特開 2025-67221 毛乳頭細胞活性化用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025067221

(43)【公開日】2025-04-24

(54)【発明の名称】毛乳頭細胞活性化用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/095 20190101AFI20250417BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20250417BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250417BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20250417BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20250417BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20250417BHJP

   A61Q 7/00 20060101ALI20250417BHJP

   A61K 8/49 20060101ALI20250417BHJP

   C07K 7/06 20060101ALN20250417BHJP

   A61K 31/5517 20060101ALN20250417BHJP

【ＦＩ】

A61K38/095

C12N5/071 ZNA

A61P43/00 107

A61P17/14

A61K45/00

A61K8/64

A61Q7/00

A61K8/49

C07K7/06

A61K31/5517

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023177009

(22)【出願日】2023-10-12

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和５年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「再生・細胞医療・遺伝子治療実現加速化プログラム」「毛髪再生医療のためのヒト毛包オルガノイドの開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504182255

【氏名又は名称】国立大学法人横浜国立大学

(71)【出願人】

【識別番号】317006683

【氏名又は名称】地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000154

【氏名又は名称】弁理士法人はるか国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】福田 淳二

(72)【発明者】

【氏名】景山 達斗

【テーマコード（参考）】

4B065

4C083

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BB19

4B065CA44

4C083AC851

4C083AC852

4C083AD411

4C083AD412

4C083CC37

4C083EE22

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA17

4C084BA44

4C084CA18

4C084DB28

4C084MA63

4C084NA14

4C084ZA921

4C084ZA922

4C084ZB221

4C084ZB222

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB11

4C086MA63

4C086NA14

4C086ZA92

4C086ZB22

4H045BA15

4H045EA20

(57)【要約】

【課題】毛乳頭細胞を効果的に活性化する毛乳頭細胞活性化用組成物を提供する。
【解決手段】毛乳頭細胞活性化用組成物は、オキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストを含有する。毛乳頭細胞活性化用組成物は、皮膚外用剤であってもよいし、頭皮外用剤であってもよいし、育毛又は発毛用組成物であってもよいし、培養培地であってもよいし、培養培地用添加剤であってもよい。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストを含有する、毛乳頭細胞活性化用組成物。

【請求項2】

オキシトシンを含有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

オキシトシン受容体アゴニストを含有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

皮膚外用剤である、請求項１乃至３のいずれかに記載の組成物。

【請求項5】

頭皮外用剤である、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

育毛又は発毛用組成物である、請求項１乃至３のいずれかに記載の組成物。

【請求項7】

培養培地である、請求項１乃至３のいずれかに記載の組成物。

【請求項8】

培養培地用添加剤である、請求項１乃至３のいずれかに記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、毛乳頭細胞活性化用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

非特許文献１には、生体の毛包に含まれる毛乳頭細胞が、毛周期の制御に重要な役割を果たしていることが記載されている。

【0003】

一方、特許文献１～３及び非特許文献１には、上皮系細胞と間葉系細胞（例えば、毛乳頭細胞）との共培養により、毛髪再生能を有する細胞凝集塊を製造する技術が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２０１７／０７３６２５号

【特許文献2】国際公開第２０２０／２２５９３４号

【特許文献3】国際公開第２０２３／０５８４２９号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Jiyu Hyun et al., "Morus alba Root Extract Induces the Anagen Phase in the Human Hair Follicle Dermal Papilla Cells", Pharmaceutics, 2021, 13, 1155

【非特許文献2】Tatsuto Kageyama et al., In vitro hair follicle growth model for drug testing, Scientific Reports (2023) 13: 4847

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら従来、毛乳頭細胞を活性化することは容易ではなかった。また、毛乳頭細胞の活性化を介して、生体における育毛又は発毛を促進することも容易ではなかった。

【0007】

本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、毛乳頭細胞を効果的に活性化する毛乳頭細胞活性化用組成物を提供することをその目的の一つとする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

［１］上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る毛乳頭細胞活性化用組成物は、オキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストを含有する。本発明によれば、毛乳頭細胞を効果的に活性化する毛乳頭細胞活性化用組成物が提供される。

【0009】

［２］前記［１］の組成物は、オキシトシンを含有することとしてもよい。[３]前記［１］又は［２］の組成物は、オキシトシン受容体アゴニストを含有することとしてもよい。

【0010】

［４］前記［１］乃至［３］のいずれかの組成物は、皮膚外用剤であることとしてもよい。［５］前記［１］乃至［４］のいずれかの組成物は、頭皮外用剤であることとしてもよい。［６］前記［１］乃至［５］のいずれかの組成物は、育毛又は発毛用組成物であることとしてもよい。

【0011】

［７］前記［１］乃至［３］のいずれかの組成物は、培養培地であることとしてもよい。［８］前記［１］乃至［３］のいずれかの組成物は、培養培地用添加剤であることとしてもよい。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、毛乳頭細胞を効果的に活性化する毛乳頭細胞活性化用組成物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】実施例１で培養された毛乳頭細胞における発毛関連遺伝子の発現量を評価した結果を示す説明図である。

【図2】参考例の共培養１で形成された細胞凝集塊の顕微鏡写真を示す説明図である。

【図3】参考例の共培養１で細胞凝集塊に形成された毛幹様構造の長さを評価した結果を示す説明図である。

【図4】参考例の共培養２で細胞凝集塊に形成された毛幹様構造の長さを評価した結果を示す説明図である。

【図5】実施例２で細胞凝集塊に形成された毛幹様構造の長さを評価した結果を示す説明図である。

【図6】実施例２で細胞凝集塊における成長因子遺伝子の発現量を評価した結果を示す説明図である。

【図7】実施例３で培養された毛乳頭細胞における発毛関連遺伝子及び成長因子遺伝子の発現量を評価した結果を示す説明図である。

【図8】実施例４で細胞凝集塊に形成された毛幹様構造の長さを評価した結果を示す説明図である。

【図9】実施例５で培養された毛乳頭細胞における発毛関連遺伝子の発現量を評価した結果を示す説明図である。

【図10】実施例６で細胞凝集塊に形成された毛幹様構造の長さを評価した結果を示す説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。

【0015】

本実施形態に係る毛乳頭細胞活性化用組成物（以下、「本組成物」という。）は、オキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストを含有する。すなわち、本組成物は、オキシトシンを含有する組成物であってもよいし、オキシトシン受容体アゴニストを含有する組成物であってもよいし、オキシトシン及びオキシトシン受容体アゴニストを含有する組成物であってもよい。

【0016】

本組成物は、毛乳頭細胞を活性化する。このため、本組成物は、毛乳頭細胞を活性化するために用いられる。この点、本発明の発明者らは、毛乳頭細胞を活性化するための技術的手段について鋭意検討を重ねた結果、意外にも、オキシトシン及びオキシトシン受容体アゴニストがそれぞれ毛乳頭細胞を活性化することを独自に見出し、本発明を完成するに至った。

【0017】

本組成物に含有されるオキシトシンは、９個のアミノ酸から構成される化合物であり、化学式Ｃ_４３Ｈ_６６Ｎ_１２Ｏ_１２Ｓ_２で表され、分子量は１００７．１９であり、ＣＡＳ（Chemical Abstracts Service）登録番号は５０－５６－６である。本組成物に含有されるオキシトシンは、本発明の効果が損なわれない範囲であれば、安定化等を目的とする化学的修飾が施されていてもよい。オキシトシンは、毛乳頭細胞が発現するオキシトシン受容体を介して、当該毛乳頭細胞を活性化すると考えられる。

【0018】

本組成物に含有されるオキシトシン受容体アゴニストは、オキシトシン受容体に作用するアゴニストである。本組成物に含有されるオキシトシン受容体アゴニストは、毛乳頭細胞が発現するオキシトシン受容体を介して、当該毛乳頭細胞を活性化すると考えられる。

【0019】

本組成物に含有されるオキシトシン受容体アゴニストは、毛乳頭細胞を活性化するものであれば特に限られないが、例えば、ＬＩＴ－００１（ＣＡＳ登録番号：２２４５０７２－２１－１）、ＷＡＹ２６７４６４（ＣＡＳ登録番号：１４３２０４３－３１－６）、ＴＣ ＯＴ ３９（ＣＡＳ登録番号：４７９２３２－５７－０）、及びカルベトシン（Ｃａｒｂｅｔｏｃｉｎ、ＣＡＳ登録番号：３７０２５－５５－１）からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。

【0020】

本組成物は、毛乳頭細胞を活性化する有効成分としてオキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストを含有する。本組成物による毛乳頭細胞の活性化は、例えば、当該毛乳頭細胞における発毛関連遺伝子及び／又は成長因子遺伝子の発現量の増加として確認される。

【0021】

発毛関連遺伝子は、生体における発毛に関連する遺伝子であれば特に限られないが、例えば、本組成物は、毛乳頭細胞におけるアルカリフォスファターゼ遺伝子、バーシカン遺伝子、ＬＥＦ１遺伝子、ＷＮＴ５Ａ遺伝子、ＢＭＰ４遺伝子、ＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子及びＷＩＦ１遺伝子からなる群より選択される１以上の発現量を増加させることとしてもよい。毛乳頭細胞における発毛関連遺伝子の発現量は、当該毛乳頭細胞のＲＮＡを抽出し、逆転写を行った後、ＲＴ－ＰＣＲを実施することにより定量される。

【0022】

具体的に、本組成物は、毛乳頭細胞における発毛関連遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ遺伝子、バーシカン遺伝子、ＬＥＦ１遺伝子、ＷＮＴ５Ａ遺伝子、ＢＭＰ４遺伝子、ＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子及びＷＩＦ１遺伝子からなる群より選択される１以上）の発現量を、オキシトシン及びオキシトシン受容体アゴニストを含有しない以外は同一組成の組成物を用いた場合における発現量の１．１倍以上、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．３倍以上、さらに好ましくは１．４倍以上、特に好ましくは１．５倍以上、増加させることとしてもよい。

【0023】

本組成物は、例えば、生体の毛乳頭細胞を活性化するために用いられる。すなわち、本組成物は、皮膚外用剤であることとしてもよい。皮膚外用剤としての本組成物は、生体の皮膚に含まれる毛乳頭細胞（例えば、当該皮膚の毛包に含まれる毛乳頭細胞）を活性化するために用いられる。

【0024】

本組成物の皮膚への適用方法は、本組成物に含有されるオキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストが、当該皮膚に含まれる毛乳頭細胞に到達する方法であれば特に限られないが、例えば、当該皮膚への塗布、噴霧又は注入が好ましく用いられる。

【0025】

本組成物が適用される生体は、毛乳頭細胞を含む皮膚を有する動物であれば特に限られず、ヒトであってもよいし、ヒト以外の動物（非ヒト動物）であってもよい。非ヒト動物は、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物は、例えば、霊長類（例えば、サル）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット又はウサギ）、食肉類（例えば、イヌ、ネコ）、又は有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ又はヒツジ）であってもよい。

【0026】

本組成物が適用される生体の皮膚は、毛乳頭細胞を含む皮膚（例えば、毛包を含む皮膚）であれば特に限られないが、例えば、頭皮であることとしてもよい。すなわち、本組成物は、頭皮外用剤であることとしてもよい。

【0027】

頭皮外用剤としての本組成物は、生体（好ましくはヒト）の頭皮に含まれる毛乳頭細胞（例えば、当該頭皮の毛包に含まれる毛乳頭細胞）を活性化するために用いられる。頭皮外用剤としての本組成物は、本組成物に含有されるオキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストが、頭皮に含まれる毛乳頭細胞に到達するよう用いられるものであれば特に限られず、例えば、育毛用組成物、発毛用組成物、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアトリートメント、又はヘアトニックであることとしてもよい。

【0028】

本組成物は、育毛又は発毛用組成物であることが好ましい。育毛又は発毛用組成物としての本組成物は、生体の皮膚（例えば、頭皮）に含まれる毛乳頭細胞（例えば、当該皮膚の毛包に含まれる毛乳頭細胞）を活性化し、当該皮膚における育毛又は発毛を促進するために用いられる。

【0029】

具体的に、育毛用組成物としての本組成物は、毛が生えている皮膚（例えば、毛髪が生えている頭皮）における、当該毛の毛包に含まれる毛乳頭細胞の活性化による育毛（例えば、毛の成長促進、脱毛の抑制、又は、毛径の低減抑制、維持並びに増加）のために用いられる。

【0030】

また、発毛用組成物としての本組成物は、毛乳頭細胞を含むが毛が生えていない皮膚（例えば、毛乳頭細胞又は毛包を含むが毛髪が生えていない頭皮）における、当該皮膚に含まれる毛乳頭細胞（例えば、当該皮膚の毛包に含まれる毛乳頭細胞）の活性化による発毛（新たな毛の形成及び成長促進）のために用いられる。

【0031】

本組成物の用途は、本発明の効果が得られれば特に限られず、例えば、医学用途であってもよいし、研究用途であってもよい。すなわち、本組成物は、例えば、発毛又は脱毛に関連する疾患の治療又は予防のために用いられることとしてもよい。この場合、本組成物は、例えば、発毛又は脱毛に関連する疾患を有する生体に適用される。発毛又は脱毛に関連する疾患を有する生体は、例えば、当該疾患を有するヒト又は非ヒト動物であってもよいし、当該疾患を患う可能性のあるヒト又は非ヒト動物であってもよい。また、本組成物は、例えば、発毛又は脱毛に関連する疾患に関連する研究のために用いられることとしてもよい。

【0032】

発毛又は脱毛に関連する疾患は、特に限られないが、例えば、男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＡＧＡ）、女子男性型脱毛症（Ｆｅｍａｌｅ Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＦＡＧＡ）、分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、及び症候性脱毛症からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。

【0033】

また、本組成物は、例えば、生体外の毛乳頭細胞を活性化するために用いられる。すなわち、本組成物は、例えば、培養毛乳頭細胞を活性化するために用いられることとしてもよい。

【0034】

具体的に、本組成物は、培養培地であることとしてもよい。培養培地としての本組成物は、培養された毛乳頭細胞の生存に必要な成分（例えば、適切な浸透圧及びｐＨを維持するためのミネラル及び緩衝剤）を含有する。培養培地としての本組成物は、培養毛乳頭細胞の代謝に必要な成分（例えば、糖類及び／又はアミノ酸）をさらに含有してもよいし、当該培養毛乳頭細胞の増殖に必要な成分（例えば、成長因子（例えば、ｂＦＧＦ）及び／又はホルモン（例えば、インスリン））をさらに含有してもよい。

【0035】

また、本組成物は、培養培地用添加剤であることとしてもよい。培養培地添加剤としての本組成物は、培養毛乳頭細胞を活性化するための培養培地の調製に用いられる。すなわち、培養培地添加剤としての本組成物は、毛乳頭細胞を培養するための生理食塩水（緩衝剤を含有するものを含む）、又は、基礎培地（例えば、ＤＭＥＭやＦ１２培地等の毛乳頭細胞の培養に用いられる培地）に添加して用いられる。

【0036】

本組成物の形態は、本発明の効果が得られれば特に限られず、用途に応じて適切な形態が適宜採用される。すなわち、本組成物は、例えば、流動性を有する組成物（例えば、液体又はペースト状の組成物）であってもよいし、流動性を有しない組成物（例えば、固体又はゲル状の組成物）であってもよい。具体的に、本組成物は、例えば、液体、ローション剤、懸濁剤、乳剤、注射剤、貼付剤、軟膏剤、パップ剤、リニメント剤、噴霧剤、凍結乾燥品、又は粉末であることとしてもよい。

【0037】

本組成物におけるオキシトシン及びオキシトシン受容体アゴニストの含有量は、本発明の効果が得られる範囲内であれば特に限られず、用途や形態に応じて適宜決定される。すなわち、例えば、本組成物が流動性を有する育毛又は発毛用組成物である場合、オキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストの含有量が異なる複数種類の当該組成物を用いて、毛乳頭細胞を活性化する効果及び／又は育毛又は発毛効果を評価することにより、所望の効果が得られるオキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストの含有量を決定することができる。

【0038】

また、例えば、本組成物が流動性を有する培養培地である場合、オキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストの含有量が異なる複数種類の当該培養培地を用いて、毛乳頭細胞を培養し、当該培養毛乳頭細胞を活性化する効果を評価することにより、所望の効果が得られるオキシトシン及び／又はオキシトシン受容体アゴニストの含有量を決定することができる。

【0039】

上述のとおり、本組成物におけるオキシトシンの含有量は、本発明の効果が得られる範囲内であれば特に限られず、用途や形態に応じて適宜決定されればよいが、本組成物（例えば、流動性を有する本組成物）におけるオキシトシンの含有量は、例えば、０．０１μＭ以上であることとしてもよく、０．０５μＭ以上であることが好ましく、０．１μＭ以上であることがより好ましく、０．５μＭ以上であることがさらに好ましく、１μＭ以上であることがさらに好ましく、３μＭ以上であることがさらに好ましく、５μＭ以上であることがさらに好ましく、７μＭ以上であることがさらに好ましく、１０μＭ以上であることが特に好ましい。

【0040】

本組成物におけるオキシトシンの含有量の上限値は特に限られないが、例えば、１０００μＭ以下であってもよいし、５００μＭ以下であってもよいし、２００μＭ以下であってもよい。本組成物におけるオキシトシンの含有量は、上述した下限値のいずれか１つと、上述した上限値のいずれか１つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0041】

また、上述のとおり、本組成物におけるオキシトシン受容体アゴニストの含有量は、本発明の効果が得られる範囲内であれば特に限られず、用途や形態に応じて適宜決定されればよいが、本組成物（例えば、流動性を有する本組成物）におけるオキシトシン受容体アゴニストの含有量は、例えば、０．０１μＭ以上であることとしてもよく、０．０５μＭ以上であることが好ましく、０．１μＭ以上であることがより好ましく、０．５μＭ以上であることがさらに好ましく、１μＭ以上であることがさらに好ましく、５μＭ以上であることがさらに好ましく、１０μＭ以上であることがさらに好ましく、１５μＭ以上であることがさらに好ましく、２０μＭ以上であることが特に好ましい。

【0042】

本組成物におけるオキシトシン受容体アゴニストの含有量の上限値は特に限られないが、例えば、１０００μＭ以下であってもよいし、５００μＭ以下であってもよいし、２００μＭ以下であってもよい。本組成物におけるオキシトシン受容体アゴニストの含有量は、上述した下限値のいずれか１つと、上述した上限値のいずれか１つとを任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0043】

また、本組成物がオキシトシン及びオキシトシン受容体アゴニストを含有する場合、本組成物（例えば、流動性を有する本組成物）におけるオキシトシン含有量とオキシトシン受容体アゴニスト含有量との組み合わせは、上述のようにして特定されるオキシトシン含有量と、上述のようにして特定されるオキシトシン受容体アゴニスト含有量と、を任意に組み合わせて特定されてもよい。

【0044】

本組成物は、用途や形態に応じて、オキシトシン及びオキシトシン受容体アゴニスト以外の成分を含む。すなわち、本組成物は、例えば、医薬品、医薬部外品、又は頭皮又は毛髪用化粧品において許容される成分を含む。具体的に、本組成物は、例えば、賦形剤、安定剤、分散剤、希釈剤、界面活性剤、乳化剤、ｐＨ調整剤、保存剤、着色剤、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、防腐剤、清涼剤、及び香料からなる群より選択される１以上を含有することとしてもよい。

【0045】

次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。

【実施例0046】

［細胞培養］
毛乳頭細胞の二次元培養系を用いて、オキシトシンが当該毛乳頭細胞の発毛関連遺伝子発現に与える影響を評価した。すなわち、まず市販のヒト毛乳頭細胞（PromoCell社、継代数４）を、市販の毛乳頭細胞増殖培地（ロート製薬株式会社）にオキシトシン（製品コード：4084-v、CAS Registry Number：50-56-6、株式会社ペプチド研究所）を０．１μＭ、１μＭ又は１０μＭの濃度で添加して調製された培地（以下、実施例１において「オキシトシン添加培地」という。）、又は、オキシトシンが添加されていない（オキシトシン濃度が０μＭ）当該毛乳頭細胞増殖培地（以下、実施例１において「無添加培地」という。）に懸濁し、当該毛乳頭細胞が分散された細胞懸濁液を調製した。

【0047】

次いで、培養開始時の細胞密度が２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなる量の細胞懸濁液を、２４ウェルプレートの平底ウェルに播種した。そして、ウェルの底面に接着した毛乳頭細胞の二次元培養を６日間行った。培地交換は３日に１回行った。

【0048】

［発毛関連遺伝子の発現量］
培養６日目の毛乳頭細胞のＲＮＡを抽出し、逆転写を行った後、ＲＴ－ＰＣＲを実施し、発毛関連遺伝子である、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）遺伝子、バーシカン（ＶＣＡＮ）遺伝子、ＬＥＦ１遺伝子、ＷＮＴ５Ａ遺伝子、ＢＭＰ４遺伝子、及びＮＯＧ遺伝子の発現量を定量した。

【0049】

なお、ＲＴ－ＰＣＲには、次の塩基配列を有するプライマーを用いた。ＡＬＰのフォワードプライマー：5'-ATTGACCACGGGCACCAT-3'。ＡＬＰのリバースプライマー：5'-CTCCACCGCCTCATGCA-3’。ＶＣＡＮのフォワードプライマー：5'-GGCACAAATTCCAAGGGCAG-3'。ＶＣＡＮのリバースプライマー：5'-TCATGGCCCACACGATTAACA-3’。ＬＥＦ１のフォワードプライマー：5'-CTTCCTTGGTGAACGAGTCTG-3’。ＬＥＦ１のリバースプライマー：5'-TCTGGATGCTTTCCGTCAT-3’。ＷＮＴ５Ａのフォワードプライマー：5'-TCCACCTTCCTCTTCACACTGA-3’。ＷＮＴ５Ａのリバースプライマー：5'-CGTGGCCAGCATCACATC-3’。ＢＭＰ４のフォワードプライマー：5'-GCCCGCAGCCTAGCAA-3’。ＢＭＰ４のリバースプライマー：5'-CGGTAAAGATCCCGCATGTAG-3’。ＮＯＧのフォワードプライマー：5'-CTGGTGGACCTCATCGAACA-3’。ＮＯＧのリバースプライマー：5'-CGTCTCGTTCAGATCCTTTTCCT-3’。コントロールとして用いたＧＡＰＤＨのフォワードプライマー：5'-TGGAAGGACTCATGACCACAG-3’。ＧＡＰＤＨのリバースプライマー：5'-GGATGATGTTCTGGAGAGCCC-3’。

【0050】

［結果］
図１には、毛乳頭細胞のＶＣＡＮ遺伝子、ＡＬＰ遺伝子、ＮＯＧ遺伝子、ＬＥＦ１遺伝子、ＷＮＴ５Ａ遺伝子、及びＢＭＰ４遺伝子の発現量を定量した結果を示す。なお、図１において、横軸には、培地に添加したオキシトシン（ＯＸＴ）の濃度（μＭ）を示し、縦軸には、無添加培地（オキシトシン濃度が０（ゼロ）μＭ）中で培養された毛乳頭細胞の遺伝子発現量を「１」とした場合の、オキシトシン添加培地中で培養された毛乳頭細胞の相対的な遺伝子発現量（算術平均値、ｎ＝３）を示す。

【0051】

図１に示すように、オキシトシン添加培地中で培養された毛乳頭細胞における発毛関連遺伝子の発現量は、無添加培地中で培養された毛乳頭細胞におけるそれより増加した。また、培地に添加されたオキシトシンの濃度が増加するにつれて、毛乳頭細胞における発毛関連遺伝子の発現量も増加する傾向が確認された。特に、ＶＣＡＮ遺伝子、ＡＬＰ遺伝子及びＮＯＧ遺伝子、中でもＮＯＧ遺伝子の発現量は、オキシトシンによって顕著に増加した。このように、オキシトシンによって毛乳頭細胞が活性化され、当該毛乳頭細胞における発毛関連遺伝子の発現量が効果的に増加することが確認された。

【0052】

なお、培養された毛乳頭細胞の数（増殖）についても定量した結果（図示せず）、培地へのオキシトシン添加の有無は、細胞数の経時的変化に対して顕著な変化は与えなかった。すなわち、オキシトシンは、毛乳頭細胞の増殖を抑制することなく、当該毛乳頭細胞を活性化していることが確認された。また、免疫蛍光染色の結果（図示せず）、培養された毛乳頭細胞はオキシトシン受容体を発現していることが確認された。すなわち、オキシトシンは、毛乳頭細胞が発現するオキシトシン受容体を介して、当該毛乳頭細胞を活性化していると考えられた。

【参考例】

【0053】

本発明の発明者らは、これまで、培地中に分散された上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養することにより、当該上皮系細胞及び間葉系細胞を含む細胞凝集塊が形成されること、及び、当該細胞凝集塊を生体に移植することにより、当該生体の移植部位において新たに毛髪を再生できることを実証してきた（特許文献１：国際公開第２０１７／０７３６２５号）。

【0054】

また、本発明の発明者らは、特定の細胞外マトリックスを低濃度で添加した培地中で上皮系細胞及び間葉系細胞を共培養することにより、in vitroで発毛する細胞凝集塊を形成する培養法を開発し（特許文献２：国際公開第２０２０／２２５９３４号、特許文献３：国際公開第２０２３／０５８４２９号）、さらに、この培養法を利用して、発毛促進物質を評価するためのin vitroモデルを確立した（非特許文献２：Tatsuto Kageyama et al., In vitro hair follicle growth model for drug testing, Scientific Reports (2023) 13: 4847）。本参考例では、このin vitroモデルの確立について説明する。

【0055】

［細胞の準備］
上皮系細胞として、市販のヒト胎児表皮角化細胞（ScienCell Research Laboratories社）（以下、本参考例において「Ｆ上皮細胞」という。）、及び、市販のヒト成人毛包角化細胞(ScienCell Research Laboratories社)（以下、本参考例において「Ａ上皮細胞」という。）を用いた（いずれの上皮系細胞も継代数は２又は３）。

【0056】

また間葉系細胞として、市販のヒト胎児真皮線維芽細胞(ScienCell Research Laboratories社)（以下、本参考例において「Ｆ間葉細胞」という。）、及び、上述の実施例１でも使用した市販のヒト成人毛乳頭細胞(PromoCell社)（以下、本参考例において「Ａ間葉細胞」という。）を用いた（いずれの間葉系細胞も継代数は２又は３）。

【0057】

［共培養１］
まず上皮系細胞（Ｆ上皮細胞又はＡ上皮細胞）、及び、間葉系細胞（Ｆ間葉細胞又はＡ間葉細胞）を、市販のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium／Ham's F-12、GIBCO（登録商標））に細胞外マトリックスとして、マトリゲル（Matrigel（登録商標）、Basement Membrane Matrix、CORNING（登録商標））、又は、タイプＩコラーゲン(Cellmatrix type I-A、新田ゼラチン株式会社)を２ｖ／ｖ％の濃度で添加して調製された培地（以下、参考例において「マトリックス添加培地」という。）に懸濁して混合し、当該上皮系細胞及び間葉系細胞がそれぞれ５×１０^３ｃｅｌｌｓ／２００μＬの密度で分散された細胞懸濁液を調製した。

【0058】

次いで、得られた細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各非細胞接着性丸底ウェルに２００μＬずつ加えることにより、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。さらに播種後、速やかに９６ウェルプレートに対して２分間の遠心処理（１００×ｇ）を施し、当該遠心処理後、速やかに当該９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して、少なくとも３０分静置した。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータ内に移して、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。培地交換は、２日に１回、ウェル内の培地２００μＬのうち１００μＬを除去し、代わりにマトリックスが添加されていないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（以下、参考例において「無添加培地」という。）１００μＬを添加することにより行った。

【0059】

なお、上述の共培養は、上皮系細胞と、間葉系細胞と、培地に添加する細胞外マトリックスとの組み合わせによって異なる次の１２条件で行った：（１）ＦＦ－Ｍ（Ｆ上皮細胞＋Ｆ間葉細胞＋マトリゲル）；（２）ＦＡ－Ｍ（Ｆ上皮細胞＋Ａ間葉細胞＋マトリゲル）；（３）ＡＦ－Ｍ（Ａ上皮細胞＋Ｆ間葉細胞＋マトリゲル）；（４）ＡＡ－Ｍ（Ａ上皮細胞＋Ａ間葉細胞＋マトリゲル）；（５）ＦＦ－Ｃ（Ｆ上皮細胞＋Ｆ間葉細胞＋コラーゲン）；（６）ＦＡ－Ｃ（Ｆ上皮細胞＋Ａ間葉細胞＋コラーゲン）；（７）ＡＦ－Ｃ（Ａ上皮細胞＋Ｆ間葉細胞＋コラーゲン）；（８）ＡＡ－Ｃ（Ａ上皮細胞＋Ａ間葉細胞＋コラーゲン）；（９）ＦＦ－Ｎｏ（Ｆ上皮細胞＋Ｆ間葉細胞＋マトリックスなし）；（１０）ＦＡ－Ｎｏ（Ｆ上皮細胞＋Ａ間葉細胞＋マトリックスなし）；（１１）ＡＦ－Ｎｏ（Ａ上皮細胞＋Ｆ間葉細胞＋マトリックスなし）；（１２）ＡＡ－Ｎｏ（Ａ上皮細胞＋Ａ間葉細胞＋マトリックスなし）。

【0060】

［結果１］
図２には、上述した１２条件のうち、ＡＡ－Ｍ、ＦＦ－Ｍ、ＦＦ－Ｃ、ＦＡ－Ｍ、ＡＦ－Ｍ、及びＡＦ－Ｃについて、培養１０日目のウェル内の細胞を撮影した位相差顕微鏡写真を示す。また、図３には、マトリックス添加培地を用いた８条件（ＦＦ－Ｍ、ＦＡ－Ｍ、ＡＦ－Ｍ、ＡＡ－Ｍ、ＦＦ－Ｃ、ＦＡ－Ｃ、ＡＦ－Ｃ及びＡＡ－Ｃ）について、細胞凝集塊に形成された毛幹様構造の長さを蛍光顕微鏡（BZ-X810、株式会社キーエンス）を用いて測定した結果を示す。

【0061】

なお、図３において、横軸には、毛幹様構造の長さを測定した培養日（培養４日目（Ｄ４）、６日目（Ｄ６）、８日目（Ｄ８）及び１０日目（Ｄ１０））を示し、縦軸には測定された毛幹様構造の長さ（ｍｍ）を示す。ここで、細胞凝集塊に形成された毛幹様構造の長さとしては、当該毛幹様構造の根元部分（細胞凝集塊との接続部分）から当該毛幹様構造の先端部分（自由端）までの直線距離を測定した。

【0062】

図２及び図３に示すように、ＡＡ－Ｍ、ＦＦ－Ｍ、ＦＦ－Ｃ、ＡＦ－Ｍ及びＡＦ－Ｃの５条件においては、播種後の培養時間の経過とともに細胞が自発的に凝集して各ウェルに１つずつ形成された細胞凝集塊において、培養４日目までに毛幹様構造が形成され、その後、培養１０日目まで当該毛幹様構造の長さが増加した。

【0063】

特に、ＡＡ－Ｍ条件においては、細胞凝集塊に形成された毛幹様構造の長さが、培養１０日目の時点において、マトリックス添加培地を用いた他の７条件で培養された細胞凝集塊のそれに比べて統計的に有意に大きかった（算術平均値、ｎ＝２４）。

【0064】

したがって、上皮系細胞としてヒト成人毛包角化細胞を用い、間葉系細胞としてヒト成人毛乳頭細胞を用い、細胞外マトリックスとしてマトリゲルを用いるＡＡ－Ｍ条件での共培養系が、細胞凝集塊からの毛幹様構造の成長を指標とする、生体における毛包からの発毛を模したin vitroモデルとして最も好ましいと考えられた。

【0065】

［共培養２］
次に、生体における発毛促進効果が実証されている発毛促進物質であるミノキシジル（ＣＡＳ登録番号：３８３０４－９１－５）を用いて、上述のＡＡ－Ｍ共培養系がin vitroモデルとして有用であることを確認した。すなわち、まず上述した「共培養１」のＡＡ－Ｍ条件と同様にして、マトリックス添加培地中に懸濁したヒト成人毛包角化細胞及びヒト成人毛乳頭細胞を非細胞接着性丸底ウェル内に播種して共培養を開始した。培地交換は、２日に１回、ウェル内の培地２００μＬのうち１００μＬを除去し、代わりに無添加培地１００μＬを添加することにより行った。

【0066】

その後、培養４日目に、一部のウェル内の培地を、無添加培地にミノキシジルを１０μＭの濃度で添加して調製された培地（以下、参考例において「ＭＮＸ添加培地」という。）に交換し、その後１０日目まで、当該ＭＮＸ添加培地中で６日間の共培養を行った。一方、比較のため、他の一部のウェルについては、培養４日目に、ウェル内の培地を無添加培地に交換し、１０日目まで共培養を行った。培地交換は２日に１回行った。

【0067】

［結果２］
図４には、培養４日目以降に無添加培地中で培養された細胞凝集塊（図中の「０μＭ ＭＮＸ」）、及び、培養４日目以降にＭＮＸ添加培地中で培養された細胞凝集塊（図中の「１０μＭ ＭＮＸ」）のそれぞれについて、培養４日目(横軸の「Ｄ４」）の時点における毛幹様構造の長さを「１」とした場合の、培養６日目、８日目、及び１０日目（それぞれ横軸の「Ｄ６」、「Ｄ８」及び「Ｄ１０」）の時点における毛幹様構造の相対的長さを蛍光顕微鏡（BZ-X810、株式会社キーエンス）を用いて評価した結果を示す（算術平均値、ｎ＝２４）。

【0068】

図４に示すように、培養４日目以降にＭＮＸ添加培地中で培養された細胞凝集塊においては、無添加培地中で培養された細胞凝集塊に比べて、毛幹様構造の長さが、より早く増加した。

【0069】

そして、培養８日目、及び１０日目の時点において、ＭＮＸ添加培地中で培養された細胞凝集塊における毛幹様構造の相対的長さは、無添加培地中で培養された細胞凝集塊のそれに比べて、統計的に有意に大きかった。

【0070】

このように、上述のＡＡ－Ｍ共培養系は、ミノキシジルに対して、生体の毛包と同様の発毛促進効果を示した。すなわち、上述のＡＡ－Ｍ共培養系は、細胞凝集塊における毛幹様構造の長さを指標として用いることで、候補物質が発毛促進効果を有するかどうかを生体外で評価するためのin vitroモデルとして有用であることが確認された。

【実施例0071】

［in vitroモデル］
上述の「参考例」で確立したin vitroモデル（ＡＡ－Ｍ共培養系）を用いて、オキシトシンが細胞凝集塊における毛幹様構造の成長に与える影響を評価した。すなわち、まず上述の「参考例」と同様にして、ヒト成人毛包角化細胞及びヒト成人毛乳頭細胞を、市販のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium／Ham's F-12、GIBCO（登録商標））（以下、実施例２において「無添加培地」という。）に、オキシトシンを添加することなく、マトリゲル（Matrigel（登録商標）、Basement Membrane Matrix、CORNING（登録商標））を２ｖ／ｖ％の濃度で添加して調製された培地に懸濁して混合し、当該毛包角化細胞及び毛乳頭細胞がそれぞれ１×１０^４ｃｅｌｌｓ／２００μＬの密度で分散された細胞懸濁液を調製した。

【0072】

次いで、得られた細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各非細胞接着性丸底ウェルに２００μＬずつ加えることにより、上皮系細胞及び間葉系細胞を播種した。さらに、播種後、速やかに９６ウェルプレートに対して２分間の遠心処理（１００×ｇ）を施し、当該遠心処理後、速やかに当該９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫内に移して、少なくとも３０分静置した。その後、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータ内に移して、上皮系細胞及び間葉系細胞の共培養を開始した。培地交換は、２日に１回、ウェル内の培地２００μＬのうち１００μＬを除去し、代わりに無添加培地１００μＬを添加することにより行った。

【0073】

培養４日目に、一部のウェル内の培地を、無添加培地にオキシトシンを１０μＭの濃度で添加して調製された培地（以下、実施例２において「ＯＸＴ添加培地」という。）に交換し、その後１０日目まで、当該ＯＸＴ添加培地中で６日間の共培養を行った。一方、比較のため、他の一部のウェルについては、培養４日目に、ウェル内の培地を無添加培地に交換し、１０日目まで共培養を行った。培地交換は２日に１回行った。

【0074】

［毛幹様構造の長さ］
共培養の開始後、毛包角化細胞及び毛乳頭細胞は自発的に凝集し、培養４日目までに各ウェル内に細胞凝集塊が１つずつ形成された。さらに、培養４日目には、各細胞凝集塊において毛幹様構造の形成が確認された。そこで、培養４日目、６日目、８日目、及び１０日目の各時点で、上述の「参考例」と同様に、各細胞凝集塊に形成された毛幹様構造の長さを蛍光顕微鏡（BZ-X810、株式会社キーエンス）を用いて測定した。

【0075】

［成長因子遺伝子の発現量］
培養１０日目の細胞凝集塊のＲＮＡを抽出し、逆転写を行った後、ＲＴ－ＰＣＲを実施して、成長因子遺伝子である、ＶＥＧＦＡ（vascular endothelial growth factor A）遺伝子、及びＰＤＧＦＢ（platelet derived growth factor subunit B）遺伝子の発現量を定量した。

【0076】

なお、ＲＴ－ＰＣＲには、次の塩基配列を有するプライマーを用いた。ＶＥＧＦＡのフォワードプライマー：5'-ACTTCTGGGCTGTTCTCG-3’。ＶＥＧＦＡのリバースプライマー：5'-TCCTCTTCCTTCTCTTCTTC-3’。ＰＤＧＦＢのフォワードプライマー：5'-GAAGGAGCCTGGGTTCCC-3’。ＰＤＧＦＢのリバースプライマー：5'-TTTCTCACCTGGACAGGT-3’。コントロールとして用いたＧＡＰＤＨのフォワードプライマー：5'-TGGAAGGACTCATGACCACAG-3’。ＧＡＰＤＨのリバースプライマー：5'-GGATGATGTTCTGGAGAGCCC-3’。

【0077】

［結果］
図５には、培養４日目以降に無添加培地中で培養された細胞凝集塊（図中の「０μＭ ＯＸＴ」）、及び、培養４日目以降にＯＸＴ添加培地中で培養された細胞凝集塊（図中の「１０μＭ ＯＸＴ」）のそれぞれについて、培養４日目(横軸の「Ｄ４」）の時点における毛幹様構造の長さを「１」とした場合の、培養６日目、８日目、及び１０日目（それぞれ横軸の「Ｄ６」、「Ｄ８」及び「Ｄ１０」））の時点における毛幹様構造の相対的長さを評価した結果を示す（算術平均値、ｎ＝２４）。

【0078】

図５に示すように、培養４日目以降にＯＸＴ添加培地中で培養された細胞凝集塊においては、無添加培地中で培養された細胞凝集塊に比べて、毛幹様構造の長さが、より早く増加した。

【0079】

そして、培養８日目、及び１０日目の各時点において、ＯＸＴ添加培地中で培養された細胞凝集塊における毛幹様構造の相対的長さは、無添加培地中で培養された細胞凝集塊のそれに比べて、統計的に有意に大きかった。すなわち、オキシトシンによる発毛促進効果が確認された。

【0080】

図６には、培養１０日目の細胞凝集塊におけるＶＥＧＦＡ遺伝子及びＰＤＧＦＢ遺伝子の発現量を定量した結果を示す。なお、図６において、横軸には、培地に添加したオキシトシン濃度（「０μＭ」、「１０μＭ」）を示し、縦軸には、無添加培地（０μＭ）中で培養された細胞凝集塊における遺伝子発現量を「１」とした場合の、ＯＸＴ添加培地（１０μＭ）中で培養された細胞凝集塊における相対的な遺伝子発現量（算術平均値、ｎ＝３）を示す。

【0081】

図６に示すように、ＶＥＧＦＡ遺伝子及びＰＤＧＦＢ遺伝子のいずれについても、ＯＸＴ添加培地中で培養された細胞凝集塊における発現量は、無添加培地中で培養された細胞凝集塊のそれに比べて、統計的に有意に大きかった。すなわち、オキシトシンによって、in vitroモデルの細胞凝集塊におけるＶＥＧＦＡ遺伝子及びＰＤＧＦＢ遺伝子の発現量が効果的に増加することが確認された。

【0082】

なお、生体における毛周期は成長期（anagen）、退行期（catagen）及び休止期（telogen）から構成されるが、毛乳頭細胞におけるＶＥＧＦの発現は、休止期から成長期への移行を含む毛成長の促進に重要な役割を果たすことが知られている（非特許文献１：Jiyu Hyun et al., "Morus alba Root Extract Induces the Anagen Phase in the Human Hair Follicle Dermal Papilla Cells", Pharmaceutics, 2021, 13, 1155）。したがって、図６に示される結果は、オキシトシンによって、in vitroモデルの細胞凝集塊に含まれる毛乳頭細胞における成長因子遺伝子の発現が増強されたことを示唆しており、当該毛乳頭細胞における成長因子遺伝子の発現増強が、図５に示されるオキシトシンによる発毛促進に寄与している可能性が考えられた。