特開 2025-41721 ＰＰ２Ａアンカリングの阻害による心疾患の処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025041721

(43)【公開日】2025-03-26

(54)【発明の名称】ＰＰ２Ａアンカリングの阻害による心疾患の処置

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20250318BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20250318BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250318BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20250318BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20250318BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20250318BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20250318BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20250318BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61P9/04 ZNA

A61P43/00 111

A61K35/76

A61K38/16 200

C12N9/12

C12N15/54

A61P9/04

A61K48/00 ZNA

C12N15/864 100Z

【審査請求】有

【請求項の数】18

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024221257

(22)【出願日】2024-12-18

(62)【分割の表示】P 2021568509の分割

【原出願日】2020-03-13

(31)【優先権主張番号】62/848,156

(32)【優先日】2019-05-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521498999

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ マイアミ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＡＭＩ

(71)【出願人】

【識別番号】516162733

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】カピロフ，マイケル エス．

(72)【発明者】

【氏名】リ，ジンリャン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】駆出率が低下した心不全を処置する方法を提供する。
【解決手段】方法は、ＰＰ２ＡのｍＡＫＡＰβへのアンカリングを阻害する薬学的有効量の組成物を、そうした障害のリスクを有する患者に投与することで行われる。この組成物は、好ましくは、ＰＰ２Ａが結合するｍＡＫＡＰβのフラグメントをコードするウイルスに基づく遺伝子治療ベクターの形態である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２２又は配列番号２３の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する分子又はその断片をコードする核酸を含み、
前記分子は、プロテイン（セリン－スレオニン）ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の脱リン酸活性を阻害して、血清応答因子（ＳＲＦ）におけるリン酸化レベルを維持する、心不全を処置するための組成物。

【請求項2】

前記核酸は、配列番号２２又は配列番号２３の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する分子又はその断片をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記核酸は、配列番号２２又は配列番号２３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する分子又はその断片をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記核酸は、配列番号２２又は配列番号２３の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する分子をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記核酸は、配列番号２２又は配列番号２３の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する分子をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記核酸は、配列番号２２又は配列番号２３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する分子をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

前記核酸は、配列番号２２又は配列番号２３の配列の分子をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記核酸は、ヒト筋肉Ａ－キナーゼアンカータンパク質（ｍＡＫＡＰ）のアミノ酸２１３２～２３１９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する分子又はその断片をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記核酸は、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する分子又はその断片をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記核酸は、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する分子又はその断片をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

前記核酸は、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する分子をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記核酸は、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する分子をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

前記核酸は、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する分子をコードする、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

前記核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項15】

前記ＡＡＶは、ＡＡＶ９である、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記分子は、ＰＰ２ＡのＢ５６δ（ＰＰＰ２Ｒ５Ｄ）のリン酸化を阻害する、請求項１に記載の組成物。

【請求項17】

前記ＳＲＦのリン酸化は、Ｓｅｒ^１０３のリン酸化である、請求項１に記載の組成物。

【請求項18】

前記心不全は、駆出率が低下した心不全である、請求項１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
この出願は、２０１９年５月１５日に出願した米国仮特許出願第６２／８４８，１５６
号の優先権を主張し、その全体が言及によって本願に援用され、この出願は、２０１５年
８月７日に出願した米国特許出願第１４／８２１，０８２号であり、現在は２０１８年４
月１０日に発行された米国特許第９，９３７，２２８号、２０１４年３月１４日に出願し
た米国特許出願第１４／２１３，５８３号であり、現在は２０１５年９月１５日に発行さ
れた米国特許第９，１３２，１７４号、２０１８年７月５日に出願した米国特許出願第１
６／０２８，００４号、２０１３年３月１５日に出願した米国仮特許出願第６１／７９８
，２６８号、及び２０１７年７月６日に出願した米国仮特許出願第６２／５２９，２２４
号の全体を言及によって援用する。

【0002】

［政府支援についての記載］
この発明は、米国国立衛生研究所により与えられた契約番号ＲＯ１ ＨＬ ０７５３９
８及びＨＬ１２６８２５のもと政府支援により実現した。政府は本発明の所定の権利を有
する。

【背景技術】

【0003】

慢性ストレスを受けると、心臓の主な代償機序は、収縮性細胞体積の非有糸分裂的な増
加である筋細胞肥大となる（Ｈｉｌｌ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ ２００８）。成人の哺乳動
物筋細胞はおよそ円筒状であり、幅又は長さ方向の成長をすることができる。筋細胞は心
臓の心筋量の大部分に寄与するので（Ｊｕｇｄｕｔｔ ２００３）、心筋細胞の求心性及
び偏心性肥大が、それぞれ心室壁の肥厚及び心室の拡張をもたらす。理論上、筋節の並行
構造に関与する幅方向の「求心性」筋細胞成長により、心室壁ストレスが低下する一方（
Ｌａｗ ｏｆ ＬａＰｌａｃｅ）、筋節の連続構造に関与する「偏心性」の長さ方向の筋
細胞成長は、収縮における最適な長さを超えて個々の筋節を伸張することなく、より大き
な心室容積に適応することができる（長さ－張力関係）（Ｇｒｏｓｓｍａｎ， Ｊｏｎｅ
ｓ， ａｎｄ ＭｃＬａｕｒｉｎ １９７５）。左心室は、妊娠又は運動訓練などの生理
的ストレスを受けて比較的対称に肥大する一方、求心性心室肥大は、高血圧又は大動脈狭
窄などの圧負荷疾患において存在する収縮期壁ストレスの増加に対する主な初期の応答で
ある。偏心性心室肥大は、心筋梗塞後に起こるものなど容積負荷の状態において、及び、
求心性肥大から、圧負荷によって主に特徴づけられる疾患を含む、心血管疾患のある形態
における駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）における拡張した心臓への移行において
、優勢である。また、偏心性及び求心性肥大は、それぞれ遺伝性肥大型及び拡張型心筋症
に存在する。

【0004】

細胞レベルにおいて、心筋細胞肥大は、個々の筋細胞内のタンパク質合成並びに筋節の
サイズ及び組織化の増大の結果として起こる。心臓リモデリング及び肥大のより充実した
考察については、Ｋｅｈａｔ（２０１０）及びＨｉｌｌ（２００８）のものが参照され、
それぞれの全体が本明細書において言及により援用される。有力な見方は、心肥大が心不
全の発症に主要な役割を果たすというものである。心不全を処置する従来の方法は、罹患
した患者における、後負荷軽減、βアドレナリン受容体（β－ＡＲ）の阻害、機械的サポ
ートデバイスの使用を含む。しかしながら、この技術は、病的な心肥大を予防又は処置す
るさらなる機序を必要としている。

【0005】

研究において、圧負荷関連心疾患の早期に「代償性」求心性肥大を誘発する機序が、心
臓を後の収縮期機能障害及び最終的な不全にしやすくすることが示唆されている（Ｓｃｈ
ｉａｔｔａｒｅｌｌａ ａｎｄ Ｈｉｌｌ ２０１５）。これに関して、ＲＳＫ３－ｍＡ
ＫＡＰβ複合体の標的化により、圧負荷による心臓リモデリングを抑え、心不全を防止し
得るということが、結果において示されている（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１
４；Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）。つまり、求心性肥大を含む
、リモデリングを誘発するシグナリング経路の阻害が、圧負荷疾患の早期に望ましいもの
であり得る。しかしながら、心臓が、圧負荷関連疾患の後期、又は容積負荷関連疾患の進
行においても、ＨＦｒＥＦをもたらす偏心性成長及び心室拡大によって特徴づけられる疾
患プロセスの段階にあるとき、求心性肥大を促進し、偏心性肥大に対抗するシグナルを維
持する取り組みにより、心臓容積及び惹起したときの収縮を保持し得るかどうか、という
疑問が残る。さらに、家族性拡張型心筋症における求心性筋細胞肥大の亢進及び／又は偏
心性筋細胞肥大の阻害が有益であり得るかは未知である。

【0006】

ＡＫＡＰ及び心臓リモデリング
心室筋細胞肥大は、心筋が心筋梗塞、高血圧、及び先天性心疾患、又は神経液性活性化
のためストレスを受けると心室壁張力を軽減する、主要な代償性機構である。これは、心
筋細胞の非分裂成長、筋原線維組織化、及び胚性期時に通常発現される「胎児」遺伝子の
特定のサブセットの上方調節（Ｆｒｅｙ ２００４，Ｈｉｌｌ ２００８）に関連する。
同時的な異常心臓収縮、Ｃａ^２＋ハンドリング、及び心筋エネルギーは、間質性線維症及
び心筋細胞死を含むとともに、心不全及び悪性不整脈を発症するリスクを増加させる不適
応性変化に関連する（Ｃａｐｐｏｌａ ２００８，Ｈｉｌｌ ２００８）。この適応は、
共に、根底にある疾患に対応して様々な比率で存在する収縮期及び拡張期の両方の機能障
害に寄与する（Ｓｈａｒｍａ ａｎｄ Ｋａｓｓ ２０１４）。筋細胞の病的なリモデリ
ングは、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、環状ヌクレオチド、Ｃａ
^２＋、低酸素、及びホスホイノシチド依存性シグナリング経路を含む複雑な細胞内シグナ
リングネットワークによって調節されている（Ｈｅｉｎｅｋｅ ａｎｄ Ｍｏｌｋｅｎｔ
ｉｎ ２００６）。

【0007】

米国において、喫煙や肥満などのリスク因子により有病率が増加したため、心不全は６
２０万の成人に発症しており、年間約１，０００，０００の成人における新しい症例が診
断されている（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ． ２０１９）。心不全の有病率及び発症
率は増加しており、これは、主に寿命延長のためであるが、リスク因子（高血圧、糖尿病
、脂質異常症、及び肥満）の有病率増加、及び他の種類の心血管疾患（心筋梗塞［ＭＩ］
及び不整脈）の生存率増加のためでもある（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ． ２
０１３）。心不全の患者の第一選択療法は、そうした患者の生存性及びクオリティ・オブ
・ライフを向上するとともに、左心室機能障害を有する患者の死亡率を下げることができ
るアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤及びβ－アドレナリン受容体遮断剤（β－
遮断剤）を含む（Ｇｒｏｕｐ １９８７）。その次の又は代替の療法は、アルドステロン
及びアンジオテンシンＩＩ受容体遮断剤、ネプリライシン阻害剤、ループ利尿剤及びチア
ジド利尿剤、血管拡張剤、及びＩ_ｆ電流遮断剤、並びにデバイス使用療法を含む（（Ｐｏ
ｎｉｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０１６）。それにもかかわらず、症候性心不全の５
年死亡率は依然として約５０％であり、ＭＩ後の４０％を超える死亡率を含む（Ｈｅｉｄ
ｅｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ． ２０１３； Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１６）
。

【0008】

心肥大は、Ｇタンパク質結合受容体、サイトカイン受容体、及び成長因子チロシンキナ
ーゼ受容体を含むいくつかの受容体ファミリーを活性化させる多様な神経液性、パラクラ
イン性、及びオートクライン性刺激によって誘発され得る（Ｂｒｏｗｎ ２００６，Ｆｒ
ｅｙ ２００４）。この文脈において、Ａ－キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）が
、これらの受容体から発する肥大経路を統合する多タンパク質複合体を会合させることが
できるということが徐々に明らかになっている。特に、近年の研究において、足場タンパ
ク質として機能するとともにストレスシグナルによって活性化される肥大経路を組織化し
て調節するのに中心的な役割を果たすｍＡＫＡＰ、ＡＫＡＰ－Ｌｂｃ、及びＤ－ＡＫＡＰ
１を含むアンカータンパク質を現在のところ同定している。

【0009】

細胞内シグナリングネットワークにおける「ノード」のまとめ役として、足場タンパク
質は、可能性のある治療標的として興味の対象となっている（Ｎｅｇｒｏ，Ｄｏｄｇｅ－
Ｋａｆｋａ，ａｎｄ Ｋａｐｉｌｏｆｆ ２００８）。細胞において、足場タンパク質は
、細胞内シグナル伝達における特異性及び有効性の要因となる重要な機構を構成する「シ
グナロソーム」と呼ばれる多分子複合体を組織化することができる（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ
Ｐａｗｓｏｎ ２００９）。第１に、多くのシグナリング酵素が広い基質特異性を有し
ている。足場タンパク質は、これらの多面発現性酵素を個々の基質と共に局在させて、基
質の触媒を選択的に向上させるとともに、酵素の活性部位に固有でないある程度の特異性
を与える（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｐａｗｓｏｎ ２００９）。第２に、一部のシグナリン
グ酵素は低含量である。足場タンパク質は、希少酵素をその基質と共に局在させることが
でき、シグナリングを動態学的に有利にする。第３に、多くの足場が多価であるので、足
場結合により、個々の基質エフェクターの複数の酵素による共調節を統括することができ
る。筋肉Ａ－キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ６としても既知のｍＡＫＡＰ）は、
広い基質特異性を有するプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）及びＣａ^２＋／カルモジュリン
依存性ホスファターゼカルシニューリン（ＣａＮ）などのシグナリング酵素と、特に低含
量であるｐ９０リボソームＳ６キナーゼ３（ＲＳＫ３）などのシグナリング酵素との両方
に結合する、心筋細胞及び骨格筋細胞並びにニューロンに発現される大きい足場である（
図１）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１５；Ｐａｒｅ， Ｅａｓｌｉｃｋ， ｅｔ ａ
ｌ． ２００５；Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００５ａ；Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ
ａｌ． １９９９ｂ）。ｍＡＫＡＰβは、筋細胞に発現される選択的スプライシングアイ
ソフォームであり、細胞において、内在性膜タンパク質のネスプリン－１αを結合するこ
とで核膜外膜に局在する（Ｐａｒｅ， Ｅａｓｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ． ２００５）。

【0010】

心筋細胞におけるストレス関連シグナリング分子の足場タンパク質としてのその役割に
一致して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるラットの新生仔心室筋細胞におけるｍＡＫＡＰβ欠
乏により、α－アドレナリン、β－アドレナリン、エンドセリン－１、アンジオテンシン
ＩＩ、及びロイシン阻害因子／ｇｐ１３０受容体シグナリングによって誘発される肥大を
阻害した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１１；Ｐａｒｅ， Ｂａｕｍａｎ， ｅｔ
ａｌ． ２００５；Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｇｕｏ ｅｔ
ａｌ． ２０１５）。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、マウスにおけるｍＡＫＡＰ遺伝子標的化
は、短期圧負荷及び慢性β－アドレナリン刺激によって誘発される肥大を抑えるとともに
、長期圧負荷後の心不全の発症を阻害して、生存の恩恵があった（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ
ａｌ． ２０１４）。具体的に、ｍＡＫＡＰ^{ｆｌ／ｆｌ}、Ｔｇ（Ｍｙｈ６－ｃｒｅ／Ｅ
ｓｒ１＊）、タモキシフェン誘発性の、コンディショナルノックアウトマウスにおけるｍ
ＡＫＡＰ遺伝子欠失により、１６週間の大動脈縮窄による筋細胞アポトーシス、及び間質
性線維症、左心房肥大、及び肺水腫（浮腫肺重量）を大きく阻害しながら、左心室肥大を
低下させた（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。

【0011】

また、ｍＡＫＡＰ遺伝子標的化は、心筋梗塞後に有益である（Ｋａｐｉｌｏｆｆ，未掲
載の知見）。マウスにおける左前下行枝（ＬＡＤ）の永続的な結紮により、広範な筋細胞
死、瘢痕形成、及びその後の左心室（ＬＶ）リモデリングを含む、心筋梗塞を起こす。Ｌ
ＡＤ結紮の４週後、ｍＡＫＡＰコンディショナルノックアウトマウスは、梗塞のコントロ
ールコホートと比較すると、ＬＶの寸法及び機能を保持した。ｍＡＫＡＰコンディショナ
ルノックアウトマウスは、梗塞サイズの顕著な減少を示しながら、コントロールと比較し
てＬＶの駆出率及び指標心房重量を保持した。

【0012】

ｍＡＫＡＰ及び心臓リモデリングの説明
ｍＡＫＡＰは、当初、新たなｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）調節サブユ
ニット（Ｒサブユニット）結合タンパク質、すなわち、Ａ－キナーゼアンカータンパク質
又はＡＫＡＰのｃＤＮＡライブラリスクリーニングにおいて同定された（Ｍｃｃａｒｔｎ
ｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９５）。ｍＡＫＡＰは、初め、当初のｃＤＮＡフラグメントに
よってコードされるタンパク質のサイズから、「ＡＫＡＰ１００」と呼ばれていた（Ｍｃ
ｃａｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９５）。その後、ニューロンに発現されるｍＡＫＡ
Ｐの選択的スプライシングアイソフォームであるｍＡＫＡＰαの全長ｍＲＮＡ配列を規定
し、野生型ｍＡＫＡＰαは２５５ｋＤＡの足場であることを明らかにした（Ｋａｐｉｌｏ
ｆｆ ｅｔ ａｌ． １９９９ｂ）。横紋筋細胞に発現されるｍＡＫＡＰの２３０ｋＤａ
の選択的スプライシングアイソフォームであるｍＡＫＡＰβの配列は後に取得され、ｍＡ
ＫＡＰは、心臓又は骨格筋に発現されると、ｍＡＫＡＰα残基Ｍｅｔ－２４５に対応する
内部開始部位から移動するということを示した（Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００５
ａ）。

【0013】

ｍＡＫＡＰは、ｍＡＫＡＰを明らかに発現する３つの細胞型である、ニューロン並びに
心臓及び骨格横紋筋細胞の両方の核膜に局在する（図６）（Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａ
ｌ． １９９９ｂ；Ｐａｒｅ， Ｅａｓｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｍｉｃｈ
ｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００５ａ）。ｍＡＫＡＰは、膜貫通ドメインタンパク質ではなく
、局在化をもたらす３つのスペクトリン様反復領域（残基７７２～１１８７）を含むもの
である（Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． １９９９ｂ）。核膜外膜タンパク質ネスプリ
ン－１αによる、ｍＡＫＡＰの第３スペクトリン反復（残基１０７４～１１８７）の結合
は、少なくとも筋細胞において、及び異種細胞に発現されるとき、ｍＡＫＡＰの核膜局在
化に必要且つ十分なものである（Ｐａｒｅ， Ｅａｓｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ．２００５
）。また、ネスプリン－１αは、Ａ型ラミン及びエメリンを結合し得る核膜内膜に存在し
得る。興味深いことに、ラミンＡ／Ｃ、エメリン、及びネスプリン－１αにおける突然変
異は、エメリー－ドレイフス型筋ジストロフィー、及び他の形態の心筋症に関連している
（Ｂｏｎｎｅ ｅｔ ａｌ． １９９９；Ｆａｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９９；Ｍｕ
ｃｈｉｒ ｅｔ ａｌ． ２０００；Ｂｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ． １９９４；Ｚｈａｎｇ
ｅｔ ａｌ． ２００７）。しかしながら、疾患を引き起こす突然変異は、ヒトｍＡＫ
ＡＰ遺伝子においてまだ同定されておらず、発育早期におけるマウス心臓のｍＡＫＡＰβ
ノックアウトは心筋症を誘発しない（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。また
、ｍＡＫＡＰβは、ネスプリン－１αを結合することに加えて、ｍＡＫＡＰの第１スペク
トリン反復によってホスホリパーゼＣε（ＰＬＣε）を結合し、核膜との会合を強化して
いる可能性がある（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。ｍＡＫＡＰβが筋小胞体に
存在するという早期の報告がある（Ｍｃｃａｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９５；Ｍａ
ｒｘ ｅｔ ａｌ． ２０００；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９８）が、これらの知見
は、抗体特異性を含む技術的問題から、疑問視されている（Ｋａｐｉｌｏｆｆ， Ｊａｃ
ｋｓｏｎ， ａｎｄ Ａｉｒｈａｒｔ ２００１；Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． １
９９９ｂ）。

【0014】

ｍＡＫＡＰβは、ＰＫＡ、ＰＬＣε、及びネスプリン－１αに加えて、アデニリルシク
ラーゼタイプ５（ＡＣ５）、ｃＡＭＰ－１によって活性化する交換タンパク質（Ｅｐａｃ
１）、ｃＡＭＰ特異性ホスホジエステラーゼタイプ４Ｄ３（ＰＤＥ４Ｄ３）、ＭＥＫ５及
びＥＲＫ５ ＭＡＰ－キナーゼ、３－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１（
ＰＤＫ１）、ｐ９０リボソームＳ６キナーゼ３（ＲＳＫ３）、プロテインキナーゼＣε（
ＰＫＣε）、プロテインキナーゼＤ（ＰＫＤ１、ＰＫＣμ）、プロテインホスファターゼ
カルシニューリン（ＣａＮ）Ａβ及びＰＰ２Ａ、タイプ２リアノジン受容体（ＲｙＲ２）
、ナトリウム／カルシウム交換体ＮＣＸ１、ＨＩＦ１α調節に関与するユビキチンＥ３－
リガーゼ、並びにミオポディン（ｍｙｏｐｏｄｉｎ）（Ｐａｒｅ， Ｂａｕｍａｎ， ｅ
ｔ ａｌ． ２００５；Ｐａｒｅ， Ｅａｓｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｄｏ
ｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ． ２０００；Ｋ
ａｐｉｌｏｆｆ， Ｊａｃｋｓｏｎ， ａｎｄ Ａｉｒｈａｒｔ ２００１；Ｍｉｃｈｅ
ｌ ｅｔ ａｌ． ２００５ａ；Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０
０８；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１１；Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ａｎｄ Ｋａｐ
ｉｌｏｆｆ ２００６；Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ． ２０１２；Ｆａｕｌ ｅｔ ａｌ
． ２００７；Ｓｃｈｕｌｚｅ ｅｔ ａｌ． ２００３；Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａ
ｌ． ２００９；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１３）という、筋細胞ストレス応答に
重要な多種多様なタンパク質を結合する。これらのシグナリング分子は、ｍＡＫＡＰβに
結合して、転写因子の低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１α）、筋細胞エンハンサー因子－２
（ＭＥＦ２）、及び活性化Ｔ細胞の核内因子（ＮＦＡＴｃ）転写因子、並びにタイプＩＩ
ヒストンデアセチラーゼ（図７）（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４；Ｌｉ，
Ｖａｒｇａｓ， ｅｔ ａｌ． ２０１３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０； Ｗｏｎｇ
ｅｔ ａｌ． ２００８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１９；Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ
ｅｔ ａｌ． ２０１８）を共調節する。これらの分子の一部は直接的に、一部は非直接
的に、一部は恒常的に、及び一部は調節された方法で結合する。このように、ｍＡＫＡＰ
βシグナロソームの組成は、根底にある筋細胞の状態に対応すると考えられる。ｍＡＫＡ
Ｐβに対して研究が続けられるにつれ、結合パートナーのリストも長くなり、リモデリン
グに要求されるシグナリング経路の重要な統括役としての仮定される役割を裏付けている
。ｍＡＫＡＰβについて知られていることの大部分は、培養した新生仔ラットの心室筋細
胞を使用した研究に基づくものであり、その中で、ｍＡＫＡＰβは、α－及びβ－アドレ
ナリン並びにサイトカイン受容体を含む、上流の多様な受容体による肥大の誘発に要求さ
れると早期に認められていた（Pａｒｅ， Ｂａｕｍａｎ， ｅｔ ａｌ． ２００５；
Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２００５）。しかしながら、近年、心筋細胞
特異的ｍＡＫＡＰβコンディショナルノックアウトマウスの表現型が掲載され、リモデリ
ングにおいてｍＡＫＡＰβが中心にあることを裏付けた（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．
２０１４）。心臓の病的なリモデリングに影響を与える、ｍＡＫＡＰβシグナロソーム
内の種々の上流インプット、下流エフェクター（アウトプット）、及び統合回路が存在す
る。

【0015】

ｍＡＫＡＰβ－プロトタイプのＡ－キナーゼアンカータンパク質
大部分のＡＫＡＰのように、ｍＡＫＡＰは、ＰＫＡを結合する要因となる両親媒性ヘリ
ックス（残基２０５５～２０７２）を含む（Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． １９９９
ｂ；Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１２）。ＰＫＡは、Ｃ－Ｒ－Ｒ－Ｃの構成にお
ける、２つのＲサブユニット及び２つの触媒Ｃサブユニットのヘテロ四量体である。ホロ
酵素内において、ＰＫＡのＲサブユニットのＮ末端ドッキング及び二量体化ドメインが、
Ｘ型で反平行の４つのヘリックス束を形成する（Ｎｅｗｌｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９９
）。この束は、ＡＫＡＰ両親媒性ヘリックスの疎水性面に対応する疎水性溝を含む。ｍＡ
ＫＡＰβは、高親和性（Ｋ_Ｄ＝１１９ｎＭ）で、選択的に（ＲＩＩサブユニットを含む）
タイプＩＩＰＫＡを結合する（Ｚａｋｈａｒｙ ｅｔ ａｌ． ２０００）。興味深いこ
とに、ＰＫＡ－ｍＡＫＡＰβ結合は、ＲＩＩαの自己リン酸化後に１６倍増加し（Ｚａｋ
ｈａｒｙ ｅｔ ａｌ． ２０００）、β－アドレナリンシグナリングの変化状態におい
てＰＫＡ－ｍＡＫＡＰβ結合に影響する可能性がある。ｍＡＫＡＰβに加えて、１２を超
える他のＡＫＡＰが筋細胞に発現され、それぞれがその独自で特定の局在性及び結合パー
トナー群を有する（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。注目すべきことに、ｍ
ＡＫＡＰは、筋細胞において最も希少なＡＫＡＰの１つであり、ｍＡＫＡＰの欠失が核周
囲ＰＫＡの局在化に影響すらしないというものである（Ｋａｐｉｌｏｆｆ，未掲載の知見
）。足場が低レベルで発現するにもかかわらず、筋細胞において内在性ｍＡＫＡＰβを、
ＰＫＡに結合できない全長ｍＡＫＡＰβ突然変異体で置換することが、筋細胞肥大誘発の
阻害に十分である（Ｐａｒｅ， Ｂａｕｍａｎ， ｅｔ ａｌ． ２００５）。このよう
に、ｍＡＫＡＰβシグナロソームは、ＰＫＡシグナリングが個々の小器官においても精密
に区画化され得ること、及び、タンパク質又はタンパク質複合体の発現レベルがそのタン
パク質の機能的意義を必ずしも示すわけではないということの両方の例となる。

【0016】

ｍＡＫＡＰβは、ｃＡＭＰシグナリングのエフェクターだけでなく、ｃＡＭＰ合成及び
分解の要因となる酵素も結合するので、重要性がある（Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．
２００９；Ｄｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ． ２００１）。ｃＡＭＰのＡＴＰからの合成は、
アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）によって触媒される一方、ｃＡＭＰの５’ＡＭＰへの代謝
は、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によって触媒される。ＡＣ及びＰＤＥのＡＫＡＰと
の会合の差が、細胞におけるｃＡＭＰの区画化に寄与し、ｃＡＭＰエフェクターの局所活
性化及び特有の調節性フィートバック及びフィードフォワードループによる局所ｃＡＭＰ
レベルの調節の両方を行う（Ｓｃｏｔｔ， Ｄｅｓｓａｕｅｒ， ａｎｄ Ｔａｓｋｅｎ
２０１３）。ｍＡＫＡＰは、ＡＣ２及びＡＣ５の両方に結合することができるが、ＡＣ
５は、心臓における関連するｍＡＫＡＰβ結合パートナーと認められる（Ｋａｐｉｌｏｆ
ｆ ｅｔ ａｌ． ２００９）。ＡＣ５のＮ末端、Ｃ１及びＣ２ドメインは、ｍＡＫＡＰ
βの特有のＮ末端部位（残基２７５～３４０）に直接結合する。ＡＣ５活性は、細胞にお
いてｍＡＫＡＰβ複合体形成によって促進されるＰＫＡフィードバックリン酸化によって
阻害される（Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． ２００９）。この負のフィードバックは
、基本のｃＡＭＰシグナリングの維持に生理学的に関連すると認められる。ＡＣ５のｍＡ
ＫＡＰβへのつながりが、ｍＡＫＡＰ ＡＣ５結合ドメインを含む競合性ペプチドによっ
て阻害されるとき、筋細胞のｃＡＭＰ含有量及びサイズの両方が肥大性刺激の存在なしで
増加した（Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． ２００９）。

【0017】

ｍＡＫＡＰは、ＰＤＥに結合することを示した最初のＡＫＡＰであった（Ｄｏｄｇｅ
ｅｔ ａｌ． ２００１）。ｍＡＫＡＰ内の部位１２８６～１８３１は、ＰＤＥ４Ｄ３の
特有のＮ末端ドメインに結合する。ＰＤＥ４Ｄ３のセリン残基１３及び５４のリン酸化に
より、それぞれ、足場への結合が増加し、ＰＤＥ触媒活性が増加する（Ｄｏｄｇｅ ｅｔ
ａｌ． ２００１；Ｓｅｔｔｅ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉ １９９６；Ｃａｒｌｉｓｌｅ
Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００４）。ＰＤＥ４Ｄ３活性の増加はｃＡＭＰ分解を速
めるので、ＰＫＡ及びＰＤＥ４Ｄ３は、局所のｃＡＭＰレベル及びＰＫＡ活性を調節可能
な負のフィードバックループを構成する（Ｄｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ． ２００１）。ｍＡ
ＫＡＰに結合したＰＤＥ４Ｄ３は、ＰＤＥとしてだけでなく、ＭＡＰＫのＭＥＫ５及びＥ
ＲＫ５、並びにｃＡＭＰ依存性のＲａｐ１－グアニンヌクレオチド交換因子Ｅｐａｃ１を
足場に動員するアダプタータンパク質としても機能する（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ
ａｌ． ２００５）。上流シグナルによるＭＥＫ５及びＥＲＫ５の活性化は、Ｓｅｒ－
５７９においてＰＤＥ４Ｄ３のリン酸化をもたらし、ＰＤＥを阻害して、ｃＡＭＰ蓄積及
びＰＫＡ活性化を促進する（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｈｏｆ
ｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． １９９９；Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ． ２００８）
。Ｅｐａｃ１は、ＰＫＡほどｃＡＭＰに感受性ではなく、極めて高いｃＡＭＰレベルによ
り、ｍＡＫＡＰ会合Ｅｐａｃ１のさらなる活性がもたらされるというようになる。Ｅｐａ
ｃ１が、Ｒａｐ１によって、ＥＲＫ５活性を阻害するので、ＭＡＰＫシグナリングによる
ＰＤＥ４Ｄ３阻害を防害し、同時のＰＫＡリン酸化のため最大のＰＤＥ４Ｄ３活性をおそ
らくもたらすことができる（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２００５）。結果
として、Ｅｐａｃ１、ＥＲＫ５、及びＰＤＥ４Ｄ３は、ｃＡＭＰが極めて高いレベルに上
昇することに対抗するｍＡＫＡＰ複合体近傍においてｃＡＭＰレベルを抑え得る第３の負
のフィードバックループを構成する。

【0018】

さらなる複雑性が、セリン－スレオニンホスファターゼＰＰ２Ａの、ｍＡＫＡＰのＣ末
端（残基２０８３～２３１９）への結合により与えられる（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅ
ｔ ａｌ． ２０１０）。ＰＰ２Ａは、ＰＤＥ４Ｄ３のＳｅｒ－５４の脱リン酸化を触媒
することで、上流の刺激の存在なしでＰＤＥを阻害することができる。ｍＡＫＡＰ複合体
と会合したＰＰ２Ａは、ＰＫＡ基質であるＢ５６δＢサブユニットを含む。ＰＫＡリン酸
化は、ＰＰ２Ａ触媒活性を高め（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）、ｍＡＫＡＰ結合Ｐ
ＫＡによるＢ５６δのリン酸化がＰＤＥ４Ｄ３脱リン酸化を増加させ、ＰＤＥを阻害する
というようになる。これにより、おそらくｃＡＭＰレベルが増加し、ｃＡＭＰシグナリン
グを開始させるための正のフィードフォワードループを構成する。ＰＫＡ及びＥＲＫ５に
よるＡＣ５リン酸化及びＰＤＥ４Ｄ３調節に基づく負のフィードバックループと共に、ｍ
ＡＫＡＰβシグナロソームにおけるｃＡＭＰレベルが、上流のβ－アドレナリン及びＭＡ
ＰＫシグナリングによって厳密に制御され得るということが予測され得る。ＡＣ５及びＥ
ＲＫ５の上流のシグナリングは、初めにＰＰ２Ａフィードフォワードシグナリングによっ
て促進し得るｃＡＭＰシグナリングを促進し得る一方、ＰＫＡ及びＥｐａｃ１の負のフィ
ードバックによるＰＤＥ４Ｄ３活性化及びＡＣ５阻害がシグナリングを抑え得る。興味深
いことに、Ｒａｂａｂａ’ｈらは、非同義の多型性を含むｍＡＫＡＰタンパク質が、どの
ように異なるようにＰＫＡ及びＰＤＥ４Ｄ３を結合するかということを示した（Ｒａｂａ
ｂａ’ｈ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。ｃＡＭＰシグナリングが、上流のシグナリング経
路間のクロストークによって又はヒト多型性によって異なるように調節される可能性は、
この複雑なシグナリングネットワークの関連を示す、筋細胞におけるさらなる研究を注目
に値するものとする。

【0019】

ｍＡＫＡＰβ及びＭＡＰ－キナーゼ－ＲＳＫ３シグナリング
ＰＤＥ４Ｄ３によるＥＲＫ５のｍＡＫＡＰβ複合体への動員は、初め、前述のフィード
バックループによるｃＡＭＰの局所調節に関連すると示されていた（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆ
ｋａ ｅｔ ａｌ． ２００５）。しかしながら、また、ＥＲＫ５は、筋細胞肥大の重要
な誘導因子であるとも認められ、優先的に、培養筋細胞における長さ方向の成長（偏心性
肥大）を誘発する一方で、圧負荷によるｉｎ ｖｉｖｏにおける求心性肥大にも重要であ
る（マウスの大動脈縮窄術）（Ｎｉｃｏｌ ｅｔ ａｌ． ２００１； Ｋｉｍｕｒａ
ｅｔ ａｌ． ２０１０）。とりわけ、培養筋細胞におけるｍＡＫＡＰβ発現のＲＮＡ干
渉（ＲＮＡｉ）による阻害により、インターロイキン－６－タイプサイトカイン白血病阻
止因子（ＬＩＦ）によって誘発される偏心性成長を阻害した（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ
ｅｔ ａｌ． ２００５）。ｍＡＫＡＰβ結合ＥＲＫ５の可能性のあるエフェクターは、
以下に記載するようにＭＥＦ２転写因子であった。しかしながら、心臓及び脳の両方にお
いて、ｍＡＫＡＰは、ＥＲＫ（ＥＲＫ１，２、又は５）と共に、ＭＡＰＫエフェクターｐ
９０ＲＳＫを活性化可能なキナーゼである、ＰＤＫ１を結合し、ＭＡＰＫエフェクターｐ
９０ＲＳＫもｍＡＫＡＰに会合するキナーゼである（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａ
ｌ． ２００６；Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００５ａ）。重要な点として、ＰＤＫ
１のｍＡＫＡＰへの結合により、ＲＳＫ活性化における膜会合の必要がなくなった（Ｍｉ
ｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００５ａ）。これらのデータは、共に、ｍＡＫＡＰβが上流
のＭＡＰＫシグナリングに対応して筋細胞においてＲＳＫ活性化を統括できることを示す
ものであった。

【0020】

ｐ９０ＲＳＫは、細胞増殖、生存、遊走、及び浸潤を含む多くの細胞プロセスを調節す
る多面性ＥＲＫエフェクターである。ＲＳＫ活性は、大部分の肥大性刺激によって筋細胞
において高まる（Ａｎｊｕｍ ａｎｄ Ｂｌｅｎｉｓ ２００８；Ｓａｄｏｓｈｉｍａ
ｅｔ ａｌ． １９９５）。その上、ＲＳＫ活性は、ヒトの末期拡張型心筋症の心臓組織
において高まることが分かった（Ｔａｋｅｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２００２）。ＲＳＫ
ファミリーメンバーは、Ｎ末端キナーゼドメイン及びＣ末端キナーゼドメインという、２
つの触媒ドメインを含む（Ａｎｊｕｍ ａｎｄ Ｂｌｅｎｉｓ ２００８）。Ｎ末端キナ
ーゼドメインはＲＳＫ基質をリン酸化し、ＥＲＫ及びＰＤＫ１によるそれぞれＣ末端及び
Ｎ末端キナーゼドメインの活性化ループにおける連続的なリン酸化によって活性化されて
、Ｓｅｒ－２１８におけるＮ末端ドメインのＰＤＫ１リン酸化が酵素の完全な活性化を示
すようになる。遍在的に発現される、４つの哺乳動物ＲＳＫファミリーメンバーが存在す
るが、ＲＳＫ３のみがｍＡＫＡＰβを結合する（Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ
． ２０１３）。ＲＳＫ３における特有のＮ末端ドメイン（１～３０）は、ｍＡＫＡＰβ
残基１６９４～１８３３を直接結合し、このアイソフォームと足場との選択的会合を説明
している（Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）。ＲＳＫ３が、他のＲ
ＳＫファミリーメンバーより少なく筋細胞に発現されるにもかかわらず、新生仔筋細胞肥
大は、ＲＳＫ３のＲＮＡｉ、ＲＳＫ３のＮ末端キナーゼドメインの不活性化、及びアンカ
リングディスラプターペプチドを使用したｍＡＫＡＰへのＲＳＫ３結合の阻害によって抑
えられることが分かった（Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）。重要
な点として、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＫ３発現が、圧負荷及びカテコールアミン注入
の両方による心肥大の誘発、並びに家族性肥大型心筋症のマウスモデルに関連する心不全
（α－トロポミオシン Ｇｌｕ１８０Ｇｌｙ）に要求されるものであった（Ｌｉ， Ｋｒ
ｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１３；Ｐａｓｓａｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ． ２０
１３）。その上、求心性肥大の選択的誘発におけるＥＲＫ１／２ＭＡＰ－キナーゼの報告
されている役割に一致して（Ｋｅｈａｔ ｅｔ ａｌ． ２０１１）、ＲＳＫ３遺伝子欠
失により」、ヌーナン症候群のマウスモデルにおいてＲａｆ１^{Ｌ６１３Ｖ}突然変異によっ
て誘発される求心性肥大が阻害された（Ｐａｓｓａｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ． ２０１
６）。この特定のＲＳＫアイソフォームが心臓リモデリングに要求とされるという認識に
より、これが治療標的のための注目に値する候補となる。

【0021】

ｍＡＫＡＰβ及びホスファチジルイノシチドシグナリング
ｃＡＭＰエフェクターＥｐａｃ１は、ＥＲＫ５シグナリングに影響するｍＡＫＡＰβ複
合体においてＲａｐ１を活性化する（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２００５
）。その上、Ｅｐａｃ１－Ｒａｐ１は、そのＲａｓ会合ドメインがｍＡＫＡＰβの第１ス
ペクトリン反復様ドメインを直接結合するホスホリパーゼである、ＰＬＣεを活性化する
（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。ＰＬＣεは、ｍＡＫＡＰβのように、ＲＮＡ
ｉによって又は競合性結合ペプチドの発現によりｍＡＫＡＰβから除くことによって阻害
されても、新生仔筋細胞肥大に要求されるものであった。Ｓｍｒｃｋａ ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙによる優れた文献において、ｍＡＫＡＰβ結合ＰＬＣεは、新たなホスファチジル
イノシトール－４－リン酸（ＰＩ４Ｐ）経路によってＰＫＣε及びＰＫＤ活性化を調節す
ることを示しており、該経路において、ＰＬＣεが核周囲のＰＩ４Ｐをジアシルグリセロ
ール及びイノシトール－１，４－ビスリン酸に選択的に変換する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ． ２０１３）。ＰＫＤ１は、タイプＩＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ ４／５
／７／９）をリン酸化して、その核外輸送を誘導し、肥大遺伝子発現を抑制解除する（Ｍ
ｏｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ． ２０１０；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｈｉｌｌ ２０１３）。Ｓ
ｍｒｃｋａらは、ＰＬＣεが圧負荷誘導ＰＫＤ活性化、タイプＩＩＨＤＡＣリン酸化、及
びｉｎ ｖｉｖｏにおける肥大に要求されることを見いだした（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ
． ２０１３）。その後、ｍＡＫＡＰβはまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、圧負荷に対応
してＰＫＤ活性化及びＨＤＡＣ４リン酸化に要求されることが分かった（Ｋｒｉｔｚｅｒ
ｅｔ ａｌ． ２０１４）。注目すべきことに、ｍＡＫＡＰβは、ＰＫＤ及びＨＤＡＣ
４と三元複合体を形成可能である。これらの結果は、共に、局所ｃＡＭＰシグナリングが
どのように心臓遺伝子発現の調節に影響し得るかを示している。

【0022】

近年、ｍＡＫＡＰβが、心筋細胞においてＨＤＡＣ５の足場となり、ＨＤＡＣ５、ＰＫ
Ｄ、及びＰＫＡを含むシグナロソームを形成することが掲載された（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆ
ｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１８）。ｍＡＫＡＰβ発現の阻害は、それぞれα－及びβ－ア
ドレナリン受容体刺激に対応するＰＫＤ及びＰＫＡによるＨＤＡＣ５のリン酸化を抑えた
。重要な点として、ｍＡＫＡＰβ－ＨＤＡＣ５アンカリングの阻害により、α－アドレナ
リン受容体シグナリング及びＰＫＤリン酸化によるＨＤＡＣ５の核外輸送誘導を妨害した
。その上、ｍＡＫＡＰβ－ＰＫＡアンカリングの阻害により、α－アドレナリン誘導ＨＤ
ＡＣ５核外輸送のβ－アドレナリン受容体刺激による阻害を妨害した。これらのデータは
、共に、ｍＡＫＡＰβシグナロソームがクラスＩＩａＨＤＡＣの核－細質質局在化を双方
向に調節するように機能するということを明らかにしている。このように、ｍＡＫＡＰβ
足場は、それぞれ健康状態及び疾患における病的な遺伝子発現の抑制及び活性化の両方を
制御する筋細胞調節ネットワークにおいて、ノードとして機能する。

【0023】

ｍＡＫＡＰβ及びカルシウムシグナリング
ｍＡＫＡＰβは、ｃＡＭＰ、ホスホイノシチド、及びＭＡＰ－キナーゼシグナリングに
加えて、Ｃａ^２＋依存性シグナリング伝達の統括に寄与している。同定されたｍＡＫＡＰ
βの第２の結合パートナーは、細胞内貯蔵部からのＣａ^２＋誘導Ｃａ^２＋放出の要因とな
るリアノジン受容体Ｃａ^２＋放出チャネル（ＲｙＲ２）であった（Ｋａｐｉｌｏｆｆ，
Ｊａｃｋｓｏｎ， ａｎｄ Ａｉｒｈａｒｔ ２００１；Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ． ２０
００）。ＲｙＲ２は、バルクＣａ^２＋が放出されて筋節収縮を誘発する興奮収縮連関にお
ける役割で最もよく知られる。ＰＫＡリン酸化は、ＲｙＲ２流を増強する（Ｖａｌｄｉｖ
ｉａ ｅｔ ａｌ． １９９５；Ｄｕｌｈｕｎｔｙ ｅｔ ａｌ． ２００７；Ｂｅｒｓ
２００６）が、興奮収縮連関に対するＰＫＡ触媒ＲｙＲ２リン酸化の重要性は、大きく
議論されるところである（Ｈｏｕｓｅｒ ２０１４；Ｄｏｂｒｅｖ ａｎｄ Ｗｅｈｒｅ
ｎｓ ２０１４）。おそらく核周囲の二分子に位置するＲｙＲ２の一部分（Ｅｓｃｏｂａ
ｒ ｅｔ ａｌ． ２０１１）は、ｍＡＫＡＰβ及びネスプリン－１α抗体と共に免疫沈
降することができる（Ｐａｒｅ， Ｅａｓｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｋａｐ
ｉｌｏｆｆ， Ｊａｃｋｓｏｎ， ａｎｄ Ａｉｒｈａｒｔ ２００１）。ｍＡＫＡＰβ
は、病的なリモデリングに関係する核イベントの調節に重要である興奮収縮連関機構及び
シグナリング分子成分をまとめると認められる。このように、ｍＡＫＡＰβ複合体は、収
縮を肥大誘発に対応させる一機構をもたらし得る。筋細胞初代培養物のβ－アドレナリン
刺激は、ｍＡＫＡＰβ会合ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化の増加をもたらす（Ｐａｒｅ， Ｂ
ａｕｍａｎ， ｅｔ ａｌ． ２００５）。ＰＫＡ触媒ＲｙＲ２リン酸化は、交換刺激増
加状態時におけるｍＡＫＡＰβシグナロソーム近傍内の局所Ｃａ^２＋放出を増強し得る。

【0024】

少数のｍＡＫＡＰβ会合ＲｙＲ２が収縮全体に影響し得るという可能性は低いが、核周
囲のＣａ^２＋増加の可能性のある標的は、足場を結合可能なＣａ^２＋／カルモジュリン依
存性ホスファターゼカルシニューリン（ＣａＮ）とし得る。ＣａＮの触媒サブユニットの
３つのアイソフォームが存在する（α、β、γ）が、ＣａＮＡβ－ｍＡＫＡＰβ複合体の
みが筋細胞において検出されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。注目すべきこと
に、ＣａＮＡβは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける心肥大誘発、及び虚血後の筋細胞生存に重要
なＣａＮＡアイソフォームである（Ｂｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ． ２００２； Ｂｕｅｎｏ
ｅｔ ａｌ． ２００４）。ＣａＮＡβは、ｍＡＫＡＰβ内の特有の部位（残基１２８
６～１３４５）に直接結合する（Ｐａｒｅ， Ｂａｕｍａｎ， ｅｔ ａｌ． ２００５
；Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。ｍＡＫＡＰβへのＣａＮＡβ結合は、アドレナリン
刺激によって及びＣａ^２＋／カルモジュリンによって直接的に、細胞において増強される
（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。とりわけ、ＣａＮＡβ－ｍＡＫＡＰβ結合は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおけるα－アドレナリン誘発性の新生仔筋細胞肥大に要求されるものであ
った（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。

【0025】

ｍＡＫＡＰβ及び遺伝子発現
ＣａＮは、多くの基質のなかでも、ＮＦＡＴｃ及びＭＥＦ２転写因子の活性化の要因と
なる。ＮＦＡＴｃ転写因子ファミリーは、そのすべてが筋細胞に発現し、且つ筋細胞肥大
誘発に寄与し得る、４つのＣａＮ依存性アイソフォームを含む（Ｗｉｌｋｉｎｓ ｅｔ
ａｌ． ２００４）。一般に、ＮＦＡＴｃファミリーメンバーは、Ｎ末端調節ドメイン内
の複数のセリン高含有モチーフにおいて著しくリン酸化されると、細胞質に保持される。
このモチーフがＣａＮによって脱リン酸化されると、ＮＦＡＴｃは核内に移行する。複数
のＮＦＡＴｃファミリーメンバーがｍＡＫＡＰβを結合可能であり、ｍＡＫＡＰβとの結
合は、筋細胞におけるＮＦＡＴｃ３のＣａＮ依存性脱リン酸化に要求されるものであった
（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。したがって、ｍＡＫＡＰβ発現はまた、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏのＮＦＡＴ核移行及び転写活性にも要求されるものであった（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．
２０１０；Ｐａｒｅ， Ｂａｕｍａｎ， ｅｔ ａｌ． ２００５）。これらの結果は
、ｉｎ ｖｉｖｏのＮＦＡＴ依存性遺伝子発現が、大動脈縮窄術後のｍＡＫＡＰβ心筋細
胞特異的ノックアウトによって抑えられたという近年の知見と互いに関連する（Ｋｒｉｔ
ｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。

【0026】

ＮＦＡＴｃ２及びＮＦＡＴｃ３のように、ＭＥＦ２Ｄは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける心肥
大に要求される転写因子である（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． ２００８；Ｗｉｌｋｉｎｓ ｅ
ｔ ａｌ． ２００２；Ｂｏｕｒａｊｊａｊ ｅｔ ａｌ． ２００８）。ＭＥＦ２ファ
ミリーメンバーは、ＭＡＤＳボックス及びＭＥＦ２相同ドメインの両方を含む保存ＤＮＡ
結合ドメインを含む（Ｐｏｔｔｈｏｆｆ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ ２００７）。ＭＥＦ２Ｄ
のＤＮＡ結合ドメインは、ｍＡＫＡＰのＮ末端ドメインに直接結合する（Ｖａｒｇａｓ
ｅｔ ａｌ． ２０１２；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． ２００８）。ＣａＮ及びＭＥＦ２Ｄは
、心臓だけでなく骨格筋においても重要である（Ｎａｙａ ｅｔ ａｌ． １９９９；Ｎ
ａｙａ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ １９９９；Ｂｌａｃｋ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ １９９８；
Ｆｒｉｄａｙ ｅｔ ａｌ． ２００３；Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ２００１）。ＭＥＦ２－
ｍＡＫＡＰβ結合の妨害は、Ｃ２Ｃ１２骨格筋芽細胞におけるＭＥＦ２転写活性及び内在
性ＭＥＦ２標的遺伝子発現を鈍化させるものであった（Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ． ２
０１２）。その上、細胞融合及び分化マーカー発現の減少によって明らかにされるように
、ＭＥＦ２－ｍＡＫＡＰ複合体の阻害により、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の筋管への分化を抑え
た（Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ． ２０１２）。注目すべきことに、ＣａＮ－ＭＥＦ２結
合は、心筋細胞においてｍＡＫＡＰβ依存性である（Ｌｉ， Ｖａｒｇａｓ， ｅｔ ａ
ｌ． ２０１３）。したがって、ＣａＮ－ｍＡＫＡＰβ結合の阻害により、Ｃ２Ｃ１２細
胞におけるＭＥＦ２転写活性及び心筋細胞肥大の両方を阻害した（Ｌｉ， Ｖａｒｇａｓ
， ｅｔ ａｌ． ２０１３）。ＮＦＡＴｃ２のように、圧負荷に対応するｉｎ ｖｉｖ
ｏにおけるＭＥＦ２Ｄ脱リン酸化は、ｍＡＫＡＰβのコンディショナルノックアウト後に
抑えられ、心房性ナトリウム利尿因子の発現を含むＭＥＦ２標的遺伝子の発現低下に相関
するものであった（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。

【0027】

圧負荷時におけるｉｎ ｖｉｖｏでのｍＡＫＡＰβによるＮＦＡＴｃ、ＭＥＦ２、及び
ＨＤＡＣ４の調節は、ストレス調節遺伝子発現に対するｍＡＫＡＰβの重要性を示してい
る（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。掲載記事において、ｍＡＫＡＰβにて
、ＮＦＡＴｃ及びＭＥＦ２がどのようにＣａＮによって調節される一方、ＨＤＡＣ４及び
ＨＤＡＣ５がどのようにＰＫＤ及びＰＫＡによって調節されるかが示されている（Ｌｉ，
Ｖａｒｇａｓ， ｅｔ ａｌ． ２０１３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１３；Ｌ
ｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０；Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１８）。ｍ
ＡＫＡＰβは、他のシグナリング酵素によるこれらの遺伝子調節タンパク質の調節を促す
と認められる。例えば、ｍＡＫＡＰβ会合ＥＲＫ５は、ＭＥＦ２をリン酸化して、転写因
子を活性化させ得る（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０００）。その上、ＰＫＡは、ＭＥＦ
２をリン酸化して、そのＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすことができる（Ｗａｎｇ ｅｔ
ａｌ． ２００５）。一方で、Ｏｌｓｏｎらは、ＨＤＡＣ４のＰＫＡリン酸化が、新た
なＨＤＡＣ４タンパク質分解フラグメントの生成によってＭＥＦ２活性を阻害可能である
ことを提案している（Ｂａｃｋｓ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。多くのｍＡＫＡＰβ結合
パートナーの活性が最終的にどのように統合されて遺伝子発現を制御するかは、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で研究可能である。

【0028】

その他のｍＡＫＡＰβ結合パートナー
ミオポディン（ｍｙｏｐｏｄｉｎ）及びＮＣＸ１を含む、足場へのドッキングの意義が
十分に特徴づけられていないｍＡＫＡＰβの他の結合パートナーが存在する（Ｆａｕｌ
ｅｔ ａｌ． ２００７；Ｓｃｈｕｌｚｅ ｅｔ ａｌ． ２００３）また、低酸素に対
する全身性応答を調節する転写因子であるＨＩＦ－１αも、ｍＡＫＡＰβを結合する（Ｗ
ｏｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００８）。正常酸素状態において、細胞におけるＨＩＦ－１α
の存在量は、ユビキチン媒介プロテアソーム分解によって少なく保たれる。ＨＩＦ－１α
は、プロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、及びＰＨＤ３）と呼ばれる酸素感
受性ジオキシゲナーゼファミリーによってヒドロキシル化される（Ｏｈｈ ｅｔ ａｌ．
２０００）。ヒドロキシル化したＨＩＦ－１αは、その後、エロンギンＣユビキチンリ
ガーゼ複合体を動員してＨＩＦ－１αをユビキチン化するとともにそのプロテアソーム依
存性分解を促進するフォン・ヒッペル・リンドウタンパク質（ｐＶＨＬ）に認識される（
Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ． １９９９）。低酸素条件において、ＰＨＤは不活性化さ
れ、ＨＩＦ－１α分解が減少し、ＨＩＦ－１αが核に蓄積して、そこでＨＩＦ－１βと二
量体化して標的遺伝子の転写を促進することができる。ｍＡＫＡＰβは、培養新生仔筋細
胞においてＨＩＦ－１α、ＰＨＤ、ｐＶＨＬ、及びＥ３リガーゼＳｉａｈ２（ｓｅｖｅｎ
ｉｎ ａｂｓｅｎｔｉａ相同体２）を含むシグナリング複合体を会合させることができ
る（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００８）。正常酸素状態において、ｍＡＫＡＰβアンカ
ーＰＨＤ及びｐＶＨＬは、ＨＩＦ－１αユビキチン化及び分解を促進する（Ｗｏｎｇ ｅ
ｔ ａｌ． ２００８）。しかしながら、低酸素条件において、Ｓｉａｈ２活性化が、結
合したＰＨＤのプロテアソーム分解を誘導し、ＨＩＦ－１α蓄積を促進する（Ｗｏｎｇ
ｅｔ ａｌ． ２００８）。ｍＡＫＡＰβノックアウトは、虚血再灌流後の心筋細胞生存
に影響し得る。

【0029】

ｍＡＫＡＰβ－リモデリング構成の統括役
上述の記載は、心肥大及び病的なリモデリングに重要であることが知られている複数の
シグナリング経路が、主要なシグナリング中間体のｍＡＫＡＰβ足場への結合によってど
のように調節されるかを示している。心筋細胞特異的なｍＡＫＡＰコンディショナルノッ
クアウトマウスは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍＡＫＡＰβシグナロソームの関連を示すよ
うに、特徴づけられている（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。ｍＡＫＡＰβ
は、心筋細胞において、大動脈縮窄術及びイソプロテレノール注入による心肥大誘発に要
求されるものであった。しかしながら、最も注目されることは、心筋アポトーシス及び間
質性線維症を含む病的なリモデリングの防止、及び長期圧負荷に直面しての心臓機能の保
護であり、共に、マウスの生存を著しく延長させた（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２
０１４）。これらの結果は、心臓疾患において、消失させることで生存の利益をもたらす
初めての足場として、ｍＡＫＡＰβを認知させた。重要な点として、Ｎｋｘ２－５－対象
ｃｒｅ欠失株の使用により、６か月齢において明らかな表現型をもたらさなかったので、
ｍＡＫＡＰβは、正常な成体心臓機能の発達又は維持のいずれにも必要とされるとは認め
られなかった。（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。ｍＡＫＡＰβノックアウ
トは、強制的な運動（水泳）によって誘発される生理学的な肥大を抑えるものの、疾患に
おけるｍＡＫＡＰβ複合体の標的化は関連するにとどまる。

【0030】

足場のｓｉＲＮＡノックダウンを含む、ヒトにおけるｍＡＫＡＰβ複合体を標的化する
種々の方法が想定され得る。しかしながら、ｍＡＫＡＰβシグナロソームの構造及び機能
を比較的詳しく理解することで、これらの経路を標的化するさらなるアプローチをもたら
す。例えば、ｍＡＫＡＰβ－ＣａＮＡβ、ｍＡＫＡＰβ－ＭＥＦ２Ｄ、ｍＡＫＡＰβ－Ｐ
ＬＣε、及びｍＡＫＡＰβ－ＲＳＫ３結合を標的とするアンカリングディスラプターペプ
チドを含む、ｍＡＫＡＰβに関与する主要なタンパク質とタンパク質との相互作用を標的
とするペプチドの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて有効であることが既に示されている
（Ｌｉ， Ｖａｒｇａｓ， ｅｔ ａｌ． ２０１３；Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ
ａｌ． ２０１３；Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ． ２０１２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ
． ２０１１）。主要な死因である心不全は、米国だけで３００億／年ドルを超える費用
のかかる、現代の治療においても診断の５年内に５０％の死亡率を招く疾患である。（Ｇ
ｏ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。心疾患における可能性のある標的の多くの候補が多面性
であり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて十分な特異性を有する薬剤の開発を複雑にしている。ｍ
ＡＫＡＰβシグナロソームの特異的標的化により、病的な心臓リモデリングに特化すると
認められ、かつ、著しい副作用を伴わずにその消失が促され得る、比較的希少なタンパク
質とタンパク質との相互作用を標的化する機会がもたらされる。心不全の患者を処置する
ための新しい有効な治療の開発、並びに冠動脈疾患、高血圧、及び弁膜疾患など他の心血
管疾患に関連するその発症の予防がまさに求められている。

【発明の概要】

【0031】

以下の簡単な概要は、本発明のすべての特徴及び態様を含むことを意図せず、本発明が
この概要に記載されるすべての特徴及び態様を含む必要があるということを示唆するもの
ではない。

【0032】

本発明者らは、特有のタンパク質とタンパク質との相互作用を標的とする薬剤を使用し
て個々のｍＡＫＡＰシグナリング複合体のシグナリング特性を阻害することで、心臓の病
的プロセスを処置する方法を発見した。そうした治療方法は、所定の細胞応答の選択的阻
害を可能にするため、従来の治療アプローチに対する利点をもたらす。

【0033】

特に、本発明者らは、ｍＡＫＡＰ媒介のタンパク質とタンパク質との相互作用を阻害す
ることが、病的な心臓リモデリングもたらす細胞プロセスを開始させる主要な転写因子の
活性化において中心的役割を果たす酵素の活性化を調節するｍＡＫＡＰの能力を阻害する
ために使用可能であるということを見いだした。

【0034】

具体的に、発明者らは、ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの結合相互作用を阻害することで、
例えば心筋梗塞後の、心不全につながる障害から心臓を保護することができるということ
を発見した。

【0035】

このように、本発明は、所定の態様において、心臓を障害から保護する方法を含み、該
方法は、ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する薬学的有効量の組成物を、そう
した障害のリスクを有する患者に投与することで行われる。

【0036】

また、本発明は、ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する薬学的有効量の組成
物を患者に投与することで心疾患を処置する方法に関する。

【0037】

また、本発明は、ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する組成物に関する。

【0038】

さらに他の実施形態において、阻害剤は、ＰＰ２Ａ及びｍＡＫＡＰβの発現又は活性を
阻害する任意の分子を含む。

【0039】

本発明の上述及び他の目的、特徴及び利点は、同様の参照符号が各種の図面において同
じ部分を指す添付の図面に示されるように、以下の本発明の好ましい実施形態のより具体
的な記載から明らかになるだろう。図面は、必ずしも正確な縮尺ではなく、代わりに本発
明の原理を示すことに重点が置かれている。

【0040】

本特許又は出願願書は、少なくとも１つの色付き図面を含む。色付き図面を含むこの特
許または特許出願公開公報の写しは、申請および必要手数料支払いの上、特許庁から提供
される。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】図１は、ｍＡＫＡＰβ調節した、ＳＲＦ依存性遺伝子発現のモデルを示す。アンカリングしたＲＳＫ３は、核周囲のｍＡＫＡＰβ複合体と会合したＳＲＦをリン酸化する、Ｇｑタンパク質結合受容体－ＥＲＫエフェクターである。ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によって活性化可能な、ｍＡＫＡＰβアンカリングＰＰ２Ａは、ＳＲＦリン酸化に対抗する。リン酸化したＳＲＦは、求心性肥大を促進する遺伝子発現を誘導する。

【図2】図２は、ヒトＲＳＫ３のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。

【図3】図３は、ラットｍＡＫＡＰのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。この文書内では、ｍＡＫＡＰ配列の参照は、「ｍＡＫＡＰβ」又は「ｍＡＫＡＰ」と記載されていても、ｍＡＫＡＰβ全体に含まれるとともに、この図に示すように当初記載のｍＡＫＡＰ配列と同一である、ｍＡＫＡＰα選択的スプライシング形態のナンバリングによるものであるということが留意される（Ｋａｐｉｌｏｆｆ １９９９， Ｍｉｃｈｅｌ ２００５）。また、「ｍＡＫＡＰ」は、参照データベース及び文献において「ＡＫＡＰ６」とも呼ばれる。ｍＡＫＡＰβは残基２４５から始まる一方、ｍＡＫＡＰαは残基１から始まる。ＰＰ２Ａ結合ドメインは残基２１３４から始まる。

【図4】図４は、ＡＡＶベクターに発現されるときのラットｍＡＫＡＰのＰＢＤのアミノ酸配列を示す。Ｎ末端のｍｙｃタグを含む（配列番号１２）。

【図5】図５は、ＡＡＶ９ｓｃ．ラットＰＢＤを作製するために使用されるｐｓｃＡ－ＴｎＴ－ｍｙｃ－ラットｍＡＫＡＰのＰＢＤのプラスミドを示す（配列番号１３及び１４）。

【図6】図６は、核周囲の足場であるｍＡＫＡＰβを示す。上部は、ｍＡＫＡＰ抗体（グレースケールのパネル及び緑色）、ヘキスト核染色（青色）、及び小麦胚芽凝集素（赤色、拡大したコントロールイメージのみに示す）で染色したマウスの心臓切片（左心室）を示す。左下パネルはコントロール、ｍＡＫＡＰノックアウトマウスのものである。横線＝２０μｍ。中央部は、ｍＡＫＡＰ（緑色）及びアクチニン（赤色）に対する抗体で染色した成体ラットの筋細胞を示す。下部は、ｍＡＫＡＰドメイン構造を示す。部位がｍＡＫＡＰβにおいて詳細にマッピングされている直接結合パートナーを示す。ｍＡＫＡＰβはｍＡＫＡＰαの残基２４５から始まる。つまり、すべての結合部位はｍＡＫＡＰαに対して番号をつけている。イメージはＫｒｉｔｚｅｒらによるものである（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。

【図7】図７は、ｍＡＫＡＰβのシグナリングモジュールを示す。ｍＡＫＡＰβは複数のシグナリング酵素及び遺伝子調節タンパク質を結合する。ｃＡＭＰ、Ｃａ^２＋、低酸素、ホスファチジルイノシチド、及びＭＡＰＫシグナリングに関与するモジュールを定め得る。詳細は上記参照のこと。この図において、ｍＡＫＡＰβ足場は、ネスプリン－１αを表す灰色の基部に配置され、種々のシグナリング分子を会合する黄色の球体として示される。金色の円筒体は、核膜に挿入される核膜孔複合体を表す。

【図8】図８は、オカダ酸感受性ホスファターゼはｍＡＫＡＰ会合ＰＤＥ４Ｄ３を調節することを示す。Ａ、ｍＡＫＡＰ及びＰＤＥ４Ｄ３の両方を発現する、遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞を、３００μＭのオカダ酸（ＯＡ）又は５００μＭのシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）のいずれかで３０分間処理した後、５μＭのフォルスコリン（Ｆｓｋ）で１０分間刺激した。ｍＡＫＡＰ抗体免疫沈降物に存在するＰＤＥ４Ｄ３のリン酸化状態は、リン酸化ＰＤＥ４Ｄ３のＳｅｒ－５４に特異的な抗体を使用して測定した（上部パネル）。ｍＡＫＡＰ抗体免疫沈降物に存在する全ＰＤＥ４Ｄ３（中央パネル）及びｍＡＫＡＰ（下部パネル）を、非リン酸特異的抗体を使用して検出した。これらの実験において、ｍＡＫＡＰはＧＦＰタグを付け、ＰＤＥ４Ｄ３はＶＳＶ及びＧＦＰタグを付け、分子量が増加したことが留意される。ｎ＝３。Ｂ、Ａのように調製したｍＡＫＡＰ抗体免疫沈降物に関連するＰＤＥ活性を、［^３Ｈ］ｃＡＭＰ基質を使用してアッセイした。未処理の細胞（棒部１）と比較して＊ｐ＜０．０５。Ｃ、内因性のタンパク質複合体を、清澄化した成体ラットの心臓抽出物（５００μｇの全タンパク質）からコントロール（ＩｇＧ）又はｍＡＫＡＰ特異的抗体を使用して単離した。免疫沈降物に関連するＰＤＥ活性を、１０ｎＭのＯＡ又は５０ｎＭのＰＫＩの存在下でアッセイした。ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５。

【図9】図９は、プロテインホスファターゼＰＰ２Ａが成体ラットの心臓においてｍＡＫＡＰ足場に会合することを示す。Ａ、成体ラットの心臓抽出物（５００μｇの全タンパク質）からｍＡＫＡＰ抗体を使用して免疫沈降したタンパク質複合体に関連するホスファターゼ活性を、３０ｎＭのＰＰ２Ａ阻害剤Ｉ（Ｌｉ， Ｍａｋｋｉｎｊｅ， ａｎｄ Ｄａｍｕｎｉ １９９６）及び１００ｎＭのＰＫＡリン酸化ＰＰ１阻害剤－１（Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ． １９９６）あり又はなしで、^３２Ｐ標識ヒストン基質を使用してアッセイした。ｎ＝３。＊ｐ＜０．０５。Ｂ及びＣ、タンパク質複合体を、清澄化した成体ラットの心臓抽出物（２ｍｇの全タンパク質）からコントロール（ＩｇＧ）又はｍＡＫＡＰ特異的抗体を使用して単離した。抽出物（８０μｇ）及び免疫沈降物（２５％ロード）におけるＰＰ２Ａ（パネルＢ）及びＰＰ１（パネルＣ）触媒サブユニットをイムノブロッティングによって検出した。ｎ＝３。

【図10】図１０は、ＰＰ２ＡがＣ末端ｍＡＫＡＰドメインを結合することを示す。Ａ、本明細書に使用するｍＡＫＡＰドメイン並びにＧＦＰ及びｍｙｃタグ付きｍＡＫＡＰタンパク質の模式図を示す。ラット及びヒトタンパク質を含むｍＡＫＡＰフラグメントをそれぞれ黒色及び灰色で表す。ハッチング棒部は、筋細胞における核膜標的化の要因となる３つのスペクトリン反復ドメインを示す（Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． １９９９ａ）。結合部位は、３－ホスホイノシチド依存性キナーゼ－１（ＰＤＫ１、ｍＡＫＡＰ残基２２７－２３２）（Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００５ｂ）、ネスプリン－１α（１０７４－１１８７）（Ｐａｒｅ， Ｅａｓｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ． ２００５）、リアノジン受容体（ＲｙＲ２、１２１７－１２４２）（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ． ２０００）、ＰＰ２Ｂ（１２８６－１３４５）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）、ＰＤＥ４Ｄ３（１２８５－１８３３）（Ｄｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ． ２００１）、及びＰＫＡ（２０５５－２０７２）を含む、ｍＡＫＡＰを直接結合することが知られるタンパク質に対して示されている（Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． １９９９ａ）。網掛け棒部はＰＰ２Ａ結合部位を示す。各フラグメントの最初と最後の残基を示す。Ｂ、精製したＧＳＴ－ＰＰ２Ａ Ａサブユニット融合タンパク質を、示したＧＦＰ－ｍＡＫＡＰ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞から調製した抽出物とともにインキュベートし、グルタチオン樹脂を使用してプルダウンで検出した。ＧＦＰ－ｍＡＫＡＰフラグメントを、ＧＦＰ抗体を使用してプルダウン（２５％ロード、上部パネル）及び抽出物（５％ロード、下部パネル）において検出した。ｎ＝３。Ｃ、ｍｙｃタグ付きｍＡＫＡＰフラグメントを、ＨＥＫ２９３細胞に発現し、ホスファターゼ結合をコントロール（ＩｇＧ）又はｍｙｃタグ付き抗体を使用した免疫沈降、その後の^３２Ｐ標識ヒストン基質を使用したホスファターゼアッセイによって検出した。ｎ＝３。他の試料と比較して＊ｐ＜０．０５。ラット及びヒトｍＡＫＡＰの両方のＣ末端相同性ドメインはＰＰ２Ａを結合することが留意される。

【図11】図１１は、ｍＡＫＡＰ－ＰＤＥ４Ｄ３複合体とのＰＰ２Ａの会合がＰＤＥ４Ｄ３リン酸化の阻害に要求されることを示す。Ａ、ＰＤＥ４Ｄ３（ＶＳＶ及びＧＦＰタグ付き）、及びｍｙｃタグ付きｍＡＫＡＰ１２８６－２３１２又はＰＰ２Ａ結合部位のない１２８６－２０８３を発現するＨＥＫ２９３細胞を、３００μＭのＯＡで３０分間処理した後、５μＭのＦｓｋで１０分間刺激した。タンパク質複合体を、ホスファターゼ阻害剤の存在下でｍｙｃタグ付き抗体を使用して免疫沈降した。免疫共沈降したＰＤＥ４Ｄ３のリン酸化状態は、リン酸化ＰＤＥ４Ｄ３のＳｅｒ－５４に特異的な抗体を使用して測定した（Ｐ－ＰＤＥ４Ｄ３、上部パネル）。免疫沈降物に存在する全ＰＤＥ４Ｄ３、ｍｙｃ－ｍＡＫＡＰ、及びＰＰ２Ａ Ｃ－サブユニットを、非リン酸特異的抗体を使用して検出した（下部の３つのパネル）。ｎ＝３。Ｂ、Ａのように処理したさらなる細胞から単離した、ｍｙｃ抗体免疫沈降物に関連するＰＤＥ活性を、［^３Ｈ］ｃＡＭＰを使用してアッセイした。ｎ＝３。棒部１と比較して＊ｐ＜０．０５。

【図12】図１２は、ｍＡＫＡＰ結合ＰＰ２ＡがＢ５６δサブユニットを含み、ｃＡＭＰ活性化されることを示す。Ａ、タンパク質複合体を、図２Ｂのように成体ラットの心臓抽出物（５００μｇの全タンパク質）からコントロール（ＩｇＧ）又はｍＡＫＡＰ特異的抗体を使用して免疫沈降し、関連するホスファターゼ活性についてアッセイした。図示するように、免疫沈降物を、５０μＭのＣＰＴ－ｃＡＭＰ、１０ｎＭのＯＡ、又は５０ｎＭのＰＫＩを添加しないで又は添加して、５分間プレインキュベートした後、［^３２Ｐ］ヒストン基質を添加した。ｎ＝３。＊ｐ＜０．０５。Ｂ、内在性タンパク質複合体を、成体の心臓抽出物（２ｍｇの全タンパク質）からＢ５６δ及びコントロール（ＩｇＧ）抗体で免疫沈降した。８０μｇの抽出物及び免疫沈降物（２５％ロード）におけるｍＡＫＡＰをイムノブロッティングによって検出した。ｎ＝３。Ｃ、Ｆｌａｇタグ付きＢ５６δ及び／又はＧＦＰタグ付きｍＡＫＡＰをＨＥＫ２９３細胞に発現させた。タンパク質複合体はｍＡＫＡＰ抗体を使用して免疫沈降した。免疫沈降物（２５％ロード）及び全抽出物（５％ロード）におけるＢ５６δをイムノブロッティングによってＦｌａｇ抗体で検出した。ｎ＝３。Ｄ、Ｃのように調製したｍＡＫＡＰ抗体免疫沈降物に関連するホスファターゼ活性を、^３２Ｐ標識ヒストン基質を使用してアッセイした。ｎ＝３。Ｅ、ｍＡＫＡＰ及びＢ５６δを発現するＨＥＫ２９３細胞を、５μＭのＦｓｋ及び１０μＭのＩＢＭＸ（Ｆｓｋ／ＩＢＭＸ）で１０分間処理した後、ｍＡＫＡＰ抗体でタンパク質複合体を免疫沈降した。免疫沈降物に関連するホスファターゼ活性を、［^３２Ｐ］ヒストン基質を使用してアッセイした。ｎ＝３。ｍＡＫＡＰへのＰＰ２ＡのＢ５６δ及びＣサブユニット結合はＦｓｋ／ＩＢＭＸに影響されなかったということが留意される（以下の図１３参照）。

【図13】図１３は、ＰＫＡによるＢ５６δのリン酸化がｍＡＫＡＰ関連ＰＰ２Ａ活性を増加させることを示す。Ａ、Ｂ５６δは、ＰＫＡによってセリン残基５３、６８、８１、及び５６６においてリン酸化される（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。野生型又は４つすべてのＰＫＡ部位でアラニン置換した（Ｓ４Ａ）Ｂ５６δを、野生型ｍＡＫＡＰ又はＰＫＡ結合部位のない全長ｍＡＫＡＰ突然変異体とＨＥＫ２９３細胞において共発現させた（ΔＰＫＡ、図３Ａ参照）。５μＭのＦｓｋ及び５０μＭのＩＢＭＸで刺激後、タンパク質複合体をｍＡＫＡＰ抗体で免疫沈降し、会合したタンパク質を、Ｂ５６δ、ｍＡＫＡＰ、及びＰＰ２Ａ－Ｃ抗体でイムノブロッティングによって検出した（下部の３つのパネル）。Ｂ５６δのＰＫＡリン酸化を、Ｂ５６δリン酸－Ｓｅｒ－５６６特異的抗体でイムノブロッティングによって検出した（Ｐ－Ｂ５６δ、上部パネル）。ｎ＝３。Ｂ、Ｂにおいて調製した免疫沈降物を、関連するホスファターゼ活性についてアッセイした。ｎ＝３。＊ｐ＜０．０５。

【図14】図１４は、ＰＫＡによるＢ５６δのリン酸化がｍＡＫＡＰ会合ＰＤＥ３Ｄ３の脱リン酸化を高めることを示す。Ａ、ｍＡＫＡＰ（ＧＦＰタグ付き）、ＰＤＥ４Ｄ３（ＶＳＶ及びＧＦＰタグ付き）、及び野生型Ｂ５６δ又はＰＫＡリン酸化部位のＢ５６δ Ｓ４Ａ突然変異体のいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞を、３００μＭのＯＡで３０分間、提示したように処理した後、５μＭのＦｓｋで１０分間刺激した。タンパク質複合体を、ホスファターゼ阻害剤の存在下においてｍＡＫＡＰ抗体で免疫沈降した。免疫沈降物に存在するＰＤＥ４Ｄ３のリン酸化状態は、リン酸化ＰＤＥ４Ｄ３のＳｅｒ－５４に特異的な抗体を使用して測定した（上部パネル）。免疫沈降物に存在する全ＰＤＥ４Ｄ３、ｍＡＫＡＰ、Ｂ５６δ、及びＰＰ２Ａ－Ｃタンパク質を、非リン酸特異的抗体を使用して検出した（下部の４つのパネル）。ｎ＝３。Ｂ、Ａのように処理したさらなる細胞から単離したタンパク質複合体に関連するＰＤＥ活性を、［^３Ｈ］ｃＡＭＰを使用してアッセイした。ｎ＝３。棒部１と比較して＊ｐ＜０．０５。

【図15】図１５は、ｍＡＫＡＰ複合体と会合したＰＫＡ及びＰＰ２Ａが連携してＰＤＥ４Ｄ３活性及びｃＡＭＰ分解を調節することを示す。ＰＫＡは、２つの調節サブユニット及び２つの触媒サブユニットから構成される。ｍＡＫＡＰ結合ＰＰ２Ａは、Ａ、Ｂ５６δ、及びＣ（触媒）サブユニットを含む。Ａ、非刺激細胞において、基本的なＰＰ２Ａ活性はＰＤＥ４Ｄ３脱リン酸化を維持し、おそらく、ＰＤＥ４Ｄ３をリン酸化及び活性化する場合より、その後の作動剤に対応してｃＡＭＰレベルをより急速に上昇させる。同時に、基本的なＰＤＥ４Ｄ３活性は、ｃＡＭＰの局所レベルを低く維持し、擬似的シグナリングを防止するはずである。Ｂ、Ｇ_ｓ－共役型受容体刺激はｃＡＭＰ合成を誘導し、ＰＤＥ４Ｄ３によるｃＡＭＰ分解速度を超え、ｍＡＫＡＰ結合ＰＫＡを活性化させる。ＰＫＡは、ＰＤＥ４Ｄ３及びＰＰ２Ａの両方をリン酸化及び活性化する。ＰＤＥ４Ｄ３活性は、ピークのｃＡＭＰレベルを制限し、ＧＰＣＲダウンレギュレート後のｃＡＭＰクリアランスの速度を加速させるはずである。一方で、ＰＰ２Ａ活性化は、ＰＫＡによるＰＤＥ４Ｄ３リン酸化に対抗し、ｃＡＭＰ分解を抑えて、より大きくて長く続くｃＡＭＰシグナルに寄与する。

【図16】図１６は、ＰＫＡリン酸化Ｉ－１のＰＰ１活性阻害の確認を示す。タンパク質複合体を、ラットの心臓抽出物からＰＰ１又はコントロールのＩｇＧ抗体で免疫沈降し、関連するホスファターゼ活性を、１００ｎＭのＰＫＡリン酸化ＰＰ１阻害剤－１（Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ． １９９６）あり又はなしで、［^３２Ｐ］ヒストン基質を使用してアッセイした。ｎ＝３。

【図17】図１７は、ラット新生仔の心筋細胞におけるｍＡＫＡＰ及びＰＰ２Ａ触媒サブユニットの分布を示す。ラット新生仔の心室筋細胞を、これまでに記載されたように単離した（Ｐａｒｅ， Ｅａｓｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ． ２００５）。筋原線維組織化及びｍＡＫＡＰ発現を誘導するため、５０μＭのフェニレフリンで１週間処理した後、これまでに記載したように、細胞を固定して、０．２５μｇ／ｍｌのマウス抗ＰＰ２Ａ－Ｃ（緑色）、０．１μｇ／ｍｌのＯＲ０１０ウサギ抗ｍＡＫＡＰ（赤色）のアフィニティー精製した抗体、及びローダミンファロイジン（複合イメージの青色）で染色し、アクチン筋原線維を示した。４色イメージを、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０／ＵＶ共焦点顕微鏡において４００×で得た。明確にするため、別々のＰＰ２Ａ－Ｃサブユニット及びｍＡＫＡＰのイメージを示す。ＰＰ２Ａ－Ｃサブユニットは、サイトゾルにおいて拡散した断続的パターンで存在する一方、ｍＡＫＡＰは核膜の位置に限定される。核膜におけるＰＰ２Ａ－Ｃサブユニット染色の存在は、ＰＰ２Ａ－ｍＡＫＡＰ複合体の存在と一致する（複合イメージの黄色）。コントロールのＩｇＧ染色を右側パネルに示す。ｎ＝３。

【図18】図１８は、ｍＡＫＡＰフラグメントがＨＥＫ２９３細胞においてＰＰ１に結合しないことを示す。ｍＡＫＡＰ－ＧＦＰ融合タンパク質をＨＥＫ２９３細胞に発現し、タンパク質複合体をＰＰ１抗体で免疫沈降した。強く発現するにもかかわらず（下部パネル）、ｍＡＫＡＰ融合タンパク質はＰＰ１抗体で沈降しなかった。ｎ＝３。

【図19】図１９は、ＳＲＦリン酸化が心筋細胞におけるｍＡＫＡＰβシグナロソームによって調節されることを示す。（Ａ）はＳＲＦドメイン構造を示す。既知のリン酸化残基を示す（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｍａｃｋ ２０１１； Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ． １９９２）。（Ｂ）新生仔ラットの心室筋細胞（ＮＲＶＭ）に、ｓｉＲＮＡ及びＳＲＥ－ルシフェラーゼ及びコントロールのウミシイタケルシフェラーゼプラスミドを一時的に遺伝子導入した。ノーマライズしたｌｕｃ：ｒｌｕｃ比を示す。ｎ＝３。（Ｃ）はマウスの心臓抽出物からの内在性複合体の免疫共沈降を示す。ｎ＝３。（Ｄ）ＨＡタグ付きＲＳＫ３ＷＴ又はＳ２１８Ａ不活性突然変異体（Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）及び／又はｍｙｃ－ｍＡＫＡＰβを、免疫共沈降アッセイのためにＣＯＳ－７細胞に発現した。ｎ＝３。（Ｅ）ＮＲＶＭ抽出物を、１０μＭのＰＥあり又はなしでｓｉＲＮＡを遺伝子導入した２日後に得た。図Ｓ１Ｂ参照。ｎ＝３。コントロールのｓｉＲＮＡ＋ＰＥに対して＊、コントロールのｓｉＲＮＡ＋薬剤なしに対して†。（Ｆ）成体ラットの心室筋細胞（ＡＲＶＭ）に、ｍｙｃ－ＧＦＰ又はｍｙｃ－ＧＦＰ－ＲＢＤを発現するアデノウイルスを感染させ、２０μＭのＰＥで１日処理した。ｎ＝３。ｍｙｃ－ＧＦＰ＋ＰＥに対して＊、ｍｙｃ－ＧＦＰ＋薬剤なしに対して†。（Ｇ）最少維持培地中のＮＲＶＭを、１μＭのオカダ酸（ＯＡ）又は１μｇ／ｍｌのシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）で１時間処理した。ｎ＝４。薬剤なしのコントロールに対して＊。（Ｈ）コントロール又はｍＡＫＡＰ ｓｉＲＮＡを遺伝子導入したＮＲＶＭを、免疫共沈降アッセイに使用した。ＰＰ２Ａホロ酵素は、Ａ及びＣサブユニットホモ二量体コア並びに足場Ｂサブユニットを含む（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。ＰＰ２Ａ Ｃサブユニット（ＰＰ２Ａ－Ｃ）をイムノブロッティングによって検出した。ｎ＝３。（Ｉ）ＮＲＶＭに、ｍｙｃ－ＰＢＤ又はβ－ｇａｌを発現するアデノウイルスを感染させた後、免疫共沈降アッセイを行った。ｎ＝３。（Ｊ）ＡＲＶＭは、ｍｙｃ－ＰＢＤ又はβ－ｇａｌアデノウイルスを感染させ、１０μＭのＩｓｏで１日処理した。ｎ＝４。β－ｇａｌ＋Ｉｓｏに対して＊、β－ｇａｌ＋薬剤なしに対して†。

【図20】図２０は、ＳＲＦ Ｓ^１０３リン酸化が筋細胞求心性成長の決定要因であることを示す。成体ラットの心室筋細胞（ＡＲＶＭ）にアデノウイルスを感染させ、２０μＭのＰＥ又は１０μＭのＩｓｏあり又はなしで２４時間培養した後、免疫細胞化学染色並びに細胞の幅及び長さの測定を行った（横紋と平行又は横紋に垂直の最大寸法、横線＝２５μｍ）。（Ａ、Ｂ）筋細胞に、β－ｇａｌ（コントロール）又はＨＡタグ付きＲＳＫ３を発現するアデノウイルスを感染させ、最少培地中で維持した。上部において、α－アクチニン－赤色、核－青色、ＨＡ－ＲＳＫ３－緑色であり、下部においてＨＡ－ＲＳＫ３－グレースケールである。ｎ＝４。（Ｃ～Ｆ）筋細胞に、ＳＲＦ ＷＴ、Ｓ１０３Ｄ、Ｓ０１３Ａを発現するアデノウイルス、又はコントロールウイルスを感染させた。Ｆｌａｇ－ＳＲＦ－緑色、、α－アクチニン－赤色、核－青色である。同じウイルスで薬剤なしに対して＊、同じ処理条件下のコントロールに対して†、同じ処理条件下のＳＲＦ ＷＴに対して‡。Ｄ：ｎ＝３、Ｆ：ｎ＝５。（Ｇ、Ｈ）筋細胞に、ｍｙｃ－ＧＦＰ又はｍｙｃ－ＧＦＰ－ＲＢＤを発現するアデノウイルスを感染させた（緑色）。（Ｉ、Ｊ）筋細胞に、ｍｙｃ－ＰＢＤ又はβ－ｇａｌコントロールを発現するアデノウイルスを感染させた。（Ｇ～Ｊ）α－アクチニン－赤色、核－青色である。同じタンパク質で薬剤コントロールなしに対して＊、同じ処理条件でのコントロールタンパク質に対して†。ｎ＝４。これらの実験で測定した細胞の相対度数分布を図Ｓ４に示す。

【図21】図２１は、ＰＰ２ＡがＳＲＦ Ｓ^１０３を脱リン酸化することを示す。細菌抽出物から精製し、グルタチオンビーズ上に配置されたＧＳＴ－ＳＲＦ融合タンパク質を、精製した０．５μｇのＲＳＫ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともに３０分間インキュベートした後、ＰＰ２Ａ反応バッファーで２回洗浄してから、１０ｎＭのオカダ酸あり又はなしで、５０ｎｇの精製ＰＰ２Ａとともに３０分間インキュベートした。

【図22】図２２は、ＡＡＶ９ｓｃ．ｍｙｃ－ＰＢＤを示す。Ａ．ＡＡＶ９ｓｃ．ｍｙｃ－ＰＢＤは、ｍｙｃタグ付きのラットＰＢＤペプチド（ラットｍＡＫＡＰ ａａ ２１３４－２３１４）を発現するミニ遺伝子及び欠損した右ＩＴＲを含み、自己相補性を与え、おそらく遅延を少なくして、発現効果を上げる（Ａｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。ＡＡＶは、心臓栄養性（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｃ）血清型９カプシドタンパク質を有し、心筋細胞特異的なトリトロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）の制御下において、コードしたタンパク質を発現させる（Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。Ｂ．ＡＡＶ９ｓｃ．ｍｙｃ－ＰＢＤのためのシャトルプラスミドを示す。

【図23】図２３は、ＰＢＤアンカリングディスラプター治療を示す。（Ａ）ｍｙｃタグ付きのラットｍＡＫＡＰ ＰＢＤ（ＡＡＶ９ｓｃ．ｍｙｃ－ＰＢＤ）及びｍｙｃ－ＧＦＰ（ＡＡＶ９ｓｃ．ＧＦＰ）を、自己相補的なＡＡＶ９及び心筋細胞特異的なトリトロポニンＴプロモーターを使用してマウスに発現した（Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。（Ｂ）ＡＡＶ９ｓｃ．ｍｙｃ－ＰＢＤ処理研究の時間経過をＣ～Ｈに示す。マウスは研究開始時に８週齢であった。（Ｃ）エンドポイントにおける代表の心臓全体の写真を示す。横線＝５μｍ。（Ｄ～Ｈ）連続的なＭモードの心エコー法を示す。ｎは、ＡＡＶ９ｓｃ．ｍｙｃ－ＰＢＤ－８（緑色）、ＡＡＶ９ｓｃ．ＧＦＰ－５（黒色）である。＊所定の時点におけるコホートの差のＰ値。ＬＶリモデリング指標＝質量÷拡張終期容積。ＬＶＡＷ；ｄ－拡張期における左心室前壁厚。

【図24】図２４は、ヒトＲＳＫ３のヌクレオチド配列を示す（配列番号１５）。

【図25】図２５は、オープンリーディングフレームを翻訳したラットｍＡＫＡＰα ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号２及び１６）。

【図26】図２６は、オープンリーディングフレームを翻訳したヒトｍＡＫＡＰβ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号１７及び１８）。

【図27】図２７は、オープンリーディングフレームを翻訳したヒトｍＡＫＡＰα ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号１９及び２０）。

【図28】図２８は、ヒトｍＡＫＡＰのアミノ酸配列を示す（配列番号８）。ｍＡＫＡＰαは残基１から始まり、ｍＡＫＡＰβは残基２４３から始まる。ＰＢＤを太字で示す。

【図29】図２９は、ＡＡＶに発現されるヒトＰＢＤのアミノ酸配列を示す（配列番号９）。

【図30】図３０は、ＡＡＶ種に発現されるヒト及びラットにおけるＰＢＤのアミノ酸配列のアライメントを示す（配列番号９及び１２）。ラットＰＢＤは、Ｎ末端のＭｙｃ－タグ［ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ］（配列番号２１）を有する（図４）。

【図31】図３１は、ヒトＰＢＤシャトルプラスミドのマップを示す。

【図32】図３２は、ｐｓｃＡＡＶ－ｈｍＡＫＡＰ ＰＢＤプラスミドのヌクレオチド配列を示す（配列番号１０及び１１）。

【図33】図３３は、ＳＲＦリン酸化が拡張した心臓において減少することを示す。（Ａ～Ｅ）マウス心室のタンパク質抽出物を、ＴＡＣ又は偽生存手術の５分後（短期圧負荷、ｎ＝４，４）又は１６週後（心不全、ｎ＝１５，１９）においてリン酸化ＳＲＦ及び全ＳＲＦについてアッセイした。（Ａ）代表するウエスタンブロットを示す。（Ｂ）Ａの上部パネルのデンシトメトリーを示す。（Ｃ）圧負荷の５分後、ＲＳＫ３をＮ－１６ ＲＳＫ３特異的抗体を使用して免疫沈降し、ＯＲ４３ ＲＳＫ３抗体及びＲＳＫ３活性を示すＲＳＫ３ Ｓ^２１８のリン酸特異的抗体を使用して検出した。免疫沈降－ウエスタンアッセイを、ＲＳＫ３－／－マウスを使用して検証した（図示せず）。各条件においてｎ＝３。（Ｄ）１６週の圧負荷により心不全を誘発した。拡張期及び収縮期における左心室（ＬＶ）容積並びに駆出率のためのＭ－モードの心エコー法により、ＴＡＣ心臓が拡張し、機能障害を有することを示した。肺水腫の存在を示す浮腫肺重量の測定（脛骨長さに連動）により、ＴＡＣマウスが心不全であることを示した。（Ｅ）Ａの下部パネルのデンシトメトリーを示す。（Ｆ～Ｈ）ヒト患者の左心室組織（非虚血性及び虚血性心筋症並びに非拡張先天性心疾患並びにコントロールを含む）をＳＲＦ Ｓ^１０３リン酸化についてアッセイし、拡張期における正常（＜５．３ｃｍ、ｎ＝７）又は上昇（＞５．３ｃｍ、ｎ＝８）左心室内径（ＬＶＩＤ；ｄ）によって分けた。ブロットにおける等しいロードを、主なタンパク質のバンドにポンソーＳ染色を使用して確認した（図示せず）。

【発明を実施するための形態】

【0042】

上述のように、ＡＫＡＰ由来シグナリング複合体は、生理学的及び病理学的な心臓での
イベントの調節において中心的役割を果たす。ゆえに、本発明者らは、心臓の病的プロセ
スを抑えるためのアプローチとしてタンパク質とタンパク質との特有の相互作用を標的と
する薬剤を使用して個々のＡＫＡＰシグナリング複合体のシグナリング特性を阻害するこ
とを検討した。そうした治療方法は、所定の細胞応答の選択的阻害を可能にするため、従
来の治療アプローチに対する利点をもたらす。

【0043】

ｍＡＫＡＰを含むアンカータンパク質は、心肥大及び心不全の処置の治療標的である。
特に、本発明者らは、ＡＫＡＰ媒介のタンパク質とタンパク質との相互作用を阻害するこ
とが、心肥大をもたらすリモデリングプロセスを開始させる主要転写因子の活性化におい
て中心的役割を果たす酵素の活性化を調節するｍＡＫＡＰの能力を阻害するために使用可
能であるということを発見した。

【0044】

本発明の一態様は、心室形状の改善、すなわち、あまり長尺でない筋細胞によりＬＶ内
径を小さくすること、及び／又は、より幅の広い筋細胞によりＬＶ壁厚を大きくすること
で、壁ストレスを小さくして（ラプラスの法則）、ＨＦｒＥＦ傾向の心臓における収縮期
機能を向上させ得る。収縮期機能障害の防止は、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２
Ａ）の筋肉Ａ－キナーゼアンカータンパク質（ｍＡＫＡＰ、ＡＫＡＰ６としても知られる
）由来アンカリングディスラプターペプチドの発現に基づく新たな遺伝子治療ベクターに
おいて示されている。

【0045】

以下に記載されるように、本発明者らは、転写因子の血清応答因子（ＳＲＦ）が、心筋
細胞においてｍＡＫＡＰβシグナロソームにてＲＳＫ３によってＳｅｒ^１０３でリン酸化
され、ＳＲＦは次に、足場に結合したプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）によっ
て脱リン酸化され得るということを近年発見した。末期の疾患及びＨＦｒＥＦの特徴を示
す心室形態における偏心性変化を抑制する方法は、本発明の主題である。

【0046】

プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）は、これまで恒常的なハウスキーピング酵
素であると考えられていたが、多くのリン酸化イベントの調節に寄与することが明らかに
なってきている。例えば、心筋細胞において、ＰＰ２Ａは、カルシウム及びＭＡＰＫシグ
ナリングの調節に関与する（ｄｕＢｅｌｌ， Ｌｅｄｅｒｅｒ， ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ
１９９６； ｄｕＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ． ２００２；Ｌｉｕ ａｎｄ Ｈｏｆｍａｎ
ｎ ２００４）。ＰＰ２Ａは、安定で遍在的に発現される触媒（ＰＰ２Ａ－Ｃ）及び足場
（ＰＰ２Ａ－Ａ）サブユニットヘテロ二量体、並びに２１個の既知の多様なＢサブユニッ
トの１つからなるヘテロ三量体複合体として存在する、セリン／スレオニンホスファター
ゼである（Ｌｅｃｈｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． ２００１；Ｗｅｒａ ａｎｄ Ｈｅｍｍｉ
ｎｇｓ １９９５）。ＰＰ２Ａ Ｂサブユニットは、Ｂ（又はＰＲ５５）、Ｂ’（又はＢ
５６）及びＢ’’（又はＰＲ７２）と呼ばれる３つの関連しないファミリーに分類され、
触媒活性及びホスファターゼの細胞内標的化の両方を調節することが提示されている（Ｖ
ｉｒｓｈｕｐ ２０００）。本発明者らは、ｍＡＫＡＰ複合体に会合するプロテインホス
ファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）がＰＤＥ４Ｄ３セリン残基５４の脱リン酸化を触媒すること
でＰＤＥ４Ｄ３活性化を覆すことが可能であることを異種細胞におけるｍＡＫＡＰ複合体
の再構成によってこれまでに示している（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２０
１０）。マッピング研究により、Ｃ末端ｍＡＫＡＰドメイン（残基２０８５～２３１９）
がＰＰ２Ａを結合することを明らかにした（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２
０１０）。ｍＡＫＡＰとの結合は、ＰＤＥ４Ｄ３におけるＰＰ２Ａの機能に要求され、Ｃ
末端ドメインの欠失がベースライン及びフォルスコリン刺激性ＰＤＥ４Ｄ３活性の両方を
高めるというようになった。興味深いことに、心臓においてｍＡＫＡＰ複合体に会合した
ＰＰ２Ａホロ酵素は、ＰＰ２Ａ標的サブユニットＢ５６δを含む（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋ
ａ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。ＰＤＥ４Ｄ３のように、Ｂ５６δはＰＫＡ基質であり、
ｍＡＫＡＰ結合Ｂ５６δのＰＫＡリン酸化により、複合体において２倍ホスファターゼ活
性を高めた。したがって、ｍＡＫＡＰを有する異種細胞においてＰＫＡによってリン酸化
できないＢ５６δ突然変異体の発現により、ＰＤＥ４Ｄ３リン酸化の増大もたらした。こ
れらの知見は、共に、ｍＡＫＡＰ複合体に会合したＰＰ２ＡがＰＤＥ４Ｄ３脱リン酸化を
促進し、非刺激細胞においてＰＤＥ４Ｄ３を阻害すること、またアデニリルシクラーゼ活
性化及びＢ５６δリン酸化後にｃＡＭＰ誘導の正のフィードバックループを媒介すること
の両方について機能することを示した。このように、ＰＫＡ－ＰＤＥ４Ｄ３－ＰＰ２Ａ－
ｍＡＫＡＰ複合体は、プロテインキナーゼ及びホスファターゼがどのように分子シグナル
複合体に関与して局在細胞内シグナリングを動的に調節し得るかを例示している。心筋細
胞機能及び任意の可能性のある治療的意義との関連は、先行する研究において定義されな
かった（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。

【0047】

本発明者らは、心筋細胞におけるｍＡＫＡＰ結合ＰＰ２Ａの新たな作用機序、及びこの
機序の治療的意義をここで開示する。発明者らは、転写因子ＳＲＦがｍＡＫＡＰβ結合Ｒ
ＳＫ３によってＳｅｒ^１０３でリン酸化され（図１９）、Ｓｅｒ^１０３におけるＳＲＦの
リン酸化が求心性心筋細胞肥大を促進するエピジェネティックスイッチを構成することを
示している（図２０）。重要な点として、ＳＲＦのＳｅｒ^１０３が、ｍＡＫＡＰβ足場に
結合したＰＰ２Ａによって脱リン酸化できるということを開示する（図１９及び図２１）
。ＳＲＦのＳｅｒ^１０３におけるリン酸化は、求心性筋細胞肥大を誘発することが示され
ている（図２０）。これらの知見は、心筋細胞形態調節の新たな機序、及びｍＡＫＡＰβ
結合ＰＰ２Ａの予期せぬ機能の発見である。特に、発明者らは、ｍＡＫＡＰβ結合ＳＲＦ
のホスファターゼとしてのＰＰ２Ａの役割に一致して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｍＡＫ
ＡＰβからＰＰ２Ａを除くことにより、心筋細胞ＳＲＦのＳｅｒ^１０３のリン酸化（図１
９）、及び求心性心筋細胞肥大（図２０）を促進し得、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてマウスの
心筋梗塞後の収縮期機能障害の発症に対して保護し得る（図２３）。

【0048】

ｍＡＫＡＰβへのＰＰ２Ａ結合の阻害はｍＡＫＡＰβにおけるＰＰ２Ａ結合部位マッピ
ングの新たな改良を示し、及び心臓疾患においてｉｎ ｖｉｖｏでｍＡＫＡＰ－ＰＰ２Ａ
結合の阻害を初めて示す、ｍＡＫＡＰβ２１３４～２３１４（図１９）又はヒトｍＡＫＡ
Ｐβの２１３２～２３１９を含む競合ペプチドの発現によって行うことができる。ラット
のｍＡＫＡＰのものと相同のヒトｍＡＫＡＰのＣ末端ドメインもまたＰＰ２Ａを結合する
ことを示したということが留意される（図１０）。ゆえに、図２８～図３０に示されるラ
ットｍＡＫＡＰ２１３４～２３１４に対するヒト配列（ヒトｍＡＫＡＰアミノ酸残基相同
２１３２～２３１９）も、ＰＰ２Ａを結合すると予期され、ＰＰ２Ａ－ｍＡＫＡＰ結合競
合ペプチドを構成する。

【0049】

ウイルスに基づく遺伝子治療を介してＰＰ２Ａアンカリングディスラプターペプチドを
有効に送達することが、マウス梗塞モデルにおける効果によって示されている（図２３）
。あるいは、ＰＰ２Ａ－ｍＡＫＡＰβ相互作用を阻害し得るそうしたペプチドの送達は、
転写ペプチドのトランスアクチベーター及びポリアルギニンテイルなどの細胞透過性配列
、又はステアレートなどの脂肪由来基とのコンジュゲーションの使用によって向上するこ
とができる。また、ペプチド模倣（すなわち、元の配列における構造的に変化を伴うペプ
チドは、ペプチドの構造的及び機能的特性に影響なくエキソプロテアーゼ及びエンドプロ
テアーゼに対して保護を与える）の使用によって、安定性を向上させることができる。

【0050】

また、発明者らは、低分子ディスラプターがＡＫＡＰ由来複合体内の特定の相互作用を
標的とするために使用可能であるということを見いだした。低分子ディスラプターは、合
理的設計とスクリーニング手法とを組み合わせて同定可能である。そうした化合物は、慢
性心不全の処置のため、ＡＫＡＰの特定の結合面を標的とし、心筋細胞においてＡＫＡＰ
とＰＰ２Ａとの相互作用を阻害し、正常な心臓の収縮を向上させるように設計可能である
。

【0051】

本発明は、ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの相互作用によって引き起こされる任意の心臓病
態を処置する方法に関する。そうした心臓機能障害は、息切れや倦怠感などの兆候及び症
状をもたらし得、高血圧、冠動脈疾患、心筋梗塞、弁膜疾患、原発性心筋症、先天性心疾
患、不整脈、肺疾患、糖尿病、貧血症、甲状腺機能亢進、及び他の全身性疾患を含むがこ
れらに限定されない種々の原因があり得る。

【0052】

本発明において、本技術分野内の従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術
が使用され得る。そうした技術は文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” （４ｔｈ Ｅｄ．， ２０１２）； “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－
ＩＩＩ ［Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ． Ｍ．， ｅｄ． （１９９４）］； “Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ” Ｖｏｌｕｍｅｓ
Ｉ－ＩＩＩ ［Ｊ． Ｅ． Ｃｅｌｉｓ， ３ｒｄ ｅｄ． （２００５））］； “Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ
Ｉ－ＩＩＩ ［Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ．， ｅｄ． （２００５）］； “Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １
９８４）； “Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” ［Ｂ．Ｄ．
Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８５）］； “Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ” ［Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ
＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ， ｅｄｓ． （１９８４）］； “Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ
ｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” ［Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６）］；
“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ［ＩＲＬ Ｐｒ
ｅｓｓ， （１９８６）］； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉ
ｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” （１９８４）； Ｃ． Ｍａｃｈ
ｉｄａ、“Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ” （２０１０）； Ｊ． Ｒｅｉｄｈａａｒ－
Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃ． Ｒｏｎｄｉｎｏｎｅ、 “Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＲＮＡｉ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
” （２００９）が参照される。

【0053】

以下の定義及び省略形が本明細書において使用される。
ＡＣ５－ アデニリルシクラーゼタイプ５
ＡＣＥ－ アンジオテンシン変換酵素
ＡＮＦ－ 心房性ナトリウム利尿因子
ＡＲＶＭ－ 成体ラット心室筋細胞
ＣａＮ－ カルシニューリン
ＣＡｒＧボックス－ （ＣＣ９ＡＴ）_６ＧＧ
ＣＰＴ－ ｃＡＭＰ－８－（４－クロロフェニルチオ）アデノシン３’，５’－環状一
リン酸
ＣｓＡ－ シクロスポリンＡ
ＣＴＫＤ－ Ｃ末端キナーゼドメイン
ＥＲＫ－ 細胞外シグナル調節キナーゼ
ＦＢＳ－ ウシ胎仔血清
Ｆｓｋ－ フォルスコリン
ＧＦＰ－ 緑色蛍光タンパク質
ＧＰＣＲ－ Ｇ－タンパク質結合受容体ＨＤＡＣ－ヒストンデアセチラーゼ
Ｇｓ－ 刺激性Ｇタンパク質
ＧＳＴ－ グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＨＩＦ１α－低酸素誘導因子１α
ＨＦｒＥＦ－ 駆出率が低下した心不全
ＩＢＭＸ－ ３－イソブチル－１－メチルキサンチン
Ｉｓｏ－ イソプロテレノール
ＬＩＦ－ 白血病阻止因子
ＭＡＤＳ－ （ＭＣＭ１、ａｇａｍｏｕｓ、ｄｅｆｉｃｉｅｎｓ、ＳＲＦ）ドメイン－
ＣＡｒＧボックス（ＣＣ９ＡＴ）_６ＧＧ血清応答要素（ＳＲＥ）へのＤＮＡ結合を媒介す
る。ＭＡＤＳボックス遺伝子ファミリーは、ＡＲＧ８０を無視して最初の４つのメンバー
を指す頭字語として後に名づけられた。
出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＭＣＭ１
シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａからのＡＧＡＭＯＵＳ
キンギョソウＡｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓからのＤＥＦＩＣＩＥＮＳ
ヒトＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからのＳＲＦ
ｍＡＫＡＰ－ 筋肉Ａ－キナーゼアンカータンパク質
ｍＡＫＡＰα－ ニューロンに発現する選択的スプライシングアイソフォーム、２５５
ｋＤａ
ｍＡＫＡＰβ－ 横紋筋細胞に発現する選択的スプライシングアイソフォーム、２３０
ｋＤａ
ＭＡＰＫ－ 分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ
ＭＥＦ２－ 筋細胞エンハンサー因子－２
ＭｇＡｃ－ マグネシウムアセテート
ＭＩ－ 心筋梗塞
ＮＣＸ１－ ナトリウム／カルシウム交換体
ＮＦＡＴｃ－ 活性化Ｔ細胞の核内因子
ＮＲＶＭ－ 新生仔ラット心室筋細胞
ＮＴＫＤ－ Ｎ末端キナーゼドメイン
ＯＡ－ オカダ酸
ＰＢＤ－ＰＰ２Ａ－ アンカリングディスラプター－偏心性肥大を抑える
ＰＤＥ４Ｄ３－ ｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼタイプ４Ｄ３
ＰＤＫ１－ ３´ホスホイノシチド依存性キナーゼ１
ＰＥ－ フェニレフリン
ＰＨＤ－ プロリルヒドロキシラーゼ
ＰＩ４Ｐ－ ホスファチジルイノシトール－４－ホスフェート
ＰＫＡ－ プロテインキナーゼＡ
ＰＫＤ－ プロテインキナーゼＤ
ＰＫＩ－ プロテインキナーゼ阻害剤
ＰＬＣε－ ホスホリパーゼＣε
ＰＫＡ－ ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ
ＰＰ２Ａ－ プロテイン（セリン－スレオニン）ホスファターゼ－ＳＲＦのＳｅｒ^１０
３を脱リン酸化する
ＰＰ２Ｂ－ カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインホスファターゼ２Ｂ
ＲＢＤ－ アイソフォーム特異的Ｎ末端ＲＳＫ３ドメインは、ｍＡＫＡＰβ内の別個の
「ＲＳＫ３結合ドメイン」を残基１６９４～１８３３（ＲＢＤ）において結合する
ＲＳＫ－ ｐ９０リボソームＳ６キナーゼ
ＲｙＲ２－ タイプ２リアノジン受容体
ｓｉＲＮＡ－ 低分子干渉ＲＮＡオリゴヌクレオチド
ｓｈＲＮＡ－ 短ヘアピンＲＮＡ
ＳＲＥ－ 血清応答要素
ＳＲＦ－ 血清応答因子－転写因子（ＳＲＦのＳｅｒ^１０３のリン酸化により、求心性
筋細胞及び心臓の肥大が誘発される。リン酸化の阻害により、心臓構造及び機能を向上す
る。）
ｓｉＲＮＡ－ 低分子干渉ＲＮＡ
ＴＡＣ－ 大動脈縮窄術
ＴＣＡ－ トリクロロ酢酸
ＶＳＶ－ 水疱性口内炎ウイルス

【0054】

他の定義をしない限り、本明細書に使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発
明の属する技術分野における当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に
記載されるものと類似する又は同等の任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験におい
て使用可能であるが、好ましい方法及び材料を記載している。一般に、細胞及び分子生物
学並びに分子化学に関して使用される専門語及びそれらの技術は、周知のものであり、本
技術分野において通常使用されるものである。具体的に規定されていない特定の実験技術
は、一般に、本技術分野において周知であるとともに、本明細書において引用及び記載さ
れている種々の一般的でより具体的な参考文献に記載されるような従来の方法によって行
われる。明確にするため、以下の用語は下記において定義される。

【0055】

本発明は、心筋細胞肥大及び／又は機能障害をもたらす種々の細胞内シグナル及び経路
をＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの相互作用が媒介するということを認める。このように、本
発明者らは、心筋細胞肥大及び／又は機能障害を予防及び／又は処置するため、この相互
作用を阻害する種々の方法を発見した。

【0056】

したがって、本発明は心臓を障害から保護する方法を含み、該方法は、ＰＰ２ＡとｍＡ
ＫＡＰβとの相互作用を阻害する薬学的有効量の組成物を、そうした障害のリスクを有す
る患者に投与することで行われる。「薬学的有効量」は、送達の方法に基づいて経験的に
決定可能であり、送達の方法によって変わり得るということが理解される必要がある。

【0057】

また、本発明は、ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する薬学的有効量の組成
物を患者に投与することで心疾患を処置する方法にも関する。

【0058】

また、本発明は、ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する組成物にも関する。
特定の実施形態において、これらの阻害組成物又は「阻害剤」は、遺伝子治療送達を含む
任意の既知の方法で投与可能なペプチド阻害剤を含む。他の実施形態において、阻害剤は
低分子阻害剤であり得る。

【0059】

具体的に、本発明は、心臓を処置する又は障害から保護する方法及び組成物に関し、該
方法は、（１）ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する、（２）ＰＰ２ＡとｍＡ
ＫＡＰβとの活性を阻害する、又は（３）ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの発現を阻害する薬
学的有効量の組成物を、そうした障害のリスクを有する患者に投与することで行われる。

【0060】

また、本発明は、心臓を処置する又は障害から保護する方法にも関し、該方法は、ＰＰ
２Ａのアンカリングによって媒介される細胞プロセスを阻害する薬学的有効量の組成物を
、そうした障害のリスクを有する患者に投与することで行われる。

【0061】

一実施形態において、組成物はｍＡＫＡＰβとペプチドを含む。好ましい実施形態にお
いて、ｍＡＫＡＰβペプチドは、ｍＡＫＡＰβアミノ酸配列のカルボキシ末端から得られ
る。特に好ましい実施形態において、ｍＡＫＡＰβペプチドは、少なくともｍＡＫＡＰβ
アミノ酸配列のアミノ酸２０８３～２３１９のフラグメントである。

【0062】

好ましい一実施形態において、ｍＡＫＡＰβペプチドは、少なくともｍＡＫＡＰβアミ
ノ酸配列のアミノ酸２１３３～２３１９のフラグメントである。

【0063】

他の実施形態において、組成物は、ＰＰ２Ａ及びｍＡＫＡＰβのいずれか又は両方の発
現を阻害する低分子干渉ＲＮＡのｓｉＲＮＡを含む。好ましい実施形態において、ｍＡＫ
ＡＰβの発現を阻害するｓｉＲＮＡは、短ヘアピンＲＮＡ発現ベクター又は生物学的薬剤
（ｓｈＲＮＡ）の投与後ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生成される。

【0064】

本発明の組成物は直接投与可能である、又はウイルスベクターを使用して投与可能であ
る。好ましい実施形態において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。

【0065】

他の実施形態において、組成物は低分子阻害剤を含む。好ましい実施形態において、低
分子はＰＰ２Ａ阻害剤である。

【0066】

他の実施形態において、組成物は、ｍＡＫＡＰβの結合、発現又は活性を阻害する分子
を含む。好ましい実施形態において、分子はｍＡＫＡＰβペプチドである。分子は、アデ
ノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含むウイルスベクターを使用して発現することができる。

【0067】

さらに他の実施形態において、組成物は、ｍＡＫＡＰβ媒介細胞プロセスを妨害する分
子を含む。好ましい実施形態において、分子は、ＰＰ２Ａのアンカリングを妨害する。

【0068】

また、本発明は、ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの結合相互作用が、直接的に、又はＰＰ２
ＡとｍＡＫＡＰβとの結合における下流での作用を測定することで、測定される、心臓疾
患の傾向を判断するための診断アッセイに関する。また、本発明はそうしたアッセイのた
めの試験キットを提供する。

【0069】

さらに他の実施形態において、阻害剤は、ｓｈＲＮＡを含む、アンチセンスＲＮＡ、リ
ボザイム、及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＰＰ２Ａ及びｍＡＫＡＰβの発
現を阻害する任意の分子を含む。

【0070】

また、本発明は、ＰＰ２Ａ及びｍＡＫＡＰβの発現及び／又は結合を阻害するために有
効な、可能性のある薬剤のスクリーニングのためのアッセイ系を含む。一態様において、
被験薬剤は、コントロールとの比較によって、ＰＰ２Ａ及びｍＡＫＡＰβの結合活性にお
けるその作用を測定するため、ＰＰ２Ａ及びｍＡＫＡＰβを含む細胞サンプル、又はＰＰ
２Ａ及びｍＡＫＡＰβを含有する抽出物に投与することができる。また、本発明はそうし
たアッセイのための試験キットを提供する。

【0071】

本発明のペプチド組成物の調製において、ＰＰ２Ａ又はｍＡＫＡＰ（図３）のアミノ酸
配列のすべて又は一部を使用することができる。一実施形態において、ｍＡＫＡＰβタン
パク質のカルボキシ末端領域は阻害剤として使用される。好ましくは、ｍＡＫＡＰ配列の
少なくとも１０個のアミノ酸を使用する。より好ましくは、ｍＡＫＡＰ配列の少なくとも
２５個のアミノ酸を使用する。最も好ましくは、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３３～２３１
９のペプチド部分を使用する。

【0072】

種々のアミノ酸置換、欠失、又は挿入も、ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害
する阻害ペプチドの能力を向上させ得るということが理解される必要がある。このような
置換の突然変異は、非保存的な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特性を有するアミノ
酸群に属するアミノ酸を、他の群に属するアミノ酸に変化させることによって）、又は保
存的な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸群に属するアミノ酸を
、同じ群に属するアミノ酸に変化させることによって）、得られたタンパク質のアミノ酸
を変化させるように行われ得る。そうして保存的に変化させることで、一般に、得られた
タンパク質の構造及び機能の変化が少なくなる。非保存的に変化させることで、得られた
タンパク質の構造、活性、又は機能をより変化させやすい。本発明は、得られたタンパク
質の活性又は結合特性を大きく変えるものではない保存的な変化を含む配列を含むと考え
る必要がある。

【0073】

以下は、種々のアミノ酸分類の一例である。
非極性Ｒ基のアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。
極性無電荷Ｒ基のアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、
アスパラギン、グルタミン。
極性電荷Ｒ基のアミノ酸（ｐＨ６．０で負電荷）：アスパラギン酸、グルタミン酸。
塩基性のアミノ酸（ｐＨ６．０で正電荷）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６
．０におけるもの）。

【0074】

他の分類は、フェニル基を有するアミノ酸であり得る：フェニルアラニン、トリプトフ
ァン、チロシン。

【0075】

他の分類は、分子量によるもの（すなわちＲ基のサイズ）であり得る：グリシン（７５
）、アラニン（８９）、セリン（１０５）、プロリン（１１５）、バリン（１１７）、ス
レオニン（１１９）、システイン（１２１）、ロイシン（１３１）、イソロイシン（１３
１）、アスパラギン（１３２）、アスパラギン酸（１３３）、グルタミン（１４６）、リ
ジン（１４６）、グルタミン酸（１４７）、メチオニン（１４９）、ヒスチジン（ｐＨ６
．０におけるもの）（１５５）、フェニルアラニン（１６５）、アルギニン（１７４）、
チロシン（１８１）、トリプトファン（２０４）。

【0076】

特に好ましい置換は、
－ 正電荷を維持可能であるように、Ａｒｇに対してＬｙｓ、及びその逆のもの、
－ 負電荷を維持可能であるように、Ａｓｐに対してＧｌｕ、及びその逆のもの、
－ 遊離－ＯＨを維持可能であるように、Ｔｈｒに対してＳｅｒ、並びに
－ 遊離ＮＨ_２を維持可能であるように、Ａｓｎに対してＧｌｎ、である。

【0077】

また、アミノ酸置換は、特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換するために導入する
ことができる。例として、Ｃｙｓは、他のＣｙｓとのジスルフィド架橋のために候補部位
として導入することができる。Ｈｉｓは、特に「触媒」部位として導入することができる
（すなわち、Ｈｉｓは、酸又は塩基として作用し得、生化学的触媒における最も一般的な
アミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質の構造においてβターンを誘発するその特に平
面である構造のため、導入することができる。少なくとも約７０％の（好ましくは少なく
とも約８０％の、最も好ましくは少なくとも約９０％又は９５％の）アミノ酸残基が同一
である、又は保存的置換に相当するとき、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」である
。

【0078】

同様に、本発明において使用されるヌクレオチド配列にはまた、置換、欠失、又は挿入
を行うことができる。特定のアミノ酸をコードするコドンが縮重する場合、特定のアミノ
酸をコードする任意のコドンを使用することができる。さらに、１つのアミノ酸を他のも
のに置換することが求められる場合、既知の遺伝コードに従ってヌクレオチド配列を修飾
することができる。

【0079】

また、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを修飾することができる。特に修飾ヌクレ
オチド及びオリゴヌクレオチドの記載のため、参照によってその全体が援用される米国特
許第７，８０７，８１６号は、例の修飾を記載している。

【0080】

少なくとも約７０％の（好ましくは少なくとも約８０％の、最も好ましくは少なくとも
約９０％又は９５％の）ヌクレオチドが同一であるとき、２つのヌクレオチド配列は「実
質的に相同」又は「実質的に同一」である。

【0081】

少なくとも約７０％の（好ましくは少なくとも約８０％の、最も好ましくは少なくとも
約９０％又は９５％の）ヌクレオチドが標的配列に水素結合可能であるとき、２つのヌク
レオチド配列は「実質的に相補的」である。

【0082】

「標準ハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄
の両方において５×ＳＳＣ及び６０Ｃと実質的に同等の塩条件及び温度条件を指す。しか
しながら、当業者は、そうした「標準ハイブリダイゼーション条件」は、バッファーにお
けるナトリウム及びマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さ及び濃度、ミスマッチ
率、及びホルムアミド率などを含む特定の条件によって決まるということ理解するであろ
う。また、「標準ハイブリダイゼーション条件」の決定において重要であるのは、ハイブ
リダイゼーションする２つの配列がＲＮＡ－ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮ、又はＲＮＡ－ＤＮＡ
であるかどうかである。そうした標準ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼー
ションが典型的に、望まれるならより高い厳密性の洗浄で、予想した又は決定したＴ_ｍよ
り１０～２０Ｃ低い、周知の製法に従って当業者によって容易に決定される。

【0083】

「薬学的に許容される」という用語は、生理学的に許容可能であるとともに、ヒトに投
与すると、胃の不調、及びめまいなどのアレルギー性の又類似の有害反応を通常は生じさ
せない分子実体及び組成物を指す。

【0084】

「治療有効量」という用語は、心筋細胞の特徴における臨床的に有意な変化を、予防す
る、好ましくは、少なくとも約３０パ－セント、より好ましくは少なくとも５０パーセン
ト、最も好ましくは少なくとも９０パーセント減少させるために十分な量を意味するよう
に、本明細書において使用される。

【0085】

有効成分としてポリペプチド、類似体、又は活性フラグメントを含む治療用組成物の調
製は、本技術分野において十分に理解されている。典型的には、そうした組成物は、液剤
又は懸濁剤としての注射剤として調製されるが、注射の前に液体内の溶解又は懸濁に適す
る固体形態も調製することができる。また、製剤は乳化させることができる。活性治療成
分は、多くの場合、薬学的に許容されるとともに有効成分に適合する賦形剤と混合される
。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタ
ノールなど、及びそれらの組合せである。さらに、望まれるなら、組成物は、有効成分の
効果を高める湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含むことができる。

【0086】

ポリペプチド、類似体、又は活性フラグメント、及び低分子阻害剤は、薬学的に許容さ
れる中和塩形態として治療用組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は
、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマンデル
酸などの有機酸とともに形成された、（ポリペプチド又は抗体分子の遊離アミノ基ととも
に形成された）酸付加塩を含む。また、遊離カルボキシル基から形成された塩は、例えば
ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは水酸化第二鉄などの無機塩
基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチ
ジン、及びプロカインなどの有機塩基由来であってもよい。

【0087】

本発明の治療用組成物は、例えば単位用量の注射によって、従来法で静脈内に投与され
る。本発明の治療用組成物に関して使用されるとき「単位用量」という用語は、ヒト用の
単位投与量として適した物理的に個別のユニットに関し、各ユニットは、必要とされる希
釈剤、すなわち担体又はビヒクルを伴って、望まれる治療的作用を生じるように計算され
た所定量の活性物質を含む。

【0088】

組成物は、投与製剤に適合する方法において、治療有効量で投与される。投与される量
は、処置する対象、有効成分を使用する対象の免疫系の能力、及び所望されるＰＰ２Ａ－
ｍＡＫＡＰβ結合の阻害の程度によって決まる。投与に必要とされる正確な有効成分量は
、医師の判断によって決まり、各個人に固有である。しかしながら、適切な投与量は、１
日あたり、個人の体重キログラムあたり、約０．１～２０、好ましくは約０．５～約１０
、及びより好ましくは１～数ミリグラムの範囲の有効成分であり、投与経路によって決ま
り得る。また、初期の投与及びブースター注射の適切な用法は変わり得るが、初期投与、
及びその後の注射又は他の投与による１時間以上の間隔でのその後の再投与が典型とされ
る。あるいは、血液において１０ナノモル～１０マイクロモルの濃度を維持するために十
分な静脈内持続注入が考慮される。

【0089】

阻害剤がサイトゾルに達する必要性があることから、本発明におけるペプチドは、細胞
膜における移動を可能にするように修飾する必要があり得る、又はペプチド阻害剤をコー
ドするベクターにより発現される必要があり得る。同様に、核酸阻害剤（ｓｉＲＮＡ、ｓ
ｈＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡを含む）をベクターによって発現可能である。標的と
される細胞に入ることができる任意のベクターを本発明において使用することができる。
特に、ウイルスベクターは細胞に「感染」し、望まれるＲＮＡ又はペプチドを発現するこ
とができる。細胞に「感染」することができる任意のウイルスベクターを使用することが
できる。特に好ましいウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。

【0090】

ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉と呼ばれるプロセスによって標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する
。ｓｉＲＮＡが、標的ｍＲＮＡに対して完全に相補的であるとき、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮ
Ａ分解を促進することによって作用する。ｓｈＲＮＡは、特別なｓｉＲＮＡの種類として
、オリゴヌクレオチドとして作製されるというｓｉＲＮＡに対する所定の利点を有する。
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的に実験室内で合成され、ｓｉＲＮＡを細胞質に
送達する送達系を使用して細胞に送達される。対照的に、ｓｈＲＮＡは、ベクターによっ
て細胞核に送達されるミニ遺伝子として発現され、ｓｈＲＮＡが、転写の後、ドローシャ
やダイサーなどの細胞酵素によって成熟ｓｉＲＮＡ種へとプロセスされる。ｓｉＲＮＡは
通常４８時間後に９９％分解される一方、ｓｈＲＮＡは最大３年発現可能である。さらに
、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡよりもはるかに少ないコピー数で送達可能であり（５コピー
対低ｎＭ）、オフターゲット作用、免疫活性化、炎症、及び毒性を生じることははるかに
少ない。ｓｉＲＮＡは、高用量を許容可能な急性疾患病態に適切であるが、ｓｈＲＮＡは
、低用量が望まれる慢性の重篤な疾患又は障害に適切である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂ
ｅｎｉｔｅｃ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｓｉｒｎａ－ｖｓ－ｓｈｒｎａ）。

【0091】

ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの設計ガイドラインは、Ｅｌｂａｓｈｉｒ（２００１）の文
献、並びにｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／
ｈｏｍｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ａｍｂｉｏｎ－ｔｅｃｈ－ｓｕｐｐｏｒｔ／ｒｎａｉ
－ｓｉｒｎａ／ｇｅｎｅｒａｌ－ａｒｔｉｃｌｅｓ／－ｓｉｒｎａ－ｄｅｓｉｇｎ－ｇｕ
ｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｈｔｍｌ及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／
ｒｅｖｉｅｗ－ｓｉｒｎａ－ｓｈｒｎａ－ｄｅｓｉｇｎを含む種々のウエブサイトにおい
て見受けられ、そのすべての全体が参照によって本明細書に援用される。好ましくは、第
１ヌクレオチドはＡ又はＧである。２５～２９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、より短いも
のよりも有効であるが、２本鎖長１９～２１のｓｈＲＮＡは、より長いものほども有効で
あると考えられる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、好ましくは１９～２９ヌクレオチドで
ある。ｓｈＲＮＡにおけるループ配列は３～９ヌクレオチド長であり得、５、７又は９ヌ
クレオチドが好ましい。

【0092】

低分子阻害剤に関して、ＰＰ２ＡとｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する任意の低分子
を使用することができる。さらに、ＰＰ２Ａ及び／又はｍＡＫＡＰβの活性を阻害する任
意の低分子を使用することができる。

【0093】

類似の構造及び機能の低分子は、同様に合理的及びスクリーニング手法によって決定可
能である。

【0094】

同様に、ＰＰ２Ａ及び／又はｍＡＫＡＰβの発現を阻害する任意の低分子を使用するこ
とができる。

【0095】

さらにまた詳細には、本発明は、その好ましい実施形態を示す以下の項によって記載さ
れる。
１．駆出率が低下した心不全を処置又は予防する方法であって、患者の心臓細胞に、血
清応答因子（ＳＲＦ）におけるリン酸化レベルを維持する組成物を投与することを含む方
法。
２．ＳＲＦはＳｅｒ^１０３においてリン酸化される、項１に記載の方法。
３．プロテイン（セリン－スレオニン）ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の脱リン酸活
性を阻害する、項１に記載の方法。
４．ＰＰ２Ａの筋肉Ａ－キナーゼアンカータンパク質（ｍＡＫＡＰβ）へのアンカリン
グを阻害する、項３に記載の方法。
５．組成物は、ｍＡＫＡＰβのフラグメントを含む、項４に記載の方法。
６．組成物は、ｍＡＫＡＰβのフラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を有する
アミノ酸配列を含む、項５に記載の方法。
７．組成物は、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９のフラグメントを含む、項５
に記載の方法。
８．組成物は、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９を含む、項５に記載の方法。
９．組成物は、ＰＰ２Ａのフラグメントを含む、項４に記載の方法。
１０．組成物はｍＡＫＡＰのフラグメントをコードするベクターを含む、項４に記載の
方法。
１１．組成物は、ｍＡＫＡＰのフラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を有する
アミノ酸配列をコードするベクターを含む、項４に記載の方法。
１２．ベクターは、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９のフラグメントをコード
する、項１０に記載の方法。
１３．ベクターは、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９をコードする、項１０に
記載の方法。
１４．ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項１０に記載の方法。
１５．ＰＰ２ＡのｍＡＫＡＰへのアンカリングを阻害する分子をコードする組成物。
１６．分子は、ｍＡＫＡＰのフラグメントを含む、項１５に記載の組成物。
１７．ｍＡＫＡＰのフラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配
列を含む、項１５に記載の組成物。
１８．ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９のフラグメントを含む、項１６に記載
の組成物。
１９．ｍＡＫＡＰβのアミノ酸２１３２～２３１９を含む、項１６に記載の組成物。
２０．ＰＰ２Ａのフラグメントを含む、項１５に記載の組成物。
２１．ＰＰ２ＡのｍＡＫＡＰへのアンカリングを阻害する分子をコードするベクターを
含む組成物。
２２．ベクターは、ｍＡＫＡＰのフラグメントをコードする、項２１に記載の組成物。
２３．ベクターは、ｍＡＫＡＰのフラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を有す
るアミノ酸配列をコードする、項２１に記載の組成物。
２４．ベクターは、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９のフラグメントをコード
する、項２１に記載の組成物。
２５．ベクターは、ｍＡＫＡＰのアミノ酸２１３２～２３１９をコードする、項２１に
記載の組成物。
２６．ベクターは、ＰＰ２Ａのフラグメントをコードする、項２１に記載の組成物。
２７．ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項２１に記載の組成物。

【0096】

以下の実施例は本発明を理解しやすくするために提供するものであって、その真の範囲
は添付の特許請求の範囲に示される。示される方法において、本発明の趣旨を逸脱するこ
となく変形を行うことができるということが理解される。

【実施例0097】

本発明の組成物及びプロセスは、例示のみを意図するとともに本発明の範囲を限定する
ものではない以下の実施例に関してより十分に理解される。開示の実施形態への種々の変
更及び改変は、当業者に明らかであろう。また、このような変更及び改変は、限定はしな
いが、本発明のプロセス、配合物及び／又は方法に関するものを含み、本発明の趣旨及び
添付の特許請求の範囲から逸脱せずに行うことができる。

【0098】

［実施例１］
ｍＡＫＡＰβシグナロソームによるＳＲＦ調節
材料及び方法
新生仔ラット心室筋細胞の培養：
生後１～３日のスプラーグドーリーラットを断頭し、切除した心臓を１×ＡＤＳバッフ
ァーに配置した（１１６ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ
_４、５．５ｍＭ グルコース、５．４ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｍＭ ＭｇＳＯ_４、ｐＨ７．
３５）。心房を慎重に取り除き、血液を洗浄して除いた。心室を細かく刻み、軽く振とう
させながら、３．３ｍｇのタイプＩＩコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、２３０Ｕ
／ｍｇ）及び９ｍｇのパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ）を含む１５ｍＬの１×ＡＤＳバッフ
ァーにおいて３７℃でインキュベートした。１５分後、ほぐした心筋細胞を５０ｇで１分
間遠心分離によって分離し、４ｍＬのウマ血清に再懸濁して、時折かく拌しながら３７℃
でインキュベートした。収量を最大にするため、筋細胞の酵素消化及び単離のステップを
１０～１２回繰り返した。筋細胞をプールし、再び５０ｇで２分間遠心沈殿し、１０％ウ
マ血清及び５％ウシ胎仔血清を添加したメンテナンス培地（ＤＭＥＭ：Ｍ１９９、４：１
）に再懸濁した。任意の混入線維芽細胞を取り除くため、ゼラチン被膜組織培養プラスチ
ック容器にプレーティングする前に、細胞を１時間プリプレーティングした。この作業に
より、９０％を超える純度の心筋細胞を得た。培養の翌日、培地を０．１ｍＭのブロモデ
オキシウリジンを含むメンテナンス培地に変えて線維芽細胞成長を抑えた。

【0099】

成体ラット心室筋細胞の単離及び培養：
２～３か月齢のラットに、心臓切除のため１０００Ｕのヘパリン処置後、ケタミン（８
０～１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５～１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に使用して麻酔
をかけた。心臓を９５％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２で予め平衡化した冷灌流バッファー（ＮａＣ
ｌ １２０ｍＭ、ＫＣｌ ５．４ｍＭ、Ｎａ_２ＨＰＯ４ ７Ｈ_２Ｏ １．２ｍＭ、ＮａＨ
ＣＯ_３ ２０．０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ １．６ｍＭ、タウリン ５ｍＭ、グルコ
ース ５．６ｍＭ、２，３－ブタンジオンモノオキシム １０ ｍＭ）内に直ちに移動さ
せた。外来性の組織を取り除いた後、心臓をハーバードランゲンドルフ装置カニューレに
大動脈を介して取り付けた。Ｃａ^２＋非含有灌流を使用して、残りの血液を８～１０ｍＬ
／ｍｉｎの一定速度において３７℃で流し出した。その後、心臓を１２５ｍｇのタイプＩ
Ｉコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、２４５Ｕ／ｍｇ）、０．１ｍｇのプロテアー
ゼ（Ｓｉｇｍａ ｔｙｐｅ ＸＩＶ）及び０．１％のＢＳＡを含む５０ｍＬ灌流バッファ
ーでの循環灌流によって消化させた。灌流後、心房を取り除き、心室筋細胞をスライスし
、ピペッティングを繰り返してほぐした。細胞片を２００μｍのナイロンメッシュによっ
てろ過し、筋細胞を５０ｇで１分間の遠心分離によって採取した。バッファー内のＣａ^２
＋濃度は、１．８ｍＭまで徐々に回復し、筋細胞を、ＡＣＣＴ培地（Ｍ１９９培地（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ １１１５０－０５９）、クレアチン ５ｍＭ、Ｌ－カルニチン ２ｍ
Ｍ、タウリン ５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ ２５ｍＭ、２，３－ブタンジオンモノオキシム １
０ｍＭ、 ＢＳＡ ０．２％ 及び１×インスリン－トランスフェリン－セレン添加）に
再懸濁し、１０μｇ／ｍｌラミニンを予め被膜したディッシュにプレーティングした。細
胞を、プレーティングの１．５時間後にＡＣＣＴ培地で洗浄し、それぞれ１００～２００
の感染多重度（ＭＯＩ）のアデノウイルス及びＤｈａｒｍａｆｅｃｔ１（Ｄｈａｒｍａｃ
ｏｎ）と混合させた１００ｎｍｏｌ／ＬのｓｉＲＮＡを使用して、アデノウイルス感染又
はｓｉＲＮＡ遺伝子導入を行った。アドレナリン作動剤を翌日添加して、生化学アッセイ
及び形態学的測定を刺激の２４時間後に行った。

【0100】

その他の細胞培養：
ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ－７細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ中に
おいて維持した。これらの細胞に、製造者によって提示されたように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ
ａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一時的に遺伝子導入した、又はアデノウ
イルス及びＡｄｅｎｏ－Ｘ Ｔｅｔ－Ｏｆｆウイルス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で感染させた
。

【0101】

ルシフェラーゼアッセイ：
２４ウェルディッシュ内の２２５，０００個の新生仔ラット心室筋細胞に、コントロー
ル又はＲＳＫ３特異的ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｎＭ）及びＤｈａｒｍａｆｅ
ｃｔ１試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を遺伝子導入した。翌日、細胞を培地で洗浄し
た後、筋細胞に、１００ｎｇのＳＲＥ－ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼ）及び１００ｎｇ
の－３６Ｐｒｌ－ｒｌｕｃ（ウミシイタケルシフェラーゼ）レポータープラスミド及びＴ
ｒａｎｓｆａｓｔ試薬を１時間再遺伝子導入し、その後、４％ウマ血清を含む培地中で一
晩培養してから、培地で洗浄し、１０μＭのＰＥあり又はなしで１日インキュベートした
。試料を、１００μｌのＰＬＢ中に採取し、Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼキッ
ト及びＢｅｒｔｈｏｌｄ Ｃｅｎｔｒｏ Ｘルミノメーターを使用してアッセイを行った
。

【0102】

免疫共沈降：
組織はポリトロンを使用してホモジナイズした、又は細胞を、阻害剤カクテル（１μｇ
／ｍｌ ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ ペプスタチン、１ｍＭ ベンズアミジン、１ｍＭ
ＡＥＢＳＦ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム）を含むＩＰバ
ッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１０％ グリセロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、１ｍＭ ＤＴＴ）中に溶
解した。可溶性タンパク質を、３～１０，０００ｇで１０分間の遠心分離によって分離し
た。抗体及びタンパク質－Ｇアガロースビーズ（５０％スラリー、Ｕｐｓｔａｔｅ）を抽
出物に添加し、揺らしながら４℃で一晩インキュベートした。ビーズをＩＰバッファーで
４℃において４回洗浄した。結合したタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおいてサイ
ズにより分別し、富士フィルムＬＡＳ－３０００又はＧＥ－ＡＩ６００イメージングシス
テムを使用してこれまでに記載されたようにイムノブロッティングによって現像した（４
６）。タンパク質マーカーはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎ
ｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１６１０３７３）であった。

【0103】

免疫細胞化学：
カバースリップ上の筋細胞をＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒド中で１時間固定し、
０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理し、０．２％ＢＳＡ及び１％ウマ血清を含む
ＰＢＳ中で遮断した。その後、スライドを、ブロッキングバッファー中で希釈した一次抗
体及びＡｌｅｘａ蛍光色素コンジュゲート特異的２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：
１０００）とともに１時間連続的にインキュベートした。スリップをブロッキングバッフ
ァーで３回洗浄した。１μｇ／ｍＬのヘキスト３３２５８を最後の洗浄に含ませ、核標識
を停止させた。蛍光顕微鏡観察のためＳｌｏｗＦａｄｅ Ｇｏｌｄ退色防止バッファー（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ３６９３８）中でスライドを封止した。ライカＤＭ４０００顕
微鏡を使用して広視野イメージを得た。

【0104】

ＧＳＴ－ＳＲＦリン酸化アッセイ：
ＧＳＴ－ＳＲＦタンパク質を、これまでに記載されたようにＢＬ２１ Ｅ．ｃｏｌｉ及
びグルタチオン－セファロースを使用して精製した（Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ． ２０
１２）。ビーズ上のＧＳＴ－ＳＲＦを、ＡＴＰ含有キナーゼバッファー中で０．５μｇの
活性組換え全長Ｈｉｓ_６タグ付きヒトＲＳＫ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １４－４６２）＋
／－５０ｎＭのＢＩ－Ｄ１８７０とともに３０分間インキュベートした。その後、ＧＳＴ
－ＳＲＦビーズを、レムリバッファーで溶出するか、又はＰＰ２Ａホスファターゼバッフ
ァーで洗浄してから、５０ｎｇのＰＰ２Ａ＋／－１０ｎＭオカダ酸の存在下でさらに３０
分間インキュベートした後、レムリバッファーで溶出した。等しいＧＳＴ－ＳＲＦタンパ
ク質のロード量を、ポンソー染色によって測定し、ＳＲＦのリン酸化をホスホ－ＳＲＦ
Ｓ^１０３特異的抗体を使用して検出した。

【0105】

プラスミドコンストラクト
ＳＲＥ－ルシフェラーゼレポーター －
ＳＲＥ－ｌｕｃを、これまでに記載されたように（Ｋａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．
１９９１）ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドにおいて－３６ｂｐのラットプロ
ラクチンプロモーターの上流でＸｈｏ Ｉ部位においてｃ－ｆｏｓＳＲＦ応答エレメント
（ＴＣＧＡＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＴＡ ＴＴＡ ＧＧＡ ＣＡＴ ＣＴＧ）（
配列番号 ）（Ｔｒｅｉｓｍａｎ １９８５）の２つのコピーをサブクローニングするこ
とによって作製した。

【0106】

－３６Ｐｒｌ－ウミシイタケルシフェラーゼ －
ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ親和性末端を有する-－３６－＋３６のラットプロラク
チンプロモーターを含むオリゴヌクレオチド（ＧＡＴＣＴ ＣＧＡ ＡＧＧ ＴＴＴ Ａ
ＴＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＡＴ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＣＡ
ＧＴＧ ＧＴＴ ＣＴＣ ＴＴＡ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＴＧ
ＴＧＧ ＴＣ）（配列番号 ）を、ｐＲＬ－ヌル（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニン
グして、コントロールのウミシイタケルシフェラーゼベクターを得た。

【0107】

ｍＡＫＡＰフラグメント発現ベクター：
ｐＳ－ＥＧＦＰＣ１－ｍＡＫＡＰ－１６９４－１８３３－ｍｈアデノウイルスシャトル
ベクターを、ｐＥＧＦＰＣ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）においてｍｙｃ、Ｈｉｓ_６、及びＧＦ
Ｐタグ付きｍＡＫＡＰ ａａ １６９４－１８３３フラグメント（ＲＢＤ）をコードする
ｃＤＮＡ（Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）を、それまでにＣＭＶ
最初期プロモーターを含むように修飾したｐＴＲＥシャトルベクターにサブクローニング
することによって作製した。ｐＳ－ＥＧＦＰＣ１－ｍｈを、ｍＡＫＡＰ配列の欠失を除い
て、同様に設計する。ｍｙｃタグ付きｍＡＫＡＰ ａａ ２１３４－２３１４（ＰＢＤ）
フラグメントをコードするｐＴＲＥ－ｍｙｃ－ｍＡＫＡＰ ＰＢＤを、Ａｐａ Ｉ－Ｓｃ
ａ Ｉにおいて、全長の、Ｎ末端にｍｙｃタグ付きのｍＡＫＡＰのｃＤＮＡを含むｐＴＲ
Ｅ－ｍｙｃ－ｍＡＫＡＰを消化、及びライゲーションすることによって作製した。β－ガ
ラクトシダーゼコントロールタンパク質をコードするｐＴＲＥ－βｇａｌをＣｌｏｎｔｅ
ｃｈから得た。ＡＡＶ－ＲＢＤを作製するために使用したｐＡｃＴｎＴＳ－ＥＧＦＰ－ｍ
ＡＫＡＰ １６９４－１８３３ｍｈプラスミドは、ｐＥＧＦＰＣ１－ｒｍＡＫＡＰ－１６
９４－１８３３－ｍｈのＮｈｅＩ－ＢａｍＨＩフラグメント（Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ，
ｅｔ ａｌ． ２０１３）を、バージニア大学のＢｒｅｎｔ Ｆｒｅｎｃｈ博士から寛
大にも提供されたｐＡｃＴｎＴｓ（Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ． ２０１１）にサブクロ
ーニングすることによって作製した。ＡＡＶ－ＧＦＰコントロールウイルスを作製するた
めのｐＡｃＴｎＴｓ－ＥＧＦＰ－ｍｈプラスミドを、Ａｃｃ６５Ｉ及びＢｓＲＧＩでｐＡ
ｃＴｎＴＳ－ＥＧＦＰ－ｍＡＫＡＰ １６９４－１８３３ｍｈを消化、平滑末端化、及び
ライゲーションすることによって作製した。他のｍＡＫＡＰプラスミドは、これまでに記
載されたようなものであった（Ｐａｒｅ， Ｂａｕｍａｎ， ｅｔ ａｌ． ２００５；
Ｋａｐｉｌｏｆｆ， Ｊａｃｋｓｏｎ， ａｎｄ Ａｉｒｈａｒｔ ２００１）。

【0108】

ＳＲＦコンストラクト －
Ｆｌａｇタグ付きＳＲＦタンパク質を発現するｐＦｌａｇ－ＳＲＦを、ｐＣＧＮ－ＳＲ
Ｆ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１１９７７）からのヒトＳＲＦのｃＤＮＡを、ｐＳＨ１
６０ｃ ＮＦＡＴｃ１発現プラスミドのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングす
ることによって作製した（Ｈｏ ｅｔ ａｌ． １９９５）。ｐＴＲＥ－Ｆｌａｇ－ｈＳ
ＲＦは、Ｆｌａｇタグ付きＳＲＦのｃＤＮＡを、ｐＴＲＥシャトルベクター（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）にサブクローニングすることによって作製した。ｐＴＲＥ－３ｘＨＡ－ｈＳＲＦ
は、Ｆｌａｇタグを３個の直列型ＨＡタグに置換するｐＴＲＥ－Ｆｌａｇ－ｈＳＲＦのＳ
ｆｉＩ及びＳａｎＤＩ部位内のカスタム配列を挿入することによって作製した。Ｓ１０３
Ａ及びＳ１０３Ｄ突然変異を、部位特異的突然変異誘発によってｐＴＲＥプラスミドに導
入して、ＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧ（配列番号 ）の代わりに、配列ＡＴＣＧＣＴＧＧ
ＣＡＧＡＧ（配列番号 ）及びＧＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡ（配列番号 ）を導入した。
細菌におけるＧＳＴ－ＳＲＦ発現のためのｐＧＥＸ－４Ｔ１－ＦＬＡＧ－ｈＳＲＦは、ｐ
ＴＲＥ－Ｆｌａｇ－ｈＳＲＦのＮｃｏＩ（平滑末端化）－ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐ
ＧＥＸ－４Ｔ１のＢａｍＨＩ（平滑末端化）－ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングするこ
とによって作製した。

【0109】

ＲＳＫ３発現ベクター：
ＨＡタグ付きＲＳＫ３野生型及びＳ２１８Ａ突然変異体及びＲＳＫ３フラグメントのプ
ラスミドは、これまでに記載されたようなものであった（Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅ
ｔ ａｌ． ２０１３）。ｐＳ－ＨＡ－ｈＲＳＫ３ １－４２アデノウイルスシャトルベ
クターは、ＨＡタグ付き１－４２ｃＤＮＡを、ｐＳ－ＥＧＦＰＣ１－ｍｈのＢｓａＢＩ及
びＮｈｅＩ部位にサブクローニングすることによって作製し、タグ付きＧＦＰのｃＤＮＡ
を置換した。

【0110】

アデノウイルスは、ＰＩ－ＳｃｅＩ及びＩ－ＣｅｕＩサブクローニングによってｐＴＲ
Ｅシャトルベクター及びＡｄｅｎｏ－Ｘ Ｔｅｔ－ｏｆｆシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
を使用して調製し、Ｖｉｖａｐｕｒｅ ＡｄｅｎｏＰＡＣＫキット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ
Ｓｔｅｄｉｍ）を使用して増幅後に精製した。これらのアデノウイルスは、テトラサイ
クリントランスアクチベーター発現ウイルスとともに感染させると、条件的に組換えタン
パク質を発現する（「ｔｅｔ－ｏｆｆ」ではアデノ－ｔＴＡ又は「ｔｅｔ－ｏｎ」では逆
ｔＴＡ）。一部のアデノウイルスを、恒常的ＣＭＶプロモーターを含む修飾ｐＴＲＥシャ
トルベクター（ｐＳ）を使用して作製した。

【0111】

結果
求心性筋細胞成長の判定におけるＲＳＫ３及びｍＡＫＡＰβの役割を考えると、研究の
焦点は、ＲＳＫ３心筋細胞基質の同定に置かれた。転写因子の血清応答因子（ＳＲＦ）は
、成長及びアクチン細胞骨格に関与する遺伝子の調節によって心臓発達及び成体機能の両
方において重要な役割を担う（Ｍｉａｎｏ ２０１０）。ＳＲＦには、Ｓｅｒ^１０３リン
酸化を含む、複数の翻訳後修飾（図１）が行われる（Ｍａｃｋ ２０１１）。筋細胞調節
におけるＳＲＦの卓越した役割と、これまでに示した、他のＲＳＫファミリーメンバーに
よるＳＲＦリン酸化とのため（Ｍｉａｎｏ ２０１０；Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ． １
９９３；Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ． １９９２；Ｈａｎｌｏｎ， Ｓｔｕｒｇｉ
ｌｌ， ａｎｄ Ｓｅａｌｙ ２００１）、ＳＲＦは、心筋細胞においてＲＳＫ３のエフ
ェクターであると考えられる。ＲＳＫ３によるＳＲＦのＳｅｒ^１０３のリン酸化は、精製
グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）－ＳＲＦ融合タンパク質を使用して容
易に確認された（データを示さず）。ＳＲＦは、ＣＡｒＧボックス［ＣＣ（Ａ／Ｔ）_６Ｇ
Ｇ］血清応答要素（ＳＲＥ）へのＤＮＡ結合、及び他の転写因子とのホモ又はヘテロ二量
体化の両方を媒介する保存ＭＡＤＳ（ＭＣＭ１、ａｇａｍｏｕｓ、ｄｅｆｉｃｉｅｎｓ、
ＳＲＦ）ドメインを含む（図１９Ａ）。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってＳＲＦを新生仔
ラット心室筋細胞初代培養物（ＮＲＶＭ）から枯渇させるためのＲＳＫ３低分子干渉ヌク
レオチド（ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＲＳＫ３の欠失が、α－アドレナリン作動剤フェニ
レフリンによって誘導されるものを含むＳＲＥ依存性の一時的なレポーター活性を阻害す
ると判定した（ＰＥ、図１９Ｂ）。ＲＳＫ３が足場タンパク質ｍＡＫＡＰβを結合する（
Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）と、ＳＲＦもｍＡＫＡＰβシグナ
ロソームに会合して、そのリン酸化を促進するかどうかを試験した。内在性のｍＡＫＡＰ
βは、ＳＲＦ抗体を使用して成体マウスの心臓抽出物のＳＲＦとともに安定して免疫共沈
降された（図１９Ｃ）。その上、ＳＲＦ及びＲＳＫ３は、異種細胞に発現されると、ｍＡ
ＫＡＰβの存在下で会合して、三元複合体を形成することができた（図１９Ｄ）。したが
って、ＮＲＶＭにおけるＲＳＫ３及びｍＡＫＡＰβ発現の阻害により、ＰＥ誘導のＳＲＦ
のＳｅｒ^１０３リン酸化を阻害した（図１９Ｅ）。アイソフォーム特異的Ｎ末端ＲＳＫ３
ドメインは、ｍＡＫＡＰβ内の別個の「ＲＳＫ３結合ドメイン」を残基１６９４～１８３
３（ＲＢＤ）において結合する（Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）
。ｍＡＫＡＰβ－ＲＳＫ３結合と競合可能な、ｍｙｃタグ付きの緑色蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）ＲＢＤ融合タンパク質の発現（Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１
３）により、ＮＲＶＭ及び成体ラット心室筋細胞初代培養物（ＡＲＶＭ、図１９及びデー
タを示さず）の両方においてＰＥ誘導のＳＲＦのＳｅｒ^１０３リン酸化を阻害した。Ｎ末
端ＲＳＫ３ペプチドを使用するアンカリング阻害によって同様の結果を得た（データを示
さず）。これらの結果をｉｎ ｖｉｖｏにおいて確証した。ＳＲＦのＳｅｒ^１０３リン酸
化は、これまでに記載したＲＳＫ３全身性及びｍＡＫＡＰβ筋細胞特異的コンディショナ
ルノックアウトマウスの両方から得た心臓において（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２
０１４；Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）、並びにｉｎ ｖｉｖｏ
におけるＲＢＤ発現マウスにおいて（データを示さず）、低下した。これらの結果は、共
に、ＳＲＦが、カテコールアミン刺激に対応するそのリン酸化をｍＡＫＡＰβシグナロソ
ームとの会合によって決める、筋細胞におけるＲＳＫ３基質であることを明らかにした。

【0112】

ｍＡＫＡＰβは、Ｃａ^２＋／カルモジュリン依存性ホスファターゼカルシニューリン（
ＰＰ２Ｂ、ＰＰＰ３）、及びＢ５６δサブユニットを含むＰＰ２Ａのプロテインキナーゼ
Ａ（ＰＫＡ）活性アイソエンザイムの、２つのホスファターゼを結合する（Ｄｏｄｇｅ－
Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。カルシニュー
リン阻害剤のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）ではなく、ＰＰ１／ＰＰ２Ａ阻害剤のオカダ酸
（ＯＡ）によるＮＲＶＭの処理により、ベースラインのＳＲＦのＳｅｒ^１０３リン酸化を
促進した（図１９Ｇ）。したがって、精製ＰＰ２ＡはＳＲＦのＳｅｒ^１０３を容易に脱リ
ン酸化するものであった（図２１）。ＳＲＦ及びＰＰ２ＡはｍＡＫＡＰβの存在下のみに
おいて免疫共沈降することができるので、ＲＳＫ３のように、ＳＲＦ、ＰＰ２Ａ、及びｍ
ＡＫＡＰβは、ＮＲＶＭにおいて三元複合体を形成する（図１９Ｈ）。ＰＰ２Ａは、ｍＡ
ＫＡＰβのＣ末端ドメインを結合し（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１０
）、ＰＰ２Ａ結合ドメイン（ｍｙｃ－ＰＢＤ、図４）の発現は、筋細胞における内在性の
ｍＡＫＡＰβ－ＰＰ２Ａ会合と競合した（図１９Ｉ）ｃＡＭＰがｍＡＫＡＰβ結合ＰＰ２
Ａを活性化するというこれまでに掲載された知見に一致して（Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ
ｅｔ ａｌ． ２０１０）、ＰＢＤ発現は、β－アドレナリンイソプロテレノール（Ｉｓ
ｏ、図１９Ｊ）で刺激したＡＲＶＭにおけるＳＲＦのＳｅｒ^１０３リン酸化の誘導を増強
した。まとめると、これらの結果は、ｍＡＫＡＰβシグナロソームが、種々の上流におけ
る刺激に対応して双方向性でＳＲＦのＳｅｒ^１０３リン酸化を調節可能であるということ
を示す。

【0113】

［実施例２］
ＳＲＦのＳｅｒ^１０３リン酸化は求心性肥大を促進する
新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）及び成体ラット心室筋細胞（ＡＲＶＭ）の両方が
、α－アドレナリン及びβ－アドレナリン誘発肥大を含む分子シグナリング経路の研究に
有用である一方、２つの細胞試料は、形状、超微細構造、及び一部の場合において細胞調
節が著しく異なる（Ｐｅｔｅｒ， Ｂｊｅｒｋｅ， ａｎｄ Ｌｅｉｎｗａｎｄ ２０１
６）。ＡＲＶＭは、その略円筒形状を利用して、ｉｎ ｖｉｖｏの心臓リモデリングにさ
らに関連する形態肥大のためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして開発された。ＲＳＫ３ノッ
クアウトマウスの特徴により、ＲＳＫ３が求心性肥大に重要であることが示唆された（Ｐ
ａｓｓａｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ． ２０１６； Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ
ａｌ． ２０１３）。ＲＳＫ３の高発現により、培養したＡＲＶＭの幅が選択的に増大し
、長さ／幅の比が著しく低下した（図２０Ａ、Ｂ）。この結果は、フェニレフリンの存在
下における筋細胞培養の１日後に得られるものと同様であった（ＰＥ、図２０Ｃ、Ｄ）。
ＰＥは、２４時間で幅の８～１０％の増大、及び長さ／幅の比の８～１４％の縮小を誘導
し、これは、大動脈縮窄術の２週間後の、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるマウス筋細胞の幅の１
７～２１％の増大、及び長さ／幅の比の１４～２１％の縮小と良好に比較される（８、１
６）。注目すべきことに、ＳＲＦ Ｓ１０３Ｄリン酸化模倣突然変異体の発現はまた、Ａ
ＲＶＭの幅を増大させ、ＰＥ処理と同程度に求心性肥大を誘発した。ところが、ＳＲＦ
Ｓ１０３Ａ突然変異体の発現は、基本的な筋細胞サイズに影響しなかったが、ＰＥ誘発求
心性肥大を阻害した（図２０Ｅ、Ｆ）。この結果は、ＳＲＦのＳｅｒ^１０３リン酸化を阻
害する（図１９Ｆ）、ＲＢＤ ＲＳＫ３アンカリングディスラプターペプチドの発現によ
って表現型模写された（図２０Ｇ、Ｈ）。ＰＥ及びＲＳＫ３高発現と対照的に、β－アド
レナリン作動剤Ｉｓｏによる長期刺激が、ＡＲＶＭの長さ及び幅の両方を増大させ、より
対称的な肥大をもたらし（図２０Ｉ、Ｊ）、これは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける長期Ｉｓｏ
注入の作用と類似するものであった（Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１
３）。ＲＢＤ及びＳＲＦ Ｓ１０３Ａ発現のように、ｍＡＫＡＰβシグナロソームからＰ
Ｐ２Ａホスファターゼを除くことは、基本的なＡＲＶＭ形態に作用をもたらさなかった。
その上、ＳＲＦ Ｓ１０３Ｄ発現のように、ＰＢＤアンカリングディスラプター発現は、
ＰＥ誘発肥大を向上も低下もしなかった。対照的に、Ｉｓｏの存在下において、ＰＤＢ発
現は、ＡＲＶＭの求心性肥大を促進し、Ｉｓｏ誘発性のＡＲＶＭの幅及び長さ増大は、Ｐ
Ｐ２Ａを除くとそれぞれ大きく及び小さくなる傾向があった。この後者の結果は、Ｉｓｏ
誘発性のＳＲＦのＳｅｒ^１０３リン酸化のＰＤＢ依存性の増強と一致した（図１９Ｊ）。
これらの結果は、共に、ｍＡＫＡＰβアンカリングＲＳＫ３及びＰＰ２Ａが、求心性心筋
細胞肥大を促進するＳＲＦのＳｅｒ^１０３リン酸化を調節するモデルを裏付けている。

【0114】

［実施例３］
ｍＡＫＡＰβ結合ＰＰ２ＡによるＰＤＥ４Ｄ３の調節
抗体 －
マウスモノクローナル抗－ＧＦＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；１：５００）、マウスモノ
クローナル抗－ＶＳＶタグ（Ｓｉｇｍａ： １：１０００）、マウスモノクローナル抗－
ｍＡＫＡＰ（Ｃｏｖａｎｃｅ、１：１０００）、９Ｅ１０マウス抗－ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ，Ｉｎｃ、１：５００希釈）、ポリクローナル抗－ＰＰ２Ａ－Ｃ（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ、１：５００），及びポリクローナル抗－ＰＰ１触媒サブユニット（Ｓａｎｔ
ａ Ｃｒｕｚ，Ｉｎｃ、１：５００）の一次抗体を、イムノブロッティングに使用した。
リン酸－ＰＤＥ４Ｄ３ Ｓｅｒ－５４のリン酸特異的抗体を作製し、残基７０～８１を含
むリン酸化及び非リン酸化ヒトＰＤＥ４Ｄ３ペプチド（２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用してアフィニティー精製し、１：５００の希釈で使用した
。非リン酸特異的及びリン酸－Ｓｅｒ－５６６に特異的の両方のポリクローナルＢ５６δ
抗体は、これまでに記載されたようなものである（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。

【0115】

発現コンストラクト －
Ｆｌａｇタグ付きＢ５６δ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ＰＰ２
Ａ－Ａ融合タンパク質、並びにｍｙｃ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ付きラット
及びヒトｍＡＫＡＰの発現ベクターは、これまでに記載されたようなものである（Ａｈｎ
ｅｔ ａｌ． ２００７；Ｐａｒｅ， Ｂａｕｍａｎ， ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｋ
ａｐｉｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ． １９９９ａ；Ｋａｐｉｌｏｆｆ， Ｊａｃｋｓｏｎ，
ａｎｄ Ａｉｒｈａｒｔ ２００１）。ＰＰ２Ａ結合を欠損させた、ｍｙｃタグ付きｍＡ
ＫＡＰコンストラクトは、ＰＣＲによって作製したラットｍＡＫＡＰ１２８６～２０８３
をコードするｃＤＮＡフラグメントを、ｐＣＭＶ－Ｍｙｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブク
ローニングすることによって作製した。ｍＡＫＡＰα及びｍＡＫＡＰβは、それぞれ心臓
及び脳に発現される、ｍＡＫＡＰの２つの選択的スプライシングアイソフォームである（
Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００５ｂ）。ｍＡＫＡＰβは、ｍＡＫＡＰα残基２４５
～２３１４と同一であり、この明細書において示されるすべての組換えｍＡＫＡＰタンパ
ク質はｍＡＫＡＰαに基づく。この明細書においてＰＤＥ４Ｄ３に使用される発現ベクタ
ーは、ＶＳＶタグ付きＰＤＥ４Ｄ３をコードするｃＤＮＡ（Ｄｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ．
２００１）を、ＧＦＰ発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングすることに
よって作製し、二重タグ付きＰＤＥ４Ｄ３タンパク質を得た。

【0116】

免疫沈降 －
ＨＥＫ２９３細胞を、種々の野生型及び突然変異タンパク質を容易に発現できる、ｍＡ
ＫＡＰを欠損した異種系として本研究に使用した。６０ｍｍプレートにおいて培養した細
胞は、プレート毎に６μｇの各ＤＮＡコンストラクトを使用してカルシウムホスフェート
方法によって５０％～７０％培養密度で遺伝子導入した。細胞を、０．５ｍｌのＨＳＥバ
ッファー中（ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％
ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及びプロテアーゼ阻害剤）の遺伝子導入の２４時間後に採取し
た。上清を、３μｇの抗体、及び１５μｌの予洗したタンパク質Ａ又はＧアガロースビー
ズとともにインキュベートした。４℃で一晩インキュベートした後、免疫沈降物を同じバ
ッファーで３回洗浄した。結合タンパク質をイムノブロッティングによって分析した。

【0117】

内在性のネイティブｍＡＫＡＰ複合体の免疫沈降のため、成体ラットの心臓（Ｐｅｌ－
Ｆｒｅｅｚｅ）を１０ｍｌのＨＳＥバッファー中でホモジナイズした。１５，０００×ｇ
で２５分間の遠心分離後、清澄化した抽出物を上述のように免疫沈降した。

【0118】

ＰＤＥアッセイ －
免疫沈降タンパク質複合体に関連するＰＤＥ活性を、Ｂｅａｖｏらによる方法に従って
アッセイした（Ｂｅａｖｏ， Ｂｅｃｈｔｅｌ， ａｎｄ Ｋｒｅｂｓ １９７４）。試
料を、４５μｌのＰＤＥバッファーＡ（１００ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、４ｍＭ Ｅ
ＧＴＡ、１．０ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン）及び５０μｌのＰＤＥバッファーＢ［
１００ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＭｇＡｃ、１μＭ ｃＡＭＰ、及び１０
０，０００ｃｐｍ［^３Ｈ］ｃＡＭＰ（Ｄｕｐｏｎｔ，ＮＥＮ）］中でアッセイした。阻害
剤を提示したように含ませた。

【0119】

ホスファターゼアッセイ －
ホスファターゼ活性を、基質として^３２Ｐ－標識ヒストンを使用してＡｈｎらの方法に
従って測定した（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。ヒストンを、２５０ｍＭ ＭＯＰ
Ｓ、ｐＨ７．４、２．５ｍＭ ＭｇＡｃ、１００ ｍＭ β－メルカプトエタノール、精
製ＰＫＡ触媒サブユニット、１μＭ ＡＴＰ、２０μＭ ヒストン、及び１ｍＣｉ［γ－
^３２Ｐ］ＡＴＰ（６０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む反応物中で放射標識した。反応を、
５０％ＴＣＡの添加によって停止させ、［^３２Ｐ］ヒストンを遠心分離によって遊離放射
性ヌクレオチドから精製した。［^３２Ｐ］ヒストンのペレットを、１ｍｌのエーテル／エ
タノール／ＨＣＬ（４：１：０．１）で１回、及び１ｍｌのエーテル／エタノール（４：
１）で３回洗浄した。その後、基質を２００μｌのＰＰ２Ａアッセイバッファー中（２５
ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＤＴＴ、及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁した
後、５０％ＴＣＡで沈殿させた。洗浄を繰り返した後、［^３２Ｐ］ヒストンを２００μｌ
のＰＰ２Ａバッファー中に懸濁した。

【0120】

ホスファターゼ活性を測定するため、免疫沈降タンパク質複合体を、ＨＳＥバッファー
中で２回、及びＰＰ２Ａ反応バッファー中で１回洗浄した。免疫沈降物を、阻害剤あり及
びなしで、１００，０００ｃｐｍ［^３２Ｐ］ヒストンを含む２０μｌのＰＰ２Ａアッセイ
バッファー中において３０℃で３０分間インキュベートした。ＰＰ２Ａ阻害剤（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ）を３０ｎＭの濃度で使用した。精製したＩ－１を、ＰＫＡによってリン酸
化した後、特異的ＰＰ１阻害剤として使用した。反応を、１００μｌの２０％ＴＣＡの添
加によって停止させ、その後１０分の遠心分離を行った。放出された^３２ＰＯ_４を含むＴ
ＣＡ上清を、シンチレーション計数によって測定した。

【0121】

ＧＳＴプルダウン －
ＰＰ２Ａ－ＡサブユニットＧＳＴ融合タンパク質又はＧＳＴコントロールタンパク質を
吸着させたグルタチオン樹脂を、ＨＥＫ２９３細胞抽出物とともにインキュベートした。
一晩インキュベートした後、ビーズを３回洗浄した。結合タンパク質をイムノブロッティ
ングによって分析した。

【0122】

統計 －
各「ｎ」は、別個の培養物又は心臓試料を使用して行った完全に独立した実験を指す。
すべてのｐ値は、スチューデントのｔ検定を使用して計算した。

【0123】

結果
オカダ酸感受性ホスファターゼによるｍＡＫＡＰ結合ＰＤＥ４Ｄ３の調節
ＰＫＡのｃＡＭＰ活性化、ＰＤＥ４Ｄ３のＰＫＡリン酸化及び活性化、並びにＰＤＥ４
Ｄ３触媒ｃＡＭＰ分解を含むｍＡＫＡＰ複合体に固有の負のフィードバックループは、こ
れまでに記載されている（Ｄｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ． ２００１）。ＰＤＥ４Ｄ３リン酸
化は、ｍＡＫＡＰへのＰＫＡ結合に依存するものであった。対称的に、ｍＡＫＡＰ結合ホ
スファターゼはＰＤＥ４Ｄ３脱リン酸化の要因となり得る。ＰＰ２Ａ及びＣａ^２＋／カル
モジュリン依存性プロテインホスファターゼカルシニューリン（ＰＰ２Ｂ）の両方が、心
筋細胞におけるｍＡＫＡＰ足場に会合する（Ｐａｒｅ， Ｂａｕｍａｎ， ｅｔ ａｌ．
２００５； Ｋａｐｉｌｏｆｆ， Ｊａｃｋｓｏｎ， ａｎｄ Ａｉｒｈａｒｔ ２０
０１； Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。この研究を始めるにあたって、ＰＰ２Ａ又は
ＰＰ２Ｂが、ＰＫＡ活性化に要求されるＰＤＥ４Ｄ３の上流保存領域内の残基であるＳｅ
ｒ－５４においてＰＤＥ４Ｄ３を脱リン酸化し得るかどうかを試験するため、異種系を使
用した（Ｓｅｔｔｅ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉ １９９６）。ｍＡＫＡＰ及びＰＤＥ４Ｄ３を
高発現するＨＥＫ２９３細胞を、３００μＭのオカダ酸（ＯＡ）で処理し、ＰＰ２Ａ（及
びプロテインホスファターゼ１［ＰＰ１］）活性を阻害した、又は５００μＭのシクロス
ポリンＡ（ＣｓＡ）で処理し、ＰＰ２Ｂ活性を阻害した（図８Ａ）。ｍＡＫＡＰ特異的抗
体を使用したタンパク質複合体の免疫沈降後、ＰＤＥ４Ｄ３のリン酸化を、作製した残基
Ｓｅｒ－５４に対するリン酸特異的抗体でのイムノブロッティングによってアッセイした
。ＯＡ処理は、ベースラインのＰＤＥ４Ｄ３のＳｅｒ－５４リン酸化を増加させた一方、
ＰＰ２Ｂの阻害は影響がなかった（図８Ａ、上部パネル、２列目）。このリン酸化の増加
は、ＰＫＡをアデニリルシクラーゼ作動剤フォルスコリンの添加によって活性化したとき
、さらに１．８倍高まった（Ｆｓｋ、図８Ａ、上部パネル、５列目）。とりわけ、フォル
スコリン単独では、ホスファターゼ阻害なしでは、著しい影響がなかった（図８Ａ、４列
目）。ＰＤＥ４Ｄ３に対する非リン酸特異的抗体及びｍＡＫＡＰに対する抗体を使用した
イムノブロッティングは、２つのタンパク質が各条件下で同様に沈降することを示した（
図８Ａ、下部パネル）。

【0124】

ＰＤＥ４Ｄ３のＳｅｒ－５４のリン酸化が、ホスホジエステラーゼ活性を２倍高めるの
で（Ｓｅｔｔｅ ａｎｄ Ｃｏｎｔｉ １９９６）、ＯＡ処置もまたｍＡＫＡＰ結合ＰＤ
Ｅ４Ｄ３活性を高め得るかどうかを試験した。ｍＡＫＡＰ複合体を、遺伝子導入したＨＥ
Ｋ２９３細胞から免疫沈降させ、関連するホスホジエステラーゼ活性についてアッセイし
た（図８Ｂ）。未処理の細胞におけるｍＡＫＡＰ関連ホスホジエステラーゼ活性は、ｍＡ
ＫＡＰをＰＤＥ４Ｄ３と共発現させたときにのみ検出され（図８Ｂ、棒部１、及びデータ
を示さず）、ＰＤＥ４Ｄ３が心筋細胞においてｍＡＫＡＰと関連するホスホジエステラー
ゼ活性のすべてに相当するというこれまでの知見に一致するものであった（Ｄｏｄｇｅ
ｅｔ ａｌ． ２００１）。リン酸－Ｓｅｒ－５４抗体で得られた結果に一致して、Ｆｓ
ｋ処理単独では、ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＡＫＡＰ結合ＰＤＥ４Ｄ３活性を十分に刺
激できない一方、Ｆｓｋ及びＯＡ処理は、共に、相乗的にＰＤＥ４Ｄ３活性を高めた（図
８Ｂ、棒部３及び６）。ＣｓＡは、基本の又は刺激したＰＤＥ４Ｄ３活性のいずれにも影
響がなく、ＰＰ２Ｂが、これらの条件下で細胞においてｍＡＫＡＰに結合したＰＤＥ４Ｄ
３を調節しないということを示唆した。これらの結果は、この異種系において、ＯＡ感受
性ホスファターゼがｍＡＫＡＰに結合したＰＤＥ４Ｄ３のベースライン及びＦｓｋ刺激の
リン酸化及び活性の両方を強力に阻害するということを共に示す。

【0125】

ＯＡによるホスホジエステラーゼ活性の向上は、ＨＥＫ２９３細胞における組換えタン
パク質の発現だけでなく、成体ラットの心臓抽出物からのネイティブｍＡＫＡＰ複合体の
単離においても見受けられた（図８Ｃ）。ＰＤＥ４Ｄ３及びＰＫＡの両方が精製したｍＡ
ＫＡＰ複合体において活性である（Ｄｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ． ２００１）。内在性のｍ
ＡＫＡＰ複合体に存在するＰＫＡ活性は、特異的ＰＫＡ阻害剤のＰＫＩによるｍＡＫＡＰ
結合ＰＫＡの阻害において明らかであったように、ホスホジエステラーゼ活性の２倍の増
加の要因となる（図８Ｃ、棒部２及び４）。重要な点として、ＯＡ阻害は、ｍＡＫＡＰ関
連ホスホジエステラーゼ活性を３０％（棒部２及び３）及びＰＫＡもまた阻害するとき６
０％（棒部４及び５）増加させた。これらのデータは、共に、ｍＡＫＡＰ複合体に会合す
るＯＡ感受性ホスファターゼがＰＤＥ４Ｄ３の脱リン酸化及びホスホジエステラーゼ活性
調節の要因となることを示す。

【0126】

ＰＰ２Ａは心臓においてｍＡＫＡＰ足場に会合する。
ＯＡ感受性ホスファターゼがｍＡＫＡＰ複合体に会合することを認めたので、ホスファ
ターゼを免疫共沈降実験によって同定した。心臓細胞抽出物から単離したｍＡＫＡＰ複合
体に関連するホスファターゼ活性を、基質として［^３２Ｐ］ヒストンを使用して測定した
。コントロールのＩｇＧ免疫沈降物に対してホスファターゼ活性が３倍向上した（図９Ａ
、棒部１及び２）。免疫沈降活性の要因となるｍＡＫＡＰ会合ホスファターゼはＰＰ２Ａ
として同定され、これは、ホスファターゼ活性が３０ｎＭのＰＰ２Ａ阻害剤Ｉによって完
全に阻害される（Ｌｉ， Ｍａｋｋｉｎｊｅ， ａｎｄ Ｄａｍｕｎｉ １９９６）が、
１００ｎＭのＰＫＡリン酸化ＰＰ１阻害剤－１の添加によっては阻害されないためである
（Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ． １９９６）。正のコントロールとして、ＰＫＡリン酸化ＰＰ
１阻害剤－１は、ＨＥＫ２９３細胞抽出物からＰＰ１抗体での免疫沈降によって単離した
ＰＰ１を確かに阻害した（図１６）。ｍＡＫＡＰ関連ホスファターゼ活性はｍＡＫＡＰ結
合ＰＰ２Ｂによるものではなく、これは、Ｃａ^２＋／カルモジュリンがホスファターゼア
ッセイバッファーに含まれていないためであった。これらの結果の裏付けは、ｍＡＫＡＰ
免疫沈降物のイムノブロッティング分析によって得られた。ＰＰ１触媒サブユニットでな
はく、ＰＰ２Ａ－ＣサブユニットをｍＡＫＡＰ特異的免疫沈降物において検出した（図１
８Ｂ及びＣ）。

【0127】

ＰＫＡのように、ＰＰ２Ａは多くの細胞基質と会合し、多様な細胞内コンパートメント
に存在すると予想される（Ｖｉｒｓｈｕｐ ２０００）。培養した新生仔ラット心筋一次
細胞の共焦点蛍光顕微鏡観察により、ＰＰ２Ａ－Ｃサブユニットが微細な断続的パターン
で細胞質にわたり分布することを明らかにした（図１７、緑色）。これまでに見いだされ
たように、ｍＡＫＡＰは、主に核膜に局在するものであった（Ｐａｒｅ， Ｅａｓｌｉｃ
ｋ， ｅｔ ａｌ． ２００５）。成体ラットの心臓抽出物からのｍＡＫＡＰ及びＰＰ２
Ａの免疫共沈降に一致して、ＰＰ２Ａ及びｍＡＫＡＰ染色の重なりを、核膜において検出
でき（図１７、複合イメージ）、ＰＰ２Ａ、ＰＫＡ、及びＰＤＥ４Ｄ３、並びに足場ｍＡ
ＫＡＰの個別のプールからなる局在シグナリング複合体が心筋細胞に存在するというモデ
ルを裏付けた。

【0128】

ｍＡＫＡＰ残基２０８３～２３１９はＰＰ２Ａ結合ドメインを含む。
ｍＡＫＡＰにおけるＰＰ２Ａ結合部位をマッピングするため、細菌で発現したＰＰ２Ａ
－ＡサブユニットＧＳＴ融合タンパク質を使用して、ＨＥＫ２９３細胞に発現したｍＡＫ
ＡＰのＧＦＰタグ付きフラグメントをプルダウンで検出した（図１０Ａ及びＢ）。ＧＳＴ
－ＰＰ２Ａ－Ａは、Ｃ末端から残基２０８５のドメインを含むｍＡＫＡＰのフラグメント
のみを安定してプルダウンで検出した。ラットｍＡＫＡＰ１８３５～２３１２及びヒト２
０８５～２３１９を含む、ヒト及びラットのｍＡＫＡＰのＧＦＰ融合タンパク質が、ＧＳ
Ｔ－ＰＰ２Ａ－Ａを結合した。負のコントロールとして、ＧＦＰ－ｍＡＫＡＰ融合タンパ
ク質は、ＨＥＫ２９３細胞においてＰＰ１を結合せず、心臓抽出物からのＰＰ１及びｍＡ
ＫＡＰの免疫共沈降がないことと一致した（図１８）。ｍＡＫＡＰにおけるＰＰ２Ａ結合
部位のマッピングを確認するため、ＨＥＫ２９３細胞に発現したｍｙｃタグ付きｍＡＫＡ
Ｐフラグメントを、ｍｙｃタグ付き抗体で免疫沈降し、関連するＰＰ２Ａ活性についてア
ッセイした（図１０Ｃ）。ｍＡＫＡＰの１２８６～２０８３ではなく、ｍＡＫＡＰの１２
８６～２３１２が、ＯＡ感受性ホスファターゼ活性で免疫共沈降した。これらのデータは
、共に、ＰＰ２Ａが、ＰＫＡ、ＰＤＥ４Ｄ３，及び他の既知のｍＡＫＡＰ結合タンパク質
の結合部位から離れたｍＡＫＡＰ内のＣ末端部位を結合するということを示す（図１０Ａ
）。

【0129】

ｍＡＫＡＰアンカリングＰＰ２Ａは複合体においてＰＤＥ４Ｄ３リン酸化を調節する。
ラットの心臓抽出物から単離したｍＡＫＡＰ複合体を使用して得られたデータは、ｍＡ
ＫＡＰ結合ＰＰ２Ａが複合体においてＰＤＥ４Ｄ３を調節することを示唆した（図８Ｃ）
。ＰＰ２ＡアンカリングがＰＤＥ４Ｄ３脱リン酸化に要求されるかどうかを試験するため
、ＰＤＥ４Ｄ３をＨＥＫ２９３細胞に発現し、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＫＡ、及びＰＰ２Ａの結
合部位を含むｍＡＫＡＰコンストラクト（ｍｙｃ－ｍＡＫＡＰ １２８６－２３１２）、
又はＰＰ２Ａ結合部位のない類似のｍＡＫＡＰコンストラクト（ｍｙｃ－ｍＡＫＡＰ １
２８６－２０８３）を発現した。細胞をＦｓｋ及びＯＡで刺激し、ｍＡＫＡＰ複合体をそ
の後免疫沈降によって単離した。ｍＡＫＡＰ結合ＰＤＥ４Ｄ３のリン酸化を、Ｓｅｒ－５
４リン酸特異的抗体でのイムノブロッティングによってアッセイした。全長ｍＡＫＡＰの
発現の際に見受けられたように（図８Ａ）、ホスファターゼ活性をＯＡによって抑えたと
きのみ、ｍｙｃ－ｍＡＫＡＰ１２８６－２３１２に結合したＰＤＥ４Ｄ３のリン酸化を検
出した（図１１Ａ、３列目）。とりわけ、顕著なＰＰ２Ａ結合のないｍｙｃ－ｍＡＫＡＰ
１２８６－２０８３の発現の際（図１１Ａ、４～６列目）、ベースラインのｍＡＫＡＰ結
合ＰＤＥ４Ｄ３のリン酸化の増加を検出した（ＯＡで得られたレベルの０．４９±０．１
９倍、図１１Ａ、４列目ｖｓ３列目）。さらに、ＰＰ２Ａ結合ドメインの欠失の際、Ｆｓ
ｋ単独では、Ｆｓｋ及びＯＡの両方で処理したＰＰ２Ａ含有複合体に関連するものと同等
のレベルまでホスホジエステラーゼのリン酸化を増加させた（図１１Ａ、３、５、及び６
列目）。ＰＤＥ４Ｄ３のＳｅｒ－５４リン酸化の変化はホスホジエステラーゼ活性の変化
に反映された（図１１Ｂ）。ＰＤＥ４Ｄ３活性は、ＰＰ２Ａのないｍｙｃ－ｍＡＫＡＰ１
２８６－２０８３免疫沈降物において、ホスファターゼを含む複合体よりも、３０％高い
（棒部１及び４）重要な点として、ＰＤＥ４Ｄ３活性における有意差は、ＰＰ２Ａのない
複合体においてＦｓｋ刺激及びＯＡの存在下のＦｓｋ刺激との間で見受けられなかった（
棒部５及び６）。これらのデータは、ＰＤＥ４Ｄ３リン酸化及び活性の調節におけるＰＰ
２Ａアンカリングの重要性を示す。さらに、これらは、ＰＰ２Ａが、ＰＫＡ活性化ホスホ
ジエステラーゼ活性を抑えるだけでなく、非刺激細胞における、基本の低いＰＤＥ４Ｄ３
活性レベルを維持するように機能することを示す。

【0130】

Ｂ５６δサブユニットを含むｍＡＫＡＰ結合ＰＰ２Ａホロ酵素はＰＫＡによって調節さ
れる。
ＰＰ２Ａホロ酵素は、コアＡ及びＣサブユニットのヘテロ二量体、及びホロ酵素を特定
の細胞内小器官に標的化し得るＢサブユニットを含む３つのサブユニットから構成される
（Ｖｉｒｓｈｕｐ ２０００）。心臓に発現し、核に局在する、３つの緊密に関連するＢ
サブユニット、Ｂ５６δ、Ｂ５６γ１、及びＢ５６γ３が同定されている（Ｇｉｇｅｎａ
ｅｔ ａｌ． ２００５； ＭｃＣｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． １９９６）。近年の研
究により、Ｂ５６δを含むＰＰ２Ａホロ酵素がＰＫＡリン酸化によって調節されることを
示した（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。ｍＡＫＡＰ複合体に会合したＰＰ２ＡもＰ
ＫＡ活性によって調節され得るかどうかを試験した。ネイティブのｍＡＫＡＰ複合体を、
成体ラットの心臓抽出物から免疫沈降して、関連するホスファターゼ活性についてアッセ
イした（図１２Ａ）。ｍＡＫＡＰ関連ホスファターゼ活性は、結合ＰＫＡを非加水分解性
ｃＡＭＰ類似体ＣＰＴ－ｃＡＭＰで刺激することによって２．５倍増加した（２及び３列
目）。コントロールとして、すべての免疫沈降ホスファターゼ活性を、１０ｍＭのＯＡに
よって阻害し（４列目）、ホスファターゼ活性のＣＰＴ－ｃＡＭＰ刺激による増加をＰＫ
Ａ阻害剤ＰＫＩの添加によって遮断した（５列目）。これらのデータは、共に、心臓にお
けるｍＡＫＡＰ複合体に関連するＰＰ２Ａ活性がＰＫＡ依存性ｃＡＭＰシグナリングによ
って増強されることを示す。

【0131】

ｍＡＫＡＰ結合ＰＰ２ＡがＰＫＡ活性によって調節されるので、ｍＡＫＡＰ結合ＰＰ２
Ａホロ酵素がＢ５６δサブユニットを含むかどうかを試験した。タンパク質複合体は、Ｂ
５６δ及びコントロールの（ＩｇＧ）抗体を使用して成体ラットの心臓抽出物から免疫沈
降させた（図１２Ｂ）。ｍＡＫＡＰはＢ５６δ抗体で安定して免疫沈降された。その上、
Ｆｌａｇタグ付きＢ５６δをＨＥＫ２９３細胞に発現し、Ｂ５６δが、（ＧＦＰタグ付き
）ｍＡＫＡＰと共発現したときのみ、ｍＡＫＡＰ抗体で免疫沈降されることを示した（図
１２Ｃ）。最後に、Ｂ５６δのｍＡＫＡＰとの結合が、ＰＰ２Ａ－Ｃサブユニットを複合
体に動員することを示し、これは、ＨＥＫ２９３細胞抽出物から免疫沈降したｍＡＫＡＰ
複合体が、ＧＦＰ－ｍＡＫＡＰをＦｌａｇ－Ｂ５６δと共発現させたときに、より大きい
ホスファターゼ活性に関連するためであった（図１２Ｄ、２及び３列目）。これらの結果
に基づいて、Ｂ５６δは、心臓においてＰＰ２Ａ－Ａ／Ｃコアのヘテロ二量体をｍＡＫＡ
Ｐ複合体に動員し、ｃＡＭＰ依存性ホスファターゼ活性を与えている。したがって、Ｆｓ
ｋ及びホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸによる細胞内ｃＡＭＰの上昇により、ｍＡＫ
ＡＰがＢ５６δと共発現されるときのみＨＥＫ２９３細胞におけるｍＡＫＡＰ関連ホスフ
ァターゼ活性を増加させた（図１２Ｅ）。

【0132】

ＰＫＡ結合はｍＡＫＡＰ複合体におけるｃＡＭＰ依存性ＰＰ２Ａ活性に要求される。
これまでの研究により、ＰＫＡが４つのセリン残基（５３、６８、８１、５６６）にお
いてＢ５６δをリン酸化することが見いだされており、Ｓｅｒ－５６６がＰＰ２Ａ活性の
誘導に相当することが示唆されている（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。ｍＡＫＡＰ
複合体がＰＫＡ及びＰＰ２Ａの両方を含むので、ｍＡＫＡＰへのＰＰ２Ａ結合がＰＤＥ４
Ｄ３脱リン酸化に要求されるように、これらの分子の複合体への会合がＰＰ２Ａリン酸化
に重要であると認められた（図１１）。この仮説を検証するため、Ｂ５６δを野生型全長
ｍＡＫＡＰ又はＰＫＡ結合部位を含む残基２０５３～２０７３を内部欠失させた全長ｍＡ
ＫＡＰ突然変異体（ΔＰＫＡ、図１３Ａ）とともに、ＨＥＫ２９３細胞に発現した（Ｐａ
ｒｅ， Ｂａｕｍａｎ， ｅｔ ａｌ． ２００５）。Ｆｓｋ／ＩＢＭＸで細胞を刺激し
て、細胞内ｃＡＭＰを上昇させた後、ｍＡＫＡＰ複合体を免疫沈降によって単離し、Ｂ５
６δのリン酸化状態が、Ｂ５６δのＳｅｒ－５６６に対するリン酸特異的抗体を使用して
測定された（図１３Ａ、上部パネル）（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。ＦＳＫ／Ｉ
ＢＭＸ処理後にのみ、及びＢ５６δをΔＰＫＡ突然変異体ではなく野生型ｍＡＫＡＰと共
発現したときのみ、Ｂ５６δのリン酸化を検出した（図１３Ａ、２及び６列目）。コント
ロールとして、突然変異体及び野生型のｍＡＫＡＰ及びＢ５６δタンパク質の同等の発現
を、非リン酸特異的抗体でのイムノブロッティングによって示した（図１３Ａ、中央及び
下部パネル）。さらに、野生型のｍＡＫＡＰを、４つのＰＫＡ基質部位のそれぞれにアラ
ニン残基を含む突然変異形態Ｂ５６δと共発現した（Ｓ４Ａ）。予想されたように、Ｆｓ
ｋ／ＩＢＭＸ刺激はＢ５６δのＳ４Ａのリン酸化を誘導しなかった（図１３Ａ、４列目）
。Ｂ５６δのリン酸化がＰＰ２Ａ触媒活性を増加させるので、ｍＡＫＡＰ抗体免疫沈降物
をホスファターゼ活性についてアッセイした（図１３Ｂ）。リン酸特異的Ｂ５６δ抗体を
使用して得た結果と一致して、ｃＡＭＰ上昇は、ｍＡＫＡＰ複合体におけるホスファター
ゼ活性を１．７倍増加させた（図１３Ｂ、２及び３列目）。Ｓ４Ａ突然変異体を含む複合
体がｃＡＭＰの増加によってＰＰ２Ａ活性の拡大を示さなかったので（５列目）、この増
加はＢ５６δのリン酸化を要求するものであった。同様に、Ｂ５６δをｍＡＫＡＰのΔＰ
ＫＡ突然変異体足場と共発現したとき増加が得られなかったので（６列目）、ｍＡＫＡＰ
へのＰＫＡ結合が、ＰＰ２Ａ活性を誘導するために要求された。興味深いことに、ｍＡＫ
ＡＰ関連ＰＰ２Ａ活性におけるＦｓｋ／ＩＢＭＸ誘導の増加は、ｍＡＫＡＰ複合体へのＰ
Ｐ２Ａ－Ｃサブユニット結合の増加によるものではなかった（図１３Ａ、１及び２列目）
。この結果は、Ｂ５６δのリン酸化が、ホロ酵素形成に影響しない構造変化によってＰＰ
２Ａ触媒活性を増加させるというこれまでの示唆に一致するものである（Ａｈｎ ｅｔ
ａｌ． ２００７）。

【0133】

ＰＰ２ＡはＰＫＡ依存的にＰＤＥ４Ｄ３リン酸化を調節する。
上述の結果は、Ｂ５６δ－ｍＡＫＡＰ複合体におけるＰＤＥ４Ｄ３のＰＰ２Ａ脱リン酸
化がホスファターゼのＰＫＡ触媒リン酸化によって高まるはずであるということを示唆す
る。.ＰＤＥ４Ｄ３の調節におけるＢ５６δリン酸化の役割を特定するため、ＰＤＥ４Ｄ
３及びｍＡＫＡＰを野生型Ｂ５６δ又はＰＫＡに応答しないＢ５６δＳ４Ａ突然変異体の
いずれかと共発現した。細胞をＦｓｋで刺激してから、ｍＡＫＡＰ複合体を単離した。リ
ン酸特異的抗体のイムノブロッティング及び酵素アッセイによって検出されたように、Ｐ
ＤＥ４Ｄ３のＳｅｒ－５４リン酸化のＦｓｋ刺激及びホスホジエステラーゼ活性は、ＰＰ
２ＡをＯＡによって阻害するとき、野生型Ｂ５６δを含むｍＡＫＡＰ複合体においてのみ
観察され（図１４Ａ及びＢ、１～３）、前述のデータと一致した（図８）。一方で、Ｂ５
６δのＳ４Ａの発現により、検出可能なｆｓｋ刺激のＰＤＥ４Ｄ３リン酸化がもたらされ
（Ｆｓｋ／ＯＡ刺激細胞の０．３９±０．１５倍、図４Ａ、５列目）、及びホスホジエス
テラーゼ活性が同時に増加した（図１４Ｂ、５列目）が、ＰＰ２Ａ活性をＯＡによって直
接阻害したときほど強力ではなかった（図１４Ａ及びＢ、３及び６列目）。図１２及び図
１３に示す結果と共に、ＰＫＡ刺激したＰＰ２Ａホロ酵素のアンカリングは、ｍＡＫＡＰ
シグナリング複合体における基本及びＰＫＡ刺激のＰＤＥ４Ｄ３活性の両方を抑える要因
となる。

【0134】

検討
本明細書に記載される結果は、足場タンパク質ｍＡＫＡＰが結合したＰＫＡリン酸化Ｐ
ＤＥ４Ｄ３の脱リン酸化及び不活性化の生化学的機序を定めている。Ａ、Ｃ、及びＢ５６
δサブユニットから構成されるＰＰ２Ａヘテロ三量体は、他の既知のｍＡＫＡＰパートナ
ーの結合部位とは別のｍＡＫＡＰにおけるＣ末端部位を結合する（図１０）。ＰＰ２Ａの
ｍＡＫＡＰ足場との会合は、重要且つ新たな２つの点で機能的重要性がある。第１に、ｍ
ＡＫＡＰは、ＰＰ２ＡとＰＤＥ４Ｄ３との両方を結合することによって、ホスホジエステ
ラーゼに近接させてホスファターゼを捕捉して、効果的なＰＤＥ４Ｄ３脱リン酸化及びダ
ウンレギュレートを可能にする（図１１）。第２に、ｍＡＫＡＰは、ＰＫＡとＰＰ２Ａと
の両方を結合することによって、ＰＰ２ＡのＢ５６δサブユニットのｃＡＭＰ依存性リン
酸化及びＰＰ２Ａ活性の誘導を促進する（図１３）。多分子シグナリング複合体形成の関
連性は、ＰＰ２Ａ及びＰＫＡの結合部位のないｍＡＫＡＰ突然変異体の発現の際に明らか
であった。

【0135】

基質特異性を得るためのホスファターゼ標的化という発想は、最初のＰＰ１標的サブユ
ニットとしてグリコーゲン粒子会合タンパク質を同定することで１９８０年代なかばに初
めて提示された（Ｂａｕｍａｎ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ ２００２）。この初期の知見以来
、他のいくつかのホスファターゼ標的モチーフが特定されてきた（Ｖｉｒｓｈｕｐ ２０
００）。ＡＫＡＰは、ホスファターゼをその適切な基質に結合する重要な機序に相当し、
いくつかのＡＫＡＰがプロテインホスファターゼを結合する。ｍＡＫＡＰがＰＰ２Ｂ（カ
ルシニューリン）を結合すること、及びこの相互作用が筋細胞におけるＰＰ２Ｂ依存性Ｎ
ＦＡＴｃ３活性化に重要であることが近年掲載された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）
。しかしながら、ＰＰ２Ｂの阻害がＰＤＥ４Ｄ３のＳｅｒ－５４リン酸化又はホスホジエ
ステラーゼ活性に影響しなかったので、ｍＡＫＡＰへのＰＰ２Ｂ結合がＰＤＥ４Ｄ３を調
節するとは認められていない（図８）。本データは、ホスホジエステラーゼの脱リン酸化
における、及び結果として局所ｃＡＭＰレベルの調節における、ｍＡＫＡＰに結合するＰ
Ｐ２Ａの特有の役割を裏付けている。

【0136】

細胞のｃＡＭＰ濃度調節における全体的なホスファターゼの役割は未だ十分に調査され
ていない。ラットの脂肪細胞において、ＰＰ２ＡがＰＤＥ３Ｂ活性及びリン酸化の両方を
調節することが分かった（Ｒｅｓｊｏ ｅｔ ａｌ． １９９９）。ＰＤＥ４Ｄ３は、Ｓ
ｅｒ－５４においてＰＫＡによってリン酸化されることに加えて、ｍＡＫＡＰ複合体に存
在するＥＲＫ５を含むＭＡＰキナーゼによってＳｅｒ－５７９においてリン酸化される（
Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． １９９９；Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ．
２００５）。ＰＰ１はｍＡＫＡＰを結合すると認められないが（図９及び図１８）、ＰＰ
１は、他の細胞ドメインにおいてＰＤＥ４Ｄ３のＳｅｒ－５７９を脱リン酸化し得、これ
は、単離したＰＤＥ４Ｄ３に精製したＰＰ１を添加することで、この部位においてリン酸
化を低減するためである。また、ホスファターゼは、Ｓｅｒ－５７９における、及びＰＤ
Ｅ４Ｄ３における第２ＰＫＡ部位のＳｅｒ－１６における、ｍＡＫＡＰ結合ＰＤＥ４Ｄ３
の脱リン酸化の要因となる（Ｃａｒｌｉｓｌｅ Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００４
）。

【0137】

アンカリングの仮説は、同じシグナリング複合体に両方のタンパク質を局在させること
によって特定の基質に対するＰＫＡの作用を標的とするように、ＡＫＡＰが機能するとい
うことを示唆している。本明細書において、ｍＡＫＡＰ複合体におけるＰＫＡに対する新
たな標的であるＰＰ２ＡのＢ５６δサブユニットを提示している。これまでの研究により
、Ｂ５６δのリン酸化がＰＰ２Ａ活性を刺激し、ＤＡＲＰＰ－３２の脱リン酸化を高める
ことを見いだした（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。これらの結果に一致して、心筋
細胞をβ－アドレナリン受容体作動剤で刺激することにより、ＰＰ２Ａ活性を増加させる
（Ｄｅ Ａｒｃａｎｇｅｌｉｓ， Ｓｏｔｏ， ａｎｄ Ｘｉａｎｇ ２００８）。ｍＡ
ＫＡＰ足場は、アンカリングタンパク質をＰＫＡ及びＰＰ２Ａの両方に会合させることが
ホスファターゼ活性のｃＡＭＰによる増加に重要であることから、この事象を促進し得る
（図１１及び１３）。ゆえに、ｍＡＫＡＰは、心臓におけるホスファターゼ活性調節にお
いて役割を有する。

【0138】

これらの結果に基づいて、ＰＰ２ＡがｍＡＫＡＰシグナリング複合体近くのｃＡＭＰレ
ベルの調節における二重の役割を担うモデルを提示する（図１５）。第１に、ｍＡＫＡＰ
複合体におけるＰＰ２Ａは、ＧＰＣＲ刺激なしで脱リン酸化した最小限の活性状態にＰＤ
Ｅ４Ｄ３を維持するはずであり（図１５Ａ）、おそらく作動剤に対応してｃＡＭＰレベル
をより急速に上昇させる。第２に、ＧＰＣＲ刺激よってｃＡＭＰレベルの活性化を誘導後
、ＰＫＡはＰＤＥ４Ｄ３及びＰＰ２Ａの両方をリン酸化し得る（図１５Ｂ）。ＰＤＥ４Ｄ
３リン酸化増加によって媒介されるｃＡＭＰレベルにおける負のフィードバックと対照的
に、ＰＰ２ＡのＰＫＡリン酸化はＰＤＥ４Ｄ３活性化に対抗する。ＰＤＥ４Ｄ３リン酸化
を阻害することによって、ＰＰ２Ａは、おそらく、正のフィードバックループの一部とし
て局所ｃＡＭＰの作用を増強して延長する。このように、これまでに記載されたｍＡＫＡ
Ｐ結合ＥＲＫ５によるＰＤＥ４Ｄ３の阻害の可能性と併せて（図示せず）（Ｄｏｄｇｅ－
Ｋａｆｋａ ｅｔ ａｌ． ２００５）、ｍＡＫＡＰシグナリング複合体は、複合体に固
有の複数のフィードバックループ、及び上流のＭＡＰＫシグナリング経路とのクロストー
クの両方によって局所ｃＡＭＰレベルを微細に調節する態勢にある。ＰＰ２Ａ発現及び細
胞内局在化が心不全において変化するということが観察されている（Ｒｅｉｋｅｎ ｅｔ
ａｌ． ２００１； Ａｉ ａｎｄ Ｐｏｇｗｉｚｄ ２００５）。ＰＰ２Ａ媒介の正
のフィードバック又はＰＤＥ４Ｄ３媒介の負のフィードバックが、ｍＡＫＡＰ複合体に局
在するｃＡＭＰレベルを主に調節するかどうかは、病態におけるｍＡＫＡＰへのＰＰ２Ａ
結合の化学量論量並びにＰＫＡ及びＰＰ２ＡによるＰＤＥ４Ｄ３リン酸化及び脱リン酸化
の相対速度の両方によって最終的に決まり得る。

【0139】

本実施例は、足場タンパク質ｍＡＫＡＰがＰＤＥ４Ｄ３、ＰＫＡ、及びＰＰ２Ａとの会
合によってアンカリングＰＤＥ４Ｄ３活性の動的調節を維持する新たな機序を示している
。この３つの酵素のそれぞれが、核周囲のｍＡＫＡＰ複合体近傍のｃＡＭＰ濃度の時間的
調節において重要な役割を果たしている。ｍＡＫＡＰ「シグナロソーム」による局所ｃＡ
ＭＰのこの複雑な調節は、ｃＡＭＰのコンパートメント化の調節におけるＡＫＡＰ及びホ
スファターゼの広範な役割を表している。

【0140】

［実施例４］
ＨＦｒＥＦの処置としてのＰＢＤの使用
心疾患の一般的最終段階である心不全は、公衆衛生上極めて重要であるシンドロームで
あり、毎年９６０，０００の新規症例を含む６５０万人の米国人に発症している（Ｂｅｎ
ｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ． ２０１７）。症候的心不全の患者は、駆出率が低下したもの
（ＨＦｒＥＦ）と駆出率が保持されたものとにほぼ等しく分けることができる。心不全の
第一選択療法は、少なくともＨＦｒＥＦにおいて生存性及びクオリティ・オブ・ライフを
向上するとともに、死亡率を下げることができるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻
害剤及びβ－アドレナリン受容体遮断剤（β－遮断剤）を含む（Ｐｏｎｉｋｏｗｓｋｉ
ｅｔ ａｌ． ２０１６）。しかしながら、これらと他の補助療法とがあるにもかかわら
ず、５年死亡率は心不全では約５０％にとどまり（２０１６年の心筋梗塞後の調査では３
９％）（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ． ２０１７； Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．
２０１６）、新たな治療アプローチの発見が必要とされている。ＳＲＦのリン酸化は、Ｈ
ＦｒＥＦにおける代償性肥大から拡張した不全の心臓への移行を調節する新規の機序に相
当する。

【0141】

上述のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方におけるＳＲＦ Ｓ１０３
Ｄの発現が求心性筋細胞肥大を促進し得る。さらに、ＰＰ２Ａアンカリングディスラプタ
ーＰＢＤの発現により、培養した成体筋細胞のＩｓｏ処理によって誘発した偏心性肥大を
抑えた（図２０）。これらの結果は、ＳＲＦ Ｓ^１０３のリン酸化が幅方向に成長を促進
する一方、心筋細胞の伸長を抑えるということを示唆している。これらの結果、及び長期
圧負荷によって誘発される収縮期機能障害とのＳＲＦ脱リン酸化の関連（データを示さず
）を考えると、正常な又は増加したＳＲＦリン酸化の回復が、慢性圧負荷の疾患及び虚血
性心疾患においてＨＦｒＥＦをもたらす心室拡張を防止し得る。

【0142】

心疾患の早期に「代償性」求心性肥大を誘発する機序が、心臓を後の収縮期機能障害及
び最終的な不全にしやすくする（Ｓｃｈｉａｔｔａｒｅｌｌａ ａｎｄ Ｈｉｌｌ ２０
１５）。これに関して、ＲＳＫ３－ｍＡＫＡＰβ複合体の標的化により、圧負荷による心
臓リモデリングを抑え、心不全を防止し得る（Ｋｒｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１４
；Ｌｉ， Ｋｒｉｔｚｅｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１３）。求心性肥大を含むリモデリン
グを誘発するシグナリング経路の阻害が疾患の早期に望ましいものであり得るが、心臓が
、ＨＦｒＥＦをもたらす偏心性成長及び心室拡大によって特徴づけられる疾患プロセスの
段階にあるとき、求心性筋細胞肥大を促進し、偏心性筋細胞肥大を抑えるシグナルを維持
する取り組みにより、心臓容積及び惹起したときの収縮を保持し得るかどうか、という疑
問が残る。したがって、ＳＲＦリン酸化を維持することは、末期の疾患及びＨＦｒＥＦの
特徴を示す心室形態における偏心性変化を抑制する方法となる。したがって、ＳＲＦリン
酸化を維持することが、末期の疾患及びＨＦｒＥＦの特徴を示す心室形態における偏心性
変化を抑制する方法となるということは、ＳＲＦリン酸化が短期圧負荷を行ったマウスに
おいて増加し、心室拡張を経たマウス及びヒトにおいて低下するという本発明者らによる
新たな知見によってさらに裏付けられる。Ｓ^２１８リン酸化によって検出すると、ＲＳＫ
３活性化が１．９倍増加するとき（図３３Ｃ）、リン酸化したＳＲＦは、圧負荷の誘発後
５分内に全左心室抽出物（細胞数で約３分の１の筋細胞を含む）において２８％増加する
（図３３Ａ及びＢ）。注目すべきことに、大動脈縮窄術手術の１６週後、心臓が拡張し、
マウスが心不全になったとき（図３３Ｄ）、リン酸化したＳＲＦは偽手術コントロールに
存在するものより３０％低く抑えられた（図３３Ｅ）。これらの結果は、ＲＳＫ３触媒リ
ン酸化と反対に、偏心性肥大誘導時にＳＲＦを脱リン酸化する要因となるホスファターゼ
と一致する。この知見のヒト疾患との関連を、患者の組織試料を使用して評価した。正常
な左心室内径を有する患者の左心室組織におけるＳＲＦ Ｓｅｒ^１０３リン酸化と比較す
ると、拡張した心臓を有する患者におけるＳＲＦ Ｓｅｒ^１０３リン酸化が５３％低下し
た（ｐ＝０．００５、図３３Ｆ～Ｈ）。

【0143】

心室形状の改善、すなわち、あまり長尺でない筋細胞によりＬＶ内径を小さくすること
、及び／又は、より幅の広い筋細胞によりＬＶ壁厚を大きくすることで、壁ストレスを小
さくして（ラプラスの法則）、ＨＦｒＥＦ傾向の心臓における収縮期機能を向上させ得る
。収縮期機能障害の防止は、ｍＡＫＡＰβ由来ＰＢＤの発現に基づく新たなＡＶＶ遺伝子
治療ベクターにおいて得られている（図２２）。

【0144】

心筋梗塞の処置
冠動脈心疾患はＨＦｒＥＦの主要な要因である（Ｗｒｉｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｅｔ
ａｌ． ２０１６）。８週齢のＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウスに、永続的なＬＡＤ結紮又は偽
開胸術を行った。手術の２日後、心臓機能を心エコー法によって評価し、マウスをＥＦ及
び体重によってランダム化した（図２３Ｂ）。ＡＡＶｓｃ．ｍｙｃ－ＰＢＤ（ｎ＝８）又
はＡＡＶｓｃ．ＧＦＰ（ｎ＝５）のいずれかで処置される、２つのマウスのコホートを、
ＬＡＤ結紮の２日後に平均駆出率＝３４％を有すると定めた（図２３Ｄ）。手術の３日後
、マウスに５ｘ１０^１１ｖｇを尾静脈から注射した。コントロールのＧＦＰマウスでは、
駆出率が次第に低下する（ＥＦが２１％になる）一方、ＰＢＤマウスでは、収縮期機能が
長期回復した（手術の８週後のＥＦ＝４３％、ｐ＜０．０００１）。その上、ＡＡＶｓｃ
．ｍｙｃ－ＰＢＤ処置マウスは、心臓機能の改善に一致して左心室容積が低下した（収縮
期－ＰＢＤでは６９μｌ ｖｓ ＧＦＰでは１５６μｌ、ｐ＜０．００１、拡張期－１１
８μｌ ｖｓ １９２μｌ、ｐ＜０．００１）。エンドポイントでは、重量分析において
、心室及び心房の肥大は低下し（それぞれｐ＝０．０５３及び０．０２４、脛骨長さに連
動、図２３Ｃ）、心不全の徴候である肺水腫が改善する傾向にあった（ｐ＝０．０７８）
。ＰＰ２ＡがＳＲＦを脱リン酸化可能なｍＡＫＡＰβからＰＰ２Ａを除く、ＰＰ２Ａアン
カリングディスラプター治療が、虚血性心疾患における駆出率が低下した心不全を防止す
る新たな治療アプローチを構成することを、これらの結果は示している。

【0145】

方法
左冠動脈結紮の一般的方法
マウスに誘導するための５％イソフルラン及びその後維持するための２．５～３％イソ
フルランで麻酔をかけた。１６Ｇカテーテルを使用して経口気管内挿管を行い、その後ミ
ニベントベンチレーターを使用してマウスに機械的に人工呼吸した。左側開胸術部位上の
皮膚を、ポビドンヨード１０％溶液を使用して滅菌するように前処理をしてドレープをか
けた。加熱パッド使用して、熱消失を防ぐように手技時にマウスを保温した。角膜乾燥を
防ぐため、外科的滅菌性非薬用眼軟膏剤を手術前に目に塗布した。顕微鏡視野下で手術を
行った。適切な鎮静作用が得られると、第４肋間腔において左側開胸術によって開胸した
。筋肉出血がある場合、熱焼灼装置（例えばファインティップ、Ｂｏｖｉｅ）を使用して
止血を行った。肋骨を切り離すために３ｍｍの開創器を使用した。心膜切開術後、前壁Ｍ
Ｉを得るため左冠動脈を７－０プロリーン縫合糸で結紮した。５－０吸収性縫合糸（筋肉
）、及び絹６－０（肋骨及び皮膚の２結紮）で３層において胸を閉鎖した。痛みを７２時
間抑えるため手術後直ちに単一用量で皮下の０．５～１ｍｇ／ｋｇブプレノルフィン徐放
（Ｂｕｐ－ＳＲ－ＬＡＢ）を投与した。手術後直ちに補液を投与した（例えば滅菌生理食
塩水０．９％、腹腔内）。マウスを機敏で活発になるまで回復させた。冠動脈結紮留置以
外のすべてを行った偽手術マウスはコントロールとしての役割をする。

【0146】

心エコー法
１～２％のイソフルランで最小限の麻酔をかけたマウスを高解像度イメージングシステ
ムのＶｅｖｏ２１００（登録商標）（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）を使用して研究した。
種々の時点において麻酔下のマウスでＭモードイメージを得た。後壁及び前壁の拡張期及
び収縮期の厚さ及び左心室腔の拡張終期の直径（ＬＶＥＤＤ）及び収縮終期の直径（ＬＶ
ＥＳＤ）を測定し、ＬＶ容積、短縮率、及び駆出率の推定を行った。

【0147】

本明細書において参照される特許文献及び科学文献は当業者が入手可能な知見を提示す
るものである。本明細書に引用したすべての米国特許及び公開又は非公開の米国特許出願
は、参照により援用される。本明細書に引用したすべての公開外国特許及び特許出願は、
参照により本明細書に援用される。本明細書に引用した他のすべての公開参考文献、文書
、原稿及び科学文献は、参照により本明細書に援用される。

【0148】

本発明はその好ましい実施形態に関して特に示されて記載されているが、当業者には、
添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく態様や詳細に種々の
変更を行い得るということが理解される。

【0149】

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Ｃａｒｎｅｇｉｅ ＧＫ， Ｓｏｕｇｈａｙｅｒ Ｊ， Ｓｍｉｔｈ ＦＤ， Ｐｅｄ
ｒｏｊａ ＢＳ， Ｚｈａｎｇ Ｆ， Ｄｉｖｉａｎｉ Ｄ， Ｂｒｉｓｔｏｗ ＭＲ，
Ｋｕｎｋｅｌ ＭＴ， Ｎｅｗｔｏｎ ＡＣ， Ｌａｎｇｅｂｅｒｇ ＬＫ， Ｓｃｏ
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Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ Ｄ， Ｐｏｐｐｌｅｔｏｎ ＨＭ， Ｓｔｒｉｎｇｆｉｅｌｄ
Ｔ， Ｂａｒｂｉｅｒ Ａ， Ｐａｔｅｌ ＴＢ． Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃ
ａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｃｔｉ
ｖａｔｅｄ ＲＳＫ１ ａｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃ
ｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ－ｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００６；
２６：４５８６-４６００．
Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｋｕｒｏｋａｗａ Ｊ， Ｋａｓｓ ＲＳ． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａ－ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｙｏｔｉａｏ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ｒ
ｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅａｒｔ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ．
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０： ３１３４７-３１３５２， ２００５．
Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｋｕｒｏｋａｗａ Ｊ， Ｋａｓｓ ＲＳ． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａ－ｋｉｎａｓｅ－ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｙｏｔｉａｏ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅａｒｔ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ．
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０： ３１３４７-３１３５２， ２００５．
Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｍａｒｑｕａｒｄｔ ＭＬ， Ｔｅｓｔｅｒ ＤＪ， Ｓａｍｐｓｏ
ｎ ＫＪ， Ａｃｋｅｒｍａｎ ＭＪ， Ｋａｓｓ ＲＳ． Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｎ Ａ－ｋｉｎａｓｅ－ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｌｏｎ
ｇ－ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０
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Ｃｈｅｎ ＰＰ， Ｐａｔｅｌ ＪＲ， Ｒｙｂａｋｏｖａ ＩＮ， Ｗａｌｋｅｒ
ＪＷ， Ｍｏｓｓ ＲＬ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｙ
ｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ Ｃａ２＋ ａｓ ａ ｒ
ｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｓ
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Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｆ， Ｓｚａｓｚａｋ Ｍ， Ｆｒｉｅｄｌ Ｓ， Ｄｒｅｗｉ
ａｎｋａ Ｓ， Ｌｏｒｅｎｚ Ｄ， Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ Ａ， Ｆｕｒｋｅｒｔ Ｊ
， Ｖａｒｇａｓ Ｃ， Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ Ｐ， Ｇｏｔｚ Ｆ， Ｚｕｈｌｋｅ
Ｋ， Ｍｏｕｔｔｙ Ｍ， Ｇｏｔｔｅｒｔ Ｈ， Ｊｏｓｈｉ Ｍ， Ｒｅｉｆ Ｂ，
Ｈａａｓｅ Ｈ， Ｍｏｒａｎｏ Ｉ， Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ Ｓ， Ｋｌｕｋｏｖｉ
ｔｓ Ａ， Ｖｅｒｌｉ Ｊ， Ｇａｓｐａｒ Ｒ， Ｎｏａｃｋ Ｃ， Ｂｅｒｇｍａ
ｎｎ Ｍ， Ｋａｓｓ Ｒ， Ｈａｍｐｅｌ Ｋ， Ｋａｓｈｉｎ Ｄ， Ｇｅｎｉｅｓ
ｅｒ ＨＧ， Ｈｅｒｂｅｒｇ ＦＷ， Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ Ｄ， Ｃｏｏｐｅｒ
ＤＭ， Ｂａｉｌｌｉｅ ＧＳ， Ｈｏｕｓｌａｙ ＭＤ， ｖｏｎ Ｋｒｉｅｓ ＪＰ
， Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｂ， Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ Ｗ， Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ Ｅ
． Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＡＫＡＰ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ （
ＰＫＡ） ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒｓ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔ
ｅ ＰＫＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ ｃ
ＡＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｂｉｏ
ｌ Ｃｈｅｍ ２８６： ９０７９-９０９６， ２０１１．
Ｃｌｅｒｋ Ａ， Ｃｕｌｌｉｎｇｆｏｒｄ ＴＥ， Ｆｕｌｌｅｒ ＳＪ， Ｇｉｒ
ａｌｄｏ Ａ， Ｍａｒｋｏｕ Ｔ， Ｐｉｋｋａｒａｉｎｅｎ Ｓ， Ｓｕｇｄｅｎ
ＰＨ （２００７） Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｃ
ａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ ２１２：３１１－３２２．
Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ （１９８７）． “Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｎａｌａｐｒｉｌ
ｏｎ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｈｅａｒｔ
ｆａｉｌｕｒｅ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｎｏｒ
ｔｈ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｅｎａｌａｐｒｉｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｔｕｄｙ
（ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ）．” Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３１６（２３）： １４２
９－１４３５．
Ｃｕｅｌｌｏ Ｆ， Ｓｎａｂａｉｔｉｓ ＡＫ， Ｃｏｈｅｎ ＭＳ， Ｔａｕｎｔ
ｏｎ Ｊ， Ａｖｋｉｒａｎ Ｍ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｇ
ｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｎａ＋／Ｈ＋ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｉ
ｓｏｆｏｒｍ １ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ
９０－ｋＤａ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ （ＲＳＫ）： ｅｆｆｅｃ
ｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＳＫ ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ ｆｍｋ ｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａｌｐｈａ１－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ
ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００７；７１：７９９
-８０６．
Ｄｅ Ａｒｃａｎｇｅｌｉｓ Ｖ， Ｓｏｔｏ Ｄ， Ｘｉａｎｇ Ｙ （２００８）
Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ４ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ａ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｃＡＭＰ／ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎ
ａｓｅ ａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆｏｒ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅ ｃｏｎｔ
ｒａｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆｂｅｔａｌ ａｄｒｅｎ
ｅｒｇｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７４：１４５３－１４６
２．
Ｄｉｖｉａｎｉ Ｄ， Ａｂｕｉｎ Ｌ， Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ Ｓ， Ｐａｎｓｉｅ
ｒ Ｌ． Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｏｆ ｂｏｔｈ ＰＫＡ ａｎｄ １４-３－３ ｉｎ
ｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ Ｒｈｏ－ＧＥＦ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＡＫＡＰ－
Ｌｂｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ． ＥＭＢＯ Ｊ ２３： ２８１１-２
８２０， ２００４．
Ｄｉｖｉａｎｉ Ｄ， Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ＫＬ， Ｌｉ Ｊ， Ｋａｐｉｌｏ
ｆｆ ＭＳ． Ａ－ｋｉｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｓｃａｆ
ｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ，” Ａｍ Ｊ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１１ Ｎｏｖ；３０１（５）
：Ｈ１７４２－５３．
Ｄｏｂｒｅｖ Ｄ， Ｗｅｈｒｅｎｓ ＸＨ （２０１４） Ｒｏｌｅ ｏｆ ＲｙＲ
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ｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ： Ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ ａｒｏｕｎｄ ｒｙａｎｏｄｉ
ｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｄ
ｉｓｅａｓｅ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １１４：１３１１－１３１９； ｄｉｓｃｕｓｓｉ
ｏｎ １３１９．
Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ， Ｋ． Ｌ．， Ｍ． Ｇｉｌｄａｒｔ， Ｊ． Ｌｉ，
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ｒｔ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈ
ｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９９：８１６－８２８．
Ｆｏｄｓｔａｄ Ｈ， Ｓｗａｎ Ｈ， Ｌａｉｔｉｎｅｎ Ｐ， Ｐｉｉｐｐｏ Ｋ
， Ｐａａｖｏｎｅｎ Ｋ， Ｖｉｉｔａｓａｌｏ Ｍ， Ｔｏｉｖｏｎｅｎ Ｌ， Ｋ
ｏｎｔｕｌａ Ｋ． Ｆｏｕｒ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｍｕｔａｔｉｏ
ｎｓ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ ７３％ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｐｅｃｔｒ
ｕｍ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｌｏｎｇ－ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ＬＱＴＳ） ａｎ
ｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｆｏｕｎｄｅｒ
ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ Ｆｉｎｌａｎｄ． Ａｎｎ Ｍｅｄ ３６， Ｓｕｐｐｌ １：
５３-６３， ２００４．
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ｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５６： ２３７-
２７２， １９９４．
Ｆｒａｓｅｒ ＩＤ， Ｔａｖａｌｉｎ ＳＪ， Ｌｅｓｔｅｒ ＬＢ， Ｌａｎｇｅ
ｂｅｒｇ ＬＫ， Ｗｅｓｔｐｈａｌ ＡＭ， Ｄｅａｎ ＲＡ， Ｍａｒｒｉｏｎ Ｎ
Ｖ， Ｓｃｏｔｔ ＪＤ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｌｉｐｉｄ－ａｎｃｈｏｒｅｄ Ａ－ｋｉ
ｎａｓｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｃＡＭＰ－
ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｖｅｎｔｓ． ＥＭＢＯ Ｊ １７： ２
２６１-２２７２， １９９８．
Ｆｒｅｙ Ｎ， Ｋａｔｕｓ ＨＡ， Ｏｌｓｏｎ ＥＮ， Ｈｉｌｌ ＪＡ． Ｈｙ
ｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ： ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃ ｔａｒｇｅｔ？ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９： １５８０ -１５８９， ２
００４．
Ｆｒｉｄａｙ ＢＢ， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＰＯ， Ｋｅｇｌｅｙ ＫＭ， Ｐａｖｌ
ａｔｈ ＧＫ （２００３） Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ｓｋｅ
ｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉ
ｎｇ ＭＥＦ２ ａｎｄ ＭｙｏＤ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７１：２１７
－２２７．
Ｆｕｌｌｅｒ ＭＤ， Ｅｍｒｉｃｋ ＭＡ， Ｓａｄｉｌｅｋ Ｍ， Ｓｃｈｅｕｅ
ｒ Ｔ， Ｃａｔｔｅｒａｌｌ ＷＡ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏ
ｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｇｈ
ｔ－ｏｒ－ｆｌｉｇｈｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ３： ｒａ７０
， ２０１０．
Ｇａｆｆｉｎ ＲＤ， Ｐｅｎａ ＪＲ， Ａｌｖｅｓ ＭＳ， Ｄｉａｓ ＦＡ，
Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＳＡ， Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ＬＳ， Ｇｏｌｄｓｐｉｎｋ ＰＨ，
Ｋｒａｎｉａｓ ＥＧ， Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ ＤＦ， Ｗｏｌｓｋａ ＢＭ． Ｌｏ
ｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉ
ｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ
ｔｈｅ ｔｈｉｎ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ，
ｖｉａ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ． ２０１１．
Ｇａｏ Ｔ， Ｙａｔａｎｉ Ａ， Ｄｅｌｌ’Ａｃｑｕａ ＭＬ， Ｓａｋｏ Ｈ，
Ｇｒｅｅｎ ＳＡ， Ｄａｓｃａｌ Ｎ， Ｓｃｏｔｔ ＪＤ， Ｈｏｓｅｙ ＭＭ．
ｃＡＭＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ Ｌ－
ｔｙｐｅ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔａｒ
ｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＰＫＡ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈａ
ｎｎｅｌ ｓｕｂｕｎｉｔｓ． Ｎｅｕｒｏｎ １９： １８５-１９６， １９９７．
Ｇａｏ Ｙ， Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ ＪＢ， Ｇｕｏ Ｆ， Ｚｈｅｎｇ Ｊ， Ｚｈ
ｅｎｇ Ｙ． Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃ
ｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０
１： ７６１８-７６２３， ２００４．
Ｇｅｌｂ ＢＤ， Ｔａｒｔａｇｌｉａ Ｍ． ＲＡＳ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔ
ｈｗａｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｔｒｏ－ ｐｈｉｃ ｃａｒｄｉｏ
ｍｙｏｐａｔｈｙ： ｇｅｔｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ａｎｄ ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈ
ｉｃｋ ｏｆ ｉｔ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１１；１２１：８４４-８
４７．
ＧｅｎｔｉｌｕｃｃｉＬ，ＴｏｌｏｍｅｌｌｉＡ，ＳｑｕａｓｓａｂｉａＦ．Ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓａｎｄｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｓｕｒｇ
ｅｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３：
２４４９- ２４６６， ２００６．
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Ｆｏｎａｒｏｗ， Ｊ． Ｓ． Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ， Ｏ． Ｋｈａｖｊｏｕ， Ｍ
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ａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ａｎｄ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ：
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙ
ｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｙａｎｏｄｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｔ ｓｅｒｉ
ｎｅ ２８０８ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ａｌｔｅｒ ｃａｒｄｉａｃ ｃｏｎｔｒａｃｔｉ
ｌｉｔｙ ｏｒ ｃａｕｓｅ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ａｎｄ ａｒｒｈｙｔｈｍ
ｉａｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １１４：１３２０－１３２７； ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ
１３２７．
Ｈｕａｎｇ ＬＪ， Ｄｕｒｉｃｋ Ｋ， Ｗｅｉｎｅｒ ＪＡ， Ｃｈｕｎ Ｊ，
Ｔａｙｌｏｒ ＳＳ． Ｄ－ＡＫＡＰ２， ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａ
ｓｅ Ａ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｒ
ＧＳ ｄｏｍａｉｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４： １１
１８４-１１１８９， １９９７．
Ｈｕａｎｇ ＬＪ， Ｄｕｒｉｃｋ Ｋ， Ｗｅｉｎｅｒ ＪＡ， Ｃｈｕｎ Ｊ，
Ｔａｙｌｏｒ ＳＳ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｕａ
ｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｄ－ＡＫＡＰ１． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２： ８０５７
-８０６４， １９９７．
Ｈｕａｎｇ ＬＪ， Ｄｕｒｉｃｋ Ｋ， Ｗｅｉｎｅｒ ＪＡ， Ｃｈｕｎ Ｊ，
Ｔａｙｌｏｒ ＳＳ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｂｉｎ
ｄｓ ｂｏｔｈ ｔｙｐｅ Ｉ ａｎｄ ｔｙｐｅ ＩＩ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕ
ｂｕｎｉｔｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９７；２７２：８０５７-８０６４．
Ｈｕｌｍｅ ＪＴ， Ａｈｎ Ｍ， Ｈａｕｓｃｈｋａ ＳＤ， Ｓｃｈｅｕｅｒ Ｔ
， Ｃａｔｔｅｒａｌｌ ＷＡ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｔ
ａｒｇｅｔｓ ＡＫＡＰ１５ ａｎｄ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ｋｉ－ ｎａｓｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｃ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ Ｃａ２ ｃｈａｎｎｅｌ ａｎｄ ｍｏｄｕ－ ｌ
ａｔｅｓ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７： ４０７９
-４０８７， ２００２．
Ｈｕｌｍｅ ＪＴ， Ｌｉｎ ＴＷ， Ｗｅｓｔｅｎｂｒｏｅｋ ＲＥ， Ｓｃｈｅｕ
ｅｒ Ｔ， Ｃａｔｔｅｒａｌｌ ＷＡ． Ｂｅｔａ－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｇｕ
ｌａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｏｆ ＰＫＡ
ｔｏ ｃａｒｄｉａｃ ＣａＶ１．２ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｖｉａ ａ ｌｅｕｃｉｎｅ
ｚｉｐｐｅｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａ ｋｉｎａｓｅ－ａｎｃｈｏｒ
－ ｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １５． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
１００： １３０９３-１３０９８， ２００３．
Ｈｕｌｍｅ ＪＴ， Ｗｅｓｔｅｎｂｒｏｅｋ ＲＥ， Ｓｃｈｅｕｅｒ Ｔ， Ｃａ
ｔｔｅｒａｌｌ ＷＡ． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ－ ｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ
１９２８ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｌ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ
ｃａｒｄｉａｃ ＣａＶ１．２ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｂｅｔａ１－ａｄｒ
ｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ
ＳＡ １０３： １６５７４ -１６５７９， ２００６．
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ Ｃ， Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ Ｅ． Ｄｉｒｅｃｔ ＡＫＡＰ
－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａ
ｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｓ． Ｈａｎｄ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ １８６： ４８３- ５０３， ２００８．
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ Ｃ， Ｋｒａｕｓｅ Ｇ， Ｂｅｙｅｒｍａｎｎ Ｍ， Ｐ
ｒｉｎｚ Ａ， Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｂ， Ｄｉｅｋｍａｎｎ Ｏ， Ｌｏｒｅｎｚ
Ｄ， Ｓｔｅｆａｎ Ｅ， Ｎｅｄｖｅｔｓｋｙ Ｐ， Ｄａｔｈｅ Ｍ， Ｃｈｒｉ
ｓｔｉａｎ Ｆ， ＭｃＳｏｒｌｅｙ Ｔ， Ｋｒａｕｓｅ Ｅ， ＭｃＣｏｎｎａｃｈ
ｉｅ Ｇ， Ｈｅｒｂｅｒｇ ＦＷ， Ｓｃｏｔｔ ＪＤ， Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ Ｗ，
Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ Ｅ． Ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＡＫＡＰ７ｄｅｌｔａ－ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ｎｏｖｅｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ－ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３９６： ２９７-３０６， ２００６．
Ｊａａｋｋｏｌａ Ｐ， Ｍｏｌｅ ＤＲ， Ｔｉａｎ ＹＭ， Ｗｉｌｓｏｎ ＭＩ
， Ｇｉｅｌｂｅｒｔ Ｊ， Ｇａｓｋｅｌｌ ＳＪ， Ｋｒｉｅｇｓｈｅｉｍ Ａ，
Ｈｅｂｅｓｔｒｅｉｔ ＨＦ， Ｍｕｋｈｅｒｊｉ Ｍ， Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ＣＪ，
Ｍａｘｗｅｌｌ ＰＨ， Ｐｕｇｈ ＣＷ， Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ ＰＪ． Ｔａｒｇ
ｅｔｉｎｇ ｏｆ ＨＩＦ－ａｌｐｈａ ｔｏ ｔｈｅ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－ Ｌｉ
ｎｄａｕ ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｙ Ｏ_２－ｒｅｇｕｌａ
ｔｅｄ ｐｒｏｌｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２： ４
６８ -４７２， ２００１．
Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ Ｒ， Ｈｉｐｓｋｉｎｄ ＲＡ， Ｈｏｕｔｈａｅｖｅ Ｔ，
Ｎｏｒｄｈｅｉｍ Ａ， Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ ＨＧ （１９９２） Ｉｄｅｎｔｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＳＲＦ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． ＥＭＢＯ Ｊ １１：１０４５－１０５４．
Ｊｕｇｄｕｔｔ ＢＩ （２００３） Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｏ
ｃａｒｄｉｕｍ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌ
ｌａｇｅｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙｓ
． Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｈａｅｍａｔｏｌ
Ｄｉｓｏｒｄ ３：１－３０．
Ｋａｍｉｓａｇｏ Ｍ， Ｓｈａｒｍａ ＳＤ， ＤｅＰａｌｍａ ＳＲ， Ｓｏｌｏ
ｍｏｎ Ｓ， Ｓｈａｒｍａ Ｐ， ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ Ｂ， Ｓｍｏｏｔ Ｌ， Ｍ
ｕｌｌｅｎ ＭＰ， Ｗｏｏｌｆ ＰＫ， Ｗｉｇｌｅ ＥＤ， Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ
， Ｓｅｉｄｍａｎ ＣＥ． Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓａｒｃｏｍｅｒｅ ｐｒｏ
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００．
Ｋａｍｍｅｒｅｒ Ｓ， Ｂｕｒｎｓ－Ｈａｍｕｒｏ ＬＬ， Ｍａ Ｙ， Ｈａｍｏ
ｎ ＳＣ， Ｃａｎａｖｅｓ ＪＭ， Ｓｈｉ ＭＭ， Ｎｅｌｓｏｎ ＭＲ， Ｓｉｎ
ｇ ＣＦ， Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ， Ｔａｙｌｏｒ ＳＳ， Ｂｒａｕｎ Ａ． Ａｍｉ
ｎｏ ａｃｉｄ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏ
ｍａｉｎ ｏｆ ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａ ｋｉｎａｓｅ－ａｎｃｈｏｒｉｎｇ
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ｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐ
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Ｌｏｒｅｎｚ ＪＮ， Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ＷＨ， Ｍｅｌｏｃｈｅ Ｓ， Ｍｏｌ
ｋｅｎｔｉｎ ＪＤ． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅ
ｄ ｋｉｎａｓｅｓ １ ａｎｄ ２ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ ｂ
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ｆａｒｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃ
ａｒｄｉａｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎ－
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Ｋｉｍｕｒａ ＴＥ， Ｊｉｎ Ｊ， Ｚｉ Ｍ， Ｐｒｅｈａｒ Ｓ， Ｌｉｕ Ｗ
， Ｏｃｅａｎｄｙ Ｄ， Ａｂｅ Ｊ， Ｎｅｙｓｅｓ Ｌ， Ｗｅｓｔｏｎ ＡＨ，
Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ ＥＪ， Ｗａｎｇ Ｘ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌ－ ｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅ
ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ５ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈ
ｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｖｅｒｌｏ
ａｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ． Ｃｉｒｃ
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Ｐｈａｍ ＢＱ， Ｓｐｒａｇｇｏｎ Ｇ， Ｘｕｏｎｇ ＮＨ， Ｊｅｎｎｉｎｇｓ
ＰＡ， Ｔａｙｌｏｒ ＳＳ． Ａ ｄｙｎａｍｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ
ＡＫＡＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＲＩＩ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｃＡＭＰ－ｄｅｐ
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ａ Ｇ， Ｈｅｎｎ Ｖ， Ｋｌａｕｓｃｈｅｎｚ Ｅ， Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ Ｃ
， Ｍａｒｉｃ Ｋ， Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ Ｗ． Ｈｔ３１： ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｉｎ
ｔｅｇｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ａｎｄ Ｒｈｏ ｓｉｇｎａｌｉ
ｎｇ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５０７： ２６４-２６８， ２００１．
Ｋｏｄａｍａ Ｈ， Ｆｕｋｕｄａ Ｋ， Ｐａｎ Ｊ， Ｓａｎｏ Ｍ， Ｔａｋａ
ｈａｓｈｉ Ｔ， Ｋａｔｏ Ｔ， Ｍａｋｉｎｏ Ｓ， Ｍａｎａｂｅ Ｔ， Ｍｕｒ
ａｔａ Ｍ， Ｏｇａｗａ Ｓ． Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＥＲＫ ｃａｓｃ
ａｄｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＪＡＫ／ＳＴＡＴ ａｎｄ ＰＩ３－Ｋ ｐａｔ
ｈｗａｙ ｉｎ ｇｐ１３０－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐ
ｈｙ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００
０；２７９（４）：Ｈ１６３５－１６４４．
Ｋｏｎｔａｒｉｄｉｓ ＭＩ， Ｙａｎｇ Ｗ， Ｂｅｎｃｅ ＫＫ， Ｃｕｌｌｅｎ
Ｄ， Ｗａｎｇ Ｂ， Ｂｏｄｙａｋ Ｎ， Ｋｅ Ｑ， Ｈｉｎｅｋ Ａ， Ｋａｎ
ｇ ＰＭ， Ｌｉａｏ Ｒ， Ｎｅｅｌ ＢＧ． Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｔｐｎ１
１ （Ｓｈｐ２） ｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｃａｕｓｅｓ ｄｉｌａｔｅ
ｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｖｉａ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒ
ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ／ｍｉｔｏｇｅ
ｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ＲｈｏＡ ｓｉｇｎ
ａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００８；１１７：１４
２３-１４３５．
Ｋｒｉｔｚｅｒ ＭＤ， Ｌｉ Ｊ， Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ Ｋ， Ｋａｐｉｌｏ
ｆｆ ＭＳ， “ＡＫＡＰｓ： ｔｈｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ ｕｎｄｅｒｐｉ
ｎｎｉｎｇｓ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｃＡＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，” Ｊ Ｍｏｌ Ｃ
ｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２０１２ Ｆｅｂ；５２（２）：３５１－８．
Ｋｒｉｔｚｅｒ， Ｍ． Ｄ．， Ｊ． Ｌｉ， Ｃ． Ｌ． Ｐａｓｓａｒｉｅｌｌ
ｏ， Ｍ． Ｇａｙａｎｉｌｏ， Ｈ． Ｔｈａｋｕｒ， Ｊ． Ｄａｙａｎ， Ｋ．
Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ ａｎｄ Ｍ． Ｓ． Ｋａｐｉｌｏｆｆ （２０１４）． “
Ｔｈｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｓｃｌｅ Ａ－ｋｉｎａｓｅ ａｎｃ
ｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｔａ ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓ ｃａｒｄｉａｃ
ｍｙｏｃｙｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｄ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ．”
Ｃｉｒｃ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ ７（４）： ６６３－６７２．
Ｋｕｍａｒ， Ｄ．， Ｔ． Ａ． Ｈａｃｋｅｒ， Ｊ． Ｂｕｃｋ， Ｌ． Ｆ．
Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ， Ｅ． Ｈ． Ｋａｊｉ， Ｐ． Ｓ． Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎ
ｄ Ｔ． Ｊ． Ｋａｍｐ （２００５）． “Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｕｓｅ ｃｏｒ
ｏｎａｒｙ ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ
ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ ｔｏ ｌｉｇａｔｉｏｎ．” Ｃｏｒｏｎ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉ
ｓ １６（１）： ４１－４４．
Ｌａｃａｎａ Ｅ， Ｍａｃｅｙｋａ Ｍ， Ｍｉｌｓｔｉｅｎ Ｓ， Ｓｐｉｅｇｅ
ｌ Ｓ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒ－ ｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＡＫＡ
Ｐ）－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ａ
ｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ １ ａｃｔｉｖｉ
ｔｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７： ３２９４７-３２９５３， ２００２．
Ｌａｙｌａｎｄ Ｊ， Ｓｏｌａｒｏ ＲＪ， Ｓｈａｈ ＡＭ． Ｒｅｇｕｌａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒ
ｏｐｏｎｉｎ Ｉ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ
６６： １２-２１， ２００５．
Ｌｅｃｈｗａｒｄ Ｋ， Ａｗｏｔｕｎｄｅ ＯＳ， Ｓｗｉａｔｅｋ Ｗ， Ｍ
ｕｓｚｙｎｓｋａ Ｇ （２００１） Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ
２Ａ： ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ ４８：９２１－９３３．
Ｌｅｈｎａｒｔ， Ｓ． Ｅ．， Ｘ． Ｈ． Ｗｅｈｒｅｎｓ， Ｓ． Ｒｅｉｋｅ
ｎ， Ｓ． Ｗａｒｒｉｅｒ， Ａ． Ｅ． Ｂｅｌｅｖｙｃｈ， Ｒ． Ｄ． Ｈａｒ
ｖｅｙ， Ｗ． Ｒｉｃｈｔｅｒ， Ｓ． Ｌ． Ｊｉｎ， Ｍ． Ｃｏｎｔｉ ａｎｄ
Ａ． Ｒ． Ｍａｒｋｓ （２００５）． “Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ
４Ｄ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｙａｎｏｄｉｎｅ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ａｎｄ ａｒｒｈｙ
ｔｈｍｉａｓ．” Ｃｅｌｌ １２３（１）： ２５－３５．
Ｌｅｓｔｅｒ ＬＢ， Ｌａｎｇｅｂｅｒｇ ＬＫ， Ｓｃｏｔｔ ＪＤ． Ａｎｃｈ
ｏｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｈｏ
ｒｍｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４： １４９４２-１４９４７， １９９７．
Ｌｉ ＣＬ， Ｓａｔｈｙａｍｕｒｔｈｙ Ａ， Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ Ａ， Ｔａｎ
ｋ Ｄ， Ｒａｍａｎａｎ Ｎ （２０１４） ＳＲＦ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏ
ｎ ｂｙ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ－３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ
ａｘｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｊ Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ ３４：４０２７－４０４２．
Ｌｉ Ｈ， Ａｄａｍｉｋ Ｒ， Ｐａｃｈｅｃｏ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｇ， Ｍｏ
ｓｓ Ｊ， Ｖａｕｇｈａｎ Ｍ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ－ａｎｃｈｏｒ
ｉｎｇ （ＡＫＡＰ） ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ－ｉｎｈｉｂｉ
ｔｅｄ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
２ （ＢＩＧ２）． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００： １６
２７-１６３２， ２００３．
Ｌｉ Ｊ， Ｋｒｉｔｚｅｒ ＭＤ， Ｍｉｃｈｅｌ ＪＪ， Ｌｅ Ａ， Ｔｈａｋ
ｕｒ Ｈ， Ｇａｙａｎｉｌｏ Ｍ， Ｐａｓｓａｒｉｅｌｌｏ ＣＬ， Ｎｅｇｒｏ
Ａ， Ｄａｎｉａｌ ＪＢ， Ｏｓｋｏｕｅｉ Ｂ， Ｓａｎｄｅｒｓ Ｍ， Ｈａｒｅ
ＪＭ， Ｈａｎａｕｅｒ Ａ， Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ Ｋ， Ｋａｐｉｌｏｆｆ
ＭＳ， “Ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐ９０ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ ３
ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏ
ｐｈｙ，” Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｊａｎ ４；１１２（１）：１２８－３９
．
Ｌｉ Ｊ， Ｎｅｇｒｏ Ａ， Ｌｏｐｅｚ Ｊ， Ｂａｕｍａｎ ＡＬ， Ｈｅｎｓ
ｏｎ Ｅ， Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ Ｋ， Ｋａｐｉｌｏｆｆ ＭＳ． Ｔｈｅ ｍＡ
ＫＡＰｂｅｔａ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙ
ｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ｖｉａ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ． Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ４８：
３８７-３９４， ２０１０．
Ｌｉ Ｊ， Ｎｅｇｒｏ Ａ， Ｌｏｐｅｚ Ｊ， Ｂａｕｍａｎ ＡＬ， Ｈｅｎｓ
ｏｎ Ｅ， Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆｋａ Ｋ， Ｋａｐｉｌｏｆｆ ＭＳ， “Ｔｈｅ ｍ
ＡＫＡＰｂｅｔａ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃ
ｙｔｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ｖｉａ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｔｉｖ
ａｔｅｄ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ，” Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２
０１０ Ｆｅｂ；４８（２）：３８７－９４．
Ｌｉ Ｊ， Ｖａｒｇａｓ ＭＡ， Ｋａｐｉｌｏｆｆ ＭＳ， Ｄｏｄｇｅ－Ｋａｆ
ｋａ ＫＬ， Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＦ２ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａ
ｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ／ｍＡＫＡＰ ｃｏｍｐｌｅｘｅ
ｓ，” Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｆｅｂ １５；３１９（４）：４４７
－５４．
Ｌｉ， Ｊ．， Ｓ． Ａｐｏｎｔｅ Ｐａｒｉｓ， Ｈ． Ｔｈａｋｕｒ， Ｍ．
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ｍｙｏｓｉｎ ｍｉｃｅ ｉｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ， ｈｙｐｅ
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Ｍｏｎｏｖｉｃｈ Ｌ， Ｖｅｇａ ＲＢ， Ｍｅｒｅｄｉｔｈ Ｅ， Ｍｉｒａｎｄ
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Ｄ， Ｋｏｃｈ ＫＡ， Ｃｈａｐｏ ＪＡ， Ｈｏｏｄ ＤＢ， ＭｃＫｉｎｓｅｙ
ＴＡ （２０１０） Ａ ｎｏｖｅｌ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｅｓｔａ
ｂｌｉｓｈｅｓ ａ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋ
ｉｎａｓｅ Ｄ ａｓ ａ ｃａｒｄｉａｃ ｃｌａｓｓ Ｉｌａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄ
ｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｋｉｎａｓｅ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５８４：６３１－６３７
．
Ｍｏｒｉｓｓｅｔｔｅ ＭＲ， Ｓａｈ ＶＰ， Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ ＣＣ， Ｂ
ｒｏｗｎ ＪＨ． Ｔｈｅ Ｒｈｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ， ＰＫＮ， ｒｅｇｕｌａｔｅ
ｓ ＡＮＦ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔ
ｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ． Ａｍ
Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７８： Ｈ１７６９-
Ｈ１７７４， ２０００．
Ｍｕｃｈｉｒ Ａ， Ｂｏｎｎｅ Ｇ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｏｉ ＡＪ， ｖａｎ
Ｍｅｅｇｅｎ Ｍ， Ｂａａｓ Ｆ， Ｂｏｌｈｕｉｓ ＰＡ， ｄｅ Ｖｉｓｓｅｒ
Ｍ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｋ （２０００） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌａｍｉｎｓ Ａ／
Ｃ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｌｉｍｂ ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃ
ｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｗｉｔｈ ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｃｏｎ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｓ （ＬＧＭＤｌＢ）． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇ
ｅｎｅｔ ９：１４５３－１４５９．
Ｎａｇａ Ｐｒａｓａｄ ＳＶ， Ｂａｒａｋ ＬＳ， Ｒａｐａｃｃｉｕｏｌｏ Ａ
， Ｃａｒｏｎ ＭＧ， Ｒｏｃｋｍａｎ ＨＡ． Ａｇｏｎｉｓｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎ
ｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａ
ｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｙ ｂｅｔａ－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ １． Ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｅｑｕ
ｅｓｔｒａｔｉｏｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６： １８９５３-１８９５９，
２００１．
Ｎａｇａ Ｐｒａｓａｄ ＳＶ， Ｌａｐｏｒｔｅ ＳＡ， Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ
Ｄ， Ｃａｒｏｎ ＭＧ， Ｂａｒａｋ Ｌ， Ｒｏｃｋｍａｎ ＨＡ． Ｐｈｏｓｐ
ｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｂｅｔａ_２－ａｄｒ
ｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｙ ＡＰ－２ ｒｅｃ
ｒｕｉｔｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｂｅｔａ－ａｒｒｅｓｔｉｎ ｃ
ｏｍｐｌｅｘ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５８： ５６３-５７５， ２００２．
Ｎａｋａｇａｍｉ Ｈ， Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｙ， Ｋａｔｓｕｙａ Ｔ， Ｍｏｒｉｓ
ｈｉｔａ Ｒ， Ａｋａｓａｋａ Ｈ， Ｓａｉｔｏｈ Ｓ， Ｒａｋｕｇｉ Ｈ， Ｋ
ａｎｅｄａ Ｙ， Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ， Ｏｇｉｈａｒａ Ｔ． Ｇｅｎｅ ｐｏ
ｌｙｍｏｒ－ ｐｈｉｓｍ ｏｆ ｍｙｏｓｐｒｙｎ （ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ
－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ５） ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｅｆｔ ｖ
ｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｗａｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉ
ｔｈ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ Ｒｅｓ ３０： １２３９-
１２４６， ２００７．
Ｎａｋａｍｕｒａ Ａ， Ｒｏｋｏｓｈ ＤＧ， Ｐａｃｃａｎａｒｏ Ｍ， Ｙｅｅ
ＲＲ， Ｓｉｍｐｓｏｎ ＰＣ， Ｇｒｏｓｓｍａｎ Ｗ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｅ． Ｌ
Ｖ ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｗｉｔｈ ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ
ａｏｒｔｉｃ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００１；２８１：Ｈ１１０４－１１
１２
Ｎａｋａｙａｍａ Ｋ， Ｆｒｅｗ ＩＪ， Ｈａｇｅｎｓｅｎ Ｍ， Ｓｋａｌｓ
Ｍ， Ｈａｂｅｌｈａｈ Ｈ， Ｂｈｏｕｍｉｋ Ａ， Ｋａｄｏｙａ Ｔ， Ｅｒｄｊ
ｕｍｅｎｔ－Ｂｒｏｍａｇｅ Ｈ， Ｔｅｍｐｓｔ Ｐ， Ｆｒａｐｐｅｌｌ ＰＢ，
Ｂｏｗｔｅｌｌ ＤＤ， Ｒｏｎａｉ Ｚ． Ｓｉａｈ２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｔａ
ｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｌｙｌ－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ， ｃｏｎｔｒｏｌｓ
ＨＩＦ１ａｌｐｈａ ａｂｕｎｄａｎｃｅ， ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｐｈｙｓｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｈｙｐｏｘｉａ． Ｃｅｌｌ １１７：
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Ｎａｕｅｒｔ ＪＢ， Ｋｌａｕｃｋ ＴＭ， Ｌａｎｇｅｂｅｒｇ ＬＫ， Ｓｃｏ
ｔｔ ＪＤ． Ｇｒａｖｉｎ， ａｎ ａｕｔｏａｎ－ ｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚ
ｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ ｐａｔｉｅ
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Ｐａｔｅｌ ＨＨ， Ｈａｍｕｒｏ ＬＬ， Ｃｈｕｎ ＢＪ， Ｋａｗａｒａｇｕｃ
ｈｉ Ｙ， Ｑｕｉｃｋ Ａ， Ｒｅ－ ｂｏｌｌｅｄｏ Ｂ， Ｐｅｎｎｙｐａｃｋｅ
ｒ Ｊ， Ｔｈｕｒｓｔｏｎ Ｊ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｐｉｎｔｏ Ｎ， Ｓｅｌｆ
Ｃ， Ｏｌｓｏｎ Ｇ， Ｉｎｓｅｌ ＰＡ， Ｇｉｌｅｓ ＷＲ， Ｔａｙｌｏｒ
ＳＳ， Ｒｏｔｈ ＤＭ． Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓ
ｅ Ａ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ
ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （ＴＡＴ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａ－ｋｉｎ
ａｓｅ－ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５： ２７６３２-２７６４０， ２０
１０．
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Ｐｅｒｉｎｏ Ａ， Ｇｈｉｇｏ Ａ， Ｆｅｒｒｅｒｏ Ｅ， Ｍｏｒｅｌｌｏ Ｆ
， Ｓａｎｔｕｌｌｉ Ｇ， Ｂａｉｌｌｉｅ ＧＳ， Ｄａｍｉｌａｎｏ Ｆ， Ｄｕ
ｎｌｏｐ ＡＪ， Ｐａｗｓｏｎ Ｃ， Ｗａｌｓｅｒ Ｒ， Ｌｅｖｉ Ｒ， Ａｌｔ
ｒｕｄａ Ｆ， Ｓｉｌｅｎｇｏ Ｌ， Ｌａｎｇｅｂｅｒｇ ＬＫ， Ｎｅｕｂａｕｅ
ｒ Ｇ， ＳＨ， Ｌｅｍｂｏ Ｇ， Ｗｙｍａｎｎ ＭＰ， Ｗｅｔｚｋｅｒ Ｒ，
Ｈｏｕｓｌａｙ ＭＤ， Ｉａｃｃａｒｉｎｏ Ｇ， Ｓｃｏｔｔ ＪＤ， Ｈｉｒｓｃ
ｈ Ｅ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｃａｒｄｉａｃ ＰＩＰ３ ａｎｄ ｃＡＭＰ ｓ
ｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＰＫＡ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏ
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ＧＧ， Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｇ， Ｇｕｅｒｒｉｅｒｏ Ｒ， Ｚａｃｃａｒｏ Ｌ，
Ｄｅｌ Ｇａｔｔｏ Ａ， Ｓａｖｉａｎｏ Ｍ， Ｇａｒｂｉ Ｃ， Ｃａｒａｎｇｉ
Ｒ， Ｄｉ Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｅ， Ｄｏｎａｔｏ Ｇ， Ｉｎｄｏｌｆｉ Ｃ， Ａ
ｖｖｅｄｉｍｅｎｔｏ ＶＥ， Ｃｈｉａｒｉｅｌｌｏ Ｍ． ＡＫＡＰ１２１ ｄｏｗ
ｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｍｐａｉｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃＡＭＰ ｓｉｇｎ
ａｌｓ， ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎ－ ｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ， ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ． Ｃａｒｄｉ
ｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ８８： １０１-１１０， ２０１０．
Ｐｅｒｒｉｎｏ Ｃ， Ｎａｇａ Ｐｒａｓａｄ ＳＶ， Ｍａｏ Ｌ， Ｎｏｍａ
Ｔ， Ｙａｎ Ｚ， Ｋｉｍ ＨＳ， Ｓｍｉｔｈｉｅｓ Ｏ， Ｒｏｃｋｍａｎ ＨＡ
． Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｖｅｒｌｏａｄ ｔｒｉｇｇｅｒ
ｓ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ－ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｒｄｉａｃ ｄｙｓｆｕ
ｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒａｒｅｆａｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｃｌｉｎ
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ｒ， Ｈ． Ｂｕｅｎｏ， Ｊ． Ｇ． Ｃｌｅｌａｎｄ， Ａ． Ｊ． Ｃｏａｔｓ，
Ｖ． Ｆａｌｋ， Ｊ． Ｒ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｊｕａｎａｔｅｙ， Ｖ． Ｐ．
Ｈａｒｊｏｌａ， Ｅ． Ａ． Ｊａｎｋｏｗｓｋａ， Ｍ． Ｊｅｓｓｕｐ， Ｃ．
Ｌｉｎｄｅ， Ｐ． Ｎｉｈｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ， Ｊ． Ｔ． Ｐａｒｉｓｓ
ｉｓ， Ｂ． Ｐｉｅｓｋｅ， Ｊ． Ｐ． Ｒｉｌｅｙ， Ｇ． Ｍ． Ｒｏｓａｎｏ
， Ｌ． Ｍ． Ｒｕｉｌｏｐｅ， Ｆ． Ｒｕｓｃｈｉｔｚｋａ， Ｆ． Ｈ． Ｒｕ
ｔｔｅｎ， Ｐ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ ａｎｄ Ｍ． Ａｕｔｈｏｒｓ／Ｔａｓ
ｋ Ｆｏｒｃｅ （２０１６）． “２０１６ ＥＳＣ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ａｎ
ｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ： Ｔｈｅ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ
ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ （ＥＳＣ） Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅ
ａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （ＨＦＡ） ｏｆ ｔｈｅ ＥＳＣ
．” Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ ３７（２７）： ２１２９－２２００．
Ｐｏｔｔｈｏｆｆ ＭＪ， Ｏｌｓｏｎ ＥＮ （２００７） ＭＥＦ２： ａ ｃｅ
ｎｔｒａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａl
ｐｒｏｇｒａｍｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４：４１３１－４１４０．
Ｐｒａｂｈａｋａｒ Ｒ， Ｂｏｉｖｉｎ ＧＰ， Ｇｒｕｐｐ ＩＬ， Ｈｏｉｔ
Ｂ， Ａｒｔｅａｇａ Ｇ， Ｓｏｌａｒｏ ＪＲ， Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ ＤＦ． Ａ
ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ａｌ
ｐｈａ－ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｓ ｓｅｖｅｒｅ ｃ
ａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ． ２００１；３３（１０）：１８１５－１８
２８．
Ｐｒａｓａｄ， Ｋ． Ｍ．， Ｙ． Ｘｕ， Ｚ． Ｙａｎｇ， Ｓ． Ｔ． Ａｃ
ｔｏｎ ａｎｄ Ｂ． Ａ． Ｆｒｅｎｃｈ （２０１１）． “Ｒｏｂｕｓｔ ｃａｒ
ｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｌｌ
ｏｗｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ： ｉｎ ｖｉｖｏ
ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｌｌｏｗｓ ａ Ｐｏｉｓｓｏｎ ｄｉｓｔｒｉｂ
ｕｔｉｏｎ．” Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １８（１）： ４３－５２．
Ｒａｂａｂａｈ Ａ， Ｃｒａｆｔ ＪＷ， Ｊｒ．， Ｗｉｊａｙａ ＣＳ， Ａｔ
ｒｏｏｚ Ｆ， Ｆａｎ Ｑ， Ｓｉｎｇｈ Ｓ， Ｇｕｉｌｌｏｒｙ ＡＮ， Ｋａｔ
ｓｏｎｉｓ Ｐ， Ｌｉｃｈｔａｒｇｅ ０， ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ＢＫ （２０１３
） Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ
－４Ｄ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｃｏｄｉｎｇ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ
ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｍＡＫＡＰ）
． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２５：３２７７－３２８８，
Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ Ａ， Ｐｅａｒｓｏｎ ＧＷ， Ｃｈｒｅｓｔｅｎｓｅｎ
ＣＡ， Ｓｔｕｒｇｉｌｌ ＴＷ， Ｃｏｂｂ ＭＨ （２００６） Ｔｈｅ ＭＡＰ
ｋｉｎａｓｅ ＥＲＫ５ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ
ｐ９０ ＲＳＫ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ４４９：８－１６．
Ｒｅｉｋｅｎ Ｓ， Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ Ｍ， Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ Ｊ，
Ｈｅ Ｋｌ ＫＬ， Ｐｒｉｅｔｏ Ａ， Ｂｅｃｋｅｒ Ｅ， Ｙｉ Ｇｈ ＧＨ，
Ｗａｎｇ Ｊ， Ｂｕｒｋｈｏｆｆ Ｄ， Ｍａｒｋｓ ＡＲ （２００１） ｂｅｔ
ａ－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋｅｒｓ ｒｅｓｔｏｒｅ ｃ
ａｒｄｉａｃ ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ ｃｈａｎｎｅｌ （ｒｙａｎｏｄｉｎ
ｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ） ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅ
ａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０４：２８４３－２８４８．
Ｒｅｓｊｏ Ｓ， Ｏｋｎｉａｎｓｋａ Ａ， Ｚｏｌｎｉｅｒｏｗｉｃｚ Ｓ， Ｍ
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ａｓｅ ｔｙｐｅ ３８ （ＰＤＥ３Ｂ） ｉｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒｓ： ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤＥ３Ｂ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ａ． Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｊ ３４１ （Ｐｔ ３）：８３９－８４５．
Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＪＧ， ＭｃＣａｌｍｏｎ ＳＡ， Ｔｏｍｃｚｙｋ Ｔ， Ｎａ
ｙａ ＦＪ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｓｔａ
ｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｙｏｓｐｒｙｎ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
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Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＳＡ， Ｄｒｅｉｓｂａｃｈ ＶＣ， Ｍｕｒｐｈｙ ＬＯ， Ｂ
ｌｅｎｉｓ Ｊ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
ｅｖｅｎｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎ
ｇ ｏｆ ｐ９０ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ １． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ． ２００１；２１：７４７０－７４８０．
Ｒｉｖｅｒａ ＶＭ， Ｍｉｒａｎｔｉ ＣＫ， Ｍｉｓｒ；ｉ ＲＰ， Ｇｉｎｔｙ
ＤＤ， Ｃｈｅｎ ＲＨ， Ｂｌｅｎｉｓ Ｊ， Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＭＥ （１９
９３） Ａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒｙｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ａｔ ａ
ｓｉｔｅ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｔｓ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔ
ｉｖｉｔｙ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：６２６０－６２７３．
Ｒｏｃｋｍａｎ ＨＡ， Ｋｏｃｈ ＷＪ， Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ ＲＪ． Ｓｅｖｅ
ｎ－ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ－ｓｐａｎ－ ｎｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ
ｈｅａｒｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ４１５： ２０６-２１２， ２０
０２．
Ｒｏｃｋｍａｎ ＨＡ， Ｒｏｓｓ ＲＳ， Ｈａｒｒｉｓ ＡＮ， Ｋｎｏｗｌｔｏ
ｎ ＫＵ， Ｓｔｅｉｎｈｅｌｐｅｒ ＭＥ， Ｆｉｅｌｄ ＬＪ， Ｒｏｓｓ Ｊ Ｊ
ｒ， Ｃｈｉｅｎ ＫＲ． Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｒｉａｌ－ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ ａｎｄ ｉｎ－ ｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｔｒ
ｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎ ａｎ ｉ
ｎ ｖｉｖｏ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐ
ｈｙ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９９１；８８：８２７７
-８２８１．
Ｒｏｇｅｒ ＶＬ， Ｇｏ ＡＳ， Ｌｌｏｙｄ－Ｊｏｎｅｓ ＤＭ， Ａｄａｍｓ
ＲＪ， Ｂｅｒｒｙ ＪＤ， Ｂｒｏｗｎ ＴＭ， Ｃａｒｎｅｔｈｏｎ ＭＲ， Ｄａ
ｉ Ｓ， ｄｅ Ｓｉｍｏｎｅ Ｇ， Ｆｏｒｄ ＥＳ， Ｆｏｘ ＣＳ， Ｆｕｌｌｅ
ｒｔｏｎ ＨＪ， Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ Ｃ， Ｇｒｅｅｎｌｕｎｄ ＫＪ， Ｈａｉｌ
ｐｅｒｎ ＳＭ， Ｈｅｉｔ ＪＡ， Ｈｏ ＰＭ， Ｈｏｗａｒｄ ＶＪ， Ｋｉｓｓ
ｅｌａ ＢＭ， Ｋｉｔｔｎｅｒ ＳＪ， Ｌａｃｋｌａｎｄ ＤＴ， Ｌｉｃｈｔｍａ
ｎ ＪＨ， Ｌｉｓａｂｅｔｈ ＬＤ， Ｍａｋｕｃ ＤＭ， Ｍａｒｃｕｓ ＧＭ，
Ｍａｒｅｌｌｉ Ａ， Ｍａｔｃｈａｒ ＤＢ， ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＭＭ， Ｍｅｉ
ｇｓ ＪＢ， Ｍｏｙ ＣＳ， Ｍｏｚａｆｆａｒｉａｎ Ｄ， Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ
ＭＥ， Ｎｉｃｈｏｌ Ｇ， Ｐａｙｎｔｅｒ ＮＰ， Ｒｏｓａｍｏｎｄ ＷＤ， Ｓ
ｏｒｌｉｅ ＰＤ， Ｓｔａｆｆｏｒｄ ＲＳ， Ｔｕｒａｎ ＴＮ， Ｔｕｒｎｅｒ
ＭＢ， Ｗｏｎｇ ＮＤ， Ｗｙｌｉｅ－Ｒｏｓｅｔｔ Ｊ； Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅ
ａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ
Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ． Ｈｅａｒｔ ｄ
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Ｒｏｓｅ ＢＡ， Ｆｏｒｃｅ Ｔ， Ｗａｎｇ Ｙ． Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖ
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ｒｔ： ａｎｇｅｌｓ ｖｅｒｓｕｓ ｄｅｍｏｎｓ ｉｎ ａ ｈｅａｒｔ－ｂｒｅａ
ｋｉｎｇ ｔａｌｅ． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ． ２０１０；９０：１５０７-１５４
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Ｒｕｓｓｅｌｌ ＭＡ， Ｌｕｎｄ ＬＭ， Ｈａｂｅｒ Ｒ， ＭｃＫｅｅｇａｎ
Ｋ， Ｃｉａｎｃｉｏｌａ Ｎ， Ｂｏｎｄ Ｍ． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ
ｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｓｙｎｅｍｉｎ， ｉｓ ａｎ ＡＫＡＰ ｉ
ｎ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ４５６： ２
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Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓ
ｔｉｍｕｌｉ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ， ｍｉｔｏｇｅｎ
－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ， ａｎｄ ９０－ｋＤ Ｓ６
ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ
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ｔｒｏｎｇ Ｃ， Ｂａｉｎ Ｊ， Ｆｒｏｄｉｎ Ｍ， Ｇｒａｕｅｒｔ Ｍ， Ｈｏ
ｆｆｍａｎｎ Ｍ， Ｓｃｈｎａｐｐ Ｇ， Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒ Ｍ， Ｃｏｈｅｎ
Ｐ， Ａｌｅｓｓｉ ＤＲ． ＢＩ－Ｄ１８７０ ｉｓ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎ
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ｔｈｅ ｃＧＭＰ／ｃＡＭＰ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ｐｒｏｔｅｏｍ－ ｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｅ
ａｒｔ ｔｉｓｓｕｅ ｖａｌｉｄａｔｅｓ ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ
ｔｙｐｅ １－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｇｅｎｕｉｎｅ
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ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ． Ｊ Ｐｒｏｔ
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ｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｓｐａｃｅ ａｎｄ ｔｉｍｅ： ｗｈｅｒｅ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ｃｏｍｅ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ａｎｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅｙ’ｒｅ ａｐａ
ｒｔ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５７）： １２２０－１２２４．
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ｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｒｉｎｅ ５４ ｉｎ
ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｒｎ ２７１：
１６５２６－１６５３４．
Ｓｆｉｃｈｉ－Ｄｕｋｅ Ｌ， Ｇａｒｃｉａ－Ｃａｚａｒｉｎ ＭＬ， Ｓｕｍａｎ
ｄｅａ ＣＡ， Ｓｉｅｖｅｒｔ ＧＡ， Ｂａｌｋｅ ＣＷ， Ｚｈａｎ ＤＹ， Ｍ
ｏｒｉｍｏｔｏ Ｓ， Ｓｕｍａｎｄｅａ ＭＰ． Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ－
ｃａｕｓｉｎｇ ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋ２１０ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉ
ｎ Ｔ ａｌｔｅｒｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ ｏｆ
ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ
４８： ９３４-９４２， ２０１０．
Ｓｈａｎ Ｊ， Ｂｅｔｚｅｎｈａｕｓｅｒ ＭＪ， Ｋｕｓｈｎｉｒ Ａ， Ｒｅｉ
ｋｅｎ Ｓ， Ｍｅｌｉ ＡＣ， Ｗｒｏｎｓｋａ Ａ， Ｄｕｒａ Ｍ， Ｃｈｅｎ
ＢＸ， Ｍａｒｋｓ ＡＲ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｙａｎｏｄｉｎｅ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒ
ｅ ａｎｄ ｂｅｔａ－ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋａｄｅ
ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０： ４３７５-４３８７， ２
０１０．
Ｓｈａｎ Ｊ， Ｋｕｓｈｎｉｒ Ａ， Ｂｅｔｚｅｎｈａｕｓｅｒ ＭＪ， Ｒｅｉ
ｋｅｎ Ｓ， Ｌｉ Ｊ， Ｌｅｈｎａｒｔ ＳＥ， Ｌｉｎｄｅｇｇｅｒ Ｎ， Ｍｏ
ｎｇｉｌｌｏ Ｍ， Ｍｏｈｌｅｒ ＰＪ， Ｍａｒｋｓ ＡＲ． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ
ｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｙａｎｏｄｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅ
ｓ ｔｈｅ ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｇｈｔ ｏｒ ｆｌｉｇｈｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉ
ｎ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０： ４３８８-４３９８， ２０
１０．
Ｓｈａｒｍａ Ｋ， Ｋａｓｓ ＤＡ （２０１４） Ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ
ｗｉｔｈ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ： ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍｓ， ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．
Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １１５：７９－９６．
Ｓｈｙｕ ＫＧ， Ｗａｎｇ ＭＴ， Ｗａｎｇ ＢＷ， Ｃｈａｎｇ ＣＣ， Ｌｅ
ｕ ＪＧ， Ｋｕａｎ Ｐ， Ｃｈａｎｇ Ｈ． Ｉｎｔｒａｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉ
ｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＨＩＦ－ １ａｌｐ
ｈａ／ＶＰ１６ ｈｙｂｒｉｄ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉ
ｎ ａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｉ
ｎ ｔｈｅ ｒａｔ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ５４： ５７６-５８３， ２
００２．
Ｓｉｌｖａ， Ｊ． Ｍ．， Ｍ． Ｚ． Ｌｉ， Ｋ． Ｃｈａｎｇ， Ｗ． Ｇｅ
， Ｍ． Ｃ． Ｇｏｌｄｉｎｇ， Ｒ． Ｊ． Ｒｉｃｋｌｅｓ， Ｄ． Ｓｉｏｌａ
ｓ， Ｇ． Ｈｕ， Ｐ． Ｊ． Ｐａｄｄｉｓｏｎ， Ｍ． Ｒ． Ｓｃｈｌａｂａｃ
ｈ， Ｎ． Ｓｈｅｔｈ， Ｊ． Ｂｒａｄｓｈａｗ， Ｊ． Ｂｕｒｃｈａｒｄ， Ａ
． Ｋｕｌｋａｒｎｉ， Ｇ． Ｃａｖｅｔ， Ｒ． Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ，
Ｗ． Ｒ． ＭｃＣｏｍｂｉｅ， Ｍ． Ａ． Ｃｌｅａｒｙ， Ｓ． Ｊ． Ｅｌｌｅ
ｄｇｅ ａｎｄ Ｇ． Ｊ． Ｈａｎｎｏｎ （２００５）． “Ｓｅｃｏｎｄ－ｇｅｎ
ｅｒａｔｉｏｎ ｓｈＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｃｏｖｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕ
ｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅｓ．” Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７（１１）：
１２８１－１２８８．
Ｓｉｎｇｈ Ａ， Ｒｅｄｄｅｎ ＪＭ， Ｋａｐｉｌｏｆｆ ＭＳ， Ｄｏｄｇｅ－
Ｋａｆｋａ ＫＬ， “Ｔｈｅ ｌａｒｇｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ Ａ－ｋｉｎａｓ
ｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １８ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎ
ａｓｅ Ａ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ １ ａｃｔｉｖｉｔｙ，” Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２０１１
Ｍａｒ；７９（３）：５３３－４０．
Ｓｋｒｏｂｌｉｎ Ｐ， Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ Ｓ， Ｓｃｈａｆｅｒ Ｇ， Ｒｏｓ
ｅｎｔｈａｌ Ｗ， Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ Ｅ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｍｏ
ｌ Ｂｉｏｌ ２８３： ２３５-３３０， ２０１０．
Ｓｍｉｔｈ ＦＤ， Ｌａｎｇｅｂｅｒｇ ＬＫ， Ｃｅｌｌｕｒａｌｅ Ｃ， Ｐａ
ｗｓｏｎ Ｔ， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＤＫ， Ｄａｖｉｓ ＲＪ， Ｓｃｏｔｔ ＪＤ．
ＡＫＡＰ－Ｌｂｃ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ
ｔｈｅ ＥＲＫ１／２ ｃａｓｃａｄｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２： １
２４２-１２４９， ２０１０．
Ｓｍｉｔｈ ＪＡ， Ｐｏｔｅｅｔ－Ｓｍｉｔｈ ＣＥ， Ｘｕ Ｙ， Ｅｒｒｉｎｇ
ｔｏｎ ＴＭ， Ｈｅｃｈｔ ＳＭ， Ｌａｎｎｉｇａｎ ＤＡ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ
ｐ９０ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｓ６ ｋｉ－ ｎａｓｅ （ＲＳＫ） ｒｅｖｅａｌｓ
ａｎ ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＲＳＫ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅ
ｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａ－ ｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５；６５：
１０２７-１０３４．
Ｓｐｉｎａｌｅ ＦＧ， Ｊａｎｉｃｋｉ ＪＳ， Ｚｉｌｅ ＭＲ． Ｍｅｍｂｒａ
ｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｈｅａ
ｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ． Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ２０１３；１１２（１）：１９５－２
０８．
Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ＳＦ， Ｂｒｕｎｔｏｎ ＬＬ （２００１） Ｃｏｒｎｐａｒ
ｔｒｎｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｓｉｇｎａｌｉ
ｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｒｎｙｏｃｙｔｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒ
ｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ４１：７５１－７７３．
Ｓｔｅｌｚｅｒ ＪＥ， Ｐａｔｅｌ ＪＲ， Ｗａｌｋｅｒ ＪＷ， Ｍｏｓｓ Ｒ
Ｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｓｉｎ－
ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ
ｉｎ ｔｈｅ ｍｙｏｆｉ－ ｂｒｉｌｌａｒ ｆｏｒｃｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔ
ｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ． Ｃｉｒｃ
Ｒｅｓ １０１： ５０３-５１１， ２００７．
Ｓｕｍａｎｄｅａ ＣＡ， Ｇａｒｃｉａ－Ｃａｚａｒｉｎ ＭＬ， Ｂｏｚｉｏ Ｃ
Ｈ， Ｓｉｅｖｅｒｔ ＧＡ， Ｂａｌｋｅ ＣＷ， Ｓｕｍａｎｄｅａ ＭＰ． Ｃａ
ｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ， ａ ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ ＡＫＡＰ， ｔｅｔ
ｈｅｒｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ａｔ ｔｈｅ ｍｙｏｆｉｌａｍｅｎｔ
ｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６： ５３０-５４１， ２０１１
Ｔａｋｅｉｓｈｉ Ｙ， Ｈｕａｎｇ Ｑ， Ａｂｅ Ｊ， Ｃｈｅ Ｗ， Ｌｅｅ
ＪＤ， Ｋａｗａｋａｔｓｕ Ｈ， Ｈｏｉｔ ＢＤ， Ｂｅｒｋ ＢＣ， Ｗａｌｓｈ
ＲＡ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｐ９０ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ
ｉｎ ｆａｉｌｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｌａｔｅｄ ｃａ
ｒｄｉｏｍｙ－ ｏｐａｔｈｙ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ． ２００２；５３：
１３１-１３７．
Ｔｅｒｒｅｎｏｉｒｅ Ｃ， Ｈｏｕｓｌａｙ ＭＤ， Ｂａｉｌｌｉｅ ＧＳ， Ｋ
ａｓｓ ＲＳ． Ｔｈｅ ｃａｒｄｉａｃ ＩＫｓ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅ
ｌ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｔｈｅ ｐｈ
ｏｓｐｈｏｄｉｅｓ ｔｅｒａｓｅ ＰＤＥ４Ｄ３． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４
： ９１４０-９１４６， ２００９．
Ｔｈｏｍａｓ ＧＭ， Ｒｕｍｂａｕｇｈ ＧＲ， Ｈａｒｒａｒ ＤＢ， Ｈｕｇａ
ｎｉｒ ＲＬ． Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ ２ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ
ｗｉｔｈ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａ
ｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＡＭＰＡ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．
２００５；１０２：１５００６-１５０１１．
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Ｎｅｕｍａｒ， Ｇ． Ｎｉｃｈｏｌ， Ｌ． Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎ， Ｄ． Ｋ
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Ｚｈａｎｇ Ｑ， Ｂｅｔｈｍａｎｎ Ｃ， Ｗｏｒｔｈ ＮＦ， Ｄａｖｉｅｓ Ｊ
Ｄ， Ｗａｓｎｅｒ Ｃ， Ｆｅｕｅｒ Ａ， Ｒａｇｎａｕｔｈ ＣＤ， Ｙｉ Ｑ，
Ｍｅｌｌａｄ ＪＡ， Ｗａｒｒｅｎ ＤＴ， Ｗｈｅｅｌｅｒ ＭＡ， Ｅｌｌｉｓ
ＪＡ， Ｓｋｅｐｐｅｒ ＪＮ， Ｖｏｒｇｅｒｄ Ｍ， Ｓｃｈｌｏｔｔｅｒ－Ｗｅ
ｉｇｅｌ Ｂ， Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇ ＰＬ， Ｒｏｂｅｒｔｓ ＲＧ， Ｗｅｈｎｅｒ
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ｒｙ Ｄｒｅｉｆｕｓｓ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ａｒｅ ｃ
ｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．
Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １６：２８１６－２８３３．
Ｚｈａｏ Ｙ， Ｂｊｏｒｂａｅｋ Ｃ， Ｍｏｌｌｅｒ ＤＥ． Ｒｅｇｕｌａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｐ９０（ｒｓｋ） ｉｓｏｆｏｒｍｓ
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Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９６；２７１：２９７７３－２９７７９．
Ｚｈａｏ Ｙ， Ｂｊｏｒｂａｅｋ Ｃ， Ｗｅｒｅｍｏｗｉｃｚ Ｓ， Ｍｏｒｔｏ
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９０ｒｓｋ ｉｓｏｆｏｒｍ ｗｉｔｈ ａ ｕｎｉｑｕｅ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ： ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９５ Ａｕｇ； １５（８）： ４３５３-４３６．

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8】

【図9】

【図10AB】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A-C】

【図19D-F】

【図19G-J】

【図20AB】

【図20CD】

【図20EF】

【図20GH】

【図20IJ】

【図21】

【図22】

【図23A-D】

【図23EF】

【図23GH】

【図24-1】

【図24-2】

【図24-3】

【図25-1】

【図25-2】

【図25-3】

【図25-4】

【図25-5】

【図25-6】

【図25-7】

【図26-1】

【図26-2】

【図26-3】

【図26-4】

【図26-5】

【図26-6】

【図26-7】

【図27-1】

【図27-2】

【図27-3】

【図27-4】

【図27-5】

【図27-6】

【図27-7】

【図27-8】

【図28-1】

【図28-2】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32-1】

【図32-2】

【図32-3】

【図32-4】

【図33A-C】

【図33DE】

【図33F-H】

【配列表】

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