特開 2025-32351 ＮＫＧ２Ｄ受容体を標的とする抗体可変ドメイン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025032351

(43)【公開日】2025-03-11

(54)【発明の名称】ＮＫＧ２Ｄ受容体を標的とする抗体可変ドメイン

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20250304BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20250304BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250304BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250304BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250304BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250304BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250304BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250304BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20250304BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250304BHJP

   C12N 5/09 20100101ALN20250304BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20250304BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/13

A61P35/00

A61P35/02

A61K39/395 D

A61K39/395 H

C07K16/28

C12N5/09

C12N5/0783

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024220384

(22)【出願日】2024-12-16

(62)【分割の表示】P 2020542863の分割

【原出願日】2019-02-08

(31)【優先権主張番号】62/628,161

(32)【優先日】2018-02-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/716,259

(32)【優先日】2018-08-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519288755

【氏名又は名称】ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】グレゴリー ピー． チャン

(72)【発明者】

【氏名】アン エフ． チュン

(72)【発明者】

【氏名】アシャ グリンバーグ

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム ヘイニー

(72)【発明者】

【氏名】ブラッドリー エム． ランディ

(72)【発明者】

【氏名】ビアンカ プリンツ

(57)【要約】

【課題】ＮＫＧ２Ｄ受容体を標的とする抗体可変ドメインの提供。
【解決手段】抗体軽鎖可変ドメインと対合して、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体を標的とする抗原結合部位を形成することができる抗体重鎖可変ドメインが、記載されている。ＮＫＧ２Ｄ抗原結合部位を含むタンパク質、その薬学的組成物、及びがんの治療を含むその治療方法も、記載されている。ＮＫＧ２Ｄに対する抗体は、治療剤の設計において重要な利点を提供することが確認されている。例えば、これらの抗体のいくつかは、ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するだけでないが、受容体を刺激する能力、受容体への結合に関して天然のリガンドと競合する能力、及び／またはカニクイザルなどの他の種からのＮＫＧ２Ｄと交差反応する能力などのうちの１つ以上のさらなる利点を有する。これらの利点は、ＮＫＧ２Ｄの親和性の範囲全体で達成され得る。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６２８，１６１号（その開示はすべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）及び２０１８年８月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７１６，２５９号の利益及び優先権を主張する。

【0002】

発明の分野
本発明は、対合して、ナチュラルキラー細胞上のナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体を標的とする抗原結合部位を形成することができる抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを有するタンパク質、そのようなタンパク質を含む薬学的組成物、ならびにがんの治療用を含むそのようなタンパク質及び薬学的組成物を使用する治療方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

がんは、この疾患を治療するために文献で報告された実質的な研究努力及び科学的進歩にもかかわらず、深刻な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんには、前立腺癌、乳癌、及び肺癌が含まれる。前立腺癌は、男性において最も一般的ながんの形態である。乳癌は、依然として女性における主要な死因である。これらのがんの現行の治療選択肢は、すべての患者に有効というわけではなく、及び／または実質的な副作用がある。他の種類のがんも、既存の治療選択肢を使用して治療することは依然として困難である。

【0004】

がん免疫療法は、非常に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進することができるため、望ましい。二重特異性Ｔ細胞誘導体などの融合タンパク質は、腫瘍細胞及びＴ細胞に結合して、腫瘍細胞の破壊を促進する、文献に記載されているがん免疫療法である。特定の腫瘍関連抗原及び特定の免疫細胞に結合する抗体は、文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１及びＷＯ２０１５／０９５４１２を参照のこと。

【0005】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の構成要素であり、循環リンパ球の約１５％を占める。ＮＫ細胞は、事実上すべての組織に浸潤し、腫瘍細胞をＴ細胞と区別するプライミングを必要することなく、腫瘍細胞を効果的に死滅させる能力によって元来特徴付けられていた。活性化されたＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の方法で、すなわち、パーフォリン及びグランザイムを含む細胞傷害性顆粒を介して、ならびに死受容体経路を介して標的細胞を死滅させる。活性化されたＮＫ細胞はまた、ＩＦＮ－ガンマなどの炎症性サイトカイン、及び標的組織への他の白血球の動員を促進するケモカインも分泌する。
ＮＫ細胞は、それらの表面上にある様々な活性化及び抑制性受容体を通してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇するとき、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化によって阻害される。あるいは、ＮＫ細胞ががん細胞に遭遇するとき、それらはそれらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、それらの表面上のＣＤ１６受容体を通して一部の免疫グロブリンの定常領域によっても活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感度は、刺激シグナル及び抑制シグナルの合計に依存する。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫＧ２Ｄが活性化受容体として機能する本質的にすべてのナチュラルキラー細胞によって発現されるＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＮＫＧ２Ｄを介してＮＫ細胞機能を調節する機能は、悪性腫瘍を含む様々な治療状況で有用である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２０１６／１３４３７１号

【特許文献2】国際公開第２０１５／０９５４１２号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

ＮＫＧ２Ｄに対する抗体は、治療剤の設計において重要な利点を提供することが確認されている。例えば、これらの抗体のいくつかは、ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体に結合するだけでないが、受容体を刺激する能力、受容体への結合に関して天然のリガンドと競合する能力、及び／またはカニクイザルなどの他の種からのＮＫＧ２Ｄと交差反応する能力などのうちの１つ以上のさらなる利点を有する。これらの利点は、ＮＫＧ２Ｄの親和性の範囲全体で達成され得る。

【0008】

したがって、本発明の一態様は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＰＮＹＧＤＴＴＨＤＹＹＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１、ＡＤＩ－２９３７９）と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインに関する。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変ドメインは、配列番号１と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号１の、第１の相補性決定領域１（「ＣＤＲ１」）としてアミノ酸配列ＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（配列番号１１）と、第２のＣＤＲ（「ＣＤＲ２」）としてＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）と、第３のＣＤＲ（「ＣＤＲ３」）としてＡＲＧＡＰＮＹＧＤＴＴＨＤＹＹＹＭＤＶ（配列番号１３）と、を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号１の、ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＳＹＹＭＨ（配列番号４５）と、ＣＤＲ２としてＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）と、ＣＤＲ３としてＧＡＰＮＹＧＤＴＴＨＤＹＹＹＭＤＶ（配列番号６８）と、を含む。

【0009】

本発明の別の態様は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＴＧＥＹＹＤＴＤＤＨＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３、ＡＤＩ－２９４６３）と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインに関する。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変ドメインは、配列番号３と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号３の、第１の相補性決定領域（「ＣＤＲ１」）としてアミノ酸配列ＹＴＦＴＧＹＹＭＨ（配列番号１７）と、第２のＣＤＲ（「ＣＤＲ２」）としてＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１８）と、第３のＣＤＲ（「ＣＤＲ３」）としてＡＲＤＴＧＥＹＹＤＴＤＤＨＧＭＤＶ（配列番号１９）と、を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号３の、ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＧＹＹＭＨ（配列番号９２）と、ＣＤＲ２としてＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１８）と、ＣＤＲ３としてＤＴＧＥＹＹＤＴＤＤＨＧＭＤＶ（配列番号６９）と、を含む。

【0010】

本発明の別の態様は、アミノ酸配列ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＧＧＹＹＤＳＧＡＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５、ＡＤＩ－２７７４４）と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインに関する。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変ドメインは、配列番号５と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号５の、第１の相補性決定領域（「ＣＤＲ１」）としてアミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（配列番号２３）と、第２のＣＤＲ（「ＣＤＲ２」）としてＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４）と、第３のＣＤＲ（「ＣＤＲ３」）としてＡＫＤＧＧＹＹＤＳＧＡＧＤＹ（配列番号２５）と、を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号５の、ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号４７）と、ＣＤＲ２としてＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４）と、ＣＤＲ３としてＤＧＧＹＹＤＳＧＡＧＤＹ（配列番号７０）と、を含む。

【0011】

本発明の別の態様は、アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＰＭＧＡＡＡＧＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７、ＡＤＩ－２７７４９）と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインに関する。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変ドメインは、配列番号７と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号７の、第１の相補性決定領域（「ＣＤＲ１」）としてアミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＳＭＮ（配列番号２９）と、第２のＣＤＲ（「ＣＤＲ２」）としてＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３０）と、第３のＣＤＲ（「ＣＤＲ３」）としてＡＲＧＡＰＭＧＡＡＡＧＷＦＤＰ（配列番号３１）と、を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号７の、ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号４８）と、ＣＤＲ２としてＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３０）と、ＣＤＲ３としてＧＡＰＭＧＡＡＡＧＷＦＤＰ（配列番号７１）と、を含む。

【0012】

本発明の別の態様は、アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＰＩＧＡＡＡＧＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８５、Ａ４９ＭＩ）と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインに関する。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変ドメインは、配列番号８５と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号８５の、ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＦＴＦＳＳＹＳＭＮ（配列番号２９）と、ＣＤＲ２としてＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３０）と、ＣＤＲ３としてＡＲＧＡＰＩＧＡＡＡＧＷＦＤＰ（配列番号７７）と、を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号８５の、ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＳＹＳＭＮ（配列番号４８）と、ＣＤＲ２としてＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３０）と、ＣＤＲ３としてＧＡＰＩＧＡＡＡＧＷＦＤＰ（配列番号７８）と、を含む。

【0013】

本発明の別の態様は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＡＧＦＡＹＧＭＤＹＹＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号９、ＡＤＩ－２９３７８）と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインに関する。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変ドメインは、配列番号９と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号９の、第１の相補性決定領域（「ＣＤＲ１」）としてアミノ酸配列ＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（配列番号３５）と、第２のＣＤＲ（「ＣＤＲ２」）としてＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３６）と、第３のＣＤＲ（「ＣＤＲ３」）としてＡＲＥＧＡＧＦＡＹＧＭＤＹＹＹＭＤＶ（配列番号３７）と、を含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号９の、ＣＤＲ１としてアミノ酸配列ＳＹＹＭＨ（配列番号４５）、ＣＤＲ２としてＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３６）と、ＣＤＲ３としてＥＧＡＧＦＡＹＧＭＤＹＹＹＭＤＶ（配列番号７２）と、を含む。

【0014】

本発明の抗体重鎖可変ドメインは、任意に、抗体定常領域、例えば、ＣＨ１ドメインを含むかまたは含まない、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの抗体定常領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列にカップリングされ得る。いくつかの実施形態において、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。いくつかの他の実施形態において、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物からの抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。１つ以上の変異体は、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及び／またはＫ４３９における定常領域に含まれ得る。例示的な置換基には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅが含まれる。

【0015】

ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に含まれ得る変異体は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、及び／またはＶ１７３であり得る。ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに含まれ得る変異体は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、及び／またはＴ１６４であり得る。

【0016】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される重鎖可変ドメインのうちの１つは、軽鎖可変ドメインと組み合わされて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成する。例えば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインは、アミノ酸配列ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＤＤＷＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２、ＡＤＩ－２９３７９）と少なくとも９０％同一である抗体軽鎖可変ドメインと対合することができる。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号２と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、軽鎖可変ドメインは、第１の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）としてアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡ（配列番号１４）と、第２のＣＤＲとしてＧＡＳＴＲＡＴ（配列番号１５）と、第３のＣＤＲとしてＱＱＹＤＤＷＰＦＴ（配列番号１６）と、を含む。

【0017】

例えば、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインは、アミノ酸配列ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＤＤＹＷＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４、ＡＤＩ－２９４６３）と少なくとも９０％同一である抗体軽鎖可変ドメインと対合することができる。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号４と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、軽鎖可変ドメインは、第１の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）としてアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡ（配列番号２０）と、第２のＣＤＲとしてＧＡＳＴＲＡＴ（配列番号２１）と、第３のＣＤＲとしてＱＱＤＤＹＷＰＰＴ（配列番号２２）と、を含む。

【0018】

例えば、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインは、アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＤＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＶＳＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６、ＡＤＩ－２７７４４）と少なくとも９０％同一である抗体軽鎖可変ドメインと対合することができる。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号６と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、軽鎖可変ドメインは、第１の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）としてアミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＤＳＷＬＡ（配列番号２６）と、第２のＣＤＲとしてＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２７）と、第３のＣＤＲとしてＱＱＧＶＳＹＰＲＴ（配列番号２８）と、を含む。

【0019】

例えば、配列番号７または配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインは、アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＶＳＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８、ＡＤＩ－２７７４９）と少なくとも９０％同一である抗体軽鎖可変ドメインと対合することができる。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号８と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、軽鎖可変ドメインは、第１の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）としてアミノ酸配列ＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡ（配列番号３２）と、第２のＣＤＲとしてＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３３）と、第３のＣＤＲとしてＱＱＧＶＳＦＰＲＴ（配列番号３４）と、を含む。

【0020】

例えば、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である抗体重鎖可変ドメインは、アミノ酸配列ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＤＮＷＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１０、ＡＤＩ－２９３７８）と少なくとも９０％同一である抗体軽鎖可変ドメインと対合することができる。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号１０と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、第１の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）としてアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号３８）と、第２のＣＤＲとしてＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号３９）と、第３のＣＤＲとしてＱＱＳＤＮＷＰＦＴ（配列番号４０）と、を含む。

【0021】

重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインと組み合わせて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成するとき、抗原結合部位を様々な構造、例えば、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を有する典型的な抗体構造に含めて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる一対の抗原結合部位、二重特異性、三重特異性、四重特異性、もしくは他の多特異性抗体、またはｓｃＦｖ（重鎖可変ドメインが軽鎖可変ドメインに連結されている）などのより小さな構造を形成することができる。

【0022】

いくつかの実施形態において、本発明で開示されている任意のＮＫＧ２Ｄ抗原結合部位は、腫瘍関連抗原に結合する別個の抗原結合部位も含むタンパク質に含まれ、タンパク質がＮＫ細胞及び腫瘍細胞と同時に相互作用することを可能にし得る。腫瘍関連抗原は、例えば、ＣＤ３３、ＨＥＲ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＳＡｐ、ＣＡ－１２５、ＴＡＧ－７２、ＥＦＧＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ－１Ｒ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＤＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＮＧＦＲ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、テネイシン、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＰＳＡ、及びＩＬ－６、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、またはＰＤ１であり得る。

【0023】

いくつかの実施形態において、本発明で開示されている任意のＮＫＧ２Ｄ抗原結合部位は、腫瘍関連抗原部位及びＣＤ１６結合部位も含むタンパク質に含まれる。ＣＤ１６結合部位は、さらなる抗原結合部位または抗体定常領域またはその一部、例えばＩｇＧ１定常領域（例えば、エフェクター活性またはＣＤ１６結合親和性に影響を与える１つ以上の変異を任意に含み得る）であり得る。

【0024】

本発明の別の態様は、患者における腫瘍細胞死を増強し、がんを治療する方法を提供する。この方法は、治療を必要とする患者に、治療有効量の本明細書に記載されるタンパク質を投与して、がんを治療することを含む。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン。
（項目２）
前記アミノ酸配列が、
配列番号４８のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列と、
配列番号３０のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列と、
配列番号４４のアミノ酸配列によって表される相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列と、を含む、項目１に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目３）
前記アミノ酸配列が、
配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目１に記載
の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目４）
前記アミノ酸配列が、
配列番号４８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号７１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目１に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目５）
前記アミノ酸配列が、
配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号７７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目１に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目６）
前記アミノ酸配列が、
配列番号４８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号７８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目１に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目７）
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン。
（項目８）
前記アミノ酸配列が、
配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号１２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号１３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目７に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目９）
前記アミノ酸配列が、
配列番号４５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号１２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号６８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目７に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目１０）
配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン。
（項目１１）
前記アミノ酸配列が、
配列番号１７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号１８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目１０に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目１２）
前記アミノ酸配列が、
配列番号４６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号１８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号６９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目１０に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目１３）
配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン。
（項目１４）
前記アミノ酸配列が、
配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号２４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目１３に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目１５）
前記アミノ酸配列が、
配列番号４７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号２４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号７０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目１３に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目１６）
配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、抗体重鎖可変ドメイン。
（項目１７）
前記アミノ酸配列が、
配列番号３５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号３６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号３７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目１６に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目１８）
前記アミノ酸配列が、
配列番号４５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、
配列番号３６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、
配列番号７２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む、項目１６に記載の抗体重鎖可変ドメイン。
（項目１９）
項目１～１８のいずれか一項に記載の抗体重鎖可変ドメインと、抗体定常領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、を含む、抗体重鎖。
（項目２０）
前記抗体定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ定常領域である、項目１９に記載の抗体重鎖。
（項目２１）
前記抗体定常領域が、ＣＨ１ドメインをさらに含むヒトＩｇＧ定常領域である、項目２０に記載の抗体重鎖。
（項目２２）
前記抗体定常領域が、ＩｇＧ１定常領域と９０％同一である、項目１９～２１のいずれか一項に記載の抗体重鎖。
（項目２３）
前記抗体定常領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列が、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、もしくはＫ４３９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目２２に記載の抗体重鎖。
（項目２４）
前記抗体定常領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列が、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４
７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅ、またはこれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目２３に記載の抗体重鎖。
（項目２５）
項目１～６のいずれか一項に記載の抗体重鎖可変ドメインと、配列番号８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む、抗原結合部位。
（項目２６）
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ１配列と、配列番号３３のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ２配列と、配列番号３４のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ３配列と、を含む、項目２５に記載の抗原結合部位。
（項目２７）
表面プラズモン共鳴で測定されるように、２～１２０ｎＭのＫ_Ｄを有する、項目２５または２６に記載の抗原結合部位。
（項目２８）
項目７～９のいずれか一項に記載の抗体重鎖可変ドメインと、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む、抗原結合部位。
（項目２９）
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ１配列と、配列番号１５のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ２配列と、配列番号１６のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ３配列と、を含む、項目２８に記載の抗原結合部位。
（項目３０）
表面プラズモン共鳴で測定されるように、５～５００ｎＭのＫ_Ｄを有する、項目２８または２９に記載の抗原結合部位。
（項目３１）
項目１０～１２のいずれか一項に記載の抗体重鎖可変ドメインと、配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む、抗原結合部位。
（項目３２）
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ１配列と、配列番号２１のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ２配列と、配列番号２２のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ３配列と、を含む、項目３１に記載の抗原結合部位。
（項目３３）
表面プラズモン共鳴で測定されるように、６～６００ｎＭのＫ_Ｄを有する、項目３１または３２に記載の抗原結合部位。
（項目３４）
項目１３～１５のいずれか一項に記載の抗体重鎖可変ドメインと、配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む、抗原結合部位。
（項目３５）
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ１配列と、配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ２配列と、配列番号２８のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ３配列と、を含む、項目３４に記載の抗原結合部位。
（項目３６）
表面プラズモン共鳴で測定されるように、１～１００ｎＭのＫ_Ｄを有する、項目３４または３５に記載の抗原結合部位。
（項目３７）
項目１６～１８のいずれか一項に記載の抗体重鎖可変ドメインと、配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む、抗原結合部位。
（項目３８）
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号３８のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ１配列と、配列番号３９のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ２配列と、配列番号４０のアミノ酸配列と同一であるＣＤＲ３配列と、を含む、項目３７に記載の抗原結合部位。
（項目３９）
表面プラズモン共鳴で測定されるように、６～６００ｎＭのＫ_Ｄを有する、項目３７または３８に記載の抗原結合部位。
（項目４０）
ＮＫＧ２Ｄに結合する、項目２５～３９のいずれか一項に記載の抗原結合部位と、さらなる抗原結合部位と、を含む、タンパク質。
（項目４１）
前記さらなる抗原結合部位が、腫瘍関連抗原に結合する、項目４０に記載のタンパク質。
（項目４２）
前記腫瘍関連抗原が、ＣＤ３３、ＨＥＲ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、及びＰＤ１からなる群から選択される、項目４１に記載のタンパク質。
（項目４３）
前記ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位が、第１の抗体重鎖可変ドメインを含み、前記さらなる抗原結合部位が、第２の抗体重鎖可変ドメインを含み、
前記第１の抗体重鎖可変ドメインが、第１の抗体定常領域をさらに含む第１のポリペプチドに存在し、前記第２の抗体重鎖可変ドメインが、第２の抗体定常領域をさらに含む第２のポリペプチドに存在する、項目４０～４２のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目４４）
前記第１の抗体定常領域及び前記第２の抗体定常領域が、ＣＤ１６に結合することができる複合体を形成する、項目４３に記載のタンパク質。
（項目４５）
前記第１の抗体定常領域及び前記第２の抗体定常領域が、それぞれ、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む、項目４３または４４に記載のタンパク質。
（項目４６）
前記第１の抗体定常領域及び前記第２の抗体定常領域が、それぞれ、ＣＨ１ドメインをさらに含む、項目４３～４５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目４７）
前記第１の抗体定常領域及び前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、それぞれ、ヒトＩｇＧ１定常領域と少なくとも９０％同一である、項目４３～４６のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目４８）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９
、Ｔ４１１、もしくはＫ４３９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、
前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、もしくはＫ４３９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目４９）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、位置Ｔ３６６のＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３６６、Ｌ３６８、もしくはＹ４０７、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目５０）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３６６、Ｌ３６８、もしくはＹ４０７、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３６６位のＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目５１）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、もしくはＴ４１１、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、もしくはＴ４１１、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目５２）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、もしくはＴ４１１、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、もしくはＴ４１１、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目５３）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００、もしくはＹ４０７、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、もしくはＴ４１１、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目５４）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、もしくはＴ４１１、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００、もしくはＹ４０７、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目５５）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０、もしくはＫ４０９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９、もしくはＦ４０５、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目５６）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９、もしくはＦ４０５、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７、もしくはＫ４０９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目５７）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、もしくはＫ４３９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｄ３５６、Ｅ３５７、もしくはＤ３９９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目５８）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｄ３５６、Ｅ３５７、もしくはＤ３９９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９、もしくはＫ４３９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目５９）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６、もしくはＤ３９９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２、もしくはＫ４０９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目６０）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２、もしくはＫ４０９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６、もしくはＤ３９９、またはこれらの任意の組み合わせにおけるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目６１）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｓ３５４Ｃ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｙ３４９Ｃ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目６２）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｙ３４９Ｃ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｓ３５４Ｃ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目６３）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目６４）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目６５）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３６６Ｗ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ
３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目６６）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３６６Ｗ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目６７）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目６８）
前記第１の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、前記第２の抗体定常領域のアミノ酸配列が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換基によるＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる、項目４７に記載のタンパク質。
（項目６９）
前記タンパク質が、ＣＤ１６に結合することができる抗原結合部位をさらに含む、項目４０～４２のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目７０）
配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む抗体を有するヒト及び／またはカニクイザルＮＫＧ２Ｄへの結合を競合する抗原結合部位を含む、タンパク質。
（項目７１）
配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む抗体を有するヒト及び／またはカニクイザルＮＫＧ２Ｄへの結合を競合する抗原結合部位を含む、タンパク質。
（項目７２）
配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む抗体を有するヒト及び／またはカニクイザルＮＫＧ２Ｄへの結合を競合する抗原結合部位を含む、タンパク質。
（項目７３）
配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む抗体を有するヒト及び／またはカニクイザルＮＫＧ２Ｄへの結合を競合する抗原結合部位を含む、タンパク質。
（項目７４）
配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む抗体を有するヒト及び／またはカニクイザルＮＫＧ２Ｄへの結合を競合する抗原結合部位を含む、タンパク質。
（項目７５）
配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む抗体を有するヒト及び／またはカニクイザルＮＫＧ２Ｄへの結合を競合する抗原結合部位を含む、タンパク質。
（項目７６）
項目４０～７５のいずれか一項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、製剤。
（項目７７）
項目４０～７５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む、細胞。
（項目７８）
腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を項目４０～７５のいずれか一項に記載のタンパク質に曝露することを含む、方法。
（項目７９）
がんを治療する方法であって、項目４０～７５のいずれか一項に記載のタンパク質または項目７６に記載の製剤を、患者に投与することを含む、方法。
（項目８０）
前記がんが、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫食道癌、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃癌、消化管癌、消化管間質腫瘍、膠芽細胞腫、頭頸部癌、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、腎細胞癌、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、及び膵臓癌、前立腺癌、肉腫、小細胞肺癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、骨髄由来サプレッサー細胞が浸潤したがん、細胞外マトリックス沈着を伴うがん、高レベルの反応性間質を伴うがん、及び血管新生を伴うがんからなる群から選択される、項目７９に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（右アーム）、腫瘍関連抗原結合ドメイン（左アーム）、及びＣＤ１６に結合するＦｃドメインまたはその一部を含む多重特異性結合タンパク質の略図である。

【図2】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインを含む多重特異性結合タンパク質の表示であり、これらのいずれか１つは、ｓｃＦｖ形式、及びＣＤ１６に結合するＦｃドメインまたはその一部であり得る。

【図3】図３Ａ～図３Ｆは、表面プラズモン共鳴によって測定されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインのＮＫＧ２Ｄ結合親和性のプロファイルである。図３Ａは、表面プラズモン共鳴によって測定されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインＡＤＩ－２７７４４のＮＫＧ２Ｄ結合親和性であり、図３Ｂは、表面プラズモン共鳴によって測定されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインＡＤＩ－２９３７９のＮＫＧ２Ｄ結合親和性であり、図３Ｃは、表面プラズモン共鳴によって測定されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインＡＤＩ－２７７４９のＮＫＧ２Ｄ結合親和性であり、図３Ｄは、表面プラズモン共鳴によって測定されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインＡＤＩ－２９４６３のＮＫＧ２Ｄ結合親和性であり、図３Ｅは、表面プラズモン共鳴によって測定されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインＡＤＩ－２９３７８のＮＫＧ２Ｄ結合親和性である。

【図4】図４Ａ～図４Ｈは、表面プラズモン共鳴によって測定されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインＡＤＩ－２７７４４（Ａ４４）及びＵＬＢＰ６または他のＮＫＧ２Ｄ抗体による競合的ＮＫＧ２Ｄ結合のプロファイルである。図４Ａは、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＵＬＢＰ６が注入されたＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体のプロファイルを示す。図４Ｂは、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が注入されたＵＬＢＰ６のプロファイルを示す。図４Ｃは、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＵＬＢＰ６が注入されたＭＳモノクローナル抗体のプロファイルを示す。図４Ｄは、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が注入されたＭＳのプロファイルを示す。図４Ｅは、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が注入された１Ｄ１１のプロファイルを示す。図４Ｆは、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が注入されたＭＡＢ１３９のプロファイルを示す。図４Ｇは、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いて、ＡＤＩ－２７７４９（Ａ４９）を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が注入されたＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体のプロファイルを示す。図４Ｈは、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＦ４７を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が注入されたＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体のプロファイルを示す。

【図5】ＥＬ４細胞で発現されたＮＫＧ２ＤへのＣＤ３３を標的としたＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルを示す線グラフである。

【図6】ＥＬ４細胞で発現されたＮＫＧ２ＤへのＨＥＲ２を標的としたＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルを示す線グラフである。

【図7】Ｍｖ４－１１細胞で発現されたＣＤ３３へのＣＤ３３を標的としたＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルを示す棒グラフである。

【図8】７８６－Ｏ細胞で発現されたＨＥＲ２へのＨＥＲ２を標的としたＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルを示す棒グラフである。

【図9】ＮＣＩ－Ｈ６６１細胞で発現されたＨＥＲ２へのＨＥＲ２を標的としたＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルを示す棒グラフである。

【図10】ＨＥＲ２を標的とするＴｒｉＮＫＥＴが、ＨＥＲ２を発現するＮＣＩ－Ｈ６６１細胞と共培養されたヒトＮＫ細胞の活性化を媒介することを示す棒グラフである。

【図11】ＨＥＲ２を標的とするＴｒｉＮＫＥＴが、ＨＥＲ２を発現するＳｋＢｒ－３細胞と共培養されたヒトＮＫ細胞の活性化を媒介することを示す棒グラフである。

【図12】ＣＤ３３を標的とするＴｒｉＮＫＥＴが、ＣＤ３３を発現するヒトＡＭＬ Ｍｖ４－１１細胞と共培養されたヒトＮＫ細胞の活性化を媒介することを示す棒グラフである。

【図13】ＣＤ３３を標的とするＴｒｉＮＫＥＴが、ＣＤ３３を発現するＭｏｌｍ－１３がん細胞に対する休止したＮＫ細胞の細胞毒性を可能にすることを示す線グラフである。

【図14】ＣＤ３３を標的とするＴｒｉＮＫＥＴが、ＣＤ３３を発現するＭｏｌｍ－１３がん細胞に対する活性化されたＮＫ細胞の細胞毒性を可能にすることを示す線グラフである。

【図15】ＨＥＲ２を標的とするＴｒｉＮＫＥＴが、ＨＥＲ２を発現する７８６－Ｏがん細胞に対する休止したＮＫ細胞の細胞毒性を可能にすることを示す棒グラフである。

【図16】ＨＥＲ２を標的とするＴｒｉＮＫＥＴが、ＨＥＲ２を発現する７８６－Ｏがん細胞に対する活性化されたＮＫ細胞の細胞毒性を可能にすることを示す棒グラフである。

【図17】ＩｇＧ様の形状を維持する三官能性二重特異性抗体である、トリオマブ形態のＴｒｉＮＫＥＴの略図である。このキメラは、２つの親抗体に由来する、それぞれ、１つの軽鎖と１つの重鎖がある２つの半抗体からなる。トリオマブ形態は、１／２のラット抗体及び１／２のマウス抗体を含むヘテロ二量体構築物である。

【図18】ノブイントゥーホール（ＫＩＨ）技術を含む、ＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態のＴｒｉＮＫＥＴの略図である。ＫｉＨは、標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂと、ヘテロ二量化変異によって安定化されたＦｃと、を含むヘテロ二量体である。ＫｉＨ形態のＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖と、両方のＨＣと対合する共通の軽鎖と、を含む、標的１及び標的２に結合する２つのｆａｂを有するヘテロ二量体構築物である。

【図19】柔軟な天然に生じるリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせて、４価のＩｇＧ様の分子を生成する、デュアル可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））の形態のＴｒｉＮＫＥＴの略図である。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）は、可変ドメインを標的とする抗原２が、Ｆａｂを標的とする抗原１の可変ドメインのＮ末端に融合しているホモ二量体のコンストラクトであり、構築物は、正常のＦｃを含む。

【図20】Ｆｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂを含むヘテロ二量体構築物である、直交Ｆａｂインターフェース（Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ）形態のＴｒｉＮＫＥＴの略図である。ＬＣ－ＨＣ対合は、直交インターフェースによって確保される。ヘテロ二量化は、Ｆｃの変異によって確保される。

【図21】ツーインワンのＩｇ形式でのＴｒｉｎＫＥＴの略図である。

【図22】Ｆｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含むヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態のＴｒｉＮＫＥＴの略図である。ヘテロ二量化は、Ｆｃの変異を静電気ステアリングによって確保される。

【図23】Ｆａｂアーム交換形態のＴｒｉＮＫＥＴ：重鎖及び付着した軽鎖（半分子）を別の分子からの重軽鎖対と交換することによってＦａｂアームを交換し、二重特異性抗体をもたらす抗体の略図である。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１及び２に結合する２つのＦａｂと、ヘテロ二量化変異によって安定化されたＦｃと、を含むヘテロ二量体である。

【図24】標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂと、ヘテロ二量化変異によって安定化されたＦｃと、を含むヘテロ二量体である、ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴの略図である。

【図25】ロイシンジッパーが２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するために使用される、ＬｕＺ－Ｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴの略図である。ＬｕＺ－Ｙ形態は、Ｆｃに融合した標的１及び２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含むヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって確保される。

【図26】Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ形態でのＴｒｉＮＫＥＴの略図である。

【図27】図２７Ａ～図２７Ｂは、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である_Ｋλ－Ｂｏｄｙ形態のＴｒｉＮＫＥＴの略図であり、Ｆａｂ１を標的とする抗原１は、カッパＬＣを含むが、第２のＦａｂを標的とする抗原２は、ラムダＬＣを含む。図２７Ａは、_Ｋλ－Ｂｏｄｙの１つの形態の例示的な略図であり、図２７Ｂは、もう一方の_Ｋλ－Ｂｏｄｙの例示的な略図である。

【図28】標的１に結合するＦａｂと、Ｆｃに融合した標的２に結合するｓｃＦａｂと、を含むＯａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量化は、Ｆｃの変異によって確保される。

【図29】抗原１及び抗原２に結合する２つの異なるＦａｂと、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃと、を含むヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂである。Ｆａｂ１及びＦａｂ２には、正確なＬＣ及びＨＣの対合を確保する特異的なＳ－Ｓ架橋が含まれる。

【図30】ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂである。ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメイン、ならびにＶＨドメイン及びＶＬドメインが入れ替わり、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインラインで融合し、一方、ＣＬは、ＶＨとインラインで融合する。

【図31】抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ－Ｉｇである。この構築物は、野生型Ｆｃを含む。

【図32】ＳＰＲによって試験されるように、ヒトＮＫＧ２ＤへのＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊及びＴｒｉＮＫＥＴ Ａの結合を示す一連の線グラフである。上部のパネルは動的適合を表し、下部のパネルは定常状態の親和性適合を表す。

【図33】標的細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性の媒介において、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ及びＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊の効力を示す線グラフである。

【図34】標的細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性の媒介において、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ及びＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊の効力を示す線グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、対合して、ナチュラルキラー細胞上のナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体を標的とする抗原結合部位を形成することができる抗体重鎖ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有するタンパク質、そのようなタンパク質を含む薬学的組成物、ならびにがんの治療用を含むそのようなタンパク質及び薬学的組成物を使用する治療方法を提供する。本発明の種々の態様が下記の章に記載されるが、しかしながら、ある特定の章に説明される本発明の態様は、いずれの特定の章にも限定されるものではない。

【0027】

本発明の理解を促進するために、多数の用語及び語句を下記に定義する。

【0028】

本明細書で使用されるとき、「ａ」及び「ａｎ」という用語は、「１つ以上」を意味し、文脈が不適切でない限り複数形を含む。

【0029】

本明細書で使用する場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書に記載される方法及び組成物によって治療される生物を指す。そのような生物は、好ましくは哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）を含み、より好ましくはヒトを含む。

【0030】

本明細書で使用する場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多岐にわたる伸展が、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られるより保存された隣接伸展間に挿入される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリン内の超可変領域間、及びそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子内で、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原のこの三次元表面に対して相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。ラクダや軟骨魚などの特定の動物では、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一の抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、単一のポリペプチドにおける軽鎖可変ドメインに重鎖可変ドメインを接続するためにペプチドリンカーを使用して、無傷の抗体、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチドに存在し得る。

【0031】

本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回以上の投与、適用、または投薬において投与することができ、特定の処方または投与経路に限定されることを意図しない。本明細書で使用されるとき、用語「治療する」は、病態、疾患、障害などの改善をもたらす、例えば、低下、低減、調節、改良、もしくは排除などの任意の効果、またはそれらの症状の改良を含む。

【0032】

本明細書で使用する場合、「薬学的組成物」という用語は、活性薬剤と、その組成物をインビボまたはエキソビボの治療的使用に本質的に好適にする不活性または活性な担体との組み合わせを指す。

【0033】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳剤（例えば、油／水または水／油乳剤など）、ならびに様々な種類の湿潤剤などの、標準の薬学的担体のいずれかを指す。また、組成物は、安定剤および防腐剤を含むことができる。担体、安定化剤、及び保存剤の例については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ［１９７５］を参照のこと。

【0034】

この説明を通して、組成物が特定の構成要素を有する、含む、もしくは備えると説明されるか、またはプロセス及び方法が特定のステップを有する、含む、もしくは備えると説明される場合、それに加えて、記載される構成要素から本質的になるか、もしくはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびに記載されるプロセスステップから本質的になるか、もしくはそれからなる本発明によるプロセス及び方法が存在することが企図される。

【0035】

一般的に、パーセンテージを指定する組成物は、特に指定のない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の以前の定義が制御する。
ＮＫＧ２Ｄ抗原結合部位

【0036】

本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位、及びそのような抗原結合部位を作製するために使用することができる抗原重鎖可変ドメインを提供する。

【0037】

ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合して作動することができる抗原結合部位を形成するためにそれらが対合する抗体重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが同定され、以下の表１に提供される。特に明記しない限り、表１に提供されているＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔの下で決定される。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【0038】

上記の抗体重鎖可変ドメインアミノ酸配列の１つ以上の利点の１つは、ヒト及びカニクイザルのＮＫＧ２Ｄに結合して受容体を刺激し、受容体への結合について天然リガンドと競合することができることである。ＮＫＧ２Ｄに結合し、これらの特性の１つ以上を共有するさらなる抗原結合部位も特に有用であり、当該技術分野で公知の結合競合アッセイによって同定することができる。例えば、さらなる抗原結合部位は、ヒト及び任意にカニクイザルＮＫＧ２Ｄの両方に結合するために、ＡＤＩ－２９３７９、ＡＤＩ－２９４６３、ＡＤＩ－２７７４４、ＡＤＩ－２７７４９、またはＡＤＩ－２９３７８との競合によって同定することができる。

【0039】

上記の抗体重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン配列を含むＮＫＧ２Ｄ結合部位の別の利点は、それらが高い親和性を有するＮＫＧ２Ｄに結合することができることである。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、０．１～１０００ｎＭのＫ_Ｄを有するＮＫＧ２Ｄに結合する。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、１～５００ｎＭのＫ_Ｄを有するＮＫＧ２Ｄに結合する。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、５～１００ｎＭのＫ_Ｄを有するＮＫＧ２Ｄに結合する。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、１０～６２ｎＭのＫ_Ｄを有するＮＫＧ２Ｄに結合する。

【0040】

ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号２と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供する。ある特定の実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号１１または配列番号９１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号１２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号１３または配列番号６８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。ある特定の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号１４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号１６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。

【0041】

ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号４と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供する。ある特定の実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号１７または配列番号９２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号１８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号１９または配列番号６９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。ある特定の実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号２０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号２１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号２２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。

【0042】

ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号６と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供する。ある特定の実施形態において、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号２３または配列番号９３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号２４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号２５または配列番号７０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。ある特定の実施形態において、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号２６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号２８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。

【0043】

ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号８と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供する。ある特定の実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号２９または配列番号９４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号３１または配列番号７１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。ある特定の実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号３２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号３４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。

【0044】

重鎖可変ドメインのＣＤＲ３にある、配列番号７の１０２位のアミノ酸残基Ｍは、変異させることができる。ある特定の実施形態において、Ｍ１０２は、非荷電残基で置換されている。ある特定の実施形態において、Ｍ１０２は、疎水性残基（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐ）で置換されている。ある特定の実施形態において、Ｍ１０２は、極性残基（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＴｙｒ）で置換されている。ある特定の実施形態において、Ｍ１０２は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅで置換されている。

【0045】

したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号８と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供する。ある特定の実施形態において、配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号２９または配列番号９４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号７３または配列番号７４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。ある特定の実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号３２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号３４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。

【0046】

ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号８４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号８と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供する。ある特定の実施形態において、配列番号８４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号２９または配列番号９４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号７５または配列番号７６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。ある特定の実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号３２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号３４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。

【0047】

ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号８と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供する。ある特定の実施形態において、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号２９または配列番号９４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号７７または配列番号７８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。ある特定の実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号３２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号３４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。

【0048】

ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号８と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供する。ある特定の実施形態において、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号２９または配列番号９４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号７９または配列番号８０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。ある特定の実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号３２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号３４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。

【0049】

ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号８と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供する。ある特定の実施形態において、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号２９または配列番号９４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号８１または配列番号８２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。ある特定の実施形態において、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号３２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号３４のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。

【0050】

ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号１０と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供する。ある特定の実施形態において、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号３５または配列番号９１のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３６のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号３７または配列番号７２のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。ある特定の実施形態において、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、配列番号３８のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ１配列と、配列番号３９のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ２配列と、配列番号４０のアミノ酸配列によって表されるＣＤＲ３配列と、を含む。

【0051】

ある特定の実施形態において、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号６と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位を提供し、これは、ＮＫＧ２Ｄへの抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＭＳ、１Ｄ１１、及びＭＡＢ１３９の結合を遮断しない。

【0052】

実施形態において、本発明は、配列番号７、８３、８４、８５、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号８と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位は、ＮＫＧ２Ｄへの、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号６と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位の結合を遮断しない。

【0053】

ある特定の実施形態において、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインと、配列番号６と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインと、を含む抗原結合部位は、ＭＳ、１Ｄ１１、ＭＡＢ１３９、ＡＤＩ－２７７４９、及びＦ４７結合エピトープ（複数可）とは異なるＮＫＧ２Ｄ上の特異エピトープに結合する。

【0054】

抗体及び多重特異性結合タンパク質
本発明のいくつかの実施形態において、抗体重鎖可変ドメインを本明細書に記載される軽鎖可変ドメインと対合することによって形成されるＮＫＧ２Ｄ抗原結合部位は、無傷の抗体、多重特異的結合タンパク質、または多重特異的結合抗体などのより大きなタンパク質に含めることができる。例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、第２の成分、例えば、第２の抗原結合部位と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合部位は、１つ以上の腫瘍関連抗原、例えば、ＣＤ３３、ＨＥＲ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＳＡｐ、ＣＡ－１２５、ＴＡＧ－７２、ＥＦＧＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ－１Ｒ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＤＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＮＧＦＲ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、テネイシン、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＰＳＡ、及びＩＬ－６、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、またはＰＤ１に結合する。ＮＫＧ２Ｄ及びがん細胞の腫瘍関連抗原への多重特異性タンパク質の結合は、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近づけ、ナチュラルキラー細胞による直接的な、または間接的ながん細胞の破壊を促進する。

【0055】

いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位及び腫瘍関連抗原結合部位に加えて、多重特異性結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、及び濾胞樹状細胞を含む、白血球の表面上のＦｃ受容体である、ＣＤ１６に結合するドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ１６結合ドメインは、抗体Ｆｃ領域またはその一部を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ１６に結合するドメインは、ＣＨ１ドメインの有無にかかわらず抗体Ｆｃ領域の、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体Ｆｃ領域は、ヒト及び／または他の哺乳類の免疫グロブリンのＦｃ領域に由来する。Ｆｃ領域内で、ＣＤ１６の結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインによって媒介されることが知られている。例えば、ヒトＩｇＧ１内で、ＣＤ１６との相互作用は、ＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸残基Ａｓｐ２６５－Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７－Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７－Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４－Ｓｅｒ２３９、及び炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンによって媒介される（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９３）：２６７－２７３を参照のこと）。既知のドメイン及びアミノ酸残基に基づいて、いくつかの実施形態において、変異は、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強または減少させるために、ＣＤ１６結合ドメイン内で選択され得る。選択方法は、ファージディスプレイライブラリーまたは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーなどの、当該技術分野で周知の方法である。当業者による相互作用の既知の三次元構造に基づいて、適切な選択方法を設計することもできる。

【0056】

本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、様々な形式をとることができる。例えば、１つの形式は、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、及び第２の免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体である。第１の免疫グロブリン重鎖には、第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第１の重鎖可変ドメイン、及び任意に第１のＣＨ１重鎖ドメインが含まれる。第１の免疫グロブリン軽鎖には、第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の軽鎖定常ドメインが含まれる。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒になって、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖には、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、及び任意に第２のＣＨ１重鎖ドメインが含まれる。第２の免疫グロブリン軽鎖には、第２の軽鎖可変ドメイン及び第２の軽鎖定常ドメインが含まれる。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒になって、腫瘍抗原に結合する抗原結合部位を形成する。第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは共に、ＣＤ１６に結合することができる（図１）。

【0057】

別の例示的な形式は、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体を含む。第１の免疫グロブリン重鎖には、リンカーまたは抗体ヒンジを介して、ＮＫＧ２Ｄに対合し、結合する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインからなる一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合した第１のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメインが含まれる。第２の免疫グロブリン重鎖には、第２のＦｃ（ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）ドメイン、第２の重鎖可変ドメイン、及び任意にＣＨ１重鎖ドメインが含まれる。免疫グロブリン軽鎖には、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインが含まれる。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対合し、腫瘍関連抗原に結合する。第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインは共に、ＣＤ１６に結合することができる（図２）。多重特異的結合タンパク質のさらなる形式は、本明細書に記載されるＮＫＧ２Ｄ結合断片の様々な形式を組み合わせることによって考案することができる。

【0058】

１つ以上のさらなる結合モチーフは、任意にリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合させ得る。ある特定の実施形態において、抗原結合部位は、一本鎖またはジスルフィド安定化可変領域（ｓｃＦｖ）であり得るか、または四価分子または三価分子を形成し得る。

【0059】

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様の形状を維持する三官能性二重特異性抗体である、トリオマブ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由来する、それぞれ、１つの軽鎖と１つの重鎖がある２つの半抗体からなる。トリオマブ形態は、１／２のラット抗体及び１／２のマウス抗体を含むヘテロ二量体構築物である。

【0060】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、ノブイントゥーホール（ＫＩＨ）技術を含む、ＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態である。ＫＩＨは、ヘテロ二量体化を促進するために各重鎖に「ノブ」または「ホール」を作製するためにＣ_Ｈ３ドメインを操作することを含む。「ノブイントゥーホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背後にある概念は、小さな残基をかさ高い残基（つまり、ＥＵ番号のＴ３６６Ｗ_ＣＨ３Ａ）で置き換えることによって、１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」を導入することであった。「ノブ」に対応するために、相補的な「ホール」表面は、その他のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）に、ノブに最も近い隣接残基を小さいもの（すなわち、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ_ＣＨ３Ｂ）で置き換えることによって作製された。「ホール」変異は、構造化ガイド付きファージライブラリスクリーニングによって最適化された（Ａｔｗｅｌｌ Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，Ｗｅｌｌｓ ＪＡ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．Ｓｔａｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９７）２７０（１）：２６－３５）。ＫｉＨ ＦｃバリアントのＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ ＪＭ，Ｕｌｔｓｃｈ Ｍ，Ｌｅｅ Ｊ，Ｔｏｎｇ Ｒ，Ｔａｋｅｄａ Ｋ，Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｈａｌｆ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ＣＨ２－ＣＨ３ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１４）４２６（９）：１９４７－５７、Ｍｉｍｏｔｏ Ｆ，Ｋａｄｏｎｏ Ｓ，Ｋａｔａｄａ Ｈ，Ｉｇａｗａ Ｔ，Ｋａｍｉｋａｗａ Ｔ，Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ
ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ＦｃｇａｍｍａＲｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１４）５８（１）：１３２－８）は、ヘテロ二量化が、ＣＨ３ドメイン間のコアインターフェースでの立体的相補性によって駆動される疎水性相互作用によって熱力学的に支持されるのに対し、ノブ－ノブ及びホール－ホールインターフェースは、それぞれ、立体障害と好ましい相互作用の中断のためにホモ二量化を支持しないことを示した。

【0061】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、柔軟な天然に生じるリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせて、４価のＩｇＧ様の分子を生成する、デュアル可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））の形態にある。ＤＶＤ－Ｉｇ（商標）は、可変ドメインを標的とする抗原２が、Ｆａｂを標的とする抗原１の可変ドメインのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物であり、構築物は、正常のＦｃを含む。

【0062】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、Ｆｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂを含むヘテロ二量体構築物である、直交Ｆａｂインターフェース（Ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ）形態にある。ＬＣ－ＨＣ対合は、直交インターフェースによって確保される。ヘテロ二量化は、Ｆｃの変異によって確保される。ｏｒｔｈｏ－Ｆａｂ ＩｇＧアプローチ（Ｌｅｗｉｓ ＳＭ，Ｗｕ Ｘ，Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ Ａ，Ｓｅｒｅｎｏ Ａ，Ｈｕａｎｇ Ｆ，Ｒｉｃｋ ＨＬ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｆａｂ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）３２（２）：１９１－８）において、構造ベースの地域設計では、ＬＣ及びＨＣ_{ＶＨ－ＣＨ１}のインターフェースに、他のＦａｂにいかなる変更を加えることなく、１つのＦａｂのみに相補的な変異を導入する。

【0063】

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、ツーインワン（２－ｉｎ－１）Ｉｇ形式である。いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、Ｆｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含むヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態にある。ヘテロ二量化は、Ｆｃの変異を静電気ステアリングによって確保される。

【0064】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である_Ｋλ－Ｂｏｄｙ形態にあり、Ｆａｂ１を標的とする抗原１は、カッパＬＣを含むが、第２のＦａｂを標的とする抗原２は、ラムダＬＣを含む。

【0065】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換形態（重鎖及び付着した軽鎖（半分子）を別の分子からの重軽鎖対と交換することによってＦａｂアームを交換し、二重特異性抗体をもたらす抗体）にある。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂと、ヘテロ二量化変異によって安定化されたＦｃと、を含むヘテロ二量体である。

【0066】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂと、ヘテロ二量化変異によって安定化されたＦｃと、を含むヘテロ二量体である、ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ形態にある。鎖交換組換えドメイン（ＳＥＥＤ）プラットフォームは、天然に存在する抗体の治療用途を拡大する機能である非対称の二重特異性抗体様分子を生成するように設計された。このタンパク質組換えプラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメイン内の免疫グロブリンの構造的に関連した配列の交換に基づいている。ＳＥＥＤ設計は、ＡＧ及びＧＡのＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避しつつ、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする。（Ｍｕｄａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１１，２４（５）：４４７－５４））。

【0067】

いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、ロイシンジッパーが２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するために使用される、ＬｕＺ－Ｙ形態にある。（Ｗｒａｎｉｋ，ＢＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２），２８７：４３３３１－９）。ＬｕＺ－Ｙ形態は、Ｆｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含むヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって確保される。

【0068】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ形態にある（二重特異性ＣｏｖＸ－Ｂｏｄｉｅｓでは、２つの異なるペプチドを、分岐アゼチジノンリンカーを用いて結合し、部位特異的に緩やかな条件下で足場抗体に融合する。ファーマコフォアが機能活性に関与するのに対し、抗体足場は、長い半減期及びＩｇ様の分布を与える。ファーマコフォアを、化学的に最適化するか、または他のファーマコフォアで置き換えることにより、最適化された、または独自の二重特異性抗体を生成することができる。（Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ ＶＲ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１０），１０７（５２）；２２６１１－２２６１６）。

【0069】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、標的１に結合するＦａｂと、Ｆｃに融合した標的２に結合するｓｃＦａｂと、を含むＯａｓｃ－Ｆａｂヘテロ二量体構築物にある。ヘテロ二量化は、Ｆｃの変異によって確保される。

【0070】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、抗原１及び抗原２に結合する２つの異なるＦａｂと、ヘテロ二量化変異によって安定化されたＦｃと、を含むＤｕｅｔＭａｂ形式にある。Ｆａｂ１及びＦａｂ２には、正確なＬＣ及びＨＣの対合を確保する特異的なＳ－Ｓ架橋が含まれる。

【0071】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形式にある。ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメイン、ならびにＶＨドメイン及びＶＬドメインが入れ替わり、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインラインで融合し、一方、ＣＬは、ＶＨとインラインで融合する。

【0072】

いくつかの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形式にある。この構築物は、野生型を含む。

【0073】

ヘテロ二量体抗体重鎖
ヘテロ二量体抗体重鎖のアセンブリは、同じ細胞で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成することができ、これにより、各抗体重鎖のホモ二量体のアセンブリならびにヘテロ二量体のアセンブリをもたらし得る。本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質内のヘテロ二量体重鎖の優先的なアセンブリは、アミノ酸置換の異なる対を、第１の重鎖ポリペプチド内の第１のＣＨ３ドメイン及び第２の重鎖ポリペプチド内の第２のＣＨ３ドメインに組み込むことによって促進することができ、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０、ＵＳ１４／８３０３３６に示されるように、これらの２つの鎖は互いに選択的にヘテロ二量体化することができる。いくつかの実施形態において、多重特異性結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。２つの重鎖のヘテロ二量体化を促進するために、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの対内のアミノ酸置換の様々な例を、以下に示す。アミノ酸置換の各位置は、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従って番号が付けられている。

【0074】

１つのシナリオでは、第１のポリペプチドのアミノ酸置換により、元のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）、及び少なくとも１つのアミノから選択されたより大きなアミノ酸で置き換えられ、第２のポリペプチドの酸置換により、元のアミノ酸（複数可）が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択されるより小さいアミノ酸（複数可）で置き換えられ、それによりアミノ酸置換（隆起）は、より小さいアミノ酸置換（空洞）の表面に適合する。例えば、一方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含むことができ、他方は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む３つの置換を含むことができる。

【0075】

あるいは、アミノ酸置換は、表２に示される以下の一連の置換から選択され得る。

【表2】

【0076】

あるいは、アミノ酸置換は、表３に示される以下の一連の置換から選択され得る。

【表3】

【0077】

あるいは、アミノ酸置換は、表４に示される以下の一連の置換から選択され得る。

【表4】

【0078】

あるいは、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換は、表５から選択され得る。

【表5】

【0079】

あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表６中の以下の一連の置換から選択され得、第１のポリペプチド列に示されている位置（複数可）は、既知の負に帯電したアミノ酸で置き換えられ、第２のポリペプチド列に示されている位置（複数可）は、既知の正に帯電したアミノ酸で置き換えられている。

【表6】

【0080】

あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表７中の以下の一連の置換から選択され得、第１のポリペプチド列に示されている位置（複数可）は、既知の正に帯電したアミノ酸で置き換えられ、第２のポリペプチド列に示されている位置（複数可）は、既知の負に帯電したアミノ酸で置き換えられている。

【表7】

【0081】

あるいは、アミノ酸置換は、表８に示される以下の一連の置換から選択され得る。

【表8】

【0082】

あるいは、または加えて、多重特異性結合タンパク質内のヘテロ二量体重鎖の構造的安定性は、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、２つのポリペプチドの境界内に人工ジスルフィド架橋を形成する反対側のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入することによって増加することができる。

【0083】

上記の多重特異性結合タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列は、第１の発現ベクターにクローン化され得、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列は、第２の発現ベクターにクローン化され得、第１の免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列は、第３の発現ベクターにクローン化され得、第２の免疫グロブリン軽鎖をコードする第４の核酸配列は、第４の発現ベクターにクローン化され得、第１、第２、第３、及び第４の発現ベクターを、一緒に安定して宿主細胞にトランスフェクトして、多量体タンパク質を産生され得る。

【0084】

多重特異性結合タンパク質の最高の収量を達成するために、第１、第２、第３、及び第４の発現ベクターの異なる比率を探索して、宿主細胞へのトランスフェクションに最適な比率を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈法、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当該技術分野で既知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単一クローンを単離することができる。

【0085】

クローンは、バイオリアクターのスケールアップに適した条件下で培養し、多重特異性タンパク質の発現を維持することができる。多重特異性結合タンパク質は、遠心分離、デプスフィルター、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーを含む当該技術分野で既知の方法を使用して、単離または精製され得る。

【0086】

本明細書に記載されるＮＫＧ２Ｄ結合部位と競合する抗原結合部位を含むタンパク質
ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるＮＫＧ２Ｄ結合部位と競合して、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を含むタンパク質を提供する。本明細書に記載されるＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３及び配列番号４のアミノ酸配列、配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列、配列番号７及び配列番号８のアミノ酸配列、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号８３及び配列番号８のアミノ酸配列、配列番号８４及び配列番号８のアミノ酸配列、配列番号８５及び配列番号８のアミノ酸配列、配列番号８６及び配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８７及び配列番号８のアミノ酸配列を含む。これらのＮＫＧ２Ｄ結合部位は、表面プラズモン共鳴によってマッピングされたＮＫＧ２Ｄ上の異なるエピトープに結合することができる。例えば、実施例２に示すように、ＡＤＩ－２７７４４は、ＮＫＧ２Ｄ上の、ＡＤＩ－２７７４９及び他の既存のＮＫＧ２Ｄ抗体とは異なるエピトープに結合する。

【0087】

いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位と競合するタンパク質の抗原結合部位は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位と競合するタンパク質の抗原結合部位は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位と競合するタンパク質の抗原結合部位は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位と競合するタンパク質の抗原結合部位は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ結合部位と競合するタンパク質の抗原結合部位は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。

【0088】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＮＫＧ２Ｄ結合部位と競合する抗原結合部位を含むタンパク質は、腫瘍関連抗原及び／またはＣＤ１６結合部位に結合する第２の抗原結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１６結合部位は、ＣＤ１６に結合することができる抗体定常領域またはその一部である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１６結合部位は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。

【0089】

タンパク質を発現するための細胞
一態様において、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有するＮＫＧ２Ｄ結合部位、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有するＮＫＧ２Ｄ結合部位、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有するＮＫＧ２Ｄ結合部位、配列番号７、８３、８４、８５、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有するＮＫＧ２Ｄ結合部位、または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有するＮＫＧ２Ｄ結合部位、を含むタンパク質をコードする１つ以上の核酸を含む細胞を提供する。

【0090】

治療への適用
本発明は、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質及び／または本明細書に記載される薬学的組成物を使用して、腫瘍細胞死を増強する及び／またはがんを治療するための方法を提供する。この方法は、様々ながんを治療するために使用され得る。治療されるがんのタイプは、タンパク質が結合するがん細胞のタイプと一致することが望ましい。治療方法のさらなる態様及び実施形態を、以下に説明する。

【0091】

薬学的組成物
一態様では、本開示はまた、本明細書に記載されるＮＫＧ２Ｄ結合部位または本明細書に記載されるＮＫＧ２Ｄ結合部位と競合するＮＫＧ２Ｄ結合部位と、薬学的に許容される担体と、を含む有効量のタンパク質を含む薬学的組成物を特徴とする。

【0092】

ある特定の実施形態において、製剤は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有する抗原結合部位を含むタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、製剤は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有する抗原結合部位を含むタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、製剤は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有する抗原結合部位を含むタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、製剤は、配列番号７、８３、８４、８５、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有する抗原結合部位を含むタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、製剤は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有する抗原結合部位を含むタンパク質を含む。

【0093】

組成物は、様々な薬物送達システムで使用するために製剤化され得る。１つ以上の生理学的に許容される賦形剤または担体には、適切な製剤のための組成物が含まれ得る。本開示での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見出される。薬剤送達のための方法の簡潔な論評については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３）１９９０を参照されたい。

【0094】

例えば、本開示は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療有効量のタンパク質を含む水性薬学的製剤中に存在し得る。水性担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストローズ溶液が含まれる。ある特定の実施形態において、本明細書に開示されるタンパク質を含む水性製剤が、ｐＨ緩衝溶液中に調製される。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９または６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。上記のｐＨの中間の範囲もまた、本開示の一部であることが意図される。例えば、上限及び／または下限として、任意の上記の値の組み合わせを用いた値の範囲が含まれることが意図される。この範囲内でｐＨを制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸、ヒスチジン、クエン酸塩、及び他の有機酸緩衝液が含まれる。ある特定の実施形態において、緩衝液系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある特定の実施形態において、緩衝液系は、約１．３ｍｇ／ｍｌ（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍｌ）のクエン酸、約０．３ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍｌ）のクエン酸ナトリウム、約１．５ｍｇ／ｍｌ（例えば、１．５３ｍｇ／ｍｌ）のリン酸二ナトリウム二水和物、約０．９ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．８６）のリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び約６．２ｍｇ／ｍｌ（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍｌ）の塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態において、緩衝液系は、１～１．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸、０．２５～０．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、１．２５～１．７５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７～１．１ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び６．０～６．４ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを含む。液体製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される酸は、塩酸であり得る。ある特定の実施形態において、塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。

【0095】

いくつかの実施形態において、製剤は、薬学的に許容され（ヒトへの投与について安全かつ非毒性である）、液体製剤の調製物に有用である、水性担体を含む。例示的な担体は、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストローズ溶液を含む。

【0096】

等張化剤として機能し、抗体を安定化させることができるポリオールも、製剤に含まれ得る。このポリオールを、製剤の所望の等張性に対して変化し得る量で製剤に添加する。ある特定の実施形態において、水性製剤は、等張であり得る。添加するポリオールの量を、ポリオールの分子量に対して変化することもできる。例えば、二糖（例えば、トレハロース）と比較して、より少量の単糖（例えば、マンニトール）を添加することができる。ある特定の実施形態において、等張化剤として製剤に使用することができるポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態において、マンニトール濃度は、約５～約２０ｍｇ／ｍｌであり得る。ある特定の実施形態において、マンニトール濃度は、約７．５～１５ｍｇ／ｍｌであり得る。ある特定の実施形態において、マンニトール濃度は、約１０～１４ｍｇ／ｍｌであり得る。ある特定の実施形態において、マンニトール濃度は、約１２ｍｇ／ｍｌであり得る。ある特定の実施形態において、ポリオールソルビトールは、製剤に含まれ得る。

【0097】

洗剤または界面活性剤も、製剤に添加され得る。例示的な洗剤としては、非イオン性洗剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）が挙げられる。添加する洗剤の量は、それが製剤化抗体の凝集を低減させ、及び／または製剤中の微粒子の形成を最小限に抑え、及び／または吸着を低減させるような量である。ある特定の実施形態において、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態において、製剤は、洗剤ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０を含み得る。Ｔｗｅｅｎ ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを記載するために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ，Ｅｄｉｔｉｏ Ｃａｎｔｏｒ
Ｖｅｒｌａｇ Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，４ｔｈ ｅｄｉ．，１９９６を参照のこと）。ある特定の実施形態において、製剤は、約０．１～約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、または約０．５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含み得る。ある特定の実施形態において、約０．１％のポリソルベート８０が、製剤に添加され得る。

【0098】

ある特定の実施形態において、本開示の液体製剤は、安定化レベルの糖と組み合わせて１０ｍｇ／ｍＬの濃縮溶液として調製され得る。ある特定の実施形態において、液体製剤は、水性担体中で調製され得る。ある特定の実施形態において、安定剤は、静脈内投与に望ましくないかまたは不適当な粘度をもたらし得る量以下で添加され得る。ある特定の実施形態において、糖は、二糖、例えばスクロースであり得る。ある特定の実施形態において、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、及び防腐剤のうちの１つ以上を含み得、細菌作用を低減するために本明細書中の製剤に添加される。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。

【0099】

いくつかの実施形態において、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、及び水酸化ナトリウムと組み合わせた、本開示のタンパク質を含む保存期間が延長された製剤を提供する。

【0100】

脱アミドは、発酵、収穫／細胞浄化、精製、薬物物質／薬物製品の保管中、及びサンプル分析中に発生し得るペプチド及びタンパク質の一般的な製品バリアントである。脱アミド化は、加水分解を受けることができるスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ３の損失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドから１７Ｄａの質量減少をもたらす。その後の加水分解により、１８ｕの質量が増加する。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下で不安定であるために困難である。したがって、脱アミド化は、通常、１ｕの質量の増加する場合に、検出可能である。アスパラギンの脱アミド化は、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかをもたらす。脱アミド化の速度に影響を与えるパラメータには、ｐＨ、温度、溶媒の誘電率、イオン強度、一次配列、局所的なポリペプチドの立体構造、及び三次構造が含まれる。ペプチド鎖のＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド率に影響する。タンパク質配列のＡｓｎに続くＧｌｙ及びＳｅｒは、脱アミド化に対する感受性が高くなる。ある特定の実施形態において、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノ化を防ぐために、ｐＨ及び湿度の条件下で保存され得る。

【0101】

いくつかの実施形態において、製剤は、凍結乾燥させた製剤である。ある特定の実施形態において、製剤は、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））され、約１２～６０バイアルに含まれる。ある特定の実施形態において、製剤は、凍結乾燥されており、４５ｍｇの凍結乾燥製剤が、１つのバイアルに含まれていてもよい。ある特定の実施形態において、約４０ｍｇ～約１００ｍｇの凍結乾燥製剤が、１つのバイアルに含まれる。ある特定の実施形態において、１２、２７、または４５バイアルからの凍結乾燥製剤を組み合わせて、静脈内薬物製剤中のタンパク質の治療用量を得る。製剤は、液体製剤であってよい。いくつかの実施形態において、液体製剤は、約２５０ｍｇ／バイアル～約１０００ｍｇ／バイアルとして保存される。ある特定の実施形態において、液体製剤は、約６００ｍｇ／バイアルとして保存される。ある特定の実施形態において、液体製剤は、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存される。

【0102】

いくつかの実施形態において、凍結乾燥製剤は、本明細書に記載されるタンパク質及び凍結保護剤を含む。凍結保護剤は、糖、例えば二糖類であり得る。ある特定の実施形態において、凍結保護剤は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥された製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、増量剤、及び／または防腐剤のうちの１つ以上も含み得る。凍結乾燥製剤の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比が少なくとも１：２であり得る。ある特定の実施形態において、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は、１：２～１：５であり得る。

【0103】

ある特定の実施形態において、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸及び／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される酸は、塩酸であり得る。ある特定の実施形態において、薬学的に許容される塩基は、水酸化ナトリウムであり得る。凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含む溶液のｐＨは、６～８の間で調整され得る。ある特定の実施形態において、凍結乾燥された薬物製品のｐＨ範囲は、７～８であり得る。

【0104】

ある特定の実施形態において、「増量剤」を付加してもよい。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を付加して、凍結乾燥ケーキの物理的構造に貢献する（例えば、開放気孔構造を維持する本質的に均質な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤は、そのような増量剤を含み得る。

【0105】

ある特定の実施形態において、凍結乾燥タンパク質製品は、水性担体で構成される。目的とする水性担体は、本明細書において、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与について安全かつ非毒性である）、凍結乾燥後、液体製剤の調製に有用である。例示的な希釈剤には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌食塩水溶液、リンゲル液、またはデキストローズ溶液が含まれる。ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥製剤は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）、または０．９％塩化ナトリウム注射、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成中、凍結乾燥粉末は、溶液に溶解する。ある特定の実施形態において、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、注射用に約４．５ｍＬの水で構成され、０．９％生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。

【0106】

タンパク質組成物は、従来の滅菌技法によって滅菌され得るか、または滅菌濾過されてもよい。結果として生じる水溶液は、そのままで使用するためにパッケージ化されても、凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性担体と混合される。固体形態での結果として生じる組成物は、複数の単回用量単位で包装されてもよく、それぞれ、固定量の上述した薬剤（複数可）を含有する。固体形態の組成物はまた、可変量用の容器にパッケージ化することもできる。

【0107】

本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変化され得る。

【0108】

特定の投与量は、患者ごとに均一な投与量、例えば５０～５０００ｍｇのタンパク質にすることができる。あるいは、患者の投与量は、患者のおおよその体重または表面積に合わせることができる。適切な投薬量を決定する際の他の因子には、治療または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別及び医学的状態が含まれ得る。治療のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、特に本明細書に開示される投薬量情報及びアッセイに照らして、当業者によって日常的に行われる。投薬量はまた、適切な用量応答データと併せて使用される投薬量を決定するための既知のアッセイの使用を通じて決定され得る。個々の患者の投薬量は、疾患の進行を観察しながら調整することができる。患者の標的可能な構築物または複合体の血中濃度を測定して、有効濃度に到達または有効濃度を維持するために投薬量を調整する必要があるかどうかを確認することができる。ファーマコゲノミックス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて、どの標的可能な構築物及び／または複合体ならびにその投薬量が、所定の個人に最も有効と思われるかを決定することができる（Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３０８：４３－５３，２００１、Ｓｔｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３０８：３３－４１，２００１）。

【0109】

一般に、体重に基づく投薬量は、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。投薬は、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年、または２～２０年ごとに１回または複数回行うことができる。当業者は、体液または組織における標的可能な構築物または複合体の測定された滞留時間及び濃度に基づいて、投薬の反復速度を容易に予測することができる。本発明の投与は、カテーテルによる灌流または直接的な病巣内注射による、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、くも膜下腔内、腔内投与であり得る。これは、１日１回以上、１週間に１回以上、１月に１回以上、および１年に１回以上投与してもよい。

【0110】

腫瘍細胞死の増強及びがん治療
本発明は、患者における腫瘍細胞死を増強し、及び／またはがんを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を、本明細書に開示される多重特異性結合タンパク質に曝露することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、治療を必要とする患者に、治療有効量の本明細書に記載されるタンパク質及びまたはその所望の製剤を投与することを含む。これらの実施形態において、多重特異的結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有する抗原結合部位、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有する抗原結合部位、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有する抗原結合部位、配列番号７、８３、８４、８５、８６、または８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有する抗原結合部位、あるいは配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、を有する抗原結合部位を含み得る。

【0111】

治療されるがんのタイプは、本明細書に開示されている多重特異的結合タンパク質が結合するがん細胞のタイプと一致することが望ましい。上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するがん、例えば、ＥｐＣＡＭを発現する結腸癌の治療は、ＥｐＣＡＭ及びＮＫＧ２Ｄに結合する本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質を使用して治療されることが望ましい。

【0112】

いくつかの実施形態において、治療される患者は、ＣＤ３３、ＨＥＲ２、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ＣＥＡ、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、及びＰＤ１のうちの１つ以上を発現するがん細胞を含む。いくつかの実施形態において、治療される患者は、固形癌、例えば、脳癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、または子宮癌を有する。さらに他の実施形態において、がんは、血管新生腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、末端性黒子性黒色腫、光線性角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管癌、肛門癌、直腸肛門癌（ａｎｏｒｅｃｔｕｍ ｃａｎｃｅｒ）、星状細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫、絨毛神経叢乳頭腫／癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織癌、嚢胞腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉性洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞癌、上衣癌、上皮細胞癌、ユーイング肉腫、眼及び眼窩癌、女性生殖器癌、限局性結節性過形成、胆嚢癌、胃前庭癌、胃底癌、ガストリノーマ、神経膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽腫、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝細胞腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物（ｉｎｔａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、上皮内扁平上皮新生物（ｉｎｔｅｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、肝内胆管癌、浸潤性扁平上皮癌、空腸癌、関節癌、カポジ肉腫、骨盤内の癌、大細胞癌、大腸癌、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、リンパ腫、男性生殖器癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄様上皮腫、髄膜癌、中皮癌、転移性癌、口内癌、粘膜表皮癌、多発性骨髄腫、筋癌、鼻道癌、神経系癌、神経上皮腺癌結節性黒色腫、非上皮性皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、オート麦細胞癌、乏突起神経膠癌、口腔癌、骨肉腫、乳頭漿液性腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋癌、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎癌、扁平上皮癌、横紋筋癌、中皮癌、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌癌、未分化癌、尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿器系癌、子宮頸癌、子宮体部癌、ブドウ膜黒色腫、膣癌、いぼ状癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰癌、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。

【0113】

いくつかの実施形態において、治療される患者は、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫を有する。ある特定の実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫である。ある特定の他の実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞リンパ腫、例えば、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性天然キラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫である。

【0114】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質は、がんに罹患している患者を治療するために追加の治療剤と組み合わせて使用される。がんを治療する際の併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤には、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボクオン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリックス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、エリプチニウムアセテート、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミソール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－２アルファ、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキン・ディフティトックス、インターロイキン－２、および黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）放出因子、ならびにその同族受容体に対する異なる結合を示し得、血清半減期を増加または減少させる前述の薬剤のバリエーションが含まれる。

【0115】

がんを治療する際の併用療法の一部として使用され得る追加のクラスの薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、（ｉ）細胞傷害性Ｔ－リンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ４、及び（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つ以上を阻害する薬剤を含む。ＣＴＬＡ４阻害剤のイピリムマブは、黒色腫に治療に対し、米国食品医薬品局によって承認されている。

【0116】

がんを治療する際の併用療法の一部として使用され得るさらなる他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体薬剤（例えば、ハーセプチン）及び非細胞毒性薬剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。

【0117】

抗癌剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ－ＰＫ及びｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤と２－クロロ－デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１及びＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、及びＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤、（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト、ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦが含まれる。

【0118】

本発明のタンパク質はまた、原発性病変の外科的除去の補助として使用され得る。

【0119】

タンパク質及び追加の治療剤の量ならびに投与の相対的なタイミングが、所望の組み合わされた治療効果を達成するために選択され得る。例えば、そのような投与を必要とする患者に併用療法を投与する場合、組み合わせ中の治療剤、または治療剤を含む薬学的組成物（複数可）は、例えば、連続して、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）、一緒に、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、本明細書に記載されるタンパク質は、追加の治療剤（複数可）がその予防的または治療的効果を発揮する時間の間に投与することができ、またはその逆も可能である。

【0120】

上記の説明は、本発明の複数の態様及び実施形態を説明している。本特許出願は、態様及び実施形態のすべての組み合わせ及び順列を明確に企図する。

【実施例0121】

ここに概して説明される本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、それらは、単に本発明のある特定の態様及び実施形態の例示の目的のために含まれ、本発明を限定することを意図するものではない。

【0122】

実施例１－様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの結合親和性
様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの反応速度及び親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴によって評価した。抗ヒトＦｃ抗体は、標準的なアミンカップリング化学を使用してＣＭ５チップ上に固定化した。様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含むヒトモノクローナル抗体が約１００ＲＵの密度で抗ヒトＦｃチップ上に捕捉された。０．４１１～１００ｎＭの可溶性マウスＦｃ－ヒトＮＫＧ２Ｄ二量体を含む溶液を、３７℃で、３０μｌ／分で捕捉されたＮＫＧ２Ｄ抗体及び制御表面上に注入した。表面は、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．８を迅速に注入することによって、サイクル間で再生された。運動速度定数を得るために、二重参照データを、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた１：１の相互作用モデルに適合した。平衡結合定数Ｋ_Ｄは、解離定数ｋ_ｄ及び結合定数ｋ_ａの比（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）によって決定された。表９及び図３に示すように、ＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの結合親和性は、１０～６２ｎＭの範囲内にある。

【表9】

【0123】

実施例２－ＡＤＩ－２７７４４クローンの結合エピトープビニング
ＡＤＩ－２７７４４（Ａ４４）ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインのビニングは、Ｂｉａｃｏｒｅ
８Ｋ装置を用いた表面プラズモン共鳴によって、一連の抗体及びＵＬＢＰ６（ＮＫＧ２Ｄ天然リガンド）に対して行われた。簡単に言うと、マウスＦｃ－ヒトＮＫＧ２Ｄは、約１００ＲＵの密度でＣＭ５チップ上に固定化された抗マウスＦｃ抗体を使用して捕捉された。これに続いて、２５℃で、３０μｌ／分、ＡＤＩ－２７７４４、ＡＤＩ－２７７４９、Ｆ４７（以下に列挙された配列）、または１Ｄ１１（市販のモノクローナルＮＫＧ２Ｄ抗体）、ＵＬＢＰ６（以下に列挙された配列）、ＭＳ（Ｎｏｖｏ ＮｏｒｄｉｓｋからのＮＫＧ２Ｄ抗体、以下に列挙された配列）、及びＭＡＢ１３９（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍからのＮＫＧ２Ｄ抗体、クローン１４９８１０）を含む、ＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体を含む、抗体を連続的に注入した。Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアを、すべてのデータ分析に対して使用した。

【表10】

【0124】

ＵＬＢＰアミノ酸配列番号６７
ＲＲＤＤＰＨＳＬＣＹＤＩＴＶＩＰＫＦＲＰＧＰＲＷＣＡＶＱＧＱＶＤＥＫＴＦＬＨＹＤＣＧＮＫＴＶＴＰＶＳＰＬＧＫＫＬＮＶＴＭＡＷＫＡＱＮＰＶＬＲＥＶＶＤＩＬＴＥＱＬＬＤＩＱＬＥＮＹＴＰＫＥＰＬＴＬＱＡＲＭＳＣＥＱＫＡＥＧＨＳＳＧＳＷＱＦＳＩＤＧＱＴＦＬＬＦＤＳＥＫＲＭＷＴＴＶＨＰＧＡＲＫＭＫＥＫＷＥＮＤＫＤＶＡＭＳＦＨＹＩＳＭＧＤＣＩＧＷＬＥＤＦＬＭＧＭＤＳＴＬＥＰＳＡＧＡＰＬＡＭＳＳＧ

【0125】

図４Ａは、ＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＵＬＢＰ６が注入されたプロファイルを示す。図４Ｂは、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が注入されたＵＬＢＰ６のプロファイルを示す。これらの結果は、ＡＤＩ－２７７４４抗原結合部位を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が、ＮＫＧ２ＤへのＵＬＢＰ６の結合を遮断しないことを示す、つまり、ＡＤＩ－２７７４４は、ＵＬＢＰ６からＮＫＧ２Ｄの異なるエピトープに結合する。

【0126】

図４Ｃは、ＭＳモノクローナル抗体が、ＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＵＬＢＰ６が注入されたというプロファイルを示す。ＭＳモノクローナル抗体は、ＮＫＧ２Ｄへの結合からＵＬＢＰ６を遮断する。図４Ｄ～図４Ｆは、ＭＳ、１Ｄ１１、またはＭＡＢ１３９が、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が注入されたというプロファイルを示す。図４Ｇ～図４Ｈは、ＡＤＩ－２７７４４を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が、固定化されたＮＫＧ２Ｄ上に注入され、続いてＡＤＩ－２７７４９またはＦ４７を含むＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体が注入されたというプロファイルを示す。ＡＤＩ－２７７４４は、ＮＫＧ２Ｄへの、ＭＳ、１Ｄ１１、及びＭＡＢ１３９の結合を遮断しない。ＡＤＩ－２７７４９及びＦ４７は、ＮＫＧ２ＤへのＡＤＩ－２７７４４の結合を遮断しない。これらの結果は、ＡＤＩ－２７７４４が、ＭＳ、１Ｄ１１、ＭＡＢ１３９、ＡＤＩ－２７７４９、及びＦ４７結合エピトープ（複数可）とは異なる、ＮＫＧ２Ｄ上の固有のエピトープに結合することを示す。

【0127】

実施例３－三重特異性結合タンパク質はＮＫＧ２Ｄに結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株は、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するように遺伝子操作された。図１に示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、腫瘍関連抗原結合ドメイン（ＣＤ３３またはＨＥＲ２結合ドメインなど）、及びＣＤ１６に結合するＦｃドメインをそれぞれ含む三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）は、ＥＬ４細胞上で発現された細胞外ＮＫＧ２Ｄに対するそれらの親和性について試験された。ＮＫＧ２Ｄへの多重特異性結合タンパク質の結合は、フルオロフォア結合された抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出された。細胞を、フローサイトメトリーによって分析し、親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、バックグラウンドに対する倍数（ｆｏｌｄ－ｏｖｅｒ－ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）（ＦＯＢ）を計算した。

【0128】

試験されたＴｒｉＮＫＥＴには、ＣＤ３３－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４４（ＡＤＩ－２７７４４及びＣＤ３３結合ドメイン）、ＣＤ３３－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４９（ＡＤＩ－２７７４９及びＣＤ３３結合ドメイン）、ＣＤ３３－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ｆ６３（ＡＤＩ－２９４６３及びＣＤ３３結合ドメイン）、ＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４４（ＡＤＩ－２７７４４及びＣＤ３３結合ドメイン）、ＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４９（ＡＤＩ－２７７４９及びＨＥＲ２結合ドメイン）、ＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ｆ６３（ＡＤＩ－２９４６３及びＨＥＲ結合ドメイン）、ならびにＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ｅ７９（ＡＤＩ－２９３７９及びＨＥＲ２結合ドメイン）が含まれる。ＨＥＲ２結合ドメインは、トラスツズマブの重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインと、からなる。ＣＤ３３結合ドメインは、以下に列挙された重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインと、からなる。
配列番号４９

【化1】

配列番号５０

【化2】

【0129】

すべてのＴｒｉＮＫＥＴは、ＥＬ４細胞のＮＫＧ２Ｄに結合するが、親和性は異なる。ＣＤ３３－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４４は、ＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４４と同じ結合プロファイルを示し、ＣＤ３３－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４９は、ＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４９と同じ結合プロファイルを示し、ＣＤ３３－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ｆ６３は、ＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ｆ６３と同じ結合プロファイルを示す。各クローンに対するＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒト及びマウスＮＫＧ２Ｄを発現する細胞間で類似していた（図５～６）。

【0130】

実施例４－三重特異性結合タンパク質はヒト腫瘍抗原に結合する
三重特異性結合タンパク質は、ＣＤ３３に結合する
ＣＤ３３を発現するヒトＡＭＬ細胞株ＭＶ４－１１を使用して、腫瘍関連抗原へのＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイした。ＴｒｉＮＫＥＴ及び親ＣＤ３３モノクローナル抗体を、細胞とインキュベートし、フルオロフォア結合された抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して、結合を検出した。細胞を、フローサイトメトリーによって分析し、二次抗体対照に対して正規化されたＴｒｉＮＫＥＴ及び親モノクローナルＣＤ３３抗体からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、バックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）を計算した。

【0131】

ＣＤ３３－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４４、ＣＤ３３－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４９、及びＣＤ３３－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ｆ６３は、親ＣＤ３３抗体と比較して、ＣＤ３３に匹敵するレベルの結合を示す（図７）。

【0132】

三重特異性結合タンパク質は、ＨＥＲ２に結合する
ＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞株を使用して、腫瘍関連抗原へのＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイした。腎細胞がん細胞株７８６－Ｏは、低レベルのＨＥＲ２を発現し、ヒト肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ６６１は、中程度のレベルのＨＥＲ２を発現する。ＴｒｉＮＫＥＴ及び任意に親ＨＥＲ２モノクローナル抗体（トラスツズマブ）を、細胞とインキュベートし、フルオロフォア結合された抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して、結合を検出した。細胞を、フローサイトメトリーによって分析し、二次抗体対照に対して正規化されたＴｒｉＮＫＥＴ及びトラスツズマブからの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、バックグラウンドに対する倍数（ＦＯＢ）を計算した。

【0133】

ＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４４、ＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ａ４９、及びＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ｆ６３は、トラスツズマブと比較して、７８６－Ｏ細胞で発現されたＨＥＲ２に匹敵するレベルの結合を示す（図８）。ＨＥＲ２－ＴｒｉＮＫＥＴ－Ｅ７９によってＮＣＩ－Ｈ６６１細胞で発現されたＨＥＲ２への結合が、示される（図９）。

【0134】

実施例５－三重特異性結合タンパク質は、ＮＫ細胞を活性化する
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、密度勾配遠心分離を使用して、ヒト末梢血バフィーコートから単離された。ＮＫ細胞（ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋）は、ＰＢＭＣからの磁気ビーズを用いた陰性選択を使用して単離され、単離されたＮＫ細胞の純度は、通常、９０％超であった。単離されたＮＫ細胞は、活性化のために１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む培地で培養されたか、またはサイトカインなしで一晩休止した。ＩＬ－２で活性化されたＮＫ細胞は、活性化後の２４～４８時間以内に使用された。

【0135】

腫瘍抗原を発現しているヒトがん細胞を採取し、２×１０^６細胞／ｍＬで培養培地に再懸濁した。腫瘍抗原を標的とするモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを、培養培地で希釈した。活性化されたＮＫ細胞を回収、洗浄し、２×１０^６細胞／ｍＬで培養培地に再懸濁した。次いで、がん細胞を、ＩＬ－２の存在下で、モノクローナル抗体／ＴｒｉＮＫＥＴ及び活性化されたＮＫ細胞と混合した。ブレフェルジンＡ及びモネンシンも、混合培養に加えて、細胞内サイトカイン染色のために細胞外へのタンパク質輸送を遮断した。フルオロフォア結合された抗ＣＤ１０７ａを混合培養物に加え、この培養物を４時間インキュベートした後、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＩＦＮ－ガンマに対するフルオロフォア結合された抗体を使用したＦＡＣＳ分析用にサンプルを準備した。ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ－ガンマ染色は、ＮＫ細胞の活性化を評価するために、ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋細胞で分析された。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ－ガンマの二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体が関与することにより、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。

【0136】

ＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮ－ガンマ産生の増加によって示されるように、ＨＥＲ２を発現するＮＣＩ－Ｈ６６１細胞（図１０）及びＳｋＢｒ－３細胞（図１１）と共培養されたヒトＮＫ細胞の活性化をそれぞれ媒介する。モノクローナル抗体のトラスツズマブと比較して、ＴｒｉＮＫＥＴは、ヒトがん細胞の存在下で、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示す。

【0137】

ＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮ－ガンマ産生の増加によって示されるように、ＣＤ３３を発現するヒトＡＭＬ Ｍｖ４－１１細胞と共培養されたヒトＮＫ細胞の活性化をそれぞれ媒介する（図１２）。モノクローナル抗ＣＤ３３抗体と比較して、ＴｒｉＮＫＥＴは、ヒトがん細胞の存在下で、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示す。

【0138】

実施例６－三重特異性結合タンパク質は、標的がん細胞の細胞毒性を可能にする
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、密度勾配遠心分離を使用して、ヒト末梢血バフィーコートから単離された。ＮＫ細胞（ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋）は、ＰＢＭＣからの磁気ビーズを用いた陰性選択を使用して単離され、単離されたＮＫ細胞の純度は、通常、９０％超であった。単離されたＮＫ細胞は、活性化のために１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む培地で培養されたか、またはサイトカインなしで一晩休止した。ＩＬ－２で活性化されたまたは休止したＮＫ細胞を、細胞毒性アッセイで翌日に使用した。

【0139】

ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で、ヒトＮＫ細胞ががん細胞を溶解する能力を試験するために、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ１７８０）のｃｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性アッセイを、製造業者の指示に従って使用した。簡潔に言えば、腫瘍抗原を発現するヒトがん細胞を採取し、１－２×１０^５細胞／ｍＬで培養培地に再懸濁した。休止した及び／または活性化されたＮＫ細胞を採取し、洗浄し、１０^５－２．０×１０^６細胞／ｍＬでがん細胞の培養培地と同じ培養培地に再懸濁した。９６ウェルプレートの各ウェルで、５０μｌのがん細胞懸濁液を、がん細胞で発現した腫瘍抗原を標的とするＴｒｉＮＫＥＴを用いてまたは用いずに、５０μｌのＮＫ細胞懸濁液と混合した。３７℃で、５％ ＣＯ_２で、３時間１５分インキュベーションした後、１０倍の溶解緩衝液を、がん細胞のみを含むウェル、最大溶解用の培地のみを含むウェル、及び陰性試薬対照にそれぞれ添加した。次いで、プレートを、さらに４５分間インキュベーターに戻し、合計４時間のインキュベーションに到達した。次いで、細胞をペレット化し、培養上清を、新しい９６ウェルプレートに移し、基質と混合して開発した。新しいプレートを、室温で３０分間インキュベートし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘで４９２ｎｍの吸光度を読み取った。がん細胞の特異的溶解の割合は、以下のように計算された：特異的溶解（％）＝（（実験的溶解－ＮＫ細胞のみからの自然溶解－がん細胞のみからの自然溶解）／（最大溶解－陰性試薬対照））＊１００％

【0140】

ＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＤ３３陽性Ｍｏｌｍ－１３ヒトＡＭＬ細胞株に対するヒトＮＫ細胞の細胞毒性を媒介する。図１３に示すように、休止したヒトＮＫ細胞を、Ｍｏｌｍ－１３がん細胞と混合し、ＴｒｉＮＫＥＴは、休止したヒトＮＫ細胞の細胞毒性活性を、がん細胞に対する用量応答性マナー（ｍａｎｏｒ）で増強することができる。点線は、ＴｒｉＮＫＥＴを用いずに、休止したＮＫ細胞の細胞毒性活性を示す。図１４に示すように、休止したヒトＮＫ細胞を、Ｍｏｌｍ－１３がん細胞と混合し、ＴｒｉＮＫＥＴは、活性化されたヒトＮＫ細胞の細胞毒性活性を、がん細胞に対する用量応答性マナー（ｍａｎｏｒ）でさらに増強する。

【0141】

ＴｒｉＮＫＥＴは、ＨＥＲ２陽性７８６－Ｏヒト腎細胞がん細胞株に対するヒトＮＫ細胞の細胞毒性を媒介する。図１５に示すように、休止したヒトＮＫ細胞を、７８６－Ｏがん細胞と混合し、ＴｒｉＮＫＥＴは、休止したヒトＮＫ細胞の細胞毒性活性を、がん細胞に対する用量応答性マナー（ｍａｎｏｒ）で増強することができる（各ＴｒｉＮＫＥＴを、アッセイにおいて５、１、０．２μｇ／ｍｌで添加し、これらの結果を、図１５～１６中の各ＴｒｉＮＫＥＴにおいて左から右への３つの列に表す）。点線は、ＴｒｉＮＫＥＴの不存在下で、７８６－Ｏ細胞に対する休止したＮＫ細胞の細胞毒性活性を示す。図１６に示すように、活性化されたヒトＮＫ細胞を、７８６－Ｏ細胞と混合され、ＴｒｉＮＫＥＴは、活性化されたヒトＮＫ細胞の細胞毒性活性を、がん細胞に対する用量応答性マナーでさらに増強する。点線は、ＴｒｉＮＫＥＴの不存在下で、７８６－Ｏ細胞に対する活性化されたＮＫ細胞の細胞毒性活性を示す。

【0142】

実施例７－ＡＤＩ－２７７４９のバリアント及びバリアントを含むＴｒｉＮＫＥＴ
上記のように、ＡＤＩ－２７７４９（Ａ４９）は、とりわけ、ＧＡＰＭＧＡＡＡＧＷＦＤＰ（配列番号７１）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む。配列番号７の１０２位の（すなわち、このＣＤＲ３配列の４位の）Ｍｅｔは、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＶａｌによって置き換えられ、それにより、表１に提供される対応する重鎖可変領域、軽鎖可変領域、及びＣＤＲ配列を有する、ＮＫＧ２Ｄ抗体Ａ４９ＭＱ、Ａ４９ＭＬ、Ａ４９ＭＩ、Ａ４９ＭＦ、及びＡ４９ＭＶがそれぞれ生成され得る。

【0143】

これらの変異が疎水性に及ぼす影響は、ａｖｇ＿ｐｒｏ＿ｐａｔｃｈ＿ｃｄｒ＿ｈｙｄのパラメータ設定を使用したＭＯＥ２０１８．０１プログラムを使用して分析された。タンパク質ビルダーモジュールを使用して、残基を変異させ、すべての残基をつなぎ合わせた後、Ｆａｂ全体を最小限に抑えた。動的特定サンプリングは、ＢＩＯＭＯＥのｌｏｗＭＤプロトコルを使用して実行された。表１１に示すように、これらの変異は、Ａ４９ Ｆａｂの予測される疎水性に実質的な悪影響を与えなかった。

【表11】

【0144】

Ａ４９を含むＴｒｉＮＫＥＴ（「ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ」）、及びＭｅｔのためにＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、またはＰｈｅの置換を有する変異形態のＴｒｉＮＫＥＴ Ａ（「ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊」）の疎水性は、分析疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって試験された。ＴｒｉＮＫＥＴのそれぞれを、第１の腫瘍抗原にも結合した。表１２に示すように、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊の保持時間は、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａの保持時間と同様であった。

【表12】

【0145】

ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ及びＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊の熱安定性は、２０ｍＭのヒスチジン、２６０ｍＭのスクロース、及び０．００５％ＰＳ－８０の示差走査熱量分析（ＤＳＣ）によってｐＨ６．０で検査された。Ｔ_ｍの値を、表１３に示し、Ｔ_ｍは、個々のドメインの中点遷移温度である。Ｍ１０２突然変異は、２つの最も安定した遷移（Ｔ_ｍ３及びＴ_ｍ４）のＴ_ｍ値に、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａと比較して、それらを０．６及び０．７℃低くシフトすることによって小さな影響を及ぼした。以前の遷移（Ｔ_ｍ１及びＴ_ｍ２）は影響を受けなかった。したがって、Ｍ１０２変異は、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａの全体的な熱安定性にわずかな影響しか与えなかった。

【表13】

【0146】

ヒトＮＫＧ２Ｄ及びマウスＦｃの融合タンパク質へのＴｒｉＮＫＥＴ Ａ及びＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊の結合（「ｍＦｃ－ｈＮＫＧ２Ｄ」）は、３７℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって特徴付けられた。平衡親和性データを得るために、定常状態親和性適合及び速度論適合の２つの異なる適合を使用した（図３２）。速度定数及び平衡親和定数が計算され、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊に対して２つの独立した実験からのデータ、及びＴｒｉＮＫＥＴ Ａに対して３つの独立した実験からのデータを、平均化した。

【表14】

【0147】

表１４に示すように、親和性適合及び速度論適合の両方から得られた平衡親和性定数（Ｋ_Ｄ）は、複製間で非常に類似しており、測定されたパラメータにおいて高い信頼性があることを示唆している。Ｍ１０２バリアントは、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａと比較して、ヒトＮＫＧ２Ｄに対する親和性が２分の１未満である。ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊のＫ_Ｄは、（６．８７±０．１６）×１０^－７Ｍであったが、ＴｒｉＮＫＥＴ ＡのＫ_Ｄは、（４．８７±０．８３）×１０^－７Ｍ（親和性適合から計算）であった。Ｋ_Ｄが速度論適合から計算されたとき、親和性における類似した違いが観察された。ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊に結合するＮＫＧ２Ｄの化学量論は、０．８５±０．１２であり、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａに対する１．０１±０．１１と同様であり、各ＮＫＧ２Ｄ二量体がＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊の１つの分子に結合することを確認した。これは、Ｍ１０２変異が、ヒトＮＫＧ２ＤへのＡ４９を含有するＴｒｉＮＫＥＴの結合にわずかな影響しか与えなかったことを示唆している。

【0148】

最後に、Ｍ１０２変異がＴｒｉＮＫＥＴの効力に及ぼす影響を、細胞毒性アッセイで評価した。簡潔に言えば、ＣＤ１６ａ（１５８Ｖ）の高親和性バリアントを発現するＫＨＹＧ－１細胞は、レトロウイルスの形質導入によって生成された。形質導入後、ピューロマイシンを含有する増殖培地で細胞を選択して、ＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６Ｖ細胞の選択した集団を生成した。選択された集団は、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２を含む培地で維持された。細胞毒性アッセイでエフェクターとして使用するためのＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６Ｖ細胞を調製するために、細胞を、培養物から採取し、ペレット化し、ＩＬ－２を含まない培養培地中で３回洗浄し、ＩＬ－２を含まない培養物に再懸濁し、２４時間休止した。

【0149】

対象となる標的を発現するヒトがん細胞株を、培養物から採取した。細胞を、ＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ１３６－１００）で標識するために、１０^６細胞／ｍＬで増殖培地に再懸濁した。標的細胞の標識については製造業者の指示に従った。標識後、細胞を、ＨＢＳで３回洗浄し、培養培地中で０．５×１０^５細胞／ｍＬで再懸濁した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。

【0150】

ＴｒｉＮＫＥＴを、培養培地中で段階的に希釈し、５０μｌの希釈したＴｒｉＮＫＥＴを、各ウェルに添加した。休止したＮＫ細胞を、培養物から採取し、洗浄し、培養培地中で１．０×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞を、プレートの各ウェルに添加して、１０：１の望ましいＥ：Ｔの比を得、各ウェルで合計２００μｌの培養物を作製した。プレートを、３７℃で、５％ ＣＯ_２で２～３時間インキュベートした。

【0151】

培養後、プレートをインキュベーターから取り出し、２００×ｇで５分間遠心分離することによって、細胞をペレット化した。２０μｌの培養上清を、製造業者から提供された無菌のマイクロプレートに移した。ＮＫ細胞を用いないで単独でインキュベートした標識細胞の上清を使用して、ＴＤＡの自然放出を測定した。１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘでインキュベートした標識細胞からの上清を使用して、標的細胞の最大溶解を測定した。２～３時間のインキュベーション前の標識細胞からの上清を使用して、バックグラウンドを測定し、品質管理を目的とした。

【0152】

２００μｌの室温ユーロピウム溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ１３５－１００）を、培養上清を含む各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカーで、２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘ機器を使用して蛍光を測定した。蛍光レベルは、標的細胞の溶解を表した。特異的溶解（％）の値は次のように計算された：特異的溶解（％）＝（（実験的放出－自然放出）／（最大放出－自然放出））×１００％。

【0153】

ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ及びＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊の活性を測定するために、第１の腫瘍抗原を発現する細胞株を、標的細胞として選択した。ＴｒｉＮＫＥＴ Ａの２つの異なるロットを、比較のために使用した。特異的溶解（％）の値は、図３３にプロットし、ＥＣ５０及び特異的溶解の最大の割合（％）を、表１５に要約した。ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊のＥＣ５０及び特異的溶解の最大の割合（％）は、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａのものと同様であり、これにより、Ｍ１０２変異がＴｒｉＮＫＥＴ Ａの生物学的活性に影響を与えなかったことを示唆した。

【表15】

【0154】

ＴｒｉＮＫＥＴ活性におけるＭ１０２変異の影響の欠如が、腫瘍抗原特異的ではなかったことを確認するために、第２の異なる腫瘍抗原に結合する、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ及びＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊を構築した。２つのＴｒｉＮＫＥＴの活性を、標的細胞として第２の腫瘍抗原を発現する細胞株、及びエフェクター細胞としてＫＨＹＧ－１－ＣＤ１６Ｖ細胞を用いた細胞毒性アッセイで比較した。図３４に示すように、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａ＊は、ＴｒｉＮＫＥＴ Ａと同等の活性を示した。

【0155】

参照による組み込み
本明細書において参照される特許文献及び科学論文の各々のすべての開示は、あらゆる目的のために参照により援用される。

【0156】

等価物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態で具現化されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を限定するものではなく、あらゆる点において例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び等価の範囲内に入るすべての変更は、それに含まれることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【配列表】

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【外国語明細書】