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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025007146
(43)【公開日】2025-01-17
(54)【発明の名称】ベルゲニンを含むＮＡＤ＋産生促進用食品組成物
(51)【国際特許分類】
A23L 33/10 20160101AFI20250109BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20250109BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20250109BHJP
【ＦＩ】
A23L33/10
A23L33/105
A23L2/00 F
A23L2/52
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023108352
(22)【出願日】2023-06-30
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】599098518
【氏名又は名称】株式会社ディーエイチシー
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】内藤 健太郎
(72)【発明者】
【氏名】片吉 健史
(72)【発明者】
【氏名】仲條 嵩久
(72)【発明者】
【氏名】北嶋 夏子
【テーマコード（参考）】
4B018
4B117
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB02
4B018LB03
4B018LB05
4B018LB06
4B018LB07
4B018LB08
4B018LB09
4B018LE02
4B018MD08
4B018ME10
4B018ME14
4B018MF01
4B117LC04
4B117LK06
4B117LK08
4B117LK11
4B117LK12
4B117LK15
4B117LL01
4B117LL02
(57)【要約】
【課題】本発明は、ＮＡＤ＋の産生を促進し、特に老化に伴って生体から減少するＮＡＤ＋の産生の回復を促進する、ベルゲニンを含む組成物を提供する。
【解決手段】細胞内のＮＡＭＰＴとＮＭＮＡＴの発現を増加させ、ＮＡＤ＋サルベージ経路を増強し、ＮＡＤ＋の産生を促進することができるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物、そして、これらのＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む内服剤、飲食品組成物及び生体内の抗老化用食品組成物を提供できる。
【選択図】図１
【解決手段】細胞内のＮＡＭＰＴとＮＭＮＡＴの発現を増加させ、ＮＡＤ＋サルベージ経路を増強し、ＮＡＤ＋の産生を促進することができるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物、そして、これらのＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む内服剤、飲食品組成物及び生体内の抗老化用食品組成物を提供できる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ベルゲニンを有効成分として０．０００１質量％～９７質量％含むＮＡＤ＋産生促進用食品組成物。
【請求項2】
細胞賦活化のために用いられることを特徴とする、請求項１に記載されるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物。
【請求項3】
睡眠の質の向上のために用いられることを特徴とする、請求項１に記載されるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物。
【請求項4】
認知力の改善のために用いられることを特徴とする、請求項１に記載されるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物。
【請求項5】
骨密度の向上のために用いられることを特徴とする、請求項１に記載されるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物。
【請求項6】
筋力維持のために用いられることを特徴とする、請求項１に記載されるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物。
【請求項7】
ベルゲニンを、液状の飲食品に対し０．０００１質量％～１質量％、固体状の飲食品に対し０．５質量％～８５質量％、錠剤状の飲食品に対し、１．０質量％～９７質量％含有する、請求項１乃至６いずれかの１つに記載されるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む内服剤。
【請求項8】
ベルゲニンを、液状の飲食品に対し０．０００１質量％～１質量％、固体状の飲食品に対し０．５質量％～８５質量％、錠剤状の飲食品に対し、１．０質量％～９７質量％含有する、請求項１乃至６いずれかの１つに記載されるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む飲食品組成物。
【請求項9】
ベルゲニンを、液状の飲食品に対し０．０００１質量％～１質量％、固体状の飲食品に対し０．５質量％～８５質量％、錠剤状の飲食品に対し、１．０質量％～９７質量％含有する、請求項１乃至６いずれかの１つに記載されるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む生体内の抗老化用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ベルゲニンを含むＮＡＤ＋産生促進用食品組成物に関する。本発明は、安全性が高く、内服剤として適用可能なＮＡＤ＋産生促進用食品組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、先進国を中心に世界の平均寿命は延び続けている一方で、健康寿命との乖離が広かる傾向がある。健康寿命とは、健康上の問題で日常生活が制限されることなく生活できる期間とされる。加齢で生じる機能低下、例えば、視力、聴力、認知力、運動能力、免疫機能、臓器機能の低下を軽減することは健康寿命を延ばすことに繋がるため非常に望まれている。
このような観点から、生体においてエネルギー産生に必須の補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と指称するが、ＮＡＤと指称することもある）が注目されている。ＮＡＤ＋は、脱水素酵素の補酵素として機能することが知られており、生体内の解糖系、クエン酸回路、電子伝達系などに関与する。また、ＮＡＤ＋はｓｉｒｔｕｉｎやｐｏｌｙ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ（ＰＡＲＰｓ）、ＣＤ３８などが触媒する酵素反応の基質にも使用される。
このような観点から、生体においてエネルギー産生に必須の補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と指称するが、ＮＡＤと指称することもある）が注目されている。ＮＡＤ＋は、脱水素酵素の補酵素として機能することが知られており、生体内の解糖系、クエン酸回路、電子伝達系などに関与する。また、ＮＡＤ＋はｓｉｒｔｕｉｎやｐｏｌｙ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ（ＰＡＲＰｓ）、ＣＤ３８などが触媒する酵素反応の基質にも使用される。
【0003】
哺乳動物において、主なＮＡＤ＋の生合成は、ニコチンアミド（ＮＡＭ）を主要基質とする２段階の酵素反応から成るサルベージ経路を介して進行する。第一段階では、ＮＡＭがニコチンアミドフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）によってニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）へと変換される。第二段階では、ＮＭＮがＮＭＮアデニリルトランスフェラーゼ（ＮＭＮＡＴ）によってＮＡＤ＋へと合成される。
皮膚をはじめとする体内のＮＡＤ＋量は年齢を重ねるごとに減少することが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。また、体内のＮＡＤ＋量の一因として細胞内ＮＡＤ＋量の維持に必須の酵素であるＮＡＭＰＴの働きが年齢とともに低下することが挙げられている（例えば、非特許文献２を参照）。一方、ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現を強化するなど体内のＮＡＤ＋産生を高めることは、健康寿命を伸ばすことが知られている（例えば、非特許文献３を参照）。また、ＮＡＤ＋産生の促進は、動脈硬化、心疾患、糖尿病、神経変性疾患、認知障害、骨老化、ストレスなどの治療に有効であると考えられている。このように、ＮＡＤ＋産生の促進は加齢による様々な生理学的な機能低下を抑制することに繋がると考えられている。
ＮＡＤ＋産生を促進する化合物としては、一般にＮＭＮ及びニコチンアミドリボシドがよく知られている（例えば、非特許文献４を参照）。しかしながら、より安全性、安定性が高く、工業的に安価に入手可能な成分が望まれていた。
皮膚をはじめとする体内のＮＡＤ＋量は年齢を重ねるごとに減少することが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。また、体内のＮＡＤ＋量の一因として細胞内ＮＡＤ＋量の維持に必須の酵素であるＮＡＭＰＴの働きが年齢とともに低下することが挙げられている（例えば、非特許文献２を参照）。一方、ＮＡＭＰＴ遺伝子の発現を強化するなど体内のＮＡＤ＋産生を高めることは、健康寿命を伸ばすことが知られている（例えば、非特許文献３を参照）。また、ＮＡＤ＋産生の促進は、動脈硬化、心疾患、糖尿病、神経変性疾患、認知障害、骨老化、ストレスなどの治療に有効であると考えられている。このように、ＮＡＤ＋産生の促進は加齢による様々な生理学的な機能低下を抑制することに繋がると考えられている。
ＮＡＤ＋産生を促進する化合物としては、一般にＮＭＮ及びニコチンアミドリボシドがよく知られている（例えば、非特許文献４を参照）。しかしながら、より安全性、安定性が高く、工業的に安価に入手可能な成分が望まれていた。
【0004】
ベルゲニン（Ｂｅｒｇｅｎｉｎ）は抗炎症作用や抗酸化作用が報告されているポリフェノールの一種である。ベルゲニンの生理作用は様々な先行研究で報告されており、大腸炎マウスでの抗炎症作用や肝障害マウスに対する肝保護作用などが知られている。特に整腸作用については数多くの報告があり、ベルゲニンを豊富に含有するトウダイグサ科の落葉樹、アカメガシワ（Ｍａｌｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）は古くから整腸作用を持つ生薬として用いられてきた。アカメガシワ樹皮の水溶性画分にはベルゲニンが１１％～１８％含まれており、アカメガシワエキスが便通改善効果を示すとの報告もある。ベルゲニンに関する様々な健康効果が報告されている一方で、ＮＡＤ＋産生作用については報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】ＰＬｏｓ ＯＮＥ．Ｖｏｌ．７，ｅ４２３５７（２０１２）
【非特許文献2】ＰＬｏｓ ＯＮＥ．Ｖｏｌ．１２，ｅ０１７０９３０（２０１７）
【非特許文献3】Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｖｏｌ．３０、ｐｐ．３２９－３４２（２０１９）
【非特許文献4】Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ ＢｉｏｌＶｏｌ．８、ｆｃｅｌｌ．２０２０．００２４６（２０２０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ＮＡＤ＋の産生を促進し、特に老化に伴って生体から減少するＮＡＤ＋の産生の回復を促進する、ベルゲニンを含む組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは鋭意検討した結果、ベルゲニンを使用して生体に適用することにより、細胞内のＮＡＤ＋の回復を促進することができることを見出し、以下の発明を完成させた。
【0008】
すなわち、本発明は一実施形態によれば、ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物であって、ベルゲニンを含む。
本発明は、別の実施形態によれば、上述に記載のＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む内服剤、飲食品組成物、及び生体内の抗老化用食品組成物に関する。
本発明は、別の実施形態によれば、上述に記載のＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む内服剤、飲食品組成物、及び生体内の抗老化用食品組成物に関する。
【発明の効果】
【0009】
ベルゲニンを適用したときに細胞内のＮＡＤ＋産生を有意に促進することができる。それに伴い、細胞賦活化、老化抑止、睡眠の質の向上、認知力の改善、骨密度の向上、筋力維持などの効果が得られる。
本発明によれば、ベルゲニンを含むＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を提供することが可能になる。ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物は、内服剤、飲食品組成物、及び生体内の抗老化用食品組成物として用いることができ、生体の老化防止に非常に有用となりうる。
本発明によれば、ベルゲニンを含むＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を提供することが可能になる。ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物は、内服剤、飲食品組成物、及び生体内の抗老化用食品組成物として用いることができ、生体の老化防止に非常に有用となりうる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。ただし、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【0012】
［第１実施形態：ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物］
本発明は、第１実施形態によれば、ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物に関する。当該ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物は、ベルゲニンを含む。
本発明は、第１実施形態によれば、ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物に関する。当該ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物は、ベルゲニンを含む。
【0013】
ベルゲニンは、アカメガシワ（Ｍａｌｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）の樹皮、葉、根などから抽出できる。また合成されるものも使用可能である。本願において、合成される市販品（東京化成工業株式会社製）を入手して使用する。
【0014】
また、ベルゲニンを含むアカメガシワエキスを使用することも可能である。アカメガシ
ワエキスに含まれるポリフェノールとしては、ベルゲニン以外に、ゲラニイン、ルチン、コリラジンなどの各種ポリフェノールが知られている。アカメガシワエキスは市販品が容易に入手可能であり、例えば、アカメガシワエキスパウダー（ポリフェノール含有率１４．０質量％以上）（以上、日本粉末薬品株式会社製）が挙げられる。
ワエキスに含まれるポリフェノールとしては、ベルゲニン以外に、ゲラニイン、ルチン、コリラジンなどの各種ポリフェノールが知られている。アカメガシワエキスは市販品が容易に入手可能であり、例えば、アカメガシワエキスパウダー（ポリフェノール含有率１４．０質量％以上）（以上、日本粉末薬品株式会社製）が挙げられる。
【0015】
ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物において、ベルゲニンが安定的に存在できるように、ベルゲニンの量またはアカメガシワエキスに含まれるベルゲニンの量は、０．０００１質量％～９７質量％であることが好ましく、０．００１質量％～９０質量％であることがより好ましい。
【0016】
本実施形態によるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物においては、ベルゲニンを含むことで、ＮＡＤ＋の産生を促進することができる。また、ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物は、従来から知られているベルゲニンの作用である抗炎症作用や抗酸化作用をも備えている。
【0017】
ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物には、任意選択的な成分として、これらに限らず、例えばプラセンタ抽出物、コラーゲンペプチド、ニコチン酸アミド、ビタミンＣ誘導体、アルブチン、エラグ酸、コウジ酸、トラネキサム酸、グリセリン、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコールを含んでもよい。
【0018】
本実施形態によるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物に含まれるコラーゲンペプチドは、生体由来コラーゲンの加水分解物であってよい。より具体的には、ウシやブタなどの哺乳類や魚類の組織、例えば、皮膚、骨及び腱などの結合組織から抽出したコラーゲンタンパク、もしくはコラーゲンタンパク質の熱変性物であるゼラチンから加水分解等により得られたものを使用してもよく、また人工的に合成したものを用いても良い。
【0019】
コラーゲンペプチドは、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を少なくとも含むペプチドであることが好ましく、Ｈｙｐを含むジペプチドまたはトリペプチドから選択されることが好ましい。より具体的には、Ａｌａ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｌｅｕ－Ｈｙｐ、Ａｌａ－Ｈｙｐのジペプチドまたはトリペプチドから選択される１または２以上の混合物であってよい。中でも、Ａｌａ－Ｈｙｐのジペプチドを含むことが最も好ましい。Ａｌａ－Ｈｙｐはトリペプチドに比べて低分子であることから体内への吸収が良く、またこれらのペプチドのなかでも安定性が高い点で好ましい。
【0020】
ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物は、ベルゲニン又はベルゲニンを含むアカメガシワエキスと、上記任意選択的な成分とを混合することにより得ることができる。得られたＮＡＤ＋産生促進用食品組成物は、ベルゲニンを含む液体又は固体組成物である。ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物は、冷蔵で１～３年程度にわたって安定に貯蔵することができ、生細胞のＮＡＤ＋の産生を促進することができる。また、得られた組成物は、特には老化して、ＮＡＤ＋産生が低減した生細胞においても、ＮＡＤ＋の産生を促進することができるため、ＮＡＤ＋の回復促進剤ということもできる。
【0021】
ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物は、内服剤及び飲食品組成物に添加して用いることができる。特には、老化防止効果を得るために、内服剤及び飲食品組成物等に添加して用いることができる。また、ＮＡＤ＋の産生促進により、生体内の老化抑止効果が得られるため、ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む組成物が、生体内の抗老化用食品組成物とすることができる。
【0022】
以下に、ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を添加して用いる各種の組成物について説明する。
【0023】
［第２実施形態：内服剤］
本発明は、第２実施形態によれば内服剤であって、第１実施形態によるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む。内服剤は、例えば経口投与剤であってよく、茶剤、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、ドライシロップ剤等が挙げられる。
本発明は、第２実施形態によれば内服剤であって、第１実施形態によるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む。内服剤は、例えば経口投与剤であってよく、茶剤、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、ドライシロップ剤等が挙げられる。
【0024】
これらの内服剤は、第１実施形態によるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含め、この分野で通常知られた慣用的な方法により製造される。内服剤には、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などを含めることができる。調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。内服剤が液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、例えば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。
【0025】
内服剤におけるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物の有効成分量は、ベルゲニンの質量を基準として、例えば、通常成人１日当たり２ｍｇ以上、好ましくは４ｍｇ以上を摂取するのが好ましい。投与量の上限は、１日当たり、２００ｍｇ以下が好ましく、１００ｍｇ以下がより好ましい。よって、ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物は、各形態に応じた範囲で前述した摂取量となるように含有されれば良い。
【0026】
［第３実施形態：飲食品組成物］
本発明は、第３実施形態によれば飲食品組成物であって、第１実施形態によるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む。本実施形態による飲食品組成物には、第１実施形態によるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を、飲食品組成物において通常用いられている任意成分と共に配合することができる。このようなヒトまたは動物用の飲食品組成物としては、例えば、パン類、菓子類、麺類、肉製品・水産加工品、穀類の加工品、加工野菜・加工果実、加工卵、乳製品、粉類、即席菓子の素、食用油脂、スープの素、粉末飲料、調味料、食品添加物、飲料類、飼料等が挙げられる。
本発明は、第３実施形態によれば飲食品組成物であって、第１実施形態によるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む。本実施形態による飲食品組成物には、第１実施形態によるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を、飲食品組成物において通常用いられている任意成分と共に配合することができる。このようなヒトまたは動物用の飲食品組成物としては、例えば、パン類、菓子類、麺類、肉製品・水産加工品、穀類の加工品、加工野菜・加工果実、加工卵、乳製品、粉類、即席菓子の素、食用油脂、スープの素、粉末飲料、調味料、食品添加物、飲料類、飼料等が挙げられる。
【0027】
また、飲食品組成物は、例えば、ビタミン剤などの栄養補助食品、栄養補助飲料、動物用健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品、保健機能食品等が含まれ、通常用いられている各種形態、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、フィルム等として製品化することができる。製品化に際しては、第１実施形態によるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物とともに、賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、吸収促進剤、吸着剤、滑沢剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が配合される。
【0028】
これらの飲食品組成物は、この分野で通常知られた慣用的な方法により製造される。
【0029】
このような飲食品組成物におけるＮＡＤ＋産生促進用食品組成物の有効成分量は、ベルゲニンの質量を基準として、飲食品の形態ごとに応じた範囲で所望の摂取量となるように添加されれば良く、飲食品には、０．０００１質量％～９７質量％の範囲内で添加することが好ましい。例えば、液状の飲食品に対し０．０００１質量％～１質量％、固体状の飲食品に対し０．５質量％～８５質量％、錠剤状の飲食品に対し、１．０質量％～９７質量％の範囲内で添加することが好ましい。さらに具体的には、以下に限定されないが、例えば、サプリメントには、アカメガシワ粉末の乾燥重量を基準として、５質量％～９０質量％の範囲内で添加することが好ましい。
【0030】
ベルゲニンの１日の摂取量は許容量を超えない限り、服用回数は特に限定されないが、通常、１日数回に分けて摂取するのが望ましい。
【実施例0031】
以下、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0032】
（ヒト肝細胞培養）
ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｕｎｔｉｓ／ｍＬストレプトマイシン、および１００μｇ／ｍＬペニシリンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で３７°Ｃ、５％ ＣＯ２の条件で培養した。培養細胞が約５０％のコンフルエンスに達するまで隔日で培地を交換し、その後は毎日交換した。細胞が８０～９０％の密度に達したら、細胞を継代した。全ての試験において、培地は予め無血清ＤＭＥＭに置き換えた。一晩インキュベーションした後、細胞をベルゲニンの存在下または非存在下で培養した。
ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｕｎｔｉｓ／ｍＬストレプトマイシン、および１００μｇ／ｍＬペニシリンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で３７°Ｃ、５％ ＣＯ２の条件で培養した。培養細胞が約５０％のコンフルエンスに達するまで隔日で培地を交換し、その後は毎日交換した。細胞が８０～９０％の密度に達したら、細胞を継代した。全ての試験において、培地は予め無血清ＤＭＥＭに置き換えた。一晩インキュベーションした後、細胞をベルゲニンの存在下または非存在下で培養した。
【0033】
（細胞内ＮＡＤ＋の定量）
ＨｅｐＧ２細胞のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比は、Ａｍｐｌｉｔｅ（登録商標）Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ Ｒａｔｉｏ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を使用して決定した。細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０％ＨＣｌＯ４に浸した後、培養プレートから掻き取った。新しいチューブに移した後、細胞を超音波発生器Ｓｏｎｉｃｓｔａｒ８５でホモジナイズし、氷上で１０分間放置した。４°Ｃ、１６，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清をＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ反応混合物に加え、暗所で４°Ｃで一晩インキュベートした。反応後、サンプルは－２０°Ｃで細胞質画分として保存した。サンプルの吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して吸光度４６０ｎｍで測定した。
ＨｅｐＧ２細胞のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比は、Ａｍｐｌｉｔｅ（登録商標）Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ Ｒａｔｉｏ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を使用して決定した。細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０％ＨＣｌＯ４に浸した後、培養プレートから掻き取った。新しいチューブに移した後、細胞を超音波発生器Ｓｏｎｉｃｓｔａｒ８５でホモジナイズし、氷上で１０分間放置した。４°Ｃ、１６，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清をＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ反応混合物に加え、暗所で４°Ｃで一晩インキュベートした。反応後、サンプルは－２０°Ｃで細胞質画分として保存した。サンプルの吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して吸光度４６０ｎｍで測定した。
【0034】
（免疫ブロッティング）
ＨｅｐＧ２細胞は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１ｍＭエチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＤＴＡ）、１％ ＮＰ－４０、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）から成る溶解液で溶解した。各細胞溶解液中のタンパク質は、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、セミドライブロッティング装置（ＡＴＴＯ）を使用してポリフッ化ビニリデン膜へ転写した。転写後、非特異的結合を減らすために、２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ （Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を含む０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で膜を１時間ブロッキングした。次に、膜を一次抗体とともに４°Ｃで一晩インキュベートし、洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合の二次抗体とともに１時間インキュベートした。タンパク質は、化学発光試薬（ＥＺ ｗｅｓｔ Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ、ＡＴＴＯ）および蛍光スキャナー（Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して検出した。次の一次抗体を使用した：抗β－アクチン（１：２０，０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ＮＭＮＡＴ（１：４，０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＮＡＭＰＴ（１：４，０００、クサビオ テクノロジー）。バンド強度の定量は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフト（米国メリーランド州国立衛生研究所）を使用して行った。
ＨｅｐＧ２細胞は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１ｍＭエチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＤＴＡ）、１％ ＮＰ－４０、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）から成る溶解液で溶解した。各細胞溶解液中のタンパク質は、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、セミドライブロッティング装置（ＡＴＴＯ）を使用してポリフッ化ビニリデン膜へ転写した。転写後、非特異的結合を減らすために、２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ （Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を含む０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で膜を１時間ブロッキングした。次に、膜を一次抗体とともに４°Ｃで一晩インキュベートし、洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合の二次抗体とともに１時間インキュベートした。タンパク質は、化学発光試薬（ＥＺ ｗｅｓｔ Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ、ＡＴＴＯ）および蛍光スキャナー（Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して検出した。次の一次抗体を使用した：抗β－アクチン（１：２０，０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ＮＭＮＡＴ（１：４，０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＮＡＭＰＴ（１：４，０００、クサビオ テクノロジー）。バンド強度の定量は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフト（米国メリーランド州国立衛生研究所）を使用して行った。
【0035】
（実施例１ ヒト肝細胞における細胞内ＮＡＤ＋の増量）
ベルゲニンがＮＡＤ＋産生を高めるのかに明らかとするため、ヒト由来のＨｅｐＧ２細
胞を０～２μＭのベルゲニンとインキュベートした。図１のＡは８時間のインキュベーション後、細胞内ＮＡＤ＋量をＡｍｐｌｉｔｅ（登録商標）Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ Ｒａｔｉｏ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を使用して測定した。結果は３回の試験結果からなる平均値±標準誤差を指す。図１のＢとＣは６時間のインキュベーション後、細胞内ＮＡＭＰＴとＮＭＮＡＴのタンパク質レベルを免疫ブロッティングによって分析した。β－アクチン（β－Ａｃｔｉｎ）をローディングコントロールとして使用した。Ｉｍａｇｅ Ｊ ソフトウェアを使用して、免疫ブロッティングで得たバンドの強度を分析した。結果は３回の試験結果からなる平均値±標準誤差を指す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１は、ベルゲニン未処理コントロールとの比較（ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔ の多重比較検定）を表した。
ベルゲニンがＮＡＤ＋産生を高めるのかに明らかとするため、ヒト由来のＨｅｐＧ２細
胞を０～２μＭのベルゲニンとインキュベートした。図１のＡは８時間のインキュベーション後、細胞内ＮＡＤ＋量をＡｍｐｌｉｔｅ（登録商標）Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ Ｒａｔｉｏ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を使用して測定した。結果は３回の試験結果からなる平均値±標準誤差を指す。図１のＢとＣは６時間のインキュベーション後、細胞内ＮＡＭＰＴとＮＭＮＡＴのタンパク質レベルを免疫ブロッティングによって分析した。β－アクチン（β－Ａｃｔｉｎ）をローディングコントロールとして使用した。Ｉｍａｇｅ Ｊ ソフトウェアを使用して、免疫ブロッティングで得たバンドの強度を分析した。結果は３回の試験結果からなる平均値±標準誤差を指す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１は、ベルゲニン未処理コントロールとの比較（ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔ の多重比較検定）を表した。
【0036】
図１のＡに示すように、細胞内ＮＡＤ＋量は２μＭのベルゲニンを添加することにより大幅に増加した。この結果から、ベルゲニンは細胞のＮＡＤ＋産生を高めることが示された。
【0037】
ベルゲニンはＮＡＤ＋サルベージ経路を活性化させることでＮＡＤ＋産生を高めていると考えられる。そこで、ベルゲニンがＮＡＤ＋サルベージ経路の２つの重要な酵素であるＮＡＭＰＴとＮＭＮＡＴのタンパク質発現へどのような影響及ぼすのか調べた。
図１のＢとＣの結果により、ベルゲニンがＮＡＤ＋サルベージ経路の２つの重要な酵素であるＮＡＭＰＴとＮＭＮＡＴのタンパク質双方の発現を増加させた。これらの結果から、ベルゲニンはＮＡＭＰＴとＮＭＮＡＴの発現を増加させることでＮＡＤ＋サルベージ経路を増強し、ＮＡＤ＋産生の活性化させるものと推量される。
図１のＢとＣの結果により、ベルゲニンがＮＡＤ＋サルベージ経路の２つの重要な酵素であるＮＡＭＰＴとＮＭＮＡＴのタンパク質双方の発現を増加させた。これらの結果から、ベルゲニンはＮＡＭＰＴとＮＭＮＡＴの発現を増加させることでＮＡＤ＋サルベージ経路を増強し、ＮＡＤ＋産生の活性化させるものと推量される。
【0038】
＜処方例＞
【表1】
【0039】
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0040】
本発明のＮＡＤ＋産生促進用食品組成物により、ＮＡＤ＋産生促進用食品組成物を含む内服剤及び飲食品組成物を提供することができる。内服剤として生体の老化を防止する効果が期待できると考えられる。
【図1】
