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特開2025-5375膵臓がんの医薬品及びその診断キットの調製におけるＴＭＥＤ８遺伝子の応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025005375
(43)【公開日】2025-01-16
(54)【発明の名称】膵臓がんの医薬品及びその診断キットの調製におけるＴＭＥＤ８遺伝子の応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20250108BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20250108BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20250108BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20250108BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/68
C12Q1/6883 Z
G01N33/574 A
【審査請求】有
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024031814
(22)【出願日】2024-03-04
(31)【優先権主張番号】2023107701073
(32)【優先日】2023-06-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】524082074
【氏名又は名称】南通大学付属医院
(74)【代理人】
【識別番号】100189131
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 拓郎
(74)【代理人】
【識別番号】100182486
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 正展
(74)【代理人】
【識別番号】100147289
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 裕子
(72)【発明者】
【氏名】肖明兵
(72)【発明者】
【氏名】呉桐
(72)【発明者】
【氏名】樊興娟
(72)【発明者】
【氏名】史加海
(72)【発明者】
【氏名】鄭文傑
(72)【発明者】
【氏名】倪温慨
(72)【発明者】
【氏名】管程斉
(72)【発明者】
【氏名】陳子微
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR48
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS33
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】膵臓がんの医薬品及び診断キットの調製におけるＴＭＥＤ８遺伝子の使用を提供する。
【解決手段】ＴＭＥＤ８の発現量を検出する試薬であって、前記試薬は、ＴＭＥＤ８のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を検出する試薬を含む、ことを特徴とする試薬を提供する。ＴＭＥＤ８発現量の検出方法は、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング及びリアルタイム定量ＰＣＲのうちの少なくとも１種を含むことが好ましい。
【選択図】図６
【解決手段】ＴＭＥＤ８の発現量を検出する試薬であって、前記試薬は、ＴＭＥＤ８のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を検出する試薬を含む、ことを特徴とする試薬を提供する。ＴＭＥＤ８発現量の検出方法は、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング及びリアルタイム定量ＰＣＲのうちの少なくとも１種を含むことが好ましい。
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＭＥＤ８の発現量を検出する試薬であって、前記試薬は、ＴＭＥＤ８のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を検出する試薬を含む、ことを特徴とする。
【請求項2】
ＴＭＥＤ８発現量の検出方法は、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング及びリアルタイム定量ＰＣＲのうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の試薬。
【請求項3】
前記試薬は、疾患診断製品を調製できることを特徴とする請求項１に記載の試薬。
【請求項4】
前記疾患のタイプは、腫瘍を含む、ことを特徴とする請求項３に記載の試薬。
【請求項5】
腫瘍診断用キットであって、免疫組織化学によるＴＭＥＤ８タンパク質の発現量を検出する試薬、ウエスタンブロッティングによるＴＭＥＤ８タンパク質の発現量を検出する試薬、リアルタイム定量ＰＣＲによるＴＭＥＤ８遺伝子及び／又はｍＲＮＡ発現量を検出するプライマーペアのうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とするキット。
【請求項6】
前記腫瘍は、膵臓がんを含む、ことを特徴とする請求項５に記載のキット。
【請求項7】
ＴＭＥＤ８の発現量を向上させる試薬であって、前記試薬は、ＴＭＥＤ８のアゴニスト、ＴＭＥＤ８のアナログ、ＴＭＥＤ８を過剰発現する試薬のうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする。
【請求項8】
前記試薬は、疾患治療製品を調製できることを特徴とする請求項７に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍の精密医療技術分野に属し、具体的には、膵臓がんの医薬品及びその診断キットの調製におけるＴＭＥＤ８遺伝子の応用に関する。
【背景技術】
【0002】
膵臓がん（ＰＣ）は極めて一般的で悪性度が極めて高い腫瘍であり、早期診断が困難で、転移しやすく、進行が迅速で予後が極めて悪く、世界のがん死亡の主な原因になる。膵臓がんの発生率が最も高い地域には、北米、ヨーロッパ、オーストラリアが含まれ、世界の人口高齢化が進行し、喫煙、肥満、糖尿病、飲酒などが、世界中の多くの地域で流行していると共に、膵臓がんの発生率の急激な増加につながり、ただし、潜在的な有病率と予防戦略の差異により、これらのリスク要因の相対的な貢献は世界的に異なる。遺伝的要因は直接変化することはできないが、遺伝性がん遺伝子中の病原性変異、遺伝性膵臓炎に関する遺伝子及び全ゲノム関連研究で決定された一般的な変異体を含む膵臓がんのリスクの重要な構成部分である。がんの遺伝子の変化を特定することは、このがんの病因を深く理解するだけでなく、早期検出戦略を指導する機会を提供することもできる。膵臓がんは、早期に明らかな症状がないため、タイムリーな発見・診断が困難になり、現在臨床で一般的に使用されている腫瘍マーカー、例えば、ＣＡ１９９やＣＥＡなどは、膵臓がんの早期診断に対する感受性・特異性が低くなる。確定診断されると、多くの患者はすでに中晩期にあり、根治的手術切除のほかは、化学放射線療法を補助する等の手段は予後の改善に非常に限られている。したがって、感受性・特異性がより強い初期マーカーと有効的な治療標的を探索し、発見することには重要な意義がある。
【0003】
ＴＭＥＤファミリー（膜貫通ｅｍｐ２４ドメインファミリー）は、Ｉ型単一チャネル膜貫通タンパク質で構成されており、すべての真核生物に発見され、ヒトの発育及び疾患での地位を無視できない。分泌経路における重要な輸送タンパク質として、制御されるタンパク質輸送経路が異常になると、先天性奇形、糖尿病、がんを含む多くの疾患を引き起こす。過去の研究により、ＴＭＥＤタンパク質の異常な発現は、通常、肝臓疾患、膵臓疾患及び免疫系障害と密接に関連しており、疾患の発生発展の過程中に、分泌ループを形成し、細胞及び細胞内の各細胞小器官の正常な形態を維持し、細胞小器官間でさまざまな重要な貨物成分を循環輸送し、細胞器間のコミュニケーションを実現することができ、それにより、疾患のプロセスを持続的に調節し、特に悪性腫瘍細胞の増殖及び分化において、重要な役割を果たす。
【0004】
ＴＭＥＤ８（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ：２８３５７８）は、該ファミリーの重要なメンバーの１つであり、１４番染色体の７７，３３５，０２１－７７，３７７，０９４塩基の間に位置し、分子量は約５５ｋＤａであり、細胞核及び細胞質内においてすべて発現される。現在、ＴＭＥＤ８とヒトの疾患と正常な生理学的機能との関係に関する文献は報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、膵臓がんの医薬品及び診断キットの調製におけるＴＭＥＤ８遺伝子の応用を提供し、具体的には疾患診断用キットの調製におけるＴＭＥＤ８の応用、及び腫瘍治療用医薬品の調製におけるＴＭＥＤ８の応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、ＴＭＥＤ８の発現量を検出する試薬の、疾患診断製品の調製における応用を提供する。
【0007】
好ましくは、前記試薬は、ＴＭＥＤ８のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を検出する試薬を含む。
【0008】
好ましくは、前記ＴＭＥＤ８の発現量の検出方法は、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング及びリアルタイム定量ＰＣＲの少なくとも１種を含む。
【0009】
好ましくは、前記疾患のタイプは、腫瘍を含む。
【0010】
本発明は、さらに、免疫組織化学によるＴＭＥＤ８タンパク質の発現量を検出する試薬、ウエスタンブロッティングによるＴＭＥＤ８タンパク質の発現量を検出する試薬、リアルタイム定量ＰＣＲによるＴＭＥＤ８遺伝子及び／又はｍＲＮＡの発現量を検出するプライマーペアの中の少なくとも１種を含む腫瘍診断用キットを提供する。
【0011】
好ましくは、前記腫瘍は、膵臓がんを含む。
【0012】
本発明はまた、疾患治療製品の調製における、ＴＭＥＤ８の発現量を向上させるための試薬の応用を提供する。
【0013】
好ましくは、前記試薬は、ＴＭＥＤ８のアゴニスト、ＴＭＥＤ８のアナログ、ＴＭＥＤ８を過剰発現する試薬のうちの少なくとも１種を含む。
【0014】
本発明はまた、内因性ＴＭＥＤ８発現量を向上させる試薬又は外因性ＴＭＥＤ８を含む腫瘍治療薬を提供する。
【0015】
好ましくは、前記治療は、腫瘍細胞の移動の阻害、腫瘍細胞増殖の阻害、腫瘍細胞アポトーシスの促進、ＭＡＰＫシグナル伝達経路活性化の阻害のうちの少なくとも１種を含む。
【発明の効果】
【0016】
本発明は、膵臓がん組織チップを作製することにより、免疫組織化学技術を使用して膵臓がんにおけるＴＭＥＤ８の発現状況を検出したところ、膵臓がん腫瘍組織におけるＴＭＥＤ８の発現レベルは、ｐａｒａｔｕｍｏｒ組織のそれよりもかなり高くなっている。また、ＴＭＥＤ８を過剰発現する膵臓がん安定発現細胞系を確立することにより、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、細胞スクラッチ、ＣＣＫ８、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、フローサイトメトリー、ヌードマウスの皮下腫瘍形成などのインビボおよびインビトロ実験を利用し、膵臓がん細胞の生物学的挙動に対するＴＭＥＤ８の影響を調査し、ＴＭＥＤ８遺伝子の発現をアップレギュレートした後、膵臓がん細胞の移動及び増殖能力を顕著に阻害し、且つ膵臓がん細胞のアポトーシスを促進することを発見している。本発明では、さらに、ＴＭＥＤ８遺伝子がＭＡＰＫシグナル伝達経路に関連していることを発見している。したがって、ＴＭＥＤ８は膵臓がん遺伝子による診断・治療における効果的な標的として使用でき、精密医療の膵臓がん診断キット及び治療薬の製造に重要な応用意義がある。本発明は、初回、膵臓がんにおけるＴＭＥＤ８の発現、および膵臓がん細胞の行動生物学に対する影響を探索し、可能な作用メカニズムとＭＡＰＫシグナル伝達経路との密接関連を調査している。ＴＭＥＤ８は、膵臓がんの診断キット及び治療薬として、膵臓がんの早期診断及び治療に有効なサポートを提供することが期待されている。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】膵臓がん及びｐａｒａｔｕｍｏｒ組織チップにおけるＴＭＥＤ８の発現をＩＨＣにより検出し、選択した代表的な部位の図である。ａ－ｂは、低分化ＰＣがん及びｐａｒａｔｕｍｏｒ組織染色結果、ｃ－ｄは、中分化ＰＣがん及びｐａｒａｔｕｍｏｒ組織染色結果、ｅ－ｆは、高分化ＰＣがん及びｐａｒａｔｕｍｏｒ組織染色結果である。
【図2】ＴＭＥＤ８の発現、それに対応するＷＢ及びＰＣＲによる検証結果の図である。
【図3】膵臓がん正常カテーテル上皮細胞と腫瘍細胞系におけるＴＭＥＤ８の発現比較図である。
【図4】膵臓がん安定発現細胞系のＴＭＥＤ８の過剰発現効率検証図である。
【図5】細胞スクラッチ及びＴｒａｎｓｗｅｌｌ実験による膵臓がん細胞の移動能に対するＴＭＥＤ８の過剰発現の影響を示す図である。
【図6】ＣＣＫ８及びクローン形成実験による膵臓がん細胞の増殖能力に対するＴＭＥＤ８の過剰発現の影響を示す図である。
【図7】フローサイトメトリーによる膵臓がん細胞アポトーシス能力に対するＴＭＥＤ８の過剰発現の影響を示す図である。
【図8】膵臓がん細胞によるヌードマウスの皮下腫瘍形成に対するＴＭＥＤ８の過剰発現の影響を示す図である。
【図9】ＭＡＰＫ関連分子に対するＴＭＥＤ８の発現増加の影響を示す図である。
【図10】ＴＭＥＤ８過剰発現プラスミドｐＬＶ３－ＣＭＶ－ＴＭＥＤ８（ｈｕｍａｎ）－３×ＦＬＡＧ－ＥＦ１ａ－ＣｏｐＧＦＰ－Ｐｕｒｏの構築図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明は、ＴＭＥＤ８発現量を検出する試薬の、疾患診断製品の調製におけるの応用を提供する。
【0019】
本発明の実施例において、生物学的サンプルライブラリーに基づいて膵臓がん組織チップを作製し、免疫組織化学技術を使用して膵臓がんにおけるＴＭＥＤ８の発現を検出し、結果として、膵臓がん腫瘍組織におけるＴＭＥＤ８の発現レベルは、ｐａｒａｔｕｍｏｒ組織よりも顕著に高くなり、且つ統計により、ＴＭＥＤ８高発現群の患者の予後が比較的に良く、それにより前記ＴＭＥＤ８を膵臓がん診断のバイオマーカーとする。
【0020】
本発明に記載の試薬は、好ましくは、ＴＭＥＤ８のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を検出する試薬を含み、かつ前記検出方法は好ましくは、免疫組織化学、ウェスタンブロット及びリアルタイム定量ＰＣＲの少なくとも１種を含む。本発明に記載の疾患のタイプは、好ましくは、腫瘍を含み、より好ましくは膵臓がんである。
【0021】
本発明は、さらに、免疫組織化学によるＴＭＥＤ８タンパク質の発現量を検出する試薬、ウエスタンブロッティングによるＴＭＥＤ８タンパク質の発現量を検出する試薬、リアルタイム定量ＰＣＲによるＴＭＥＤ８遺伝子のｍＲＮＡ発現量を検出するプライマーペアのうちの少なくとも１種を含む腫瘍診断用キットを提供する。ＴＭＥＤ８及び内部コントロール１８Ｓのプライマー配列を表１に示す。
【0022】
表１ プライマー配列
【0023】
本発明に記載の腫瘍は、好ましくは、膵臓がんを含む。
【0024】
本発明はまた、疾患治療製品の調製における、ＴＭＥＤ８の発現量を向上させる試薬の応用を提供する。
【0025】
本発明の実施例において、ＴＭＥＤ８を過剰発現する膵臓がん安定発現細胞系を確立することにより、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、細胞スクラッチ、ＣＣＫ８、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、フローサイトメトリー、ヌードマウスの皮下腫瘍形成などのインビボおよびインビトロ実験を利用し、膵臓がん細胞の生物学的挙動に対するＴＭＥＤ８の影響を調査し、ＴＭＥＤ８遺伝子の発現をアップレギュレートした後、膵臓がん細胞の移動及び増殖能力を顕著に阻害し、且つ膵臓がん細胞のアポトーシスを促進することを発見しており、本発明はさらに、ＴＭＥＤ８遺伝子がＭＡＰＫシグナル伝達経路に関連していることを発見している。したがって、ＴＭＥＤ８は膵臓がん遺伝子の診断・治療における効果的な標的として使用できる。
【0026】
本発明に記載の試薬は、好ましくは、ＴＭＥＤ８のアゴニスト、ＴＭＥＤ８のアナログ、ＴＭＥＤ８を過剰発現する試薬のうちの少なくとも１種を含む。
【0027】
本発明に記載のＴＭＥＤ８を過剰発現する方法は、ＳＥＱ ＩＤＮｏ．５に示すＴＭＥＤ８過剰発現プラスミドｐＬＶ３－ＣＭＶ－ＴＭＥＤ８（ｈｕｍａｎ）－３×ＦＬＡＧ－ＥＦ１ａ－ＣｏｐＧＦＰ－Ｐｕｒｏを構築することを含むことが好ましい。
【0028】
本発明は、さらに、内因性ＴＭＥＤ８発現量を向上させる試薬又は外因性ＴＭＥＤ８を含む腫瘍治療薬を提供する。
【0029】
本発明に記載の内因性ＴＭＥＤ８発現量を向上させる試薬は、好ましくは、上記ＴＭＥＤ８を過剰発現する試薬と同じであり、ここでさらに説明しない。本発明に記載の外因性ＴＭＥＤ８は、好ましくは、上記ＴＭＥＤ８のアゴニスト、ＴＭＥＤ８のアナログと同じであり、ここでさらに説明しない。本発明に記載の治療は、好ましくは、腫瘍細胞移動の阻害、腫瘍細胞増殖の阻害、腫瘍細胞アポトーシスの促進、ＭＡＰＫシグナル伝達経路活性化の阻害のうちの少なくとも１種を含む。
【0030】
以下、本発明をさらに説明するために実施例を参照しながら本発明で提供された膵臓がんの医薬品及び診断キットの調製におけるＴＭＥＤ８遺伝子の応用を詳しく説明しているが、本発明の保護範囲に対する制限として理解することができない。
【0031】
本発明の実施例において、使用された試薬及び機器は、特に説明しない限り、すべて本分野の一般的なキット及び機器であり、試薬販売店から購入することができる。
【0032】
１、本発明の実施例での主な試薬：
ＩＨＣ検査キット（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、中国）、４％パラホルムアルデヒド固定液（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、中国）、ＰＢＳ緩衝液（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、中国）、ウシ血清アルブミンＢＳＡ粉末（Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、中国）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、中国）、キシレン（国薬集団、中国）、ヘマトキシリン染色液（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）、ヘマトキシリン分化液（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）、無水エタノール（国薬集団、中国）、クエン酸ナトリウム抗原賦活化溶液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、中国）、ウサギ由来抗ＴＭＥＤ８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ合衆国）、ウサギ由来抗Ｋｉ６７（Ａｂｓｉｎ、中国）、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ａｂｃａｍ、アメリカ合衆国）、９５％エタノール（国薬集団、中国）、ＤＭＥＭ基礎培地（Ｃｙｔｉｖａ、中国）、ＩＭＤＭ基礎培地（Ｃｙｔｉｖａ、中国）、ＲＰＭＩ基礎培地（Ｃｙｔｉｖａ、中国）、ＰＢＳ基礎緩衝液（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、中国）、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、アメリカ合衆国）、無血清タイプ細胞凍結保存液（新賽美、中国）、ＥＤＴＡ含有トリプシナーゼ消化液（新賽美、中国）、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（新賽美、中国）、塩酸テトラサイクリン溶液（上海生工、中国）、ピューロマイシン（Ｓａｎｇｏｎ、アメリカ合衆国）、細胞培養ディッシュ（Ｎｅｓｔ、中国）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ合衆国）、６ウェルプレート、９６ウェルプレート、２４ウェルプレート（Ｎｅｓｔ、中国）、細胞培養チャンバー８μｍ透明ＰＥＴフィルム（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、アメリカ合衆国）、１．５ｍＬ、４ｍＬ、１０ｍＬの遠沈管、細胞凍結保存管（Ｂｉｏｓｈａｒｐ、アメリカ合衆国）、Ｔｒｉｚｏｌ（諾維賛、中国）、セルスクレイパー（Ｎｅｓｔ、中国）、ＤＥＰＣ水（上海生工、中国）、ＬＣ ８連チューブ（Ｒｏｃｈｅ、スイス）、無酵素ピペットチップ、遠沈管（Ｂｉｏｓｈａｒｐ、中国）、無水エタノール（国薬集団、中国）、イソプロパノール（国薬集団、中国）、トリクロロメタン／クロロホルム（国薬集団、中国）、（１）ＲＩＰＡ強力な細胞溶解液（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）、プロテアーゼ阻害剤ＣＭ（Ａｍｒｅｓｃｏ、アメリカ合衆国）、ホスファターゼ阻害剤ＰＩ（Ａｍｒｅｓｃｏ、アメリカ合衆国）、ＢＣＡタンパク質解析用キット（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）、タンパク質ローディング用緩衝液４×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（諾維賛、中国）、Ｍａｒｋｅｒ標準タンパク質（諾維賛、中国）、ＰＶＤＦ膜（Ｓｉｇｍａ、アメリカ合衆国）、ＴＥＭＥＤテトラメチルエチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ、アメリカ合衆国）、０×電気泳動用緩衝液プレミックス（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、武漢）、１０×転写バッファープレミックス（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、武漢）、１０×ＴＢＳＴプレミックス（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、武漢）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（国薬集団、中国）、イソプロパノール（国薬集団、中国）、過硫酸アンモニウム（ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ、アメリカ合衆国）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）（国薬集団、中国）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（国薬集団、中国）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）（国薬集団、中国）、メタノール（国薬集団、中国）、脱脂粉乳（伊利乳業、中国）、超高感度ＥＣＬ化学発光キット（新賽美、中国）、３０％ポリアクリルアミド溶液（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、中国）、Ｔｗｅｅｎ（国薬集団、中国）、マウス抗ヒトＧＡＰＤＨ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、中国）、ウサギ抗ヒトＴＭＥＤ８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＥＲＫ１／２抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＥＲＫリン酸化抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＰ３８抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＰ３８リン酸化抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＪＮＫ抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＪＮＫリン酸化抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＣａｓｅｐａｓｅ３抗体（Ｓａｎｔａ、日本）、ウサギ抗ヒトＣＤ６３抗体（Ａｂｃａｍ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＣＤ８１抗体（Ａｂｃａｍ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＣＤ９抗体（Ａｂｃａｍ、アメリカ合衆国）、マウス抗ヒトＫｉ－６７抗体（武漢三鷹、中国）、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ合衆国）、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ合衆国）、ＣＣＫ－８キット（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）、細胞周期解析キット（福麦斯生物、中国）、アポトーシス検出キット：ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＰＥ／７－ＡＡＤ二重染色（凱基生物、中国）、クリスタルバイオレット染液（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）。
２、本発明の実施例で使用される主な機器
組織チップシステム（ＵＴ０６、韓国Ｕｎｉｔｍａ社）、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ）、化学発光・ゲル撮影装置（ＢｉｏＲａｄ、アメリカ合衆国）、全自動マイクロプレートリーダ（ＢｉｏＲａｄ、アメリカ合衆国）、電気泳動システム（ＢｉｏＲａｄ、アメリカ合衆国）、細胞培養インキュベーター（賽默飛、アメリカ合衆国）。
ＩＨＣ検査キット（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、中国）、４％パラホルムアルデヒド固定液（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、中国）、ＰＢＳ緩衝液（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、中国）、ウシ血清アルブミンＢＳＡ粉末（Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、中国）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、中国）、キシレン（国薬集団、中国）、ヘマトキシリン染色液（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）、ヘマトキシリン分化液（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）、無水エタノール（国薬集団、中国）、クエン酸ナトリウム抗原賦活化溶液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、中国）、ウサギ由来抗ＴＭＥＤ８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ合衆国）、ウサギ由来抗Ｋｉ６７（Ａｂｓｉｎ、中国）、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ａｂｃａｍ、アメリカ合衆国）、９５％エタノール（国薬集団、中国）、ＤＭＥＭ基礎培地（Ｃｙｔｉｖａ、中国）、ＩＭＤＭ基礎培地（Ｃｙｔｉｖａ、中国）、ＲＰＭＩ基礎培地（Ｃｙｔｉｖａ、中国）、ＰＢＳ基礎緩衝液（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、中国）、ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、アメリカ合衆国）、無血清タイプ細胞凍結保存液（新賽美、中国）、ＥＤＴＡ含有トリプシナーゼ消化液（新賽美、中国）、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（新賽美、中国）、塩酸テトラサイクリン溶液（上海生工、中国）、ピューロマイシン（Ｓａｎｇｏｎ、アメリカ合衆国）、細胞培養ディッシュ（Ｎｅｓｔ、中国）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ合衆国）、６ウェルプレート、９６ウェルプレート、２４ウェルプレート（Ｎｅｓｔ、中国）、細胞培養チャンバー８μｍ透明ＰＥＴフィルム（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、アメリカ合衆国）、１．５ｍＬ、４ｍＬ、１０ｍＬの遠沈管、細胞凍結保存管（Ｂｉｏｓｈａｒｐ、アメリカ合衆国）、Ｔｒｉｚｏｌ（諾維賛、中国）、セルスクレイパー（Ｎｅｓｔ、中国）、ＤＥＰＣ水（上海生工、中国）、ＬＣ ８連チューブ（Ｒｏｃｈｅ、スイス）、無酵素ピペットチップ、遠沈管（Ｂｉｏｓｈａｒｐ、中国）、無水エタノール（国薬集団、中国）、イソプロパノール（国薬集団、中国）、トリクロロメタン／クロロホルム（国薬集団、中国）、（１）ＲＩＰＡ強力な細胞溶解液（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）、プロテアーゼ阻害剤ＣＭ（Ａｍｒｅｓｃｏ、アメリカ合衆国）、ホスファターゼ阻害剤ＰＩ（Ａｍｒｅｓｃｏ、アメリカ合衆国）、ＢＣＡタンパク質解析用キット（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）、タンパク質ローディング用緩衝液４×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（諾維賛、中国）、Ｍａｒｋｅｒ標準タンパク質（諾維賛、中国）、ＰＶＤＦ膜（Ｓｉｇｍａ、アメリカ合衆国）、ＴＥＭＥＤテトラメチルエチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ、アメリカ合衆国）、０×電気泳動用緩衝液プレミックス（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、武漢）、１０×転写バッファープレミックス（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、武漢）、１０×ＴＢＳＴプレミックス（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、武漢）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（国薬集団、中国）、イソプロパノール（国薬集団、中国）、過硫酸アンモニウム（ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ、アメリカ合衆国）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）（国薬集団、中国）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（国薬集団、中国）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）（国薬集団、中国）、メタノール（国薬集団、中国）、脱脂粉乳（伊利乳業、中国）、超高感度ＥＣＬ化学発光キット（新賽美、中国）、３０％ポリアクリルアミド溶液（Ｓｅｒｖｉｃｅｂｉｏ、中国）、Ｔｗｅｅｎ（国薬集団、中国）、マウス抗ヒトＧＡＰＤＨ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、中国）、ウサギ抗ヒトＴＭＥＤ８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＥＲＫ１／２抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＥＲＫリン酸化抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＰ３８抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＰ３８リン酸化抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＪＮＫ抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＪＮＫリン酸化抗体（ＣＳＴ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＣａｓｅｐａｓｅ３抗体（Ｓａｎｔａ、日本）、ウサギ抗ヒトＣＤ６３抗体（Ａｂｃａｍ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＣＤ８１抗体（Ａｂｃａｍ、アメリカ合衆国）、ウサギ抗ヒトＣＤ９抗体（Ａｂｃａｍ、アメリカ合衆国）、マウス抗ヒトＫｉ－６７抗体（武漢三鷹、中国）、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ合衆国）、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ合衆国）、ＣＣＫ－８キット（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）、細胞周期解析キット（福麦斯生物、中国）、アポトーシス検出キット：ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＰＥ／７－ＡＡＤ二重染色（凱基生物、中国）、クリスタルバイオレット染液（Ｂｙｏｔｉｍｅ、中国）。
２、本発明の実施例で使用される主な機器
組織チップシステム（ＵＴ０６、韓国Ｕｎｉｔｍａ社）、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ）、化学発光・ゲル撮影装置（ＢｉｏＲａｄ、アメリカ合衆国）、全自動マイクロプレートリーダ（ＢｉｏＲａｄ、アメリカ合衆国）、電気泳動システム（ＢｉｏＲａｄ、アメリカ合衆国）、細胞培養インキュベーター（賽默飛、アメリカ合衆国）。
【0033】
実施例１
２０２０～２０２３年間、南通大学附属医院の臨床生物ライブラリーから７９例のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されたがん及びｐａｒａｔｕｍｏｒ組織を含む膵臓がん組織サンプルを取得した。がん患者は、放射線療法、化学療法、免疫療法を含む何の治療も受けておらず、臨床症例情報は詳細で完全である。該研究計画は、中国南通大学附属医院人類研究倫理委員会によって承認されたものである。
１、組織チップの制作
（１）ＨＥ切片の鏡下観察結果に基づいて、パラフィンブロックの代表的ながん巣領域を標識した。
（２）パラフィンと黄蝋を１：１で混合し、ＴＭＡブランク受容体パラフィンブロックを制作した。パラフィンブロックにおいて、１０×７ポイントの組織アレイを設計し、次に組織マイクロアレイヤーでパンチしてＴＭＡブランクパラフィンブロックを制作した。
（３）ドナーパラフィンブロックを標識点において最も代表的ながん巣領域を選択し、直径２ｍｍの組織ブロックを収集し、各例からそれぞれ１つのコアを採取した。
（４）採取された組織コアを、受容体パラフィンブロックの孔に移し、各組織コアの間に、一定の距離をあけて、対応するｐａｒａｔｕｍｏｒ組織を対照として採取した。
（５）組織アレイブロックを５５℃のインキュベーターに入れて１０分間加熱して融合させ、パラフィンブロックが溶融する前に、取り出して室温で冷却し、受容体パラフィンブロックとドナー組織を一体として融合させた。
（６）切片にする前、組織チップを４℃の条件下で置いて、約４時間予冷し、その後、全自動組織スライサーを使用して組織アレイブロックを修正し、速度が２０ｍｍ／回転であり、全部の組織が完全であるまで修正した。
（７）スライサーを使用して組織アレイブロックを切片にし、連続切片をそれぞれ冷水にさらして自然に展開させ、次に切片を４５℃の温水に移して、２分間程度展開させた後に、剥離防止処理を施したスライドガラスに貼り付けて乾させた。
（８）切片を６０℃の高温オーブンに置いて３分間焼き、５８℃で１８ｈ焼き続いた。
（９）完成した組織チップを切片ボックスに保存し、－２０℃で置いて保存して使用に備えた。
２、免疫組織化学染色：
（１）まず組織チップを、６０℃の恒温オーブンに置いて、パラフィンが熔融するまで約４０ｍｉｎ焼き付けた。
（２）すぐにチップをキシレンＩ、キシレンＩＩ、１００％エタノールＩ及び１００％エタノールＩＩに置き、それぞれ５分間浸漬させ、次に順次９５％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール及び７０％エタノールに入れ、それぞれ２分間浸漬させ、次に清水で洗浄した。
（３）事前に免疫組織化学用キットに抗原賦活化溶液を入れ、且つ水浴法で、９５℃まで予熱し、次にチップを容器に入れ、次に９５℃で２０分間処理して抗原賦活化を行い、室温まで自然に冷却し、５分間／１回でＰＢＳにより３回洗浄した。
（４）スーパーパップペンでチップ上の組織周りに境界線を描き、次に円の内部に３％Ｈ２Ｏ２を滴下し、１０ｍｉｎ培養させ、５分間／１回でＰＢＳにより３回洗浄した。
（５）一次抗体（ウサギ抗ヒトＴＭＥＤ８抗体）を滴加し、４℃で一晩培養させた。
（６）室温で１時間復温させ、一次抗体を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、５分間／１回で、ポリマー増強剤を滴加し、室温で２０ｍｉｎ培養させ、５分間／１回でＰＢＳにより３回洗浄した。
（７）二次抗体（酵素標識抗マウス／ウサギＩｇＧポリマー）を滴加し、室温で３０ｍｉｎ培養させ、５分間／１回でＰＢＳにより３回洗浄した。
（８）新鮮に調製されたＤＡＢ試薬を滴加し、発色した後、チップを水道水で５分間すすいで発色を終了させた。
（９）チップをヘマトキシリンで２分間染色させ、すぐに流水でゆっくり洗浄し、０．５％ＨＣｌエタノール溶液に入れ、２分間浸漬させ、最後に流水で１５分間洗浄した。
（１０）チップを順次８０％エタノール、９０％エタノール、９５％エタノール、１００％エタノールＩ、１００％エタノールＩＩ、キシレンにおいて、１分間浸漬させ、且つ通風室において自然に陰干しにした。
（１１）最後に中性樹脂で封入した。
３、結果の判断：
組織内細胞の着色程度に応じて、陽性強度を３つのレベルに分けることができ、陽性着色がない場合、０レベル（陰性）であり、淡黄色の場合、１レベル（弱陽性）であり、黄褐色の場合、２レベル（中陽性）であり、ダークブラウンの場合、３レベル（強陽性）であり、細胞陽性比率＝陽性細胞数／細胞総数であり、４つのレベルに分けることができ、０～４レベルの比率は順次、０～５％、６％～２５％、２６％～５０％、５１％～７５％及び＞７５％である。チップの結果は、３人の病理科専門家が、独立的に閲読してスコアリングした後、スコアリングの四分位数に従って「－、＋、＋＋、＋＋＋」４つの群に分けて統計及び解析を行った。
２０２０～２０２３年間、南通大学附属医院の臨床生物ライブラリーから７９例のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されたがん及びｐａｒａｔｕｍｏｒ組織を含む膵臓がん組織サンプルを取得した。がん患者は、放射線療法、化学療法、免疫療法を含む何の治療も受けておらず、臨床症例情報は詳細で完全である。該研究計画は、中国南通大学附属医院人類研究倫理委員会によって承認されたものである。
１、組織チップの制作
（１）ＨＥ切片の鏡下観察結果に基づいて、パラフィンブロックの代表的ながん巣領域を標識した。
（２）パラフィンと黄蝋を１：１で混合し、ＴＭＡブランク受容体パラフィンブロックを制作した。パラフィンブロックにおいて、１０×７ポイントの組織アレイを設計し、次に組織マイクロアレイヤーでパンチしてＴＭＡブランクパラフィンブロックを制作した。
（３）ドナーパラフィンブロックを標識点において最も代表的ながん巣領域を選択し、直径２ｍｍの組織ブロックを収集し、各例からそれぞれ１つのコアを採取した。
（４）採取された組織コアを、受容体パラフィンブロックの孔に移し、各組織コアの間に、一定の距離をあけて、対応するｐａｒａｔｕｍｏｒ組織を対照として採取した。
（５）組織アレイブロックを５５℃のインキュベーターに入れて１０分間加熱して融合させ、パラフィンブロックが溶融する前に、取り出して室温で冷却し、受容体パラフィンブロックとドナー組織を一体として融合させた。
（６）切片にする前、組織チップを４℃の条件下で置いて、約４時間予冷し、その後、全自動組織スライサーを使用して組織アレイブロックを修正し、速度が２０ｍｍ／回転であり、全部の組織が完全であるまで修正した。
（７）スライサーを使用して組織アレイブロックを切片にし、連続切片をそれぞれ冷水にさらして自然に展開させ、次に切片を４５℃の温水に移して、２分間程度展開させた後に、剥離防止処理を施したスライドガラスに貼り付けて乾させた。
（８）切片を６０℃の高温オーブンに置いて３分間焼き、５８℃で１８ｈ焼き続いた。
（９）完成した組織チップを切片ボックスに保存し、－２０℃で置いて保存して使用に備えた。
２、免疫組織化学染色：
（１）まず組織チップを、６０℃の恒温オーブンに置いて、パラフィンが熔融するまで約４０ｍｉｎ焼き付けた。
（２）すぐにチップをキシレンＩ、キシレンＩＩ、１００％エタノールＩ及び１００％エタノールＩＩに置き、それぞれ５分間浸漬させ、次に順次９５％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール及び７０％エタノールに入れ、それぞれ２分間浸漬させ、次に清水で洗浄した。
（３）事前に免疫組織化学用キットに抗原賦活化溶液を入れ、且つ水浴法で、９５℃まで予熱し、次にチップを容器に入れ、次に９５℃で２０分間処理して抗原賦活化を行い、室温まで自然に冷却し、５分間／１回でＰＢＳにより３回洗浄した。
（４）スーパーパップペンでチップ上の組織周りに境界線を描き、次に円の内部に３％Ｈ２Ｏ２を滴下し、１０ｍｉｎ培養させ、５分間／１回でＰＢＳにより３回洗浄した。
（５）一次抗体（ウサギ抗ヒトＴＭＥＤ８抗体）を滴加し、４℃で一晩培養させた。
（６）室温で１時間復温させ、一次抗体を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、５分間／１回で、ポリマー増強剤を滴加し、室温で２０ｍｉｎ培養させ、５分間／１回でＰＢＳにより３回洗浄した。
（７）二次抗体（酵素標識抗マウス／ウサギＩｇＧポリマー）を滴加し、室温で３０ｍｉｎ培養させ、５分間／１回でＰＢＳにより３回洗浄した。
（８）新鮮に調製されたＤＡＢ試薬を滴加し、発色した後、チップを水道水で５分間すすいで発色を終了させた。
（９）チップをヘマトキシリンで２分間染色させ、すぐに流水でゆっくり洗浄し、０．５％ＨＣｌエタノール溶液に入れ、２分間浸漬させ、最後に流水で１５分間洗浄した。
（１０）チップを順次８０％エタノール、９０％エタノール、９５％エタノール、１００％エタノールＩ、１００％エタノールＩＩ、キシレンにおいて、１分間浸漬させ、且つ通風室において自然に陰干しにした。
（１１）最後に中性樹脂で封入した。
３、結果の判断：
組織内細胞の着色程度に応じて、陽性強度を３つのレベルに分けることができ、陽性着色がない場合、０レベル（陰性）であり、淡黄色の場合、１レベル（弱陽性）であり、黄褐色の場合、２レベル（中陽性）であり、ダークブラウンの場合、３レベル（強陽性）であり、細胞陽性比率＝陽性細胞数／細胞総数であり、４つのレベルに分けることができ、０～４レベルの比率は順次、０～５％、６％～２５％、２６％～５０％、５１％～７５％及び＞７５％である。チップの結果は、３人の病理科専門家が、独立的に閲読してスコアリングした後、スコアリングの四分位数に従って「－、＋、＋＋、＋＋＋」４つの群に分けて統計及び解析を行った。
【0034】
７９例の膵臓がん腫瘍及びｐａｒａｔｕｍｏｒ組織切片標本を免疫組織化学染色した結果を図１に示すように、ＴＭＥＤ８タンパク質陽性は主に、がん組織の腫瘍細胞の胞質及びがん組織間質に発現され、黄褐色を呈するが、大部分のｐａｒａｔｕｍｏｒ組織は、低発現又は無発現である。統計的結果より、ＴＭＥＤ８は実際に膵臓がん組織チップで顕著に高発現＊ｐ＜０．０５になることを示している。
【0035】
８対の膵臓がん患者のがん及びｐａｒａｔｕｍｏｒ組織を選択してＷＢ検証を行い、結果を図２に示すように、上記に一致した。
【0036】
実施例２
１、細胞のトランスフェクション
（１）プラスミドの転換及び抽出：－２０℃の冷蔵庫で保存されたＴＭＥＤ８の過剰発現プラスミドｐＬＶ３－ＣＭＶ－ＴＭＥＤ８（ｈｕｍａｎ）－３×ＦＬＡＧ－ＥＦ１ａ－ＣｏｐＧＦＰ－Ｐｕｒｏのプラスミド乾燥粉末を取り出し、４０μＬのＤＥＰＣ水を添加して溶解し、同時に電熱恒温水槽を開いて４２℃まで上昇し、－８０℃の超低温冷蔵庫に貯蔵されたＤＨ５αコンピテントセルを、氷に置いて融解し、コンピテントセルが融解したらすぐに転換実験操作を行い、
ＴＭＥＤ８過剰発現プラスミド（図１０）と融解したコンピテントセルを、１：３の体積比で混合させ、管壁を軽くはじいて２～３回に軽く吹き付けて、均一に混合し、氷に静置し、２５分間計った直後に４２℃のウォーターバスに入れて、４５秒間の時間を正確に計って培養させ、すぐに氷に移動して３分間氷浴し、転換されたプラスミドを、４０μＬ無抗生物質ＬＢ液体培地含有の細胞培養チューブに添加し、恒温振動台を使用して、３７℃の条件下で、２００ｒｐｍ回転速度で１時間予振動させ、予振動が終了して５０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリン含有液体培地４ｍＬを添加し、３７℃の条件下で、２５０ｒｐｍ回転速度で一晩振動させ、雑菌が生えないように具体的な時間を１４～１６時間範囲内に制御し、Ａｘｙｇｅｎプラスミド抽出キットを用いて、標準手順に応じて菌液を抽出し、得られたプラスミド濃度を測定し、記録し、余剰の菌液とグリセリンを混合して保全することができ、－８０℃条件下で貯蔵した。
（２）安定発現細胞株の確立：適量の野生型トランスフェクト対象細胞（ＰＡＮＣ－１及びＢＸＰＣ－３膵臓がん細胞系）を、６ウェルプレート内に播種し、好ましくは６時間の接着後の密度を、６０％～７０％に制御し、血清及びジアボディを含まない１６４０基礎培地８０μＬとプラスミド３μｇを融合させ、管壁を軽くはじき、試薬を均一に混合させ、ＤＮＡの断裂を回避するために、ピペットで吹き付けず、室温で５分間静置した後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬３μＬを添加し、室温で２０～３０分間静置した後、６ウェルプレートの完全培地に添加し、ピペットで軽く吹き付けて均一に混合させ、３７℃、５％二酸化炭素条件での細胞培養器に置いて２４～４８時間培養させ、初回の２４時間に、１回観察し、その後に、１２時間ごとに細胞状態を１回観察し、トランスフェクション試薬毒性による細胞状態が悪くなる場合、すぐに培地を交換し、トランスフェクションが安定した後、蛍光顕微鏡下で、プラスミドに付属する蛍光標識を使用して、細胞トランスフェクションの効率を観察し、トランスフェクションが成功した後、対応する抵抗性を使用し、一般的にピューロマイシンを使用して、トランスフェクションが失敗した野生型細胞を選び出し、トランスフェクションが成功した細胞をスクリーニングし、安定発現細胞株を確立し、継代保存後に細胞総タンパク又は総ＲＮＡを取得してＷＢ又はｑＲＴ－ＰＣＲ実験を行い、細胞の過剰発現効率を検証し、結果を図４に示した。
２、ＣＣＫ－８細胞増殖活力の検出
中皿に予培養して検出しようとする過剰発現安定発現細胞及び野生型対照細胞株を使用して、皿内の細胞融合度が９０％になると、消化して再懸濁させ、皿内の細胞量を適切に制御する必要があり、混雑した状態で成長した細胞は、その自身のアポトーシスを引き起こし、その後の結果の正確性に影響を与える可能性がある。細胞をカウントし、細胞成長特性によれば、１ウェルあたり５，０００～１００，００個の数で９６ウェルプレートに播種し、各群は、操作方法によって引き起こされる実験誤差を減らすために、すべて５～６個の繰り返しウェルを設置し、変数制御の目的を達成するために、対照細胞の数と処理群細胞の数が等しくなければならないことに注意して、６～１２時間後、細胞が接着した後、細胞増殖活力の検出を開始し、細胞増殖活力は、細胞倍増周期に基づいて５日間連続的に検出する必要があるため、実験操作及び結果の検出は、毎日同時に実行する必要がある。
ＣＣＫ８試薬と対応する細胞の基礎培地を１：９の体積比で混合させ、新鮮な作動液を取得し、元のウェル中の培地を廃棄し、１×ＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、１ウェルあたり１０％濃度ＣＣＫ８作動液１００μＬを添加し、３７℃培養器において、１～２時間静置して反応した後、マイクロプレートリーダを使用して４６０ｎｍ部位において、それに対して吸光度を測定し、データを記録し、全ての検出が完了した後、データの処理及び比較解析を行った。
結果を図６に示すように、ＴＭＥＤ８の過剰発現は、膵臓がん細胞の増殖能力を阻害した。
３、細胞スクラッチ治癒実験
新しい無菌包装６ウェルプレートを、クリーンベンチに置いて逆さまにして置き、直定規及びマーカーを用いてプレートの底部に、３×３の格子座標線を描き、後期スクラッチ実験の顕微鏡下での撮影の位置決めを容易にした。適量の野生型及び過剰発現細胞株を６ウェルプレート内に播種し、対照群及び過剰発現群にそれぞれ３つの繰返しウェルを設置し、その成長周期に基づいて、新鮮な完全栄養培地を使用して９０％の密度に培養する時、アルコールで消毒殺菌された直定規及び１ｍＬの無菌青ピペットチップで細胞スクラッチを行い、過程中、手法の垂直と力度が均一であることに注意し、操作による結果誤差を減らし、実験変数をよりよく制御するために、各ウェル内のひっかき傷のサイズを、基本的に同じになるように制御すべきであり、実験結果の繰り返しを確保するために、各ウェル内にもそれぞれ３つのスクラッチ線を描き、スクラッチが完了した後、１×ＰＢＳ緩衝液を添加し、掻き出した浮遊細胞及び細胞破片をきれいに洗浄し、スクラッチ傷の境界で細胞が洗い流されないように力を入れて柔らかくしなければならない。低血清濃度の完全な培地に交換し、細胞成長を維持しながら後続の観察を便利にするように成長速度を制御し、実験開始の０ｈとして時点を記録し、写真を撮り、２４ｈごとに１回、細胞スクラッチの治癒を顕微鏡下で観察し、写真を撮り、７２ｈ後、実験の最終結果を統合解析した。
結果を図５に示すように、ＴＭＥＤ８の過剰発現は、膵臓がん細胞の移動能力を阻害していることが分かった。
４、細胞コロニー形成実験
ＥＤＴＡ含有トリプシンを使用して検出対象細胞を単一の状態に消化させ、細胞懸濁液を収集し、細胞をカウントし、１ウェルあたり５００個の数で、対照群及び過剰発現群の細胞をそれぞれ６ウェルプレートに播種し、各群に３個のウェルを設置し繰り返し、各ウェルにいずれも新鮮な完全培地２ｍＬを添加して培養し、細胞培養器に置いて、３７℃、５％二酸化炭素の条件下で５～７日間培養し、細胞初期数量が少ないため、コロニー形成期間に培地を交換する必要がなく、５～７日間後、培養用プレートを取り出し、顕微鏡下でコロニー形成状態を観察し、１×ＰＢＳで洗浄して廃棄した後、各ウェルに１ｍＬの４％パラホルムアルデヒド固定液を添加して２時間固定し、ＰＢＳで３回洗浄してクリスタルバイオレット染液を添加して１時間染色し、作動液を廃棄して再蒸留水で洗浄して干した後、写真を撮り、両方の群の細胞間のコロニー形成差異を観察した。
結果を図６に示すように、ＴＭＥＤ８の過剰発現は、膵臓がん細胞コロニーの形成を阻害し、即ち膵臓がん細胞の増殖能力を阻害していることが分かった。
５、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細胞移動実験
検出対象の細胞に対して消化再懸濁及びカウントを行い、傍らに置いて使用に備え、細胞培養用２４ウェルプレート及びサポートモデルの８μｍの透明なＰＥＴフィルム付きチャンバーを取り出し、チャンバーを２４ウェルプレートの培養用ウェルに置き、チャンバーの槽外には即ち、培養用ウェル内に５％濃度のウシ胎児血清含有完全栄養培地６００μＬを加え、３００００個の細胞をカウントして吸い取り、ウシ胎児血清を含まない基礎栄養培地２００μＬを用いて十分に再懸濁し、ピペットをチャンバーの内槽に移し、細胞成長周期に基づいて２４～７２時間培養し、細胞を十分に生体膜を通過させ、細胞の移動能力を観察し、チャンバーを取り出し、内槽培地を吸引して廃棄し、きれいな２４ウェルプレートのウェル内に置き、４％パラホルムアルデヒド固定液に浸漬して２時間固定した後、再蒸留水で軽くすすぎ、次にクリスタルバイオレット染色液を添加して１時間染色した後、再蒸留水で洗浄し、染色が深すぎて結果への観察に影響を与えると、メタノールで脱色洗浄を行い、フィルムのブランク部位でのクリスタルバイオレットを溶離させることができ、染色が完了した後、チャンバーを逆さまにし、室温で乾かし、通常の光学顕微鏡で観察し、適切な視野を選択して撮影した。
結果を、図５に示すように、ＴＭＥＤ８の過剰発現は、膵臓がん細胞の移動能力を阻害していることが分かった。
６、フローサイトメトリー
アポトーシスのフローサイトメトリー検出：ＰＥフルオレセイン標識ＡｎｎｅｘｉｎＶ染料及び７－ＡＡＤ染料を選択して検出対象の細胞に対して二重染色を行い、アポトーシスを検出し、まずＥＤＴＡを含まないトリプシンを使用して細胞を消化して収集し、１×ＰＢＳ細胞洗浄液で２～３回洗浄し、細胞をカウントし、好ましくは、各サンプルを一般的に１００００～５００００個の細胞に制御し、その後の蛍光消光を防ぐために固定する必要がなく、収集されたきれいな細胞を沈殿させ、緩衝液１００μＬで再懸濁し、懸濁液１００μＬごとにそれぞれＡｎｎｅｘｉｎＶ染料１μＬ及び７－ＡＡＤ染料５μＬを添加し、軽くて均一に混合した後、遮光及び室温で染色を与え、５～１０分間反応させた後、さらに緩衝液４００μＬを添加して均一に混合し、フローサイト専門試験管に移し、１時間内に検出が完了し、ＰＥでは朱色蛍光であり、その励起波長はＥｘ＝４８８ｎｍ、発光波長はＥｍ＝５７８ｎｍ、ＦＬ２チャネルを使用することを提案し、７－ＡＡＤ染料は赤色蛍光であり、その励起波長はＥｘ＝５４６ｎｍ、発光波長はＥｍ＝６４７ｎｍであり、ＦＬ３チャネルを使用して検出することを提案し、後続のデータ解析過程中に蛍光補償調整を実行する必要がある。
結果を図７に示すように、ＴＭＥＤ８の過剰発現は、膵臓がん細胞のアポトーシスを促進していることが分かった。
７、ヌードマウス皮下腫瘍形成
４週齢の雄性ＢＡＬＢ／Ｃ免疫欠陥ヌードマウスを選択して皮下腫瘍形成実験を行い、実験前に、各ヌードマウスを計量及び記録し、ＰＡＮＣ－１対照細胞及び過剰発現細胞をそれぞれトリプシンで消化した後、細胞のカウントを行い、各ヌードマウスについて各種細胞を約２×１０７個注射する必要があり、無菌の１×ＰＢＳ溶液で再懸濁し、動物実験を行う前に、細胞の損傷による死亡を防ぐために細胞懸濁液を氷に置く必要があることに注意し、同一のヌードマウスの上肢の左右腋下にそれぞれＴＭＥＤ８を過剰発現した等量のＰＡＮＣ－１細胞及びＰＡＮＣ－１対照細胞を注射し、その後、毎日にマウスの状態を観察する必要があり、４～６週間、腫瘍形成後、ヌードマウスを屠殺して解剖し、腫瘍体を取り出して計量及び体積測定を行った後、固定して後続の免疫組織化学実験に使用しており、マウスの異質性による干渉因子を制御しやすく、腫瘍の体内成長に対するＴＭＥＤ８の影響をより直感的に判断することができる。
結果を図８に示すように、ＴＭＥＤ８は、ヌードマウス皮下での膵臓がん細胞の腫瘍形成能力を阻害し、即ち動物体内での膵臓がん細胞の増殖能力を阻害していることが分かった。
８、ウエスタンブロッティング
（１）細胞及び組織総タンパク質の抽出：過程全体に、総タンパク質を取得する必要がある細胞サンプルを氷に置いて操作し、皿から培地を捨て、１×ＰＢＳ溶液で洗浄し、０．２～０．４ｍＬのＲＩＰＡ強力な細胞溶解液を添加し、約半時間溶解させた後、セルスクレイパーで溶解を補助してスクラップした後、１．５ｍＬ遠沈管に移し、４℃の環境下での電気輪転機に置いて一晩輪転し、タンパク質を十分に溶解させた後、７５００ｒｐｍ回転速度で１５分間遠心分離し、上澄み液を吸引して細胞破片沈殿を捨て、上澄み液の総体積の１／４量のサンプル緩衝液（Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、少なくとも３０分間煮沸し、タンパク質を十分に加熱して安定的に変性することを確保し、タンパク質は凍結し繰り返して分解されないように、室温まで冷却した後に－２０℃又は－８０℃の冷蔵庫に分けて包装して保存した。
（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの調製：ゲルプレートを洗浄乾燥してゲル調製用フレームに置いてクランプし、再蒸留水を添加して漏れをテストし、漏れをテストして合格してから、垂直に乾燥し、異なる濃度の分離ゲルの成分割合で調製し（表２を参照）、調製された分離ゲルを予め架設したゲルプレートに緩慢で均一に注入し、過程中に気泡の生成を回避することを注意し、イソプロパノールでゲルを押して約４０分間静置し、ゲルプレートを軽く揺れし、コロイドが凝固したことを確認した後、イソプロパノールを流し出して再蒸留水で軽く洗浄して乾燥させ、調製された上層濃縮ゲルを添加して櫛を迅速で垂直に挿入し（表３を参照）、このステップでは、特に、気泡の生成を回避する必要があり、そうしないと、ローディングウェルの変形及びサンプル漏れが現れやすい。
１、細胞のトランスフェクション
（１）プラスミドの転換及び抽出：－２０℃の冷蔵庫で保存されたＴＭＥＤ８の過剰発現プラスミドｐＬＶ３－ＣＭＶ－ＴＭＥＤ８（ｈｕｍａｎ）－３×ＦＬＡＧ－ＥＦ１ａ－ＣｏｐＧＦＰ－Ｐｕｒｏのプラスミド乾燥粉末を取り出し、４０μＬのＤＥＰＣ水を添加して溶解し、同時に電熱恒温水槽を開いて４２℃まで上昇し、－８０℃の超低温冷蔵庫に貯蔵されたＤＨ５αコンピテントセルを、氷に置いて融解し、コンピテントセルが融解したらすぐに転換実験操作を行い、
ＴＭＥＤ８過剰発現プラスミド（図１０）と融解したコンピテントセルを、１：３の体積比で混合させ、管壁を軽くはじいて２～３回に軽く吹き付けて、均一に混合し、氷に静置し、２５分間計った直後に４２℃のウォーターバスに入れて、４５秒間の時間を正確に計って培養させ、すぐに氷に移動して３分間氷浴し、転換されたプラスミドを、４０μＬ無抗生物質ＬＢ液体培地含有の細胞培養チューブに添加し、恒温振動台を使用して、３７℃の条件下で、２００ｒｐｍ回転速度で１時間予振動させ、予振動が終了して５０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリン含有液体培地４ｍＬを添加し、３７℃の条件下で、２５０ｒｐｍ回転速度で一晩振動させ、雑菌が生えないように具体的な時間を１４～１６時間範囲内に制御し、Ａｘｙｇｅｎプラスミド抽出キットを用いて、標準手順に応じて菌液を抽出し、得られたプラスミド濃度を測定し、記録し、余剰の菌液とグリセリンを混合して保全することができ、－８０℃条件下で貯蔵した。
（２）安定発現細胞株の確立：適量の野生型トランスフェクト対象細胞（ＰＡＮＣ－１及びＢＸＰＣ－３膵臓がん細胞系）を、６ウェルプレート内に播種し、好ましくは６時間の接着後の密度を、６０％～７０％に制御し、血清及びジアボディを含まない１６４０基礎培地８０μＬとプラスミド３μｇを融合させ、管壁を軽くはじき、試薬を均一に混合させ、ＤＮＡの断裂を回避するために、ピペットで吹き付けず、室温で５分間静置した後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬３μＬを添加し、室温で２０～３０分間静置した後、６ウェルプレートの完全培地に添加し、ピペットで軽く吹き付けて均一に混合させ、３７℃、５％二酸化炭素条件での細胞培養器に置いて２４～４８時間培養させ、初回の２４時間に、１回観察し、その後に、１２時間ごとに細胞状態を１回観察し、トランスフェクション試薬毒性による細胞状態が悪くなる場合、すぐに培地を交換し、トランスフェクションが安定した後、蛍光顕微鏡下で、プラスミドに付属する蛍光標識を使用して、細胞トランスフェクションの効率を観察し、トランスフェクションが成功した後、対応する抵抗性を使用し、一般的にピューロマイシンを使用して、トランスフェクションが失敗した野生型細胞を選び出し、トランスフェクションが成功した細胞をスクリーニングし、安定発現細胞株を確立し、継代保存後に細胞総タンパク又は総ＲＮＡを取得してＷＢ又はｑＲＴ－ＰＣＲ実験を行い、細胞の過剰発現効率を検証し、結果を図４に示した。
２、ＣＣＫ－８細胞増殖活力の検出
中皿に予培養して検出しようとする過剰発現安定発現細胞及び野生型対照細胞株を使用して、皿内の細胞融合度が９０％になると、消化して再懸濁させ、皿内の細胞量を適切に制御する必要があり、混雑した状態で成長した細胞は、その自身のアポトーシスを引き起こし、その後の結果の正確性に影響を与える可能性がある。細胞をカウントし、細胞成長特性によれば、１ウェルあたり５，０００～１００，００個の数で９６ウェルプレートに播種し、各群は、操作方法によって引き起こされる実験誤差を減らすために、すべて５～６個の繰り返しウェルを設置し、変数制御の目的を達成するために、対照細胞の数と処理群細胞の数が等しくなければならないことに注意して、６～１２時間後、細胞が接着した後、細胞増殖活力の検出を開始し、細胞増殖活力は、細胞倍増周期に基づいて５日間連続的に検出する必要があるため、実験操作及び結果の検出は、毎日同時に実行する必要がある。
ＣＣＫ８試薬と対応する細胞の基礎培地を１：９の体積比で混合させ、新鮮な作動液を取得し、元のウェル中の培地を廃棄し、１×ＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、１ウェルあたり１０％濃度ＣＣＫ８作動液１００μＬを添加し、３７℃培養器において、１～２時間静置して反応した後、マイクロプレートリーダを使用して４６０ｎｍ部位において、それに対して吸光度を測定し、データを記録し、全ての検出が完了した後、データの処理及び比較解析を行った。
結果を図６に示すように、ＴＭＥＤ８の過剰発現は、膵臓がん細胞の増殖能力を阻害した。
３、細胞スクラッチ治癒実験
新しい無菌包装６ウェルプレートを、クリーンベンチに置いて逆さまにして置き、直定規及びマーカーを用いてプレートの底部に、３×３の格子座標線を描き、後期スクラッチ実験の顕微鏡下での撮影の位置決めを容易にした。適量の野生型及び過剰発現細胞株を６ウェルプレート内に播種し、対照群及び過剰発現群にそれぞれ３つの繰返しウェルを設置し、その成長周期に基づいて、新鮮な完全栄養培地を使用して９０％の密度に培養する時、アルコールで消毒殺菌された直定規及び１ｍＬの無菌青ピペットチップで細胞スクラッチを行い、過程中、手法の垂直と力度が均一であることに注意し、操作による結果誤差を減らし、実験変数をよりよく制御するために、各ウェル内のひっかき傷のサイズを、基本的に同じになるように制御すべきであり、実験結果の繰り返しを確保するために、各ウェル内にもそれぞれ３つのスクラッチ線を描き、スクラッチが完了した後、１×ＰＢＳ緩衝液を添加し、掻き出した浮遊細胞及び細胞破片をきれいに洗浄し、スクラッチ傷の境界で細胞が洗い流されないように力を入れて柔らかくしなければならない。低血清濃度の完全な培地に交換し、細胞成長を維持しながら後続の観察を便利にするように成長速度を制御し、実験開始の０ｈとして時点を記録し、写真を撮り、２４ｈごとに１回、細胞スクラッチの治癒を顕微鏡下で観察し、写真を撮り、７２ｈ後、実験の最終結果を統合解析した。
結果を図５に示すように、ＴＭＥＤ８の過剰発現は、膵臓がん細胞の移動能力を阻害していることが分かった。
４、細胞コロニー形成実験
ＥＤＴＡ含有トリプシンを使用して検出対象細胞を単一の状態に消化させ、細胞懸濁液を収集し、細胞をカウントし、１ウェルあたり５００個の数で、対照群及び過剰発現群の細胞をそれぞれ６ウェルプレートに播種し、各群に３個のウェルを設置し繰り返し、各ウェルにいずれも新鮮な完全培地２ｍＬを添加して培養し、細胞培養器に置いて、３７℃、５％二酸化炭素の条件下で５～７日間培養し、細胞初期数量が少ないため、コロニー形成期間に培地を交換する必要がなく、５～７日間後、培養用プレートを取り出し、顕微鏡下でコロニー形成状態を観察し、１×ＰＢＳで洗浄して廃棄した後、各ウェルに１ｍＬの４％パラホルムアルデヒド固定液を添加して２時間固定し、ＰＢＳで３回洗浄してクリスタルバイオレット染液を添加して１時間染色し、作動液を廃棄して再蒸留水で洗浄して干した後、写真を撮り、両方の群の細胞間のコロニー形成差異を観察した。
結果を図６に示すように、ＴＭＥＤ８の過剰発現は、膵臓がん細胞コロニーの形成を阻害し、即ち膵臓がん細胞の増殖能力を阻害していることが分かった。
５、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細胞移動実験
検出対象の細胞に対して消化再懸濁及びカウントを行い、傍らに置いて使用に備え、細胞培養用２４ウェルプレート及びサポートモデルの８μｍの透明なＰＥＴフィルム付きチャンバーを取り出し、チャンバーを２４ウェルプレートの培養用ウェルに置き、チャンバーの槽外には即ち、培養用ウェル内に５％濃度のウシ胎児血清含有完全栄養培地６００μＬを加え、３００００個の細胞をカウントして吸い取り、ウシ胎児血清を含まない基礎栄養培地２００μＬを用いて十分に再懸濁し、ピペットをチャンバーの内槽に移し、細胞成長周期に基づいて２４～７２時間培養し、細胞を十分に生体膜を通過させ、細胞の移動能力を観察し、チャンバーを取り出し、内槽培地を吸引して廃棄し、きれいな２４ウェルプレートのウェル内に置き、４％パラホルムアルデヒド固定液に浸漬して２時間固定した後、再蒸留水で軽くすすぎ、次にクリスタルバイオレット染色液を添加して１時間染色した後、再蒸留水で洗浄し、染色が深すぎて結果への観察に影響を与えると、メタノールで脱色洗浄を行い、フィルムのブランク部位でのクリスタルバイオレットを溶離させることができ、染色が完了した後、チャンバーを逆さまにし、室温で乾かし、通常の光学顕微鏡で観察し、適切な視野を選択して撮影した。
結果を、図５に示すように、ＴＭＥＤ８の過剰発現は、膵臓がん細胞の移動能力を阻害していることが分かった。
６、フローサイトメトリー
アポトーシスのフローサイトメトリー検出：ＰＥフルオレセイン標識ＡｎｎｅｘｉｎＶ染料及び７－ＡＡＤ染料を選択して検出対象の細胞に対して二重染色を行い、アポトーシスを検出し、まずＥＤＴＡを含まないトリプシンを使用して細胞を消化して収集し、１×ＰＢＳ細胞洗浄液で２～３回洗浄し、細胞をカウントし、好ましくは、各サンプルを一般的に１００００～５００００個の細胞に制御し、その後の蛍光消光を防ぐために固定する必要がなく、収集されたきれいな細胞を沈殿させ、緩衝液１００μＬで再懸濁し、懸濁液１００μＬごとにそれぞれＡｎｎｅｘｉｎＶ染料１μＬ及び７－ＡＡＤ染料５μＬを添加し、軽くて均一に混合した後、遮光及び室温で染色を与え、５～１０分間反応させた後、さらに緩衝液４００μＬを添加して均一に混合し、フローサイト専門試験管に移し、１時間内に検出が完了し、ＰＥでは朱色蛍光であり、その励起波長はＥｘ＝４８８ｎｍ、発光波長はＥｍ＝５７８ｎｍ、ＦＬ２チャネルを使用することを提案し、７－ＡＡＤ染料は赤色蛍光であり、その励起波長はＥｘ＝５４６ｎｍ、発光波長はＥｍ＝６４７ｎｍであり、ＦＬ３チャネルを使用して検出することを提案し、後続のデータ解析過程中に蛍光補償調整を実行する必要がある。
結果を図７に示すように、ＴＭＥＤ８の過剰発現は、膵臓がん細胞のアポトーシスを促進していることが分かった。
７、ヌードマウス皮下腫瘍形成
４週齢の雄性ＢＡＬＢ／Ｃ免疫欠陥ヌードマウスを選択して皮下腫瘍形成実験を行い、実験前に、各ヌードマウスを計量及び記録し、ＰＡＮＣ－１対照細胞及び過剰発現細胞をそれぞれトリプシンで消化した後、細胞のカウントを行い、各ヌードマウスについて各種細胞を約２×１０７個注射する必要があり、無菌の１×ＰＢＳ溶液で再懸濁し、動物実験を行う前に、細胞の損傷による死亡を防ぐために細胞懸濁液を氷に置く必要があることに注意し、同一のヌードマウスの上肢の左右腋下にそれぞれＴＭＥＤ８を過剰発現した等量のＰＡＮＣ－１細胞及びＰＡＮＣ－１対照細胞を注射し、その後、毎日にマウスの状態を観察する必要があり、４～６週間、腫瘍形成後、ヌードマウスを屠殺して解剖し、腫瘍体を取り出して計量及び体積測定を行った後、固定して後続の免疫組織化学実験に使用しており、マウスの異質性による干渉因子を制御しやすく、腫瘍の体内成長に対するＴＭＥＤ８の影響をより直感的に判断することができる。
結果を図８に示すように、ＴＭＥＤ８は、ヌードマウス皮下での膵臓がん細胞の腫瘍形成能力を阻害し、即ち動物体内での膵臓がん細胞の増殖能力を阻害していることが分かった。
８、ウエスタンブロッティング
（１）細胞及び組織総タンパク質の抽出：過程全体に、総タンパク質を取得する必要がある細胞サンプルを氷に置いて操作し、皿から培地を捨て、１×ＰＢＳ溶液で洗浄し、０．２～０．４ｍＬのＲＩＰＡ強力な細胞溶解液を添加し、約半時間溶解させた後、セルスクレイパーで溶解を補助してスクラップした後、１．５ｍＬ遠沈管に移し、４℃の環境下での電気輪転機に置いて一晩輪転し、タンパク質を十分に溶解させた後、７５００ｒｐｍ回転速度で１５分間遠心分離し、上澄み液を吸引して細胞破片沈殿を捨て、上澄み液の総体積の１／４量のサンプル緩衝液（Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、少なくとも３０分間煮沸し、タンパク質を十分に加熱して安定的に変性することを確保し、タンパク質は凍結し繰り返して分解されないように、室温まで冷却した後に－２０℃又は－８０℃の冷蔵庫に分けて包装して保存した。
（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの調製：ゲルプレートを洗浄乾燥してゲル調製用フレームに置いてクランプし、再蒸留水を添加して漏れをテストし、漏れをテストして合格してから、垂直に乾燥し、異なる濃度の分離ゲルの成分割合で調製し（表２を参照）、調製された分離ゲルを予め架設したゲルプレートに緩慢で均一に注入し、過程中に気泡の生成を回避することを注意し、イソプロパノールでゲルを押して約４０分間静置し、ゲルプレートを軽く揺れし、コロイドが凝固したことを確認した後、イソプロパノールを流し出して再蒸留水で軽く洗浄して乾燥させ、調製された上層濃縮ゲルを添加して櫛を迅速で垂直に挿入し（表３を参照）、このステップでは、特に、気泡の生成を回避する必要があり、そうしないと、ローディングウェルの変形及びサンプル漏れが現れやすい。
【0037】
表２ １０ｍＬの異なる濃度ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離ゲルの調製ための成分（ｍＬ）
【0038】
表３ ８ｍＬの上層濃縮ゲルの調製ための配合処方
９、ＴＭＥＤ８は、ＭＡＰＫ経路を介してＰＡＡＤ腫瘍細胞の生物機能を調節することにより膵臓がんの発生・発展に影響を与える可能性がある。
ＰＡＮＣ－１対照及び過剰発現細胞系（各群にはいずれも、３つの繰り返しのサンプルがある）を選択して転写群の配列決定を行い、データ解析により、２４８個の差異遺伝子を取得し、そのうち、アップレギュレートしたのは１０３個であり、ダウンレギュレートしたのは１４５個であり、それぞれヒートマップ及びボルケーノプロットで可視化を行い、それらに対して機能注釈及びＫＥＧＧエンリッチメント解析を行い、顕著な相関性があるＭＡＰＫシグナル伝達経路を選択して次の研究を行い、重要な分子であるＥＲＫ、ＪＮＫ、Ｐ３８及びＪＮＫ、及びそれらのリン酸化の発現レベルにＷＢ検証を行った。
ＰＡＮＣ－１対照及び過剰発現細胞系（各群にはいずれも、３つの繰り返しのサンプルがある）を選択して転写群の配列決定を行い、データ解析により、２４８個の差異遺伝子を取得し、そのうち、アップレギュレートしたのは１０３個であり、ダウンレギュレートしたのは１４５個であり、それぞれヒートマップ及びボルケーノプロットで可視化を行い、それらに対して機能注釈及びＫＥＧＧエンリッチメント解析を行い、顕著な相関性があるＭＡＰＫシグナル伝達経路を選択して次の研究を行い、重要な分子であるＥＲＫ、ＪＮＫ、Ｐ３８及びＪＮＫ、及びそれらのリン酸化の発現レベルにＷＢ検証を行った。
【0039】
結果を図９に示すように、ＴＭＥＤ８は、ＭＡＰＫ経路の活性化を阻害していることが分かった。
【0040】
上記の実施例より本発明を詳細に説明しているが、それらは本発明の実施例の一部にすぎず、全ての実施例ではなく、本実施例に基づいて創造的な前提なしで本発明の保護範囲に属する他の実施例を得ることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】