特開 2025-3058 粒子分離チップおよび粒子分離装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025003058

(43)【公開日】2025-01-09

(54)【発明の名称】粒子分離チップおよび粒子分離装置

(51)【国際特許分類】

   B01J 19/00 20060101AFI20241226BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20241226BHJP

   G01N 1/28 20060101ALI20241226BHJP

   G01N 1/10 20060101ALI20241226BHJP

   G01N 33/49 20060101ALI20241226BHJP

   B03B 5/00 20060101ALI20241226BHJP

   G01N 15/01 20240101ALI20241226BHJP

【ＦＩ】

B01J19/00 321

G01N37/00 101

G01N1/28 J

G01N1/10 A

G01N33/49 Z

B03B5/00 Z

G01N15/00 B

【審査請求】未請求

【請求項の数】23

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023103519

(22)【出願日】2023-06-23

(71)【出願人】

【識別番号】390014960

【氏名又は名称】シスメックス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100111383

【弁理士】

【氏名又は名称】芝野 正雅

(74)【代理人】

【識別番号】100170922

【弁理士】

【氏名又は名称】大橋 誠

(72)【発明者】

【氏名】阿尻 大雅

(72)【発明者】

【氏名】白井 健太郎

(72)【発明者】

【氏名】藤山 真吾

(72)【発明者】

【氏名】小日向 寛之

(72)【発明者】

【氏名】前田 夏希

【テーマコード（参考）】

2G045

2G052

4D071

4G075

【Ｆターム（参考）】

2G045AA02

2G045CA02

2G045CA11

2G045CA24

2G045CA25

2G045CB02

2G052AA30

2G052AA40

2G052AB27

2G052AD06

2G052AD26

2G052AD55

2G052BA22

2G052DA09

2G052EA08

2G052GA09

2G052GA11

2G052GA28

2G052GA29

2G052JA11

2G052JA16

4D071AA02

4D071AB61

4D071DA20

4G075AA13

4G075AA27

4G075AA39

4G075AA61

4G075AA65

4G075BB05

4G075BB10

4G075DA02

4G075DA18

4G075EB50

4G075FA01

4G075FA02

4G075FA12

4G075FB06

4G075FB12

(57)【要約】

【課題】粒子を分離する際のスループットを高めることが可能な粒子分離チップおよび粒子分離装置を提供する。
【解決手段】試料に含まれる複数の粒子を粒子の大きさに基づいて分離するための粒子分離チップ１は、内部にマイクロ流路１ａを有する上基板１０および下基板２０と複数の孔の形成された多孔シート３０とを含む。マイクロ流路１ａは、上流側に設けられた第１の粒子および第１の粒子より小さい第２の粒子を含む第１の試料が送り込まれる入口１０１と、下流側に設けられた主に第１の粒子を含む第２の試料が取り出される出口１０４と、を有する主流路１００と、主流路１００の流れ方向に沿った複数の分岐箇所において主流路１００と連通し、下流側に第２の粒子を含む第３の試料が取り出される出口２１３を有する分岐流路２００と、を備える。複数の分岐箇所において、主流路１００と分岐流路２００は多孔シート３０の孔を介して連通する。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料に含まれる複数の粒子を粒子の大きさに基づいて分離するための粒子分離チップであって、
内部にマイクロ流路を有する基板と複数の孔の形成された多孔シートとを含み、
前記マイクロ流路は、
上流側に設けられた第１の粒子および前記第１の粒子より小さい第２の粒子を含む試料が送り込まれる入口と、下流側に設けられた主に前記第１の粒子を含む試料が取り出される第１の出口と、を有する主流路と、
前記主流路の流れ方向に沿った複数の分岐箇所において前記主流路と連通し、下流側に前記第２の粒子を含む試料が取り出される第２の出口を有する分岐流路と、を備え、
前記複数の分岐箇所において、前記主流路と前記分岐流路は前記多孔シートの前記孔を介して連通する、粒子分離チップ。

【請求項2】

前記主流路および前記分岐流路が、前記入口から導入された前記試料のうち一部の試料が前記分岐流路に流れ、残りの試料が前記主流路に流れることにより、前記第１の粒子が前記第１の出口から導出され、前記第２の粒子が前記第２の出口から導出されるように構成されている、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項3】

前記主流路の流路幅は、１００μｍ以上５０ｍｍ以下である、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項4】

前記主流路の流路幅は、５００μｍ以上５０ｍｍ以下である、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項5】

前記分岐流路は、前記分岐箇所において前記主流路と連通する、平面視で前記主流路と非平行に配置された流路を含む、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項6】

前記分岐箇所において前記主流路と連通する前記流路は、平面視で前記主流路と交差して配置され、前記第２の粒子を含む前記試料を前記主流路の両側に流す、請求項５に記載の粒子分離チップ。

【請求項7】

前記分岐流路は、前記分岐箇所において前記主流路と連通する流路を、２本以上１５０００本以下含む、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項8】

前記分岐流路は、前記粒子分離チップの使用状態において前記主流路の下方に配置されている、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項9】

前記主流路は、前記分岐箇所より上流側に設けられたシース液の入口をさらに有する、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項10】

前記シース液の入口は、前記主流路を流れる前記試料の上側から前記シース液を導入するための入口である、請求項９に記載の粒子分離チップ。

【請求項11】

前記シース液の入口は、前記主流路を流れる前記試料の両側から前記シース液を導入するための入口である、請求項９に記載の粒子分離チップ。

【請求項12】

前記主流路の上流側における前記分岐箇所から前記第２の出口までの前記分岐流路の流体抵抗は、前記主流路の下流側における前記分岐箇所から前記第２の出口までの前記分岐流路の流体抵抗より大きい、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項13】

前記分岐流路は、
前記複数の分岐箇所において前記主流路とそれぞれ連通する、平面視で前記主流路と非平行に配置された複数の流路と、
前記複数の流路と前記第２の出口とを接続する中継流路と、を含み、
前記主流路の上流側の前記分岐箇所において前記主流路と連通する前記流路の長さは、前記主流路の下流側の前記分岐箇所において前記主流路と連通する前記流路の長さより長い、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項14】

前記分岐流路は、
前記複数の分岐箇所において前記主流路とそれぞれ連通する、平面視で前記主流路と非平行に配置された複数の流路と、
前記複数の流路と前記第２の出口とを接続する中継流路と、を含み、
前記主流路の上流側の前記分岐箇所において前記主流路と連通する前記流路の断面積は、前記主流路の下流側の前記分岐流路において前記主流路と連通する前記流路の断面積より小さい、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項15】

前記マイクロ流路は、前記分岐箇所における前記主流路の流量に対する前記分岐流路への流量の割合である液除去率が、前記第２の粒子が前記分岐流路に流れ、前記第１の粒子が前記主流路に流れる値になるように形成されている、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項16】

前記マイクロ流路は、前記分岐箇所における前記主流路の流量に対する前記分岐流路への流量の割合である液除去率が、前記複数の分岐箇所において、互いに実質的に同じ値になるように形成されている、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項17】

前記マイクロ流路は、前記分岐箇所における前記主流路の流量に対する前記分岐流路への流量の割合である液除去率が、前記複数の分岐箇所において、０％より大きく５０％以下になるように形成されている、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項18】

前記多孔シートは、前記主流路と前記分岐流路との交差面の開口の面積に対する前記多孔シートの孔の面積の割合である開孔率が、所定サイズの前記第１の粒子が所定の回収率で前記第１の出口から回収される値になるように形成されている、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項19】

前記多孔シートの孔の孔径は、３０ｎｍ以上１００μｍ以下である、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項20】

前記多孔シートは、前記主流路と前記分岐流路との交差面の開口の面積に対する前記多孔シートの孔の面積の割合である開孔率が、前記複数の分岐箇所において、０％より大きく５０％以下になるように形成されている、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項21】

前記第１の粒子の粒径は、３０ｎｍ以上１００μｍ以下である、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項22】

前記入口から導入される前記試料は、血液試料であり、
前記第１の粒子は、循環腫瘍細胞であり、
前記第２の粒子は、白血球、赤血球および血小板である、請求項１に記載の粒子分離チップ。

【請求項23】

請求項１ないし２２の何れか一項に記載の粒子分離チップと、
前記粒子分離チップが載置される設置部と、
前記粒子分離チップにおける前記試料の入口およびシース液の入口のそれぞれに前記試料および前記シース液を導入し、前記マイクロ流路内の液体を送液する送液部と、
前記第１の出口に連通する前記第１の粒子の第１回収部と、
前記第２の出口に連通する前記第２の粒子の第２回収部と、を備える、粒子分離装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、粒子分離チップおよび粒子分離装置に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、マイクロ流路を用いた粒子分離方法が種々開発されている。例えば、以下の非特許文献１には、水力学的濾過法を用いた粒子の分離方法が開示されている。この分離方法では、主流路と、主流路から分岐した複数の分岐流路とからなるマイクロ流路が用いられる。試料が主流路に導入されることにより、粒子の大きさに基づいて、粒子が主流路と分岐流路との間で分離される。この分離方法によれば、分離による粒子に対するダメージが少なく、また、流路の構造もシンプルにできる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】松田美由紀、外2名、「水力学的濾過法を用いた血液細胞の分級」、電気学会論文誌Ｅ、一般社団法人電気学会、2008年、128巻、10号、p. 396―401

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

上述のような水力学的濾過法を利用したマイクロ流路は、実験室レベルでの使用は可能かもしれないが、実用レベル、例えば、製品開発現場や臨床現場において求められる高い試料処理能力（スループット）を満足するものではなかった。

【0005】

かかる課題に鑑み、本発明は、製品開発現場や臨床現場において十分な試料処理能力（スループット）を発揮できる粒子分離チップおよび粒子分離装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の粒子分離チップ（１、ＣＰ１～ＣＰ５、ＣＰ１１～ＣＰ１６）は、内部にマイクロ流路（１ａ）を有する基板（１０、２０）と複数の孔（３１）の形成された多孔シート（３０）とを含む。マイクロ流路（１ａ）は、上流側に設けられた第１の粒子および第１の粒子より小さい第２の粒子を含む試料が送り込まれる入口（１０１）と、下流側に設けられた主に第１の粒子を含む試料が取り出される第１の出口（１０４）と、を有する主流路（１００）と、主流路（１００）の流れ方向に沿った複数の分岐箇所（Ｂ）において主流路（１００）と連通し、下流側に第２の粒子を含む試料が取り出される第２の出口（２１３）を有する分岐流路（２００）と、を備える。複数の分岐箇所（Ｂ）において、主流路（１００）と分岐流路（２００）は多孔シート（３０、ＰＳ１～ＰＳ７）の孔（３１）を介して連通する。

【0007】

本発明の粒子分離チップによれば、主流路と分岐流路は、複数の分岐箇所（Ｂ）において、多孔シートの孔を介して連通する。これにより、製品開発現場や臨床現場において十分な試料処理能力（スループット）を発揮できる。

【0008】

本発明の粒子分離装置（２）は、上記発明の粒子分離チップ（１、ＣＰ１～ＣＰ５、ＣＰ１１～ＣＰ１６）と、粒子分離チップ（１、ＣＰ１～ＣＰ５、ＣＰ１１～ＣＰ１６）が載置される設置部（４１）と、粒子分離チップ（１、ＣＰ１～ＣＰ５、ＣＰ１１～ＣＰ１６）における試料の入口（１０１）およびシース液の入口（１０２、１０３）のそれぞれに試料およびシース液を導入し、前記マイクロ流路（１ａ）内の液体を送液する送液部（６１～６３）と、第１の出口（１０４）に連通する第１の粒子の第１回収部（６４）と、第２の出口（２１３）に連通する第２の粒子の第２回収部（６５）と、を備える。

【0009】

本発明の粒子分離装置によれば、粒子分離チップを設置部に載置し、送液部を駆動して第１の試料およびシース液を導入することにより、第１回収部および第２回収部から、それぞれ第１の粒子および第２の粒子を円滑に回収できる。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、製品開発現場や臨床現場において十分な試料処理能力（スループット）を発揮できる粒子分離チップおよび粒子分離装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、実施形態に係る、上基板の構成を模式的に示す斜視図である。

【図2】図２は、実施形態に係る、下基板の構成を模式的に示す斜視図である。

【図3】図３は、実施形態に係る、多孔シートの構成を模式的に示す斜視図および拡大図である。

【図4】図４は、実施形態に係る、上基板、下基板および多孔シートの組み立てを模式的に示す斜視図である。

【図5】図５は、実施形態に係る、粒子分離チップの構成を模式的に示す斜視図である。

【図6】図６は、実施形態に係る、粒子分離チップの入口に対する試料およびシース液の注入と、出口からの試料の注出とを模式的に示す図である。

【図7】図７は、実施形態に係る、シース液によって第１の試料の流れる範囲が制限されることを模式的に示す図である。

【図8】図８は、実施形態に係る、シース液によって第１の試料の流れる範囲が制限されることを模式的に示す図である。

【図9】図９は、実施形態に係る、主流路の流路と、分岐流路の流路とが交差する部分の近傍を模式的に示す斜視図である。

【図10】図１０は、実施形態に係る、分岐箇所において第１の粒子と第２の粒子とが分離されることを模式的に示す図である。

【図11】図１１は、実施形態に係る、分岐流路の１つの流路の近傍を模式的に示す拡大図である。

【図12】図１２は、実施形態に係る、粒子分離装置の構成を模式的に示す斜視図である。

【図13】図１３は、実施形態に係る、細胞検出システムの機能構成を示すブロック図である。

【図14】図１４は、実施例に係る、主流路および分岐流路のサイズを模式的に示す図である。

【図15】図１５は、実施例に係る、多孔シートの孔の配置およびサイズを模式的に示す図である。

【図16】図１６は、実施例に係る、４種類のチップの構成を示す表である。

【図17】図１７は、実施例に係る、７種類の多孔シートの構成を示す表である。

【図18】図１８は、実施例に係る、４種類のチップの構成を模式的に示す平面図である。

【図19】図１９は、実施例１に係る、４種類の粒子分離チップの構成を示す表および３種類の第１の試料の構成を示す表である。

【図20】図２０は、実施例１に係る、４種類の粒子分離チップの赤血球除去率および白血球除去率を示すグラフである。

【図21】図２１は、実施例２に係る、粒子分離チップの構成を示す表および第１の試料の構成を示す表である。

【図22】図２２は、実施例２に係る、粒子分離チップの赤血球除去率、白血球除去率およびＡ５４９細胞回収率を示すグラフである。

【図23】図２３は、実施例３に係る、６種類の粒子分離チップの構成を示す表および第１の試料の構成を示す表である。

【図24】図２４は、実施例３に係る、第１の試料に含まれるJurkat細胞およびＡ５４９細胞の粒径分布を示すグラフである。

【図25】図２５は、実施例３に係る、６種類の粒子分離チップのJurkat細胞の除去率およびＡ５４９細胞の回収率を示すグラフである。

【図26】図２６は、実施例３に係る、６種類の粒子分離チップの各出口への流量を示すグラフである。

【図27】図２７は、実施例３に係る、６種類の粒子分離チップの粒径ごとの回収率を示すグラフである。

【図28】図２８は、分岐流路への排出量のシミュレーションに係る、主流路および分岐流路の構成を模式的に示す図と、分岐流路への試料の排出割合の結果を示すグラフである。

【図29】図２９は、分岐流路の変更例に係る、分岐流路の構成を模式的に示す図である。

【図30】図３０は、分岐流路の変更例に係る、分岐流路の近傍の構成を示す平面図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

＜実施形態＞
以下の実施形態は、液体試料に含まれる複数の粒子を、粒子の大きさに基づいて分離するための粒子分離チップおよび粒子分離装置に本発明を適用したものである。以下の実施形態において、粒子分離チップは、第１の粒子および第１の粒子より小さい第２の粒子を含む液体の試料（第１の試料）を、主として第１の粒子を含む液体の試料（第２の試料）と、主として第２の粒子を含む液体の試料（第３の試料）とに分離する。第１の試料は、血液試料である。血液試料は、例えば、全血や、全血から調製された試料などである。第１の粒子は、例えば、血中循環腫瘍細胞（Circulating Tumor Cell：ＣＴＣ）であり、第２の粒子は、例えば、白血球、赤血球、血小板およびナノ粒子である。ナノ粒子は、例えば、エクソソーム等の細胞外小胞、微小なタンパク質、微小なデブリスなどである。粒子の大きさとは、例えば、粒子の直径や半径、平面視した場合の面積や周囲の長さなどである。以下の説明において、粒径は、粒子の直径を示す。

【0013】

以下、便宜上、各図には互いに直交するＸ、Ｙ、Ｚ軸が付記されている。Ｚ軸方向は、後述する粒子分離チップ１および粒子分離装置２の高さ方向である。Ｘ－Ｙ平面は、水平面に平行である。なお、実施形態において、試料はＸ軸方向に流れ、図中、流路の左側を上流側、流路の右側を下流側と呼ぶ。

【0014】

図１～５を参照して、粒子分離チップ１の構成を説明する。粒子分離チップ１は、上基板１０（図１に示す）と、下基板２０（図２に示す）と、上基板１０と下基板２０に挟まれた多孔シート３０（図３に示す）と、から構成されている。

【0015】

図１は、上基板１０の構成を模式的に示す斜視図である。

【0016】

上基板１０は、Ｘ－Ｙ平面に平行な対向面１０ａおよび上面１０ｂを有し、両面の間隔がＤ１である板状部材で構成されている。また、上基板１０は、Ｘ軸方向に平行な中心軸ＣＡにおいて、上基板１０と垂直に交わる仮想の垂直面ＶＰに関して、Ｙ軸方向に面対称に構成されている。対向面１０ａは、後述する下基板２０に対向する面であり、上面１０ｂは、粒子分離チップ１が完成した場合に粒子分離チップ１の上面となる面である。

【0017】

上基板１０は、表面を血液試料が円滑に流れ、且つ、高精度な加工が可能な材料、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）により構成される。なお、上基板１０は、ガラス、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）などにより構成されてもよい。

【0018】

対向面１０ａには、所定の深さｄ１の主流路１００が形成されている。また、上基板の右側端に沿って貫通孔からなる４つの出口２１３が形成されている。主流路１００および４つの出口２１３は、例えば、半導体の加工プロセスによって形成される。主流路１００は、対向面１０ａに対してＺ軸方向に窪んだ凹部を有し、この凹部の底面は、Ｘ－Ｙ平面に平行である。主流路１００は、上基板１０と下基板２０とが重ね合わせられることにより流路を形成し、その中を試料が移送可能となる。４つの出口２１３は、後述する分岐流路２００の一部を構成する。

【0019】

主流路１００は、その左側に設けられた入口１０１、１０２、１０３と、流路１１１、１１２と、一対の流路１１３と、その中央部に設けられた流路１２０と、その右側に設けられた出口１０４と、を備える。

【0020】

入口１０１～１０３および出口１０４は、上基板１０をＺ軸方向に貫通する貫通孔で形成され、垂直面ＶＰおよび中心軸ＣＡに沿って一列に配置されている。出口１０４のＹ軸に沿った両側には、それぞれ２つの出口２１３が一列に配置されている。４つの出口２１３は、上基板１０をＺ軸方向に貫通する貫通孔で形成されている。

【0021】

流路１１１、１１２は、Ｘ軸方向に延びており、中心軸ＣＡ上に沿って配置されている。流路１１１、１１２の幅は一定である。流路１１１の上流側の端部は、入口１０１に繋がっており、流路１１１の下流側の端部は、流路１２０に繋がっており、流路１１１の中央部は、入口１０２に繋がっている。

【0022】

入口１０３は、入口１０１の左側に位置し、流路１１２の左側の端部は、入口１０３に繋がっている。一対の流路１１３は、流路１１２から垂直面ＶＰのＹ軸方向両側に沿って分岐している。一対の流路１１３は、入口１０１、１０２を迂回して、流路１１２と流路１１１とを接続している。一対の流路１１３の右側の端部は、入口１０２と流路１２０との間で、流路１１１に対して斜め方向に繋がっている。一対の流路１１３の幅は一定である。

【0023】

流路１２０は、Ｘ軸方向に延びており、中心軸ＣＡ上に配置されている。流路１２０のＹ軸方向の幅は、流路１２０の左側の部分において、流路１１１、１２０の接続部分から中央部に進むにつれて徐々に大きくなっている。流路１２０の左側部分を除くＹ軸方向の幅は、一定であり、流路１１１～１１３の幅よりも広い。流路１２０の右側の端部は、出口１０４に繋がっている。

【0024】

主流路１００のサイズは、例えば以下のように設定可能である。

【0025】

粒子分離チップ１の外形が平面視において１５０ｍｍ四方に形成される場合、流路１２０のＸ軸方向の長さは、例えば、１５０ｍｍ以下に設定される。流路１２０のＹ軸方向の幅は、外形の一辺の長さの３分の１程度を目安として、例えば、５０ｍｍ以下に設定される。

【0026】

流路１２０のＹ軸方向の幅は、１回の粒子分離処理において血液試料として全血５ｍＬが粒子分離チップ１に流される場合、例えば、５００μｍ以上に設定される。本実施形態によれば、流路１２０のＹ軸方向の幅が５００μｍである場合、例えば、全血５ｍＬを流すために必要な時間は２００分であり、粒子分離処理のスループットは２５μＬ／分となる。また、流路１２０のＹ軸方向の幅が５０ｍｍである場合、例えば、全血５ｍＬを流すために必要な時間は２分であり、粒子分離処理のスループットは２．５ｍＬ／分となる。１回の粒子分離処理においてさらに少ない量の全血が粒子分離チップ１に流される場合、流路１２０のＹ軸方向の幅は、例えば１００μｍ以上に設定されてもよい。スループットとは、単位時間当たりに粒子分離処理に供される試料の量であり、試料が血液試料の場合、単位時間当たりに粒子分離処理に供される無希釈の全血の量である。

【0027】

流路１２０の深さｄ１（上基板１０に形成された流路１２０に対応する凹部のＺ軸方向の高さ）は、第１の粒子が流路１２０内で移送可能となるよう、第１の粒子の粒径よりも大きく設定される。第１の粒子がＣＴＣである場合、流路１２０の深さｄ１は、例えば１００μｍ以上に設定され、第１の粒子がナノ粒子である場合、流路１２０の深さｄ１は、例えば５０ｎｍ以上に設定される。また、流路１２０は半導体の加工プロセスによって形成されるため、流路１２０の深さｄ１は、例えば１ｍｍ以下に設定される。

【0028】

なお、流路１１１～１１３の深さも、流路１２０の深さと同様の理由から、例えば５０ｎｍ以上１ｍｍ以下に設定される。

【0029】

図２は、下基板２０の構成を模式的に示す斜視図である。

【0030】

下基板２０は、Ｘ－Ｙ平面に平行な対向面２０ａおよび下面２０ｂを有し、両面の間隔がＤ２である板状部材で構成されている。また、下基板２０は、Ｘ軸方向に平行な中心軸ＣＡにおいて、下基板２０と垂直に交わる仮想の垂直面ＶＰに関して、Ｙ軸方向に面対称に構成されている。対向面２０ａは、上基板１０に対向する面であり、下面２０ｂは、粒子分離チップ１が完成した場合に粒子分離チップ１の下面となる面である。

【0031】

下基板２０は、表面を血液試料が円滑に流れ、且つ、高精度な加工が可能な材料により構成される。本実施形態の下基板２０は、上基板１０と同様、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）により構成される。なお、下基板２０は、ガラス、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）などにより構成されてもよい。

【0032】

対向面２０ａには、所定の深さｄ２の分岐流路２００が形成されている。分岐流路２００は、例えば、半導体の加工プロセスによって形成される。分岐流路２００は、対向面２０ａに対してＺ軸方向に窪んだ凹部を有し、この凹部の底面は、Ｘ－Ｙ平面に平行である。分岐流路２００は、上基板１０と下基板２０とが重ね合わせられることにより流路を形成し、その中を試料が移送可能に構成となる。

【0033】

分岐流路２００は、複数の流路２０１と、２つの中継流路２１１と、４つの中継流路２１２と、を備える。また、分岐流路２００は、図１に示した４つの出口２１３を含む。図２では、複数の流路２０１の一部および２つの中継流路２１１の一部の図示が、便宜上、点線によって省略されている。

【0034】

複数の流路２０１は、Ｙ軸方向に平行に延びており、所定の間隔をあけてＸ軸方向に並んでいる。各流路２０１のＹ軸方向の長さは、Ｘ軸方向右側に進むにつれて、短くなっている。すなわち、複数の流路２０１の全体の外形は、平面視において台形になっている。

【0035】

２つの中継流路２１１は、それぞれ、複数の流路２０１の一端と他端に配置されており、複数の流路２０１と繋がっている。中継流路２１１は、主流路１００（図１参照）の右側に進むにつれて、その両端が中心軸ＣＡに近づくように延びている。４つの中継流路２１２は、Ｘ軸方向に平行に延びている。複数の流路２０１の一端側の中継流路２１１および複数の流路２０１の他端側の中継流路２１１に、それぞれ、２つの中継流路２１２が繋がっている。

【0036】

分岐流路２００のサイズは、例えば以下のように設定可能である。

【0037】

粒子分離チップ１の外形が平面視において１５０ｍｍ四方に形成される場合、複数の流路２０１のＹ軸方向の長さは、例えば、１５０ｍｍ以下に設定される。また、複数の流路２０１のＹ軸方向の長さは、いずれも流路１２０のＹ軸方向の幅より長く設定される。

【0038】

流路２０１の幅（Ｘ軸方向の長さ）は、第２の粒子が流路２０１内で移送可能となるよう、第２の粒子の粒径よりも大きく設定される。第２の粒子が白血球、赤血球および血小板である場合、流路２０１の幅は、例えば１００μｍ以上に設定され、第２の粒子がナノ粒子である場合、流路２０１の幅は、例えば５０ｎｍ以上に設定される。流路２０１の幅は、十分な数の流路２０１を配置可能とするために、例えば１ｍｍ以下に設定される。

【0039】

また、複数の流路２０１の本数は、２本以上１５０００本以下に設定される。発明者らの検討によれば、流路２０１の幅を１００μｍとし、隣り合う流路２０１の間隔を５０μｍとした場合、１５０本程度の流路２０１を形成可能である。また、半導体の加工プロセスによれば、上記流路２０１の幅および間隔をさらに１／１００程度に小さくできることから、１５０００本の流路２０１の形成が可能となる。また、流路２０１は、後述する水力学的濾過法（Hydrodynamic Filtration：ＨＤＦ）を実現するために、２本以上配置される。

【0040】

流路２０１の深さｄ２（下基板２０に形成された流路２０１に対応する凹部のＺ軸方向の高さ）も、第２の粒子が流路２０１内で移送可能となるよう、第２の粒子の粒径よりも大きく設定される。第２の粒子が白血球、赤血球および血小板である場合、流路２０１の深さｄ２は、例えば１００μｍ以上に設定され、第２の粒子がナノ粒子である場合、流路２０１の深さｄ２は、例えば５０ｎｍ以上に設定される。また、流路２０１は半導体の加工プロセスによって形成されるため、流路２０１の深さｄ２は、例えば１ｍｍ以下に設定される。

【0041】

なお、中継流路２１１、２１２の深さも、流路２０１の深さと同様の理由から、例えば５０ｎｍ以上１ｍｍ以下に設定される。

【0042】

図３は、多孔シート３０の構成を模式的に示す斜視図および拡大図である。

【0043】

多孔シート３０は、平面視において矩形形状であり、薄膜状のシートである。多孔シート３０は、Ｚ軸方向に多孔シート３０を貫通する複数の孔３１を備える。後述するように、主流路１００を流れる第２の粒子は、多孔シート３０の孔３１を通って分岐流路２００へと移動する。多孔シート３０は、表面を血液試料が円滑に流れ、高精度に孔３１を形成可能であり、且つ、破損しにくい材料により構成される。本実施形態の多孔シート３０は、例えばニッケルにより構成される。なお、多孔シート３０は、必ずしも金属でなくてもよく、ガラスやＰＤＭＳなどにより構成されてもよい。

【0044】

多孔シート３０のサイズは、例えば以下のように設定可能である。

【0045】

多孔シート３０の厚さは、水力学的濾過法による第２の粒子の分離が実現されるよう、例えば、１μｍ以上１ｍｍ以下に設定される。発明者らの検討によれば、多孔シート３０の厚みを１ｍｍに設定したとしても、多孔シート３０により孔３１を通過する第２の粒子にかかる流体抵抗をほぼ無視できる。孔３１の孔径は、第１の粒子が主流路１００の流路１２０内を下流側に円滑に進むように、例えば、３０ｎｍ以上１００μｍ以下、より好ましくは、５０ｎｍ以上１００μｍ以下に設定される。

【0046】

多孔シート３０の孔３１の面積の割合である開孔率は、多孔シート３０の強度を維持するために、例えば０％より大きく５０％以下に設定される。本実施形態では、多孔シート３０に形成された全ての孔３１の大きさおよび形状は、互いに同じであり、全ての孔３１は、多孔シート３０において均等に配置されている。したがって、多孔シート３０の開孔率は、後述する主流路１００および分岐流路２００が連通する複数の分岐箇所Ｂ（図９参照）において、互いに実質的に同じ値となる。

【0047】

なお、多孔シート３０の開孔率は、複数の分岐箇所Ｂにおいて、互いに異なる値であってもよい。この場合、多孔シート３０は、複数の分岐箇所Ｂにおいて、孔３１の数が互いに異なってもよいし、孔３１の径が互いに異なってもよい。また、多孔シート３０は、１つの分岐箇所Ｂ内において、領域によって孔３１の数が互いに異なってもよいし、孔３１の径が互いに異なってもよい。

【0048】

多孔シート３０のＹ軸方向の長さは、上基板１０の流路１２０の一定幅の部分のＹ軸方向の幅より、長く設定される。多孔シート３０のＸ軸方向の長さは、下基板２０の複数の流路２０１全体のＸ軸方向の長さより、長く設定される。

【0049】

図４は、上基板１０、下基板２０および多孔シート３０の組み立てを模式的に示す斜視図である。図４では、便宜上、主流路１００の対向面１０ａ側の輪郭が破線で示されている。

【0050】

図１に示した上基板１０が、表裏反転された状態で、図２に示した下基板２０に接合される。すなわち、上基板１０の対向面１０ａと、下基板２０の対向面２０ａとが対向するように、上基板１０および下基板２０が接合される。このとき、上基板１０と下基板２０との間に、図３に示した多孔シート３０が配置される。上基板１０および下基板２０がＰＤＭＳにより構成される場合、対向面１０ａ、２０ａの表面の二酸化ケイ素に対して酸素プラズマにより表面改質を行うことにより、対向面１０ａ、２０ａが接合される。表面改質は、紫外線を用いたＵＶオゾン処理により行われてもよい。こうして、図５に示すように粒子分離チップ１が完成する。

【0051】

図５は、粒子分離チップ１の構成を模式的に示す斜視図である。

【0052】

主流路１００は、上基板１０の対向面１０ａに形成された凹部と、この凹部に対向する下基板２０の対向面２０ａとによって構成される。分岐流路２００は、下基板２０の対向面２０ａに形成された凹部と、この凹部に対向する上基板１０の対向面１０ａとによって構成される。主流路１００および分岐流路２００により、マイクロ流路１ａが構成される。マイクロ流路とは、一般的に、深さおよび幅が１０μｍ～１ｍｍ程度の流路のことである。上基板１０の出口２１３は、下基板２０の中継流路２１２のＸ軸方向右側の端部に重なっており、出口２１３は、中継流路２１２に繋がっている。

【0053】

Ｘ軸方向において、多孔シート３０は、分岐流路２００の複数の流路２０１の全体を覆うように配置されている。また、Ｙ軸方向において、多孔シート３０は、最も短い流路２０１の内側に配置されている。

【0054】

次に、図６～１１を参照して、粒子分離チップ１によって試料に含まれる第１の粒子と第２の粒子とが分離される作用について説明する。

【0055】

図６は、粒子分離チップ１の入口１０１～１０３に対する試料およびシース液の注入と、出口１０４、２１３からの試料の注出とを模式的に示す図である。

【0056】

入口１０１には、第１の粒子および第１の粒子より小さい第２の粒子を含む液体試料が第１の試料として流し込まれる。入口１０２、１０３には、シース液が注入される。シース液として、例えば、シスメックス株式会社製のセルパック（登録商標）を用いることができる。出口１０４から、主として第１の粒子を含む液体試料が第２の試料として取り出される。複数の出口２１３から、主として第２の粒子を含む液体試料が第３の試料として取り出される。

【0057】

図７、８は、シース液によって第１の試料の流れる範囲が制限されることを模式的に示す図である。図７は、便宜上、入口１０１、１０２と、流路１１１、１１３の接続部分の近傍とを模式的に示している。図８の上段、中段および下段は、それぞれ、図７のＣ２１－Ｃ２２断面、Ｃ３１－Ｃ３２断面およびＣ４１－Ｃ４２断面を示している。

【0058】

図７に示すように、第１の試料は、入口１０１を介して流路１１１に流される。入口１０２から注入されたシース液は、流路１１１を流れる第１の試料を、下方向に押し付ける。これにより、図８の上段に示すように、流路１１１を流れる第１の試料の範囲が、シース液により流路１１１の底面付近に制限される。

【0059】

図７に示すように、一対の流路１１３は、入口１０２と流路１２０との間において、Ｘ軸方向に対して傾いた方向で、流路１１１の両側面に接続されている。一対の流路１１２から流路１１１に流れ込むシース液は、入口１０２の下方から下流側に流れる第１の試料を、垂直面ＶＰ（図１、２参照）に近づく方向に押し付ける。これにより、図８の中段に示すように、流路１１１を流れる第１の試料の範囲が、シース液により流路１１１の中央付近に制限される。

【0060】

図７に示すように、流路１２０の幅は、流路１１１の幅よりも広いため、流路１１１から流路１２０に流れる第１の試料は、Ｙ軸方向に広がって下流側へと流れる。このとき、図８の下段に示すように、第１の試料の範囲は、Ｙ軸方向に広がるものの、一対の流路１１３からのシース液によって中央に向かって押さえられているため、流路１２０の中央付近に制限される。

【0061】

図９は、主流路１００の流路１２０と、分岐流路２００の流路２０１とが交差する部分の近傍を模式的に示す斜視図である。

【0062】

平面視において流路１２０と流路２０１とが重なる部分において、流路１２０側の凹部と、流路２０１側の凹部とは、Ｚ軸方向に繋がっている。流路１２０と流路２０１との交差面は開口となるが、この開口には多孔シート３０が配置され、開口は塞がれる。多孔シート３０が配置された流路１２０と流路２０１との交差面の開口に対応する箇所が、分岐箇所Ｂである。従って、分岐箇所Ｂの面積は、流路１２０と流路２０１との交差面の開口の面積と等しい。分岐流路２００は、主流路１００の流れ方向（Ｘ軸方向）に沿った複数の分岐箇所Ｂにおいて主流路１００と連通している。多孔シート３０は、複数の分岐箇所Ｂに跨がるように配置されている。

【0063】

なお、本実施形態において、複数の分岐箇所Ｂは、互いに同じ形状であり、互いに同じＹ軸方向の位置およびＺ軸方向の位置に配置されている。また、複数の分岐箇所Ｂは、Ｘ軸方向の間隔が互いに同じになるように配置されている。しかし、複数の分岐箇所Ｂは、主流路１００の入口１０１から出口１０４の間で互いにＸ軸方向の間隔を空けて配置されていればよい。例えば、複数の分岐箇所Ｂは、互いに異なる形状であってもよいし、互いに異なる面積であってもよい。複数の分岐箇所Ｂは、互いに異なるＹ軸方向の位置に配置されていてもよいし、互いに異なるＺ軸方向の位置に配置されていてもよい。分岐箇所Ｂの複数の間隔は、互いに異なっていてもよい。

【0064】

流路１２０を通って下流側に流れる第１の試料が分岐箇所Ｂを通ると、第１の試料に含まれる第２の粒子が、多孔シート３０の孔３１を介して流路２０１へと流れる。そして、第２の粒子を含む第３の試料が、出口２１３（図６参照）から取り出される。一方、第１の試料に含まれる第１の粒子は、流路２０１に流れることなく流路１２０を下流側へと流れる。そして、第１の粒子を含む第２の試料が、出口１０４（図６参照）から取り出される。

【0065】

このとき、図８の下段に示したように、第１の試料は、厚さ方向の上部および幅方向の両端が制限された状態で分岐箇所Ｂに流れるため、第１の試料に含まれる第２の粒子を流路２０１へ円滑に分離できる。

【0066】

図１０は、図９に示した分岐箇所Ｂにおいて、第１の粒子と第２の粒子とが分離されることを模式的に示す図である。図１０は、図６のＣ１１－Ｃ１２断面を示している。

【0067】

図１０では、便宜上、第１の粒子が白色の円で示されており、第２の粒子が黒色の円で示されている。第１の試料に含まれる第１の粒子および第２の粒子以外の成分が、濃い網点で示されており、入口１０２、１０３から注入されたシース液が薄い網点で示されている。また、多孔シート３０全体のうち、分岐箇所Ｂ（図９参照）の位置における多孔シート３０のみが図示されている。

【0068】

図７および図８の上段を参照して説明したように、入口１０１から注入された第１の試料は、入口１０２から注入されたシース液によって下方向に押し付けられているため、第１の試料は、主流路１００の底面に沿って下流側へと流れる。本実施形態の複数の流路２０１は、水力学的濾過法（ＨＤＦ）によって第１の粒子と第２の粒子とが分離可能となるように構成されている。

【0069】

図１１は、図１０において１つの流路２０１の近傍を模式的に示す拡大図である。

【0070】

１つの流路２０１に対して上流側から流れる流路１２０内の流量をＱｍとし、当該流路２０１へと流れる流量をＱｓとすると、流量Ｑｍと流量Ｑｓとの関係は、当該分岐箇所Ｂにおける液除去率ａを用いて、以下の式（１）により表すことができる。

【0071】

Ｑｓ＝Ｑｍ×ａ …（１）

【0072】

分岐箇所Ｂにおける液除去率ａは、第２の粒子が分岐流路２００に流れ、第１の粒子が主流路１００に流れる値に設定される。水力学的濾過法によれば、第１の試料の液体部分のうち各流路２０１に流れ込む第１の試料の液体部分の高さｈは、液除去率ａによって決まる。そこで、本実施形態では、第１の試料の液体部分の高さｈが、第１の粒子の半径より小さく、且つ、第２の粒子の半径より大きくなるように、液除去率ａが設定されている。これにより、第１の粒子は、第１の試料の流れに沿って下流側に移送され、第２の粒子は、第１の試料の高さｈの範囲の液体部分によって各流路２０１へと分離される。

【0073】

本実施形態では、全ての分岐箇所Ｂにおける液除去率ａが、互いに実質的に同じ値に設定される。各流路２０１の液除去率ａが互いに等しい場合、各流路２０１に流れ込む第１の試料の液体部分の高さｈも互いに等しくなる。これにより、複数の分岐箇所Ｂにおいて、満遍なく一定のサイズの第２の粒子を分離できる。

【0074】

ここで、分岐箇所Ｂにおける液除去率ａは、分岐箇所Ｂから出口２１３（図６参照）までの分岐流路２００の流体抵抗により決まる。そこで、本実施形態では、上流側における分岐箇所Ｂから出口２１３までの分岐流路２００の流体抵抗が、下流側における分岐箇所Ｂから出口２１３までの分岐流路２００の流体抵抗より大きく設定される。これにより、上流側の分岐箇所Ｂにおける流体抵抗が、下流側の分岐箇所Ｂにおける流体抵抗より大きくなり、各分岐箇所Ｂにおける液除去率ａを、互いに実質的に等しい値に設定できる。

【0075】

本実施形態では、中継流路２１１、２１２（図６参照）のサイズが流路２０１に比べて大きいため、分岐箇所Ｂにおける液除去率ａは、実質的に流路２０１の流体抵抗によって決まる。したがって、本実施形態では、上流側における流路２０１のＹ軸方向の長さが、下流側における流路２０１のＹ軸方向の長さより長く設定されている。これにより、上流側の分岐箇所Ｂに繋がる流路２０１の流体抵抗を、下流側の分岐箇所Ｂに繋がる流路２０１の流体抵抗より大きく設定できる。

【0076】

また、複数の分岐箇所Ｂにおける液除去率ａは、いずれも０％より大きく５０％以下となるように設定される。これにより、流路１２０の深さｄ１よりも小さな粒径を有する第２の粒子を流路２０１に分離できる。

【0077】

また、本実施形態では、分岐箇所Ｂに配置された多孔シート３０の各々の孔３１によって、図１１の孔３１の位置の太線矢印に示すように、主流路１００の流路１２０から分岐流路２００の流路２０１へと、第２の粒子を移動させる試料の流れを形成できる。このため、スループットを高めるために、図１１に示すように流路２０１のＸ軸方向の幅を広げて流路２０１の流量を高めても、流路２０１へと向かう第２の粒子の試料の流れを、多孔シート３０の複数の孔３１に分散させることができる。これにより、第２の粒子の試料の流れを、流路２０１の一部にだけ形成するのではなく流路２０１全体に形成できる。また、図１１に示すように、多孔シート３０に複数の孔３１が形成され、流路２０１のＸ軸方向の幅が広いため、多孔シート３０および流路２０１において目詰まりが生じることを抑制できる。

【0078】

よって、目詰まりなく効率的に、第２の粒子を流路２０１へと分離させることができ、主流路１００および分岐流路２００の流量を高めて、粒子分離のスループットを効率的に高めることができる。

【0079】

なお、本実施形態では、流路２０１へと分離される第２の粒子の粒径は、多孔シート３０の孔３１の孔径と第２の粒子の粒径との大小関係により決まるのではなく、液除去率ａに基づく高さｈにより決まる。すなわち、多孔シート３０は、孔３１によって第１の試料から第２の粒子を分離させるフィルタとして用いられているのではなく、上述したように、流路２０１へと向かう第２の粒子の流れを分散させるために用いられている。したがって、孔３１の孔径は、例えば、分離対象とする第２の粒子の粒径より大きくてもよい。

【0080】

図１０に戻り、複数の分岐箇所Ｂにおいて第２の粒子が分離されることにより、分岐流路２００の流路２０１には、第２の粒子および第１の試料の液体部分が流れる。これにより、出口２１３（図６参照）から取り出される第３の試料は、主として第２の粒子を含むことになる。一方、主流路１００の流路１２０には、第１の粒子およびシース液が残される。これにより、出口１０４から取り出される第２の試料は、主として第１の粒子を含むことになる。

【0081】

次に、第１の粒子と第２の粒子とを分離する粒子分離装置２について説明する。

【0082】

図１２は、粒子分離装置２の構成を模式的に示す斜視図である。

【0083】

粒子分離装置２は、粒子分離チップ１と、固定部４０と、３つの入口ノズル５１～５３と、５つの出口ノズル５４、５５と、送液部６１～６３と、第１回収部６４と、４つの第２回収部６５と、を備える。

【0084】

粒子分離チップ１は、粒子分離処理が行われる度に洗浄され、再利用される。なお、粒子分離チップ１は、粒子分離処理が行われるたびに新しいものに交換される交換可能な粒子分離チップとして構成されてもよい。

【0085】

固定部４０は、設置部４１と、昇降部４２と、を備える。設置部４１は、Ｘ－Ｙ平面に平行な平板４０ａと、平板４０ａの上面に設置された枠部４０ｂと、を備える。平面視において、枠部４０ｂの中央には粒子分離チップ１の外形とほぼ同じサイズの開口が形成されており、この開口に粒子分離チップ１が設置される。昇降部４２は、Ｚ軸方向に移動可能となるよう昇降機構２ｂ（図１３参照）に支持されている。昇降部４２は、枠部４０ｂに配置された粒子分離チップ１の上方に延びたアーム部４２ａを備える。

【0086】

入口ノズル５１～５３の上端は、それぞれ、送液部６１～６３にチューブを介して接続されている。送液部６１～６３は、例えばシリンジポンプである。送液部６１は、所定量の第１の試料を所定の速度で入口ノズル５１に送液可能に構成されている。送液部６２、６３は、所定量のシース液を所定の速度で、それぞれ入口ノズル５２、５３に送液可能に構成されている。

【0087】

出口ノズル５４の上端は、第１回収部６４にチューブを介して接続されている。４つの出口ノズル５５の上端は、それぞれ、第２回収部６５にチューブを介して接続されている。第１回収部６４および４つの第２回収部６５は、試料を回収するための容器である。なお、出口ノズル５４と第１回収部６４とを接続するチューブに、第２の試料を第１回収部６４に送るためのシリンジポンプにより構成された送液部が配置されてもよい。出口ノズル５５と第２回収部６５とを接続するチューブに、第３の試料を第２回収部６５に送るためのシリンジポンプにより構成された送液部が配置されてもよい。

【0088】

粒子分離処理が行われる場合、枠部４０ｂの開口に粒子分離チップ１が設置され、昇降部４２が下方に移動することにより、粒子分離チップ１の上面（上基板１０の上面１０ｂ）が、アーム部４２ａによって下方に押さえられる。これにより、粒子分離チップ１が固定される。その後、入口ノズル５１～５３が、それぞれ、粒子分離チップ１の入口１０１～１０３に接続され、出口ノズル５４、５５が、それぞれ、粒子分離チップ１の出口１０４、２１３に接続される。

【0089】

この状態で、送液部６２が、入口１０２を介して流路１１１（図６参照）にシース液を送り、送液部６３が、入口１０３を介して流路１１２、１１３（図６参照）にシース液を送る。そして、送液部６１が、入口１０１を介して流路１１１に第１の試料を送る。これにより、図１０、１１を参照して説明したように、第１の粒子および第２の粒子を含む試料（第１の試料）が、第１の粒子を含む試料（第２の試料）と、第２の粒子を含む試料（第３の試料）とに分離される。そして、第２の試料が、出口１０４を介して第１回収部６４に回収され、第３の試料が、４つの出口２１３を介して４つの第２回収部６５に回収される。こうして、粒子分離処理が終了する。

【0090】

図１３は、細胞検出システム５の機能構成を示すブロック図である。

【0091】

細胞検出システム５は、粒子分離装置２と、染色濃縮装置３と、イメージングフローサイトメーター４と、を備える。細胞検出システム５は、被検者から採取された血液試料に含まれる第１の粒子（例えば、ＣＴＣ）を検出するためのシステムである。

【0092】

図１２に示した粒子分離装置２は、制御部２ａと、昇降機構２ｂと、送液部６１～６３と、を備える。制御部２ａは、例えば、ＣＰＵおよびメモリを備え、粒子分離装置２の各部を制御する。昇降機構２ｂは、図１２の昇降部４２を上下に移送させるためのモータを備える。

【0093】

粒子分離装置２は、粒子分離チップ１を用いて血液試料を分離し、第１の粒子を含む第２の試料を取得する。染色濃縮装置３は、粒子分離装置２で取得された第２の試料に基づいて、第２の試料に含まれる第１の粒子を染色する染色工程を行う。イメージングフローサイトメーター４は、染色工程を経た第２の試料に含まれる粒子を撮像し、撮像画像を取得する。医師や検査技師などのオペレータは、イメージングフローサイトメーター４で取得された撮像画像を参照し、被検者から採取した血液試料における第１の粒子（例えば、ＣＴＣ）の有無を判定する。

【0094】

＜実施例の構成＞
次に、上記実施形態の具体的な実施例について説明する。以下の実施例では、第１の試料は、被検者から採取された全血である。第１の粒子は、取得対象の細胞（標的細胞）であり、血中循環腫瘍細胞（Circulating Tumor Cell：ＣＴＣ）である。第２の粒子は、除去対象の細胞（非標的細胞）であり、白血球、赤血球および血小板である。発明者らは、図１４～１８を参照して説明するチップおよび多孔シートを組み合わせて粒子分離チップ１を作成し、作成した粒子分離チップ１を用いて実際に粒子分離処理を行った。

【0095】

図１４は、実施例に係る、主流路１００および分岐流路２００のサイズを模式的に示す図である。図１５は、実施例に係る、多孔シート３０の孔３１の配置およびサイズを模式的に示す図である。

【0096】

図１４に示すように、主流路１００の深さは、０．１ｍｍである。入口１０１～１０３の径は、１．５ｍｍである。流路１１１～１１３の幅（流路内の試料の進行方向に垂直な方向の長さ）は、０．５ｍｍである。流路１２０の幅（Ｙ軸方向の長さ）は、４ｍｍである。流路１２０のＹ軸方向の幅が一定の領域のＸ軸方向右側の端部は、複数の流路２０１の最もＸ軸方向右側の端部に対して、Ｘ軸方向右側に２ｍｍ離れている。

【0097】

分岐流路２００の深さは、０．１ｍｍである。複数の流路２０１の最も左側の端部から、流路１２０のＹ軸方向の幅が一定の領域の右側の端部までの距離は、Ｌｍａｉｎである。複数の流路２０１の本数はｎである。最も左側の流路２０１の通し番号は１であり、最も右側の流路２０１の通し番号はｎである。１番目およびｎ番目の流路２０１が、流路１２０に対してＹ軸方向に突出している長さは、それぞれＬ１、Ｌｎである。流路２０１の幅（Ｘ軸方向の長さ）はｗであり、隣り合う２つの流路２０１の間隔はｖである。

【0098】

多孔シート３０のＸ軸方向の長さは、３０ｍｍであり、多孔シート３０のＹ軸方向の幅は、６ｍｍである。図１５に示すように、多孔シート３０の孔３１の孔径はφであり、隣り合う２つの孔３１のピッチはｐである。隣り合う３つの孔３１の中心を結ぶ３つの直線は、互いに６０°の角度をなしている。多孔シート３０の孔３１の面積の割合である開孔率はＲである。多孔シート３０の厚さは、５μｍである。

【0099】

以下、距離Ｌｍａｉｎ、本数ｎ、長さＬ１、Ｌｎ、幅ｗおよび間隔ｖを異ならせて、図１６に示すように、上基板１０および下基板２０からなる４種類のチップＣ１～Ｃ４を作成した。また、ピッチｐ、孔径φおよび開孔率Ｒを異ならせて、図１７に示すように、多孔シートＰＳ１～ＰＳ７を作成した。

【0100】

なお、図１８に示すように、チップＣ１、Ｃ２では、４つの中継流路２１２が設けられ、４つの中継流路２１２に第３の試料をそれぞれ導く４つの中継流路２１１が設けられている。チップＣ３、Ｃ４では、６つの中継流路２１２が設けられ、６つの中継流路２１２に第３の試料をそれぞれ導く６つの中継流路２１１が設けられている。図１８に示すチップＣ１～Ｃ４によれば、１つの流路２０１に流れ出た第３の試料は、当該流路２０１に対応する１つの中継流路２１１および１つの中継流路２１２を経由して、出口２１３から取り出される。

【0101】

［実施例１］
実施例１では、４種類の粒子分離チップ１を上記の粒子分離装置２に設置し、各粒子分離チップ１に第１の試料を流して、赤血球および白血球の除去率を調査した。

【0102】

図１９の上段は、実施例１に係る、４種類の粒子分離チップＣＰ１～ＣＰ４の構成を示す表である。図１９の下段は、実施例１に係る、３種類の第１の試料の構成を示す表である。

【0103】

図１９の上段に示すように、４種類の粒子分離チップＣＰ１～ＣＰ４は、図１６に示したチップＣ１～Ｃ４と、図１７に示した多孔シートＰＳ７とを組み合わせたものである。図１９の下段に示すように、３種類の第１の試料は、全血量および希釈液量が異なっている。「全血希釈なし」の第１の試料は、全血のみからなる５ｍＬの試料である。「全血１．５倍希釈」の第１の試料は、３．３３ｍＬの全血を１．６７ｍＬの希釈液で希釈した５ｍＬの試料である。「全血２倍希釈」の第１の試料は、２．５ｍＬの全血を２．５ｍＬの希釈液で希釈した５ｍＬの試料である。３種類の第１の試料に用いられる全血は、健常人から採取したものである。

【0104】

実施例１では、粒子分離チップＣＰ１～ＣＰ４において、入口１０１から１００μＬ／ｍｉｎで上記３種類の第１の試料１ｍＬを別々に流した。このとき、３種類の第１の試料（全血希釈なし、全血１．５倍希釈、全血２倍希釈）の全血のスループットは、それぞれ、１００μＬ／ｍｉｎ、６７μＬ／ｍｉｎ、５０μＬ／ｍｉｎである。また、入口１０２から９００μＬ／ｍｉｎでシース液を流し、入口１０３から２０００μＬ／ｍｉｎでシース液を流した。入口１０１～１０３への第１の試料の送液時間を、いずれの第１の試料においても１０分とした。そして、各粒子分離チップＣＰ１～ＣＰ４において、第１回収部６４（図１２参照）から第２の試料を回収し、複数の第２回収部６５（図１２参照）から第３の試料を回収した。

【0105】

次に、３種類の第１の試料と、各粒子分離チップＣＰ１～ＣＰ４で回収した第２の試料とに含まれる細胞（赤血球および白血球）の数を、以下の式（２）により取得した。

【0106】

細胞数＝細胞濃度（個／ｍＬ）×液量（ｍＬ） …（２）

【0107】

ここで、細胞濃度を、シスメックス株式会社製の血球計数装置（ＸＮシリーズ）または血球計算盤を用いて測定した。また、液量を、電子天秤を用いて重量から測定した。

【0108】

続いて、第１の試料および粒子分離チップＣＰ１～ＣＰ４の組合せごとに、上記式（２）により取得した細胞（赤血球および白血球）の数に基づいて、以下の式（３）、（４）により赤血球除去率および白血球除去率を算出した。

【0109】

赤血球除去率＝｛１－（第２の試料に含まれる赤血球数／第１の試料に含まれる赤血球の数）｝×１００（％） …（３）
白血球除去率＝｛１－（第２の試料に含まれる白血球数／第１の試料に含まれる白血球の数）｝×１００（％） …（４）

【0110】

図２０は、粒子分離チップＣＰ１～ＣＰ４の赤血球除去率および白血球除去率を示すグラフである。

【0111】

図２０のグラフでは、便宜上、第１の試料の種類ごとに除去率が直線で結ばれている。粒子分離チップＣＰ１～ＣＰ４の液除去率は、それぞれ、図１６に示したチップＣ１～Ｃ４の液除去率（０．７３％、１．１２％、１．３１％、１．５０％）に対応する。

【0112】

図２０に示すように、いずれの例においても、高い赤血球除去率および高い白血球除去率を実現できた。また、液除去率が高いほど、図１１に示した高さｈが高くなるため、より確実に赤血球および白血球を除去できることが分かった。さらに、希釈率が高いほど、赤血球除去率および白血球除去率が高くなった。この理由としては、希釈率が高いほど、第１の試料中の細胞の密度および粘性が低下し、分岐流路２００への赤血球および白血球の分離が容易になるためと予想される。

【0113】

［実施例２］
実施例２では、１種類の粒子分離チップ１を上記の粒子分離装置２に設置し、当該粒子分離チップ１に第１の試料を流して、赤血球および白血球の除去率と、ＣＴＣの回収率とを調査した。

【0114】

図２１の上段は、実施例２に係る、粒子分離チップＣＰ５の構成を示す表である。図２１の下段は、実施例２に係る、第１の試料の構成を示す表である。

【0115】

図２１の上段に示すように、粒子分離チップＣＰ５は、図１６に示したチップＣ４と、図１７に示した多孔シートＰＳ６とを組み合わせたものである。図２１の下段に示すように、実施例２に係る「全血２倍希釈」の第１の試料は、健常人から採取した１．２５ｍＬの全血を１．２５ｍＬの希釈液で希釈した２．５ｍＬの試料である。また、実施例２では、ＣＴＣとして、Ａ５４９細胞株から得られたＡ５４９細胞を第１の試料に添加した。具体的には、Ａ５４９細胞を予め所定の試薬により染色し、染色したＡ５４９細胞を第１の試料に４０万個程度添加した。なお、上記のＡ５４９細胞の大きさは、発明者らによる測定によれば、１１μｍ以上２０μｍ以下であり、平均約１７μｍである。

【0116】

実施例２では、粒子分離チップＣＰ５において、入口１０１から１００μＬ／ｍｉｎで上記の第１の試料の全量（２．５ｍＬ）を別々に３回流した。このとき、第１の試料の全血のスループットは、いずれの回においても５０μＬ／ｍｉｎである。また、入口１０２から９００μＬ／ｍｉｎでシース液を流し、入口１０３から２０００μＬ／ｍｉｎでシース液を流した。入口１０１～１０３への第１の試料の送液時間を、いずれの回においても２５分とした。そして、粒子分離チップＣＰ５において、第１回収部６４から第２の試料を回収し、複数の第２回収部６５から第３の試料を回収した。

【0117】

次に、実施例１と同様の手順で、第１の試料および第２の試料に含まれる細胞（赤血球および白血球）を上記式（２）により取得し、取得した赤血球および白血球の数に基づいて、上記式（３）、（４）により赤血球除去率および白血球除去率を算出した。

【0118】

また、回収した第２の試料および第３の試料に含まれるＡ５４９細胞を上記式（２）により取得し、取得したＡ５４９細胞の数に基づいて、以下の式（５）によりＡ５４９細胞の回収率を算出した。

【0119】

Ａ５４９細胞回収率＝第２の試料に含まれるＡ５４９細胞の数／（第２の試料に含まれるＡ５４９細胞の数＋第３の試料に含まれるＡ５４９細胞の数）×１００（％） …（５）

【0120】

図２２は、粒子分離チップＣＰ５の赤血球除去率、白血球除去率およびＡ５４９細胞回収率を示すグラフである。

【0121】

図２２の上段に示すように、第１の試料を流した１～３回目のいずれの場合も、赤血球除去率は約９９％以上、白血球除去率は約９０％以上となり、高い赤血球除去率および高い白血球除去率を実現できた。また、図２２の下段に示すように、第１の試料を流した１～３回目のいずれの場合も、Ａ５４９細胞の回収率は約９０％以上となり、高いＡ５４９細胞回収率を実現できた。以上の結果から、粒子のサイズの違いに基づいて、第１の試料から血球成分（赤血球および白血球）とＡ５４９細胞とを、適正に分離できることが分かった。

【0122】

［実施例３］
実施例３では、６種類の粒子分離チップ１を上記の粒子分離装置２に設置し、各粒子分離チップ１に第１の試料を流して、細胞除去率と、細胞回収率と、流路２０１への重量比率と、粒径ごとの回収率および除去率と、を調査した。

【0123】

図２３の上段は、実施例３に係る、６種類の粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６の構成を示す表である。図２３の下段は、実施例３に係る、第１の試料の構成を示す表である。

【0124】

図２３の上段に示すように、６種類の粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６は、図１６に示したチップＣ４と、図１７に示した多孔シートＰＳ１～ＰＳ６とを組み合わせたものである。図２３の下段に示すように、実施例３に係る第１の試料は、細胞懸濁液である。この細胞懸濁液は、１％ポリビニルピロリドン溶液２ｍＬと、Jurkat細胞を１×１０^６個程度と、予め所定の試薬により染色したＡ５４９細胞を３×１０^５個程度とを含む。Jurkat細胞は通常の血液に存在する血球成分（赤血球や白血球）に対応し、Ａ５４９細胞はＣＴＣに対応する。そして、発明者らは、あらかじめ第１の試料（細胞懸濁液）に含まれるJurkat細胞およびＡ５４９細胞の粒径を、イメージングフローサイトメーターを用いて調査した。

【0125】

図２４は、第１の試料に含まれるJurkat細胞およびＡ５４９細胞の粒径分布を示すグラフである。図２４において、横軸は細胞の粒径を示しており、縦軸は粒径に対応する頻度（％）を示している。所定の粒径に対応する頻度は、当該所定の粒径の存在確率に対応する。

【0126】

実施例３では、粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６において、入口１０１から１１０μＬ／ｍｉｎで上記の第１の試料を流した。また、入口１０２から１４００μＬ／ｍｉｎでシース液を流し、入口１０３から１５１０μＬ／ｍｉｎでシース液を流した。入口１０１～１０３への送液時間を１５分とした。そして、粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６において、第１回収部６４から第２の試料を回収し、複数の第２回収部６５から第３の試料を回収した。

【0127】

次に、第２の試料および第３の試料にそれぞれ含まれる細胞（Jurkat細胞およびＡ５４９細胞）の数を、以下の式（６）により算出した。

【0128】

試料中の所定の粒径の細胞数＝試料中の所定の粒径の細胞の存在確率×試料中の総細胞数 …（６）

【0129】

上記式（６）において、細胞の存在確率は、図２４の頻度により取得される。総細胞数は、血球計算盤により測定された細胞濃度を用いて、上記式（２）により取得される。

【0130】

続いて、上記式（６）により取得した細胞（Jurkat細胞およびＡ５４９細胞）の粒径ごとの数に基づいて、以下の式（７）により所定の粒径における回収率を算出した。

【0131】

所定の粒径の細胞の回収率＝｛第２の試料中の所定の粒径の細胞数／（第２の試料中の所定の粒径の細胞数＋第３の試料中の所定の粒径の細胞数）｝×１００（％） …（７）

【0132】

また、回収した第２の試料および第３の試料に含まれるJurkat細胞およびＡ５４９細胞の数を上記式（２）により取得し、取得したJurkat細胞の数に基づいて、以下の式（８）によりJurkat細胞の除去率を算出した。

【0133】

Jurkat細胞除去率＝第３の試料に含まれるJurkat細胞の数／（第２の試料に含まれるJurkat細胞の数＋第３の試料に含まれるJurkat細胞の数）×１００（％） …（８）

【0134】

さらに、回収した第２の試料および第３の試料に含まれるＡ５４９細胞を上記式（２）により取得し、取得したＡ５４９細胞の数に基づいて、上記式（５）によりＡ５４９細胞の回収率を算出した。

【0135】

図２５は、粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６のJurkat細胞の除去率およびＡ５４９細胞の回収率を示すグラフである。

【0136】

図２５の上段に示すように、いずれの粒子分離チップにおいても、通常の血球成分（赤血球、白血球および血小板など）に対応するJurkat細胞を分離し、第３の試料として除去できることが分かった。また、図２３の上段に示したように、粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６では、多孔シートの構成のみが異なっている。図１７に示したように、多孔シートＰＳ１～ＰＳ６は、概ねこの順に孔３１の孔径が大きくなっている。したがって、図２５の上段の結果から、孔３１の孔径が大きくなるほど、通常の血球成分に対応するJurkat細胞を除去できることが分かった。

【0137】

図２５の下段に示すように、いずれの粒子分離チップにおいても、ＣＴＣに対応するＡ５４９細胞を分離し、第２の試料として回収できることが分かった。また、多孔シートＰＳ１～ＰＳ６は概ねこの順に孔径が大きくなっているため、図２５の下段の結果から、孔３１の孔径が小さくなるほど、ＣＴＣに対応するＡ５４９細胞を回収できることが分かった。

【0138】

＜スループットに関する調査＞
次に、発明者らは、実施例１～３に示した構成の粒子分離チップを用いることにより、上記非特許文献１に記載の従来の粒子分離手法（比較例）に対して、どの程度スループットが高められるかを調査した。

【0139】

比較例では、ＰＢＳで１０倍に希釈した全血１ｍＬが、２５μＬ／ｍｉｎの流速で流路に導入されており、全血のスループットは、２．５μＬ／ｍｉｎである。したがって、比較例によれば、全血５ｍＬの粒子分離処理にかかる時間は、２０００分（約３３時間）である。これに対し、実施例１～３に示した構成の粒子分離チップ１では、全血（実施例１～２）および細胞懸濁液（実施例３）のスループットを５０μＬ／ｍｉｎ以上に設定できる。したがって、実施形態によれば、全血５ｍＬの粒子分離処理にかかる時間は、１００分以下となる。このように、実施例１～３によれば、比較例と比較して、大幅にスループットを向上できる。

【0140】

図２６は、粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６の各出口への流量を示すグラフである。

【0141】

図２６において、廃液１～３、５～７は、それぞれ、Ｙ軸方向に並ぶ６つの出口２１３（図１８の右下を参照）から取得される第３の試料を示している。すなわち、廃液１は、主流路１００よりもＹ軸方向下側に位置する３つの出口２１３のうち、最もＹ軸方向下側の出口２１３から取得される第３の試料であり、廃液３は、主流路１００よりもＹ軸方向下側に位置する３つの出口２１３のうち、最もＹ軸方向上側の出口２１３から取得される第３の試料であり、廃液５は、主流路１００よりもＹ軸方向上側に位置する３つの出口２１３のうち、最もＹ軸方向下側の出口２１３から取得される第３の試料であり、廃液７は、主流路１００よりもＹ軸方向上側に位置する３つの出口２１３のうち、最もＹ軸方向上側の出口２１３から取得される第３の試料である。回収液４は、出口１０４から取得される第２の試料を示している。図２６の縦軸は、粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６ごとの、廃液１～３、回収液４および廃液４～７から取得される試料の重量比率を示している。

【0142】

廃液１～３、５～７の重量比率を参照すると、主流路１００に近い出口２１３（すなわち、主流路１００の下流側に位置する流路２０１に接続された出口２１３）から取得された第３の試料ほど、重量比率が小さくなっている。また、粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６には、互いに異なる多孔シートＰＳ１～ＰＳ６が設置されているものの、同一の出口から取得される廃液および回収液の重量比率はほぼ同じである。このことから、実施例３のように多孔シートＰＳ１～ＰＳ６が構成された場合、多孔シートによる流体抵抗の違いをほぼ無視できることが分かる。言い換えれば、この場合、分岐流路２００の流路２０１への流量は、流路２０１による流体抵抗が支配的であることが分かる。

【0143】

図２７は、粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６の粒径ごとの回収率を示すグラフである。

【0144】

図２７において、横軸は細胞の粒径を示しており、縦軸は上記式（７）により算出された回収率である。図２７には、便宜上、回収率７０％を示すカットオフが破線で示されている。

【0145】

上述したように、多孔シートＰＳ１～ＰＳ６は概ねこの順に孔３１の孔径が大きくなっている。また、図２７のグラフを参照すると、粒子分離チップＣＰ１１～ＣＰ１６において、この順に、孔径が大きくなるほどカットオフを上回る細胞の粒径が大きくなっている。例えば、粒子分離チップＣＰ１１では、カットオフを上回る細胞の粒径は約１１．５μｍであり、粒子分離チップＣＰ１６では、カットオフを上回る細胞の粒径は約１６．３μｍである。このことから、多孔シートの孔径が大きくなると、主流路１００および分岐流路２００の構成が同じであっても、回収率が変化し、比較的大きな粒径の細胞を主として回収しやすくなることが分かる。

【0146】

すなわち、基本的には粒子分離チップの液除去率によって、分岐流路２００へと分離されず主流路１００を通って回収される粒子の粒径が決まるものの、主流路１００を通って回収される所定の粒径の粒子の割合は、多孔シートの孔径によっても変化することが分かる。

【0147】

なお、粒子分離チップＣＰ１１に設置されている多孔シートＰＳ１と、粒子分離チップＣＰ１２に設置されている多孔シートＰＳ２とを比較すると、図１７に示したように、孔径は互いに同じ１２μｍであるが、多孔シートＰＳ２の開孔率２０．９％は、多孔シートＰＳ１の開孔率３６．９％より小さい。すなわち、多孔シートＰＳ２の孔３１の数は、多孔シートＰＳ１の孔３１の数より少ない。また、図２６に示したように、粒子分離チップＣＰ１１、ＣＰ１２の各出口から取得される試料の重量比率はほぼ同じである。このことから、１つの孔３１から分岐流路２００へと流れる第３の試料の流量は、粒子分離チップＣＰ１１より粒子分離チップＣＰ１２の方が大きい。このように、１つの孔３１に流れる流量が大きいと、孔３１へと細胞を引き込む力が大きくなる。このような理由で、図２７の回収率に示すように、比較的大きな粒径の細胞（例えば、粒径１２．５μｍ～１８μｍの細胞）の回収率については、粒子分離チップＣＰ１１より粒子分離チップＣＰ１２の方が小さくなっていると考えられる。

【0148】

＜分岐流路への排出量のシミュレーション＞
次に、発明者らは、主流路１００から分岐流路２００へ流れる試料の流量（排出量）をシミュレーションにより調査した。

【0149】

図２８の上段は、本シミュレーションに係る、主流路１００の流路１２０と、分岐流路２００の流路２０１との構成を模式的に示す図である。

【0150】

本シミュレーションでは、流路１２０に対して流路２０１が１本だけ配置されており、流路１２０と流路２０１との間の分岐箇所Ｂには、多孔シート３０が配置されている。本シミュレーションでは、流路１２０に対してＸ軸方向に試料を流し、多孔シート３０を介して流路２０１に排出された試料の流量をシミュレーションにより算出した。

【0151】

図２８の下段は、本シミュレーションに係る、分岐流路２００への試料の排出割合の結果を示すグラフである。

【0152】

図２８の下段のグラフにおいて、横軸は、流路２０１のＹ軸方向の位置を示しており、中央は、流路１２０のＹ軸方向の中央位置に対応し、左端および右端は、それぞれ、流路１２０のＹ軸方向の一端および他端に対応する。縦軸は、分岐流路２００の流路２０１への試料の排出割合（％）を示している。

【0153】

図２８の下段のグラフにおいて実線で示すように、流路１２０から流路２０１へと流れる試料の流量は、分岐箇所Ｂにおいて、中央よりも左端および右端の方が多い。このように、左端および右端において試料の高さ（図１１の高さｈ）が大きくなると、試料に第１の粒子（例えば、ＣＴＣ）が含まれる場合、両端において第１の粒子が意図せず分岐流路２００へと排出されてしまう。また、中央において試料の高さが極端に小さくなるため、試料に第２の粒子（例えば、赤血球、白血球および血小板）が含まれる場合、中央において第２の粒子が分岐流路２００へと排出されにくくなる。発明者らの検討によれば、粒径が１４．５μｍ以下の第２の粒子を分岐流路２００へと流すためには、例えば、中央付近の排出割合Ｆｍｉｎを、カットオフ（１．８％）程度まで高める必要がある。

【0154】

このような理由から、上記実施形態では、第１の試料に含まれる第１の粒子が、分岐流路２００へと流れず、第１の試料に含まれる第２の粒子が分岐流路２００へと流れるように、入口１０３から流されるシース液によって、第１の試料が、流路１２０において中央付近に寄せられる。これにより、第１の粒子と第２の粒子とを適正に分離できる。また、第１の試料が流路１２０の両端に多く流れることが抑制されるため、分岐箇所Ｂにおいて満遍なく粒子の分離を行って、第２の粒子を効率的に分離できる。

【0155】

＜粒子分離チップおよび粒子分離装置の効果＞
図６に示したように、粒子分離チップ１は、内部にマイクロ流路１ａを有する上基板１０および下基板２０（基板）と複数の孔３１の形成された多孔シート３０とを含む。マイクロ流路１ａは、主流路１００および分岐流路２００を備える。主流路１００は、上流側に設けられた第１の粒子および第１の粒子より小さい第２の粒子を含む第１の試料の入口１０１と、下流側に設けられた主に第１の粒子を含む第２の試料が取り出される出口１０４（第１の出口）と、を有する。分岐流路２００は、Ｘ軸方向（主流路１００の流れ方向）に沿った複数の分岐箇所Ｂ（図９参照）において主流路１００と連通し、下流側に第２の粒子を含む第３の試料が取り出される出口２１３（第２の出口）を有する。複数の分岐箇所Ｂにおいて、主流路１００と分岐流路２００は多孔シート３０の孔３１を介して連通する。

【0156】

この構成によれば、主流路１００と分岐流路２００は、複数の分岐箇所Ｂにおいて、多孔シート３０の孔３１を介して連通する。これにより、製品開発現場や臨床現場において十分な試料処理能力（スループット）を発揮できる。

【0157】

また、図１１に示したように、多孔シート３０の各々の孔３１によって、主流路１００から分岐流路２００へと第２の粒子を移動させる試料の流れを形成できる。このため、分岐流路２００へと向かう第２の粒子の試料の流れを、多孔シート３０の複数の孔３１に分散させることができる。これにより、効率的に第２の粒子を分岐流路２００へと分離させることができる。よって、主流路１００および分岐流路２００の流量を高めて、粒子分離のスループットを効率的に高めることができる。

【0158】

また、分岐流路２００の幅を広げることができるため、血液試料に細胞の凝集塊が含まれる場合でも、目詰まりなく粒子分離を行うことができる。例えば、第１の粒子としてＣＴＣが想定される場合、ＣＴＣはクラスタを形成している場合がある。このような場合でも、ＣＴＣのクラスタを目詰まりなく回収できるため、血液試料に含まれるＣＴＣに基いて診断を適正に行うことができる。

【0159】

また、全血内の不要な血球（例えば、赤血球）を溶血することなく、全血を第１の試料として用いることができる。これにより、溶血剤を用いて第１の試料を調製する手間を省略でき、溶血剤による取得対象の粒子の破損を回避できる。また、粒子分離処理を確実に行うために、全血を過度に希釈する必要がないため、粒子分離のスループットを高めることができる。

【0160】

図６に示したように、主流路１００および分岐流路２００が、入口１０１から導入された第１の試料のうち一部の試料が分岐流路２００に流れ、残りの試料が主流路１００に流れることにより、第１の粒子が出口１０４（第１の出口）から導出され、第２の粒子が出口２１３（第２の出口）から導出されるように構成されている。

【0161】

この構成によれば、分離された第１の粒子および第２の粒子を、出口１０４および出口２１３にそれぞれ集約できる。よって、第１の粒子および第２の粒子を円滑に回収できる。

【0162】

主流路１００の流路１２０のＹ軸方向の幅（流路幅）は、５００μｍ以上５０ｍｍ以下である。また、例えば、第１の試料に含まれる全血の量が少ない場合には、主流路１００の流路１２０のＹ軸方向の幅（流路幅）は、１００μｍ以上５０ｍｍ以下でもよい。

【0163】

このように主流路１００の流路幅を設定することにより、高い粒子分離のスループットを実現できる。また、流路１２０のＹ軸方向の幅が１００μｍ以上であると、１００μｍ以下の第１の粒子を流路１２０に流すことができる。

【0164】

図９に示したように、分岐流路２００は、分岐箇所Ｂにおいて主流路１００と連通する、平面視で主流路１００と非平行に配置された流路２０１を含む。

【0165】

この構成によれば、分岐流路２００の複数の流路２０１の長さを、下基板２０の面内方向に円滑に調整できる。よって、各々の流路２０１の長さを、水力学的濾過法に適する長さに円滑に設定できる。

【0166】

図９に示したように、分岐箇所Ｂにおいて主流路１００と連通する流路２０１は、平面視で主流路１００と交差して配置され、第３の試料を主流路１００の両側に流す。

【0167】

この構成によれば、分岐流路２００の流路２０１の入口（分岐箇所Ｂ）付近の主流路１００の試料を、主流路１００の幅方向に偏りなく流路２０１へと流すことができる。このため、流路２０１の入口の範囲内における多孔シート３０の全ての孔３１に、粒子分離のための機能を適正に発揮させることができる。よって、粒子の分離を効率的に行うことができる。

【0168】

分岐流路２００は、分岐箇所Ｂにおいて主流路１００と連通する流路２０１を、２本以上１５０００本以下含む。

【0169】

この構成によれば、流路２０１が２本以上設けられることにより、少なくとも水力学的濾過を実現しつつ、四辺が１５０ｍｍ程度の粒子分離チップ１において流路２０１を数多く設けることができる。

【0170】

図４、５に示したように、分岐流路２００は、粒子分離チップ１の使用状態において主流路１００の下方に配置されている。

【0171】

この構成によれば、重力を利用して第２の粒子を含む第３の試料を分岐流路２００に導入することができる。よって、粒子の分離効率を円滑に高めることができる。

【0172】

また、主流路１００を形成するための凹部を下面に有する上基板１０と、分岐流路２００を形成するための凹部を上面に有する下基板２０とを、多孔シート３０を介して重ねて接合することにより、粒子分離チップ１を形成できる。よって、粒子分離チップ１を簡易に形成できる。

【0173】

図６に示したように、主流路１００は、分岐箇所Ｂ（図９参照）より上流側に設けられたシース液の入口１０２、１０３をさらに有する。

【0174】

この構成によれば、図７、８に示したように、シース液によって、第１の試料が流れる範囲を粒子の分離に適する範囲に制限できる。よって、効率的に粒子を分離できる。

【0175】

図６に示したように、シース液の入口１０２は、主流路１００を流れる第１の試料の上側からシース液を導入するための入口である。

【0176】

この構成によれば、図８に示したように、第１の試料は、厚さ方向の上部が制限された状態で分岐流路２００の入口（分岐箇所Ｂ）に流れるため、第２の粒子の取りこぼしを抑制できる。

【0177】

図６に示したように、シース液の入口１０３は、主流路１００を流れる第１の試料の両側からシース液を導入するための入口である。

【0178】

この構成によれば、図８の中段および下段に示すように、第１の試料は、幅方向の両端が制限された状態で分岐流路２００の入口（分岐箇所Ｂ）に流れる。これにより、図２８のシミュレーションにおいて説明したように、第１の粒子と第２の粒子とを適正に分離でき、分岐箇所Ｂにおいて満遍なく粒子の分離を行って、第２の粒子を効率的に分離できる。

【0179】

主流路１００の上流側における分岐箇所Ｂから出口２１３（第２の出口）までの分岐流路２００の流体抵抗は、主流路１００の下流側における分岐箇所Ｂから出口２１３（第２の出口）までの分岐流路２００の流体抵抗より大きい。

【0180】

この構成によれば、各分岐箇所Ｂにおける主流路１００の流量に対する分岐流路２００への流量の割合である液除去率を、分岐箇所Ｂごとに互いに近づけることができる。よって、一定サイズの第２の粒子を分離できる。

【0181】

分岐流路２００は、複数の分岐箇所Ｂにおいて主流路１００とそれぞれ連通する、平面視で主流路１００と非平行に配置された複数の流路２０１と、複数の流路２０１と出口２１３（第２の出口）とを接続する中継流路２１１、２１２と、を含む。主流路１００の上流側の分岐箇所Ｂにおいて主流路１００と連通する流路２０１の長さは、主流路１００の下流側の分岐箇所Ｂにおいて主流路１００と連通する流路２０１の長さより長い。

【0182】

この構成によれば、簡易な構成で、主流路１００の上流側の分岐箇所Ｂにおける流体抵抗を、主流路１００の下流側の分岐箇所Ｂにおける流体抵抗より大きく設定できる。

【0183】

マイクロ流路１ａは、分岐箇所Ｂにおける主流路１００の流量に対する分岐流路２００への流量の割合である液除去率が、第２の粒子が分岐流路２００に流れ、第１の粒子が主流路１００に流れる値になるように形成されている。

【0184】

この構成によれば、水力学的濾過法により、第１の粒子と第２の粒子とを分離できる。

【0185】

マイクロ流路１ａは、分岐箇所Ｂにおける主流路１００の流量に対する分岐流路２００への流量の割合である液除去率が、複数の分岐箇所Ｂにおいて、互いに実質的に同じ値になるように形成されている。

【0186】

この構成によれば、複数の分岐箇所Ｂにおいて、満遍なく一定のサイズの第２の粒子を分離できる。

【0187】

マイクロ流路１ａは、分岐箇所Ｂにおける主流路１００の流量に対する分岐流路２００への流量の割合である液除去率が、複数の分岐箇所Ｂにおいて、０％より大きく５０％以下になるように形成されている。

【0188】

この構成によれば、主流路１００の深さ以下の第２の粒子を分岐流路に分離できる。

【0189】

多孔シートＰＳ１～ＰＳ６は、主流路１００と分岐流路２００との交差面の開口の面積（分岐箇所Ｂの面積）に対する孔３１の面積の割合である開孔率が、所定サイズの第１の粒子が所定の回収率で出口１０４（第１の出口）から回収される値になるように形成されている。

【0190】

この構成によれば、実施例２、３に示したように、所望のサイズの第１の粒子を所定の回収率で回収できる。

【0191】

多孔シート３０、ＰＳ１～ＰＳ７の孔３１の孔径は、３０ｎｍ以上１００μｍ以下である。

【0192】

この構成によれば、第１粒子の粒径が５０ｎｍ～１００μｍ程度である場合、第１の粒子が分岐流路２００に流れることを抑制できるよう多孔シートを構成できる。

【0193】

多孔シート３０、ＰＳ１～ＰＳ７は、開孔率が、前記複数の分岐箇所において、０％より大きく５０％以下になるように形成されている。

【0194】

この構成によれば、多孔シートの強度を維持できる。

【0195】

第１の粒子の粒径は、３０ｎｍ以上１００μｍ以下である。

【0196】

この構成によれば、エクソソーム等のナノ粒子から比較的大きい循環腫瘍細胞まで、様々なサイズの第１の粒子を分離できる。

【0197】

入口１０１から導入される第１の試料は、血液試料であり、第１の粒子は、循環腫瘍細胞であり、第２の粒子は、白血球、赤血球および血小板である。

【0198】

腫瘍から血液中に漏出した血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、がん診断の因子として有用性が報告されており、非侵襲的な癌の検査として期待されている。しかしながら、ＣＴＣの血中の存在率は１０ｍＬあたり数個～数十個であるため、血液試料からＣＴＣを分離して取り出すことは極めて困難である。しかしながら、上記構成によれば、希少細胞であるＣＴＣを効率的に分離できる。また、粒子分離処理において試薬等が用いられないため、ＣＴＣにダメージが与えられることなくＣＴＣを分離できる。

【0199】

図１２に示したように、粒子分離装置２は、粒子分離チップ１と、粒子分離チップ１が載置される設置部４１と、粒子分離チップ１における第１の試料の入口１０１およびシース液の入口１０２、１０３のそれぞれに第１の試料およびシース液を導入し、マイクロ流路１ａ（図６参照）内の液体を送液する送液部６１～６３と、出口１０４（第１の出口）に連通する第１の粒子の第１回収部６４と、出口２１３（第２の出口）に連通する第２の粒子の第２回収部６５と、を備える。

【0200】

この構成によれば、粒子分離チップ１を設置部４１に載置し、送液部６１～６３を駆動して第１の試料およびシース液を導入することにより、第１回収部６４および第２回収部６５から、それぞれ第１の粒子および第２の粒子を円滑に回収できる。

【0201】

＜その他の変更例＞
上流側における分岐箇所Ｂから出口２１３までの分岐流路２００の流体抵抗を、下流側における分岐箇所Ｂから出口２１３までの分岐流路２００の流体抵抗より大きくするために、上流側における流路２０１のＹ軸方向の長さが、下流側における流路２０１のＹ軸方向の長さより長く設定された。しかしながら、これに限らず、上流側における流路２０１の断面積が、下流側における流路２０１の断面積より小さく設定されてもよい。

【0202】

図２９は、この場合の変更例に係る、分岐流路２００の構成を模式的に示す図である。図２９の上段は、分岐流路２００の近傍の構成を示す平面図であり、図２９の下段は、下基板２０に形成された流路２０１に対応する凹部の構成を示す断面図である。

【0203】

図２９の上段に示すように、複数の流路２０１のＹ軸方向の長さは、互いに同じである。図２９の下段に示すように、複数の流路２０１のＸ軸方向の幅は、互いに同じであり、上流側における流路２０１のＺ軸方向の高さが、下流側における流路２０１のＺ軸方向の高さより小さく設定されている。これにより、上流側における流路２０１の断面積が、下流側における流路２０１の断面積より小さく設定されている。この構成においても、簡易な構成で、主流路１００の上流側の分岐箇所Ｂにおける流体抵抗を、主流路１００の下流側の分岐箇所Ｂにおける流体抵抗より大きく設定できる。

【0204】

なお、断面積の設定において、流路２０１のＸ軸方向の幅とＺ軸方向の高さの両方が調整されてもよい。また、流体抵抗の設定において、複数の流路２０１のＹ軸方向の長さおよび断面積の両方が調整されてもよい。

【0205】

複数の流路２０１は、主流路１００の流路１２０の両側に延びて形成されたが、これに限らず、流路１２０の一方側にだけ延びて形成されてもよい。

【0206】

図３０は、この場合の変更例に係る、分岐流路２００の近傍の構成を示す平面図である。この変更例では、平面視において、複数の流路２０１の一方の端部が、流路１２０のＹ軸方向の一方の端部に一致している。

【0207】

この場合、分岐箇所Ｂにおいて分離された第２の粒子は、流路２０１に沿って一方向に移動する。このとき、流路２０１のＹ軸反対方向の端部において、流路２０１内で当該一方向の試料の流れが生じにくくなる。このため、分岐箇所Ｂにおいて第２の粒子の分離機能が発揮されにくくなり、結果、第２の粒子の分離効率が低下する。これに対し、上記実施形態のように、流路２０１が流路１２０の両側に延びる場合、分岐箇所Ｂにおける分離機能が適正に発揮され、第２の粒子の分離効率が高められる。

【0208】

図１に示したように、流路１１１の側面から流路１１１内にシース液を注入させるために、１つの入口１０３が中心軸ＣＡ上に配置されたが、これに限らず、２つの入口１０３が中心軸ＣＡに対してＹ軸方向の両側に離れて配置されてもよい。この場合、２つの入口１０３にそれぞれ繋がる２つの流路が、流路１１１のＹ軸方向の両側面に繋げられる。これにより、上記実施形態および実施例と同様に、流路１１１の側面から流路１１１内にシース液を注入できる。ただし、この場合、２つの入口１０３にそれぞれシース液を注入するための２つの送液部６３が必要となり、２つの送液部６３の送液量を互いに等しくする必要があるため、粒子分離装置２の構成および制御が煩雑になる。したがって、上記のように、入口１０３は、中心軸ＣＡに沿って１つだけ設けられことが好ましい。

【0209】

１枚の多孔シート３０が、全ての分岐箇所Ｂに重なるように配置されたが、これに限らず、複数の多孔シート３０が、それぞれ１以上の分岐箇所Ｂに重なるように配置されてもよい。

【0210】

複数の流路２０１は、平面視において、主流路１００の流路１２０に対して垂直に延びて形成されたが、これに限らず、流路１２０に対して斜め方向に配置されてもよい。この場合も、複数の流路２０１の長さを、下基板２０の面内方向に円滑に調整できる。

【0211】

上記実施形態では、図２に示したように、中継流路２１１は、複数の流路２０１のＹ軸方向の両端部にそれぞれ１つずつ設けられ、上記実施例では、図１８に示したように、中継流路２１１は、複数の流路２０１のＹ軸方向の両端部にそれぞれ２つまたは３つずつ設けられた。これに限定されることなく、中継流路２１１のＹ軸方向の両端部に、それぞれ４つ以上の中継流路２１１が設けられてもよい。

【0212】

上記実施形態では、図２に示したように、一方の中継流路２１１が全ての流路２０１のＹ軸方向の一方の端部に繋がり、一方の中継流路２１１に２つの出口２１３が接続された。これに限らず、一方の中継流路２１１に、１つまたは３以上の出口２１３が接続されてもよい。上記実施例では、図１８に示したように、１つの中継流路２１１に１つの出口２１３が接続された。これに限らず、１つの中継流路２１１に複数の出口２１３が接続されてもよく、複数の中継流路２１１に１つの出口２１３が接続されてもよい。

【0213】

上記実施形態では、図１に示したように、主流路１００の下流側に、１つの出口１０４が配置されたが、複数の出口１０４が配置されてもよい。

【0214】

上記実施例では、第１の粒子がＣＴＣであり、第２の粒子が赤血球、白血球および血小板であったが、第１の粒子および第２の粒子の組合せはこれに限らない。例えば、第１の粒子が、エクソソーム等の細胞外小胞であり、第２の粒子が、細胞外小胞より小さいタンパク質やデブリスでもよい。

【0215】

第１の粒子が取得対象の粒子であり、第２の粒子が除去対象の粒子であったが、これに限らず、第１の粒子が除去対象の粒子であり、第２の粒子が取得対象の粒子でもよい。この場合も、粒子の大きさに基づいて、高いスループットで第１の粒子と第２の粒子とを分離し、第２の粒子を取得できる。

【0216】

入口１０１から導入される第１の試料は、血液試料であったが、これに限らない。第１の試料に含まれる大きさの異なる２種類の粒子が存在し、これら２種類の粒子が粒子分離チップ１により分離可能であれば、第１の試料は、血液以外の体液（脳脊髄液、腹水、胸水、滑液、腹膜透析排液等）や、体液から調製された試料でもよく、尿や、尿から調製された試料でもよい。

【0217】

本発明の実施形態は、特許請求の範囲に示された技術的思想の範囲内において、適宜、種々の変更が可能である。

【符号の説明】

【0218】

１ 粒子分離チップ
１ａ マイクロ流路
２ 粒子分離装置
１０ 上基板（基板）
２０ 下基板（基板）
３０ 多孔シート
３１ 孔
４１ 設置部
６１～６３ 送液部
６４ 第１回収部
６５ 第２回収部
１００ 主流路
１０１ 入口
１０２、１０３ 入口（シース液の入口）
１０４ 出口（第１の出口）
２００ 分岐流路
２０１ 流路
２１１、２１２ 中継流路
２１３ 出口（第２の出口）
Ｂ 分岐箇所
ＣＰ１～ＣＰ５、ＣＰ１１～ＣＰ１６ 粒子分離チップ
ＳＰ１～ＳＰ７ 多孔シート

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】