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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025036271
(43)【公開日】2025-03-14
(54)【発明の名称】酵素活性の評価方法、及び酵素活性評価用キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/48 20060101AFI20250306BHJP
C12Q 1/25 20060101ALI20250306BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20250306BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20250306BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20250306BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20250306BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20250306BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20250306BHJP
C12N 1/15 20060101ALN20250306BHJP
C12N 1/19 20060101ALN20250306BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20250306BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20250306BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20250306BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/48
C12Q1/25 ZNA
C12Q1/02
C07K19/00
C12N1/00 B
C07K14/435
C12N9/10
C12N9/00
C12Q1/25
C12Q1/48 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/54
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024145892
(22)【出願日】2024-08-27
(31)【優先権主張番号】P 2023139902
(32)【優先日】2023-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000253503
【氏名又は名称】キリンホールディングス株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】899000068
【氏名又は名称】学校法人早稲田大学
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100140888
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 欣乃
(74)【代理人】
【識別番号】100126653
【弁理士】
【氏名又は名称】木元 克輔
(72)【発明者】
【氏名】渡邊 太郎
(72)【発明者】
【氏名】梅野 太輔
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QQ26
4B063QQ40
4B063QR06
4B063QR20
4B063QR75
4B063QS31
4B063QX02
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA89
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、Ｓ－アデノシルメチオニンを基質とする酵素の活性を簡便に評価する方法、又は酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を簡便に評価するためのキットを提供することを目的とする。
【解決手段】第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費を競合させる工程、該第二の酵素が触媒する該反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価する工程、を含む該第一の酵素の活性を評価する方法。
【選択図】なし
【解決手段】第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費を競合させる工程、該第二の酵素が触媒する該反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価する工程、を含む該第一の酵素の活性を評価する方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費を競合させる工程、
該第二の酵素が触媒する該反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価する工程、
を含む該第一の酵素の活性を評価する方法。
該第二の酵素が触媒する該反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価する工程、
を含む該第一の酵素の活性を評価する方法。
【請求項2】
前記第一の酵素をコードする遺伝子を含む第一の発現ベクターを細胞に導入する工程、
前記第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターを該細胞に導入する工程、を更に含み、
Ｓ－アデノシルメチオニンの消費の競合が該細胞内で行われるものである、
請求項１に記載の方法。
前記第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターを該細胞に導入する工程、を更に含み、
Ｓ－アデノシルメチオニンの消費の競合が該細胞内で行われるものである、
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細胞が、エシェリヒア属に属する細菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記第二の酵素が、配列番号２７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記蛍光及び／又は呈色が、トリメチルピロコルフィンの蛍光である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第二の酵素が、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第一の酵素が、メチルトランスフェラーゼ、ラジカルＳ－アデノシルメチオニン酵素、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、Ｎ－アシルホモセリンラクトン合成酵素、オパインメタロフォア合成酵素、５’－デオキシ－５’－フルオロアデノシン合成酵素、５’－デオキシ－５’－クロロアデノシン合成酵素、及びアゼチジン－２－カルボン酸合成酵素からなる群より選択される酵素である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、
Ｓ－アデノシルメチオニン、及び
ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ
を含む、該酵素とは異なる酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキット。
Ｓ－アデノシルメチオニン、及び
ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ
を含む、該酵素とは異なる酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキット。
【請求項9】
Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、
Ｓ－アデノシルメチオニン、並びに
５－アミノレブリン酸、ポルフォビリノーゲンシンターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ
を含む、該酵素とは異なる酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキット。
Ｓ－アデノシルメチオニン、並びに
５－アミノレブリン酸、ポルフォビリノーゲンシンターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ
を含む、該酵素とは異なる酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酵素活性の評価方法、及び酵素活性評価用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
Ｓ－アデノシルメチオニンは、生体内において様々な酵素反応の基質として利用されている。例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼは、Ｓ－アデノシルメチオニンをメチルドナーとして利用したメチル化反応を担う酵素であり、その基質は、低分子化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等多岐にわたる。Ｓ－アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼによるメチル化反応を経て生合成される天然物には生理活性、健康機能性等を示す産業上重要な物質が多く含まれる。そのような天然物の例として、香料として広く用いられているバニリン、鎮痛剤として広く用いられているモルヒネ等が挙げられる。また、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼは、Ｓ－アデノシルメチオニンを脱炭酸しＳ－アデノシル３－（メチルスルファニル）プロピルアミンを産生するが、この反応は長鎖ポリアミン生合成系の初発反応として重要である。他にも、Ｓ－アデノシルメチオニン－８－アミノ－７－オキソノナノエートアミノトランスフェラーゼは、ビオチン生合成経路中に存在し、Ｓ－アデノシルメチオニンから８－アミノ－７－オキソノナノエートへアミノ基を転移する。また、ニコチアナミンシンターゼは、三分子のＳ－アデノシルメチオニンからニコチアナミンを合成する。ニコチアナミンは植物が分泌する鉄キレート物質ムギネ酸の合成中間体であると共に、アンジオテンシン変換酵素の阻害活性を持つ化合物である。したがって、Ｓ－アデノシルメチオニンを基質とする酵素の探索又は改変は、細胞生理における重要性及び産業上の高い有用性から重要な技術課題である。
【0003】
Ｓ－アデノシルメチオニンを基質とする酵素の探索又は改変のための酵素活性の評価方法として、例えば、バニリン酸の高生産に適したＳ－アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼの探索に、バニリン酸に応答する転写因子型のバイオセンサが開発された例（非特許文献１）、評価系中のＳ－アデノシルメチオニン量の定量により、無細胞転写翻訳系で合成されたＳ－アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼの基質特異性プロファイルを行った例（非特許文献２）等が報告されている。その他には、Ｌ－システインへの要求性を付与した微生物においてメチル基転移反応により生じる副産物であるＳ－アデノシル－Ｌ－ホモシステインを介しメチル化活性依存的にＬ－システイン要求性が相補されることを利用したメチルトランスフェラーゼ活性検出系（特許文献１）等も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】米国特許第１１４７９７５８号明細書
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｋｕｎｊａｐｕｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｖａｎｉｌｌａｔｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｖａｎｉｌｌｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ”， ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．８． １９５８－１９６７ （２０１９）
【非特許文献2】Ｈａｓｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｒａｐｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｆｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”， Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．２８． ８７６－８８６．ｅ４ （２０２１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながらこれらの方法は、対象のＳ－アデノシルメチオニンを基質とする酵素及び当該酵素の基質の組み合わせが限定される事、酵素調製法及びＳ－アデノシルメチオニン測定に用いるキットが高価である事、並びに栄養要求性を相補するアッセイであるため定量的な解析が難しい事から、汎用性及び簡便性に課題があった。
【0007】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、Ｓ－アデノシルメチオニンを基質とする酵素の活性を簡便に評価する方法、又は酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を簡便に評価するためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、Ｓ－アデノシルメチオニンを消費し蛍光及び／又は呈色を示す化合物を生成する酵素によるＳ－アデノシルメチオニンの消費、並びに目的酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費を競合させると、当該蛍光及び／又は呈色が当該目的酵素の触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費に応じて減弱することを見出し、本発明を完成させた。
【0009】
本発明は、例えば、以下の各発明を提供する。
［１］
第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費を競合させる工程、
当該第二の酵素が触媒する当該反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価する工程、
を含む当該第一の酵素の活性を評価する方法。
［２］
上記第一の酵素をコードする遺伝子を含む第一の発現ベクターを細胞に導入する工程、
上記第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターを当該細胞に導入する工程、を更に含み、
Ｓ－アデノシルメチオニンの消費の競合が当該細胞内で行われるものである、
［１］に記載の方法。
［３］
上記細胞が、エシェリヒア属に属する細菌である、［２］に記載の方法。
［４］
上記第二の酵素が、配列番号２７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性を有する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
上記蛍光及び／又は呈色が、トリメチルピロコルフィンの蛍光である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
上記第二の酵素が、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
上記第一の酵素が、メチルトランスフェラーゼ、ラジカルＳ－アデノシルメチオニン酵素、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、Ｎ－アシルホモセリンラクトン合成酵素、オパインメタロフォア合成酵素、５’－デオキシ－５’－フルオロアデノシン合成酵素、５’－デオキシ－５’－クロロアデノシン合成酵素、及びアゼチジン－２－カルボン酸合成酵素からなる群より選択される酵素である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、
Ｓ－アデノシルメチオニン、及び
ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ
を含む、当該酵素とは異なる酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキット。
［９］
Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、
Ｓ－アデノシルメチオニン、並びに
５－アミノレブリン酸、ポルフォビリノーゲンシンターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ
を含む、当該酵素とは異なる酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキット。
［１］
第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費を競合させる工程、
当該第二の酵素が触媒する当該反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価する工程、
を含む当該第一の酵素の活性を評価する方法。
［２］
上記第一の酵素をコードする遺伝子を含む第一の発現ベクターを細胞に導入する工程、
上記第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターを当該細胞に導入する工程、を更に含み、
Ｓ－アデノシルメチオニンの消費の競合が当該細胞内で行われるものである、
［１］に記載の方法。
［３］
上記細胞が、エシェリヒア属に属する細菌である、［２］に記載の方法。
［４］
上記第二の酵素が、配列番号２７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性を有する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
上記蛍光及び／又は呈色が、トリメチルピロコルフィンの蛍光である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
上記第二の酵素が、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
上記第一の酵素が、メチルトランスフェラーゼ、ラジカルＳ－アデノシルメチオニン酵素、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、Ｎ－アシルホモセリンラクトン合成酵素、オパインメタロフォア合成酵素、５’－デオキシ－５’－フルオロアデノシン合成酵素、５’－デオキシ－５’－クロロアデノシン合成酵素、及びアゼチジン－２－カルボン酸合成酵素からなる群より選択される酵素である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、
Ｓ－アデノシルメチオニン、及び
ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ
を含む、当該酵素とは異なる酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキット。
［９］
Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、
Ｓ－アデノシルメチオニン、並びに
５－アミノレブリン酸、ポルフォビリノーゲンシンターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ
を含む、当該酵素とは異なる酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキット。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、Ｓ－アデノシルメチオニンを基質とする酵素の活性を簡便に評価する方法、又は酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を簡便に評価するキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】プラスミドｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）のプラスミドマップである。
【図2】実施例１で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、ＩＰＴＧ存在下又は非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【図3】プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１のプラスミドマップである。
【図4】実施例２で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、各濃度のテオブロミン存在下又は非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【図5】プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤのプラスミドマップである。
【図6】実施例３で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、各濃度のＬ－ヒスチジン存在下又は非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【図7】プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）のプラスミドマップである。
【図8】実施例４で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、各濃度のＬ－ヒスチジン、若しくはＬ－トリプトファン存在下、又は基質非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【図9】プラスミドｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）のプラスミドマップである。
【図10】実施例５で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、各濃度のテオブロミン存在下、又は非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【図11】実施例６で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、各濃度のＬ－ヒスチジン存在下、又は非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【図12】実施例７で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、各濃度のＬ－ヒスチジン、若しくはＬ－トリプトファン存在下、又は基質非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【図13】プラスミドｐＱＥ８０Ｌ-ＮｐＮ４ＯＭＴ１のプラスミドマップである。
【図14】実施例８で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、ドパミン塩酸塩存在下又は非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【図15】実施例９で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、ドパミン塩酸塩存在下又は非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【図16】プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＳｐｅＤのプラスミドマップである。
【図17】実施例１０で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、ＩＰＴＧ存在下又は非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【図18】実施例１１で撮影した、３６５ｎｍの紫外線ランプ下での、ＩＰＴＧ存在下又は非存在下における、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）のコロニーの写真である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本実施形態に係る第一の酵素の活性を評価する方法は、第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費を競合させる工程（競合工程）、当該第二の酵素が触媒する当該反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価する工程（評価工程）を含む。
【0013】
また、本実施形態に係る第一の酵素の活性を評価する方法は、競合工程の前に、上記第一の酵素をコードする遺伝子を含む第一の発現ベクターを細胞に導入する工程（第一導入工程）、上記第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターを当該細胞に導入する工程（第二導入工程）、を更に含んでもよい（以下「第一導入工程」及び「第二導入工程」を総括して「導入工程」ともいう）。
【0014】
本明細書において、Ｓ－アデノシルメチオニンについて使用される「消費」とは、酵素がＳ－アデノシルメチオニンに作用して化学反応を起こすことにより、反応系内のＳ－アデノシルメチオニンの量を減少させることを意味する。なお、第一の酵素がＳ－アデノシルメチオニンに作用して化学反応を起こすために必要な活性を有しないこと、第一の酵素がＳ－アデノシルメチオニンに作用して化学反応を起こすために必要な基質が反応系内に存在しないこと、及び第一の酵素が第一の酵素の阻害物質により阻害されていること、からなる群より選択される少なくとも１つの理由によって、第一の酵素がＳ－アデノシルメチオニンの量を減少させない場合も、「消費」の概念に含まれる。
【0015】
本明細書において、Ｓ－アデノシルメチオニンの消費について使用される「競合」とは、２つの酵素がＳ－アデノシルメチオニンを互いに消費しあうことを意味し、それによって、それぞれの酵素が消費するＳ－アデノシルメチオニンの量が、他方の酵素が存在していなかった場合に比べて減少する。なお、第一の酵素がＳ－アデノシルメチオニンに作用して化学反応を起こすために必要な活性を有しないこと、第一の酵素がＳ－アデノシルメチオニンに作用して化学反応を起こすために必要な基質が反応系内に存在しないこと、及び第一の酵素が第一の酵素の阻害物質により阻害されていること、からなる群より選択される少なくとも１つの理由によって、第一の酵素が反応系内のＳ－アデノシルメチオニンの量を減少させないために、第二の酵素が消費するＳ－アデノシルメチオニンの量が、第一の酵素が存在していなかった場合に比べて減少しない場合も、「競合」の概念に含まれる。
【0016】
本明細書において、第二の酵素が触媒する反応により生じる「蛍光及び／又は呈色」とは、第二の酵素が触媒する反応の生成物に含まれる、蛍光を発する化合物及び／又は呈色反応を引き起こす化合物が示す、蛍光及び／又は呈色を意味する。
【0017】
本発明の第一の酵素の活性を測定する方法は、第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により蛍光及び／又は呈色が生じること、並びにこれら蛍光及び／又は呈色が、第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費の競合の際の、第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費に応じて減弱すること、を利用するものである。
【0018】
本実施形態に係る第一の酵素の活性を評価する方法の用途は、特に制限されず、例えば、目的の反応に対しての酵素の活性の有無の評価に用いてもよく、高い活性を示す酵素のスクリーニングに用いてもよく、酵素が高い活性を示す基質のスクリーニングに用いてもよく、酵素が高い活性を示す酵素及び基質の組み合わせのスクリーニングに用いてもよく、酵素に対する阻害物質の探索に用いてもよく、基質選択性の高い酵素のスクリーニングに用いてもよい。
【0019】
（第一の酵素）
本実施形態に係る第一の酵素は、特に制限されず、目的に応じて適宜選択することができ、Ｓ－アデノシルメチオニンを消費する反応を触媒する酵素であってもよく、Ｓ－アデノシルメチオニンを消費する反応を触媒するか触媒しないか不明な酵素であってもよい。本実施形態に係る第一の酵素としては、例えば、ＣＣＳ１（即ち、配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）、ＥｇｔＤ（即ち、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）、ドパミン－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ等のメチルトランスフェラーゼ、ラジカルＳ－アデノシルメチオニン酵素、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、Ｎ－アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）合成酵素、ニコチアナミン合成酵素等のオパインメタロフォア（Ｏｐｉｎｅ Ｍｅｔａｌｌｏｐｈｏｒｅ）合成酵素、５’－デオキシ－５’－フルオロアデノシン合成酵素、５’－デオキシ－５’－クロロアデノシン合成酵素、アゼチジン－２－カルボン酸合成酵素等が挙げられる。上記ドパミン－Ｏ－メチルトランスフェラーゼとしては、例えば、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）属植物由来のドパミン－Ｏ－メチルトランスフェラーゼＮｐＮ４ＯＭＴ１（配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。Kilgore, Matthew B., et al. "Cloning and characterization of anorbelladine 4'-O-methyltransferase involved in the biosynthesis of theAlzheimer’s drug galanthamine in Narcissus sp. aff.pseudonarcissus." PloS one 9.7 (2014): e103223.）等が挙げられる。上記Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＳ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼＳｐｅＤ（配列番号３９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）これらの酵素は公知の酵素であってもよく、アミノ酸の置換等により改変をされた酵素であってもよい。
本実施形態に係る第一の酵素は、特に制限されず、目的に応じて適宜選択することができ、Ｓ－アデノシルメチオニンを消費する反応を触媒する酵素であってもよく、Ｓ－アデノシルメチオニンを消費する反応を触媒するか触媒しないか不明な酵素であってもよい。本実施形態に係る第一の酵素としては、例えば、ＣＣＳ１（即ち、配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）、ＥｇｔＤ（即ち、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）、ドパミン－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ等のメチルトランスフェラーゼ、ラジカルＳ－アデノシルメチオニン酵素、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、Ｎ－アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）合成酵素、ニコチアナミン合成酵素等のオパインメタロフォア（Ｏｐｉｎｅ Ｍｅｔａｌｌｏｐｈｏｒｅ）合成酵素、５’－デオキシ－５’－フルオロアデノシン合成酵素、５’－デオキシ－５’－クロロアデノシン合成酵素、アゼチジン－２－カルボン酸合成酵素等が挙げられる。上記ドパミン－Ｏ－メチルトランスフェラーゼとしては、例えば、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）属植物由来のドパミン－Ｏ－メチルトランスフェラーゼＮｐＮ４ＯＭＴ１（配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。Kilgore, Matthew B., et al. "Cloning and characterization of anorbelladine 4'-O-methyltransferase involved in the biosynthesis of theAlzheimer’s drug galanthamine in Narcissus sp. aff.pseudonarcissus." PloS one 9.7 (2014): e103223.）等が挙げられる。上記Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＳ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼＳｐｅＤ（配列番号３９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）これらの酵素は公知の酵素であってもよく、アミノ酸の置換等により改変をされた酵素であってもよい。
【0020】
（第二の酵素）
本実施形態に係る第二の酵素は、特に制限されず、Ｓ－アデノシルメチオニンを消費する反応であって、蛍光及び／又は呈色を生じる反応を触媒する酵素であればよく、例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＳＵＭＴ）活性を有する酵素（ＳＵＭＴを含む）、エスクレチンメチル化活性を有する酵素等が挙げられる。ＳＵＭＴ活性を有する酵素としては、配列番号２７で表されるアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよく、例えば、大腸菌ＣｙｓＧ、ＣｙｓＧ（Ａ）（即ち、配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）等が挙げられる。本明細書において、高い同一性とは、アミノ酸配列全体あるいは塩基配列全体で、９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列又は塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， “Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ－ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ９０（１２）， ５８７３－５８７７ （１９９３））によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ｓ． Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， “Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， ２１５（３）， ４０３－４１０ （１９９０））。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）のウェブサイトの情報を参照することができる。
本実施形態に係る第二の酵素は、特に制限されず、Ｓ－アデノシルメチオニンを消費する反応であって、蛍光及び／又は呈色を生じる反応を触媒する酵素であればよく、例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン依存的ウロポルフィリノーゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＳＵＭＴ）活性を有する酵素（ＳＵＭＴを含む）、エスクレチンメチル化活性を有する酵素等が挙げられる。ＳＵＭＴ活性を有する酵素としては、配列番号２７で表されるアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよく、例えば、大腸菌ＣｙｓＧ、ＣｙｓＧ（Ａ）（即ち、配列番号２７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）等が挙げられる。本明細書において、高い同一性とは、アミノ酸配列全体あるいは塩基配列全体で、９０％以上（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列又は塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， “Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ－ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ９０（１２）， ５８７３－５８７７ （１９９３））によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ｓ． Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， “Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， ２１５（３）， ４０３－４１０ （１９９０））。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）のウェブサイトの情報を参照することができる。
【0021】
なお、ＳＵＭＴ活性を有する酵素は、Ｓ－アデノシルメチオニンをメチルドナーとして利用し、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩのメチル化反応を１回以上触媒する酵素である。ウロポルフィリノーゲンＩＩＩがＳＵＭＴ活性を有する酵素により三度のメチル化を受けると、蛍光を発するトリメチルピロコルフィンが生成される。（Ｊ． Ｆｅｌｉｃｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， “Ｎｏｖｅｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ－ｂａｓｅｄ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｓｅｎｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ”， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｖｏｌ．９３． ９８９－９９７ （２００６））。
【0022】
また、大腸菌ＣｙｓＧはＳＵＭＴ活性、プレコリン－２デヒドロゲナーゼ活性、及びシロヒドロクロリンフェロキラターゼ活性を有する多機能酵素であり、ＣｙｓＧ（Ａ）は、大腸菌ＣｙｓＧうちＳＵＭＴ活性を持つＣ末端側ドメインのみを切り出したタンパク質であって、ＳＵＭＴ活性を有することが知られている（Ｍ Ｊ Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ， ”Ｇｅｎｅ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｙｓＧ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ”， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ｖｏｌ．３０２． ８３７－８４４ （１９９４））。
【0023】
また、本実施形態に係る第二の酵素は、Ｓ－アデノシルメチオニンを消費する反応であって、蛍光及び／又は呈色を生じる反応を触媒する酵素と、蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質であってもよい。蛍光タンパク質は、励起光によって蛍光を発するタンパク質であればよく、例えば、ａｖＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰｕｖ、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＤｓＲＥＤ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＥＹＦＰ等が挙げられる。第二の酵素が蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である場合は、第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により生じる蛍光及び／又は呈色の評価を、色相の変化を評価することで行うことができる。この場合、本実施形態に係る第一の酵素の活性の評価がより容易となる。第二の酵素が蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である場合は、第二の酵素としては、例えば、ＣｙｓＧ（Ａ）及びｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰの融合タンパク質等が挙げられる。
【0024】
＜導入工程＞
導入工程では、第一の酵素をコードする遺伝子を含む第一の発現ベクターを細胞に導入させ、また、第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターを当該細胞に導入させる。第一の酵素をコードする遺伝子を含む第一の発現ベクターの細胞への導入、及び第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターの当該細胞への導入は、同時に行ってもよく、第一の酵素をコードする遺伝子を含む第一の発現ベクターの細胞への導入を先に行ってもよく、第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターの細胞への導入を先に行ってもよい。
導入工程では、第一の酵素をコードする遺伝子を含む第一の発現ベクターを細胞に導入させ、また、第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターを当該細胞に導入させる。第一の酵素をコードする遺伝子を含む第一の発現ベクターの細胞への導入、及び第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターの当該細胞への導入は、同時に行ってもよく、第一の酵素をコードする遺伝子を含む第一の発現ベクターの細胞への導入を先に行ってもよく、第二の酵素をコードする遺伝子を含む第二の発現ベクターの細胞への導入を先に行ってもよい。
【0025】
また、本実施形態に係る第一の酵素の活性を評価する方法が、導入工程を含む場合、第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費の競合は、第一の発現ベクター及び第二の発現ベクターが導入された細胞内で行われる。
【0026】
（第一の発現ベクター及び第二の発現ベクター）
本実施形態に係る第一の発現ベクターは、第一の酵素をコードする遺伝子を含んでおり、原核細胞及び／又は真核細胞のいずれかの細胞中で第一の酵素を生産する機能を有するものであれば特に制限されない。また、本実施形態に係る第二の発現ベクターは、第二の酵素をコードする遺伝子を含んでおり、原核細胞及び／又は真核細胞のいずれかの細胞中で第二の酵素を生産する機能を有するものであれば特に制限されない。また、本実施形態に係る第一の発現ベクター及び本実施形態に係る第二の発現ベクターは、それぞれ独立して任意に選択することができる（以下、本実施形態に係る第一の発現ベクター及び本実施形態に係る第二の発現ベクターを「本実施形態に係る発現ベクター」と総称する）。また、本実施形態に係る発現ベクターは、宿主細胞として、エシェリヒア属に属する細菌等を用いる場合、プロモーター－オペレーター領域、開始コドン、終止コドン、及びターミネーター領域を含んでいてもよい。これらは、当業者において通常使用されるものを用いることができ、プロモーターとしては、Ｔ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター等が挙げられ、オペレーターとしては、Ｌａｃオペレーター等が挙げられる。
本実施形態に係る第一の発現ベクターは、第一の酵素をコードする遺伝子を含んでおり、原核細胞及び／又は真核細胞のいずれかの細胞中で第一の酵素を生産する機能を有するものであれば特に制限されない。また、本実施形態に係る第二の発現ベクターは、第二の酵素をコードする遺伝子を含んでおり、原核細胞及び／又は真核細胞のいずれかの細胞中で第二の酵素を生産する機能を有するものであれば特に制限されない。また、本実施形態に係る第一の発現ベクター及び本実施形態に係る第二の発現ベクターは、それぞれ独立して任意に選択することができる（以下、本実施形態に係る第一の発現ベクター及び本実施形態に係る第二の発現ベクターを「本実施形態に係る発現ベクター」と総称する）。また、本実施形態に係る発現ベクターは、宿主細胞として、エシェリヒア属に属する細菌等を用いる場合、プロモーター－オペレーター領域、開始コドン、終止コドン、及びターミネーター領域を含んでいてもよい。これらは、当業者において通常使用されるものを用いることができ、プロモーターとしては、Ｔ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター等が挙げられ、オペレーターとしては、Ｌａｃオペレーター等が挙げられる。
【0027】
これらの他にも、形質転換された宿主細胞を選抜することを可能とするマーカー遺伝子（抗生物質耐性遺伝子等）、第一の酵素をコードする遺伝子の転写を促進又は抑制する転写調節因子をコードする遺伝子等を含んでもよい。抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。転写調節因子をコードする遺伝子としては、例えば、第一の発現ベクターがオペレーターとしてＬａｃオペレーターを含む場合は、Ｌａｃリプレッサーを過剰発現するｌａｃＩｑ遺伝子等が挙げられる。
【0028】
本実施形態に係る発現ベクターは、プラスミドのみならず、例えば、人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドを用いてもよい。
本実施形態に係る発現ベクターを導入する宿主細胞としてエシェリヒア属に属する細菌を用いる場合、ベクターとしては、例えば、ｐＴｒｃ－ｌｕｘＲ（Ｙ． Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉk-aphｓｃｈｅｒｉ ＬｕｘＲ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ．１２２． ５３３－５３８ （２０１６））、Ｐｌｕｘ－ｓｆｇｆｐ－ＨＳＶｔｋ－ａｐｈ（Ｙ． Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ＬｕｘＲ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ Ｑｕｏｒｕｍ Ｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ＯＦＦ－Ｓｔａｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”， ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．９． ５６７－５７５ （２０２０））、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８（いずれもニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＥＴ２８ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ－６０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４８， ６６９ （１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ２７７ （１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８２， ４３０６ （１９８５）］、ｐＴｒＳ３０ ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２ ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７， Ｖｏｌ．７３， Ｎｏ．２０， ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００７， ７３：６３７８－６３８５）、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３， １０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（特開昭６３－２３３７９８号公報）等を挙げることができる。
上記のベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、Ｔ５プロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーター等のように人為的に設計改変されたプロモーターを用いることもできる。
本実施形態に係る発現ベクターを導入する宿主細胞としてエシェリヒア属に属する細菌を用いる場合、ベクターとしては、例えば、ｐＴｒｃ－ｌｕｘＲ（Ｙ． Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉk-aphｓｃｈｅｒｉ ＬｕｘＲ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ．１２２． ５３３－５３８ （２０１６））、Ｐｌｕｘ－ｓｆｇｆｐ－ＨＳＶｔｋ－ａｐｈ（Ｙ． Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ＬｕｘＲ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ Ｑｕｏｒｕｍ Ｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ＯＦＦ－Ｓｔａｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”， ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．９． ５６７－５７５ （２０２０））、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８（いずれもニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＥＴ２８ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ－６０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４８， ６６９ （１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ２７７ （１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８２， ４３０６ （１９８５）］、ｐＴｒＳ３０ ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２ ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７， Ｖｏｌ．７３， Ｎｏ．２０， ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００７， ７３：６３７８－６３８５）、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３， １０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（特開昭６３－２３３７９８号公報）等を挙げることができる。
上記のベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、Ｔ５プロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーター等のように人為的に設計改変されたプロモーターを用いることもできる。
【0029】
（細胞）
本実施形態に係る細胞は、第一の発現ベクター及び第二の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、当業者において通常使用される細菌等の原核細胞、動物細胞、真菌等の真核細胞等であってもよい。これらの細胞は、天然細胞であってもよく、組換え細胞であってもよい。本実施形態に係る細胞としては、例えば、原核生物又は酵母菌が好ましく、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属に属する細菌、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属に属する酵母菌がより好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）、 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ―、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２、若しくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ９６３７であるエシェリヒア属に属する細菌、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、若しくはＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓであるセラチア属に属する細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、若しくはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓであるバチルス属に属する細菌、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、若しくはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６であるブレビバクテリウム属に属する細菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、若しくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０であるコリネバクテリウム属に属する細菌、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４であるミクロバクテリウム属に属する細菌、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ－０１１０であるシュードモナス属に属する細菌、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであるサッカロマイセス属に属する酵母菌、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅであるシゾサッカロマイセス属に属する酵母菌、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓであるクルイベロミセス属に属する酵母菌、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓであるトリコスポロン属に属する酵母菌、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓであるシワニオミセス属に属する酵母菌、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであるピチア属に属する酵母菌、若しくはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓであるキャンディダ属に属する酵母菌が更に好ましい。
本実施形態に係る細胞は、第一の発現ベクター及び第二の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、当業者において通常使用される細菌等の原核細胞、動物細胞、真菌等の真核細胞等であってもよい。これらの細胞は、天然細胞であってもよく、組換え細胞であってもよい。本実施形態に係る細胞としては、例えば、原核生物又は酵母菌が好ましく、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属に属する細菌、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属に属する酵母菌がより好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）、 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ―、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２、若しくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ９６３７であるエシェリヒア属に属する細菌、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、若しくはＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓであるセラチア属に属する細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、若しくはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓであるバチルス属に属する細菌、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、若しくはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６であるブレビバクテリウム属に属する細菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、若しくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０であるコリネバクテリウム属に属する細菌、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４であるミクロバクテリウム属に属する細菌、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ－０１１０であるシュードモナス属に属する細菌、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであるサッカロマイセス属に属する酵母菌、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅであるシゾサッカロマイセス属に属する酵母菌、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓであるクルイベロミセス属に属する酵母菌、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓであるトリコスポロン属に属する酵母菌、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓであるシワニオミセス属に属する酵母菌、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであるピチア属に属する酵母菌、若しくはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓであるキャンディダ属に属する酵母菌が更に好ましい。
【0030】
本実施形態に係る第一の発現ベクターの細胞への導入（形質転換）及び第二の発現ベクターの細胞への導入（形質転換）は、特に制限されず、公知の方法で行うことができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ６９， ２１１０ （１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６， ６１２７ （１９８８）］、パーティクルガン法［Ｔ．Ｍ． Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．： Ｎａｔｕｒｅ， ３２７， ７０ （１９８７）．］ 、ＴＳＳ法［Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， Ｖｏｌ． ８６， ２１７２－２１７５ （１９８９）］、接合伝達法［Ｔｈｏｍａｓ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００５ Ｓｅｐ；３（９）：７１１－２１．］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等が挙げられる。
【0031】
第一の発現ベクター及び／又は第二の発現ベクターを細胞に導入した後、発現ベクター、細胞の種類等に応じて、当業者において通常行われる方法で、細胞培養、導入（形質転換）された細胞の選抜、第一の酵素の発現誘導、第二の酵素の発現誘導等を適宜行ってもよい。第一の酵素の発現誘導及び／又は第二の酵素の発現誘導の方法としては、例えば、Ｌａｃリプレッサーによって第一の酵素及び／又は第二の酵素の発現が抑制されている場合は、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によってＬａｃリプレッサーを阻害すること等が挙げられる。
【0032】
＜競合工程＞
競合工程では、第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費を競合させる。競合工程における競合は、第一の酵素、第二の酵素、Ｓ－アデノシルメチオニン、及び第二の酵素の基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）の存在下で行われ、必要であれば第一の酵素の基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）の存在下で行われてもよい。
競合工程では、第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費を競合させる。競合工程における競合は、第一の酵素、第二の酵素、Ｓ－アデノシルメチオニン、及び第二の酵素の基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）の存在下で行われ、必要であれば第一の酵素の基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）の存在下で行われてもよい。
【0033】
競合工程において、第一の酵素、第二の酵素、及びＳ－アデノシルメチオニンは、上記競合が適切に行われればよく、あらかじめ十分な量が存在していてもよく、適宜供給されてもよい。
【0034】
第一の酵素の基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）は、特に制限されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、第一の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応における基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）であってもよく、当該反応における基質であるか基質でないか不明な物質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）であってもよい。競合工程において、第一の酵素の基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）は、上記反応における、第一の酵素又はＳ－アデノシルメチオニンに対して十分な量が存在するように、あらかじめ十分な量が存在していてもよく、適宜供給されてもよい。
【0035】
第二の酵素の基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）とは、第二の酵素が触媒する、Ｓ－アデノシルメチオニンを消費する反応であって、蛍光及び／又は呈色を生じる反応における基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）のことをいう。第二の酵素の基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）としては、第二の酵素の種類に応じて適宜決定すればよく、例えば、第二の酵素がＳＵＭＴ活性を有する酵素であった場合、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩであってもよい。競合工程において、第二の酵素の基質（Ｓ－アデノシルメチオニンを除く）は、上記反応における、第二の酵素又はＳ－アデノシルメチオニンに対して十分な量が存在するように、あらかじめ十分な量が存在していてもよく、適宜供給されてもよい。
【0036】
競合工程は、必要に応じて第一の酵素の阻害物質の存在下で行われてもよい。第一の酵素の阻害物質は、第二の酵素が触媒する、Ｓ－アデノシルメチオニンを消費する反応であって、蛍光及び／又は呈色を生じる反応を阻害しなければ特に制限されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、第一の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応を阻害する物質であってもよく、当該反応を阻害するか阻害しないか不明な物質であってもよい。競合工程において、第一の酵素の阻害物質は、あらかじめ十分な量が存在していてもよく、適宜供給されてもよい。
【0037】
競合工程は特に制限されず、例えば、細胞内、無細胞系で行われてもよく、Ｓ－アデノシルメチオニン及び／又は第二の酵素の基質の生合成能を有する細胞内で行われてもよい。競合工程がＳ－アデノシルメチオニン及び／又は第二の酵素の基質の生合成能を有する細胞内で行われる場合、Ｓ－アデノシルメチオニン及び／又は第二の酵素の基質を、競合工程の前及び競合工程において、外部から供給しなくてもよい。例えば、第二の酵素がＳＵＭＴ活性を有する酵素であり、第二の酵素の基質がウロポルフィリノーゲンＩＩＩであり、エシェリヒア属に属する細菌等のＳ－アデノシルメチオニン及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩの生合成能を有する細胞内で競合工程が行われる場合、Ｓ－アデノシルメチオニン及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩを、競合工程の前及び競合工程において、外部から供給しなくてもよい。
【0038】
また、競合工程の反応時間、反応温度等の条件は、第一の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費及び第二の酵素が触媒する反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費の競合が適切に起きるように適宜設定されてよい。
【0039】
＜評価工程＞
評価工程では、競合工程における第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価する。蛍光及び／又は呈色の評価は、特に制限されず、蛍光及び／又は呈色の測定によるものであってもよく、蛍光及び／又は呈色の検出によるものであってもよい。
評価工程では、競合工程における第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価する。蛍光及び／又は呈色の評価は、特に制限されず、蛍光及び／又は呈色の測定によるものであってもよく、蛍光及び／又は呈色の検出によるものであってもよい。
【0040】
第二の酵素が触媒する反応の生成物に含まれる、蛍光を発する化合物及び／又は呈色反応を引き起こす化合物としては、特に制限されず、例えば、第二の酵素がＳＵＭＴ活性を有する酵素である場合、トリメチルピロコルフィンであってもよい。
【0041】
評価工程における蛍光の測定は、特に制限されず、蛍光を発する化合物に応じて、励起波長、蛍光波長、測定装置等を適宜設定し、蛍光強度等を測定してもよい。また、評価工程における蛍光の検出は、特に制限されず、蛍光を発する化合物に応じて、励起波長等を適宜設定し、蛍光を目視によって観察してもよい。例えば、第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応の生成物にトリメチルピロコルフィンが含まれる場合、波長３４０ｎｍ～３８０ｎｍ（極大は３５７ｎｍ）の励起光を照射して、波長６００ｎｍ～６４０ｎｍ（極大は６２０ｎｍ）における蛍光強度を、プレートリーダー、分光蛍光光度計で測定してもよく、波長３４０ｎｍ～３８０ｎｍ（極大は３５７ｎｍ）の励起光を照射して、桃色の蛍光を目視で観察してもよい。
【0042】
評価工程における呈色の測定は、特に制限されず、呈色反応を引き起こす化合物に応じて、呈色反応の条件、測定法、測定装置等を適宜設定してもよい。また、評価工程における呈色の検出は、特に制限されず、呈色反応を引き起こす化合物に応じて、呈色反応の条件等を適宜設定し、呈色を目視によって観察してもよい。
【0043】
評価工程において、第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により生じる蛍光及び／又は呈色が、第一の酵素が非存在であること以外は同一の条件における第二の酵素が触媒する反応により生じる蛍光及び／又は呈色と比較して、一定以上減弱している場合に、第一の酵素が活性を有すると判断してもよい。また、第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により生じる蛍光及び／又は呈色が、第一の酵素の基質が非存在であること以外は同一の条件における第二の酵素が触媒する反応により生じる蛍光及び／又は呈色と比較して、一定以上減弱している場合に、当該第一の酵素の基質に対して第一の酵素が活性を有すると判断してもよい。また、２種類以上の第一の酵素について、第一の酵素が異なること以外は同一の条件で第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価した場合、強い蛍光及び／又は呈色を示す第一の酵素の活性は相対的に低く、弱い蛍光及び／又は呈色を示す第一の酵素の活性は相対的に高いと評価してもよい。また、２種類以上の第一の酵素の基質について、第一の酵素の基質が異なること以外は同一の条件で第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価した場合、強い蛍光及び／又は呈色を示す第一の酵素の基質に対する第一の酵素の活性は相対的に低く、低い蛍光強度及び／又は呈色強度を示す第一の酵素の基質に対する第一の酵素の活性は相対的に高いと評価してもよい。また、２種類以上の第一の酵素、及び２種以上の第一の酵素の基質について、第一の酵素及び第一の酵素の基質が異なること以外は同一の条件で第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価した場合、強い蛍光及び／又は呈色を示す第一の酵素及び第一の酵素の基質の組み合わせにおける第一の酵素の活性は相対的に低く、低い蛍光強度及び／又は呈色強度を示す第一の酵素及び第一の酵素の基質の組み合わせにおける第一の酵素の活性は相対的に高いと評価してもよい。また、第一の酵素の阻害物質の存在下における第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により生じる蛍光及び／又は呈色が、第一の酵素の阻害物質が非存在であること以外は同一の条件における第二の酵素が触媒する反応により生じる蛍光及び／又は呈色と比較して、一定以上増強している場合に、当該第一の酵素の阻害物質は阻害作用を有していると判断してもよい。また、２種類以上の第一の酵素の阻害物質について、第一の酵素の阻害物質が異なること以外は同一の条件で第二の酵素が触媒するＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応により生じる蛍光及び／又は呈色を評価した場合、強い蛍光及び／又は呈色を示す第一の酵素の阻害物質の阻害作用は相対的に高く、低い蛍光強度及び／又は呈色強度を示す第一の酵素の阻害物質の阻害作用は相対的に低いと評価してもよい。
【0044】
また、第二の酵素が蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である場合、評価工程において蛍光タンパク質が発する蛍光を更に測定してもよい。この蛍光の測定は、特に制限されず、蛍光タンパク質に応じて、励起波長、蛍光波長、測定装置等を適宜設定し、蛍光強度を測定してもよい。また、この場合、評価工程において蛍光タンパク質に由来する蛍光強度に対する、第二の酵素が触媒する反応により生じる蛍光強度及び／又は呈色強度の比を算出してもよい。
【0045】
評価工程において、第二の酵素が蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である場合、上記比が、第一の酵素が非存在であること以外は同一の条件における当該比と比較して、一定以上小さい場合に、第一の酵素が活性を有すると判断してもよい。また、上記比が、第一の酵素の基質が非存在であること以外は同一の条件における当該比と比較して、一定以上小さい場合に、当該第一の酵素の基質に対して第一の酵素が活性を有すると判断してもよい。また、２種類以上の第一の酵素について、第一の酵素が異なること以外は同一の条件で上記比を算出した場合、大きい当該比を示す第一の酵素の活性は相対的に低く、小さい当該比を示す第一の酵素の活性は相対的に高いと評価してもよい。また、２種類以上の第一の酵素の基質について、第一の酵素の基質が異なること以外は同一の条件で上記比を算出した場合、大きい当該比を示す第一の酵素の基質に対する第一の酵素の活性は相対的に低く、小さい当該比を示す第一の酵素の基質に対する第一の酵素の活性は相対的に高いと評価してもよい。また、２種類以上の第一の酵素、及び２種以上の第一の酵素の基質について、第一の酵素及び第一の酵素の基質が異なること以外は同一の条件で上記比を算出した場合、大きい当該比を示す第一の酵素及び第一の酵素の基質の組み合わせにおける第一の酵素の活性は相対的に低く、小さい当該比を示す第一の酵素及び第一の酵素の基質の組み合わせにおける第一の酵素の活性は相対的に高いと評価してもよい。また、第一の酵素の阻害物質の存在下における上記比が、第一の酵素の阻害物質が非存在であること以外は同一の条件における上記比と比較して、一定以上大きい場合に、当該第一の酵素の阻害物質は阻害作用を有していると判断してもよい。また、２種類以上の第一の酵素の阻害物質について、第一の酵素の阻害物質が異なること以外は同一の条件で上記比を算出した場合、大きい当該比を示す第一の酵素の阻害物質の阻害作用は相対的に高く、小さい当該比を示す第一の酵素の阻害物質の阻害作用は相対的に低いと評価してもよい。
【0046】
また、第二の酵素が蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である場合、評価工程において蛍光タンパク質が発する蛍光を更に検出してもよい。この蛍光の検出は、特に制限されず、蛍光タンパク質に応じて、励起波長等を適宜設定し、蛍光を目視によって観察してもよい。また、この場合、評価工程において蛍光タンパク質に由来する蛍光並びに第二の酵素が触媒する反応により生じる蛍光及び／又は呈色が合わさった色相を検出してもよい。
【0047】
評価工程において、第二の酵素が蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である場合、上記色相が、第一の酵素が非存在であること以外は同一の条件における当該色相（初期色相）と比較して、蛍光タンパク質に由来する蛍光の色相に近い場合に、第一の酵素が活性を有すると判断してもよい。また、上記色相が、第一の酵素の基質が非存在であること以外は同一の条件における当該色相（初期色相）と比較して、蛍光タンパク質に由来する蛍光の色相に近い場合に、当該第一の酵素の基質に対して第一の酵素が活性を有すると判断してもよい。また、２種類以上の第一の酵素について、第一の酵素が異なること以外は同一の条件で上記色相を検出した場合、初期色相に近い色相を示す第一の酵素の活性は相対的に低く、蛍光タンパク質に由来する蛍光の色相に近い色相を示す第一の酵素の活性は相対的に高いと評価してもよい。また、２種類以上の第一の酵素の基質について、第一の酵素の基質が異なること以外は同一の条件で上記色相を検出した場合、初期色相に近い色相を示す第一の酵素の基質に対する第一の酵素の活性は相対的に低く、蛍光タンパク質に由来する蛍光の色相に近い色相を示す第一の酵素の基質に対する第一の酵素の活性は相対的に高いと評価してもよい。また、２種類以上の第一の酵素、及び２種以上の第一の酵素の基質について、第一の酵素及び第一の酵素の基質が異なること以外は同一の条件で上記色相を検出した場合、初期色相に近い色相を示す第一の酵素及び第一の酵素の基質の組み合わせにおける第一の酵素の活性は相対的に低く、蛍光タンパク質に由来する蛍光の色相に近い色相を示す第一の酵素及び第一の酵素の基質の組み合わせにおける第一の酵素の活性は相対的に高いと評価してもよい。また、第一の酵素の阻害物質の存在下における上記色相が、第一の酵素の阻害物質が非存在であること以外は同一の条件における上記色相と比較して、初期色相に近い場合に、当該第一の酵素の阻害物質は阻害作用を有していると判断してもよい。また、２種類以上の第一の酵素の阻害物質について、第一の酵素の阻害物質が異なること以外は同一の条件で上記色相を検出した場合、初期色相に近い色相を示す第一の酵素の阻害物質の阻害作用は相対的に高く、蛍光タンパク質に由来する蛍光の色相に近い色相を示す第一の酵素の阻害物質の阻害作用は相対的に低いと評価してもよい。
【0048】
＜キット＞
一実施形態に係る、酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキットは、ＳＵＭＴ活性を有する酵素、Ｓ－アデノシルメチオニン、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩを含む。上記キットは、更に、緩衝剤、チオール試薬（ジチオトレイトール等）、酵素安定剤、金属イオン、金属イオンキレート剤、プロテアーゼ阻害剤、及び塩（塩化ナトリウム等）を含んでもよい。上記キットの用途は、上述の本実施形態に係る第一の酵素の活性を評価する方法の用途と同様であってもよい。また、上記キットを用いた、酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性の評価は、当該酵素を第一の酵素、ＳＵＭＴ活性を有する酵素を第二の酵素として、上記競合工程及び上記評価工程を含んでもよい。また、上記キットにおいて、ＳＵＭＴ活性を有する酵素、Ｓ－アデノシルメチオニン、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩはいずれも、当該酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターが導入された細胞であって、Ｓ－アデノシルメチオニン、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩの生合成能を有する細胞内に存在していてもよい。この場合、上記キットは上記細胞を含んでもよい。上記キットが上記細胞を含む場合は、上記キットを用いた、酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性の評価は、当該酵素を第一の酵素、ＳＵＭＴ活性を有する酵素を第二の酵素、当該酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを第二の発現ベクターとして、更に上記第一導入工程を含んでもよい。
一実施形態に係る、酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキットは、ＳＵＭＴ活性を有する酵素、Ｓ－アデノシルメチオニン、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩを含む。上記キットは、更に、緩衝剤、チオール試薬（ジチオトレイトール等）、酵素安定剤、金属イオン、金属イオンキレート剤、プロテアーゼ阻害剤、及び塩（塩化ナトリウム等）を含んでもよい。上記キットの用途は、上述の本実施形態に係る第一の酵素の活性を評価する方法の用途と同様であってもよい。また、上記キットを用いた、酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性の評価は、当該酵素を第一の酵素、ＳＵＭＴ活性を有する酵素を第二の酵素として、上記競合工程及び上記評価工程を含んでもよい。また、上記キットにおいて、ＳＵＭＴ活性を有する酵素、Ｓ－アデノシルメチオニン、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩはいずれも、当該酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターが導入された細胞であって、Ｓ－アデノシルメチオニン、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩの生合成能を有する細胞内に存在していてもよい。この場合、上記キットは上記細胞を含んでもよい。上記キットが上記細胞を含む場合は、上記キットを用いた、酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性の評価は、当該酵素を第一の酵素、ＳＵＭＴ活性を有する酵素を第二の酵素、当該酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを第二の発現ベクターとして、更に上記第一導入工程を含んでもよい。
【0049】
別の実施形態に係る、酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性を評価するためのキットは、ＳＵＭＴ活性を有する酵素、Ｓ－アデノシルメチオニン、並びに５－アミノレブリン酸、ポルフォビリノーゲンシンターゼ（大腸菌ＨｅｍＢ等）、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（大腸菌ＨｅｍＣ等）、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼ（大腸菌ＨｅｍＤ等）を含む。上記キットにおいては、順にポルフォビリノーゲンシンターゼ（大腸菌ＨｅｍＢ等）、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（大腸菌ＨｅｍＣ等）、及びウロポルフィリノーゲンＩＩＩシンターゼによる反応を経て、５－アミノレブリン酸からウロポルフィリノーゲンＩＩＩが合成される。上記キットは、更に、緩衝剤、チオール試薬（ジチオトレイトール等）、酵素安定剤、金属イオン、金属イオンキレート剤、プロテアーゼ阻害剤、及び塩（塩化ナトリウム等）を含んでもよい。上記キットの用途は、上述の本実施形態に係る第一の酵素の活性を評価する方法の用途と同様であってもよい。また、上記キットを用いた、酵素のＳ－アデノシルメチオニンを消費する反応に対する活性の評価は、当該酵素を第一の酵素、ＳＵＭＴ活性を有する酵素を第二の酵素として、上記競合工程及び上記評価工程を含んでもよい。
【実施例0050】
以下、試験例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0051】
＜実施例１．ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光＞
（プラスミドの作成）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（大腸菌ＭＧ１６５５株）由来のＣｙｓＧ（Ａ）配列（配列番号２３）を含むプラスミドを鋳型に、配列番号１及び２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＣｙｓＧ（Ａ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐＴｒｃ－ｌｕｘＲ（Ｙ． Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＬｕｘＲ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ．１２２． ５３３－５３８ （２０１６））を鋳型に、配列番号３及び４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター部分に当たるＤＮＡ断片を増幅した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、プラスミドｐＴｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を取得した。
ｐＴｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を鋳型に、配列番号５及び６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｌａｃＩｑ遺伝子、ｔｒｃプロモーター、及びｃｙｓＧ（Ａ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、Ｐｌｕｘ－ｓｆｇｆｐ－ＨＳＶｔｋ－ａｐｈ（Ｙ． Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ＬｕｘＲ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ Ｑｕｏｒｕｍ Ｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ＯＦＦ－Ｓｔａｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”， ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．９． ５６７－５７５ （２０２０））を鋳型に、配列番号７及び８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター部分に当たるＤＮＡ断片を増幅した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を取得した。図１はｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）のプラスミドマップである。
（プラスミドの作成）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（大腸菌ＭＧ１６５５株）由来のＣｙｓＧ（Ａ）配列（配列番号２３）を含むプラスミドを鋳型に、配列番号１及び２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＣｙｓＧ（Ａ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐＴｒｃ－ｌｕｘＲ（Ｙ． Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＬｕｘＲ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ．１２２． ５３３－５３８ （２０１６））を鋳型に、配列番号３及び４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター部分に当たるＤＮＡ断片を増幅した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、プラスミドｐＴｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を取得した。
ｐＴｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を鋳型に、配列番号５及び６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｌａｃＩｑ遺伝子、ｔｒｃプロモーター、及びｃｙｓＧ（Ａ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、Ｐｌｕｘ－ｓｆｇｆｐ－ＨＳＶｔｋ－ａｐｈ（Ｙ． Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ＬｕｘＲ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ Ｑｕｏｒｕｍ Ｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ＯＦＦ－Ｓｔａｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”， ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．９． ５６７－５７５ （２０２０））を鋳型に、配列番号７及び８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター部分に当たるＤＮＡ断片を増幅した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を取得した。図１はｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）のプラスミドマップである。
【0052】
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法により形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。得られたＭＧ１６５５／ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含んだＬＢ液体培地にて３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ固体培地、並びに３０ｍｇ／ＬのＣｍ及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で１６時間培養した。
ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法により形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。得られたＭＧ１６５５／ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含んだＬＢ液体培地にて３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ固体培地、並びに３０ｍｇ／ＬのＣｍ及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で１６時間培養した。
【0053】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図２）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図２）。
【0054】
図２に示されるように、ＩＰＴＧによりＣｙｓＧ（Ａ）の発現を誘導した場合は、ＣｙｓＧ（Ａ）の発現を誘導してない場合と比べて、コロニーがより強い桃色の蛍光を呈した。よって、ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を大腸菌ＭＧ１６５５株に導入することにより、大腸菌ＭＧ１６５５株におけるＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性が強化され、トリメチルピロコルフィンの蛍光も増強されることが示された。
【0055】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
また、ＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表１に示す(小数点以下四捨五入)。
また、ＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表１に示す(小数点以下四捨五入)。
【0056】
【表1】
【0057】
表１に示されるように、上記検出と同様に、ＩＰＴＧによりＣｙｓＧ（Ａ）の発現を誘導した場合は、ＣｙｓＧ（Ａ）の発現を誘導してない場合と比べて、（蛍光強度／ＯＤ）が高かった。よって、（蛍光強度／ＯＤ）によって、生成された蛍光を発する化合物を測定可能であることが示された。また、（蛍光強度／ＯＤ）によって、生成された蛍光を発する化合物の定量解析が可能であることが示唆された。
【0058】
＜実施例２．カフェインシンターゼの活性の評価＞
（プラスミドの作成）
アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅｅ ａｒａｂｉｃａ）由来カフェインシンターゼ（ＣＣＳ１）をコードする人工合成された配列（配列番号２４）を含むプラスミドを鋳型に、配列番号９及び１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＣＣＳ１をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を鋳型に、配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター配列を増幅し線状化したＤＮＡ断片を取得した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ（ｐｒｅ）－ＣＣＳ１を取得した。
ｐＱＥ８０Ｌ（ｐｒｅ）－ＣＣＳ１を鋳型に、配列番号１３及び１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号１５及び１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、それぞれに対応した２つのＤＮＡ断片を増幅した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１を取得した。図３はｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１のプラスミドマップである。
また、対照実験用（Ｖｏｉｄ）に、ＣＣＳ１をコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａを準備した。ｐＴｒｃ９９ａは、ｐＱＥ８０Ｌと同じ複製起点、及び抗生物質耐性遺伝子を有し、ｐＱＥ８０Ｌと同様にｌａｃＩｑ遺伝子を有する。
（プラスミドの作成）
アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅｅ ａｒａｂｉｃａ）由来カフェインシンターゼ（ＣＣＳ１）をコードする人工合成された配列（配列番号２４）を含むプラスミドを鋳型に、配列番号９及び１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＣＣＳ１をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を鋳型に、配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター配列を増幅し線状化したＤＮＡ断片を取得した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ（ｐｒｅ）－ＣＣＳ１を取得した。
ｐＱＥ８０Ｌ（ｐｒｅ）－ＣＣＳ１を鋳型に、配列番号１３及び１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号１５及び１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、それぞれに対応した２つのＤＮＡ断片を増幅した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１を取得した。図３はｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１のプラスミドマップである。
また、対照実験用（Ｖｏｉｄ）に、ＣＣＳ１をコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａを準備した。ｐＴｒｃ９９ａは、ｐＱＥ８０Ｌと同じ複製起点、及び抗生物質耐性遺伝子を有し、ｐＱＥ８０Ｌと同様にｌａｃＩｑ遺伝子を有する。
【0059】
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンナトリウム（Ａｍｐ）及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＣＣＳ１の基質であるテオブロミンを０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンナトリウム（Ａｍｐ）及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＣＣＳ１の基質であるテオブロミンを０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
【0060】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図４）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図４）。
【0061】
図４に示されるように、ＩＰＴＧによりＣｙｓＧ（Ａ）及びＣＣＳ１の発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、テオブロミン濃度依存的にコロニーの蛍光が減弱した。コロニーの蛍光が減弱したのは、ＣＣＳ１の触媒するメチル化反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費、及びＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性によるＳ－アデノシルメチオニンの消費が競合したことにより、ＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンの生成量が減少したためであると考えられる。よって、ＣＣＳ１の活性が可視化されており、ＣＣＳ１の活性の検出が可能であるといえる。
【0062】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表２に示す(小数点以下四捨五入)。
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表２に示す(小数点以下四捨五入)。
【0063】
【表2】
【0064】
表２に示されるように、上記検出と同様に、ＩＰＴＧによりＣｙｓＧ（Ａ）及びＣＣＳ１の発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、テオブロミン濃度依存的にコロニーの（蛍光強度／ＯＤ）が小さくなった。よって、（蛍光強度／ＯＤ）によって、ＣＣＳ１の活性を測定可能であると示された。また、（蛍光強度／ＯＤ）によって、ＣＣＳ１の活性の定量解析が可能であることが示唆された。
【0065】
＜実施例３．Ｌ－ヒスチジンＮ－α－メチルトランスフェラーゼの活性の評価＞
（プラスミドの作成）
マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来Ｌ－ヒスチジンＮ－α－メチルトランスフェラーゼ（ＥｇｔＤ）をコードする配列（配列番号２５）を含むプラスミドを鋳型に、配列番号１７及び１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＥｇｔＤをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を鋳型に、配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター配列を増幅し線状化したＤＮＡ断片を取得した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ（ｐｒｅ）－ＥｇｔＤを取得した。
ｐＱＥ８０Ｌ（ｐｒｅ）－ＥｇｔＤを鋳型に、配列番号１３及び１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号１５及び１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、それぞれに対応した２つのＤＮＡ断片を増幅した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤを取得した。図５はｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤのプラスミドマップである。
また、対照実験用（Ｖｏｉｄ）に、ＥｇｔＤをコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａを準備した。
（プラスミドの作成）
マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来Ｌ－ヒスチジンＮ－α－メチルトランスフェラーゼ（ＥｇｔＤ）をコードする配列（配列番号２５）を含むプラスミドを鋳型に、配列番号１７及び１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＥｇｔＤをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を鋳型に、配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター配列を増幅し線状化したＤＮＡ断片を取得した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ（ｐｒｅ）－ＥｇｔＤを取得した。
ｐＱＥ８０Ｌ（ｐｒｅ）－ＥｇｔＤを鋳型に、配列番号１３及び１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号１５及び１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、それぞれに対応した２つのＤＮＡ断片を増幅した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤを取得した。図５はｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤのプラスミドマップである。
また、対照実験用（Ｖｏｉｄ）に、ＥｇｔＤをコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａを準備した。
【0066】
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＥｇｔＤの基質であるＬ－ヒスチジンを２ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＥｇｔＤの基質であるＬ－ヒスチジンを２ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
【0067】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図６）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図６）。
【0068】
図６に示されるように、ＩＰＴＧによりＣｙｓＧ（Ａ）及びＥｇｔＤの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、Ｌ－ヒスチジン濃度依存的にコロニーの蛍光が減弱した。コロニーの蛍光が減弱したのは、ＥｇｔＤの触媒するメチル化反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費、及びＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性によるＳ－アデノシルメチオニンの消費が競合したために、ＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンの生成量が減少したためであると考えられる。よって、ＥｇｔＤの活性が可視化されており、ＥｇｔＤの活性の検出が可能であるといえる。
【0069】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表３に示す(小数点以下四捨五入)。
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表３に示す(小数点以下四捨五入)。
【0070】
【表3】
【0071】
表３に示されるように、上記検出と同様に、ＩＰＴＧによりＣｙｓＧ（Ａ）及びＥｇｔＤの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、Ｌ－ヒスチジン濃度依存的にコロニーの（蛍光強度／ＯＤ）が小さくなった。よって、（蛍光強度／ＯＤ）によって、ＥｇｔＤの活性を測定可能であると示された。また、（蛍光強度／ＯＤ）によって、ＥｇｔＤの活性の定量解析が可能であることが示唆された。
【0072】
＜実施例４．Ｌ－ヒスチジンＮ－α－メチルトランスフェラーゼの変異体の活性の評価＞
（プラスミドの作成）
実施例３で作成したｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤを鋳型に、配列番号１９及び２０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２１及び２２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、それぞれに対応した２つのＤＮＡ断片を増幅した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（Ｃ． Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｏｎｅ ｐｏｔ， ｏｎｅ ｓｔｅｐ， ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ”， ＰＬｏＳ ＯＮＥ， Ｖｏｌ．３ ｅ３６４７ （２００８））により連結し、ＥｇｔＤのアミノ酸配列（配列番号２９）における２５２番目のメチオニン及び２８２番目のグルタミン酸がアラニンへ置換されたＥｇｔＤ（ＡＡ）（即ち、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードする配列（配列番号２６）を含むプラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）を取得した。この変異を持つＥｇｔＤ（ＡＡ）は本来の基質であるＬ－ヒスチジンに対する親和性が低下し、一方でＬ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンを基質として好むことが知られている（Ａ． Ｖｉｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｒｇｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＥｇｔＤ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｂｅｔａｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ Ｖｏｌ．１６ １１９－１２５ （２０１５））。図７はｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）のプラスミドマップである。
（プラスミドの作成）
実施例３で作成したｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤを鋳型に、配列番号１９及び２０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号２１及び２２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、それぞれに対応した２つのＤＮＡ断片を増幅した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法（Ｃ． Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｏｎｅ ｐｏｔ， ｏｎｅ ｓｔｅｐ， ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ”， ＰＬｏＳ ＯＮＥ， Ｖｏｌ．３ ｅ３６４７ （２００８））により連結し、ＥｇｔＤのアミノ酸配列（配列番号２９）における２５２番目のメチオニン及び２８２番目のグルタミン酸がアラニンへ置換されたＥｇｔＤ（ＡＡ）（即ち、配列番号３０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードする配列（配列番号２６）を含むプラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）を取得した。この変異を持つＥｇｔＤ（ＡＡ）は本来の基質であるＬ－ヒスチジンに対する親和性が低下し、一方でＬ－トリプトファン及びＬ－フェニルアラニンを基質として好むことが知られている（Ａ． Ｖｉｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｒｇｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＥｇｔＤ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｂｅｔａｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ Ｖｏｌ．１６ １１９－１２５ （２０１５））。図７はｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）のプラスミドマップである。
【0073】
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。得られたＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＥｇｔＤの基質であるＬ－ヒスチジンを４ｇ／Ｌ、ＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質であるＬ－トリプトファン５ｇ／Ｌ、又はいずれも不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。得られたＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＥｇｔＤの基質であるＬ－ヒスチジンを４ｇ／Ｌ、ＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質であるＬ－トリプトファン５ｇ／Ｌ、又はいずれも不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
【0074】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図８）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図８）。
【0075】
図８に示されるように、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてはＬ－ヒスチジン存在下においてコロニーの蛍光が顕著に減弱し、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてはＬ－トリプトファン存在下において顕著にコロニーの蛍光が減弱した。いずれの場合においても、コロニーの蛍光が減弱したのは、ＥｇｔＤ（ＡＡ）の触媒するメチル化反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費、及びＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性によるＳ－アデノシルメチオニンの消費が競合したために、ＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンの生成量が減少したためであると考えられる。よって、ＥｇｔＤ及びＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質特異性の差異がトリメチルピロコルフィンの蛍光により可視化されており、ＥｇｔＤ及びＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質特異性の差異が検出可能であるといえる。
【0076】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表４に示す(小数点以下四捨五入)。
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表４に示す(小数点以下四捨五入)。
【0077】
【表4】
【0078】
表４に示されるように、上記検出と同様に、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてはＬ－ヒスチジン存在下においてコロニーの（蛍光強度／ＯＤ）が小さくなり、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてはＬ－トリプトファン存在下においてコロニーの（蛍光強度／ＯＤ）が小さくなった。よって、（蛍光強度／ＯＤ）によって、ＥｇｔＤ及びＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質特異性の差異を測定可能であると示された。また、（蛍光強度／ＯＤ）によって、ＥｇｔＤ及びＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質特異性の差異の定量解析が可能であることが示唆された。
【0079】
＜実施例５．カフェインシンターゼの活性の評価２＞
（プラスミドの作成）
ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰをコードする配列（配列番号３５）を含むプラスミドを鋳型に、配列番号３１及び３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を鋳型に、配列番号３３及び３４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター配列を増幅し線状化したＤＮＡ断片を取得した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を取得した。本プラスミドにおいてｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ（配列番号３６）及びＣｙｓＧ（Ａ）は融合タンパク質ｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）として発現される。図９はｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）のプラスミドマップである。
（プラスミドの作成）
ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰをコードする配列（配列番号３５）を含むプラスミドを鋳型に、配列番号３１及び３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を鋳型に、配列番号３３及び３４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター配列を増幅し線状化したＤＮＡ断片を取得した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて連結し、プラスミドｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を取得した。本プラスミドにおいてｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ（配列番号３６）及びＣｙｓＧ（Ａ）は融合タンパク質ｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）として発現される。図９はｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）のプラスミドマップである。
【0080】
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおＣＣＳ１をコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＣＣＳ１の基質であるテオブロミンを０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおＣＣＳ１をコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＣＣＳ１の基質であるテオブロミンを０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
【0081】
（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ及びＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１０）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１０）。
【0082】
図１０に示されるように、ＩＰＴＧによりｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）のみの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてコロニーは黄色の蛍光を示したが、ｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）及びＣＣＳ１の発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、テオブロミンの濃度依存的に蛍光の色相が黄色から緑色へと変化し、０．５ｍＭのテオブロミン存在下においてコロニーは緑色の蛍光を示した。ＣＣＳ１の触媒するメチル化反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費、及びＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性によるＳ－アデノシルメチオニンの消費が競合したために、ＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンの生成量が減少し、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰとＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンが示す蛍光が重なった黄色から、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰの示す蛍光色が主となった緑色へと蛍光の色相が変化したと考えられる。よって、ＣＣＳ１の活性が蛍光の色相の変化として可視化されており、ＣＣＳ１の活性の検出が可能であるといえる。
【0083】
（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ及びＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にて４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ由来の蛍光）及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度で割った値（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）を表５に示す(小数点第５位を四捨五入)。
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にて４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ由来の蛍光）及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度で割った値（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）を表５に示す(小数点第５位を四捨五入)。
【0084】
【表5】
【0085】
表５に示されるように、ＩＰＴＧによりｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）及びＣＣＳ１の発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＣＣＳ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、テオブロミン濃度依存的にコロニーの（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）が小さくなった。よって、（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）によって、ＣＣＳ１の活性を測定可能であると示された。また、（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）によって、ＣＣＳ１の活性の定量解析が可能であることが示唆された。
【0086】
＜実施例６．Ｌ－ヒスチジンＮ－α－メチルトランスフェラーゼの活性の評価２＞
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおＥｇｔＤをコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＥｇｔＤの基質であるＬ－ヒスチジンを２ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおＥｇｔＤをコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で６時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＥｇｔＤの基質であるＬ－ヒスチジンを２ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
【0087】
（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ及びＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１１）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１１）。
【0088】
図１１に示されるように、ＩＰＴＧによりｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）のみの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてコロニーは黄色の蛍光を示したが、ｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）及びＥｇｔＤの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、Ｌ－ヒスチジン濃度依存的に蛍光の色相が黄色から緑色へと変化し、４ｇ／ＬのＬ－ヒスチジン存在下においてコロニーは緑色の蛍光を示した。ＥｇｔＤの触媒するメチル化反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費、及びＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性によるＳ－アデノシルメチオニンの消費が競合したために、ＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンの生成量が減少し、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰとＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンが示す蛍光が重なった黄色から、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰの示す蛍光色が主となった緑色へと蛍光の色相が変化したと考えられる。よって、ＥｇｔＤの活性が蛍光の色相の変化として可視化されており、ＥｇｔＤの活性の検出が可能であるといえる。
【0089】
（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ及びＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にて４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ由来の蛍光）及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度で割った値（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）を表６に示す(小数点第５位を四捨五入)。
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にて４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ由来の蛍光）及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度で割った値（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）を表６に示す(小数点第５位を四捨五入)。
【0090】
【表6】
【0091】
表６に示されるように、ＩＰＴＧによりｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）及びＥｇｔＤの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、Ｌ－ヒスチジン濃度依存的にコロニーの（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）が小さくなった。よって、（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）によって、ＥｇｔＤの活性を測定可能であると示された。また、（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）によって、ＥｇｔＤの活性の定量解析が可能であることが示唆された。
【0092】
＜実施例７．Ｌ－ヒスチジンＮ－α－メチルトランスフェラーゼの変異体の活性の評価２＞
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。得られたＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＥｇｔＤの基質であるＬ－ヒスチジンを４ｇ／Ｌ、ＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質であるＬ－トリプトファン５ｇ／Ｌ、又はいずれも不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。得られたＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＥｇｔＤの基質であるＬ－ヒスチジンを４ｇ／Ｌ、ＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質であるＬ－トリプトファン５ｇ／Ｌ、又はいずれも不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２１時間培養した。
【0093】
（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ及びＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１２）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１２）。
【0094】
図１２に示されるように、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてはＬ－ヒスチジン存在下においてコロニーの示す蛍光が非存在下の黄色から緑色へと変化し、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてはＬ－トリプトファン存在下においてコロニーの示す蛍光が非存在下の橙色から緑色へと変化した。よって、ＥｇｔＤ及びＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質特異性の差異が蛍光の色相の変化として可視化されており、ＥｇｔＤ及びＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質特異性の差異が検出可能であるといえる。
【0095】
（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ及びＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にて４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ由来の蛍光）及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度で割った値（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）を表７に示す(小数点第５位を四捨五入)。
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ社製）にて４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ由来の蛍光）及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度で割った値（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）を表７に示す(小数点第５位を四捨五入)。
【0096】
【表7】
【0097】
表７に示されるように、上記検出と同様に、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてはＬ－ヒスチジン存在下においてコロニーの（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）が小さくなり、ＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ（ＡＡ）＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてはＬ－トリプトファン存在下においてコロニーの（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）が小さくなった。よって、（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）によって、ＥｇｔＤ及びＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質特異性の差異を測定可能であると示された。また、（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）によって、ＥｇｔＤ及びＥｇｔＤ（ＡＡ）の基質特異性の差異の定量解析が可能であることが示唆された。
【0098】
＜実施例８．ドパミン－Ｏ－メチルトランスフェラーゼの活性の評価＞
（プラスミドの作成）
スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）属植物由来のドパミン－Ｏ－メチルトランスフェラーゼＮｐＮ４ＯＭＴ１（アミノ酸配列番号３７）をコードする人工合成された配列（配列番号３８）を含むプラスミドを鋳型に、配列番号４１及び４２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＮｐＮ４ＯＭＴ１をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐＱＥ８０Ｌ-ＥｇｔＤを鋳型に、配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター配列を増幅し線状化したＤＮＡ断片を取得した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ-ＮｐＮ４ＯＭＴ１を取得した。図１３はｐＱＥ８０Ｌ-ＮｐＮ４ＯＭＴ１のプラスミドマップである。
（プラスミドの作成）
スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）属植物由来のドパミン－Ｏ－メチルトランスフェラーゼＮｐＮ４ＯＭＴ１（アミノ酸配列番号３７）をコードする人工合成された配列（配列番号３８）を含むプラスミドを鋳型に、配列番号４１及び４２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＮｐＮ４ＯＭＴ１をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐＱＥ８０Ｌ-ＥｇｔＤを鋳型に、配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター配列を増幅し線状化したＤＮＡ断片を取得した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ-ＮｐＮ４ＯＭＴ１を取得した。図１３はｐＱＥ８０Ｌ-ＮｐＮ４ＯＭＴ１のプラスミドマップである。
【0099】
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ-ＮｐＮ４ＯＭＴ１、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおＮｐＮ４ＯＭＴ１をコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３．５時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の基質であるドパミンの塩酸塩を１ｍＭ又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２４時間培養した。
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ-ＮｐＮ４ＯＭＴ１、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおＮｐＮ４ＯＭＴ１をコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３．５時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の基質であるドパミンの塩酸塩を１ｍＭ又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２４時間培養した。
【0100】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１４）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１４）。
【0101】
図１４に示されるように、ＩＰＴＧによりＣｙｓＧ（Ａ）及びＮｐＮ４ＯＭＴ１の発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、ドパミン塩酸塩の添加依存的にコロニーの蛍光が減弱した。コロニーの蛍光が減弱したのは、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の触媒するメチル化反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費、及びＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性によるＳ－アデノシルメチオニンの消費が競合したために、ＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンの生成量が減少したためであると考えられる。よって、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の活性が可視化されており、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の活性の検出が可能であるといえる。
【0102】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、ＳＨ－９０００Ｌａｂ（コロナ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表８に示す(小数点以下四捨五入)。
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、ＳＨ－９０００Ｌａｂ（コロナ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表８に示す(小数点以下四捨五入)。
【0103】
【表8】
【0104】
表８に示されるように、上記検出と同様に、ＩＰＴＧによりＣｙｓＧ（Ａ）及びＮｐＮ４ＯＭＴ１の発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、Ｖｏｉｄと比較してドパミン塩酸塩の添加による顕著なコロニーの（蛍光強度／ＯＤ）の低下が確認された。よって、（蛍光強度／ＯＤ）によって、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の活性を測定可能であると示された。また、（蛍光強度／ＯＤ）によって、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の活性の定量解析が可能であることが示唆された。
【0105】
＜実施例９．ドパミン－Ｏ－メチルトランスフェラーゼの活性の評価２＞
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおＮｐＮ４ＯＭＴ１をコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３．５時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の基質であるドパミンの塩酸塩を１ｍＭ、又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２４時間培養した。
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおＮｐＮ４ＯＭＴ１をコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３．５時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の基質であるドパミンの塩酸塩を１ｍＭ、又は不含有のＬＢ固体培地であって、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２４時間培養した。
【0106】
（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ及びＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１５）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１５）。
【0107】
図１５に示されるように、ＩＰＴＧによりｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）のみの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてコロニーは橙色から桃色に近い蛍光色を示したが、ｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）及びＮｐＮ４ＯＭＴ１の発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、ドパミン塩酸塩の添加依存的に緑色側への蛍光の色相変化が観察された。ＮｐＮ４ＯＭＴ１の触媒するメチル化反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費、及びＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性によるＳ－アデノシルメチオニンの消費が競合したために、ＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンの生成量が減少し、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰとＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンが示す蛍光が重なった橙色から桃色に近い蛍光色から、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰの示す蛍光色が主となった緑色側へと蛍光の色相が変化したと考えられる。よって、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の活性が蛍光の色相の変化として可視化されており、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の活性の検出が可能であるといえる。
【0108】
（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ及びＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、ＳＨ－９０００Ｌａｂ（コロナ社製）にて４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ由来の蛍光）及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度で割った値（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）を表９に示す(小数点第５位を四捨五入)。
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、ＳＨ－９０００Ｌａｂ（コロナ社製）にて４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ由来の蛍光）及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度で割った値（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）を表９に示す(小数点第５位を四捨五入)。
【0109】
【表9】
【0110】
表９に示されるように、ＩＰＴＧによりｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）及びＮｐＮ４ＯＭＴ１の発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ＮｐＮ４ＯＭＴ１＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆｇｆｐ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、ドパミン塩酸塩の添加依存的にコロニーの（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）が小さくなった。よって、（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）によって、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の活性を測定可能であると示された。また、（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）によって、ＮｐＮ４ＯＭＴ１の活性の定量解析が可能であることが示唆された。
【0111】
＜実施例１０．Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼの活性の評価＞
（プラスミドの作成）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＳ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼＳｐｅＤ（アミノ酸配列番号３９。以下、単に「ＳｐｅＤ」ともいう。）をコードする配列（配列番号４０）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号４３及び４４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＳｐｅＤをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤを鋳型に、配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター配列を増幅し線状化したＤＮＡ断片を取得した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＳｐｅＤを取得した。図１６はｐＱＥ８０Ｌ－ＳｐｅＤのプラスミドマップである。
（プラスミドの作成）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＳ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼＳｐｅＤ（アミノ酸配列番号３９。以下、単に「ＳｐｅＤ」ともいう。）をコードする配列（配列番号４０）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号４３及び４４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＳｐｅＤをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。続いて、ｐＱＥ８０Ｌ－ＥｇｔＤを鋳型に、配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、発現ベクター配列を増幅し線状化したＤＮＡ断片を取得した。上記で得られた二つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｎａｐ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ－ＳｐｅＤを取得した。図１６はｐＱＥ８０Ｌ－ＳｐｅＤのプラスミドマップである。
【0112】
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおｓｐｅＤをコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３．５時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２４時間培養した。
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおｓｐｅＤをコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３．５時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２４時間培養した。
【0113】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１７）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１７）。
【0114】
図１７に示されるように、ＩＰＴＧによりＣｙｓＧ（Ａ）及びＳｐｅＤの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、ＣｙｓＧ（Ａ）のみの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）と比べてコロニーの蛍光が減弱した。コロニーの蛍光が減弱したのは、ＳｐｅＤの触媒する細胞内在のＳ－アデノシルメチオニンのみを基質としたＳ－アデノシルメチオニン脱炭酸反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費、及びＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性によるＳ－アデノシルメチオニンの消費が競合したために、ＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンの生成量が減少したためであると考えられる。よって、ＳｐｅＤの活性が可視化されており、ＳｐｅＤの活性の検出が可能であるといえる。
【0115】
（ＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、ＳＨ－９０００Ｌａｂ（コロナ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表１０に示す(小数点以下四捨五入)。
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、ＳＨ－９０００Ｌａｂ（コロナ社製）にてＯＤ５９５及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。その蛍光強度をＯＤ５９５で割った値（蛍光強度／ＯＤ）を表１０に示す(小数点以下四捨五入)。
【0116】
【表10】
【0117】
表１０に示されるように、上記検出と同様に、ＩＰＴＧによりＣｙｓＧ（Ａ）及びＳｐｅＤの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、Ｖｏｉｄと比較して顕著なコロニーの（蛍光強度／ＯＤ）の低下が確認された。よって、（蛍光強度／ＯＤ）によって、ＳｐｅＤの活性を測定可能であると示された。また、（蛍光強度／ＯＤ）によって、ＳｐｅＤ活性の定量解析が可能であることが示唆された。
【0118】
＜実施例１１．Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼの活性の評価２＞
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおＳｐｅＤをコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３．５時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２４時間培養した。
（プラスミドの大腸菌への導入等）
ｐＴｒｃ９９ａ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）、並びにｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ、及びｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）で、大腸菌ＭＧ１６５５株をエレクトロポレーション法によりそれぞれ形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）を得た。なおＳｐｅＤをコードする遺伝子を含まないｐＴｒｃ９９ａは対照実験用（Ｖｏｉｄ）として準備された。得られたＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）及びＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）をそれぞれ１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ及び３０ｍｇ／ＬのＣｍを含んだＬＢ液体培地にて３７℃で３．５時間振とう培養した。得られた培養液を希釈し、１００ｍｇ／ＬのＡｍｐ、３０ｍｇ／ＬのＣｍ、及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含んだＬＢ固体培地へそれぞれ播種し、３０℃で２４時間培養した。
【0119】
（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ及びＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の検出）
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１８）。
培養終了後、生育したコロニーを３６５ｎｍの紫外線ランプ下に置き、写真を撮影した（図１８）。
【0120】
図１８に示されるように、ＩＰＴＧによりｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）のみの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＴｒｃ９９ａ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においてコロニーは橙色から桃色に近い蛍光色を示したが、ｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）及びＳｐｅＤの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｓｆＧＦＰ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、緑色の蛍光への色相変化が観察された。ＳｐｅＤの触媒する細胞内在のＳ－アデノシルメチオニンのみを基質としたＳ－アデノシルメチオニン脱炭酸反応によるＳ－アデノシルメチオニンの消費、及びＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性によるＳ－アデノシルメチオニンの消費が競合したために、ＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンの生成量が減少し、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰとＣｙｓＧ（Ａ）のＳＵＭＴ活性による蛍光産物であるトリメチルピロコルフィンが示す蛍光が重なった橙色から桃色に近い蛍光色から、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰの示す蛍光色が主となった緑色側への蛍光の色相が変化したと考えられる。よって、ＳｐｅＤの活性が蛍光の色相の変化として可視化されており、ＳｐｅＤの活性の検出が可能であるといえる。
【0121】
（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ及びＣｙｓＧ（Ａ）により生じる蛍光の測定）
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、ＳＨ－９０００Ｌａｂ（コロナ社製）にて４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ由来の蛍光）及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度で割った値（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）を表１１に示す(小数点第５位を四捨五入)。
またＬＢ固体培地からコロニーを生理食塩水へかきとり、ＳＨ－９０００Ｌａｂ（コロナ社製）にて４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ由来の蛍光）及び３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度（ＣｙｓＧ（Ａ）由来の蛍光）を測定した。３５９ｎｍで励起した際の波長６２０ｎｍの蛍光強度を４８５ｎｍで励起した際の波長５３５ｎｍの蛍光強度で割った値（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）を表１１に示す(小数点第５位を四捨五入)。
【0122】
【表11】
【0123】
表１１に示されるように、上記検出と同様に、ＩＰＴＧによりｓｆＧＦＰ－ＣｙｓＧ（Ａ）及びＳｐｅＤの発現を誘導したＭＧ１６５５／ｐＱＥ８０Ｌ－ｓｐｅＤ＋ｐ１５Ａ－Ｐｔｒｃ－ｃｙｓＧ（Ａ）においては、Ｖｏｉｄと比較して顕著なコロニーの（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）の低下が確認された。よって、（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）によって、ＳｐｅＤの活性を測定可能であると示された。また、（ＣｙｓＧ（Ａ）蛍光強度／ＧＦＰ蛍光強度）によって、ＳｐｅＤの活性の定量解析が可能であることが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】