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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025003531
(43)【公開日】2025-01-09
(54)【発明の名称】ＤＮＡ結合ドメイントランスアクチベーター及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20241226BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20241226BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20241226BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241226BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241226BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20241226BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20241226BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241226BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20241226BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241226BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241226BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20241226BHJP
C07K 14/46 20060101ALN20241226BHJP
C12N 5/0793 20100101ALN20241226BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/864 100Z
C12N7/01
C12N5/10
A61K48/00
A61K38/17
A61K38/46
A61K31/7105
A61P25/08
A61P43/00 105
C12N15/12 ZNA
C07K19/00
C07K14/46
C12N5/0793
C12N15/12
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024184019
(22)【出願日】2024-10-18
(62)【分割の表示】P 2021549631の分割
【原出願日】2020-02-24
(31)【優先権主張番号】62/810,005
(32)【優先日】2019-02-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】505231659
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ マサチューセッツ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ミゲル セナ エステベス
(72)【発明者】
【氏名】スコット エー． ウルフ
(57)【要約】
【課題】ＤＮＡ結合ドメイントランスアクチベーター及びその使用の提供。
【解決手段】いくつかの態様では、本開示は、ＤＮＡ結合ドメインと転写調節因子ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、及びその使用方法に関する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の発現によって、細胞内の標的遺伝子の発現が改変される。本開示の複数の態様は、遺伝子送達用の単離核酸及び組換えＡＡＶベクターに関する。
【選択図】なし
【解決手段】いくつかの態様では、本開示は、ＤＮＡ結合ドメインと転写調節因子ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、及びその使用方法に関する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の発現によって、細胞内の標的遺伝子の発現が改変される。本開示の複数の態様は、遺伝子送達用の単離核酸及び組換えＡＡＶベクターに関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、発明の名称が「ＺＩＮＣ ＦＩＮＧＥＲ ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＶＡＴＯＲＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」（ジンクフィンガータンパク質トランスアクチベーター及びその使用）である２０１９年２月２５日出願の米国特許仮出願第６２／８１０，００５号の出願日の利益を米国特許法１１９条（ｅ）に基づいて主張するものであり、当該出願の全容を参照によって本明細書に援用するものである。
本出願は、発明の名称が「ＺＩＮＣ ＦＩＮＧＥＲ ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＶＡＴＯＲＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」（ジンクフィンガータンパク質トランスアクチベーター及びその使用）である２０１９年２月２５日出願の米国特許仮出願第６２／８１０，００５号の出願日の利益を米国特許法１１９条（ｅ）に基づいて主張するものであり、当該出願の全容を参照によって本明細書に援用するものである。
【背景技術】
【0002】
標的遺伝子発現の調節は、生体医学研究の主要領域として台頭してきた。遺伝子発現の増加は、遺伝子発現の減少によって生じるハプロ不全を修正することができる。ハプロ不全は、１つ以上の機能喪失変異が少なくとも１つの遺伝子のコピーに存在する場合に生じる。ハプロ不全に伴う疾患の治療における遺伝子増強のＡＡＶを用いたアプローチは、従来のｒＡＡＶベクターのパッケージング容量によって阻まれている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本開示の複数の態様は、遺伝子送達用の単離核酸及び組換えＡＡＶベクターに関する。本開示は、標的遺伝子の発現を調節するための組成物（例えば、ｒＡＡＶベクター及びｒＡＡＶ）及び方法であって、標的遺伝子がＳＣＮ１Ａなどのハプロ不全であるような組成物及び方法に一部基づいたものである。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）などのＤＮＡ結合ドメインと、転写調節因子ドメインと、を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示に記載される組成物は、転写調節因子ドメインに融合されたＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ドメインなど）を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本開示に記載される融合タンパク質は、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現を増大させ、したがって、正常な細胞または対象と比較して細胞または対象内の標的遺伝子の発現不全により特徴付けられる疾患（例えば、標的遺伝子のハプロ不全に関連する疾患）の治療に有用である。
【0004】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合された少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを発現するように構成された導入遺伝子を含む単離核酸であって、ＤＮＡ結合ドメインが（例えば、対象または細胞内の）標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域（例えば、エンハンサー配列、プロモーター配列、リプレッサー配列など）に結合し、標的遺伝子が電圧ゲートナトリウムチャネル（例えば、Ｎａｖ１．１）をコードする、単離核酸を提供する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子はＳＣＮ１Ａ遺伝子である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子にはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが（例えば、対象または細胞内の）標的遺伝子に結合し、転写調節因子ドメインは標的遺伝子の発現を改変する（例えば、増加させる）。
【0005】
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合された少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインをコードする導入遺伝子を含む核酸を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、ＤＮＡ結合ドメインが（例えば、対象または細胞内の）標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域に結合し、標的遺伝子が電圧ゲートナトリウムチャネル（例えば、Ｎａｖ１．１）と少なくとも１つのカプシドタンパク質とをコードする、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子はＳＣＮ１Ａ遺伝子である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子にはＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接される。
【0006】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが（例えば、対象または細胞内の）標的遺伝子に結合し、転写調節因子ドメインは対象内の標的遺伝子の発現を改変する（例えば、増加させる）。
【0007】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、標的遺伝子の非翻訳領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインが、標的遺伝子の調節領域、場合により、エンハンサー配列、プロモーター配列、及び／またはリプレッサー配列に結合する。
【0008】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインが、標的遺伝子の調節領域（例えば、エンハンサー配列、プロモーター配列、リプレッサー配列など）の２～２０００ｂｐ上流または２～２０００ｂｐ上流または下流に結合する。
【0009】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ｄＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２ａ）、及び／またはホメオドメインをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号５～７のいずれか１つに記載の核酸配列に結合する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１～１６、２３～２８、または３５～４０のいずれか１つに記載の配列を有する核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１７～２２、２９～３４、または４１～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質である。
【0010】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１２を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１３を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１４を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、及び／または配列番号１６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質である。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0011】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２３を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２４を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２７を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、及び／または配列番号２８を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質である。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0012】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３７を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３８を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３９を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、及び／または配列番号４０を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質である。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0013】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む認識ヘリックス、配列番号１８のアミノ酸配列を含む認識ヘリックス、配列番号１９のアミノ酸配列を含む認識ヘリックス、配列番号２０のアミノ酸配列を含む認識ヘリックス、配列番号２１のアミノ酸配列を含む認識ヘリックス、及び／または配列番号２２のアミノ酸配列を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。
【0014】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２９を含む認識ヘリックス、配列番号３０を含む認識ヘリックス、配列番号３１を含む認識ヘリックス、配列番号３２を含む認識ヘリックス、配列番号３３を含む認識ヘリックス、及び／または配列番号３４を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。
【0015】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号４１を含む認識ヘリックス、配列番号４２を含む認識ヘリックス、配列番号４３を含む認識ヘリックス、配列番号４４を含む認識ヘリックス、配列番号４５を含む認識ヘリックス、及び／または配列番号４６を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。
【0016】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質）である。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質（または「不活化Ｃａｓタンパク質」）は、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２タンパク質である。いくつかの実施形態では、核酸またはｒＡＡＶは、少なくとも１つのガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）を更に含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、ＳＣＮ１Ａを標的とするスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、配列番号８５、８６、８９、９０、９３、または９４のいずれか１つのヌクレオチド配列を有するスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、配列番号８３～９４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、配列番号８３～９４のいずれか１つに記載の核酸配列によってコードされる。
【0017】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの転写調節因子ドメインは、ＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４ドメイン、Ｒｔａドメイン、ｐ６５ドメイン、Ｈｓｆ１ドメイン、またはＶＰＲドメイン（ＶＰ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ１ドメイン）などのこれらの任意の組み合わせを含むトランスアクチベータードメインである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの転写調節因子ドメインは、配列番号４７に記載の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのトランス活性化ドメインは、配列番号４８に記載の核酸配列を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子に隣接するＩＴＲは、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、またはＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲからなる群から選択されるＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ΔＴＲまたはｍＴＲである。
【0019】
いくつかの実施形態では、単離核酸の導入遺伝子は、プロモーターと機能的に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、ＳＳＴ、ＮＹＰ、リン酸活性化グルタミナーゼ（ＰＡＧ）、小胞グルタミン酸トランスポーター１（ＶＧＬＵＴ１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５及び５７（ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７）、シナプシンＩ、ａ－ＣａｍＫＩＩ、Ｄｏｃｋ１０、Ｐｒｏｘ１、パルブアルブミン（ＰＶ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、カルレチニン（ＣＲ）、またはニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）などのニューロン性プロモーターである。
【0020】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子のＤＮＡ結合ドメインは、リンカードメインによって転写調節因子ドメインに融合される。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、例えばグリシンリッチリンカーもしくはグリシン－セリンリンカーなどの柔軟なリンカー、または光切断可能なリンカーもしくは酵素（例えば、プロテアーゼ）切断可能なリンカーなどの切断可能なリンカーである。
【0021】
いくつかの実施形態では、単離核酸は、複数のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＤＮＡ結合ドメインをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、単離核酸は、複数の転写調節因子ドメイン、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の転写調節因子ドメインをコードする導入遺伝子を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、単離核酸またはｒＡＡＶは、正常な細胞または対象に対して標的遺伝子の異常な発現またはハプロ不全（例えば、発現の増加または発現の減少）を特徴とする細胞または対象で発現される。いくつかの実施形態では、単離核酸またはｒＡＡＶは、正常な細胞または対象に対して標的遺伝子の発現の不全（例えば、減少）を特徴とする細胞または対象で発現される。いくつかの実施形態では、単離核酸またはｒＡＡＶの標的遺伝子は、ＳＣＮ１Ａである。
【0023】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶ．ＰＨＰＢからなる群から選択される。
【0024】
いくつかの態様形態では、本開示は、標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、本明細書に記載される単離核酸またはｒＡＡＶを、標的遺伝子を発現する細胞または対象に投与することを含み、対象は標的遺伝子についてハプロ不全（例えば、ＳＣＮ１Ａについてハプロ不全）である。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａなどの標的遺伝子の発現は、正常な細胞または対象における標的遺伝子の発現に対して不全である（例えば、減少している）。いくつかの実施形態では、単離核酸またはｒＡＡＶが投与される細胞は、ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである。
【0025】
いくつかの実施形態では、単離核酸またはｒＡＡＶの投与は、単離核酸またはｒＡＡＶが投与されていない対象に対して少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍増加した標的遺伝子の発現（例えば、ＳＣＮ１Ａの発現）をもたらす。いくつかの実施形態では、単離核酸またはｒＡＡＶの投与は、単離核酸またはｒＡＡＶが投与される前の対象における標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現に対して少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍増加した標的遺伝子の発現（例えば、ＳＣＮ１Ａの発現）をもたらす。
【0026】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象における遺伝子発現（例えば、ＳＣＮ１Ａの発現）を調節する方法であって、本明細書に記載される単離核酸またはｒＡＡＶが、標的遺伝子を発現する対象に投与される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象における標的遺伝子の発現は、健康な対象に対して異常である（例えば、増加または減少している）。いくつかの実施形態では、対象は、健康な対象に対して標的遺伝子の発現に関してハプロ不全であるか、またはハプロ不全であることが疑われる。
【0027】
いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子のハプロ不全発現によって引き起こされる疾患または状態を有するか又は有することが疑われる。例えば、ＳＣＮ１Ａの発現についてハプロ不全である対象は、いくつかの実施形態では、ドラベ症候群を患っている。いくつかの実施形態では、単離核酸またはｒＡＡＶは、静脈内注射、筋肉内注射、吸入、皮下注射、及び／または頭蓋内注射により対象に投与される。
【0028】
いくつかの態様では、本開示は、本開示に記載される単離核酸またはｒＡＡＶを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
【0029】
いくつかの態様では、本開示は、本開示に記載される単離核酸またはｒＡＡＶを収容した容器を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体を収容した容器を含む。いくつかの実施形態では、単離核酸またはｒＡＡＶと薬学的に許容される担体とは同じ容器に収容される。いくつかの実施形態では、容器は注射器である。
【0030】
いくつかの態様では、本開示は、本開示に記載される単離核酸またはｒＡＡＶを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はヒト細胞、場合によりニューロン、例えばＧＡＢＡ作動性ニューロンである。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1-1】ヒト（ＨＥＫ）とマウス（ＨＥＰＧ２）のＳＣＮ１Ａ遺伝子間の配列の保存を示すクロマトグラフィーシークエンシングデータを示す（コンセンサス配列：配列番号９８、標的配列：配列番号９９、Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（上）：配列番号１００、Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（下）：配列番号１０１。
【図1-2】ヒト（ＨＥＫ）とマウス（ＨＥＰＧ２）のＳＣＮ１Ａ遺伝子間の配列の保存を示すクロマトグラフィーシークエンシングデータを示す（コンセンサス配列：配列番号９８、標的配列：配列番号９９、Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（上）：配列番号１００、Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（下）：配列番号１０１。
【図1-3】ヒト（ＨＥＫ）とマウス（ＨＥＰＧ２）のＳＣＮ１Ａ遺伝子間の配列の保存を示すクロマトグラフィーシークエンシングデータを示す（コンセンサス配列：配列番号９８、標的配列：配列番号９９、Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（上）：配列番号１００、Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（下）：配列番号１０１。
【図2】ヒト（配列番号１）とマウス（配列番号２）のＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域の配列のアラインメントを示し、保存領域が強調表示されている。この保存配列内には、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）結合領域の対象標的領域があり、太字で示されている（配列番号４）。
【図3】ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域内の３つの重複する標的ＺＦＰ（ＺＦＰ１、ＺＦＰ２、ＺＦＰ３）（配列番号５～７）結合部位の位置（配列番号３）を示す模式図である。
【図4】Ａ～Ｄは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号２）内の個々の３塩基領域（「・」によって分けられた赤で示すＤＮＡトリプレット）を認識するＺＦＰ１の個々のジンクフィンガー（フィンガー１～フィンガー６：Ｆ１～Ｆ６）の６個の認識ヘリックス配列のアラインメントを示す。Ａは、ＺＦＰ１のジンクフィンガー１～６（Ｆ１～Ｆ６）が結合するヌクレオチド配列（配列番号３）を強調して示す。Ｂは、ＺＦＰ１のフィンガー１～６の各認識ヘリックス（アミノ酸７個）（配列番号１７～２２）によって認識される３ヌクレオチド配列を示す。Ｃは、各ラインに１つずつ示される６個のフィンガーを含むＺＦＰ１のアミノ酸配列を示し、各フィンガー間のリンカーはカノニカル（ＴＧＥＫＰ）及び非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を示すために強調表示されている（配列番号６５～７０）。Ｄは、ＺＦＰ１（Ｆ１～Ｆ６）のヌクレオチド配列（配列番号１０２～１０７）を示す。
【図5】（Ａ）～（Ｄ）は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号３）内の個々の３塩基領域（「＊」によって分けられた赤で示すＤＮＡトリプレット）を認識するＺＦＰ２の個々のジンクフィンガー（フィンガー１～フィンガー６：Ｆ１～Ｆ６）の６個の認識ヘリックス配列のアラインメントを示す。Ａは、ＺＦＰ２のジンクフィンガー１～６（Ｆ１～Ｆ６）が結合するヌクレオチド配列（配列番号３）を強調して示す。Ｂは、ＺＦＰ２のフィンガー１～６の各認識ヘリックス（アミノ酸７個）（配列番号２９～３４）によって認識される最初の３個のヌクレオチドを示す。Ｃは、各ラインに１つずつ示される６個のフィンガーを含むＺＦＰ２のアミノ酸配列（配列番号６９～７４）を示し、各フィンガー間のリンカーはカノニカル（ＴＧＥＫＰ）及び非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を示すために強調表示されている。Ｄは、ＺＦＰ２（Ｆ１～Ｆ６）のヌクレオチド配列（配列番号１０８～１１３）を示す。
【図6】Ａ～Ｄは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号４）内の個々の３塩基領域（「＊」によって分けられた赤で示すＤＮＡトリプレット）を認識するＺＦＰ２の個々のジンクフィンガー（フィンガー１～フィンガー６：Ｆ１～Ｆ６）の６個の認識ヘリックス配列のアラインメントを示す。Ａは、ＺＦＰ３のジンクフィンガー１～６（Ｆ１～Ｆ６）が結合するヌクレオチド配列（配列番号３）を強調して示す。Ｂは、ＺＦＰ３のフィンガー１～６の各認識ヘリックス（アミノ酸７個）（配列番号４１～４６）によって認識される最初の３個のヌクレオチドを示す。Ｃは、各ラインに１つずつ示される６個のフィンガーを含むＺＦＰ３のアミノ酸配列（配列番号７５～８０）を示し、各フィンガー間のリンカーはカノニカル（ＴＧＥＫＰ）及び非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を示すために強調表示されている。Ｄは、ＺＦＰ３（Ｆ１～Ｆ６）のヌクレオチド配列（配列番号１１４～１１９）を示す。
【図7】図４～６に示される各ＳＣＮ１Ａ結合ＺＦＰが、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により測定した場合にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させることを示すデータを示す。これらの発現コンストラクトは、以下の転写調節因子をコードする発現プラスミドの一過性トランスフェクションにより細胞に送達した。化膿レンサ球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス）（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９＋ＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ（ＳｐＣａｓ９＋Ｓｃｎ１ａ）、エンドヌクレアーゼ活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）、ＶＰＲ活性化ドメイン＋ＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ（ｄＣａｓ９＿ＶＰＲ＋Ｓｃｎ１ａ）、ＶＰＲ活性化ドメイン＋ＺＦＰ１（ＶＰＲ＿ＺＦＰ１）、ＶＰＲ活性化ドメイン＋ＺＰＦ２（ＶＰＲ＿ＺＦＰ２）、ＶＰＲ活性化ドメイン＋ＺＦＰ３（ＶＰＲ＿ＺＦＰ３）、ＳｐＣａｓ９＋ＡＳＣＬ１ガイドＲＮＡ（ＳｐＣａｓ９＋Ａｓｃｌ１）、３個のＶＰＲ＿ＺＦＰ（ＶＰＲ＿ＺＦＰ１＋ＶＰＲ＿ＺＦＰ２＋ＶＰＲ＿ＺＦＰ３）。発現レベルは、各試料でｑＲＴ－ＰＣＲにより測定されたＴＢＰの発現レベルに対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【0032】
本開示の複数の態様は、細胞または対象の標的遺伝子の発現を調節（例えば、増加させる）ための方法及び組成物であって、標的遺伝子がハプロ不全（すなわち、標的遺伝子が１つの機能的コピーを含む）であるような方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子はＳＣＮ１Ａである。
【0033】
いくつかの実施形態では、本開示はＺＦＰなどのＤＮＡ結合ドメインと、転写調節因子ドメインと、を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＺＦＰなどのＤＮＡ結合ドメインと、トランスアクチベータードメイン（例えば、ＶＰＲドメイン）と、を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質が標的遺伝子の配列または標的遺伝子の調節領域に結合する。いくつかの実施形態では、調節領域は、エンハンサー配列、プロモーター配列、またはリプレッサー配列である。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、内部プロモーター（例えば、標的遺伝子のイントロン内に位置する）または外部プロモーター（例えば、標的遺伝子の転写開始点の上流に位置する）であってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）のプロモーター領域内の保存された配列と結合し、その際、トランスアクチベータードメインは遺伝子の発現を増加させる。
【0034】
いくつかの態様では、本開示は、細胞または対象の標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現を増加させるための方法に関する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は細胞または対象を標的遺伝子についてハプロ不全とする変異を含む。したがって、本開示の方法及び組成物は、いくつかの実施形態では、例えば、電圧ゲートナトリウムチャネルαサブユニットＮａｖ１．１のハプロ不全につながるＳＣＮ１Ａ遺伝子の一方のコピーの変異から一般的に生じるドラベ症候群など、標的遺伝子産物のハプロ不全に関連した疾患及び障害を治療するために用いることができる。
【0035】
トランスアクチベーター融合タンパク質
本開示のいくつかの態様は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、トランスアクチベータードメインと、を含む融合タンパク質に関する。本明細書で使用するところの融合タンパク質は、２つ以上の別々のアミノ酸配列によってコードされた２つ以上の連結されたポリペプチドを含む。本明細書で使用するところのキメラタンパク質は、２つ以上の連結された遺伝子が異なる種に由来するものである、融合タンパク質である。融合タンパク質は、通常、組換えにより産生され、融合タンパク質をコードする遺伝子は、２つ以上の連結された遺伝子の発現及び得られたｍＲＮＡの組換えタンパク質への翻訳を支持するシステム内にある。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、原核細胞または真核細胞内で組換えにより産生される。融合タンパク質は、複数の配置で構成することができる。例えば、１つのタンパク質（タンパク質Ａ）が第２のタンパク質（タンパク質Ｂ）の上流に配置される。他の融合タンパク質の構成では、タンパク質Ｂはタンパク質Ａの上流に配置される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列が、トランスアクチベータードメインをコードする核酸配列の上流に配置され、トランスアクチベーターに連結されたＤＢＤを含む融合タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、トランスアクチベータードメインをコードする核酸が、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列の上流に配置され、ＤＮＡ結合ドメインに連結されたトランスアクチベータードメインを含む融合タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインの上流に配置されたトランスアクチベータードメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、トランスアクチベータードメインの上流に配置されたＤＮＡ結合ドメインを含む。
本開示のいくつかの態様は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、トランスアクチベータードメインと、を含む融合タンパク質に関する。本明細書で使用するところの融合タンパク質は、２つ以上の別々のアミノ酸配列によってコードされた２つ以上の連結されたポリペプチドを含む。本明細書で使用するところのキメラタンパク質は、２つ以上の連結された遺伝子が異なる種に由来するものである、融合タンパク質である。融合タンパク質は、通常、組換えにより産生され、融合タンパク質をコードする遺伝子は、２つ以上の連結された遺伝子の発現及び得られたｍＲＮＡの組換えタンパク質への翻訳を支持するシステム内にある。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、原核細胞または真核細胞内で組換えにより産生される。融合タンパク質は、複数の配置で構成することができる。例えば、１つのタンパク質（タンパク質Ａ）が第２のタンパク質（タンパク質Ｂ）の上流に配置される。他の融合タンパク質の構成では、タンパク質Ｂはタンパク質Ａの上流に配置される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列が、トランスアクチベータードメインをコードする核酸配列の上流に配置され、トランスアクチベーターに連結されたＤＢＤを含む融合タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、トランスアクチベータードメインをコードする核酸が、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列の上流に配置され、ＤＮＡ結合ドメインに連結されたトランスアクチベータードメインを含む融合タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインの上流に配置されたトランスアクチベータードメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、トランスアクチベータードメインの上流に配置されたＤＮＡ結合ドメインを含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、本開示に記載される融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。本明細書で使用するところの「ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）」とは、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ）を認識する少なくとも１つの構造モチーフを含む独立してフォールディングしたタンパク質を指す。ある特定のＤＢＤが特定の配列（認識配列またはモチーフ）を認識するのに対して、他のタイプのＤＢＤは、ＤＮＡに対する一般的な親和性を有する。いくつかの実施形態では、本開示に記載される融合タンパク質は、配列特異的なＤＢＤを含む。いくつかの実施形態では、ＤＢＤは、ＳＣＮ１Ａタンパク質（例えば、Ｎａｖ１．１）をコードする遺伝子内の、またはそれに隣接した核酸配列を認識する（例えば、特異的に結合する）。ＤＢＤを含むタンパク質は、転写、複製、修復、及びＤＮＡ貯蔵などの細胞プロセスに一般的に関与している。転写因子のＤＢＤは、プロモーター領域内またはエンハンサーエレメント内の特異的ＤＮＡ配列を認識して遺伝子発現を促進する。転写因子のＤＢＤは、標的遺伝子の発現を調節するための遺伝子操作において融合タンパク質として用いられ、ＤＮＡ結合特異性またはＤＮＡ結合親和性を変化させるように変異させることができ、これにより、所望の標的遺伝子の発現を調節することができる。ＤＢＤの例としては、限定されるものではないが、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ、ジンクフィンガーモチーフ（Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーを含む）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ウィングドヘリックスモチーフ、ＨＭＧボックス、ｄＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２ａ）、ホメオドメイン及びＯＢフォールドドメインが挙げられる。
【0037】
いくつかの実施形態では、本開示は、ジンクフィンガーＤＢＤ融合タンパク質に関する。本明細書で使用するところの「ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）」とは、タンパク質のフォールドを安定化させる１つ以上の亜鉛イオンの配位を特徴とする少なくとも１つの構造的モチーフを含むタンパク質を指す。ジンクフィンガーは、タンパク質にみられる最も多様な構造的モチーフであり、ヒト遺伝子の最大３％がジンクフィンガーをコードしている。ほとんどのＺＦＰは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び小分子タンパク質であるユビキチンを含む標的遺伝子とタンデムに接触する複数のジンクフィンガーを含んでいる。「古典的」なジンクフィンガーモチーフは、２個のシステインアミノ酸と２個のヒスチジンアミノ酸とで構成され（Ｃ２Ｈ２）、配列特異的にＤＮＡと結合する。転写因子ＩＩＩＡ（ＴＦＩＩＩＡ）をはじめとするこれらのＺＦＰは、通常、遺伝子発現に関与している。ＤＮＡ結合タンパク質中の複数のジンクフィンガーモチーフが、ＤＮＡの二重らせんと結合して外側を包み込む。それらの比較的小さいサイズ（例えば、各フィンガーはアミノ酸約２５～４０個、通常２７～３５個である）のため、ジンクフィンガードメイン融合タンパク質は、新規なＤＮＡ結合特異性を有するＤＢＤを作製するために用いられる。これらのＤＢＤは、他の融合ドメイン（例えば、転写活性化もしくは抑制ドメインまたはエピジェネティック改変ドメイン）を送達して標的遺伝子の転写調節を変化させることができる。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は２～８個のフィンガーを含み、各フィンガーは２４～４０個のアミノ酸（例えば、２７、２８、２９、３０、３１、３２
、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のアミノ酸）を含む。
、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のアミノ酸）を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、ＺＦＰは、１、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーを含む。各ジンクフィンガーは、２５～４０個、２５～３０個、３０～３５個、３５～４０個、または４０～４５個のアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーは、２７～３５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーは、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のアミノ酸を含む。ジンクフィンガーは、対象においてハプロ不全である標的配列、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域を特異的に認識するかまたはそれに特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子、例えば配列番号４９に記載されるヒトＳＣＮ１Ａの標的配列に結合する。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の標的配列に結合するジンクフィンガーは、配列番号６３～８０のうちの１つ以上のアミノ酸配列、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーは３ヌクレオチド配列を含む標的配列を特異的に認識するかまたは特異的に結合する。
【0039】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーは、標的配列、例えば、３ヌクレオチド配列を含む標的配列を認識するかまたはこれに結合する認識ヘリックスを含む。いくつかの実施形態では、認識ヘリックスは、３ヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、認識ヘリックスは、４～１０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、認識ヘリックスは、４、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、認識ヘリックスは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の３ヌクレオチド配列に結合する。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合する認識配列は、配列番号１７～２２、２９～３４、または４１～４６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合する認識配列は、配列番号１１～１６、２３～２８、または３５～４０のいずれか１つによってコードされる。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーは、配列番号１７～２２、２９～３４、または４１～４６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む認識ヘリックスと同じヌクレオチド配列に結合する。
【0040】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーは、そのＣ末端に、前記ジンクフィンガーを更なるジンクフィンガーに連結または接続する機能を有しうるリンカー配列を有する。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、例えば、ＴＧＥＫＰ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を含むカノニカルリンカーとすることができる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、例えば、ＴＧＳＱＫＰ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を含む非カノニカルリンカーとすることができる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、２～１０個のアミノ酸、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸であってよい。
【0041】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子、例えばＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、それぞれが標的遺伝子、例えばＳＣＮ１Ａ遺伝子の異なる３ヌクレオチド配列を認識するかまたはこれに結合する６個のジンクフィンガーを含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、及び／または６８のアミノ酸配列を含むジンクフィンガーを含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、及び／または２２のアミノ酸配列を含む認識ヘリックスを含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号６９、７０、７１、７２、７３、及び／または７４のアミノ酸配列を含むジンクフィンガーを含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、及び／または３４のアミノ酸配列を含む認識ヘリックスを含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、及び／または８０のアミノ酸配列を含むジンクフィンガーを含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号４１、４２、４３、４４、４５、及び／または４６のアミノ酸配列を含む認識ヘリックスを含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、下記に示される配列番号５７、５９、または６１と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【0042】
配列番号５７（ＺＦＰ１タンパク質のアミノ酸配列）
ＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＲＧＮＬＶＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＬＳＦＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＫＡＨＬＴＡＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ
配列番号５９（ＺＦＰ２タンパク質のアミノ酸配列）
ＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＳＮＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＤＫＲＴＬＩＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＲＧＮＬＶＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＬＳＦＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ
配列番号６１（ＺＦＰ３タンパク質のアミノ酸配列）
ＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＳＡＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＲＳＤＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＧＤＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＶＲＱＴＬＫＱＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＡＡＧＮＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ
ＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＲＧＮＬＶＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＬＳＦＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＫＡＨＬＴＡＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ
配列番号５９（ＺＦＰ２タンパク質のアミノ酸配列）
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配列番号６１（ＺＦＰ３タンパク質のアミノ酸配列）
ＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＳＡＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＲＳＤＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＧＤＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＶＲＱＴＬＫＱＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＡＡＧＮＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ
【0043】
いくつかの実施形態では、ＤＢＤは、転写活性化因子様エフェクタータンパク質（ＴＡＬＥ）である。ＴＡＬＥは、標的配列、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域を特異的に認識するかまたは特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子についてハプロ不全である。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子、例えば配列番号４９に示されるヒトＳＣＮ１Ａの標的配列に結合する。ＴＡＬＥタンパク質は細菌によって分泌され、宿主植物内のプロモーター配列と結合して細菌感染を助ける植物遺伝子の発現を活性化する。一般的に、ＴＡＬＥタンパク質は、約３０～３０個の可変の数のアミノ酸の反復配列からなる中央の反復ドメインによって標的配列を認識し、各反復配列は標的配列内の１個の塩基対を認識することから、新たなＤＮＡ配列に結合するように操作される。ＤＮＡ配列を認識するためにはこれらの反復配列のアレイが通常、必要とされる。
【0044】
いくつかの実施形態では、ＤＢＤは、ホメオドメインである。ホメオドメインは、標的配列、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域を特異的に認識するかまたは特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子についてハプロ不全である。いくつかの実施形態では、ホメオドメインは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子、例えば配列番号４９に示されるヒトＳＣＮ１Ａの標的配列に結合する。ホメオドメインは、標的配列の認識に関与する３個のαヘリックスとＮ末端アームを有するタンパク質である。ホメオドメインは、小さなＤＮＡ配列（約４～８塩基対）を通常は認識するが、これらのドメインを他のＤＮＡ結合ドメイン（他のホメオドメインまたはジンクフィンガータンパク質）とタンデムに融合させることでより長い伸長された配列（１２～２４塩基対）を認識させることができる。したがって、ホメオドメインは、ヒトゲノム内の固有の配列を認識するＤＢＤの構成要素となりうる。
【0045】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質）である。触媒的に不活性なＣａｓタンパク質（ｄＣａｓまたは「不活化Ｃａｓタンパク質」としても知られる）は、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性）が低下しているかまたはすべてのヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性）を欠くように改変または変異されたＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質は、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤＢＤは、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２などのｄＣａｓタンパク質（「不活化Ｃａｓ」としても知られる）である。ｄＣａｓタンパク質は、触媒的に不活化された、すなわち、ヌクレオチド切断ができないように変異させられたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ、例えばＣａｓ９またはＣａｓ１２ａ）の変異体である。ｄＣａｓは、標的配列、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域を特異的に認識するかまたは特異的に結合することができる。ｄＣａｓタンパク質とガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）とを含む複合体は、ガイド核酸と相補的な特異的ヌクレオチド配列または遺伝子を標的とする、及び／またはこれと結合することができる。いくつかの実施形態では、対象は、標的遺伝子についてハプロ不全である。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子、例えば配列番号４９に示されるヒトＳＣＮ１Ａの標的配列に結合する。ただし、ｄＣａｓタンパク質は、標的ＤＮＡ配列と完全または部分的に相補的なガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）に結合された場合に標的ＤＮＡ配列を認識して結合する能力を維持する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）タンパク質をＳＣＮ１Ａにターゲティングするためのガイド核酸は、配列番号８５、８６、８９、９０、９３、または９４のいずれか１つを有するスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）タンパク質をＳＣＮ１Ａにターゲティングするためのガイド核酸は、配列番号８５、８６、８９、９０、９３、または９４のいずれか１つの少なくとも１５個（例えば、１６、１７、１８、１９、または２０個）の連続したヌクレオチドを有するスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）タンパク質をＳＣＮ１Ａにターゲティングするためのガイド核酸は、配列番号８３、８４、８７、８８、９１、または９２のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）タンパク質をＳＣＮ１Ａにターゲティングするためのガイド核酸は、配列番号８３～９４のいずれか１つを含むかまたはそれからなる。したがって、ｄＣａｓエンドヌクレアーゼは、ヒトゲノム内の固有の配列を認識するＤＢＤの構成要素となりうる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９タンパク質とトランス活性化ドメイン（例えば、ＶＰＲドメイン）とを含む。
【0046】
本開示は、いくつかの態様において、電圧ゲートナトリウムチャネル（例えば、Ｎａｖ１．１）をコードする遺伝子に結合するＤＮＡ結合ドメインに関する。いくつかの実施形態では、電圧ゲートナトリウムチャネルをコードする遺伝子はＳＣＮ１Ａ遺伝子であり、配列番号４９に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）または５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）などの標的遺伝子の非翻訳領域に結合する。いくつかの実施形態では、非翻訳領域は、調節配列、例えば、エンハンサー、プロモーター、イントロン、またはリプレッサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５７～６２に記載される配列を含むジンクフィンガータンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５～７のいずれか１つに記載される核酸配列に結合する。
【0047】
導入遺伝子によってコードされるＤＮＡ結合ドメインの数は異なりうる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は１個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は２個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は３個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は４個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は５個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は６個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は７個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は８個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は９個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は１０個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、１０個よりも多い（例えば、２０、３０、５０、１００個など）ＤＮＡ結合ドメインをコードする。ＤＮＡ結合ドメインは、同じＤＮＡ結合ドメイン（例えば、同じＤＢＤの複数のコピー）、異なるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、各ＤＢＤは固有の配列に結合する）、またはこれらの組み合わせであってよい。
【0048】
本開示は、いくつかの態様において、トランスアクチベータードメインを含む融合タンパク質に関する。本明細書で使用するところの「トランス活性化ドメイン」とは、転写調節共役因子のような遺伝子発現を調節する他のタンパク質に対する結合部位を含む転写因子内のスカフォールドドメインを指す。いくつかの実施形態では、トランス活性化ドメイン（転写活性化ドメインとしても知られる）は、ＤＢＤと共に働いて、転写因子と接触することによって直接、またはコアクチベータータンパク質を介して間接的にプロモーターまたはエンハンサーからの転写を活性化する。トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）は、そのアミノ酸組成に関して一般的に命名され、それらのアミノ酸は活性に不可欠なものであるかまたはＴＡＤ中に最も多く存在するものである。ＴＡＤは、標的遺伝子の発現を調節するための遺伝子操作において融合タンパク質として用いられ、転写活性化のレベル、したがって標的遺伝子の発現レベルを変化させるように変異させることができる。トランス活性化ドメインの例としては、限定されるものではないが、ＧＡＬ４、ＨＡＰ１、ＶＰ１６、Ｐ６５、ＲＴＡ及びＧＣＮ４が挙げられる。
【0049】
いくつかの実施形態では、トランスアクチベータードメインは、ＶＰ６４ドメインを含む。ＶＰ６４は、単純ヘルペスウイルスによって自然に発現されるＶＰ１６タンパク質の４個のタンデムなコピーで構成される酸性ＴＡＤである。遺伝子のプロモーターと、またはその近くに結合するＤＢＤと融合された場合、ＶＰ６４は強力な転写活性化因子として作用するため、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現を調節するために用いることができる。ＶＰ６４ドメインは一般的に、単純ヘルペスタンパク質ＶＰ１６の最小活性化ドメインの四量体反復配列からなる。いくつかの実施形態では、ＶＰ６４ドメインは、ＶＰ１６のアミノ酸残基４３７～４４８の４つの反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＰ１６タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＣ＿００１７９８．２に記載される配列を含むヒトヘルペスウイルス２ＵＬ４８遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＶＰ１６遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＹＰ＿００９１３７２００．１に記載される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＰ１６タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号Ｑ６９１１３－１に記載されるアミノ酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＰ１６遺伝子は、配列番号５１に記載される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＰ１６タンパク質は、配列番号５２に記載されるアミノ配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、トランスアクチベータードメインは、Ｐ６５活性化ドメインを含む。Ｐ６５は、そのＣ末端に２個の隣接した酸性ＴＡＤを含むＮＦ－κβ転写因子のサブユニットである。例えば、Ｕｒｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ｐ６５ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｕｍａｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｇｅｎｅ，２０００によって記載されるように、ｐ６５タンパク質は、遺伝子のプロモーターに、またはその近くに結合するＤＢＤと融合された場合、強力な転写活性化因子として作用するため、標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ｐ６５タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００１１４５１３８．１、ＮＭ＿００１２４３９８４．１、ＮＭ＿００１２４３９８５．１、またはＮＭ＿０２１９７５．３に記載される配列を含むヒトＲＥＬＡ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＲＥＬＡ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１１４５１３８．１、ＮＭ＿００１２４３９８４．１、ＮＭ＿００１２４３９８５．１、またはＮＭ＿０２１９７５．３のいずれかに記載される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｐ６５タンパク質は、ＮＰ＿００１１３８６１０．１、ＮＰ＿００１２３０９１３．１、ＮＰ＿００１２３０９１４．１、及びＮＰ＿０６８１１０．３に記載されるアミノ酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＥＬＡ遺伝子は、配列番号５３に記載される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｐ６５タンパク質は、配列番号５４に記載されるアミノ配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、トランスアクチベータードメインは、ＲＴＡドメインを含む。ＲＴＡは、エンハンサー領域に結合していくつかのウイルス遺伝子の発現を促進する強力なトランス活性化ドメインであるエプスタイン・バール・ウイルスに由来する疎水性ＴＡＤである。例えば、Ｍｉｙａｚａｗａ，ｅｔ ａｌ．，“ＩＬ－１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ Ｋ－ＲＴＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｔｈｅ ｈｏｓｔ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ １ ａｎｄ ３，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１８によって記載されるように、ＲＴＡタンパク質は、遺伝子のプロモーターと、またはその近くに結合するＤＢＤと融合された場合、強力な転写活性化因子として作用するため、標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。いくつかの実施形態では、ＲＴＡタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＹＰ＿０４１６７４．１に記載される配列を含むエプスタイン・バール・ウイルスＢＲＬＦ１遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＢＲＬＦ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０４１６７４．１のいずれかに記載される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴＡタンパク質は、ＹＰ＿０４１６７４．１に記載されるアミノ配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢＲＬＦ１遺伝子は、配列番号５５に記載される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴＡタンパク質は、配列番号５６に記載されるアミノ配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0052】
本開示は、ハイブリッドトランスアクチベータードメインを含む融合タンパク質に一部基づくものである。本明細書で使用するところの「ハイブリッドトランスアクチベータードメイン」とは、複数の転写活性化タンパク質またはそれらの部分（例えば、２、３、４、５個、またはそれよりも多い転写活性化タンパク質、またはそれらの部分）を含む融合タンパク質を指す。ハイブリッドトランスアクチベータードメインは、標的遺伝子の発現を増加させるために遺伝子工学で用いられる。本開示のいくつかの実施形態では、Ｃｈａｖｅｚ，ｅｔ ａｌ．“Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ”，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１５に記載される、ＶＰ６４－Ｐ６５－ＲＴＡ（ＶＰＲ）のヌクレオチド配列を含む３つの部分からなるハイブリッドトランス活性化ドメイン（配列番号４７）が、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現を増加させるために用いられる。
【0053】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、ＤＢＤ（例えば、ＺＦＰ）と、転写リプレッサータンパク質とを含むことができる。いくつかの態様では、本開示は、転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質に関する。本明細書で使用するところの「転写リプレッサー」タンパク質とは、標的遺伝子の発現を減少させるポリペプチドを一般的に指す。転写リプレッサーの例としては、限定されるものではないが、ＫＲＡＢ、ＳＭＲＴ／ＴＲＡＣ－２、及びＮＣｏＲ／ＲＩＰ－１３が挙げられる。いくつかの実施形態では、かかる転写リプレッサー融合タンパク質は、標的遺伝子（例えば、機能獲得型疾患において過剰発現される遺伝子）の発現レベルを低減させるのに有用である。
【0054】
単離核酸
単離核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質及び核酸は単離される。本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、人工的に生成されることを意味する。核酸に関して本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりインビトロで増幅されたもの、（ｉｉ）クローニングにより組換えによって産生されたもの、（ｉｉｉ）切断及びゲル分離などにより精製されたもの、または（ｉｖ）例えば化学合成により合成されたものを指す。単離核酸は、当該技術分野では周知の組換えＤＮＡ技術により容易に操作可能であるものである。したがって、５’及び３’側の制限部位が知られているかまたはそのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマー配列が開示されている、ベクターに含まれるヌクレオチド配列は単離されたものとみなされるが、天然宿主内にその天然状態で存在する核酸配列は単離されたものとはみなされない。単離核酸は実質的に精製されていてもよいが、そうである必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内で単離されている核酸は、単離核酸が存在する細胞内の物質のわずかな割合のみを構成し得る点で純粋ではない。しかしながら、かかる核酸は、当業者には周知の標準的な技術により容易に操作可能であるため、本明細書でこの用語が使用されているように単離されている。タンパク質またはペプチドに関して本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、その天然の環境から単離されているかまたは人工的に生成された（例えば、化学合成により、組換えＤＮＡ技術により、など）タンパク質またはペプチドを指す。
単離核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質及び核酸は単離される。本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、人工的に生成されることを意味する。核酸に関して本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりインビトロで増幅されたもの、（ｉｉ）クローニングにより組換えによって産生されたもの、（ｉｉｉ）切断及びゲル分離などにより精製されたもの、または（ｉｖ）例えば化学合成により合成されたものを指す。単離核酸は、当該技術分野では周知の組換えＤＮＡ技術により容易に操作可能であるものである。したがって、５’及び３’側の制限部位が知られているかまたはそのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマー配列が開示されている、ベクターに含まれるヌクレオチド配列は単離されたものとみなされるが、天然宿主内にその天然状態で存在する核酸配列は単離されたものとはみなされない。単離核酸は実質的に精製されていてもよいが、そうである必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内で単離されている核酸は、単離核酸が存在する細胞内の物質のわずかな割合のみを構成し得る点で純粋ではない。しかしながら、かかる核酸は、当業者には周知の標準的な技術により容易に操作可能であるため、本明細書でこの用語が使用されているように単離されている。タンパク質またはペプチドに関して本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、その天然の環境から単離されているかまたは人工的に生成された（例えば、化学合成により、組換えＤＮＡ技術により、など）タンパク質またはペプチドを指す。
【0055】
いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のＺＦＰ－トランス活性化ドメイン融合タンパク質を発現するように構成された単離核酸（例えば、ｒＡＡＶベクターなどの発現コンストラクト）に関する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、１～１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のＤＢＤ及び／または１～１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のトランスアクチベータードメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、１０個超のＤＢＳ及び／または１０個超のトランスアクチベータードメインを含む。
【0056】
本開示のいくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、リンカーを介して転写調節ドメインに間接的に融合される。本明細書で使用するところの「リンカー」とは、一般的に、単一の導入遺伝子内の２個の別個のポリペプチド同士を構造的に連結するポリペプチドのストレッチである。いくつかの実施形態では、リンカーは、別個のポリペプチドが動くことができるような柔軟なものである。いくつかの実施形態では、柔軟なリンカーは、グリシン残基を含む。いくつかの実施形態では、柔軟なリンカーは、グリシン残基とセリン残基の混合物を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリペプチド同士を分離することができるように切断可能なものである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、プロテアーゼにより切断される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはトリプシンまたは第Ｘ因子である。
【0057】
いくつかの実施形態では、リンカーは、５～３０個のアミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、３～３０個のアミノ酸（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、３～２０個のアミノ酸（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸）を含む。
【0058】
本開示は、例えばＳＣＮ１Ａなどの電圧ゲートナトリウムイオンチャネルサブユニットタンパク質（ＳＣＮタンパク質とも呼ばれる）をコードする遺伝子の発現を増加させるように操作された融合タンパク質に一部基づいたものである。本明細書で使用するところの「ＳＣＮタンパク質」とは、興奮性膜の電圧依存性ナトリウムイオン透過性を媒介し、ナトリウムイオンが膜を通過することを可能とするナトリウムイオンチャネルタンパク質を指す。ヒトのＳＣＮタンパク質の例としては、限定されるものではないが、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ５Ａ、ＳＣＮ１０Ａ、及びＳＣＮ１１Ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＳＣＮタンパク質は、１型α１イオンチャネルサブユニットをコードするＳＣＮ１Ａ（Ｎａｖ１．１とも呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、ＳＣＮタンパク質は、１型β１イオンチャネルサブユニットまたはＳＣＮ１ＣをコードするＳＣＮ１Ｂタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＳＣＮタンパク質は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、及び／またはＳＣＮ１Ｃの組み合わせである。本明細書で使用するところのＳＣＮタンパク質は、ＳＣＮタンパク質の部分またはフラグメントであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＳＣＮタンパク質は、点突然変異体または切断変異体などのＳＣＮタンパク質の変異体である。
【0059】
ヒトでは、ＳＣＮ１Ａは、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、及びニワトリで保存されているＳＣＮ１Ａ遺伝子（遺伝子ＩＤ６３２３、ヒト）によりコードされる。ヒトのＳＣＮ１Ａ遺伝子は、脳、肺、及び睾丸で主に発現している。いくつかの実施形態では、ＳＣＮタンパク質は、５つの構造的リピート（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｑ）を含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、ＳＣＮタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１１６５９６３．２、ＮＭ＿００１６５９６４．２、ＮＭ＿００１２０２４３５．２、ＮＭ＿００１３５３９４８．１、ＮＭ＿００１３５３９４９．１、ＮＭ＿００１３５３９５０．１、ＮＭ＿００１３５３９５．１、ＮＭ＿００１３５３９５２．１、ＮＭ＿００１３５３９５４．１、ＮＭ＿００３５３９５５．１、ＮＭ＿００１３５３９５７．１、ＮＭ＿００１３５３９５８．１、ＮＭ＿００１３５３９６０．１、ＮＭ＿００１３５３９６１．１、またはＮＭ＿００６９２０．５に記載される配列を含むヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１３１３９９７．１またはＮＭ＿０１８７３３．２に記載される配列を含むマウスＳＣＮ１Ａ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＧ＿０１１９０６．１、ＮＭ＿００１３１３９９７．１またはＮＭ＿０１８７３３．２のいずれかに記載される核酸によりコードされるアミノ酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、配列番号５０に記載される配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＣＮタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１１５９４３５．１、ＮＰ＿００１１１５９４３６．１、ＮＰ＿００１１８９３６４．１、ＮＰ＿００１３４０８７７．１、ＮＰ＿００１３４０８７８．１、ＮＰ＿００１３４０８７９．１、ＮＰ＿００１３４０８８０．１、ＮＰ＿００１３４０８８１．１、ＮＰ＿００１３４０８８３．１、ＮＰ＿００１３４０８８４．１、ＮＰ＿００１３４０８８６．１、ＮＰ＿００１３４０８８７．１、ＮＰ＿００１３４０８８９．１、ＮＰ＿００１３４０８９０．１、ＮＰ＿００８５１．３に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＧ＿０１１９０６．１、ＮＭ＿００１３１３９９７．１またはＮＭ＿０１８７３３．２のいずれかに記載される核酸によりコードされるアミノ酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マウスＳＣＮ１Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１３００９２６．１またはＮＰ＿０６１２０３．２に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＣＮ１Ａタンパク質は、配列番号４９に記載される核酸配列と９９％同一、９５％同一、９０％同一、８０％同一、７０％同一、６０％同一、または５０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0061】
本開示の単離核酸は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ｒＡＡＶベクター）とすることができる。いくつかの実施形態では、本開示に記載される単離核酸は、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む領域（例えば、第１の領域）、またはそのバリアントを含む。単離核酸（例えば、組換えＡＡＶベクター）は、カプシドタンパク質にパッケージングして、対象に投与する、及び／または選択された標的細胞に送達することができる。「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、通常、最低でも、導入遺伝子及びその調節配列、ならびに５’及び３’側のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）で構成される。導入遺伝子は、本開示の別の箇所に記載されるように、例えば、タンパク質及び／または発現制御配列（例えば、ポリＡテール）をコードする領域を含むことができる。
【0062】
一般的に、ＩＴＲ配列は長さ約１４５ｂｐである。好ましくは、ＩＴＲをコードする配列のほぼ全体を分子中に用いることができるが、これらの配列のある程度の改変は許容される。これらのＩＴＲ配列を改変することは当業者の技能の範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；及び Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）などの文献を参照）。本開示で用いられるかかる分子の例として、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドがあり、選択された導入遺伝子配列と付随する調節エレメントに５’及び３’側のＡＡＶのＩＴＲ配列が隣接させられたものである。ＡＡＶのＩＴＲ配列は、本明細書で特定される哺乳動物のＡＡＶ型を含むいずれの公知のＡＡＶからも得ることができる。いくつかの実施形態では、単離核酸は、第２のＡＡＶのＩＴＲを含む領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域など）を更に含む。
ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）などの文献を参照）。本開示で用いられるかかる分子の例として、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドがあり、選択された導入遺伝子配列と付随する調節エレメントに５’及び３’側のＡＡＶのＩＴＲ配列が隣接させられたものである。ＡＡＶのＩＴＲ配列は、本明細書で特定される哺乳動物のＡＡＶ型を含むいずれの公知のＡＡＶからも得ることができる。いくつかの実施形態では、単離核酸は、第２のＡＡＶのＩＴＲを含む領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域など）を更に含む。
【0063】
組換えＡＡＶベクターについて上記に特定された主要なエレメント以外に、ベクターは、ベクターをトランスフェクトした、または本開示により作製されたウイルスを感染させた細胞内での導入遺伝子の転写、翻訳及び／または発現を可能とする形で導入遺伝子の各エレメントと機能的に連結された従来の制御エレメントも含む。本明細書で使用するところの「機能的に連結された」配列とは、対象とする遺伝子と連続している発現制御配列、及びトランスに作用するかまたは一定距離を置いて作用することで対象とする遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、適当な転写開始配列、転写終止配列、プロモーター配列、及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；及び必要に応じてコードされた産物の分泌を高める配列を含む。天然、誘導性、構成的、及び／または組織特異的なプロモーターをはじめとする多数の発現制御配列が当該技術分野では周知であり、使用することができる。
【0064】
本明細書で使用するところの核酸配列（例えば、コード配列）と調節配列とは、核酸配列の発現または転写が調節配列の影響下または制御下に置かれるような形で共有結合により連結されている場合に機能的に連結されていると言われる。核酸配列が機能性タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、２個のＤＮＡ配列は、５’側の調節配列内のプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、及び２個のＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入につながらず、（２）コード配列の転写を誘導するプロモーター領域の能力を妨げず、または（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写産物の能力を妨げない場合に機能的に連結されていると言われる。したがって、あるプロモーター領域は、そのプロモーター領域がＤＮＡ配列の転写を行う能力を有し、生じた転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されうる場合、核酸配列と機能的に連結されている。同様に、２つ以上のコード領域は、共通のプロモーターからのそれらの転写がインフレームで翻訳された２つ以上のタンパク質の発現をもたらすような形で連結されている場合に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、機能的に連結されたコード配列は、融合タンパク質を生じる。
【0065】
導入遺伝子（例えば、融合タンパク質などを含む）を含む領域は、融合タンパク質の発現を可能とする単離核酸の任意の適当な位置に配置することができる。
【0066】
導入遺伝子が複数のポリペプチドをコードする場合、各ポリペプチドは導入遺伝子内の任意の適当な位置に配置することができる点は認識されるはずである。例えば、第１のポリペプチドをコードする核酸を導入遺伝子のイントロンに配置することができ、第２のポリペプチドをコードする核酸を別の非翻訳領域内（例えば、タンパク質コード配列の最後のコドンと導入遺伝子のポリＡシグナルの最初の塩基との間）に配置することができる。
【0067】
「プロモーター」とは、遺伝子の特異的転写を開始するために必要とされる、細胞の合成マシナリーまたは導入された合成マシナリーによって認識されるＤＮＡ配列を指す。「機能的に連結された」、「機能的に配置された」、「制御下の」、または「転写制御下」なる表現は、核酸に対してプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御するための適正な位置及び向きにあることを意味する。
【0068】
タンパク質をコードする核酸の場合、ポリアデニル化配列が一般的に導入遺伝子配列の後ろで３’側のＡＡＶのＩＴＲ配列の前に挿入される。本開示で有用なｒＡＡＶコンストラクトは、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置するイントロンも含むことができる。１つの可能なイントロン配列はＳＶ－４０に由来し、ＳＶ－４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。使用することが可能な別のベクターエレメントは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写産物から複数のポリペプチドを生成するために用いられる。ＩＲＥＳ配列は、複数のポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成するために用いられる。これらの、及び他の共通のベクターエレメントの選択は従来技術であり、多くのそのような配列が利用可能である［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ならびに本明細書に引用される参照文献の例えば３．１８ ３．２６及び１６．１７ １６．２７頁、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照］。いくつかの実施形態では、手足口病ウイルス２Ａ配列がポリタンパク質に含まれる。これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小分子ペプチド（アミノ酸約１８個の長さ）である（Ｒｙａｎ，Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ，１９９４；４：９２８－９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ，Ｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６；ｐ． ８１２４－８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８６４－８７３；及びＨａｌｐｉｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９；４：４５３－４５９）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミド及び遺伝子療法ベクターを含む人工的システムにおいてこれまでに実証されている（ＡＡＶ及びレトロウイルス）（Ｒｙａｎ，Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ，１９９４；４：９２８－９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ，Ｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６；ｐ．８１２４－８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８６４－８７３；ａｎｄ
Ｈａｌｐｉｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９；４：４５３－４５９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：１９８－２０８；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００；１１：１９２１－１９３１．；及びＫｌｕｍｐ，Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８１１－８１７）。
Ｈａｌｐｉｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９；４：４５３－４５９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：１９８－２０８；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００；１１：１９２１－１９３１．；及びＫｌｕｍｐ，Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８１１－８１７）。
【0069】
構成的なプロモーターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶプロモーターを伴う）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターはＰ２プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターはニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは２個のＣＢＡプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターによって分離された２個のＣＢＡプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターはＣＡＧプロモーターである。
【0070】
誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能とし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、もしくは例えば急性期、細胞の特定の分化状態などの特定の生理学的状態の存在によって、または複製中の細胞においてのみ調節され得る。誘導性プロモーター及び誘導性システムは、限定されるものではないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ及びＡｒｉａｄをはじめとする広範な販売元から入手可能である。多くの他のシステムが記載されており、当業者によって容易に選択することができる。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６－３３５１（１９９６））、テトラサイクリン抑制システム（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２））、テトラサイクリン誘導システム（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９（１９９５），Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２－５１８（１９９８）も参照）、ＲＵ４８６誘導システム（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１（１９９７））及びラパマイシン誘導システム（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５－２８７２（１９９７））が挙げられる。この関連で有用となり得る更に他のタイプの誘導性プロモーターは、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態などの特定の生理学的状態により、または複製中の細胞においてのみ調節されるものである。
【0071】
別の実施形態では、導入遺伝子の天然プロモーターが用いられる。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣したものであることが望ましい場合に好ましい場合がある。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が、時間的もしくは発生的に、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節される必要がある場合に用いることができる。更なる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列などの他の天然の発現制御エレメントを天然の発現を模倣するために用いることもできる。
【0072】
いくつかの実施形態では、調節配列は、組織特異的な遺伝子発現能力を付与する。いくつかの場合では、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的な転写因子と結合する。かかる組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は当該技術分野では周知のものである。例示的な組織特異的調節配列としては、限定されるものではないが、以下の組織特異的プロモーター、すなわち、肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、α－ミオシン重鎖（α－ＭＨＣ）プロモーター、または心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーターが挙げられる。他の例示的なプロモーターとしては、当業者には明らかであるものの中でもとりわけ、β－アクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６））；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６））、骨オステオカルシンプロモーター（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７））；骨シアロタンパク質プロモーター（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４（１９９６））、ＣＤ２プロモーター（Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８））；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体α鎖プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターなどのニューロン性プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３））、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））、及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））が挙げられる。
【0073】
いくつかの実施形態では、ＤＢＤとトランスアクチベーターとを含む融合タンパク質をコードする導入遺伝子はプロモーターと機能的に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは神経組織に特異的である。いくつかの実施形態では、プロモーターはＳＳＴまたはＮＰＹプロモーターである。
【0074】
本開示の複数の態様は、複数のプロモーター（例えば、２、３、４、５、またはそれよりも多いプロモーター）を含む単離核酸に関する。例えば、１つのタンパク質をコードする第１の領域と１つのタンパク質をコードする第２の領域とを含む導入遺伝子を有するコンストラクトとの関連では、第１のプロモーター配列（例えば、タンパク質コード領域に機能的に連結された第１のプロモーター配列）を用いて第１のタンパク質コード領域の発現を誘導し、第２のプロモーター配列（例えば、第２のタンパク質コード領域に機能的に連結された第２のプロモーター配列）を用いて第２のタンパク質コード領域の発現を誘導することが望ましい場合がある。一般的に、第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列とは、同じプロモーター配列または異なるプロモーター配列であってよい。いくつかの実施形態では、第１のプロモーター配列（例えば、タンパク質コード領域の発現を誘導するプロモーター）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列の非限定的な例としては、Ｕ６及びＨ１プロモーター配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、第２のプロモーター配列（例えば、第２のタンパク質の発現を誘導するプロモーター配列）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌ ＩＩプロモーター配列の非限定的な例としては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、ＲＳＶ、及びサイトメガロウイルスプロモーター配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列が第１のタンパク質コード領域の発現を誘導する。いくつかの実施形態では、ｐｏｌ IＩプロモーター
配列が第２のタンパク質コード領域の発現を誘導する。
配列が第２のタンパク質コード領域の発現を誘導する。
【0075】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
いくつかの態様では、本開示は、単離されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。ＡＡＶに関連して本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、人工的に作製された、または得られたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組換え法を用いて作製することができる。かかるＡＡＶは、本明細書では「組換えＡＡＶ」と呼ばれる。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ヌクレアーゼ及び／またはｒＡＡＶの導入遺伝子が１つ以上の所定の組織（複数可）に特異的に送達されるような組織特異的ターゲティング能力を有することが好ましい。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的なターゲティング能力を決定する重要な要素である。したがって、標的とされる組織に適したカプシドを有するｒＡＡＶを選択することができる。
いくつかの態様では、本開示は、単離されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。ＡＡＶに関連して本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、人工的に作製された、または得られたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組換え法を用いて作製することができる。かかるＡＡＶは、本明細書では「組換えＡＡＶ」と呼ばれる。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ヌクレアーゼ及び／またはｒＡＡＶの導入遺伝子が１つ以上の所定の組織（複数可）に特異的に送達されるような組織特異的ターゲティング能力を有することが好ましい。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的なターゲティング能力を決定する重要な要素である。したがって、標的とされる組織に適したカプシドを有するｒＡＡＶを選択することができる。
【0076】
所望のカプシドターゲティングを有する組換えＡＡＶを得るための方法は当該技術分野では周知である（例えば、参照によって本明細書にその全容を援用するＵＳ２００３／０１３８７７２を参照）。一般的に、その方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質と、機能性ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）及び導入遺伝子からなる組換えＡＡＶベクターと、組換えＡＡＶベクターのＡＡＶカプシドタンパク質内へのパッケージングを可能とするのに十分なヘルパー機能と、をコードする核酸配列を含む宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子によりコードされる構造タンパク質である。ＡＡＶは、いずれも選択的スプライシングによって単一のｃａｐ遺伝子から転写されるビリオンタンパク質１～３の３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３と名付けられている）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の分子量はそれぞれ約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａ及び約６２ｋＤａである。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は翻訳されるとウイルスゲノムの周囲に球状の６０量体タンパク質を形成する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護し、ゲノムを送達し、宿主と相互作用することである。いくつかの態様では、カプシドタンパク質はウイルスゲノムを組織特異的に宿主に送達する。
【0077】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、及びＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂからなる群から選択されるＡＡＶ血清型のものである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、例えばＡＡＶｒｈ８血清型のような非ヒト霊長類に由来する血清型のものである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、例えば、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂなどの広範かつ効率的なＣＮＳへの形質導入を行うために誘導された血清型のものである。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型９のものである。
【0078】
ｒＡＡＶベクターをＡＡＶベクター内にパッケージングするために宿主細胞内で培養される構成成分は、宿主細胞にトランスで与えることができる。あるいは、必要な構成成分（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）のいずれか１つ以上が、当業者には周知の方法を用いて必要な構成成分の１つ以上を含むように操作された安定な宿主細胞によって与えられてもよい。かかる安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下の必要な構成成分（複数可）を含むことが最も適当である。しかしながら、必要な構成成分（複数可）は構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適当な誘導性及び構成的プロモーターの例は、導入遺伝子とともに使用するのに適した調節エレメントの考察において、本明細書で提供される。更なる別の代替例では、選択された安定な宿主細胞は、構成性プロモーターの制御下にある選択された構成成分（複数可）と、１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された構成成分（複数可）とを含むことができる。例えば、２９３細胞（構成性プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含む）から誘導されるが、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質を含む安定な宿主細胞を作製することができる。当業者は、更なる他の安定な宿主細胞を作製することができる。
【0079】
いくつかの実施形態では、本開示は、導入遺伝子（例えば、転写調節ドメインに融合されたＤＮＡ結合ドメイン）をコードするコード配列を含む核酸を含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または真菌細胞である。
【0080】
本開示のｒＡＡＶを作製するために必要とされる組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、任意の適当な遺伝的エレメント（ベクター）を使用してパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択された遺伝的エレメントは、本明細書に記載されるものを含む任意の適当な方法によって送達することができる。本明細書のいずれの実施形態を構築するために用いられる方法も核酸操作の分野の当業者には周知のものであり、遺伝子操作、組換え操作、及び／または合成技術を含む（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作製する方法は周知であり、適当な方法の選択は本開示を限定するものではない（例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（１９９３）、及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照）。
【0081】
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、三重トランスフェクション法（米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載される）を用いて作製することができる。一般的に、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、及びアクセサリー機能ベクターにパッケージングするためのＡＡＶベクター（ＩＴＲエレメントを隣接させた導入遺伝子を含む）を宿主細胞にトランスフェクトすることにより作製される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的ＡＡＶ複製及びカプシド形成を行うためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（例えば、機能性のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）を生成することなく、効率的なＡＡＶの作製を支持する。本開示とともに使用するのに適したベクターの非限定的な例としては、米国特許第６，００１，６５０号に記載されるｐＨＬＰ１９、及び米国特許第６，１５６，３０３号に記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられ、いずれも本明細書にその全容を援用する。アクセサリー機能ベクターは、ＡＡＶが複製するために依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／または細胞機能（例えば、アクセサリー機能）のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能としては、限定されるものではないが、ＡＡＶ遺伝子の転写活性化、段階特異的なＡＡＶのｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶのＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシドのアセンブリに関与する部分を含む、ＡＡＶの複製に必要とされる機能が挙げられる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外の）、及びワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来するものであってよい。
【0082】
いくつかの態様では、本明細書は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。「トランスフェクション」なる用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指し、細胞は外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されている場合に「トランスフェクト」されている。いくつかのトランスフェクション法が当該技術分野で一般的に知られている（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ａｎｄ Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７．を参照）。これらの方法を使用して、ヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子のような１つ以上の外因性核酸を適当な宿主細胞内に導入することができる。
ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ａｎｄ Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７．を参照）。これらの方法を使用して、ヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子のような１つ以上の外因性核酸を適当な宿主細胞内に導入することができる。
【0083】
「宿主細胞」とは、対象とする物質を有しているかまたは有することが可能な任意の細胞を指す。宿主細胞はしばしば哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はニューロンであり、場合によりＧＡＢＡ作動性ニューロンである。本明細書で使用するところの「ＧＡＢＡ作動性ニューロン」とは、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を生成する神経細胞である。哺乳動物では、ＧＡＢＡは、ニューロンと結合し、結合するニューロンを抑制する神経系に広く分布する神経伝達物質である。そのため、ＧＡＢＡは、てんかん、自閉症、及び不安症をはじめとする神経系を冒す多くの疾患との関係が示唆されている。ＳＣＮ１Ａヘミ接合体及びノックアウトマウスにおける研究により、脳内のＧＡＢＡ作動性ニューロンにおける著明なナトリウム電流欠陥が観察されている。宿主細胞を、ＡＡＶヘルパーコンストラクト、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、または組み換えＡＡＶの生成に関連する他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして用いることができる。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用するところの「宿主細胞」とは、外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトした細胞を指す場合もある。単一の親細胞の子孫は、天然の変異、偶発的な変異、または意図的な変異のため、形態において、またはゲノム相補体もしくは全DNAの相補体に
おいて、元の親と必ずしも完全に同一でない場合がある点は理解されよう。
おいて、元の親と必ずしも完全に同一でない場合がある点は理解されよう。
【0084】
本明細書で使用するところの「細胞株」なる用語は、インビトロで持続的または長期的な増殖及び分裂が可能な細胞の集団を指す。細胞株はしばしば、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。更に、かかるクローン集団の貯蔵または伝達の際に、核型に自然変化または誘導される変化が生じ得ることが当該分野で知られている。したがって、ここで言う細胞株に由来する細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同じでない場合があり、ここで言う細胞株はかかるバリアントを含む。
【0085】
本明細書で使用するところの「組み換え細胞」なる用語は、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはＲＮＡなどの生物学的に活性な核酸の産生をもたらすＤＮＡセグメントなどの外因性ＤＮＡセグメントが導入された細胞を指す。
【0086】
本明細書で使用するところの「ベクター」なる用語は、適切な制御エレメントと結合する際に複製可能であり、細胞間で遺伝子配列を伝達することができる、例えばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝子エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｒＡＡＶ、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。したがって、この用語は、クローニング及び発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。いくつかの態様において、有用なベクターは、転写しようとする核酸セグメントが、プロモーターの転写制御下に置かれたベクターであると企図される。
【0087】
「プロモーター」とは、遺伝子の特異的転写を開始させるために必要な細胞の合成マシナリーまたは導入された合成マシナリーによって認識されるＤＮＡ配列を指す。「機能的に連結された」、「機能的に配置された」、「制御下の」、または「転写制御下」なる語句は、核酸に対してプロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御するための適正な位置及び向きにあることを意味する。「発現ベクターまたはコンストラクト」なる用語は、その核酸のコード配列の一部またはすべてが転写され得る核酸を含むあらゆる種類の遺伝子コンストラクトを意味する。いくつかの実施形態において、発現とは、例えば、転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物を生成するための核酸の転写を含む。組み換えベクターを所望のＡＡＶカプシド中にパッケージングして本開示のｒＡＡＶを作製するための上記の方法は限定的であることを意図したものではなく、当業者には他の適当な方法が明らかであろう。
【0088】
標的遺伝子の発現を調節するための方法
本開示は、細胞または対象の遺伝子発現を調節するための方法を提供する。本方法は、細胞または対象に、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰドメイン）とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む単離核酸またはｒＡＡＶを投与することを一般的に含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰとＶＰ６４トランスアクチベーターとを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰとｐ６５トランスアクチベーターとを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰとＲＴＡトランスアクチベーターとを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰとＶＰＲトランスアクチベーターとを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞または対象に、ｄＣａｓ９タンパク質と、ＳＣＮ１Ａを標的とする少なくとも１つのガイド核酸（例えば、配列番号８３～９４のいずれか１つを含むか、または配列番号８３～９４のいずれか１つによってコードされるガイド核酸）を投与することを含む。
本開示は、細胞または対象の遺伝子発現を調節するための方法を提供する。本方法は、細胞または対象に、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰドメイン）とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む単離核酸またはｒＡＡＶを投与することを一般的に含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰとＶＰ６４トランスアクチベーターとを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰとｐ６５トランスアクチベーターとを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰとＲＴＡトランスアクチベーターとを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰとＶＰＲトランスアクチベーターとを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞または対象に、ｄＣａｓ９タンパク質と、ＳＣＮ１Ａを標的とする少なくとも１つのガイド核酸（例えば、配列番号８３～９４のいずれか１つを含むか、または配列番号８３～９４のいずれか１つによってコードされるガイド核酸）を投与することを含む。
【0089】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質（例えばトランスアクチベーターを含む融合タンパク質）をコードする単離核酸またはｒＡＡＶを細胞または対象に投与することは、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現を増加させる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示に記載される組成物及び方法は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のハプロ不全により生じるドラベ症候群などの標的遺伝子のハプロ不全によって生じる状態を治療するうえで有用である。
【0090】
本明細書で使用するところの「ハプロ不全」とは、遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の一方のコピーが例えば遺伝子変異または欠失などにより不活性化されており、遺伝子の残りの機能的コピーがその遺伝子の正常な機能を維持するのに十分な量の遺伝子産物を生成するのに適切でない遺伝的状態を指す。
【0091】
ドラベ症候群は、乳児重症ミオクロニーてんかんとしても知られ、通常、３才までに発症する稀な生涯にわたるてんかんの形態である。ドラベ症候群は、長く頻繁な発作、行動及び発達遅滞、運動及びバランス障害、言語及び会話の遅れの問題、ならびに自律神経系の障害を特徴とする。いくつかの実施形態では、対象は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の一方のコピーが変異している結果、細胞または対象内のＳＣＮ１Ａタンパク質が減少しているといった、ドラベ症候群に伴うハプロ不全を有する。ドラベ症候群患者の大半は、トランケートされたタンパク質に翻訳されるＳＣＮ１Ａ変異を有している。ドラベ症候群に関連した他のＳＣＮ１Ａ変異には、スプライス部位変異及びミスセンス変異、ならびにＳＣＮ１Ａ遺伝子全体にランダムに分布した変異が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＳＣＮ１Ａを標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＳＣＮ１Ａ遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。
【0092】
いくつかの実施形態では、対象は、ＭＥＤ１３Ｌハプロ不全症候群に関連したハプロ不全を有し、対象はＭＥＤ１３Ｌ遺伝子の１個の機能的コピーのみを有する。ＭＥＤ１３Ｌハプロ不全症候群を患う対象は、通常、ＭＥＤ１３Ｌ遺伝子の２番目の非機能的コピーに変異を有する。ＭＥＤ１３Ｌハプロ不全症候群は、知的障害、会話障害、特徴的顔貌、及び発達遅滞を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＭＥＤ１３Ｌ遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＤ１３Ｌを標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＭＥＤ１３Ｌ遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、対象は、骨髄異形成症候群に関連したハプロ不全を有する。骨髄異形成症候群を患う対象は通常、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ２）、及び／またはＧＡＴＡ２遺伝子の一方のコピーに変異を有する。骨髄異形成症候群は、骨髄中の未成熟な血液細胞が正常な血液細胞に成熟しない一群のがんである。この症候群は、急性骨髄性白血病につながる場合がある。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＩＤＨ１遺伝子を特異的に標的とする（例えば、結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＨ１を標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＩＤＨ１遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＩＤＨ２遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＨ２を標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＩＤＨ２遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＧＡＴＡ２遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＴＡ２を標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＧＡＴＡ２遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。
【0094】
いくつかの実施形態では、対象は、ディジョージ症候群に関連したハプロ不全を有する。ディジョージ症候群を有する対象は通常、２２番染色体の中央の２２ｑ１１．２として知られる位置に３０～４０個の遺伝子の欠失を有している。詳細には、この疾患はＴＢＸ遺伝子のハプロ不全を特徴としうる。ディジョージ症候群は、先天性心臓疾患、特定の顔貌、頻繁な感染、発達遅滞、学習障害及び口蓋裂を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＴＢＸ遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＴＢＸを標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＴＢＸ遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。
【0095】
いくつかの実施形態では、対象は、ＣＨＡＲＧＥ症候群に関連したハプロ不全を有する。多くの症例において、ＣＨＡＲＧＥ症候群を有する対象は、ＣＨＤ７遺伝子についてハプロ不全である。ＣＨＡＲＧＥ症候群は、眼のコロボーマ、心臓の欠陥、後鼻孔閉鎖症、成長及び／または発達の遅滞、生殖器及び／または泌尿器異常、及び／または耳の異常及び聴覚消失を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＣＨＤ７遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨＤ７を標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＣＨＤ７遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。
【0096】
いくつかの実施形態では、対象は、エーラス・ダンロス症候群に関連したハプロ不全を有する。エーラス・ダンロス症候群を有する対象は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＴＮＸＢ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＰＬＯＤ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＤＳＥ、及び／またはＤ４ＳＴ１／ＣＨＳＴ１４遺伝子についてハプロ不全でありうる。エーラス・ダンロス症候群は、皮膚の過伸展性を特徴とし、大動脈解離、脊柱側弯症、及び若年性骨関節症を生じうる。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＴＮＸＢ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＰＬＯＤ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＤＳＥ、またはＤ４ＳＴ１／ＣＨＳＴ１４遺伝子のうちのいずれか１つを特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＴＮＸＢ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＰＬＯＤ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＤＳＥ、またはＤ４ＳＴ１／ＣＨＳＴ１４のうちのいずれか１つを標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＴＮＸＢ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＰＬＯＤ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＤＳＥ、またはＤ４ＳＴ１／ＣＨＳＴ１４遺伝子のうちのいずれか１つを特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。
【0097】
いくつかの実施形態では、対象は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）に関連したハプロ不全を有する。ＦＴＤを有する対象は、Ｔａｕタンパク質をコードするＭＡＰＴ遺伝子及び／またはＧＲＮ遺伝子についてハプロ不全である。ＦＴＤは、記憶の喪失、社会性の欠如、衝動制御障害、及び会話の困難を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＭＡＰＴ遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＰＴを標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＭＡＰＴ遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＧＲＮ遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＧＲＮを標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＧＲＮ遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。
【0098】
いくつかの実施形態では、対象は、ホルト・オーラム症候群に関連したハプロ不全を有する。ホルト・オーラム症候群を有する対象は、ＴＢＸ５遺伝子についてハプロ不全である。ホルト・オーラム症候群は、先天性心臓欠陥及び心臓興奮伝導障害を含む心臓合併症を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＴＢＸ５遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＴＢＸ５を標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＴＢＸ５遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、対象は、マルファン症候群に関連したハプロ不全を有する。マルファン症候群を有する対象は、通常、フィブリン１タンパク質をコードするＦＢＮ１遺伝子についてハプロ不全である。マルファン症候群は、不均衡四肢長、若年性関節炎、心臓合併症、及び／または自律神経系の機能不全を特徴とする。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＦＢＮ１遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインと、トランス活性化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＦＢＮ１を標的とするための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質とトランス活性化ドメインとを含む融合タンパク質と、（ｉｉ）ＦＢＮ１遺伝子を特異的に標的とする（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。
【0100】
本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質を対象に投与する方法に一部基づいたものである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＤＢＤと、転写活性化因子とを含む。いくつかの実施形態では、ＤＢＤは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＮＦ、ＴＡＬＥ、ｄＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２ａ）、またはホメオドメインである。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、ＶＰ６４、ｐ６５、ＲＴＡ、またはＶＰ６４－ｐ６５－ＲＴＡ（ＶＰＲ）を含む３つの部分からなる転写活性化因子である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質にはＡＡＶの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質はプロモーターと機能的に連結される。いくつかの実施形態では、対象は、ＳＣＮ１Ａタンパク質のハプロ不全につながるＳＣＮ１Ａの変異を有するかまたは有することが疑われる。いくつかの実施形態では、対象は、ドラベ症候群を有するかまたは有することが疑われる。
【0101】
いくつかの態様では、本開示は、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する（例えば、増加させる、減少させる、など）方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞内の標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は対象内（例えば、インビボ）にある。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物対象、例えばヒトである。いくつかの実施形態では、細胞は神経系細胞（中枢神経系細胞または末梢神経系細胞）、例えば、ニューロン（例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、単極性ニューロン、双極性ニューロン、バスケット細胞、ベッツ細胞、ルガロ細胞、有棘ニューロン、プルキンエ細胞、錐体細胞、レンショー細胞、顆粒細胞、運動ニューロン、紡錘細胞など）またはグリア細胞（例えば、アストロサイト、希突起膠細胞、上衣細胞、
放射状グリア細胞、シュワン細胞など）である。
放射状グリア細胞、シュワン細胞など）である。
【0102】
「正常な」細胞または対象では、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現は十分であり、細胞または対象が標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）に関してハプロ不全ではない。いくつかの実施形態では、導入遺伝子の発現または活性の「改善」または「増加」は、本明細書に記載される１つ以上の単離核酸、ｒＡＡＶ、または組成物が投与されていない細胞または対象における導入遺伝子の発現または活性に対して測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子の発現または活性の「改善」または「増加」は、対象に本明細書に記載される１つ以上の単離核酸、ｒＡＡＶ、または組成物が投与された後（例えば、遺伝子発現は投与前または投与後に測定される）の対象における導入遺伝子の発現または活性に対して測定される。例えば、いくつかの実施形態では、細胞または対象におけるＳＣＮ１Ａの発現の「改善」または「増加」は、融合ＺＦＰ－トランスアクチベーターをコードする導入遺伝子が投与されていない細胞または対象に対して測定される。いくつかの実施形態では、本開示に記載される方法は、本開示に記載される１つ以上の組成物を投与されていない対象のＳＣＮ１Ａの発現及び／または活性に対して２倍～１００倍（例えば、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍など）増加したＳＣＮ１Ａの発現及び／または活性を対象にもたらす。
【0103】
本明細書で使用するところの「治療」、「治療する」、及び「療法」なる用語は、治療的処置及び防止的または予防的措置を指す。これらの用語には、例えばハプロ不全の遺伝子、例えばハプロ不全のＳＣＮ１Ａ遺伝子に関連する症状などの既存の症状を改善すること、更なる症状を予防すること、症状の基礎にある要因を改善または予防することと、症状の要因を予防または逆転させることを含む。したがって、これらの用語は、疾患（例えば、ハプロ不全遺伝子に関連する疾患または状態、例えばドラベ症候群）を有する、またはかかる疾患を発症する可能性を有する対象に有益な結果がもたらされることを示す。更に、「治療」なる用語は、対象への薬剤（例えば、治療剤または治療組成物、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域を標的とするかもしくはこれに結合する単離核酸またはｒＡＡＶ）の適用または投与、または、疾患、疾患の症状または疾患の素因を治療、治癒、軽減、緩和、変化、修正、改善、向上し、または影響を及ぼす目的での、疾患、疾患の症状または疾患の素因を有する可能性のある対象から単離された組織または細胞株の投与も含む。
【0104】
治療剤または治療組成物は、特定の疾患（例えば、ハプロ不全に関連する疾患または状態、例えば、ドラベ症候群）の症状を予防及び／または軽減する薬学的に許容される形態の化合物を含むことができる。例えば、治療組成物は、ハプロ不全に関連する疾患または状態、例えばドラベ症候群の症状を予防及び／または軽減する医薬組成物とすることができる。本発明の治療組成物は任意の適当な形態で提供されることが企図される。治療組成物の形態は、本明細書に記載される投与方法を含む多くの要因に依存する。治療組成物は、本明細書に記載される他の成分の中でもとりわけ、希釈剤、アジュバント、及び賦形剤を含有することができる。
【0105】
投与方法
本明細書の単離核酸、ｒＡＡＶ、及び組成物は、当該技術分野では周知の任意の適切な方法による組成物として対象に投与することができる。例えば、好ましくは、生理学的に適合する担体中に懸濁した（例えば、組成物中）ｒＡＡＶを、例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長類（例えば、マカク）などの対象、すなわち宿主動物に投与することができる。いくつかの実施形態では、宿主動物は、ヒトを含まない。
本明細書の単離核酸、ｒＡＡＶ、及び組成物は、当該技術分野では周知の任意の適切な方法による組成物として対象に投与することができる。例えば、好ましくは、生理学的に適合する担体中に懸濁した（例えば、組成物中）ｒＡＡＶを、例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長類（例えば、マカク）などの対象、すなわち宿主動物に投与することができる。いくつかの実施形態では、宿主動物は、ヒトを含まない。
【0106】
哺乳動物対象へのｒＡＡＶの投与は、例えば、筋肉内注射によるか、または哺乳動物対象の血流中への投与によるものとすることができる。血流中への投与は、静脈、動脈、または他の任意の脈管中への注入によるものとすることができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、外科分野では周知の方法である分離式肢灌流法によって血流中に投与されるが、この方法は当業者がｒＡＡＶビリオンの投与に先立って全身の循環から肢を分離することを基本的に可能とする。当業者は、米国特許第６，１７７，４０３号に記載される分離式肢灌流法の変法を用いて、分離された肢の脈管構造中にビリオンを投与して筋肉細胞または組織中への形質導入を潜在的に増強することもできる。更に、ある特定の場合では、ビリオンを対象のＣＮＳに送達することが望ましい場合もある。「ＣＮＳ」とは、脊椎動物の脳及び脊髄のすべての細胞及び組織を意味する。したがって、この用語には、限定されるものではないが、神経細胞、グリア細胞、アストロサイト、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質空間、骨、軟骨などが含まれる。組換えＡＡＶは、例えば定位注射などによる当該分野では周知の神経外科技術を用いて、針、カテーテルまたは関連する装置により、例えば脳室領域中への、ならびに線条体（例えば、線条体の尾状核もしくは被殻）、脊髄及び神経筋接合部、または小脳小葉への注射により、ＣＮＳまたは脳に直接投与することができる（例えば、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：３４２４－３４２９，１９９９、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２，２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９－２２３，１９９３、及びＡｌｉｓｋｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：２３１５－２３２９，２０００を参照）。いくつかの実施形態では、本開示に記載されるｒＡＡＶは静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは脳内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは髄腔内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは線条体内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは頭蓋内注射によって送達される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは大槽内注射によって送達される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは側脳室注射によって送達される。
【0107】
本開示の複数の態様は、カプシドタンパク質と、導入遺伝子をコードする核酸とを含む組換えＡＡＶを含む組成物であって、導入遺伝子が１つ以上のタンパク質をコードする核酸を含む、組成物に関する。いくつかの実施形態では、核酸はＡＡＶ ＩＴＲを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。
【0108】
本開示の組成物は、ｒＡＡＶを単独で、または１つ以上の他のウイルス（例えば、１つ以上の異なる導入遺伝子を有する第２のｒＡＡＶ）と組み合わせて含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の異なる導入遺伝子をそれぞれが有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの異なるｒＡＡＶを含む。
【0109】
当業者によれば、ｒＡＡＶが対象とする適応症を考慮して、適当な担体を容易に選択することができる。例えば、１つの適当な担体は食塩水を含み、広範な緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）と配合することができる。他の例示的な担体としては、無菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、及び水が挙げられる。担体の選択は、本開示の限定要因ではない。
【0110】
場合により、本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（複数可）以外に、保存剤または化学安定化剤などの他の従来の医薬成分を含んでもよい。適当な例示的な保存剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８などのポロキサマー（非イオン性界面活性剤）が挙げられる。適当な化学安定化剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
【0111】
ｒＡＡＶは、所望の組織の細胞にトランスフェクトするうえで、また過度の有害作用を伴わずに十分なレベルの遺伝子導入及び発現を与えるうえで十分な量で投与される。従来の、及び薬学的に許容される投与経路としては、限定されるものではないが、選択された臓器への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻内及び気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、及び他の非経口の投与経路が挙げられる。投与経路は必要に応じて組み合わせることができる。
【0112】
特定の「治療効果」を得るために必要とされるｒＡＡＶビリオンの用量、例えば体重１キログラムあたりのゲノムコピー数（ＧＣ／ｋｇ）としての用量の単位は、限定されるものではないが、ｒＡＡＶビリオンの投与経路、治療効果を得るために必要とされる遺伝子またはＲＮＡの発現のレベル、治療される特定の疾患または障害、及び遺伝子またはＲＮＡ産物の安定性を含むいくつかの要因に基づいて異なる。当業者であれば、上記に述べた因子、ならびに当該技術分野では周知の他の因子に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を治療するためのｒＡＡＶビリオンの用量範囲を容易に決定することができる。
【0113】
ｒＡＡＶの有効量とは、動物に感染させ、所望の組織を標的とするのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの有効量は、リソソーム蓄積症の発症前段階において対象に投与される。いくつかの実施形態では、リソソーム蓄積症の発症前段階は、出生時（例えば、周産期）～４週目に生じる。
【0114】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、特に高濃度のｒＡＡＶが存在する場合（例えば、約１０１３ＧＣ／ｍＬ以上）、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を低減するように配合される。ｒＡＡＶの凝集を低減するための方法は当該技術分野では周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度の調整などを含む（例えば、参照によって本明細書にその内容を援用するＷｒｉｇｈｔ ＦＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５）１２，１７１－１７８を参照）。
【0115】
薬学的に許容される賦形剤及び担体溶液の配合は当業者には周知であり、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するのに適した投与及び治療レジメンの開発もまた、当業者には周知である。
【0116】
一般的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％以上の活性化合物を含有することができるが、活性成分（複数可）の割合は無論のこと異なってよく、都合に応じて全製剤の重量または体積の約１または２％～約７０％または８０％以上であってよい。当然ながら、各々の治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、化合物の任意の特定の単位用量中で適当な投与量が得られるように調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期間、及び他の薬理学的考慮事項などの要因は、かかる医薬製剤の調製の分野における当業者によって想到されるものであり、したがって、様々な投与量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
【0117】
ある特定の状況では、本明細書に開示される適切に配合された医薬組成物中のｒＡＡＶベースの治療用コンストラクトを、皮下、膵臓内、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、髄腔内、または経口、腹腔内投与するか、または吸入により投与することが望ましい。いくつかの実施形態では、米国特許第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号及び同第５，３９９，３６３号（いずれも参照によって本明細書にその全容を具体的に援用する）に記載される投与モダリティを用いてｒＡＡＶを投与することができる。いくつかの実施形態では、好ましい投与方法は、門脈注射によるものである。
【0118】
注射用途に適した医薬形態としては、滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液及び滅菌粉末が挙げられる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中で、また、油中で分散液を調製することもできる。通常の保存および使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含む必要がある。多くの場合、かかる形態は滅菌状態であり、かつ容易に注射可能な程度の流動性を有さなければならない。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む溶媒または分散媒とすることができる。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗細菌剤及び抗真菌剤によって微生物の活動を防止することができる。多くの場合で、例えば、糖類または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる剤を組成物中に使用することによって注射用組成物の吸収を遅延させることができる。
【0119】
注射可能な水溶液を投与するには、例えば、溶液を必要に応じて適宜、緩衝化することができ、液体希釈剤を初めに十分な食塩水またはグルコースにより等張液にすることができる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。このことに関連して、使用することができる無菌の水性媒質は当業者には周知のものである。例えば、１回の投与量を、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００ｍｌの皮下点滴液に添加するか、または提示された点滴部位で注入することができる（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８及び１５７０－１５８０を参照）。投与量のある程度の変動が、宿主の条件に応じて必然的に生じる。どのような場合であれ、投与の責任者は個々の宿主についての適当な用量を決定する。
【0120】
必要な量の活性ｒＡＡＶを適当な溶媒中に、必要に応じて本明細書に列挙した各種の他の成分とともに加えた後、滅菌濾過を行うことによって滅菌注射液が調製される。一般的に、分散液は、基本分散媒及び上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに各種の滅菌有効成分を添加することによって調製される。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライ法であり、予め滅菌濾過したその溶液から有効成分及び任意の更なる所望の成分の粉末が得られる。
【0121】
本明細書に開示されるｒＡＡＶ組成物は、中性または塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が挙げられ、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸と、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基から、また、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。製剤化に際して、溶液は、投与製剤と適合する形で、かつ治療上有効な量で投与される。これらの製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。
【0122】
本明細書で使用するところの「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝化剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。薬学的に活性な物質用のかかる媒質および剤の使用は当該技術分野では周知である。補助的な活性成分を組成物に添加することもできる。「薬学的に許容される」なる表現は、宿主に投与される際にアレルギー反応または同様の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
【0123】
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルを、適当な宿主細胞中への本開示の組成物の導入に使用することができる。詳細には、ｒＡＡＶベクターにより送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などの中に封入して送達用に製剤化することができる。
【0124】
かかる製剤は、本明細書に開示される核酸またはｒＡＡＶコンストラクトの薬学的に許容される製剤の導入に好ましいものとなりうる。リポソームの形成および使用は、当業者には一般的に知られている。近年、血清安定性及び循環半減期が向上したリポソームが開発されている（米国特許第５，７４１，５１６号）。更に、有望な薬剤担体としてのリポソーム及びリポソーム様製剤の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号及び同第５，７９５，５８７号）。
【0125】
リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに対して通常では耐性を示す多くの細胞タイプで効果的に使用されてきた。加えて、リポソームは、ウイルスベースの送達系で一般的であるＤＮＡの長さによる制約を有さない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射性治療剤、ウイルス、転写因子及びアロステリックエフェクターを様々な培養細胞株および動物中に導入するために効果的に用いられている。加えて、リポソーム媒介薬物送達の有効性を検証するいくつかの成功した臨床試験が行われている。
【0126】
リポソームは、水性の溶媒中に分散して多重膜の同心状二重層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは一般的に２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶを超音波処理すると、コア中に水溶液を含む、２００～５００オングストロームの範囲の直径を有する小さな単層膜小胞（ＳＵＶ）が形成される。
【0127】
あるいは、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤を用いることもできる。ナノカプセルは、一般的に、物質を安定かつ再現可能な形で閉じ込めることができる。細胞内の過剰量のポリマーによる副作用を防止するため、こうした超微粒子（約０．１μｍの粒径）はインビボで分解可能なポリマーを用いて設計する必要がある。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子の使用が考えられる。
【0128】
上記の送達の方法に加えて、以下の技術もｒＡＡＶ組成物を宿主に送達する代替的な方法として想到される。米国特許第５，６５６，０１６号には、ソノフォレーシス（例えば、超音波）が、循環系中への、また循環系にわたった薬物浸透の速度及び有効性を増強するためのデバイスとして使用及び記載されている。想到される他の薬物送達の選択肢としては、骨内注射法（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼用製剤（Ｂｏｕｒｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号及び同第５，７８３，２０８号）ならびにフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）がある。
【実施例0129】
実施例１．ＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を増加させるためのジンクフィンガータンパク質の設計
ヒト（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）とマウス（ＨＥＰＧ２細胞）のＳＣＮ１Ａプロモーター配列間の相同領域を、それぞれの種についてＲＩＫＥＮ ＣＡＧＥ－ｓｅｑデータセットで特定された２つの著明な転写開始点の周囲の配列のアラインメントによって特定した（図１）。ヒト（ＨＥＫ）とマウス（ＨＥＰＧ２）間の高度に保存された配列がＳＣＮ１Ａの近位プロモーター領域に存在している（図２）。６個のフィンガーで構成される３つのＺＦＰを、所定のＤＮＡ結合特異性での１個のフィンガーモジュールと２個のフィンガーモジュールとのアセンブリによって、重複する１５～２２ヌクレオチドの相同性領域に結合するように設計した（図３）。それぞれ６個のフィンガーで構成される３つのＺＦＰ（ＺＦＰ１～ＺＦＰ３）を、図３に特定される重複した高度に保存された配列に結合するように設計した。各フィンガーは、ＳＣＮ１Ａの近位プロモーターの高度に保存された領域内の３塩基領域（トリプレット）に結合するように設計する。
ヒト（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）とマウス（ＨＥＰＧ２細胞）のＳＣＮ１Ａプロモーター配列間の相同領域を、それぞれの種についてＲＩＫＥＮ ＣＡＧＥ－ｓｅｑデータセットで特定された２つの著明な転写開始点の周囲の配列のアラインメントによって特定した（図１）。ヒト（ＨＥＫ）とマウス（ＨＥＰＧ２）間の高度に保存された配列がＳＣＮ１Ａの近位プロモーター領域に存在している（図２）。６個のフィンガーで構成される３つのＺＦＰを、所定のＤＮＡ結合特異性での１個のフィンガーモジュールと２個のフィンガーモジュールとのアセンブリによって、重複する１５～２２ヌクレオチドの相同性領域に結合するように設計した（図３）。それぞれ６個のフィンガーで構成される３つのＺＦＰ（ＺＦＰ１～ＺＦＰ３）を、図３に特定される重複した高度に保存された配列に結合するように設計した。各フィンガーは、ＳＣＮ１Ａの近位プロモーターの高度に保存された領域内の３塩基領域（トリプレット）に結合するように設計する。
【0130】
ＺＦＰ１は、図４Ａに示されるＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号２）内の個々の３つの塩基領域（「・」によって分けられた赤で示されたＤＮＡトリプレット）を認識する。図４Ｂに示されるように、ＺＦＰ１のフィンガー１～フィンガー６の各認識へリックス（７個のアミノ酸からなる）は、３ヌクレオチドの配列と結合する。ＺＦＰ１の６個のフィンガーのアミノ酸配列（配列番号１７～２２）を図４Ｃに示す。各フィンガー間のリンカーが強調表示され、カノニカル（ＴＧＥＫＰ）及び非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を示す。ＺＦＰ１の６個のフィンガーのヌクレオチド配列（配列番号１１～１６）を図４Ｄに示す。
【0131】
表１．ＳＣＮ１Ａを標的とするＺＦＰ１の認識ヘリックス
【表1】
【0132】
ＺＦＰ２は、図５Ａに示されるＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号３）内の個々の３塩基領域（「・」によって分けられた赤で示されたＤＮＡトリプレット）を認識する。図５Ｂに示されるように、ＺＦＰ２のフィンガー１～フィンガー６の各認識へリックス（７個のアミノ酸からなる）は、３ヌクレオチドの配列と結合する。ＺＦＰ２の６個のフィンガーのアミノ酸配列（配列番号２９～３４）を図５Ｃに示す。各フィンガー間のリンカーが強調表示され、カノニカル（ＴＧＥＫＰ）及び非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を示す。ＺＦＰ１の６個のフィンガーのヌクレオチド配列（配列番号２３～２８）を図５Ｄに示す。
【0133】
表２．ＳＣＮ１Ａを標的とするＺＦＰ２の認識ヘリックス
【表2】
【0134】
ＺＦＰ３は、図６Ａに示されるＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号４）内の個々の３塩基領域（「・」によって分けられた赤で示されたＤＮＡトリプレット）を認識する。図６Ｂに示されるように、ＺＦＰ３のフィンガー１～フィンガー６の各認識へリックス（７個のアミノ酸からなる）は、３ヌクレオチドの配列と結合する。ＺＦＰ３の６個のフィンガーのアミノ酸配列（配列番号４１～４６）を図６Ｃに示す。各フィンガー間のリンカーが強調表示され、カノニカル（ＴＧＥＫＰ）及び非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を示す。ＺＦＰ１の６個のフィンガーのヌクレオチド配列（配列番号３５～４０）を図６Ｄに示す。
【0135】
表３．ＳＣＮ１Ａを標的とするＺＦＰ３の認識ヘリックス
【表3】
【0136】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域内で保存された配列を標的とするように設計された更なるＺＦＰは、それぞれ５個または６個のフィンガードメインを含み、ヒトとマウスのＳＣＮ１Ａ間で高度に保存された１５～２２ヌクレオチドの領域に結合する。
【0137】
表４．ＳＣＮ１Ａを標的とするジンクフィンガータンパク質
【表4-1】
【表4-2】
【0138】
実施例２．ＺＦＰは、ヒト細胞のＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる。
ＺＦＰ１～ＺＦＰ３がＳＣＮ１Ａの転写を増加させる能力を調べるため、ＺＦＰ１～ＺＦＰ３のＤＮＡ結合ドメインを、ＶＰ６４、ｐ５３、及びＲＴＡ（ＶＰＲ）の３つの部分からなる強力なハイブリッド転写アクチベータードメインに融合してキメラトランスアクチベーターを作製した。ＶＰＲ融合アクチベータードメインは、転写調節複合体を動員してクロマチンへのアクセシビリティを高めるように働き、高い遺伝子発現レベルを得る助けとなる。したがって、ＺＦＰドメインは、ＶＰＲアクチベーターが近位プロモーター領域内の高度に保存された領域を標的とするようにさせることによってＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる。
ＺＦＰ１～ＺＦＰ３がＳＣＮ１Ａの転写を増加させる能力を調べるため、ＺＦＰ１～ＺＦＰ３のＤＮＡ結合ドメインを、ＶＰ６４、ｐ５３、及びＲＴＡ（ＶＰＲ）の３つの部分からなる強力なハイブリッド転写アクチベータードメインに融合してキメラトランスアクチベーターを作製した。ＶＰＲ融合アクチベータードメインは、転写調節複合体を動員してクロマチンへのアクセシビリティを高めるように働き、高い遺伝子発現レベルを得る助けとなる。したがって、ＺＦＰドメインは、ＶＰＲアクチベーターが近位プロモーター領域内の高度に保存された領域を標的とするようにさせることによってＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる。
【0139】
ＶＰＲ－ＺＦＰ１、ＶＰＲ－ＺＦＰ２、及び／またはＶＰＲ－ＺＦＰ３融合タンパク質をコードする発現プラスミドを一過性トランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した（ＴＢＰの発現量を正規化の基準として用いた）。ＶＰＲ－ＺＦＰ融合体は、ＶＰＲに融合されたＺＦＰ１、ＺＦＰ２、及び／またはＺＦＰ３を含む。ＶＰＲにそれぞれ融合させたＺＦＰ１、ＺＦＰ２、及びＺＦＰ３を含む多重調節用の３つのコンストラクトのトランスフェクションにより、非トランスフェクト細胞と比較してＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現量が４５倍に増加し、ＶＰＲ－ＺＦＰキメラトランスアクチベーターが遺伝子のプロモーター近位領域で結合することにより、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させることができることを示した。
【0140】
ＶＰＲ－［ＺＦＰ１～ＺＦＰ３］融合タンパク質、ならびにＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインが現在設計中であるＶＰＲ－ＺＦＰ融合タンパク質が、ＨｅＬａ及びＨＥＰＧ２細胞にトランスフェクトされており、どちらも低いＳＣＮ１Ａ発現レベルを示している。各ＶＰＲ－ＺＦＰ融合タンパク質は、ＶＰＲトランスアクチベーターに融合された１個の、または複数のＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインの組み合わせを含んでいる。ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにより測定してこれらのＶＰＲ－ＺＦＰ融合体が遺伝子発現を増加させることができるかどうかを調べた。最も有望なＶＰＲ－ＺＦＰ融合体候補を、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による各融合タンパク質の送達後に初代マウス皮質ニューロンでＳＣＮ１Ａの発現を増加させる能力について試験した。
【0141】
各ＺＦＰドメインの特異性が、ＤＮＡへの結合に重要な残基を変化させたランダム化ライブラリーから理想的なＺＦＰを特定するために細菌１ハイブリッド選択システム（例えば、Ｍｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８を参照）を用いて更に最適化されている。新たに選択されたＺＦＰを、個々に、及び複数のＺＦＰの組み合わせとしてＶＰＲトランスアクチベータードメインに融合して、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、及びＨＥＰＧ２細胞、ならびに初代マウス皮質ニューロンにトランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析後にＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を最も増加させる候補ＺＦＰドメインを特定する。
【0142】
実施例３．有効性の異なるＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターシリーズの生成
最も効果的にＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させた実施例２からのＺＦＰを、期待される有効性の勾配を有する一連のヒトトランス活性化ドメイン（例えば、Ｒｔａ、ｐ６５、Ｈｓｆ１）と融合させて、一定範囲のＡＡＶの多重感染度（ＭＯＩ）にわたってＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現の２倍の増加を達成するアセンブリを特定する。正常なマウス及びＳＣＮ１Ａ＋／－マウスから得たマウス初代皮質ニューロンに、ＺＦＰＳＣＮ１Ａ融合トランスアクチベーターを発現するＡＡＶベクターを感染させる Ｎａｖ１．１タンパク質の発現レベルを、ウェスタンブロット及びｑＰＣＲを用いて評価する。ＴＧＦαによる処置はＮａｖ１．１タンパク質の発現量を約６～８倍増加させる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １２：１２６）ことから、ＴＧＦαで８時間処理した初代ニューロンをポジティブコントロールとして使用する。ＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化の特異性を実証するために他のＮａｖαサブユニット遺伝子の発現レベルの変化も評価する。免疫蛍光法を用い、ＺＦＰＳＣＮ１Ａに対する抗体（ＨＡｔａｇ）及びＧＡＢＡ作動性ニューロンに特異的なマーカー（例えば、パルブアルブミン＋またはソマトスタチン＋）または汎用ニューロンマーカー（例えば、ＮｅｕＮ、ＴＵＢＩＩＩ、及び／またはＭａｐ２）による二重免疫蛍光染色により、Ｎａｖ１．１の発現がＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに制限されたままであるかどうかを判定する。ＳＣＮ１Ａ遺伝子のトランス活性化に対するＺＦＰＳＣＮ１Ａの特異性もＣｈＩＰ－Ｓｅｑ及びＲＮＡ－Ｓｅｑにより評価して、ゲノム結合部位及び結果として得られる遺伝子導入時に生成されるトランスクリプトームプロファイルをマッピングする。
最も効果的にＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させた実施例２からのＺＦＰを、期待される有効性の勾配を有する一連のヒトトランス活性化ドメイン（例えば、Ｒｔａ、ｐ６５、Ｈｓｆ１）と融合させて、一定範囲のＡＡＶの多重感染度（ＭＯＩ）にわたってＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現の２倍の増加を達成するアセンブリを特定する。正常なマウス及びＳＣＮ１Ａ＋／－マウスから得たマウス初代皮質ニューロンに、ＺＦＰＳＣＮ１Ａ融合トランスアクチベーターを発現するＡＡＶベクターを感染させる Ｎａｖ１．１タンパク質の発現レベルを、ウェスタンブロット及びｑＰＣＲを用いて評価する。ＴＧＦαによる処置はＮａｖ１．１タンパク質の発現量を約６～８倍増加させる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １２：１２６）ことから、ＴＧＦαで８時間処理した初代ニューロンをポジティブコントロールとして使用する。ＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化の特異性を実証するために他のＮａｖαサブユニット遺伝子の発現レベルの変化も評価する。免疫蛍光法を用い、ＺＦＰＳＣＮ１Ａに対する抗体（ＨＡｔａｇ）及びＧＡＢＡ作動性ニューロンに特異的なマーカー（例えば、パルブアルブミン＋またはソマトスタチン＋）または汎用ニューロンマーカー（例えば、ＮｅｕＮ、ＴＵＢＩＩＩ、及び／またはＭａｐ２）による二重免疫蛍光染色により、Ｎａｖ１．１の発現がＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに制限されたままであるかどうかを判定する。ＳＣＮ１Ａ遺伝子のトランス活性化に対するＺＦＰＳＣＮ１Ａの特異性もＣｈＩＰ－Ｓｅｑ及びＲＮＡ－Ｓｅｑにより評価して、ゲノム結合部位及び結果として得られる遺伝子導入時に生成されるトランスクリプトームプロファイルをマッピングする。
【0143】
実施例４．プロモーター活性に依存したＳＣＮ１Ａ－ＺＦＰトランスアクチベーターの設計を導くためのＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンにおけるヒストン組織化及びＳＣＮ１Ａプロモーターのエピゲノミック・ランドスケープ
ゲノム標的と結合するＺＦＰの能力は、標的配列のアクセシビリティ（例えば、ヌクレオソーム非含有領域の存在）に依存する。ＤＮＡへのアクセシビリティについてのこの要件を用いて、ＤＮＡの標的配列アクセシビリティの存在に基づいてある細胞タイプのサブセットでのみ機能するＺＦＰトランスアクチベーターを設計する。細胞タイプの活性における更なる制限は、ＺＦＰトランスアクチベーター発現に対する組織特異的プロモーターの使用により実現される。フグ（トラフグ）ソマトスタチン及びニューロペプチドＹ遺伝子由来の小型プロモーターは、ＡＡＶベクター及びレンチウイルスとの関連で皮質及び海馬の抑制性介在ニューロンに高度に特異的な導入遺伝子発現を誘導することが示されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡへのアクセシビリティに感受性を有するＳＣＮ１Ａ特異的なＺＦＰのＡＡＶを用いた転写制限の組み合わせは、脳全体にわたった抑制性介在ニューロンにおけるＮａｖ１．１タンパク質発現の高度に特異的な増加をもたらす。この二重調節アプローチは、Ｎａｖ１．１が通常は発現されない細胞におけるＮａｖ１．１タンパク質の異所性発現によって生じ得る副作用を最小限に抑える。
ゲノム標的と結合するＺＦＰの能力は、標的配列のアクセシビリティ（例えば、ヌクレオソーム非含有領域の存在）に依存する。ＤＮＡへのアクセシビリティについてのこの要件を用いて、ＤＮＡの標的配列アクセシビリティの存在に基づいてある細胞タイプのサブセットでのみ機能するＺＦＰトランスアクチベーターを設計する。細胞タイプの活性における更なる制限は、ＺＦＰトランスアクチベーター発現に対する組織特異的プロモーターの使用により実現される。フグ（トラフグ）ソマトスタチン及びニューロペプチドＹ遺伝子由来の小型プロモーターは、ＡＡＶベクター及びレンチウイルスとの関連で皮質及び海馬の抑制性介在ニューロンに高度に特異的な導入遺伝子発現を誘導することが示されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡへのアクセシビリティに感受性を有するＳＣＮ１Ａ特異的なＺＦＰのＡＡＶを用いた転写制限の組み合わせは、脳全体にわたった抑制性介在ニューロンにおけるＮａｖ１．１タンパク質発現の高度に特異的な増加をもたらす。この二重調節アプローチは、Ｎａｖ１．１が通常は発現されない細胞におけるＮａｖ１．１タンパク質の異所性発現によって生じ得る副作用を最小限に抑える。
【0144】
ヌクレオソーム構造及びＳＣＮ１Ａプロモーターのエピジェネティック・ランドスケープを、マウス及びヒトのＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロン及びグルタミン酸作動性興奮性ニューロンの両方で分析する。この情報を用いて、この細胞タイプのＳＣＮ１Ａ遺伝子座の周囲でのみアクセシブルな配列をターゲティングすることにより、ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンに制限されたＺＦＰトランスアクチベーターを設計する。
【0145】
ＧＡＤ６７プロモーターの制御下でＴｄＴｏｍａｔｏを発現するトランスジェニックマウスからのＧＡＢＡ抑制性ニューロン、及びＥｍｘ１－ＩＲＥＳ－ＣｒｅマウスとＲＯＳＡ２６／ｓｔｏｐ／ＥＧＦＰマウスを交配させることにより生じるＧＦＰ陽性グルタミン酸作動性興奮性ニューロンを、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を用いて単離する。ヒトＧＡＢＡ作動性及び興奮性ニューロンが、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から作製され、これらの細胞タイプに特異的なマーカーについての免疫染色及びＲＴ－ＰＣＲ、ならびに電気生理学的活動を用いて確認される。マウス及びヒトニューロン集団におけるＳＣＮ１Ａプロモーターの周囲のアクセシブルなゲノム領域を、トランスポザーゼアクセシブルクロマチンアッセイ（ＡＴＡＣ－Ｓｅｑ（Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ－Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ））を用いて特性評価する。
【0146】
ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいてのみアクセシブルな配列を認識するＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターが、抑制性及び興奮性ニューロンの周囲のゲノム領域のクロマチンへのアクセシビリティの差に基づいて設計されている。異なるＳＣＮ１Ａのアクセシブルな領域をターゲティングするために一連の候補ＺＦＰ－ＶＰＲトランスアクチベーター融合体が作製されており、各トランスアクチベーターの結合は、抑制性領域のＮａｖ１．１の発現を強力に増加させるとともに、興奮性ニューロンにおけるＮａｖ１．１の望ましくない誘導性発現を明らかにすることが予想される。
【0147】
培養したヒトｉＰＳ由来ニューロン及びドラベ症候群をモデル化したマウスＳＣＮ１Ａ＋／－初代ニューロンで発現実験を行い、抑制性ニューロンにおいてのみアクセシブルなＤＮＡ配列を認識するように設計されたＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターが、全ニューロンのヒトシナプシン１プロモーターまたは抑制性介在ニューロン特異的プロモーターの制御下でＡＡＶベクターから発現させた場合に必要な特異性を与えるか否かを判定する。Ｎａｖ１．１の発現レベルを、抑制性ＧＡＢＡ作動性（例えば、ＧＡＢＡ＋、ＧＡＤ６５／６７＋、ソマトスタチン、及び／またはパルブアルブミン）ニューロン及び興奮性グルタミン酸作動性（例えば、Ｃｕｘ１＋、ＦｏｘＧ１＋、ＧＡＢＡＡ受容体ＧＡＢＡ－）ニューロンについて、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、及びニューロンタイプ特異的マーカーを用いた二重免疫蛍光法により測定する。クロマチン構造及びシンテニー領域内のＤＮＡ配列は種間で異なるため、ＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターの細胞タイプ特異性は、マウス及びヒトＳＣＮ１Ａプロモーター内の異なる配列をターゲティングするように設計されている。これらの実験におけるコントロールとしては、ＧＦＰ、トランス活性化ドメインを含まないＺＦＰ、またはＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインを含まないトランスアクチベーターをコードした同様のＡＡＶベクターを感染させたニューロン培養物が含まれる。
【0148】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ （ｍｉＲＮＡ）結合部位が、望ましくない発現が生じている細胞タ
イプ（例えば、グルタミン酸作動性興奮性ニューロン）に制限されたＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内に組み込まれている。このアプローチは、ＡＡＶ送達導入遺伝子の発現を制限するために過去に用いられている（Ｘｉｅ，ｅｔ ａｌ．，“ＭｉｃｒｏＲＮＡ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｒＡＡＶ９：ａ ｓｔｅｐ ｃｌｏｓｅｒ ｔｏ ＣＮＳ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，” Ｍｏｌ．Ｔ
ｈｅｒ．２０１１）。ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンと他の細胞タイプのｍｉＲＮＡ発現プロファイルの差を小分子ＲＮＡシークエンシングにより決定する。
イプ（例えば、グルタミン酸作動性興奮性ニューロン）に制限されたＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内に組み込まれている。このアプローチは、ＡＡＶ送達導入遺伝子の発現を制限するために過去に用いられている（Ｘｉｅ，ｅｔ ａｌ．，“ＭｉｃｒｏＲＮＡ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｒＡＡＶ９：ａ ｓｔｅｐ ｃｌｏｓｅｒ ｔｏ ＣＮＳ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，” Ｍｏｌ．Ｔ
ｈｅｒ．２０１１）。ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンと他の細胞タイプのｍｉＲＮＡ発現プロファイルの差を小分子ＲＮＡシークエンシングにより決定する。
【0149】
実施例５．患者由来のｉＰＳから生成されたＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにおけるナトリウム電流欠損を修正するＡＡＶ－ＺＦＰＳＣＮ１Ａ遺伝子療法の効果の評価
ドラベ症候群に対するＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターの開発における重要なステップの１つは、これらの人工トランスアクチベーターがヒトニューロンにおいて所望の機能を有することを証明することである。この目的のため、ドラベ患者（ｎ＝４～６）及び非ドラベ患者（ｎ＝４）由来のｉＰＳ細胞が得られている。非ドラベ症候群の遺伝的バックグラウンドがこれらの細胞内で表されるため、人工的に遺伝子発現を操作する必要がなく、そのため、ｉＰＳ細胞は生体医学研究用の最新の細胞株として台頭している。ＳＣＮ１Ａの遺伝子変異を野生型配列に修復することにより、またはドラベ関連変異をコントロール細胞株内の正常な対立遺伝子に導入することによりアイソジェニック細胞株を作製するためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集技術が用いられている。これにより、アイソジェニック株は、異なるヒト被験者由来の細胞株を比較することにより生じる自然変動がなく、そのため、疾患特異的な表現型を確認してこれを増幅するために有用である。ｉＰＳ細胞を前脳のＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに分化させるために確立された抑制性ニューロン分化プロトコール及び検証パイプラインが用いられている。
ドラベ症候群に対するＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターの開発における重要なステップの１つは、これらの人工トランスアクチベーターがヒトニューロンにおいて所望の機能を有することを証明することである。この目的のため、ドラベ患者（ｎ＝４～６）及び非ドラベ患者（ｎ＝４）由来のｉＰＳ細胞が得られている。非ドラベ症候群の遺伝的バックグラウンドがこれらの細胞内で表されるため、人工的に遺伝子発現を操作する必要がなく、そのため、ｉＰＳ細胞は生体医学研究用の最新の細胞株として台頭している。ＳＣＮ１Ａの遺伝子変異を野生型配列に修復することにより、またはドラベ関連変異をコントロール細胞株内の正常な対立遺伝子に導入することによりアイソジェニック細胞株を作製するためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集技術が用いられている。これにより、アイソジェニック株は、異なるヒト被験者由来の細胞株を比較することにより生じる自然変動がなく、そのため、疾患特異的な表現型を確認してこれを増幅するために有用である。ｉＰＳ細胞を前脳のＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに分化させるために確立された抑制性ニューロン分化プロトコール及び検証パイプラインが用いられている。
【0150】
全細胞パッチクランプ電気生理学測定により測定されるように、ドラベ患者由来の抑制性ニューロンではナトリウム電流が低下し、活動電位の発火が妨げられる。本明細書に記載されるドラベ由来ニューロンがこれらの疾患関連表現型を再現することを確認するために同様の測定が行われている。ナトリウム電流の欠陥は、ドラベ患者の抑制性ニューロンで生じるが興奮性ニューロンでは生じず（Ｓｕｎら）、したがって本開示では抑制性ニューロンのみを用いている。ドラベ患者由来の抑制性ニューロンにおける変異誘導性ナトリウム電流欠陥は、野生型ＳＣＮ１Ａの異所性発現によって修復することができる（参照文献２０）。したがって、本開示に記載される方法は、ドラベ症候群との関連で野生型ナトリウムチャネルの機能及び生理機能を回復させるうえでのＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターの有効性を試験するのに適している。
【0151】
ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロン培養物に、汎用ニューロンプロモーターまたは抑制性ニューロン特異的プロモーターの制御下でＺＦＰＳＣＮ１ＡトランスアクチベーターをコードしたＡＡＶベクターを感染させる。Ｎａｖ１．１の発現レベルの変化をウェスタンブロットにより評価する。阻害性ニューロンにおける機能的ナトリウム電流の回復を、感染細胞と比較した非感染細胞の全細胞パッチクランピングにより評価する。すべての患者に由来するゲノムにまたがったＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターの結合をＣｈＩＰ－ｓｅｑにより分析し、ＲＮＡ－ｓｅｑによって検出される特定されたトランスクリプトーム変化と相関させる。これらの実験におけるコントロールは、ＧＦＰ、ＶＰＲトランスアクチベータードメインを含まないＺＦＰ、及びＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインを含まないＶＰＲトランスアクチベータードメインをコードした同様のＡＡＶベクターを感染させたニューロン培養物である。
【0152】
実施例６．異なる週齢及びＳＣＮ１Ａマウスにおける異なる投与経路でのＡＡＶ－ＺＦＰＳＣＮ１Ａ介入の治療効果の評価
ＡＡＶの幅広いトロピズムは、幅広く発現する遺伝子に対する遺伝子療法用途における重要な性質であるが、対象とする導入遺伝子が細胞タイプに特異的な形で発現する場合には大きな問題となりうる。この問題は、それぞれ、サイロキシン結合タンパク質（ＴＢＰ）、クレアチンキナーゼ、及びトロポニンＴなどの組織特異的プロモーターの使用により、肝臓、筋肉、及び心臓などの体内の主要組織では概ね解消されている。更なるレベルの制御を組織特異的プロモーターに重ね合わせることで、肝臓におけるｍｉＲ－１２２及び骨格筋におけるｍｉＲ－１などのこれらの組織に非常に多く存在するｍｉｃｒｏＲＮＡに対する結合部位の複数のコピーを取り込ませることにより、特定の組織からのより高度な脱標的化を実現することが可能である。最近、報告されたＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ血清型は、全身投与後のＣＮＳ遺伝子導入において極めて効率的であり、広い範囲の細胞タイプに形質導入する。更に、末梢組織へのそのトロピズムは、ほとんどの場合、ＡＡＶ９のものと同じく広範である。ドラベ症候群に対する遺伝子療法アプローチの目標は、ＧＡＢＡ作動性阻害性介在ニューロンのみでＮａｖ１．１の発現を回復する一方で他のニューロン及びそれ以外の場所での異所性発現による有害作用は防止することにある。フグ（トラフグ）ソマトスタチン及びニューロペプチドＹ遺伝子由来の小型プロモーター（２．８ｋｂ未満）の制御下のＧＦＰをコードしたＡＡＶ及びレンチウイルスベクターが、頭蓋内注射によりマウス脳における阻害性ニューロン特異的発現を誘導することが示されている。ＧＦＰ発現を誘導するこれらのプロモーターを有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターは、遍在性の強力なＣＡＧプロモーター及び最小の比較的弱いマウスＭｅＣＰ２プロモーターにより導入遺伝子の発現が誘導されるコントロールベクターと比較されている。ｆＳＳＴ及びｆＮＹＰを有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ＧＦＰベクターのＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに対する特異性が、６週齢（尾静脈）及び生後１日目（後眼窩）のマウスにおける全身投与、新生児におけるＣＳＦ送達、及び最後に歯状回（ＤＧ）をターゲティングした一側性注射によるＣＮＳへの送達により試験されている（表５）。ＣＮＳへの遺伝子導入の効率は投与経路によって大きく異なり、異なる週齢のＳＣＮ１Ａ＋／－マウスで処置が行われているため、それぞれの投与経路についてＣＮＳ全体にわたったニューロンへの形質導入効率及びＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに対するプロモーター特異性のベースラインを確立するための幅広い分析が行われている。短いｆＳＳＴ及びｆＮＹＰプロモーターからＧＦＰ発現を誘導するＡＡＶベクターは、直接注射後に海馬の阻害性介在ニューロンに対して高度に特異的であることがこれまでに示されている。本開示のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターは、その後の試験と同じ方法で検証されており、Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスの海馬体の阻害性ニューロン（詳細には歯状回及び顆粒細胞層の内側ライニングに位置する）におけるＮａｖ１．１の発現を回復する治療効果の評価が行われている（理論的解釈は下記に述べる）。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）より入手した１２９ＳｖＪマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスを交配することによってＵＭＭＳで作製された１２９ＳｖＪ／Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実験が行われている。マウスは、注入の１か月後に安楽死させ、脳及び脊髄を採取して、細胞特異的マーカー及びＧＦＰに対する抗体による二重免疫蛍光法を用いて形質導入の効率及び特異性の組織学的分析を行う。ＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに対する遺伝子導入の効率及び特異性を、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ；ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対するマーカー）及びＧＦＰに対する抗体を用いた二重免疫蛍光染色により脳及び脊髄の全体にわたって評価する。更に、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、パルブアルブミン（ＰＶ）、カルレチニン（ＣＲ）、血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、マウスニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）を発現する阻害性介在ニューロンのサブセットについて、これらのタンパク質及びＧＦＰに特異的な抗体を用いて各プロモーター及び／またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの選択的特異性を評価する。全身投与及びＩＣＶ投与により処置したマウスから肝臓、心臓及び骨格筋を採取してＧＦＰの発現を組織学的に評価し、ウェスタンブロットを用いて末梢組織における異所性発現の可能性を調べる。
ＡＡＶの幅広いトロピズムは、幅広く発現する遺伝子に対する遺伝子療法用途における重要な性質であるが、対象とする導入遺伝子が細胞タイプに特異的な形で発現する場合には大きな問題となりうる。この問題は、それぞれ、サイロキシン結合タンパク質（ＴＢＰ）、クレアチンキナーゼ、及びトロポニンＴなどの組織特異的プロモーターの使用により、肝臓、筋肉、及び心臓などの体内の主要組織では概ね解消されている。更なるレベルの制御を組織特異的プロモーターに重ね合わせることで、肝臓におけるｍｉＲ－１２２及び骨格筋におけるｍｉＲ－１などのこれらの組織に非常に多く存在するｍｉｃｒｏＲＮＡに対する結合部位の複数のコピーを取り込ませることにより、特定の組織からのより高度な脱標的化を実現することが可能である。最近、報告されたＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ血清型は、全身投与後のＣＮＳ遺伝子導入において極めて効率的であり、広い範囲の細胞タイプに形質導入する。更に、末梢組織へのそのトロピズムは、ほとんどの場合、ＡＡＶ９のものと同じく広範である。ドラベ症候群に対する遺伝子療法アプローチの目標は、ＧＡＢＡ作動性阻害性介在ニューロンのみでＮａｖ１．１の発現を回復する一方で他のニューロン及びそれ以外の場所での異所性発現による有害作用は防止することにある。フグ（トラフグ）ソマトスタチン及びニューロペプチドＹ遺伝子由来の小型プロモーター（２．８ｋｂ未満）の制御下のＧＦＰをコードしたＡＡＶ及びレンチウイルスベクターが、頭蓋内注射によりマウス脳における阻害性ニューロン特異的発現を誘導することが示されている。ＧＦＰ発現を誘導するこれらのプロモーターを有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターは、遍在性の強力なＣＡＧプロモーター及び最小の比較的弱いマウスＭｅＣＰ２プロモーターにより導入遺伝子の発現が誘導されるコントロールベクターと比較されている。ｆＳＳＴ及びｆＮＹＰを有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ＧＦＰベクターのＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに対する特異性が、６週齢（尾静脈）及び生後１日目（後眼窩）のマウスにおける全身投与、新生児におけるＣＳＦ送達、及び最後に歯状回（ＤＧ）をターゲティングした一側性注射によるＣＮＳへの送達により試験されている（表５）。ＣＮＳへの遺伝子導入の効率は投与経路によって大きく異なり、異なる週齢のＳＣＮ１Ａ＋／－マウスで処置が行われているため、それぞれの投与経路についてＣＮＳ全体にわたったニューロンへの形質導入効率及びＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに対するプロモーター特異性のベースラインを確立するための幅広い分析が行われている。短いｆＳＳＴ及びｆＮＹＰプロモーターからＧＦＰ発現を誘導するＡＡＶベクターは、直接注射後に海馬の阻害性介在ニューロンに対して高度に特異的であることがこれまでに示されている。本開示のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターは、その後の試験と同じ方法で検証されており、Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスの海馬体の阻害性ニューロン（詳細には歯状回及び顆粒細胞層の内側ライニングに位置する）におけるＮａｖ１．１の発現を回復する治療効果の評価が行われている（理論的解釈は下記に述べる）。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）より入手した１２９ＳｖＪマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスを交配することによってＵＭＭＳで作製された１２９ＳｖＪ／Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実験が行われている。マウスは、注入の１か月後に安楽死させ、脳及び脊髄を採取して、細胞特異的マーカー及びＧＦＰに対する抗体による二重免疫蛍光法を用いて形質導入の効率及び特異性の組織学的分析を行う。ＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに対する遺伝子導入の効率及び特異性を、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ；ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対するマーカー）及びＧＦＰに対する抗体を用いた二重免疫蛍光染色により脳及び脊髄の全体にわたって評価する。更に、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、パルブアルブミン（ＰＶ）、カルレチニン（ＣＲ）、血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、マウスニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）を発現する阻害性介在ニューロンのサブセットについて、これらのタンパク質及びＧＦＰに特異的な抗体を用いて各プロモーター及び／またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの選択的特異性を評価する。全身投与及びＩＣＶ投与により処置したマウスから肝臓、心臓及び骨格筋を採取してＧＦＰの発現を組織学的に評価し、ウェスタンブロットを用いて末梢組織における異所性発現の可能性を調べる。
【0153】
表５．実験群
*各群は、両方の性からの同数のマウスで構成される。
#各ベクター当たり１匹の同腹子に注入。
略号: ＩＣＶ-脳室内注入、ＩＣ-頭蓋内注入、ＰＮＤ１-生後１日目
【表5】
#各ベクター当たり１匹の同腹子に注入。
略号: ＩＣＶ-脳室内注入、ＩＣ-頭蓋内注入、ＰＮＤ１-生後１日目
【0154】
６週齢のＳｃｎ１ａ＋／－マウスに歯状回への両側性注射により、様々なＺＦＰＳｃｎ１ａトランスアクチベータータンパク質をコードしたＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクター、アクチベーター単独の影響についてのコントロールとして、ＺＦＰＳｃｎ１ａアクチベータードメインを含むがＤＮＡ結合ドメインは含まないコンストラクト、または同体積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与する（ｎ＝雄３頭＋雌３頭／群）。これらの実験で使用した一本鎖ＡＡＶベクターは、形質導入された細胞の特定を容易とするためにＺＦＰＳｃｎ１ａｃＤＮＡの下流にＩＲＥＳ－ＧＦＰカセットも有している。広範なニューロンにおいてより幅広い活性化を行うことができる少なくとも２つのＺＦＰＳｃｎ１ａｃトランスアクチベーターと、上記に述べた最も有望な２つのＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに制限されたＺＦＰＳＣＮ１Ａトランスアクチベーターを試験する。注入１か月後、脳を採取し、脳の片半球からの海馬を切除し、βアクチン及びチューブリンをローディングコントロールとして用いたウェスタンブロットによりＺＦＰＳｃｎ１ａｃ、Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．３、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７タンパク質の発現レベルを評価する。脳の他方の半球を、脳の連続切片（１０μｍ）を使用した組織学的検査により調べ、ＧＡＤ及びＧＦＰに対する、またはＧＡＤ及びすべてのＺＦＰＳｃｎ１ａｃタンパク質に含まれるエピトープタグ（ＨＡまたはｍｙｃタグ）に対する抗体を用いた二重免疫蛍光染色によって歯状回及び顆粒細胞層の内葉における形質導入された阻害性介在ニューロンの割合（％）を分析する。また、ナトリウムチャネルの発現の正常なパターンの回復を証明するため、Ｎａｖ１．１及びＮａｖ１．３を発現するＧＡＤ陽性ニューロンの割合（％）も決定する。Ｎａｖ１．１及びＮａｖ１．３タンパク質発現の免疫蛍光法による検出に加えて、Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．３、ＺＦＰＳｃｎ１ａｃ及びＧＡＤに対するＲＮＡｓｃｏｐｅプローブを使用してＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにおけるｍＲＮＡレベルの変化を評価する。ＲＮＡＳｃｏｐｅは、脳のニューロンにおけるｍＲＮＡレベルを分析するためのインサイチューハイブリダイゼーション法において高い感度を有する。ＺＦＰＳｃｎ１ａｃの発現から生じるＮａｖ１．１のレベルを評価するためのこれら２つのアプローチの組み合わせは、本開示の遺伝子療法アプローチによって介在ニューロンの変化がどのように得られるかについての包括的な理解を与える。
【0155】
ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ＺＦＰＳｃｎ１ａｃ遺伝子療法の治療効果を、尾静脈を介して生後１日目、または６週齢で開始される両方の性別のＳｃｎ１ａ＋／－マウスで分析する。コントロールには、ＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインを含まないＺＦＰ様タンパク質をコードしたＡＡＶベクターで処置したマウス、ならびに同齢の非処置のＳｃｎ１ａ＋／－マウス及び野生型同腹子（各群、ｎ＝雄１５頭及びｎ＝雌１５頭）が含まれる。各群のマウスのサブセット（ｎ＝雄３頭及び雌３頭）を１２週齢で安楽死させ、ウェスタンブロット、ならびにＧＡＤ（及びＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７などの他のニューロンタイプ特異的マーカー）及びＺＦＰに対する抗体による免疫蛍光法、及び脳及び脊髄全体にわたったこれらの細胞におけるＮａｖ１．１の発現量の回復を用いてＧＡＢＡ作動性介在ニューロンへの遺伝子導入効率を評価する。更に、ＺＦＰの異所性発現、ならびに末梢組織におけるＮａｖ１．１を評価する。各群（ｎ＝２４）の動物の他のサブセットを用いて生存率（年齢１才までの）、運動性能及び行動に対する影響を調べる。これは月齢２～１２か月まで２か月ごとに試験する。Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスは生後２１日目までに前肢及び後肢の協調運動が損なわれることから、加速ローターロッド及び平均台歩行試験を用いて運動機能及び協調運動を評価する。更に、オープンフィールド試験、高架式十字迷路試験、巣作り試験、ガラス玉覆い隠し試験、バーンズ迷路試験を含む、Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスにおいて成績が低下する行動試験を用いて、Ｓｃｎ１ａ＋／－で深刻な低下がみられる空間学習及び記憶能力を試験する。Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスではドラベ症候群患者に特徴的な自発性発作も著明であり、その頻度は加齢及び体温とともに増加する。更に、強直間代発作の直後にＳｃｎ１ａ＋／－マウスの早期突然死が生じる。したがって、月齢２、６、及び１２か月に２４時間の連続的なビデオ監視を用いて発作の頻度及び持続時間を評価する。新奇な物体、匂いに応じたチャンバ嗜好性指示値を用いて社会的相互作用試験を行い、上記に述べた試験で測定された主要評価項目に有意な変化が検出された場合にマウスを考慮する。脳、脊髄、及び末梢臓器を採取し、人道的エンドポイントについて実験で評価して上記に示した分子的及び組織学的分析を行う。
【0156】
実施例７．ＺＦＰ及びｄＣａｓ９システムは、ヒト細胞のＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる
ＺＦＰ１～ＺＦＰ３がＳＣＮ１Ａの転写を増加させる能力を調べるため、ＺＦＰ１～ＺＦＰ３のＤＮＡ結合ドメインを、ＶＰ６４、ｐ５３、及びＲＴＡ（ＶＰＲ）の３つの部分からなる強力なハイブリッド転写アクチベータードメインに融合してキメラトランスアクチベーターを作製した。ＶＰＲ融合アクチベータードメインは、転写調節複合体を動員してクロマチンへのアクセシビリティを高めるように働き、高い遺伝子発現レベルを得る助けとなる。したがって、ＺＦＰドメインは、ＶＰＲアクチベーターが近位プロモーター領域内の高度に保存された領域を標的とするようにさせ、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる。
ＺＦＰ１～ＺＦＰ３がＳＣＮ１Ａの転写を増加させる能力を調べるため、ＺＦＰ１～ＺＦＰ３のＤＮＡ結合ドメインを、ＶＰ６４、ｐ５３、及びＲＴＡ（ＶＰＲ）の３つの部分からなる強力なハイブリッド転写アクチベータードメインに融合してキメラトランスアクチベーターを作製した。ＶＰＲ融合アクチベータードメインは、転写調節複合体を動員してクロマチンへのアクセシビリティを高めるように働き、高い遺伝子発現レベルを得る助けとなる。したがって、ＺＦＰドメインは、ＶＰＲアクチベーターが近位プロモーター領域内の高度に保存された領域を標的とするようにさせ、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる。
【0157】
更に、ＳＣＮ１Ａを標的とするｄＣａｓ９システムがＳＣＮ１Ａの転写を増加させる能力を調べるため、ＳＣＮ１Ａを標的とする３つのガイドＲＮＡをｄＣａｓ９タンパク質と複合体化した。
【0158】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を以下の実験条件、すなわち（１）ＶＰＲ－ＺＦＰ１コンストラクト、（２）ＶＰＲ－ＺＦＰ２コンストラクト、（３）ＶＰＲ－ＺＦＰ３コンストラクト、（４）ＶＰＲ－ＺＦＰ１、ＶＰＲ－ＺＦＰ２、及びＶＰＲ－ＺＦＰ３コンストラクトの３つすべて、（５）ｄＣａｓ９－ＶＰＲコンストラクトとＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ１、（６）ｄＣａｓ９－ＶＰＲコンストラクトとＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ２、（７）ｄＣａｓ９－ＶＰＲコンストラクトとＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ３、（８）ｄＣａｓ９－ＶＰＲコンストラクトとＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ１、ＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ２、及びＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ３の３つすべて、ならびに（９）ガイドＲＮＡを全く伴わないｄＣａｓ９－ＶＰＲ（コントロール）のうちの１つで一過性にトランスフェクトした。ＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した。ＳＣＮ１Ａの活性化倍率をコントロール実験（ガイドＲＮＡを全く伴わないｄＣａｓ９－ＶＰＲ）に対して正規化した。
【0159】
試験した実験条件のすべてが、コントロール実験に対してＳＣＮ１Ａの遺伝子活性化を増加させた（図８）。これらのデータは、本実施例及び本明細書全体を通じて記載されるジンクフィンガータンパク質がＳＣＮ１Ａを標的として遺伝子発現に影響を及ぼすことができることを示している。これらのデータは、本実施例の各ガイドＲＮＡ配列（配列番号８３～９４）が、ｄＣａｓ９がＳＣＮ１Ａを標的とするようにさせて遺伝子発現に影響を及ぼすことができることを更に示している。
【0160】
【表6】
（項目１）
少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合された少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを発現するように構成された導入遺伝子を含む単離核酸であって、前記ＤＮＡ結合ドメインが標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域に結合し、前記標的遺伝子が電圧ゲートナトリウムチャネルをコードする、前記単離核酸。
（項目２）
前記導入遺伝子にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接されている、項目１に記載の単離核酸。
（項目３）
前記転写調節因子ドメインが前記標的遺伝子の発現を増加させる、項目１または２に記載の単離核酸。
（項目４）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、前記標的遺伝子の非翻訳領域に結合する、項目１～３のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目５）
前記非翻訳領域が、エンハンサー、プロモーター、イントロン、及び／またはリプレッサーである、項目４に記載の単離核酸。
（項目６）
前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記標的遺伝子の調節領域の２～２０００ｂｐ上流または２～２０００ｂｐ下流で結合する、項目４または５に記載の単離核酸。
（項目７）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ｄＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２ａ）、及び／またはホメオドメインをコードする、項目１～６のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目８）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号５～７のいずれか１つに記載の核酸配列に結合する、項目１～７のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目９）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１１～１６、２３～２８、または３５～４０のいずれか１つに記載の配列を有する核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目１～８のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目１０）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１１を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１２を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１３を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１４を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、及び／または配列番号１６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目９に記載の単離核酸。
（項目１１）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２３を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２４を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２７を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、及び／または配列番号２８を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目９に記載の単離核酸。
（項目１２）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号３５を含む核酸によってコード
される認識ヘリックス、配列番号３６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３７を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３８を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３９を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、及び／または配列番号４０を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目９に記載の単離核酸。
（項目１３）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１７～２２、２９～３４、または４１～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質である、項目１～１２のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目１４）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１７を含む認識ヘリックス、配列番号１８を含む認識ヘリックス、配列番号１９を含む認識ヘリックス、配列番号２０を含む認識ヘリックス、配列番号２１を含む認識ヘリックス、及び／または配列番号２２を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目１３に記載の単離核酸。
（項目１５）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２９を含む認識ヘリックス、配列番号３０を含む認識ヘリックス、配列番号３１を含む認識ヘリックス、配列番号３２を含む認識ヘリックス、配列番号３３を含む認識ヘリックス、及び／または配列番号３４を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目１３に記載の単離核酸。
（項目１６）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号４１を含む認識ヘリックス、配列番号４２を含む認識ヘリックス、配列番号４３を含む認識ヘリックス、配列番号４４を含む認識ヘリックス、配列番号４５を含む認識ヘリックス、及び／または配列番号４６を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目１３に記載の単離核酸。
（項目１７）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、ｄＣａｓタンパク質、場合によりｄＣａｓ９タンパク質であり、前記単離核酸が少なくとも１つのガイド核酸を更に含む、項目１～７のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目１８）
前記ガイド核酸が、ＳＣＮ１Ａを標的とするスペーサー配列を含む、項目１７に記載の単離核酸。
（項目１９）
前記ガイド核酸が、配列番号８５、８６、８９、９０、９３、または９４のいずれか１つのヌクレオチド配列を有するスペーサー配列を含む、項目１７または１８に記載の単離核酸。
（項目２０）
前記ガイド核酸が、配列番号８３～９４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、項目１７～１９のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目２１）
前記少なくとも１つの転写調節因子ドメインが、ＶＰＲ、Ｒｔａ、ｐ６５、もしくはＨｓｆ１トランスアクチベーター、またはこれらの任意の組み合わせを含む、項目１～１６のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目２２）
前記少なくとも１つのトランス活性化ドメインが、配列番号４７に記載の核酸配列によってコードされる、項目１～２１のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目２３）
前記少なくとも１つのトランス活性化ドメインが、配列番号４８に記載のアミノ酸配列
によってコードされる、項目１～２２のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目２４）
前記核酸が、ＡＡＶ２のＩＴＲを含む、項目１～２３のいずれかに記載の単離核酸。
（項目２５）
前記ＩＴＲが、ΔＴＲ及び／またはｍＴＲである、項目２４に記載の単離核酸。
（項目２６）
前記導入遺伝子がプロモーターと機能的に連結されている、項目１～２５のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目２７）
前記プロモーターが組織特異的プロモーターであり、場合により、前記プロモーターが、ＳＳＴ、ＮＰＹ、リン酸活性化グルタミナーゼ（ＰＡＧ）、小胞グルタミン酸トランスポーター１（ＶＧＬＵＴ１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５及び５７（ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７）、シナプシンＩ、ａ－ＣａｍＫＩＩ、Ｄｏｃｋ１０、Ｐｒｏｘ１、パルブアルブミン（ＰＶ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、カルレチニン（ＣＲ）、またはニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）などのニューロン性プロモーターである、項目２６に記載の単離核酸。
（項目２８）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、リンカードメインによって前記少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合されている、項目１～２７のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目２９）
前記リンカードメインが、場合により、
（ｉ）場合によりグリシンで構成される柔軟なリンカー、または
（ｉｉ）切断可能なリンカー
である、項目２８に記載の単離核酸。
（項目３０）
前記導入遺伝子が、１個のＤＮＡ結合ドメイン、２個のＤＮＡ結合ドメイン、３個のＤＮＡ結合ドメイン、４個のＤＮＡ結合ドメイン、５個のＤＮＡ結合ドメイン、６個のＤＮＡ結合ドメイン、７個のＤＮＡ結合ドメイン、８個のＤＮＡ結合ドメイン、９個のＤＮＡ結合ドメイン、または１０個のＤＮＡ結合ドメインをコードする、項目１～２９のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目３１）
前記導入遺伝子が、１個の転写調節因子ドメイン、２個の転写調節因子ドメイン、３個の転写調節因子ドメイン、４個の転写調節因子ドメイン、５個の転写調節因子ドメイン、６個の転写調節因子ドメイン、７個の転写調節因子ドメイン、８個の転写調節因子ドメイン、９個の転写調節因子ドメイン、または１０個の転写調節因子ドメインをコードする、項目１～３０のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目３２）
（ｉ）少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合された少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインをコードした導入遺伝子を含む核酸であって、前記ＤＮＡ結合ドメインが標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域に結合し、前記標的遺伝子が電圧ゲートナトリウムチャネルをコードする、前記核酸と、
（ｉｉ）少なくとも１つのカプシドタンパク質と、
を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
（項目３３）
前記導入遺伝子にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接されている、項目３２に記載のｒＡＡＶ。
（項目３４）
前記転写調節因子が前記標的遺伝子の発現を増加させる、項目３２または項目３３に記載のｒＡＡＶ。
（項目３５）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、前記標的遺伝子の非翻訳領域に結合する、項目３２～３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目３６）
前記非翻訳領域が、エンハンサー、プロモーター、イントロン、及び／またはリプレッサーである、項目３５に記載のｒＡＡＶ。
（項目３７）
前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記標的遺伝子の調節領域の２～２０００ｂｐ上流または２～２０００ｂｐ下流で結合する、項目３５または３６に記載のｒＡＡＶ。
（項目３８）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ｄＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２ａ）、及び／またはホメオドメインをコードする、項目３２～３７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目３９）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号５～７のいずれか１つに記載の核酸配列に結合する、項目３２～３８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目４０）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１１～１６、２３～２８、または３５～４０のいずれか１つに記載の配列を有する核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目３２～３９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目４１）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１１を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１２を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１３を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１４を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、及び／または配列番号１６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目４０に記載のｒＡＡＶ。
（項目４２）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２３を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２４を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２７を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、及び／または配列番号２８を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目４０に記載のｒＡＡＶ。
（項目４３）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号３５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３７を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３８を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３９を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、及び／または配列番号４０を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目４０に記載のｒＡＡＶ。
（項目４４）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１７～２２、２９～３４、または４１～４６のいずれか１つに記載の配列を含むジンクフィンガータンパク質である、項目３２～４３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目４５）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１７を含む認識ヘリックス、配列番号１８を含む認識ヘリックス、配列番号１９を含む認識ヘリックス、配列番号２０を
含む認識ヘリックス、配列番号２１を含む認識ヘリックス、及び／または配列番号２２を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目４４に記載のｒＡＡＶ。
（項目４６）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２９を含む認識ヘリックス、配列番号３０を含む認識ヘリックス、配列番号３１を含む認識ヘリックス、配列番号３２を含む認識ヘリックス、配列番号３３を含む認識ヘリックス、及び／または配列番号３４を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目４４に記載のｒＡＡＶ。
（項目４７）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号４１を含む認識ヘリックス、配列番号４２を含む認識ヘリックス、配列番号４３を含む認識ヘリックス、配列番号４４を含む認識ヘリックス、配列番号４５を含む認識ヘリックス、及び／または配列番号４６を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、項目４４に記載のｒＡＡＶ。
（項目４８）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、ｄＣａｓタンパク質、場合によりｄＣａｓ９タンパク質であり、前記ｒＡＡＶが少なくとも１つのガイド核酸を更に含む、項目３２～３７のいずれか１項に記載の単離核酸。
（項目４９）
前記ガイド核酸が、ＳＣＮ１Ａを標的とするスペーサー配列を含む、項目４８に記載のｒＡＡＶ。
（項目５０）
前記ガイド核酸が、配列番号８５、８６、８９、９０、９３、または９４のいずれか１つのヌクレオチド配列を有するスペーサー配列を含む、項目４８または４９に記載のｒＡＡＶ。
（項目５１）
前記ガイド核酸が、配列番号８３～９４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、項目４８～５０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目５２）
前記少なくとも１つの転写調節因子ドメインが、ＶＲＰ、Ｒｔａ、ｐ６５、Ｈｓｆ１またはこれらの任意の組み合わせに由来するトランスアクチベーターである、項目３２～４７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目５３）
前記少なくとも１つの転写調節因子ドメイン導入遺伝子をコードする前記導入遺伝子が、配列番号４７に記載の配列を含む、項目３２～５２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。（項目５４）
前記少なくとも１つの転写調節因子ドメインが、配列番号４８に記載のアミノ酸配列によってコードされる、項目３２～５３のいずれか１項に記載の核酸。
（項目５５）
前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、リンカードメインによって前記少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合されている、項目３２～５４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目５６）
前記リンカードメインが、場合により、
（ｉ）場合によりグリシンで構成される柔軟なリンカー、または
（ｉｉ）切断可能なリンカー
である、項目５５に記載のｒＡＡＶ。
（項目５７）
前記導入遺伝子が、１個のＤＮＡ結合ドメイン、２個のＤＮＡ結合ドメイン、３個のＤ
ＮＡ結合ドメイン、４個のＤＮＡ結合ドメイン、５個のＤＮＡ結合ドメイン、６個のＤＮＡ結合ドメイン、７個のＤＮＡ結合ドメイン、８個のＤＮＡ結合ドメイン、９個のＤＮＡ結合ドメイン、または１０個のＤＮＡ結合ドメインをコードする、項目３２～５６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目５８）
前記導入遺伝子が、１個の転写調節因子ドメイン、２個の転写調節因子ドメイン、３個の転写調節因子ドメイン、４個の転写調節因子ドメイン、５個の転写調節因子ドメイン、６個の転写調節因子ドメイン、７個の転写調節因子ドメイン、８個の転写調節因子ドメイン、９個の転写調節因子ドメイン、または１０個の転写調節因子ドメインをコードする、項目３２～５７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目５９）
前記ＡＡＶカプシドの血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶ．ＰＨＰＢからなる群から選択される、項目３２～５８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目６０）
前記ＡＡＶカプシドの血清型が、ＡＡＶ９である、項目３２～５９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目６１）
前記ＡＡＶカプシドの血清型が、ＡＡＶ．ＰＨＢＰである、項目３２～５９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目６２）
前記核酸が、ＡＡＶ２のＩＴＲを含む、項目３２～６１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目６３）
前記ＩＴＲが、ΔＴＲ及び／またはｍＴＲである、項目６２に記載のｒＡＡＶ。
（項目６４）
前記導入遺伝子がプロモーターと機能的に連結されている、項目３２～６３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
（項目６５）
前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、項目６４に記載のｒＡＡＶ。
（項目６６）
前記組織特異的プロモーターが、ＳＳＴ、ＮＰＹ、リン酸活性化グルタミナーゼ（ＰＡＧ）、小胞グルタミン酸トランスポーター１（ＶＧＬＵＴ１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５及び５７（ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７）、シナプシンＩ、ａ－ＣａｍＫＩＩ、Ｄｏｃｋ１０、Ｐｒｏｘ１、パルブアルブミン（ＰＶ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、カルレチニン（ＣＲ）、またはニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）などのニューロン性プロモーターである、項目６４または６５に記載のｒＡＡＶ。
（項目６７）
標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記標的遺伝子を含む細胞または対象に、項目１～３１のいずれか１項に記載の単離核酸、または項目３２～６６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することを含む、前記方法。
（項目６８）
前記対象が前記標的遺伝子についてハプロ不全である、項目５７に記載の方法。
（項目６９）
前記標的遺伝子がＳＣＮ１Ａである、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７０）
前記細胞がニューロン、場合により、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである、項目６７～６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
項目１～３１のいずれか１項に記載の単離核酸、または項目３２～６６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶの投与が、投与前の前記対象における前記導入遺伝子の発現に対して少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍増加した標的遺伝子の発現をもたらす、項目６７～７０のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
対象のドラベ症候群を治療する方法であって、標的遺伝子を発現する対象に、項目１～３１のいずれか１項に記載の単離核酸、または項目３２～６６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することを含む、前記方法。
（項目７３）
前記対象における前記標的遺伝子の発現が、正常な対象と比較して減少している、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記対象が、正常な対象に対して標的遺伝子の発現においてハプロ不全であるか、またはハプロ不全であることが疑われる、項目７２または７３に記載の方法。
（項目７５）
前記対象が、前記標的遺伝子のハプロ不全発現によって引き起こされる状態を有するか、または有することが疑われる、項目７２～７４のいずれか１項に記載の方法。
（項目７６）
前記標的遺伝子が、ＳＣＮ１Ａである、項目７２～７５のいずれか１項の記載の方法。（項目７７）
前記単離核酸または前記ｒＡＡＶが、静脈内注射、筋肉内注射、吸入、皮下注射、及び／または頭蓋内注射により投与される、項目７２～７６のいずれか１項に記載の方法。
（項目７８）
前記単離核酸または前記ｒＡＡＶの投与が、投与前の前記対象における前記導入遺伝子の発現に対して少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍増加した標的遺伝子の発現をもたらす、項目７２～７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目７９）
項目１～３１のいずれか１項に記載の単離核酸または項目３２～６６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを含む、組成物。
（項目８０）
薬学的に許容される担体を更に含む、項目７９に記載の組成物。
（項目８１）
項目１～３１のいずれか１項に記載の単離核酸、または項目３２～６６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを収容した容器を含む、キット。
（項目８２）
薬学的に許容される担体を収容した容器を更に含む、項目８１に記載のキット。
（項目８３）
前記単離核酸または前記ｒＡＡＶ及び前記薬学的に許容される担体が同じ容器に収容されている、項目８１または８２に記載のキット。
（項目８４）
前記容器が注射器である、項目８１～８３のいずれか１項に記載のキット。
（項目８５）
項目１～３１のいずれか１項に記載の単離核酸、または項目３２～６６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを含む、宿主細胞。
（項目８６）
真核細胞である、項目８５に記載の宿主細胞。
（項目８７）
哺乳動物細胞である、項目８５に記載の宿主細胞。
（項目８８）
前記宿主細胞が、ヒト細胞、場合によりニューロン、場合によりＧＡＢＡ作動性ニューロンである、項目８７に記載の宿主細胞。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【外国語明細書】