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特開2025-54994微生物腐食リスクの評価方法、及び微生物腐食リスクを評価するための評価キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025054994
(43)【公開日】2025-04-08
(54)【発明の名称】微生物腐食リスクの評価方法、及び微生物腐食リスクを評価するための評価キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20250401BHJP
G01N 27/416 20060101ALI20250401BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20250401BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
G01N27/416 341Z
C12M1/34 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023164266
(22)【出願日】2023-09-27
(71)【出願人】
【識別番号】301023238
【氏名又は名称】国立研究開発法人物質・材料研究機構
(72)【発明者】
【氏名】トウ ギョウ
(72)【発明者】
【氏名】岡本 章玄
(72)【発明者】
【氏名】ファム デュエン ミン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB01
4B029FA01
4B029FA11
4B063QA01
4B063QA05
4B063QQ05
4B063QQ18
4B063QR64
4B063QR66
4B063QR74
4B063QS39
4B063QX01
4B063QX05
(57)【要約】 （修正有）
【課題】より簡便に、且つより正確に微生物腐食リスクの評価が可能な評価方法、及び評価キットを提供する。
【解決手段】環境における微生物腐食リスクの評価方法であって、前記環境からの採取物を含む評価試料を用意することと、前記評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞を検出すること、を含む評価方法である。
【選択図】図１
【解決手段】環境における微生物腐食リスクの評価方法であって、前記環境からの採取物を含む評価試料を用意することと、前記評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞を検出すること、を含む評価方法である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
環境における微生物腐食リスクの評価方法であって、
前記環境からの採取物を含む評価試料を用意することと、
前記評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞を検出すること、を含む評価方法。
前記環境からの採取物を含む評価試料を用意することと、
前記評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞を検出すること、を含む評価方法。
【請求項2】
前記外膜小胞を検出することが、前記外膜小胞の存在の存否の判定、及び／又は、前記外膜小胞の定量である、請求項１に記載の評価方法。
【請求項3】
前記外膜小胞の検出が、染色法によって行われる、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項4】
前記染色法に酸化還元系発色試薬を用いる、請求項３に記載の評価方法。
【請求項5】
前記外膜小胞の検出が、酸化還元電位測定によって行われる、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項6】
前記外膜小胞の検出が、吸光度測定によって行われる、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項7】
前記外膜小胞の酸化還元電位が、鉄材料の酸化還元電位より正である、請求項１～６のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項8】
前記外膜小胞の酸化還元電位（２５℃、ｐＨ７）が、－０．６Ｖ（ＳＨＥ）よりも正である、請求項１～７のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項9】
前記外膜小胞の標準酸化還元電位（２５℃、ｐＨ７）が、鉄材料の酸化還元電位よりも正であり、＋０．７７Ｖ（ＳＨＥ）よりも負である、請求項１～８のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項10】
環境における微生物腐食リスクを評価するための評価キットであって、
前記環境からの採取物を含む評価試料を接触させるように構成された、評価試料導入部と、
前記評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞を検出するように構成された、検出部と、
前記評価試料導入部と、前記検出部とを連結し、前記評価試料導入部から前記検出部へ前記評価試料が移動可能なように構成された、連結部と、を備える評価キット。
前記環境からの採取物を含む評価試料を接触させるように構成された、評価試料導入部と、
前記評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞を検出するように構成された、検出部と、
前記評価試料導入部と、前記検出部とを連結し、前記評価試料導入部から前記検出部へ前記評価試料が移動可能なように構成された、連結部と、を備える評価キット。
【請求項11】
前記検出部が酸化還元系発色試薬を含み、染色法により前記外膜小胞を検出するように構成されている、請求項１０に記載の評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物腐食リスクの評価方法、及び微生物腐食リスクを評価するための評価キットに関する。
【背景技術】
【0002】
硫酸還元菌は土壌、海底、海水、河川水などの環境に普遍的に生息しており、様々な有機物や水素ガスを電子供与体として酸化し、硫酸塩を腐食性硫化水素まで還元するため、それらの環境（特に嫌気環境）における鉄材料腐食の主要な原因の一つと考えられてきた。そのため、硫酸還元菌を環境中から検出することは、腐食リスクの評価法として用いられてきた。硫酸還元菌の検出法としては、例えば、環境から採取したサンプル（採取物）を、硫酸還元菌に合った有機物（電子供与体）と硫酸塩（電子受容体）を含む培地に加えて培養することが行われている。
【0003】
また、近年、鉄を電子源として利用する硫酸還元菌が単離された（非特許文献１）。これらの硫酸還元菌による鉄の腐食過程では、鉄表面に分厚い、導電性の腐食生成物が形成され、硫酸還元菌は腐食生成物上で、鉄から直接電子を摂取すること（ＥＥＵ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｕｐｔａｋｅ）によって腐食が進行する。このような細菌が引き起こす、電子の引き抜きに依存した腐食をＥＭＩＣ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ、電気的微生物腐食）と呼ぶ。発明者らは、硫酸還元菌の細胞膜を詳細に分析して電子取り込み機構を解析した結果、鉄から電子を直接引き抜くことに特定の酵素群が関わっていることを明らかにした（特許文献１、非特許文献２）。
【0004】
このような、電気的微生物腐食（ＥＭＩＣ）は、ＥＭＩＣではない腐食と比較して、腐食速度が数十倍速いことが知られており、一度発生すると毎年数十ｍｍという急激な速度で進む。このため、例えば、石油パイプライン内部、汚染水や処理水を扱う設備、処理水の貯留タンクなど、日常的に目視確認できない環境で、ＥＭＩＣが原因の、突発的かつ重大な事故が多数報告されている。先進国のエネルギー産業や海運業を中心に、年間数百億ドルと推定される甚大な経済損失が生じており、ＥＭＩＣを引き起こす硫酸還元菌の検出は特に重要である。
【0005】
一方、様々な微生物は外膜小胞（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ，ＯＭＶ）を分泌することが知られている。ＯＭＶは、約４０年前に病原性細菌で発見され、細菌の病原性や宿主との相互作用に深く関与していることが明らかとなり、医学分野では大いに注目されてきた。しかし、非病原菌におけるＯＭＶの役割に関する議論は非常に限られており、特に、ＥＭＩＣ（電気的微生物腐食）を引き起こす細菌の分泌するＯＭＶに関する検討はこれまで皆無であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第７０６６２２４号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Hang T. Dinh, et al. “Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms”, Nature volume 427, p.829-832, 2004.
【非特許文献2】Xiao Deng, et al. “Multi-heme cytochromes provide a pathway for survival in energy-limited environments” Science Advances. 4 [2] (2018).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
従来の細菌検出に基づく腐食リスクの評価方法は、例えば、以下の課題を有していた。培地の種類によって増殖する細菌が限定されてしまうため、特定の細菌しか検出できない虞があり、また、菌体が増殖するまで少なくとも１週間以上の長い時間が必要であった。また、ＥＭＩＣは金属上に形成されたバイオフィルム中で加速的に進行するが、一旦、バイオフィルムが形成されると、バイオフィルム外へ細菌が放出されることは必ずしも多くない。したがって、細菌検出では、バイオフィルムを形成する程の量の細菌が存在することを把握できず、正確な腐食リスクの評価ができなかった。
【0009】
本発明はこれらの課題を解決するものである。即ち、本発明は、より簡便に、且つより正確に微生物腐食リスクを評価できる評価方法、及び該評価方法を利用した評価キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
【0011】
［１］ 環境における微生物腐食リスクの評価方法であって、
前記環境からの採取物を含む評価試料を用意することと、
前記評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞を検出すること、を含む評価方法。
［２］ 前記外膜小胞を検出することが、前記外膜小胞の存在の存否の判定、及び／又は、前記外膜小胞の定量である、［１］に記載の評価方法。
［３］ 前記外膜小胞の検出が、染色法によって行われる、［１］又は［２］に記載の評価方法。
［４］ 前記染色法に酸化還元系発色試薬を用いる、［３］に記載の評価方法。
［５］ 前記外膜小胞の検出が、酸化還元電位測定によって行われる、［１］又は［２］に記載の評価方法。
［６］ 前記外膜小胞の検出が、吸光度測定によって行われる、［１］又は［２］に記載の評価方法。
［７］ 前記外膜小胞の酸化還元電位が、鉄材料の酸化還元電位より正である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の評価方法。
［８］ 前記外膜小胞の酸化還元電位（２５℃、ｐＨ７）が、－０．６より正である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の評価方法。
［９］ 前記外膜小胞の標準酸化還元電位（２５℃、ｐＨ７）が、鉄材料の酸化還元電位よりも正であり、＋０．７７Ｖ（ＳＨＥ）よりも負である、［１］～［８］のいずれか１つに記載の評価方法。
［１０］ 環境における微生物腐食リスクを評価するための評価キットであって、
前記環境からの採取物を含む評価試料を接触させるように構成された、評価試料導入部と、
前記評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞を検出するように構成された、検出部と、
前記評価試料導入部と、前記検出部とを連結し、前記評価試料導入部から前記検出部へ前記評価試料が移動可能なように構成された、連結部と、を備える評価キット。
［１１］ 前記検出部が酸化還元系発色試薬を含み、染色法により前記外膜小胞を検出するように構成されている、［１０］に記載の評価キット。
前記環境からの採取物を含む評価試料を用意することと、
前記評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞を検出すること、を含む評価方法。
［２］ 前記外膜小胞を検出することが、前記外膜小胞の存在の存否の判定、及び／又は、前記外膜小胞の定量である、［１］に記載の評価方法。
［３］ 前記外膜小胞の検出が、染色法によって行われる、［１］又は［２］に記載の評価方法。
［４］ 前記染色法に酸化還元系発色試薬を用いる、［３］に記載の評価方法。
［５］ 前記外膜小胞の検出が、酸化還元電位測定によって行われる、［１］又は［２］に記載の評価方法。
［６］ 前記外膜小胞の検出が、吸光度測定によって行われる、［１］又は［２］に記載の評価方法。
［７］ 前記外膜小胞の酸化還元電位が、鉄材料の酸化還元電位より正である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の評価方法。
［８］ 前記外膜小胞の酸化還元電位（２５℃、ｐＨ７）が、－０．６より正である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の評価方法。
［９］ 前記外膜小胞の標準酸化還元電位（２５℃、ｐＨ７）が、鉄材料の酸化還元電位よりも正であり、＋０．７７Ｖ（ＳＨＥ）よりも負である、［１］～［８］のいずれか１つに記載の評価方法。
［１０］ 環境における微生物腐食リスクを評価するための評価キットであって、
前記環境からの採取物を含む評価試料を接触させるように構成された、評価試料導入部と、
前記評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞を検出するように構成された、検出部と、
前記評価試料導入部と、前記検出部とを連結し、前記評価試料導入部から前記検出部へ前記評価試料が移動可能なように構成された、連結部と、を備える評価キット。
［１１］ 前記検出部が酸化還元系発色試薬を含み、染色法により前記外膜小胞を検出するように構成されている、［１０］に記載の評価キット。
【発明の効果】
【0012】
本発明は、より簡便に、且つより正確に微生物腐食リスクを評価できる評価方法、及び該評価方法を利用した評価キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】第１実施形態の微生物腐食リスクの評価方法を説明するフローチャートである。
【図2】第２実施形態の評価キットの模式図である。
【図4】実施例において細菌（ＩＳ５）培養液から分離したＯＭＶの粒度分布を示す図である。
【図5】実施例において、シトクロム反応性ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジジン）－Ｈ２Ｏ２染色したＯＭＶのＴＥＭ像である。図５（ａ）は、Ｈ２Ｏ２非存在下におけるＤＡＢ染色陰性（ネガティブ染色）の結果であり、図５（ｂ）は、Ｈ２Ｏ２存在下におけるＤＡＢ染色陽性（ポジティブ染色）の結果である。
【図6】実施例において、ＯＭＶの電気泳動後のゲルのＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）染色、及びヘム反応性ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）－Ｈ２Ｏ２染色（ヘム染色）を行った結果（ＯＭＶのタンパク質プロファイル）を示す図である。
【図8】実施例における、ＯＭＶを用いた電気化学測定の結果を示す図である。
【図9】実施例における、電気化学測定後に電極上に形成されたバイオフィルムの共焦点レーザー顕微鏡像である。
【図10】実施例において、電気化学測定後に電極上に形成されたバイオフィルムのＳＥＭ像である。
【図11】ＩＴＯ電極上に形成されたバイオフィルムの模式的モデルを示す図である。
【図12】実施例における腐食試験後の試験片の重量減少量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。尚、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【0015】
［第１実施形態］
本実施形態の微生物腐食リスクの評価方法では、ＥＭＩＣを引き起こす細菌が分泌する外膜小胞を新規な腐食バイオマーカーとして利用し、これを検出することで、微生物腐食リスクを評価する。外膜小胞（ＯＭＶ）とは、細菌細胞の細胞膜の一部が菌体外にくびり取られるようにして産生されたマイクロベシクルである。
本実施形態の微生物腐食リスクの評価方法では、ＥＭＩＣを引き起こす細菌が分泌する外膜小胞を新規な腐食バイオマーカーとして利用し、これを検出することで、微生物腐食リスクを評価する。外膜小胞（ＯＭＶ）とは、細菌細胞の細胞膜の一部が菌体外にくびり取られるようにして産生されたマイクロベシクルである。
【0016】
本願発明者は、硫酸還元菌を含む複数のＥＭＩＣ（電気的微生物腐食）を引き起こす細菌についての研究を行っており、これらの細菌が直径４０～１２０ｎｍの外膜小胞（ＯＭＶ）を分泌することを発見した。更に、分泌されたＯＭＶの表面には、電子摂取を直接媒介できる酸化還元活性なタンパク質が存在すること、即ち、ＯＭＶが酸化還元特性を有することを明らかにした。この酸化還元特性を有する外膜小胞（以下、適宜、「特定ＯＭＶ」と記載する）は、導電性バイオフィルムの形成、及び、細菌の細胞外電子摂取（ＥＥＵ）を促進し、結果として、ＥＭＩＣを加速することも見出した（後述する実施例、及び図９～図１３）。微生物は普遍的にＯＭＶを分泌すると言われているものの、ＥＭＩＣを引き起こす鉄腐食細菌におけるＯＭＶの分泌や、鉄腐食過程におけるＯＭＶの役割に関する報告は、これまで皆無であった。本発明は、本願発明者の研究におけるこれらの知見に基づいてなされたものである。即ち、本発明では、ＥＭＩＣを引き起こす細菌が分泌する、酸化還元特性を有する外膜小胞（特定ＯＭＶ）を新規な腐食バイオマーカーとして利用し、これにより腐食リスクを検出する。
【0017】
特定ＯＭＶを分泌する細菌、即ち、ＥＭＩＣを引き起こす細菌としては、例えば、Ｄ． ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓ ＩＳ５，Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ，Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ ＩＳ４等が挙げあれる。環境から特定ＯＭＶが検出されるということは、環境中にこれらの細菌が存在し、且つ、特定ＯＭＶの存在により微生物腐食がより加速され易い状態にあることを意味する。
【0018】
以下に本実施形態の評価方法の詳細について説明する。本実施形態の評価方法は、図１に示すように、
ステップＳ１：環境からの採取物を含む評価試料を用意することと、
ステップＳ２：評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞（特定ＯＭＶ）を検出すること、
を含む。
ステップＳ１：環境からの採取物を含む評価試料を用意することと、
ステップＳ２：評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞（特定ＯＭＶ）を検出すること、
を含む。
【0019】
＜ステップＳ１：評価試料の用意＞
まず、環境からの採取物を含む評価試料を用意する（図１のステップＳ１）。「環境」とは、特に限定されないが、例えば、石油パイプライン、汚染水や処理水を扱う設備（配管を含む）、処理水の貯留タンク等の内部が挙げられる。これらは、一部または全部が金属（典型的には、鉄材料を含む金属）で構成される設備であり、金属の電気的微生物腐食（ＥＭＩＣ）が大きな問題となる。「環境からの採取物」とは、これらの設備内に存在する流体（液体）、固体（汚泥）等である。これらの「採取物」は、環境において、金属と接触しているか、又は、金属と接触する可能性があるものであってよい。また、「環境からの採取物」は、例えば、海水、海底土、汚泥、地下水、河川水、土壌であってもよい。
まず、環境からの採取物を含む評価試料を用意する（図１のステップＳ１）。「環境」とは、特に限定されないが、例えば、石油パイプライン、汚染水や処理水を扱う設備（配管を含む）、処理水の貯留タンク等の内部が挙げられる。これらは、一部または全部が金属（典型的には、鉄材料を含む金属）で構成される設備であり、金属の電気的微生物腐食（ＥＭＩＣ）が大きな問題となる。「環境からの採取物」とは、これらの設備内に存在する流体（液体）、固体（汚泥）等である。これらの「採取物」は、環境において、金属と接触しているか、又は、金属と接触する可能性があるものであってよい。また、「環境からの採取物」は、例えば、海水、海底土、汚泥、地下水、河川水、土壌であってもよい。
【0020】
評価試料は、例えば、環境からの採取物そのものであってもよいが、採取物に何らかの処理を施し、採取物からＯＭＶを抽出、分離、精製等したものを評価試料とすることが好ましい。これにより、特定ＯＭＶ検出の精度を高めることができる。ＯＭＶの抽出、分離、精製等の方法は特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、環境からの採取物を溶媒（例えば、生理学的緩衝液）に溶解又は分散した後、遠心分離、濾過等を行ってもよい。また、市販のＯＭＶ単離キットを用いて処理してもよい。
【0021】
＜ステップＳ２：酸化還元特性を有する外膜小胞の検出＞
次に、評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞（特定ＯＭＶ）を検出する。ここで、「特定ＯＭＶの検出」とは、少なくとも特定ＯＭＶの存否の判定を意味し、更に、特定ＯＭＶの定量を含んでもよい。そして、特定ＯＭＶの検出結果に基づいて、環境（採取物を採取したサイト）における微生物腐食リスクを評価できる。例えば、評価試料中に特定ＯＭＶが存在していれば、特定ＯＭＶが存在していない場合と比較して、環境における微生物腐食リスクは高いと評価できる。特定ＯＭＶの定量を行った場合は、特定ＯＭＶの検出量が多いほど、環境における微生物腐食リスクはより高いと評価できる。また、特定ＯＭＶの量に基準値を設定し、検出量が基準値を越えた場合に、環境における微生物腐食リスクが高いと判断してもよい。基準値を複数設けて、微生物腐食リスクを多段階で評価してもよい。更に、定期的に環境からサンプル（採取物）を採取して、環境に存在する特定ＯＭＶの量の経時変化をモニターし、これに基づき、環境における微生物腐食リスクを評価してもよい。
次に、評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞（特定ＯＭＶ）を検出する。ここで、「特定ＯＭＶの検出」とは、少なくとも特定ＯＭＶの存否の判定を意味し、更に、特定ＯＭＶの定量を含んでもよい。そして、特定ＯＭＶの検出結果に基づいて、環境（採取物を採取したサイト）における微生物腐食リスクを評価できる。例えば、評価試料中に特定ＯＭＶが存在していれば、特定ＯＭＶが存在していない場合と比較して、環境における微生物腐食リスクは高いと評価できる。特定ＯＭＶの定量を行った場合は、特定ＯＭＶの検出量が多いほど、環境における微生物腐食リスクはより高いと評価できる。また、特定ＯＭＶの量に基準値を設定し、検出量が基準値を越えた場合に、環境における微生物腐食リスクが高いと判断してもよい。基準値を複数設けて、微生物腐食リスクを多段階で評価してもよい。更に、定期的に環境からサンプル（採取物）を採取して、環境に存在する特定ＯＭＶの量の経時変化をモニターし、これに基づき、環境における微生物腐食リスクを評価してもよい。
【0022】
尚、評価試料中（即ち、採取物を採取した環境中）には、ＥＭＩＣに関与しないＯＭＶ、即ち、酸化還元特性を有さないＯＭＶも存在する可能性がある。本実施形態の評価方法では、酸化還元特性を有するＯＭＶ（特定ＯＭＶ）のみをバイオマーカーとして検出する。
【0023】
特定ＯＭＶの検出方法は、特に限定されない。例えば、染色法を用いて特定ＯＭＶを検出してもよい。上述のように、本願発明者は、特定ＯＭＶの表面には、酸化還元活性なタンパク質（例えば、シトクロム酵素等の酸化還元酵素）が存在することを発見した。酸化還元酵素（タンパク質）は、例えば、酸化還元系発色試薬を用いた染色法（酸化還元染色法）により検出できる。染色法による検出では、特定ＯＭＶの存否の判定、更には、定量が可能となる。
【0024】
染色法としては、例えば、後述する実施例で行ったシトクロム反応性ＤＡＢ－Ｈ２Ｏ２染色が挙げられる。図５（ａ）（ｂ）に、シトクロム反応性ＤＡＢ－Ｈ２Ｏ２で染色したＯＭＶの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を示す。図５（ａ）は、Ｈ２Ｏ２非存在下におけるＤＡＢ染色陰性（ネガティブ染色）の結果であり、図５（ｂ）は、Ｈ２Ｏ２存在下におけるＤＡＢ染色陽性（ポジティブ染色）の結果である。図５（ｂ）のポジティブ染色でのみ染色されて明瞭に視認可能であることから、このＯＭＶが酸化還元特性を有する（即ち、特定ＯＭＶである）と判断できる。
【0025】
また、染色法としては、後述する実施例で行ったヘム反応性ＴＭＢＺ－Ｈ２Ｏ２染色（ヘム染色）が挙げられる。図６に、評価試料を電気泳動させた後のゲルに対して、ＣＢＢ染色、及びヘム染色を行った、ＯＭＶのタンパク質プロファイルを示す。ＣＣＢ染色と共に、ヘム染色によっても染色されバンドが視認できることから、このＯＭＶが酸化還元特性を有する（即ち、特定ＯＭＶである）と判断できる。また、電気泳動と組み合わせた染色法では、検量線法等により、バンドの濃さに基づいて特定ＯＭＶの定量も可能である。
【0026】
尚、上述のＤＡＢ染色ではＴＥＭを用いて観察し（図５（ａ）（ｂ））、ヘム染色では電気泳動後にゲル染色を行って観察している（図６）が、本実施形態はこれに限定されない。例えば、評価試料と、各染色試薬とを直接接触させて染色の有無を観察してもよい。この場合、ＴＥＭや電気泳動装置等が不要となり、よい簡便且つ短時間で特定ＯＭＶの存否の判定が可能となる。
【0027】
染色法は、上述の例に留まらず、例えば、オルト‐フェニレンジアミンを用いた染色方法（Okajimas Folia Anatomica Japonica, １９５５年２７巻５号ｐ．３３５－３４３参照）、市販のペルオキシダーゼ染色キット（例えば、ナカライテスク株式会社製）等、従来公知のものを利用できる。
【0028】
また、特定ＯＭＶの検出は、酸化還元電位測定を用いて行ってもよい。評価試料中のＯＭＶの酸化還元電位を測定し、酸化還元電位が特定の範囲内にあるとき、そのＯＭＶが酸化還元特性を有する（即ち、特定ＯＭＶである）と判断してもよい。例えば、特定ＯＭＶの酸化還元電位は、鉄材料の酸化還元電位より正であってよい。この場合、鉄材料から特定ＯＭＶに電子が移動し易くなり、鉄腐食細菌（例えば、硫酸還元菌）の鉄から電子を直接引き抜く作用（ＥＥＵ）が促進され、結果として、ＥＭＩＣが促進される。このように、特定ＯＭＶは、細菌の鉄からの電子摂取を媒介する経路となり得る。ここで、鉄材料とは、純鉄（標準酸化還元電位（２５℃、ｐＨ７）－０．４４Ｖ（ＳＨＥ））だけでなく、炭素鋼、合金鋼等の鉄を含む金属材料を意味する。鉄材料は純鉄よりも負の標準酸化還元電位を有する場合もある（例えば、－０．６Ｖ（ＳＨＥ）程度）。特定ＯＭＶの酸化還元電位（２５℃、ｐＨ７）は、例えば、－０．６Ｖ（ＳＨＥ）より正であってよく、－０．４４Ｖ（ＳＨＥ）より正であってもよい。
【0029】
また、特定ＯＭＶの酸化還元電位は、鉄腐食細菌の電子受容体の酸化還元電位より負であってよい。これにより、特定ＯＭＶから電子受容体へ電子が流れ易くなり、鉄腐食細菌から電子受容体への電子供与が促進される。例えば、鉄腐食細菌の電子供与体としては、硫酸塩（－０．２Ｖ（ＳＨＥ））、鉄イオン（Ｆｅ３＋／Ｆｅ２＋の酸化還元電位：＋０．７７Ｖ（ＳＨＥ））等が挙げられる。特定ＯＭＶの酸化還元電位（２５℃、ｐＨ７）は、例えば、＋０．７７Ｖ（ＳＨＥ）より負であってよく、－０．２Ｖ（ＳＨＥ）より負であってもよい。
【0030】
ＯＭＶの酸化還元測定方法は特に限定されない。例えば、図７（ａ）に示すように、まず、ＯＭＶが吸着可能に表面処理した電極（例えば、ＰＬＬコートＩＴＯ電極）を用意する。この電極と評価試料とを接触させて電極上にＯＭＶを吸着させることで、ＯＭＶの酸化還元電位を測定できる。図７（ｂ）に、後述する実施例で行ったＯＭＶの酸化還元測定結果を示す。測定したＯＭＶは、鉄材料の酸化還元電位より正の酸化還元電位（－０．３２Ｖ（ＳＨＥ））を有していることから、酸化還元特性を有する（即ち、特定ＯＭＶである）と判断できる。また、検量線法等により、酸化還元ピーク（－０．３２Ｖ（ＳＨＥ））強度に基づいて特定ＯＭＶの定量も可能である。
【0031】
更に、特定ＯＭＶの検出は、吸光度測定を用いて行ってもよい。上述のように、特定ＯＭＶの表面には、酸化還元活性なタンパク質が存在する。このタンパク質の吸光特性を把握している場合には、吸光度測定により特定ＯＭＶを検出できる。例えば、本願発明者は、硫酸還元菌であるＤ． ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓ ＩＳ５から分泌されるＯＭＶが、細菌（ＩＳ５）の表面タンパク質と同じ特定のシトクロム酵素を有することを発見した。この特定のシトクロム酵素は、４１９ｎｍ、及び５１２ｎｍに吸収ピークを有することが分かっている（特許文献１、非特許文献２）。この吸収ピークに着目し、評価試料中のＯＭＶが同様の吸収ピークを有するとき、そのＯＭＶがＩＳ５から分泌されたＯＭＶである（即ち、特定ＯＭＶである）と判断できる。また、検量線法等により、吸収ピーク強度に基づいて特定ＯＭＶの定量も可能である。
【0032】
特定ＯＭＶの検出方法として説明した上述の方法、即ち、染色法、酸化還元電位測定、及び吸光度測定は、いずれか1つの方法により特定ＯＭＶを検出してもよいし、いくつかの方法を組み合わせて実施して、検出精度を高めてもよい。尚、吸光度測定と比較して、染色法、及び酸化還元電位測定は特定ＯＭＶ検出の感度が高く、より腐食リスクの低い状態（特定ＯＭＶの少ない状態）の評価にも適している。また、特定ＯＭＶの検出方法は、染色法、酸化還元電位測定、及び吸光度測定に限定されず、例えば、酸化還元特異的染色（例えばＤＡＢ－Ｈ２Ｏ２染色）前後でＯＭＶの直径変化の測定、ＡＦＭ等によるＯＭＶ表面導電性の直接測定、インピーダンス測定等を用いて検出してもよい。
【0033】
以上説明した本実施形態の微生物腐食リスクの評価方法は、以下の利点を有する。本実施形態の微生物腐食リスクの評価方法は、特定ＯＭＶを新規な腐食バイオマーカーとして利用する。このため、細菌培養は不要であり、従来の方法（細菌検出に基づく腐食リスクの評価方法）と比較して、簡便且つ短時間で腐食リスクを評価できる。また、ＯＭＶはナノ粒子であるため、バイオフィルムを形成する菌体と比べてバイオフィルム外へ放出され易い。このため、細菌を検出する従来の方法よりも、特定ＯＭＶを検出する本実施形態の方法の方が、より正確に微生物腐食リスクを評価できる。更に、厳格嫌気環境や適切な温度を要する鉄腐食細菌と比較して、特定ＯＭＶはロバストネスが遥かに高く、環境からの検出がより容易である。この点からも、従来法（細菌検出）よりも、本実施形態の方法（特定ＯＭＶの検出）の方が、より簡便で、より正確に微生物腐食リスクを評価できる。
【0034】
［第２実施形態］
本実施形態（第２実施形態）では、第１実施形態の微生物腐食リスクの評価方法を利用した、環境における微生物腐食リスクを評価するための評価キットについて説明する。図２に示すように、本実施形態の評価キット１００は、環境からの採取物を含む評価試料（図２中のＳａｍｐｌｅ）を接触させるように構成された、評価試料導入部１０と、評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞（特定ＯＭＶ）を検出するように構成された、検出部２０と、評価試料導入部１０と、検出部２０とを連結し、評価試料導入部１０から検出部２０へ評価試料が移動可能なように構成された、連結部３０とを備える。評価キット１００は、更に基材４０を備え、評価試料導入部１０、検出部２０、及び連結部３０は、基材４０上に設けられていてもよい。
本実施形態（第２実施形態）では、第１実施形態の微生物腐食リスクの評価方法を利用した、環境における微生物腐食リスクを評価するための評価キットについて説明する。図２に示すように、本実施形態の評価キット１００は、環境からの採取物を含む評価試料（図２中のＳａｍｐｌｅ）を接触させるように構成された、評価試料導入部１０と、評価試料中の酸化還元特性を有する外膜小胞（特定ＯＭＶ）を検出するように構成された、検出部２０と、評価試料導入部１０と、検出部２０とを連結し、評価試料導入部１０から検出部２０へ評価試料が移動可能なように構成された、連結部３０とを備える。評価キット１００は、更に基材４０を備え、評価試料導入部１０、検出部２０、及び連結部３０は、基材４０上に設けられていてもよい。
【0035】
評価試料導入部１０、検出部２０、及び連結部３０を構成する材質は特に限定されないが、例えば、評価試料を吸収可能な繊維、紙、スポンジ等の液体吸収材であってよい。評価試料導入部１０で吸収された評価試料が、検出部２０までスムーズに移動可能なように、評価試料導入部１０、検出部２０、及び連結部３０は、連続した一体の液体吸収材で構成されてもよい。また、評価試料導入部１０は、基材４０に形成された凹部であって、そこに液体吸収材は存在しなくともよい。この場合、凹部である評価試料導入部１０に評価試料が保持され、そこから、液体吸収材である連結部３０に評価試料が吸収される。
【0036】
検出部２０における、特定ＯＭＶの検出方法は特に限定されないが、例えば、染色法が挙げられる。この場合、検出部２０は、特定ＯＭＶを検出（染色）可能な染色試薬（例えば、酸化還元系発色試薬）を含む。染色法、及びそれに用いる染色試薬については、第１実施形態で説明したものと同様のものが挙げられ、好適態様も同様である。
【0037】
次に、評価キット１００の使用方法について説明する。評価キット１００は、環境からの採取物を含む評価試料を評価試料導入部１０に接触させるだけという、非常に簡便な方法により、微生物腐食リスクを評価できる。評価試料は、環境からの採取物そのものであってもよいが、特定ＯＭＶ検出の精度を高めるため、第１実施形態と同様の方法で評価試料を調製してもよい。評価試料導入部１０に接触させた評価試料は、毛細管現象により連結部３０内を移動して検出部２０に至る。評価試料中に特定ＯＭＶが存在する場合、検出部２０において、染色試薬により染色されて染色部２１が形成される。染色部２１の有無を目視で判断することで、特定ＯＭＶの存否を判定でき、また、検量線法等により、染色部２１の濃さに基づいて特定ＯＭＶの定量も可能である。これらの特定ＯＭＶの検出結果から、第１実施形態と同様に環境における微生物腐食リスクを評価できる。
【0038】
本実施形態の評価キット１００を使用すれば、上述のように非常に簡便な方法により、微生物腐食リスクを評価できる。また、特定ＯＭＶはナノ粒子であるため、評価試料導入部１０から検出部２０までの容易に移動でき、正確な微生物腐食リスク評価が可能である。
【実施例0039】
以下に実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。
【0040】
［硫酸還元菌の培養］
Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓ ＩＳ５（ＤＳＭ番号：１５５７９）を、８０ｍＬのＤＳＭＺ培地１９５ｃを含むブチルゴム栓付きガラスバイアル中で、ヘッドスペースをＣＯ２／Ｎ２（体積比２０／８０）で無酸素状態とし、２８℃で前培養を５日間行った。５日後の培養物は、細胞光学密度ＯＤ６００ｎｍ＝０.３であった。尚、菌体を大量培養する際は、５日間培養した菌液を更にＤＳＭＺ培地１９５ｃに１０％接種して５日間培養した。
Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓ ＩＳ５（ＤＳＭ番号：１５５７９）を、８０ｍＬのＤＳＭＺ培地１９５ｃを含むブチルゴム栓付きガラスバイアル中で、ヘッドスペースをＣＯ２／Ｎ２（体積比２０／８０）で無酸素状態とし、２８℃で前培養を５日間行った。５日後の培養物は、細胞光学密度ＯＤ６００ｎｍ＝０.３であった。尚、菌体を大量培養する際は、５日間培養した菌液を更にＤＳＭＺ培地１９５ｃに１０％接種して５日間培養した。
【0041】
［評価試料の調製］
上述の培養物（培養液）（３０００ｍＬ）から細菌を除去してＯＭＶを精製するため、遠心分離（７，０００Ｇ×１５分間）した後、上澄み液をフィルターで濾過し（孔径：０．２２μｍ）、濾過液を更に限外ろ過（１００ｋＤａ）することでＯＭＶ濃縮を行った。この濃縮液（１０ｍＬ）にＮａ＋－ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）を１００ｍＬ添加し、限外ろ過により１０ｍＬに濃縮する、という操作を３回行い、ＯＭＶをＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＬ）に分散させた。この分散液を実験に用いた。
上述の培養物（培養液）（３０００ｍＬ）から細菌を除去してＯＭＶを精製するため、遠心分離（７，０００Ｇ×１５分間）した後、上澄み液をフィルターで濾過し（孔径：０．２２μｍ）、濾過液を更に限外ろ過（１００ｋＤａ）することでＯＭＶ濃縮を行った。この濃縮液（１０ｍＬ）にＮａ＋－ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）を１００ｍＬ添加し、限外ろ過により１０ｍＬに濃縮する、という操作を３回行い、ＯＭＶをＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＬ）に分散させた。この分散液を実験に用いた。
【0042】
［外膜小胞（ＯＭＶ）の特性評価］
（１）ＴＥＭ観察
細菌（ＩＳ５）培養液から分離したＯＭＶの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察を行った。ＴＥＭグリッドはＥＭステイナー（日新ＥＭ株式会社製）で染色した。図３（ａ）（ｂ）に倍率の異なるＴＥＭ像を示す（図３（ｂ）の方が高倍率）。図３（ｂ）に示すように、一部のＯＭＶでは、外膜（ＯＭ）と内膜（ＩＭ）の層が観察された。
（１）ＴＥＭ観察
細菌（ＩＳ５）培養液から分離したＯＭＶの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察を行った。ＴＥＭグリッドはＥＭステイナー（日新ＥＭ株式会社製）で染色した。図３（ａ）（ｂ）に倍率の異なるＴＥＭ像を示す（図３（ｂ）の方が高倍率）。図３（ｂ）に示すように、一部のＯＭＶでは、外膜（ＯＭ）と内膜（ＩＭ）の層が観察された。
【0043】
（２）粒度分布測定
フローナノアナライザー装置を用いて、精製したＯＭＶ（評価試料中のＯＭＶ）の粒度分布を測定した。結果を図４に示す。平均粒子径は、６２．８ｎｍであった。
フローナノアナライザー装置を用いて、精製したＯＭＶ（評価試料中のＯＭＶ）の粒度分布を測定した。結果を図４に示す。平均粒子径は、６２．８ｎｍであった。
【0044】
（３）酸化還元染色１
精製したＯＭＶ（評価試料中のＯＭＶ）をシトクロム反応性ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジジン）－Ｈ２Ｏ２染色し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図５（ａ）（ｂ）に示す。図５（ａ）は、Ｈ２Ｏ２非存在下におけるＤＡＢ染色陰性（ネガティブ染色）の結果であり、図５（ｂ）は、Ｈ２Ｏ２存在下におけるＤＡＢ染色陽性（ポジティブ染色）の結果である。図５（ｂ）のポジティブ染色でのみ染色され、特に、ＯＭＶの表面が強く染色されていた。これから、ＯＭＶ表面にはシトクロム酵素（酸化還元酵素）が存在しており、このＯＭＶが酸化還元特性を有する（即ち、特定ＯＭＶである）ことが確認できた。
精製したＯＭＶ（評価試料中のＯＭＶ）をシトクロム反応性ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジジン）－Ｈ２Ｏ２染色し、ＴＥＭ観察を行った。結果を図５（ａ）（ｂ）に示す。図５（ａ）は、Ｈ２Ｏ２非存在下におけるＤＡＢ染色陰性（ネガティブ染色）の結果であり、図５（ｂ）は、Ｈ２Ｏ２存在下におけるＤＡＢ染色陽性（ポジティブ染色）の結果である。図５（ｂ）のポジティブ染色でのみ染色され、特に、ＯＭＶの表面が強く染色されていた。これから、ＯＭＶ表面にはシトクロム酵素（酸化還元酵素）が存在しており、このＯＭＶが酸化還元特性を有する（即ち、特定ＯＭＶである）ことが確認できた。
【0045】
（４）酸化還元染色２
評価試料を電気泳動させた後のゲルに対して、ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）染色、及びヘム反応性ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）－Ｈ２Ｏ２染色（ヘム染色）を行った。結果（ＯＭＶのタンパク質プロファイル）を図６に示す。図６に示すように、ＣＣＢ染色と共に、ヘム染色によっても染色されバンドが視認できた。これから、このＯＭＶが酸化還元特性を有する（即ち、特定ＯＭＶである）ことが確認できた。
評価試料を電気泳動させた後のゲルに対して、ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）染色、及びヘム反応性ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）－Ｈ２Ｏ２染色（ヘム染色）を行った。結果（ＯＭＶのタンパク質プロファイル）を図６に示す。図６に示すように、ＣＣＢ染色と共に、ヘム染色によっても染色されバンドが視認できた。これから、このＯＭＶが酸化還元特性を有する（即ち、特定ＯＭＶである）ことが確認できた。
【0046】
（５）酸化還元電位測定
まず、図７（ａ）に示すように、ＯＭＶが吸着可能なように、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）で表面処理した（コートした）酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）電極を用意した。このＩＴＯ電極上に、ＯＭＶサンプル液を添加して１５分静置して、電極上にＯＭＶを吸着させ、微分パルスボルタンメトリー法（ＤＰＶ）により電気化学測定を行い、ＯＭＶの酸化還元電位を求めた。結果を「ＯＭＶ」と表示して図７（ｂ）に示す。比較のため、ＯＭＶを含有しないこと以外は評価試料と同組成の溶液に対して、同様の電気化学測定を行った。結果を併せて、「Ｓｔｅｒｉｌｅ」と表示して図７（ｂ）に示す。
まず、図７（ａ）に示すように、ＯＭＶが吸着可能なように、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）で表面処理した（コートした）酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）電極を用意した。このＩＴＯ電極上に、ＯＭＶサンプル液を添加して１５分静置して、電極上にＯＭＶを吸着させ、微分パルスボルタンメトリー法（ＤＰＶ）により電気化学測定を行い、ＯＭＶの酸化還元電位を求めた。結果を「ＯＭＶ」と表示して図７（ｂ）に示す。比較のため、ＯＭＶを含有しないこと以外は評価試料と同組成の溶液に対して、同様の電気化学測定を行った。結果を併せて、「Ｓｔｅｒｉｌｅ」と表示して図７（ｂ）に示す。
【0047】
図７（ｂ）に示すように、ＯＭＶは－０．３２Ｖ（ＳＨＥ）の酸化還元電位を有していた。この値は、鉄の酸化還元電位（－０．４４Ｖ（ＳＨＥ））より正であり、硫酸塩の酸化還元電位（－０．２Ｖ（ＳＨＥ））より負である。この結果から、このＯＭＶは、硫酸還元菌（ＩＳ５）のＥＭＩＣを促進すると推測される。
【0048】
［ＯＭＶの電気化学測定］
－０．４Ｖ（ＳＨＥ）の電位に保たれたＩＴＯ電極を備えた３電極嫌気性反応器を用いて、以下の３種類の試料（溶液）１～３において生成するカソード電流を測定した。結果を図８に示す。本試験においては、ＩＴＯ電極が細菌（ＩＳ５）にとって唯一の電子供与体である。
試料１（ＯＭＶのみ）：ＯＭＶ溶液（上述の評価試料）（２．６×１０９粒子／ｍＬ）０．５ｍＬを反応容器内の電解液４．５ｍＬに添加して試料１を調製した。試料１中のＯＭＶ密度は２．６×１０８粒子／ｍＬである。
試料２（ＩＳ５のみ）：まず、５日間液体培養した培養液から細菌（ＩＳ５）を遠心分離し、分離した細菌を０．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）に再分散した。再分散液を反応容器内の電解液４．５ｍＬに添加して（最終ＯＤ６００ｎｍ＝１）試料２を調製した。
試料３（ＩＳ５＋ＯＭＶ）：５日間液体培養した培養液から細菌（ＩＳ５）を遠心分離し、分離した細菌を０．５ｍＬのＯＭＶ溶液（上述の評価試料）に再分散した。再分散液を反応容器内の電解液４．５ｍＬに添加して試料３を調製した。試料３中のＯＭＶ密度は２．６×１０８粒子／ｍＬである。
尚、試料１～３で用いた電解液は、非特許文献２に開示されている電解液と同組成のものを自家調製した。
－０．４Ｖ（ＳＨＥ）の電位に保たれたＩＴＯ電極を備えた３電極嫌気性反応器を用いて、以下の３種類の試料（溶液）１～３において生成するカソード電流を測定した。結果を図８に示す。本試験においては、ＩＴＯ電極が細菌（ＩＳ５）にとって唯一の電子供与体である。
試料１（ＯＭＶのみ）：ＯＭＶ溶液（上述の評価試料）（２．６×１０９粒子／ｍＬ）０．５ｍＬを反応容器内の電解液４．５ｍＬに添加して試料１を調製した。試料１中のＯＭＶ密度は２．６×１０８粒子／ｍＬである。
試料２（ＩＳ５のみ）：まず、５日間液体培養した培養液から細菌（ＩＳ５）を遠心分離し、分離した細菌を０．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）に再分散した。再分散液を反応容器内の電解液４．５ｍＬに添加して（最終ＯＤ６００ｎｍ＝１）試料２を調製した。
試料３（ＩＳ５＋ＯＭＶ）：５日間液体培養した培養液から細菌（ＩＳ５）を遠心分離し、分離した細菌を０．５ｍＬのＯＭＶ溶液（上述の評価試料）に再分散した。再分散液を反応容器内の電解液４．５ｍＬに添加して試料３を調製した。試料３中のＯＭＶ密度は２．６×１０８粒子／ｍＬである。
尚、試料１～３で用いた電解液は、非特許文献２に開示されている電解液と同組成のものを自家調製した。
【0049】
図８に示すように、細菌を含む試料２（ＩＳ５のみ）及び試料３（ＩＳ５＋ＯＭＶ）では電流の発生が確認でき、特に、試料３（ＩＳ５＋ＯＭＶ）は、試料２（ＩＳ５のみ）と比較して電流値が大きく増加した。試料３（ＩＳ５＋ＯＭＶ）では、ＯＭＶが低濃度（１０８個／ｍＬ、ｐＭオーダー)であるにも関わらず、電流値の増加が見られたことから、ＯＭＶは電子メディエーターとして拡散による電子伝達を媒介するのではなく、ＯＭＶが細菌（ＩＳ５）のＩＴＯ電極からの電子の引き抜き（ＥＥＵ）を促進していると推測される。また、試料１（ＯＭＶのみ）ではわずかな電流発生しか確認できず、ＯＭＶ自体は電子の引き抜き（ＥＥＵ）を行わないことが確認できた。
【0050】
［バイオフィルムの共焦点走査蛍光顕微鏡観察、及びＳＥＭ観察］
上述の電気化学測定（図８参照）において、試料２（ＩＳ５のみ）に用いたＩＴＯ電極（Ｗｉｔｈｏｕｔ ＯＭＶ）、試料３（ＩＳ５＋ＯＭＶ）に用いたＩＴＯ電極（Ｗｉｔｈ ＯＭＶ）の共焦点走査蛍光顕微鏡観察、及びＳＥＭ観察を行った。共焦点レーザー顕微鏡像を図９に、ＳＥＭ像を図１０に示す。尚、共焦点走査蛍光顕微鏡観察においては、細胞をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ蛍光染料で染色した。
上述の電気化学測定（図８参照）において、試料２（ＩＳ５のみ）に用いたＩＴＯ電極（Ｗｉｔｈｏｕｔ ＯＭＶ）、試料３（ＩＳ５＋ＯＭＶ）に用いたＩＴＯ電極（Ｗｉｔｈ ＯＭＶ）の共焦点走査蛍光顕微鏡観察、及びＳＥＭ観察を行った。共焦点レーザー顕微鏡像を図９に、ＳＥＭ像を図１０に示す。尚、共焦点走査蛍光顕微鏡観察においては、細胞をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ蛍光染料で染色した。
【0051】
図９及び図１０に示すように、試料２（Ｗｉｔｈｏｕｔ ＯＭＶ）と比較して、試料３（Ｗｉｔｈ ＯＭＶ）では、より厚いバイオフィルムが形成され、多くの細菌が確認された。また、図１０に示すように、試料３（Ｗｉｔｈ ＯＭＶ）では、細菌間、及び細菌と電極表面との間に、ナノワイヤの形成が確認された。本願発明者は、非特許文献２において、このナノワイヤも、細菌（ＩＳ５）の細胞膜と同じ特定のシトクロム酵素を有し、細菌（ＩＳ５）のＥＥＵを促進することを報告している。このナノワイヤの存在により、試料３（Ｗｉｔｈ ＯＭＶ）に形成されたバイオフィルムは、膜厚が厚いにも関わらず、高い導電性を有していたと推測される。以上の結果から、ＯＭＶの存在によって、細菌（ＩＳ５）はより厚く、且つより導電性が高いバイオフィルムを形成し、この結果、細菌（ＩＳ５）のＩＴＯ電極からの電子の引き抜き（ＥＥＵ）が加速した（図８参照）したことが確認できた。図１１に、試料２（Ｗｉｔｈｏｕｔ ＯＭＶ）、及び試料３（Ｗｉｔｈ ＯＭＶ）においてＩＴＯ電極上に形成されたバイオフィルムの模式的モデルを示す。
【0052】
［ＯＭＶの微生物腐食に与える影響の評価］
上述の電気化学測定（図８参照）において調製した３種類の試料（ＯＭＶのみ、ＩＳ５のみ、ＩＳ５＋ＯＭＶ）を用いて、金属（炭素鋼）の腐食試験を行った。上記試料を分散させる培地として、９ｍＬの改変したＤＳＭＺ１９５ｃ培地を腐食媒体として使用した。改変したＤＳＭＺ１９５ｃ培地とは、ＤＳＭＺ１９５ｃ培地から乳酸を除去し、炭素源として１ｍＭ酢酸ナトリウムを添加した培地である。試料１（ＯＭＶのみ）、試料２（ＩＳ５のみ）、及び試料３（ＩＳ５＋ＯＭＶ）のそれぞれに、試験片（ＳＰＣＣ炭素鋼クーポン（１０ｍｍ×１０ｍｍ×２ｍｍ））を細菌（ＩＳ５）の唯一の電子供与体として添加した。試料１及び試料３では、ＯＭＶ密度を２．６×１０８粒子／ｍＬとした。試料２及び試料３では、チューブ内のＩＳ５の開始細胞濃度をＯＤ６００ｎｍ＝０．０５とした。試料１～３を、２週間、２８℃において嫌気性環境下で培養した。その後、腐食した鉄板の様子をＳＥＭで観察した。結果を図１３（ａ）に示す。観察後、試験片を３．５ｇ／Ｌのヘキサメチレンテトラミンを含む６Ｍ塩酸に５分浸漬し、試験片表面の腐食生成物とバイオフィルムを剥離させた。剥離後の試験片表面のＳＥＭ観察を行った。結果を図１３（ｂ）に示す。
上述の電気化学測定（図８参照）において調製した３種類の試料（ＯＭＶのみ、ＩＳ５のみ、ＩＳ５＋ＯＭＶ）を用いて、金属（炭素鋼）の腐食試験を行った。上記試料を分散させる培地として、９ｍＬの改変したＤＳＭＺ１９５ｃ培地を腐食媒体として使用した。改変したＤＳＭＺ１９５ｃ培地とは、ＤＳＭＺ１９５ｃ培地から乳酸を除去し、炭素源として１ｍＭ酢酸ナトリウムを添加した培地である。試料１（ＯＭＶのみ）、試料２（ＩＳ５のみ）、及び試料３（ＩＳ５＋ＯＭＶ）のそれぞれに、試験片（ＳＰＣＣ炭素鋼クーポン（１０ｍｍ×１０ｍｍ×２ｍｍ））を細菌（ＩＳ５）の唯一の電子供与体として添加した。試料１及び試料３では、ＯＭＶ密度を２．６×１０８粒子／ｍＬとした。試料２及び試料３では、チューブ内のＩＳ５の開始細胞濃度をＯＤ６００ｎｍ＝０．０５とした。試料１～３を、２週間、２８℃において嫌気性環境下で培養した。その後、腐食した鉄板の様子をＳＥＭで観察した。結果を図１３（ａ）に示す。観察後、試験片を３．５ｇ／Ｌのヘキサメチレンテトラミンを含む６Ｍ塩酸に５分浸漬し、試験片表面の腐食生成物とバイオフィルムを剥離させた。剥離後の試験片表面のＳＥＭ観察を行った。結果を図１３（ｂ）に示す。
【0053】
また、培養前の試験片の重量、及び、培養後に腐食生成物及びバイオフィルムを剥離した試験片の重量を測定して、これらの重量差から腐食試験による試験片の重量減少量を求めた。結果を図１２に示す。
また、比較のため、試料１～３に代えて、改変したＤＳＭＺ１９５ｃ培地（無菌）を用いて同様の腐食実験を行った。図１２及び図１３（ａ）（ｂ）に、「Ｓｔｅｒｉｌｅ」と表示して結果を示す。
また、比較のため、試料１～３に代えて、改変したＤＳＭＺ１９５ｃ培地（無菌）を用いて同様の腐食実験を行った。図１２及び図１３（ａ）（ｂ）に、「Ｓｔｅｒｉｌｅ」と表示して結果を示す。
【0054】
【産業上の利用可能性】
【0055】
本発明の微生物腐食リスクの評価方法は、より簡便に、且つより正確に微生物腐食リスクを評価できる。これにより、例えば、石油パイプライン内部等に存在する嫌気鉄腐食を早期に検出することができ、微生物腐食による事故を事前に抑制することができる。
【符号の説明】
【0056】
１００ 評価キット
１０ 評価試料導入部
２０ 検出部
２１ 染色部
３０ 連結部
４０ 基材
１０ 評価試料導入部
２０ 検出部
２１ 染色部
３０ 連結部
４０ 基材
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
