特開 2025-72615 ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025072615

(43)【公開日】2025-05-09

(54)【発明の名称】ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/32 20060101AFI20250430BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20250430BHJP

   A23L 33/13 20160101ALI20250430BHJP

【ＦＩ】

C12P19/32 Z

C12N1/20 E

A23L33/13

【審査請求】有

【請求項の数】16

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2025021095

(22)【出願日】2025-02-12

(62)【分割の表示】P 2021551670の分割

【原出願日】2020-10-06

(31)【優先権主張番号】P 2019187501

(32)【優先日】2019-10-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】304023318

【氏名又は名称】国立大学法人静岡大学

(71)【出願人】

【識別番号】000108993

【氏名又は名称】株式会社大阪ソーダ

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(74)【代理人】

【識別番号】100175651

【弁理士】

【氏名又は名称】迫田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】吉田 信行

(72)【発明者】

【氏名】西川 孝治

(72)【発明者】

【氏名】井戸垣 秀聡

(57)【要約】      （修正有）

【課題】本発明の目的は、ニコチンアミドリボシドの産生効率が高い微生物、並びにニコチンリボモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を産生できる微生物を提供することである。
【解決手段】フルクトバシラス属に属する乳酸菌を培養することによって、ニコチンリボモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを製造することができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の培養を行い、ニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製する工程を含む、ニコチンアミドリボシドの製造方法。

【請求項2】

前記培養を、フルクトースを含まない培地にて行う、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、請求項１又は２に記載の製造方法。

【請求項4】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項１又は２に記載の製造方法。

【請求項5】

フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された上清、及び／又は前記上清から単離されたニコチンアミドリボシドを含有する、ニコチンアミドリボシド強化剤。

【請求項6】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、請求項５に記載の強化剤。

【請求項7】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項５に記載の強化剤。

【請求項8】

請求項５～７のいずれかに記載のニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品。

【請求項9】

Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌。

【請求項10】

フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の培養を行う工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法。

【請求項11】

前記培養を、フルクトースを含む培地にて行う、請求項１０に記載の製造方法。

【請求項12】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、請求項１０又は１１に記載の製造方法。

【請求項13】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。

【請求項14】

フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された菌体、前記菌体の破砕物、及び／又は前記破砕物から単離されたニコチンアミドリボシド及びニコチンアミドリボシドを含有する、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤。

【請求項15】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、請求項１４に記載の強化剤。

【請求項16】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項１４に記載の強化剤。

【請求項17】

請求項１４～１６のいずれかに記載のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品。

【請求項18】

Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、老化および老化関連疾患は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＮＡＤ⁺）量低下及びＮＡＤ⁺依存性脱アセチル化酵素サーチュインの活性低下と密接な関わりを持つことが示されている（非特許文献１、２）。また、サーチュインの活性化は、カロリー制限における寿命延長又は健康増進に関わる効果の多くを説明すると考えられている（非特許文献２）。

【0003】

ＮＡＤ⁺は、古くから酸化還元反応の補酵素として知られている一方、近年では、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ、ＣＤ３８／ＣＤ１５７、サーチュインの基質等としての役割も知られるようになった（非特許文献１）。特に、サーチュインによるＮＡＤ⁺からニコチンアミドへの分解反応は、それと共役するサーチュインによるリシン残基脱アセチル化反応を促進することで、健康、長寿に関わるさまざまな生命現象に関与している（非特許文献１、２）。老化に伴いＮＡＤ⁺量およびサーチュイン活性は低下する一方で、ニコチンアミドからＮＡＤ⁺を再合成する律速酵素ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の酵素反応産物、具体的には、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｒｉｂｏｓｉｄｅ：ＮＲ）といったＮＡＤ⁺中間代謝産物の補充は、サーチュインを効果的に再活性化する（非特許文献１）ことが知られており、更に、サーチュインの活性化を介して幅広い抗酸化作用を発現することが知られている。このため、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドは、カロリー制限における寿命延長及び健康増進等に関わる多くの生体現象に寄与することが知られている。

【0004】

従って、ニコチンアミドモノヌクレオチド又はニコチンアミドリボシドを効率的に生産する方法が望まれている。これまで、トルラ酵母等の食経験のある酵母からニコチンアミドモノヌクレオチドが取得できること（特許文献１）、及び、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）、及びＲ．オイトロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）からなる群から選択される細菌の遺伝修飾細菌からニコチンアミドリボシドを取得できること（特許文献２）が報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１７／２０００５０号

【特許文献2】国際公開第２０１７／０８３８５８号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Imai, S. & Guarente, L. (2014) Trends Cell Biol., 24, 464-471.

【非特許文献2】Guarente, L. (2013) Genes Dev., 27, 2072-2085.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ニコチンアミドモノヌクレオチド又はニコチンアミドリボシドを産生するこれまでの微生物学的方法では、依然として生産効率に改善の余地がある。

【0008】

そこで、本発明は、ニコチンアミドリボシドの産生効率が高い微生物、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を産生可能な微生物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者は鋭意検討の結果、特定の属に属する乳酸菌が、ニコチンアミドリボシドを効率よく産生し、更に、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を生産できることを見出した。本発明は、この知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。

【0010】

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の培養を行い、ニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製する工程を含む、ニコチンアミドリボシドの製造方法。
項２． 前記培養を、フルクトースを含まない培地にて行う、項１に記載の製造方法。
項３． 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、項１又は２に記載の製造方法。
項４． 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、項１又は２に記載の製造方法。
項５． フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された上清、及び／又は前記上清から単離されたニコチンアミドリボシドを含有する、ニコチンアミドリボシド強化剤。
項６． 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、項５に記載の強化剤。
項７． 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、項５に記載の強化剤。
項８． 項５～７のいずれかに記載のニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品。
項９． Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌。
項１０． フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の培養を行う工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法。
項１１． 前記培養を、フルクトースを含む培地にて行う、項１０に記載の製造方法。
項１２． 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、項１０又は１１に記載の製造方法。
項１３． 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、項１０又は１１に記載の製造方法。
項１４． フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された菌体、前記菌体の破砕物、及び／又は前記破砕物から単離されたニコチンアミドリボシド及びニコチンアミドリボシドを含有する、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤。
項１５． 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、項１４に記載の強化剤。
項１６． 前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、項１４に記載の強化剤。
項１７． 項１４～１６のいずれかに記載のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品。
項１８． Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌。
項１９．フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された上清、及び／又は前記上清から単離されたニコチンアミドリボシドの、ニコチンアミドリボシド強化剤の製造のための使用。
項２０．フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された菌体、前記菌体の破砕物、及び／又は前記破砕物から単離されたニコチンアミドリボシド及びニコチンアミドリボシドの、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤の製造のための使用。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、ニコチンアミドリボシドの産生効率が高い微生物、及びニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を産生可能な微生物として、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌が提供される。従って、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られる、ニコチンアミドリボシドを含む培養物、又はニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物は、それぞれ、ニコチンアミドリボシドを強化する食品添加物又はニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを強化する食品添加物に用いることができる。

【発明を実施するための形態】

【0012】

１．ニコチンアミドリボシドの製造方法
本発明のニコチンアミドリボシドの製造方法は、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌を培養し、ニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製する工程を含むことを特徴とする。以下、本発明のニコチンアミドリボシドの製造方法について詳述する。

【0013】

乳酸菌
本発明の製造方法で用いられる乳酸菌は、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌であれば特に限定されない。フルクトバシラス属に属する乳酸菌は、ニコチンアミドリボシドを産生する。

【0014】

好ましい乳酸菌の例としては、フルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられ、より好ましくは、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられる。

【0015】

より好ましい乳酸菌の例としては、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＮＢＲＣ１１３２３９株が挙げられ、更に好ましくは、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株が挙げられる。

【0016】

本発明のニコチンアミドリボシドの製造方法においては、ニコチンアミドリボシドをより一層多く産生する観点から、乳酸菌として、好ましくは、フルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株が挙げられ、より好ましくは、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株が挙げられ、特に好ましくは、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株が挙げられる。

【0017】

Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、２０１８年８月２１日付で受託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４として国内寄託されている。

【0018】

Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、２０１８年８月２１日付で受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５として国内寄託されている。

【0019】

Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、２０１８年８月２１日付で受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６として国内寄託されている。

【0020】

これらのフルクトバシラス菌乳酸菌株は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。

【0021】

培地
フルクトバシラス菌乳酸菌の培養に用いられる培地は適宜選択されればよい。培地としては、拡大培養に用いられるもの（前培養培地）、及び生産培養に用いられるもの（本培養培地）が挙げられる。本培養培地は、前培養培地として用いられる培地を基本として、更に添加物を含有させて調製することができる。培地の性状については、好ましくは液体培地であるが、寒天培地であってもよい。培地は、炭素源の他、一般的には窒素源、ミネラル等を含む。

【0022】

炭素源としては、糖質及び糖質材料が挙げられる。糖質としては、糖類（単糖、二糖、オリゴ糖）、多糖類、及び糖アルコールが挙げられる。糖質としては、乳糖、ショ糖、グルコース、デンプン、キシリトール、デキストロース等が挙げられる。糖質材料は、糖質を含む有機組成物であればよく、例えば、乳及びその加工品（脱脂粉乳、ホエイ、ミルクパウダー、練乳等）、豆乳及びその加工品（豆乳加水分解物等）、穀類、果実、野菜等の食品が挙げられる。乳としては、ウシ、ヤギ、ヒツジ、水牛、ラクダ、ラマ、ロバ、ヤク、ウマ、トナカイ等の任意の哺乳動物に由来するものが挙げられる。なお糖質は、単離されたものであってもよいし、糖質材料に含まれているものであってもよい。例えば、フルクトース（糖質）は、果実（糖質材料）に含まれる形態のものを用いてもよい。これらの炭素源は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの炭素源の中でも、好ましくはグルコースが挙げられる。本発明のニコチンアミドリボシドの製造方法においては、培地にはフルクトースを含まないことが好ましい。

【0023】

培地中の炭素源の濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、例えば０．５～４ｗ／ｗ％、好ましくは１～３ｗ／ｗ％、より好ましくは１．５～２．５ｗ／ｗ％が挙げられる。

【0024】

窒素源としては、任意の無機窒素源又は有機窒素源を使用することができる。例えば、酵母エキス（ビール酵母等）、肉エキス、カゼイン等のタンパク質；ペプトン（プロテアーゼペプトン等）等のタンパク質加水分解物、ペプチド等のペプチド類；アンモニウム塩（クエン酸アンモニウム等）、硝酸塩等の含窒素塩等が挙げられる。これらの窒素源は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。

【0025】

培地中の窒素源の濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、タンパク質の場合、例えば０．３～４ｗ／ｗ％、好ましくは０．５～３ｗ／ｗ％、より好ましくは１～２ｗ／ｗ％が挙げられ；ペプチド類の場合、例えば０．１～２ｗ／ｗ％、好ましくは０．３～１．８ｗ／ｗ％、より好ましくは０．５～１．５ｗ／ｗ％が挙げられ；含窒素塩の場合、例えば０．０３～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５～１ｗ／ｗ％、より好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられる。

【0026】

ミネラルとしては、例えば、マンガン（硫酸マンガン等）、亜鉛、鉄、ナトリウム（酢酸ナトリウム等）、カリウム（硫酸水素二カリウム、リン酸カリウム等）、マグネシウム（硫酸マグネシウム等）、カルシウム、リン（リン酸カリウム等）、硫黄（硫酸マンガン、硫酸水素カリウム、硫酸マグネシウム等）、微量元素等が挙げられる。これらのミネラルは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのミネラルの中でも、好ましくは、マンガン、ナトリウム、マグネシウム、カリウムが挙げられる。

【0027】

培地中のミネラルの濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、マンガンの場合、例えば０．００１～０．０１ｗ／ｗ％、好ましくは０．００３～０．００８ｗ／ｗ％が挙げられ；ナトリウムの場合、例えば０．０５～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～１ｗ／ｗ％が挙げられ；マグネシウムの場合、例えば０．００１～０．０２ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５～０．０１５ｗ／ｗ％が挙げられ；カリウムの場合、例えば０．０５～１ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられる。

【0028】

培地は、上記成分以外に、ビタミン（ビタミンＢ群など）、界面活性剤（非イオン性界面活剤（Ｔｗｅｅｎ等）、陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳ等）等）、抗菌剤（トリクロサン等）、抗生物質（モネシン等）等の他の成分を含んでもよい。これらの他の成分は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの他の成分の中でも、好ましくは界面活性剤、より好ましくは非イオン性界面活性剤が挙げられる。

【0029】

培地中の他の成分の濃度については特に限定されず、他の成分の種類、培地の種類、培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、界面活性剤を含む場合、界面活性剤の濃度として、例えば０．０１～０．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５～０．３ｗ／ｗ％が挙げられる。

【0030】

また、本発明の製造方法で得られた培養物を食品へのニコチンアミドリボシド強化剤として用いる場合、培地成分は、上記の成分のうち、食品添加物として認可されている成分が選択される。

【0031】

培養方法
本発明の製造方法におけるフルクトバシラス属乳酸菌の培養方法としては、フルクトバシラス属乳酸菌の生育条件下、ニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製できる条件下であれば特に限定されない。

【0032】

培養温度としては、培養対象となるフルクトバシラス属乳酸菌の至適温度であればよく、例えば２６～４０℃、好ましくは２７～３８℃、より好ましくは２８～３６℃、更に好ましくは２９～３４℃が挙げられる。培養時間としては、実際に培養するフルクトバシラス属乳酸菌の種類等に合せて適宜設定すればよく、例えば４～４８時間、好ましくは８～３６時間、より好ましくは１２～２４時間が挙げられる。

【0033】

本発明の製造方法においては、フルクトバシラス属乳酸菌の培養中に培養液を攪拌しなくてもよく、そのような条件であっても、ニコチンアミドリボシドを高産生できる。なお、本発明の製造方法では、ニコチンアミドリボシドをより高産生するために、乳酸菌の培養中に培養液を攪拌しても構わない。

【0034】

本発明の製造方法においては、好ましくは、上述の培養を一定時間生産培養（本培養）として行い、その前に、少量（例えば体積比で本培養培地の１／６～１／４）の培地で拡大培養を（前培養）行うことができる。前培養の培養条件は、フルクトバシラス属乳酸菌の種類などに合せて適宜設定すればよく、上述の条件を採用することができる。また、本培養においては、前培養で得られた培養物を、ＯＤ６６０が例えば０．０１～０．０４、好ましくは０．０１～０．０３となるように本培養培地に植菌することができる。

【0035】

以上のようにして得られるニコチンアミドリボシドを含む培養物が調製される。この培養物には、培養で共産生された他のフルクトバシラス属乳酸菌代謝物が含まれていてもよい。

【0036】

調製されたニコチンアミドリボシドを含む培養物の使用形態としては、調製された培養物そのままで使用する形態、当該培養物から上清を分離して使用する形態、及び上清からニコチンアミドリボシドを単離して使用する形態が挙げられる。分離方法としては、例えば遠心分離法、膜ろ過法等が挙げられる。単離法としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー技術、塩析、溶媒沈殿等が挙げられる。

【0037】

２．ニコチンアミドリボシド強化剤；飲食品、化粧品又は医薬品
以上のようにして得られたニコチンアミドリボシドを含む培養物、当該培養物から分離された上清、及び／又は当該上清から単離されたニコチンアミドリボシドは、ニコチンアミドリボシドの強化を目的とした食品への添加物若しくは化粧品又は医薬品の有効成分として配合される、ニコチンアミドリボシド強化剤として、好適に用いることができる。

【0038】

ニコチンアミドリボシド強化剤は、飲食品、化粧品又は医薬品に配合して摂取、服用又は適用させることで、体内に取り込まれたニコチンアミドリボシドが、細胞がエネルギーを利用するために必要な物質であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換されることによる様々な有用な効果ができる。

【0039】

ニコチンアミドリボシド強化剤は、ニコチンアミドリボシド以外に、他のフルクトバシラス属乳酸菌代謝物が含まれていてよい。この場合、ニコチンアミドリボシド強化剤は、ニコチンアミドリボシドに加えて、当該他のフルクトバシラス属乳酸菌代謝物の少なくともいずれかの強化剤としても用いることができる。

【0040】

ニコチンアミドリボシド強化剤を飲食品に配合することで、飲食によってニコチンアミドリボシドを効率的に摂取することができる。これによって、ニコチンアミドリボシド摂取による健康効果（カロリー制限、アンチエイジング、健康増進等）を期待することができる。なお、飲食品には、ヒト用の飲食品だけでなく、動物用の飼料も含む。

【0041】

飲食品としては、特に限定されないが、例えば、飲料としては、特に限定されないが、例えば、発酵乳（ドリンクヨーグルト等）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳等）、茶系飲料（緑茶、紅茶及び烏龍茶等）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどう等の果汁、トマト、ニンジン等の野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワイン等）、炭酸飲料、清涼飲料、水ベースの飲料等の飲料；及び発酵乳（セットタイプヨーグルト、ソフトヨーグルト等）、菓子、インスタント食品、調味料等の加工食品等の食品が挙げられる。

【0042】

また、飲食品としては、機能性食品も挙げられる。機能性食品は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ［特定保健用食品］を含む）及び栄養機能食品等の保健機能食品、機能性表示食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤等の各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）等が挙げられる。更に、機能性食品は、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品、介護用食品等の特別用途食品であってもよい。

【0043】

また、当該ニコチンアミドリボシド強化剤を化粧品に配合することで、適用によって、ニコチンアミドリボシドによる薬理効果（老化予防等）を期待できる。

【0044】

化粧品としては、化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、ゲル、パック、シートマスク、リップクリーム等の基礎化粧料；洗顔料、メイク落とし（クレンジング剤を含む）、角質除去剤、ボディーシャンプーなどの皮膚洗浄料；サンスクリーン剤、ボディー用ジェル、ボディー用マッサージ剤、抑汗剤、防臭剤、除毛剤、入浴剤等のボディーケア化粧料；ファンデーション、おしろい、口紅、頬紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、眉墨等のメークアップ化粧料；マネキュア、ネイルリムーバー等の爪用化粧料；ヘアスタイリング剤、シャンプー、コンディショナー、リンス、育毛剤等の毛髪化粧料；液体歯磨、練歯磨、洗口液、マウススプレー等の口腔用化粧料等が挙げられる。

【0045】

更に、当該ニコチンアミドリボシド強化剤を医薬品に配合することで、服用又は適用によってニコチンアミドリボシドを有効成分として経口又は経皮摂取することができる。これによって、ニコチンアミドリボシド摂取による薬理効果（コケイン症候群及び加齢関連疾病等の治療又は予防、並びに皮膚の酸化損傷の治療又は予防等）を期待できる。

【0046】

医薬品としては、経口剤及び外用剤（医薬部外品を含む）が挙げられる。経口剤の剤形としては、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤等が挙げられ、外用剤の剤型としては、液剤（ローション剤、スプレー剤、エアゾール剤、及び乳液剤を含む）、フォーム剤、軟膏剤、クリーム剤、ジェル剤、貼付剤等が挙げられる。

【0047】

ニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品の適用対象としては、好ましくは哺乳動物が挙げられ、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類；イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ等のペット又は家畜；マウス、ラット、ハムスター、サル等の実験動物が挙げられる。

【0048】

３．ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法
フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌は、ニコチンアミドリボシドと共にニコチンアミドモノヌクレオチドも産生する。従って、本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法も提供する。

【0049】

ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法では、フルクトバシラス属乳酸菌の生育条件下、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製できる条件下で培養を行うことで、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを共産生する。これによって、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物が調製される。

【0050】

ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法において用いられる乳酸菌は、上記「１．ニコチンアミドリボシドの製造方法」において記載した通りである。具体的には、好ましい乳酸菌の例としては、フルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられる。

【0051】

より好ましい乳酸菌の例としては、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＮＢＲＣ１１３２３９株が挙げられる。

【0052】

ただし、本発明のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法においては、ニコチンアミドモノヌクレオチドをより多く（つまり、ニコチンアミドリボシドに対してニコチンアミドモノヌクレオチドの比率がより高くなるように）産生する観点から、乳酸菌として、好ましくはフルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株が挙げられ、より好ましくはフルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、フルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられ、さらに好ましくはＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓＮＢＲＣ３５１６株が挙げられる。

【0053】

また、本発明のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法においては、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方をバランス良く産生する観点から、乳酸菌として、好ましくはフルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）が挙げられ、好ましくはＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株が挙げられる。

【0054】

ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法において用いられる培地は、炭素源として、更にフルクトースを含むことが好ましいことを除いて、上記「１．ニコチンアミドリボシドの製造方法」において記載した通りである。培地中のフルクトースの濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、例えば０．５～４ｗ／ｗ％、好ましくは１～３．５ｗ／ｗ％、より好ましくは１．５～２．５ｗ／ｗ％が挙げられる。培地中にフルクトースを含むことで、フルクトバシラス属に属する乳酸菌は、ニコチンアミドリボシド及びニコチンアミドリボシドを菌体内に蓄積する。

【0055】

ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法において用いられる培養方法等についても、上記「１．ニコチンアミドリボシドの製造方法」において記載した通りである。これによって、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を産生する。調製されたニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を含む培養物の使用形態としては、調製された培養物そのままで使用する形態、当該培養物から菌体を分離して使用する形態、菌体を破砕して使用する形態、及びニコチンアミドリボシドを単離して使用する形態が挙げられる。分離方法としては、例えば遠心分離法、膜ろ過法等が挙げられる。菌体破砕法としては、ビーズ破砕法等が挙げられる。単離法としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー技術、塩析、溶媒沈殿等が挙げられる。

【0056】

４．ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤；飲食品、化粧品又は医薬品
ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法により得られるニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物、当該培養物から分離された菌体、当該菌体の破砕物、及び／又は当該破砕物から単離されたニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドは、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの強化を目的とした食品への添加物若しくは化粧品又は医薬品の有効成分として配合される、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤として、好適に用いることができる。

【0057】

ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤は、飲食品、化粧品又は医薬品に配合して摂取、服用又は適用させることで、体内に取り込まれたニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドが、細胞がエネルギーを利用するために必要な物質であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換されることによる様々な有用な効果ができる。

【0058】

ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤は、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド以外に、他のフルクトバシラス属乳酸菌代謝物が含まれていてよい。この場合、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤は、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドに加えて、当該他のフルクトバシラス属乳酸菌代謝物の強化剤としても用いることができる。

【0059】

ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を飲食品に配合することで、飲食によってニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを効率的に摂取することができる。

【0060】

ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤が配合される飲食品については、上記「２．ニコチンアミドリボシド強化剤；飲食品、化粧品又は医薬品」に記載の通りである。

【0061】

また、当該ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を化粧品に配合することで、適用によって、ニコチンアミドリボシドによる薬理効果（老化予防等）及びニコチンアミドモノヌクレオチドによる薬理効果（細胞内ニコチンアミドモノヌクレオチド増加、老化予防等）を期待できる。

【0062】

ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤が配合される化粧品については、上記「２．ニコチンアミドリボシド強化剤；飲食品、化粧品又は医薬品」に記載の通りである。

【0063】

更に、当該食品のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を医薬品に配合することで、服用又は適用によってニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを有効成分として経口又は経皮摂取することができる。これによって、ニコチンアミドモノヌクレオチド摂取による薬理効果（加齢関連疾病等の治療又は予防等）及びニコチンアミドリボシド摂取による薬理効果（コケイン症候群及び加齢関連疾病等の治療又は予防、並びに皮膚の酸化損傷の治療又は予防等）を期待できる。

【0064】

ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤が配合される医薬品の剤型及び適用対象については、上記「２．ニコチンアミドリボシド強化剤；飲食品、化粧品又は医薬品」に記載の通りである。

【実施例0065】

以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0066】

実施例１ フルクトバシラス属乳酸菌を用いたニコチンアミドリボシドの産生
Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株を、それぞれ独立に、Ｄｉｆｃｏ社製のＭＲＳ培地（前培養培地）３ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間、静置で拡大培養した。得られた培養液をＯＤ６６０が０.０２となるように、ＭＲＳ培地（本培養培地）１５ｍｌに植菌し、３０℃で１２時間、静置で生産培養した。得られた培養液を遠心分離に供して上清と菌体とをそれぞれ回収した。回収した培養上清及び回収した菌体それぞれについて、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の定量を行った。

【0067】

（ＭＲＳ培地組成）
２ｗ／ｗ％ グルコース
１ｗ／ｗ％ プロテアーゼペプトン
１ｗ／ｗ％ 牛肉エキス
０．５ｗ／ｗ％ 酵母エキス
０．２ｗ／ｗ％ クエン酸アンモニウム
０．１ｗ／ｗ％ Ｔｗｅｅｎ８０
０．５ｗ／ｗ％ 酢酸ナトリウム
０．０１ｗ／ｗ ％硫酸マグネシウム
０．００５ｗ／ｗ％ 硫酸マンガン
０．２ｗ／ｗ％ リン酸水素二カリウム

【0068】

（上清中のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの定量）
回収した上清１５ｍｌを、同体積の４ｗ／ｗ％炭酸水素ナトリウム溶液と混合し、得られた混合液をＢｏｎｄＥｌｕｔ ＰＢＡカラム（１ｍｌ、アジレント社製）へ通液した。さらに、カラムに３ｍｌの２ｗ／ｗ％炭酸水素ナトリウム溶液を通液して洗浄を行い、次いで、３ｍｌの２ｖ／ｖ％ギ酸溶液を通液し、溶出液を回収した。溶出液２５０μｌに、１５０μｌの１.３Ｍ水酸化カリウム水溶液、及び１００μｌの２０ｗ／ｗ％アセトフェノンを加え、４℃で３０分間反応させた後、４００μｌの９８ｖ／ｖ％ギ酸水溶液を加え、１１０℃で７分間反応させることで、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの蛍光誘導体化処理を行い、後述するＨＰＬＣ条件にて分析し、上清中のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド生産量（培養液当たりの生産量；ｍｇ／Ｌ）を測定した。結果を表１に示す。なお、表１中、ｎ．ｄ．は、不検出であったことを示す。

【0069】

（菌体内のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの定量）
回収した菌体を１０ｍｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。回収した菌体を０.５ｍｌの０.１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）に懸濁し、０.１ｍｍのジルコニアビーズを等量添加した後、ビーズ破砕機にて菌体を破砕した。破砕した菌体を遠心分離にて分離し、上清（菌体破砕抽出液）を回収した。菌体破砕抽出液２５０μｌに、１５０μｌの１.３Ｍ水酸化カリウム水溶液及び１００μｌの２０ｗ／ｗ％アセトフェノンを加え、４℃で３０分間反応させた後、４００μｌの９８ｖ／ｖ％ギ酸水溶液を加え、１１０℃で７分間反応させることで、コチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの蛍光誘導体化処理を行い、後述するＨＰＬＣ条件にて分析し、回収菌体中のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド生産量（菌体当たりの生産量；ｍｇ／乾燥菌体１ｇ当り）を測定した。結果を表１に示す。

【0070】

（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：ＹＭＣ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８（４.６×１５０ｍｍ）
カラム温度：３０℃
溶離液Ａ：０.１ｖ／ｖ％ギ酸の水溶液
溶離液Ｂ：０.１ｖ／ｖ％ギ酸のアセトニトリル溶液
グラジエント条件：０分（溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９：１（体積比））から１５分（溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝３：７（体積比））へのグラジエント
流速：１ｍｌ/ｍｉｎ
検出器：蛍光検出器（Ｅｘ：３２０ｎｍ、Ｅｍ：４５８ｎｍ）
検出時間：４．３分（ニコチンアミドモノヌクレオチドの場合）５.１分（ニコチンアミドリボシドの場合）

【0071】

【表1】

【0072】

表１から明らかなとおり、フルクトースを含まない培地を用いて得られた培養物においては、菌体内からはニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）のいずれも検出されず、上清中からはニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）が検出されなかった一方で、上清中からニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の特異的産生が確認できた。また、中でもＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株、特にＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株から、多くのニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の産生が確認できた。

【0073】

実施例２ フルクトバシラス属乳酸菌を用いたニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの産生
本培養培地に２ｗ／ｗ％のフルクトースを添加したこと以外は実施例１と同様の方法で、培養、培養上清及び菌体の回収、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの定量を行った。結果を表２に示す。

【0074】

【表2】

【0075】

表２から明らかなとおり、フルクトースを含む培地を用いて得られた培養物においては、上清からはニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）のいずれも検出されなかった一方で、菌体内でのニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の特異的産生が確認できた。また、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株、特にＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株からは、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の両方がバランスよく産生された。一方、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株、特にＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株からは、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の両方が産生するとともに、これらのうちニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の比率がとりわけ高くなるように産生したことが確認できた。

【手続補正書】

【提出日】2025-03-11

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の培養を行い、ニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製する工程を含む、ニコチンアミドリボシドの製造方法。

【請求項2】

前記培養を、フルクトースを含まない培地にて行う、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、請求項１又は２に記載の製造方法。

【請求項4】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項１又は２に記載の製造方法。

【請求項5】

フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌と、ニコチンアミドリボシドと、培地成分とを含有する、及び／又は
ニコチンアミドリボシドと、ニコチンアミドリボシド以外の、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の代謝物と、を含有する、ニコチンアミドリボシド強化剤。

【請求項6】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、請求項５に記載の強化剤。

【請求項7】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項５に記載の強化剤。

【請求項8】

請求項５～７のいずれかに記載のニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品。

【請求項9】

フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の培養を行う工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法。

【請求項10】

前記培養を、フルクトースを含む培地にて行う、請求項９に記載の製造方法。

【請求項11】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、請求項９又は１０に記載の製造方法。

【請求項12】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項９又は１０に記載の製造方法。

【請求項13】

フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌と、ニコチンアミドモノヌクレオチド及び／又はニコチンアミドリボシドと、培地成分とを含有する、並びに／若しくは、
ニコチンアミドモノヌクレオチド及び／又はニコチンアミドリボシドが菌体内に蓄積したフルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌及び／又はその破砕物を含有する、
ニコチンアミドモノヌクレオチド及び／又はニコチンアミドリボシド強化剤。

【請求項14】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｏｐａｅｏｉｌ ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、請求項１３に記載の強化剤。

【請求項15】

前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｉｏｎｉｓ ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項１３に記載の強化剤。

【請求項16】

請求項１３～１５のいずれかに記載のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品。