＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ（ＮＢＲＣ １０５６８８株）を２０μＬ植菌し３７℃、嫌気条件下にて培養を行った。結果を図３に示す。
【0039】
コントロールであるＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌の死菌を用いた培養上清でのＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育率を１００％とし、他の２群についてもＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａの生育率を表現した。
Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の培養２４ｈ、４８ｈ後において、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌の１日経過後の培養上清を用いた場合、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育率が大きく減少していた。Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌を１日培養して培地上清のｐＨが大きく下がることによる影響でＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育が抑えられている結果となった。すなわちＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌の培養産物（短鎖脂肪酸）が、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａの生育抑制に関与していることが推察される。
Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の培養２４ｈ、４８ｈ後において、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌の１日経過後の培養上清を用いた場合、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育率が大きく減少していた。Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌を１日培養して培地上清のｐＨが大きく下がることによる影響でＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の生育が抑えられている結果となった。すなわちＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌の培養産物（短鎖脂肪酸）が、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａの生育抑制に関与していることが推察される。
【0040】
実施例５
養殖下にある養殖魚（ニシキゴイ、ティラピア）について、実施例１と同様に腸内の内容物からＤＮＡを抽出した。一方、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌をＰＣＲにより検出するプライマーセット（５’－ＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＴＣ－３’，５’－ＣＧＣＣＴＣＡＣＧＡＣＴＴＧＧＣＴＧ－３’）を設計した。このプライマーセットは、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓを定量する為にデザインされた論文記載（chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.jstage.jst.go.jp/article/bmfh/38/2/38_18-023/_pdf）のプライマーセットのそれぞれ３’末端に、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の該当配列の下線で示した塩基を追加したものである。さらに、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌をＰＣＲにより検出するプライマーセット（５’－ＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＴＡＡＴＡＧＣＡ－３’，５’－ＧＡＧＡＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＡ－３’）を設計した。このプライマーセットは、ウナギの腸内で頻度高く検出されたＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の上位３種類をアラインメントしてデザインしたものである。
これらのプライマーセットを用い、各養殖魚の腸内内容物から抽出したＤＮＡ、及びＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓ（ＪＣＭ１４０４株）とＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ（ＮＢＲＣ １０５６８８株）の培養液を実施例１と同様に破砕したゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の調製はＱｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）の仕様書に従い、反応条件は９４℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃２０秒の４０サイクルとした。その後、２％ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌを用いて電気泳動を行い、増幅断片を確認した。
この結果、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌をＰＣＲにより検出するプライマーセット及びＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌をＰＣＲにより検出するプライマーセットを用いた場合のいずれにおいても、ニシキゴイとティラピアで、増幅ＤＮＡ断片が認められ、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌もしくはＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の存在を確認した。
養殖下にある養殖魚（ニシキゴイ、ティラピア）について、実施例１と同様に腸内の内容物からＤＮＡを抽出した。一方、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌をＰＣＲにより検出するプライマーセット（５’－ＴＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＴＣ－３’，５’－ＣＧＣＣＴＣＡＣＧＡＣＴＴＧＧＣＴＧ－３’）を設計した。このプライマーセットは、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓを定量する為にデザインされた論文記載（chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.jstage.jst.go.jp/article/bmfh/38/2/38_18-023/_pdf）のプライマーセットのそれぞれ３’末端に、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の該当配列の下線で示した塩基を追加したものである。さらに、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌をＰＣＲにより検出するプライマーセット（５’－ＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＧＴＧＴＴＡＡＴＡＧＣＡ－３’，５’－ＧＡＧＡＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＴＣＴＴＧＧＡ－３’）を設計した。このプライマーセットは、ウナギの腸内で頻度高く検出されたＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の上位３種類をアラインメントしてデザインしたものである。
これらのプライマーセットを用い、各養殖魚の腸内内容物から抽出したＤＮＡ、及びＲｏｍｂｏｕｔｓｉａ ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｉｓ（ＪＣＭ１４０４株）とＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ（ＮＢＲＣ １０５６８８株）の培養液を実施例１と同様に破砕したゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の調製はＱｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）の仕様書に従い、反応条件は９４℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃２０秒の４０サイクルとした。その後、２％ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌを用いて電気泳動を行い、増幅断片を確認した。
この結果、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌をＰＣＲにより検出するプライマーセット及びＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌をＰＣＲにより検出するプライマーセットを用いた場合のいずれにおいても、ニシキゴイとティラピアで、増幅ＤＮＡ断片が認められ、Ｒｏｍｂｏｕｔｓｉａ属細菌もしくはＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属細菌の存在を確認した。
【0041】
実施例６
スクロース投与によるウナギの飼料効率への影響
ウナギにスクロース（伊藤忠製糖製）を経口投与し、飼料効率ならびに全長・体重に及ぼす影響を調べた。５８尾ずつ収容された水槽を対照区と試験区とした。飼料はウナギ用配合飼料（マッシュ、日本農産工業株式会社製）を用い、給餌率は収容総魚体重の１．０～１．５質量％とした。給餌は配合飼料：タラ肝油：水＝１：０．１：１．３で混合して練り、柔らかい餅状にして行った。試験区の飼料は、水に配合飼料に対する添加率１０質量％のスクロースを溶解した後、配合飼料およびタラ肝油と混合して調製した。給餌は一日一回平日の９時に行った。４１日飼育したのち、対照区・試験区それぞれから全個体を取り上げ、全長と体重を測定した。
表４に対照区及び試験区における増重量に基づき算出した飼料効率を示す。
スクロース投与によるウナギの飼料効率への影響
ウナギにスクロース（伊藤忠製糖製）を経口投与し、飼料効率ならびに全長・体重に及ぼす影響を調べた。５８尾ずつ収容された水槽を対照区と試験区とした。飼料はウナギ用配合飼料（マッシュ、日本農産工業株式会社製）を用い、給餌率は収容総魚体重の１．０～１．５質量％とした。給餌は配合飼料：タラ肝油：水＝１：０．１：１．３で混合して練り、柔らかい餅状にして行った。試験区の飼料は、水に配合飼料に対する添加率１０質量％のスクロースを溶解した後、配合飼料およびタラ肝油と混合して調製した。給餌は一日一回平日の９時に行った。４１日飼育したのち、対照区・試験区それぞれから全個体を取り上げ、全長と体重を測定した。
表４に対照区及び試験区における増重量に基づき算出した飼料効率を示す。
【0042】
【表4】
【0043】
表４に示すとおり、スクロースを投与することにより、飼料効率が向上することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0044】
本発明の感染症予防剤は、安全性が高い有効成分を用いるものであり、経口投与することにより、細菌性感染症を有効に予防ないし治療することが可能であるため、抗生物質に依存しない安全で簡便な感染症に対する予防治療剤として、養殖漁業において極めて有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】