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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025076431
(43)【公開日】2025-05-15
(54)【発明の名称】三次元皮膚組織の作製方法、及び三次元皮膚組織
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20250508BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20250508BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250508BHJP
C12N 5/02 20060101ALI20250508BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/0735
C12N5/10
C12N5/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2025006794
(22)【出願日】2025-01-17
(62)【分割の表示】P 2024560451の分割
【原出願日】2024-10-10
(31)【優先権主張番号】P 2023186507
(32)【優先日】2023-10-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000113470
【氏名又は名称】ポーラ化成工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110004163
【氏名又は名称】弁理士法人みなとみらい特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】白井 悠暉
(72)【発明者】
【氏名】森 葵
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼橋 萌奈
(72)【発明者】
【氏名】望月 麻友
(72)【発明者】
【氏名】久下 貴之
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】本発明は、幹細胞から、表皮層及び真皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を作製する新規の技術を提供することを課題とする。
【解決手段】上記課題を解決する本発明は、真皮層及び表皮層が積層した三次元皮膚組織を作製する皮膚組織形成工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法であって、
前記皮膚組織形成工程は、幹細胞を浮遊培養して得られた三次元培養物を、培養液を透過可能な膜を備えた培養容器の前記膜上に切開せずに配置し、培養することにより、少なくとも真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を得る、三次元培養工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法である。
【選択図】図１
【解決手段】上記課題を解決する本発明は、真皮層及び表皮層が積層した三次元皮膚組織を作製する皮膚組織形成工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法であって、
前記皮膚組織形成工程は、幹細胞を浮遊培養して得られた三次元培養物を、培養液を透過可能な膜を備えた培養容器の前記膜上に切開せずに配置し、培養することにより、少なくとも真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を得る、三次元培養工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
真皮層及び表皮層が積層した三次元皮膚組織を作製する皮膚組織形成工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法であって、
前記皮膚組織形成工程は、幹細胞を浮遊培養して得られた三次元培養物を、培養液を透過可能な膜を備えた培養容器の前記膜上に切開せずに配置し、培養することにより、少なくとも真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を得る、三次元培養工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法。
前記皮膚組織形成工程は、幹細胞を浮遊培養して得られた三次元培養物を、培養液を透過可能な膜を備えた培養容器の前記膜上に切開せずに配置し、培養することにより、少なくとも真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を得る、三次元培養工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項2】
前記幹細胞の分化誘導の開始から１～２０日経過後に、前記三次元培養工程を実施する、請求項１に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項3】
前記三次元培養工程では、気液界面培養、及び／又は、前記膜を隔てて上方と下方に異なる培養液を充填した二層液間培養を行う、請求項１又は２に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項4】
前記二層液間培養では、前記膜の上方に上皮細胞用培地を充填し、前記三次元培養物の上部を前記上皮細胞用培地と接触させて培養する、請求項３に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項5】
前記三次元培養工程において、真皮層の上方に表皮層が積層した前記三次元皮膚組織を得る、請求項１～４の何れか一項に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項6】
前記皮膚組織形成工程は、
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達のアンタゴニスト、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアゴニストから選ばれる１種又は２種以上の因子を含む第１分化培地で幹細胞を含むスフェロイドを培養し、非神経外胚葉上皮の形成を誘導する第１誘導工程と、
前記第１誘導工程を経た三次元培養物を、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアンタゴニストを含む第２分化培地で培養し、前記三次元培養物を高次な構造に誘導する工程を含む、請求項１～５の何れか一項に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達のアンタゴニスト、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアゴニストから選ばれる１種又は２種以上の因子を含む第１分化培地で幹細胞を含むスフェロイドを培養し、非神経外胚葉上皮の形成を誘導する第１誘導工程と、
前記第１誘導工程を経た三次元培養物を、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアンタゴニストを含む第２分化培地で培養し、前記三次元培養物を高次な構造に誘導する工程を含む、請求項１～５の何れか一項に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項7】
前記三次元培養工程において、前記膜上に配置する前記三次元培養物は、最大径が２ｍｍ以下である、請求項１～６の何れか一項に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項8】
前記三次元培養工程において、前記膜上に配置する前記三次元培養物は、毛包を有さない、請求項１～７の何れか一項に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項9】
前記三次元培養工程において、前記膜上に配置する前記三次元培養物は、間葉系細胞が未分化であるか、又は前記間葉系細胞を有する層の厚さが２００μｍ以下である、請求項１～８の何れか一項に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項10】
前記三次元皮膚組織は、ヒト由来である、請求項１～９の何れか一項に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項11】
前記三次元培養工程にて得られる前記三次元皮膚組織は、毛包を有する、請求項１～１０の何れか一項に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【請求項12】
請求項１～１１の何れか一項に記載の三次元皮膚組織の作製方法により作製された、三次元皮膚組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は幹細胞から三次元皮膚組織を作製する技術に関する。
【背景技術】
【0002】
皮膚移植用組成物としての応用や、医薬品又は化粧品の有効成分のスクリーニングツールとして応用するために皮膚オルガノイドの作製技術の開発が進められている。
現在までに未分化細胞や変異導入細胞を用いて生体内の上皮構造に類似したオルガノイドを作製する技術（非特許文献１）、上皮と間質を共に有するオルガノイドを作製する技術（非特許文献２）、内部に血管網を有するオルガノイドを作製する技術（非特許文献３、非特許文献４、特許文献１）などが提案されている。
特に非特許文献５及び特許文献２には上皮層と真皮層の多層構造を備える皮膚オルガノイドの作製技術が提案されている。
現在までに未分化細胞や変異導入細胞を用いて生体内の上皮構造に類似したオルガノイドを作製する技術（非特許文献１）、上皮と間質を共に有するオルガノイドを作製する技術（非特許文献２）、内部に血管網を有するオルガノイドを作製する技術（非特許文献３、非特許文献４、特許文献１）などが提案されている。
特に非特許文献５及び特許文献２には上皮層と真皮層の多層構造を備える皮膚オルガノイドの作製技術が提案されている。
【0003】
また、非特許文献６には、非特許文献５の手法により得られた、表皮層が内側に形成された球状の皮膚オルガノイドを切開し、セルカルチャーインサート上で培養する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開２０１３／０４７６３９号
【特許文献2】国際公開２０１７／０７０５０６号
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｓａｔｏ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５９，ｐｐ２６２－２６５，２００９
【非特許文献2】Ｓｐｅｎｃｅ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７０，ｐｐ１０５－１０９，２０１１
【非特許文献3】Ｔａｋｅｂｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９９，ｐｐ４８１－４８４，２０１３
【非特許文献4】Ｔａｋｅｂｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １６，ｐｐ５５６－５６５，２０１５
【非特許文献5】Ｊ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５８２，ｐｐ３９９－４０４，２０２０
【非特許文献6】Ｓｏｎｇ－ｙｉ Ｊ ｅｔ ｌａ．，ｉＳｃｉｅｎｃｅ．２５（１０），１０５１５０，２０２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記先行技術のあるところ、本発明は、幹細胞から、表皮層及び真皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を作製する新規の技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記課題を解決する本発明、及びその好ましい形態は、以下の通りである。
［１］真皮層及び表皮層が積層した三次元皮膚組織を作製する皮膚組織形成工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法であって、
前記皮膚組織形成工程は、幹細胞を浮遊培養して得られた三次元培養物を、培養液を透過可能な膜を備えた培養容器の前記膜上に切開せずに配置し、培養することにより、少なくとも真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を得る、三次元培養工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法。
［１］真皮層及び表皮層が積層した三次元皮膚組織を作製する皮膚組織形成工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法であって、
前記皮膚組織形成工程は、幹細胞を浮遊培養して得られた三次元培養物を、培養液を透過可能な膜を備えた培養容器の前記膜上に切開せずに配置し、培養することにより、少なくとも真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を得る、三次元培養工程を含む、三次元皮膚組織の作製方法。
【0008】
幹細胞を培養して得た三次元培養物を、切開せずに膜上で培養することで、真皮層と表皮層が積層した三次元皮膚組織を簡便に得ることができる。
【0009】
［２］前記幹細胞の分化誘導の開始から１～２０日経過後に、前記三次元培養工程を実施する、［１］に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
上記形態とすることで、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
上記形態とすることで、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
【0010】
［３］前記三次元培養工程では、気液界面培養、及び／又は、前記膜を隔てて上方と下方に異なる培養液を充填した二層液間培養を行う、［１］又は［２］に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
上記形態とすることにより、真皮層及び表皮層の層構造を備える三次元皮膚組織を効率よく得ることができる。
上記形態とすることにより、真皮層及び表皮層の層構造を備える三次元皮膚組織を効率よく得ることができる。
【0011】
［４］前記二層液間培養では、前記膜の上方に上皮細胞用培地を充填し、前記三次元培養物の上部を前記上皮細胞用培地と接触させて培養する、［３］に記載の三次元皮膚組織の作製方法。
上記形態とすることにより、三次元培養物の上部にて表皮層を構成する細胞の分化を促進することで、真皮層及び表皮層の層構造を備える三次元皮膚組織を効率よく得ることができる。
上記形態とすることにより、三次元培養物の上部にて表皮層を構成する細胞の分化を促進することで、真皮層及び表皮層の層構造を備える三次元皮膚組織を効率よく得ることができる。
【0012】
［５］前記三次元培養工程において、真皮層の上方に表皮層が積層した前記三次元皮膚組織を得る、［１］～［４］の何れか一つに記載の三次元皮膚組織の作製方法。
かかる形態の三次元皮膚組織は、真皮層の上方に表皮層が形成され、表皮層が外界と接する形態となる。そのため、上記形態の三次元皮膚組織は、臨床又は試験ツールとして好適に用いることができる。
かかる形態の三次元皮膚組織は、真皮層の上方に表皮層が形成され、表皮層が外界と接する形態となる。そのため、上記形態の三次元皮膚組織は、臨床又は試験ツールとして好適に用いることができる。
【0013】
［６］前記皮膚組織形成工程は、
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達のアンタゴニスト、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアゴニストから選ばれる１種又は２種以上の因子を含む第１分化培地で幹細胞を含むスフェロイドを培養し、非神経外胚葉上皮の形成を誘導する第１誘導工程と、
前記第１誘導工程を経た三次元培養物を、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアンタゴニストを含む第２分化培地で培養し、前記三次元培養物を高次な構造に誘導する工程を含む、［１］～［５］の何れか一つに記載の三次元皮膚組織の作製方法。
上記形態とすることで、皮膚組織形成工程において、培養物の皮膚組織への分化を誘導することができる。
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達のアンタゴニスト、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアゴニストから選ばれる１種又は２種以上の因子を含む第１分化培地で幹細胞を含むスフェロイドを培養し、非神経外胚葉上皮の形成を誘導する第１誘導工程と、
前記第１誘導工程を経た三次元培養物を、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアンタゴニストを含む第２分化培地で培養し、前記三次元培養物を高次な構造に誘導する工程を含む、［１］～［５］の何れか一つに記載の三次元皮膚組織の作製方法。
上記形態とすることで、皮膚組織形成工程において、培養物の皮膚組織への分化を誘導することができる。
【0014】
［７］前記培養容器は、前記膜上が細胞外マトリックス成分でコーティングされる、［１］～［６］の何れか一つに記載の三次元皮膚組織の作製方法。
上記形態とすることで、培養物が真皮層と表皮層の層構造を形成するのを促進させることができる。
上記形態とすることで、培養物が真皮層と表皮層の層構造を形成するのを促進させることができる。
【0015】
［８］前記三次元皮膚組織は、ヒト由来である、［１］～［７］の何れか一つに記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【0016】
［９］［１］～［８］の何れか一項に記載の三次元皮膚組織の作製方法により作製された、三次元皮膚組織。
【0017】
［１０］前記三次元培養工程において、前記膜上に配置する前記三次元培養物は、最大径が２ｍｍ以下である、［１］～［８］の何れか一つに記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【0018】
［１１］前記三次元培養工程において、前記膜上に配置する前記三次元培養物は、毛包を有さない、［１］～［８］及び［１０］の何れか一つに記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【0019】
［１２］前記三次元培養工程において、前記膜上に配置する前記三次元培養物は、間葉系細胞が未分化であるか、又は前記間葉系細胞を有する層の厚さが２００μｍ以下である、［１］～［８］及び［１０］～［１１］の何れか一つに記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【0020】
［１３］前記三次元培養工程にて得られる前記三次元皮膚組織は、毛包を有する、［１］～［８］、［１０］～［１２］の何れか一つに記載の三次元皮膚組織の作製方法。
【0021】
［１４］［１］～［８］及び［１０］～［１３］の何れか一つに記載の三次元皮膚組織の作製方法により作製された、三次元皮膚組織。
［１５］毛包を有する、［１４］に記載の三次元皮膚組織。
［１５］毛包を有する、［１４］に記載の三次元皮膚組織。
【発明の効果】
【0022】
本発明によれば、表皮層及び真皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】本発明の三次元皮膚組織の作製方法の工程フローの好ましい実施形態を示す図である。
【図2】三次元培養工程Ｓ２４における、気液界面培養を行う様子を模式的に示す図である。
【図3】三次元培養工程Ｓ２４における、二層液間培養を行う様子を模式的に示す図である。
【図4】試験例１の実施例１における、誘導開始から２７日目の三次元皮膚組織の免疫組織染色の結果を示す蛍光写真である。スケールバーは２００μｍである。
【図5】試験例２における、毛包を有する三次元皮膚組織の免疫組織染色の結果を示す蛍光写真である。図５（ａ）は誘導開始から１１６日目の実施例１０であり、（ｂ）は誘導開始から１１６日目の実施例１１であり、（ｃ）は誘導開始から１１７日目の実施例１２である。スケールバーは１００μｍである。破線はカルチャーインサートの膜の位置を示し、＊は毛包の位置を示す。
【図6】試験例３における、スフェロイドの皮膚組織への分化誘導過程を示す、免疫組織染色後の蛍光写真である。スケールバーは１００μｍである。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本発明は幹細胞から三次元皮膚組織を作製するものである。以下、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は以下に説明する実施形態に限定されず、発明の範囲内において適宜変更可能である。
【0025】
本実施形態では、本発明の三次元皮膚組織の作製方法は、大別して幹細胞のスフェロイドを得るスフェロイド形成工程Ｓ１と、当該スフェロイドを培養して三次元皮膚組織を形成する皮膚組織形成工程Ｓ２を備える。該皮膚組織形成工程Ｓ２は、誘導培地を用いてスフェロイドを培養する工程（第１分化培地で培養する第１誘導工程Ｓ２１、任意で、第２分化培地で培養する第２誘導工程Ｓ２２、及び任意で、より高度な構造に誘導する第３誘導工程Ｓ２３）と、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を形成させる三次元培養工程Ｓ２４を含む。
【0026】
図１は、本発明の三次元皮膚組織の培養方法における、４つの好ましい実施形態を示す。
【0027】
第１の実施形態では、スフェロイド形成工程Ｓ１、第１誘導工程Ｓ２１、第２誘導工程Ｓ２２、三次元培養工程Ｓ２４を順に実施する（図１（ａ））。第１の実施形態における三次元培養工程Ｓ２４は、第２分化培地で培養する誘導ステップＳ２４１と、真皮層及び表皮層が積層したより高次な構造を誘導する成熟ステップＳ２４２を含む。
【0028】
第２の実施形態では、スフェロイド形成工程Ｓ１、第１誘導工程Ｓ２１、第２誘導工程Ｓ２２、及び三次元培養工程Ｓ２４を順に実施する（図１（ｂ））。第２の実施形態における三次元培養工程Ｓ２４は、上記成熟ステップＳ２４２を含む。
【0029】
第３の実施形態では、スフェロイド形成工程Ｓ１、第１誘導工程Ｓ２１、第２誘導工程Ｓ２２、第３誘導工程Ｓ２３、及び三次元培養工程Ｓ２４を順に実施する（図１（ｃ））。第３の実施形態における三次元培養工程Ｓ２４は、上記成熟ステップＳ２４２を含む。
【0030】
第４の実施形態では、スフェロイド形成工程Ｓ１、第１誘導工程Ｓ２１、及び三次元培養工程Ｓ２４を順に実施する（図１（ｄ））。第４の実施形態における三次元培養工程Ｓ２４は、上記誘導ステップＳ２４１と成熟ステップＳ２４２を含む。
【0031】
なお、本実施形態では、スフェロイド形成工程Ｓ１を含む形態を例示しているが、本発明では予め作製した幹細胞のスフェロイドを用いて、皮膚組織形成工程Ｓ２から実施する形態であってもよい。
【0032】
以下、本発明に使用する幹細胞及びその培養方法、並びに各工程の好ましい形態について説明する。
【0033】
＜１＞幹細胞及びその培養方法
本発明で使用する幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性幹細胞や体性幹細胞が挙げられる。
本発明で使用する幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性幹細胞や体性幹細胞が挙げられる。
【0034】
幹細胞の由来は特に限定はされず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の細胞を使用することができる。
【0035】
本発明の方法で作製する三次元皮膚組織は、ヒトへの臨床応用やヒト用の医薬品や化粧品等の評価ツールとしての応用に有効である。そのため、本発明ではヒト幹細胞を使用することが好ましい。
三次元皮膚組織を臨床のために使用する場合、幹細胞は、自家の細胞でも他家の細胞でもよいが、好ましくは自家の細胞を用いる。
三次元皮膚組織を臨床のために使用する場合、幹細胞は、自家の細胞でも他家の細胞でもよいが、好ましくは自家の細胞を用いる。
【0036】
ｉＰＳ細胞は、ある特定の核初期化因子を、当該因子をコードする核酸又はタンパク質の形態で体細胞に導入すること又は薬剤によって当該因子の内在性のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６），Ｃｅｌｌ，１２６：６６３－６７６、Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ，１３１：８６１－８７２、Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７－１９２０、Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：１０１－１０６）。
【0037】
核初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子又はＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えばＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ又はＥｓｒｒｇが例示される。これらの核初期化因子は、ｉＰＳ細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば上記核初期化因子を少なくとも１つ、好ましくは２以上含む組み合わせであり、より好ましくは３以上を含む組み合わせである。
【0038】
本発明の実施には細胞株として樹立されたヒトｉＰＳ細胞株を使用してもよい。例えば、ＣｈｉＰＳＣ７、ＣｈｉＰＳＣ１１、ＣｈｉＰＳＣ１２、ＣｈｉＰＳＣ１９、ＣｈｉＰＳＣ２０、ＣｈｉＰＳＣ２１、ＣｈｉＰＳＣ２２、ＣｈｉＰＳＣ２３、２０１Ｂ７、２０１Ｂ７－Ｆｆ、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４、１２０１Ｃ１、１２０５Ｄ１、１２１０Ｂ２、及び８３６Ｂ３から選択されるヒトｉＰＳ細胞株を本発明の方法で培養することができる。上述のヒトｉＰＳ細胞株はＣｅｌｌａｒｔｉｓ、ｉＰＳアカデミアジャパン社又は京都大学ｉＰＳ研究所から入手可能である。
【0039】
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、分化多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４－１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された。
【0040】
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、ＬＩＦ、ｂＦＧＦなどの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒト及びサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＨ．Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６－９３２、Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０－１５８５などに記載されている。また、いくつかの研究機関はＥＳ細胞の分譲を行っている。例えばヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
【0041】
体性幹細胞としては、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞及び生殖幹細胞などが挙げられる。体性幹細胞として、好ましくは間葉系幹細胞が挙げられる。なお、間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞等の間葉系の細胞全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。間葉系幹細胞としてより具体例には、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、また毛包間葉系幹細胞などを挙げることができる。
【0042】
これら幹細胞は、一次的に取得ないし樹立したものを用いてもよいし、市販されているものを使用してもよい。
【0043】
スフェロイド形成工程Ｓ１に供する前の幹細胞の培養方法は、その分化能を維持しながら培養することができれば特に限定されない。幹細胞の培養は、好ましくは付着培養法により行う。ＭＥＦ細胞などのフィーダー細胞を敷設した培養面上で幹細胞を付着培養してもよいが、フィーダーフリー条件で付着培養を行うことが好ましい。
【0044】
フィーダーフリー条件で幹細胞の付着培養を行う場合、培養面には種々の培養基質によるコーティングを施すことが好ましい。培養基質としては、例えば、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、マトリゲル、フィブリン、トロンビン等の細胞外マトリックス；ポリＬ－リシン、ポリＤ－リシン等のアミノ酸ポリマー等及びこれらの断片等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。
培養基質のうち、ラミニン及びその断片が好適である。
培養基質のうち、ラミニン及びその断片が好適である。
【0045】
ラミニン及びその断片として、ラミニン５１１（α５鎖、β１鎖、γ１鎖からなるラミニン）及びその断片を用いることが好適である。ラミニンとは、基底膜の主要な細胞接着分子であり、α鎖、β鎖、及びγ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ３量体で、分子量約８０万Ｄａの巨大な糖タンパク質である。３本のサブユニット鎖がＣ末端側で会合してコイルドコイル構造を作りジスルフィド結合によって安定化したヘテロ３量体分子をいう。よって、ラミニン５１１とは、α鎖がα５であり、β鎖がβ１であり、並びにγ鎖がγ１であるラミニンを意味する。
【0046】
ラミニンは、変異体であってもよく、インテグリン結合活性を有している変異体であれば、特に限定されない。ラミニンはヒト由来のものが好適である。ラミニン及びその断片は、インテグリンα６Ｂ１との結合活性が解離定数１０ｎＭ以下を示すものが好適である。ラミニン又はラミニン断片は、市販品を用いることが好適である。
【0047】
ラミニン断片として、ラミニン５１１をエラスターゼにて消化して得られる断片であるＥ８フラグメント（ラミニン５１１Ｅ８断片又はラミニン５１１Ｅ８ともいう）（参考文献２：Ｉｄｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００７，２８２，１１１４４－１１１５４）、遺伝子組み換えカイコ繭より発現した組み換えヒトラミニン５１１Ｅ８断片等が挙げられる。
ラミニン及びその断片のうち、ラミニン断片が好適であり、より好適にはラミニン５１１断片、さらに好適にはラミニン５１１Ｅ８断片であり、さらにヒト由来が好適である。
ラミニン及びその断片のうち、ラミニン断片が好適であり、より好適にはラミニン５１１断片、さらに好適にはラミニン５１１Ｅ８断片であり、さらにヒト由来が好適である。
【0048】
培養基質でコーティングする細胞培養器材としては、例えば、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、ボトル、プレート等が挙げられるがこれらに限定されない。当該細胞培養器材の材質は、特に限定されないが、スチレン系樹脂（ポリスチレン又はスチレン共重合体等）、ポリカーボネート、ポリオレフィン系樹脂（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、エチレン共重合体等）、（メタ）アクリル系樹脂、シリコーン樹脂、アミノ樹脂、フッ素樹脂、及びポリイミド樹脂等の合成樹脂（好適にはプラスチック）、ガラス基材から選択される１種又は２種以上が好適である。
【0049】
幹細胞を培養する際に用いる培地も限定されない。例えば、ＳｔｅｍＦｉｔＴＭＡＫ０２Ｎ（味の素)、ＳｔｅｍＳｕｒｅＴＭｈＰＳＣ（富士フイルム和光純薬）、ｍＴｅＳＲＴＭ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲＴＭ－Ｅ６（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲＴＭ－Ｅ８（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＳｔｅｍＦｌｅｘＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６ＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８ＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８ＴＭ Ｆｌｅｘ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することが好ましい。またそれらの培地に、必要に応じてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)やｎｏｒｍｏｃｉｎＴＭ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）等の抗生物質を添加することが可能である。
さらに、αＭＥＭ、ＤＭＥＭといった一般的な細胞培養基礎培地に適宜必要なＦＧＦ等の成長因子や先に挙げた抗生物質、ＨＳＡ、ＢＳＡといった種々の蛋白質等を添加して多能性幹細胞培養用に適した自作培地も使用することができる。
さらに、αＭＥＭ、ＤＭＥＭといった一般的な細胞培養基礎培地に適宜必要なＦＧＦ等の成長因子や先に挙げた抗生物質、ＨＳＡ、ＢＳＡといった種々の蛋白質等を添加して多能性幹細胞培養用に適した自作培地も使用することができる。
【0050】
ｉＭａｔｒｉｘコーティングした場合にはＳｔｅｍＦｉｔＴＭ ＡＫ０３Ｎ（味の素）が好適であり、ビトロネクチンでコーティングした場合にはＥｓｓｅｎｔｉａｌ８ＴＭ Ｆｌｅｘ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が好適であり、マトリゲルでコーティングした場合はｍＴｅＳＲＴＭ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が好適である。
【0051】
また、ＭＥＦ細胞などのフィーダー細胞上ではノックアウト血清代替物、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、及びｂ－ＦＧＦ等を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地を例示することができる。
【0052】
＜２＞スフェロイド形成工程Ｓ１
スフェロイド形成工程Ｓ１は、幹細胞のスフェロイドを形成することができれば、その具体的態様は限定されない。スフェロイド形成工程Ｓ１は、幹細胞を浮遊培養することで実施することが好ましい。
スフェロイド形成工程Ｓ１は、幹細胞のスフェロイドを形成することができれば、その具体的態様は限定されない。スフェロイド形成工程Ｓ１は、幹細胞を浮遊培養することで実施することが好ましい。
【0053】
浮遊培養とは培地中で細胞を浮遊状態で増殖させることをいう。浮遊培養の手段としては特に限定されないが、攪拌培養、静置培養もしくは攪拌培養と静置培養の組み合わせが挙げられ、さらに静置培養では必要に応じてマイクロキャリアを使用することも可能である。
【0054】
攪拌培養とは、細胞が培養基材(容器)の表面に付着するのではなく、培地中に懸濁されている状態での培養である。攪拌培養の方法としては、攪拌子あるいは攪拌羽根等によって培養液を攪拌しながら培養する方法と、培養容器自体を駆動することによって内部の培養液を間接的に流動させて培養する方法があり、前者としてはスピナーフラスコを用いた培養方法が挙げられる。
【0055】
マイクロキャリアを用いた培養とは、マイクロキャリア表面に細胞を付着させた状態での培養である。マイクロキャリアとしては、合成高分子又は天然高分子からなるものを使用することができる。マイクロキャリアは、コラーゲンやラミニンなど接着基質によって被覆されていても、被覆されていなくてもよいが、被覆されていることが好ましい。マイクロキャリアを使用してスフェロイドを形成する場合には、後述の静置培養により行うことが好ましい。
【0056】
静置培養の方法としては、スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレート（例えば、＃１７４９２５、Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に幹細胞を播種する方法が挙げられる。この静置培養に使用するスフェロイド形成用培養基材は、細胞が接着せず、さらに底部形状がＵ字状等になっており、播種された細胞がその最下部に自然に集まる構造になっていればよい。底の形状はＵ字型に限定されず、Ｖ字型、Ｍ字形、平面等の何れの形状でも使用可能であり、さらに９６ウェルに限定されるものではない。
【0057】
Ｕ字底プレートを使用する場合、幹細胞を播種した後に、遠心分離を実施してもよい。遠心力によりプレートの底に幹細胞が集まり、凝集が促進される。
【0058】
スフェロイド形成工程Ｓ１前に実施する幹細胞の維持のための培養を付着培養によって行う場合には、トリプシンやアキュターゼなどの任意の剥離剤を用いて培養面から幹細胞を剥離してから、スフェロイド形成工程Ｓ１に供する。
【0059】
スフェロイド形成工程Ｓ１において使用する培地の量及び幹細胞の数は限定されず、適宜設計することができる。例えば、スフェロイド形成用Ｕ字底９６ウェルプレートを用いる場合には、培地量は好ましくは５０～２００μｌ／ウェル、より好ましくは８０～１２０μｌ／ウェル分配し、好ましくは１０００～６０００細胞／ウェル、より好ましくは２０００～５０００細胞／ウェルで幹細胞を播種する。
【0060】
生細胞と死細胞を区別してカウントし、生細胞の数が上述したスフェロイド形成に好適な個数となるように調整する形態としてもよい。生細胞と死細胞の区別は、生細胞又は死細胞に特異的な染色試薬を用いることで容易に実施可能である。死細胞に特異的な核染色試薬としてトリパンブルーを用いることができる。
【0061】
スフェロイド形成工程Ｓ１の培養期間は、スフェロイドの形成に十分な期間であれば限定されない。培養期間は例えば、１～１０日、好ましくは１～４日とすることができる。
【0062】
スフェロイド形成工程Ｓ１で用いる培地は、上述した幹細胞培養用の培地を使用することができる。より具体的には、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ Ｆｌｅｘ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いることが好ましい。
【0063】
スフェロイド形成工程Ｓ１においては、培地にスフェロイドの形成を促進するための成分を添加してもよい。スフェロイドの形成を促進するための成分としては、Ｒｈｏ－キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤は、単細胞および細胞の小凝集体を保護する作用を有することが知られている（例えば、Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｒｍｉｔｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：６８１－６８６（２００７）を参照）。
【0064】
スフェロイド形成工程Ｓ１で好適に使用できるＲＯＣＫ阻害剤として、（Ｓ）－（＋）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジンジヒドロクロリド（非公式名：Ｈ－１１５２）、１－（５－イソキノリンスルホニル）ピペラジンヒドロクロリド（非公式名：ＨＡ－１００）、１－（５－イソキノリンスルホニル）－２－メチルピペラジン（非公式名：Ｈ－７）、１－（５－イソキノリンスルホニル）－３－メチルピペラジン（非公式名：イソＨ－７）、Ｎ－２－（メチルアミノ）エチル－５－イソキノリン－スルホンアミドジヒドロクロリド（非公式名：Ｈ－８）、Ｎ－（２－アミノエチル）－５－イソキノリンスルホンアミドジヒドロクロリド（非公式名：Ｈ－９）、Ｎ－［２－（ｐ－ブロモ－シンナミルアミノ）エチル］－５－イソキノリンスルホンアミドジヒドロクロリド（非公式名：Ｈ－８９）、Ｎ－（２－グアニジノエチル）－５－イソキノリンスルホンアミドヒドロクロリド（非公式名：Ｈ－１００４）、１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンジヒドロクロリド（非公式名：Ｈ－１０７７）、（Ｓ）－（＋）－２－メチル－４－グリシル－１－（４－メチルイソキノリニル－５－スルホニル）ホモピペラジンジヒドロクロリド（非公式名：グリシルＨ－１１５２）および（＋）－（Ｒ）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド（非公式名：Ｙ－２７６３２）が例示できるが、これらだけには限られない。
【0065】
培地中でのＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、好ましくは１～２０μＭ、より好ましくは３～１５μＭ、さらに好ましくは５～１２μＭである。
【0066】
＜３＞皮膚組織形成工程Ｓ２
皮膚組織形成工程Ｓ２は、幹細胞を分化誘導し、幹細胞のスフェロイドから真皮層と表皮層が積層した三次元皮膚組織を形成させる工程である。以下、皮膚組織形成工程Ｓ２についての説明を行う。なお、皮膚組織形成工程Ｓ２の初日、すなわち分化誘導を開始する日を「０日目」として培養期間等に関する説明を行う。
皮膚組織形成工程Ｓ２は、幹細胞を分化誘導し、幹細胞のスフェロイドから真皮層と表皮層が積層した三次元皮膚組織を形成させる工程である。以下、皮膚組織形成工程Ｓ２についての説明を行う。なお、皮膚組織形成工程Ｓ２の初日、すなわち分化誘導を開始する日を「０日目」として培養期間等に関する説明を行う。
【0067】
本実施形態において、皮膚組織形成工程Ｓ２は、幹細胞のスフェロイドを分化誘導する工程（第１誘導工程Ｓ２１、第２誘導工程Ｓ２２、及び第３誘導工程Ｓ２３）と、これらの誘導工程を経た三次元培養物から、少なくとも真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を得る、三次元培養工程Ｓ２４を含む。
本実施形態では、皮膚組織形成工程Ｓ２のうち第１誘導工程Ｓ２１の開始日が「０日目」に該当する。
本実施形態では、皮膚組織形成工程Ｓ２のうち第１誘導工程Ｓ２１の開始日が「０日目」に該当する。
【0068】
分化誘導の工程では、第１誘導工程Ｓ２１、第２誘導工程Ｓ２２及び第３誘導工程Ｓ２３は、分化誘導の条件が異なる。以下、それぞれの工程について説明する。
【0069】
＜３－１＞第１誘導工程Ｓ２１
第１誘導工程Ｓ２１は、非神経外胚葉上皮の形成を誘導する工程である。より具体的には、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達のアンタゴニスト、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアゴニストから選ばれる１種又は２種以上の因子を含む第１分化培地で培養を実施する。
第１誘導工程Ｓ２１は、非神経外胚葉上皮の形成を誘導する工程である。より具体的には、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達のアンタゴニスト、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアゴニストから選ばれる１種又は２種以上の因子を含む第１分化培地で培養を実施する。
【0070】
より具体的には、ＴＧＦβシグナル伝達のアンタゴニスト及びＦＧＦシグナル伝達のアゴニストを含み、任意で骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアゴニストを含んでいてもよい第１分化培地で培養を実施する。
【0071】
一つの実施形態では、０日目から、ＴＧＦβシグナル伝達のアンタゴニスト、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニスト及びＦＧＦシグナル伝達のアゴニストを全て含む第１分化培地で、幹細胞のスフェロイドを培養する。
【0072】
別の一つの実施形態では、第１分化培地として、第１－１分化培地と第１－２分化培地を用いる。具体的に本実施形態では、０日目ではＴＧＦβシグナル伝達のアンタゴニスト及びＦＧＦシグナル伝達のアゴニストを含む第１－１分化培地で幹細胞のスフェロイドを培養し、０日目から１日目の任意のタイミングで、さらにＢＭＰシグナル伝達のアゴニストを含む第１－２分化培地で培養を行う。
【0073】
第１分化培地は、上述した幹細胞の培養に適した培地をベースとして、上述の因子を添加することで調製することができる。第１分化培地のベースは幹細胞の培養に適した培地であれば特に制限されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６ＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が特に好適に例示できる。
【0074】
ＴＧＦβシグナル伝達のアンタゴニストとしては、ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド）、ＳＢ５２５３３４（６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－キノキサリン）、ＳＤ－２０８（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド）、ＬＤＮ－１９３１８９（４－［６－［４－（１－ピペラジニル）フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］－キノリン塩酸塩）、Ｅ－６１６４５２（２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン）、ＬＹ２１５７２９９（２－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－３－［６－アミド－キノリン－４－イル］－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール）、ＬＹ２１０９７６１（４－［５，６－ジヒドロ－２－（２－ピリジニル）－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル］－７－［２－（４－モルフォリニル）エトキシ］－キノリン）などの低分子化合物や、ＴＧＦβ受容体に特異的なＲＮＡｉ核酸、また抗ＴＧＦβ抗体が挙げられる。本発明においては、ＳＢ４３１５４２が特に好適に例示できる。
【0075】
ＴＧＦβシグナル伝達のアンタゴニストとして、上記低分子化合物を用いる場合、第１誘導工程Ｓ２１における当該低分子化合物の培地中の濃度は、好ましくは１～５０μＭ、より好ましくは３～３０μＭ、さらに好ましくは５～２０μＭである。
【0076】
ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストとしては、例えばＢＭＰ４、ＢＭＰ２及びＢＭＰ７、並びにこれらのコンジュゲート若しくは断片からなる群から選択される１種若しくは２種以上が挙げられる。特にＢＭＰ４又はそのコンジュゲート若しくは断片が好適に例示できる。
【0077】
第１誘導工程Ｓ２１における、上述したＢＭＰシグナル伝達のアゴニストの第１分化培地中の濃度は、好ましくは０～３０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１～２０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．５～１０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１～７ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２～６ｎｇ／ｍｌである。
【0078】
ＦＧＦシグナル伝達のアゴニストとしては、ＦＧＦファミリーに属するタンパク質又はそのコンジュゲート若しくは断片が挙げられる。本発明においては、ＦＧＦファミリーに属するタンパク質として、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９などが好適に例示でき、このうちｂＦＧＦが特に好適に例示できる。
【0079】
第１誘導工程Ｓ２１における、上述したＦＧＦシグナル伝達のアゴニストの第１分化培地中の濃度は、好ましくは０．１～２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１～１０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２～６ｎｇ／ｍｌである。
【0080】
第１分化培地には、さらに細胞外マトリックス成分を添加してもよい。細胞外マトリックス成分は基底膜抽出物（ＢＭＥ）であってもよい。また、具体的には、細胞外マトリックス成分として、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン（ナイトジェン）、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどが挙げられる。
これら細胞外マトリックス成分を含む試薬として、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社等）を使用することができる。
これら細胞外マトリックス成分を含む試薬として、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社等）を使用することができる。
【0081】
また、本発明において、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）とは、エンゲルブレス－ホルム－スウォーム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ）（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から得た可溶性調製物のことをいう。マトリゲルの調製には、ＤＭＥＭが用いられることが好ましく、例えば、ＤＭＥＭ（１ｇ／Ｌのグルコースを含有）を好適に用いることができる。
【0082】
第１分化培地における細胞外マトリックス成分の濃度は、好ましくは０．１～５質量％、より好ましくは０．３～３質量％、さらに好ましくは０．５～２質量％である。
【0083】
第１誘導工程Ｓ２１では、スフェロイド形成工程Ｓ１で形成したスフェロイドを第１分化培地中で浮遊培養する。浮遊培養の具体的態様は特に限定されないが、上述した静置培養にて第１誘導工程Ｓ２１を実施することが好ましい。
【0084】
好ましい実施の形態では、第１分化培地を９６ウェルＵ字底プレートに、好ましくは５０～２００μｌ／ウェル、より好ましくは８０～１５０μｌ／ウェルにて分注し、各ウェルで一つのスフェロイドを個別に培養する。
【0085】
第１誘導工程Ｓ２１の実施期間は、好ましくは１日以上、より好ましくは２日以上、さらに好ましくは３日以上である。第１誘導工程Ｓ２１を上記期間で実施することで、非神経外胚葉上皮をより良好に形成することができる。
また、第１誘導工程Ｓ２１の実施期間は、好ましくは７日以下、より好ましくは５日以下、さらに好ましくは４日以下である。上記期間は、非神経外胚葉上皮の形成のために十分である。
特に好ましい実施の形態では、第１誘導工程Ｓ２１の実施期間は３日である。
また、第１誘導工程Ｓ２１の実施期間は、好ましくは７日以下、より好ましくは５日以下、さらに好ましくは４日以下である。上記期間は、非神経外胚葉上皮の形成のために十分である。
特に好ましい実施の形態では、第１誘導工程Ｓ２１の実施期間は３日である。
【0086】
第１誘導工程Ｓ２１の期間中、第１分化培地の交換は任意である。上記期間で第１誘導工程Ｓ２１を実施する場合、第１分化培地の交換は不要である。
【0087】
＜３－２＞第２誘導工程Ｓ２２
第２誘導工程Ｓ２２は、第１誘導工程Ｓ２１を経た三次元培養物をさらに高次な構造に誘導する工程である。第２誘導工程Ｓ２２では、三次元培養物を浮遊培養することが好ましい。また、第２誘導工程Ｓ２２では、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアンタゴニストを含む第２分化培地を使用して培養することが好ましい。
第２誘導工程Ｓ２２は、第１誘導工程Ｓ２１を経た三次元培養物をさらに高次な構造に誘導する工程である。第２誘導工程Ｓ２２では、三次元培養物を浮遊培養することが好ましい。また、第２誘導工程Ｓ２２では、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達のアゴニスト及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達のアンタゴニストを含む第２分化培地を使用して培養することが好ましい。
【0088】
一つの実施形態では、第２分化培地は、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストを含み、任意でＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト含んでいてもよい。
【0089】
別の実施形態では、第２分化培地は、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストを含む。かかる実施形態によれば、三次元皮膚組織の形成効率を向上させることができる。
【0090】
第２誘導工程Ｓ２２で使用するＦＧＦシグナル伝達のアゴニストは、上述したＦＧＦファミリーに属するタンパク質又はそのコンジュゲート若しくは断片が挙げられる。本発明においては、ＦＧＦファミリーに属するタンパク質として、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９などが好適に例示でき、このうちｂＦＧＦが特に好適に例示できる。
第１誘導工程Ｓ２１と第２誘導工程Ｓ２２で使用するＦＧＦシグナル伝達のアゴニストは同一であることが好ましく、より好ましくは両工程ともにｂＦＧＦを使用する。
第１誘導工程Ｓ２１と第２誘導工程Ｓ２２で使用するＦＧＦシグナル伝達のアゴニストは同一であることが好ましく、より好ましくは両工程ともにｂＦＧＦを使用する。
【0091】
第２分化培地におけるＦＧＦシグナル伝達のアゴニストの濃度は、好ましくは１～１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０～８００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５０～５００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１００～３００ｎｇ／ｍｌである。
【0092】
ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストとしては、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６－［４－（２－ピペリジン－１－イル－エトキシ）フェニル］－３－ピリジン－４－イル－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン）、その誘導体（Ｐ．Ｂ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６：ＩＩ＿６０；Ｐ．Ｂ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：３３－４１；Ｊ．Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ ＯＮＥ，３（８）：ｅ２９０４）およびＬＤＮ－１９３１８９（４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリン）が例示される。好ましくは、ＬＤＮ－１９３１８９である。
【0093】
第２分化培地におけるＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストの濃度は、好ましくは０～４０００ｎＭ、より好ましくは５０～３０００ｎＭ、さらに好ましくは１００～２０００ｎＭ、さらに好ましくは５００～１５００ｎＭである。
【0094】
第２分化培地は、上述した幹細胞の培養に適した培地をベースとして、これに上述の因子を添加して調製することができる。第２分化培地のベースは特に限定されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６ＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が特に好適に例示できる。
【0095】
第２誘導工程Ｓ２２では、第１誘導工程Ｓ２１で用いた第１分化培地をすべて除去して、第２分化培地に置き換えて実施してもよい。
【0096】
一つの実施形態では、第１誘導工程Ｓ２１において浮遊培養を実施している第１分化培地に、さらに第２分化培地を添加することで、第２誘導工程Ｓ２２を開始する。
【0097】
この場合、第１誘導工程Ｓ２１の終了日（第２誘導工程Ｓ２２の開始日）において、第１分化培地に対して、好ましくは０．０１～１倍量、より好ましくは０．０５～０．５倍量、さらに好ましくは０．１～０．３倍量、さらに好ましくは０．１５～０．２５倍量の第２分化培地を添加する。
【0098】
より好ましい実施形態では、第１誘導工程Ｓ２１において浮遊培養を実施している第１分化培地に、さらに第２分化培地を添加することで、第２誘導工程Ｓ２２を開始する。そして、第２誘導工程Ｓ２２の期間中、上述の混合培地にＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストを含まない新鮮な培地を添加するか、または、前記混合培地の一部若しくは全部を前記新鮮な培地に置き換えながら、三次元培養物の培養を行う。
かかる実施形態では、第２誘導工程Ｓ２２の期間中、第２分化培地の含有成分の濃度が段階的に変更される。このように段階的に培地組成が変更されるように第２誘導工程Ｓ２２を実施することで、三次元皮膚組織の形成効率を向上させることができる。
かかる実施形態では、第２誘導工程Ｓ２２の期間中、第２分化培地の含有成分の濃度が段階的に変更される。このように段階的に培地組成が変更されるように第２誘導工程Ｓ２２を実施することで、三次元皮膚組織の形成効率を向上させることができる。
【0099】
第２誘導工程Ｓ２２の実施期間は、好ましくは１日以上であり、また、３日以上とすることができ、４日以上とすることができ、５日以上とすることができる。また、別の実施形態では、第２誘導工程Ｓ２２の実施期間は、好ましくは７日以上とすることができる。
この期間で第２誘導工程Ｓ２２を実施することで、続く三次元培養工程Ｓ２４において、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
この期間で第２誘導工程Ｓ２２を実施することで、続く三次元培養工程Ｓ２４において、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
【0100】
第２誘導工程Ｓ２２の実施期間の上限は限定されず、例えば１４日以下、より好ましくは１０日以下、さらに好ましくは９日以下とすることができる。第２誘導工程Ｓ２２の実施期間の上限は、５日以下とすることができ、４日以下とすることができ、３日以下とすることができる。
上記期間で第２誘導工程Ｓ２２を実施することで、続く三次元培養工程Ｓ２４において、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
上記期間で第２誘導工程Ｓ２２を実施することで、続く三次元培養工程Ｓ２４において、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
【0101】
ここで、本発明の第１の実施形態（図１（ａ））では、第２誘導工程Ｓ２２の実施期間は、好ましくは１～１４日間、より好ましくは１～１０日間、より好ましくは１～８日間、より好ましくは１～５日間、より好ましくは１～４日間、より好ましくは１～３日間である。
第２の実施形態及び第３の実施形態（図１（ｂ）～（ｃ））では、第２誘導工程Ｓ２２の実施期間は、好ましくは３～１４日間、より好ましくは４～１０日間、より好ましくは５～１０日間、より好ましくは７～９日間である。
上記期間で第２誘導工程Ｓ２２を実施することで、続く三次元培養工程Ｓ２４において、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
第２の実施形態及び第３の実施形態（図１（ｂ）～（ｃ））では、第２誘導工程Ｓ２２の実施期間は、好ましくは３～１４日間、より好ましくは４～１０日間、より好ましくは５～１０日間、より好ましくは７～９日間である。
上記期間で第２誘導工程Ｓ２２を実施することで、続く三次元培養工程Ｓ２４において、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
【0102】
また、一実施形態（例えば、第４の実施形態）では、第２誘導工程Ｓ２２を実施せず、第１誘導工程Ｓ２１の後、三次元培養工程Ｓ２４を行うこともできる。
【0103】
＜３－３＞第３誘導工程Ｓ２３
皮膚組織形成工程Ｓ２は、任意で、第２誘導工程Ｓ２２を経た三次元培養物をより成熟させる、第３誘導工程Ｓ２３を含んでもよい。具体的には、本発明の第３の実施形態（図１（ｃ））が該当する。
皮膚組織形成工程Ｓ２は、任意で、第２誘導工程Ｓ２２を経た三次元培養物をより成熟させる、第３誘導工程Ｓ２３を含んでもよい。具体的には、本発明の第３の実施形態（図１（ｃ））が該当する。
【0104】
第３誘導工程Ｓ２３では、浮遊培養を行うことが好ましい。
かかる浮遊培養の具体的形態は限定されず、成熟培地を充填したフラスコ、ディッシュ、シャーレ、ボトル、プレート等の培養容器でオルガノイドを浮遊培養させる形態が好ましく例示できる。培養容器は低接着表面を有するものが好ましい。
かかる浮遊培養の具体的形態は限定されず、成熟培地を充填したフラスコ、ディッシュ、シャーレ、ボトル、プレート等の培養容器でオルガノイドを浮遊培養させる形態が好ましく例示できる。培養容器は低接着表面を有するものが好ましい。
【0105】
第３誘導工程Ｓ２３は、培養容器を静置して実施してもよいが、シェイカーに載置して培養液を振とうしながら実施してもよい。シェイカーとしては、２次元軌道で振とうするオービタルシェイカーが例示できる。オービタルシェイカーの振とう速度は、例えば５０～８０ｒｐｍである。
【0106】
第３誘導工程Ｓ２３で使用する成熟培地は、いずれの細胞培養用培地を制限なく使用することができる。例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＮｅｕｒｏｂａｌｓａｌＴＭ ＭＥＤＩＵＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはこれらの混合培地が好適に例示できる。
【0107】
第３誘導工程Ｓ２３の実施期間は、好ましくは３日以上、より好ましくは４日以上、さらに好ましくは５日以上、さらに好ましくは６日以上である。
【0108】
第３誘導工程Ｓ２３の実施期間の上限は、好ましくは８日以下、より好ましくは７日以下である。
【0109】
第３誘導工程Ｓ２３の実施期間は、好ましくは３～８日、より好ましくは４～８日、さらに好ましくは５～８日、さらに好ましくは６～７日である。
【0110】
第３誘導工程Ｓ２３で使用する培地には、さらに細胞外マトリックス成分を添加してもよい。細胞外マトリックス成分は基底膜抽出物（ＢＭＥ）であってもよい。また、具体的には、細胞外マトリックス成分として、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン（ナイトジェン）、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどが挙げられる。
これら細胞外マトリックス成分を含む試薬として、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社等）を使用することができる。
これら細胞外マトリックス成分を含む試薬として、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社等）を使用することができる。
【0111】
第３誘導工程Ｓ２３で使用する培地における細胞外マトリックス成分の濃度は、好ましくは０．０５～５質量％、より好ましくは０．１～２質量％、さらに好ましくは０．３～１質量％である。
【0112】
＜３－４＞三次元培養工程Ｓ２４
三次元培養工程Ｓ２４は、浮遊培養により得た前記三次元培養物を培養することにより、少なくとも真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を得る工程である。
三次元培養工程Ｓ２４は、浮遊培養により得た前記三次元培養物を培養することにより、少なくとも真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を得る工程である。
【0113】
三次元培養工程Ｓ２４は、第１誘導工程Ｓ２１による第１分化培地での分化誘導後に実施後に開始されることが好ましい。
【0114】
三次元培養工程Ｓ２４は、分化誘導の開始から好ましくは１～２０日経過後、より好ましくは１～１８日経過後、さらに好ましくは３～１８日経過後、さらに好ましくは３～１５日経過後、特に好ましくは４～１２日経過後に開始されることが好ましい。また三次元培養工程Ｓ２４を、分化誘導の開始から５～２０日経過後、より好ましくは５～１８日経過後、さらに好ましくは６～１８日経過後に開始する形態も好ましい。
そして、一実施形態では、三次元培養工程Ｓ２４は、分化誘導の開始日から好ましくは１日以上、より好ましくは２日以上、さらに好ましくは３日以上の経過時点で開始される。また、一実施形態では、三次元培養工程Ｓ２４は、分化誘導の開始日から好ましくは２０日以下、より好ましくは１８日以下、さらに好ましくは１５日以下、さらに好ましくは１２日以下の経過時点で開始される。
そして、一実施形態では、三次元培養工程Ｓ２４は、分化誘導の開始日から好ましくは１日以上、より好ましくは２日以上、さらに好ましくは３日以上の経過時点で開始される。また、一実施形態では、三次元培養工程Ｓ２４は、分化誘導の開始日から好ましくは２０日以下、より好ましくは１８日以下、さらに好ましくは１５日以下、さらに好ましくは１２日以下の経過時点で開始される。
【0115】
すなわち、好ましい形態では、三次元培養工程Ｓ２４は、分化誘導の開始日から好ましくは１～２０日目、より好ましくは３～１８日目、さらに好ましくは３～１５日目、特に好ましくは４～１２日目に開始されることが好ましい。
【0116】
分化誘導の開始時期を上記の通りとすることで、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。さらに、三次元皮膚組織における毛包の形成を促進することができる。
なお、本発明において、「少なくとも表皮層が外界に開放された構造」とは、「真皮層が表皮層を取り囲むことで表皮層が真皮層に内包された形態」ではなく、表皮層が外界に露出している形態を示す。
なお、本発明において、「少なくとも表皮層が外界に開放された構造」とは、「真皮層が表皮層を取り囲むことで表皮層が真皮層に内包された形態」ではなく、表皮層が外界に露出している形態を示す。
【0117】
例えば第１の実施形態（図１（ａ））では、三次元培養工程Ｓ２４は、誘導開始日から５～９日目、より好ましくは５～８日目に、さらに好ましくは６～７日目に開始される。また、好ましい形態では、三次元培養工程Ｓ２４は、誘導開始日から３～１２日目、より好ましくは４～１１日目に開始されてもよい。
かかる形態とすることで、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。また、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
かかる形態とすることで、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。また、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
【0118】
第２の実施形態（図１（ｂ））では、三次元培養工程Ｓ２４は、誘導開始日から１０～１３日目、より好ましくは１２～１３日目に開始されてもよい。第３の実施形態（図１（ｃ））では、誘導開始日から１５～１９日目、より好ましくは１７～１８日目に開始されてもよい。第４の実施形態（図１（ｄ））では、誘導開始日から１～３日目、より好ましくは２～３日目に開始されてもよい。
【0119】
三次元培養工程Ｓ２４では、好ましくは、培養液を透過可能な膜を備えた培養容器の該膜上に、第１誘導工程Ｓ２１、第２誘導工程Ｓ２２又は第３誘導工程Ｓ２３を実施後の三次元培養物を切開せずに配置する。
【0120】
本発明では、前記培養容器の膜上に、立体形状を有する三次元培養物を配置する。すなわち、本発明は、単一に分離された細胞を膜上に配置するものではない。好ましい形態では、該三次元培養物は、膜上に配置する前に、切開及び細胞を分離する処理を行わず、立体形状を維持したまま膜上に配置されることが好ましい。
三次元培養物における細胞を分離する処理とは、例えば三次元培養物の細胞外マトリックスの構成成分を分解する処理であり、具体的には三次元培養物をタンパク質分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ）で処理すること、さらにはタンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素で処理することが挙げられる。
三次元培養物を膜上に配置する本発明は、細胞を分離させるための酵素処理等の手間を省くことができ、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織をより容易に得ることができる。また、かかる形態とすることにより、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造であり、毛包を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
三次元培養物における細胞を分離する処理とは、例えば三次元培養物の細胞外マトリックスの構成成分を分解する処理であり、具体的には三次元培養物をタンパク質分解酵素及び／又はコラーゲン分解酵素（コラゲナーゼ）で処理すること、さらにはタンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素で処理することが挙げられる。
三次元培養物を膜上に配置する本発明は、細胞を分離させるための酵素処理等の手間を省くことができ、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織をより容易に得ることができる。また、かかる形態とすることにより、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造であり、毛包を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
【0121】
膜上に配置する三次元培養物は、幹細胞の浮遊培養を経て得た、立体形状を有する培養物であれば細胞や組織の分化状態は特に限定されない。例えば、三次元培養物は、真皮層を形成する細胞や表皮層を形成する細胞がそれぞれ未分化の状態であってもよく、真皮層と表皮層がすでに形成されている状態であってもよい。真皮層と表皮層がすでに形成されている場合、三次元培養物は、表皮層を内側、真皮層を外側に備える形態であってもよい。
一実施形態では、膜上に配置する三次元培養物は、上皮系細胞のみが分化した球状の形態であってもよく、上皮系細胞を含む層を取り囲むように間葉系細胞を含む層が形成され、該上皮系細胞を含む層が間葉系細胞を含む層に内包された球状の形態であってもよい。
一実施形態では、膜上に配置する三次元培養物は、上皮系細胞のみが分化した球状の形態であってもよく、上皮系細胞を含む層を取り囲むように間葉系細胞を含む層が形成され、該上皮系細胞を含む層が間葉系細胞を含む層に内包された球状の形態であってもよい。
【0122】
第１誘導工程Ｓ２１を経て得た三次元培養物は、培養物の表層に非神経外胚葉上皮が形成されている。すなわち、一実施形態では、三次元培養工程Ｓ２４において、好ましくは非神経外胚葉上皮が形成された三次元培養物を、膜上に配置する。また、膜上に配置する三次元培養物は、非神経外胚葉上皮、表皮前駆細胞、頭蓋プラコード、神経外胚葉及び間葉系細胞から選択される１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種全てを含むものを用いることもできる。
【0123】
また、別の実施形態では、三次元培養工程Ｓ２４において、表皮角化細胞及び／又は線維芽細胞を含む三次元培養物を、膜上に配置することもできる。
【0124】
一実施形態では、膜上に配置する三次元培養物は、毛包を有さないものであることが好ましい。すなわち、膜上に配置する三次元培養物は、毛包が分化していないものであることが好ましい。
毛包が未分化の未熟な三次元培養物を用いることで、該三次元培養物を膜上で培養するのみで、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織を、容易に得ることができる。
毛包が未分化の未熟な三次元培養物を用いることで、該三次元培養物を膜上で培養するのみで、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織を、容易に得ることができる。
【0125】
一実施形態では、膜上に配置する三次元培養物は、球形の形状であることが好ましい。球形の三次元培養物は、細胞が凝集して形成される、略球形の形状を含む。
球形の三次元培養物を用いる場合、該三次元培養物の最大径は、２ｍｍ以下であることが好ましく、１．５ｍｍ以下であることがより好ましく、１．３ｍｍ以下であることがより好ましく、１ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
かかる形態とすることで、該三次元培養物を膜上で培養するのみで、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。さらに、三次元皮膚組織における毛包の形成を促進することができる。
三次元培養物の最大径は、画像解析により測定することができる。
球形の三次元培養物を用いる場合、該三次元培養物の最大径は、２ｍｍ以下であることが好ましく、１．５ｍｍ以下であることがより好ましく、１．３ｍｍ以下であることがより好ましく、１ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
かかる形態とすることで、該三次元培養物を膜上で培養するのみで、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。さらに、三次元皮膚組織における毛包の形成を促進することができる。
三次元培養物の最大径は、画像解析により測定することができる。
【0126】
なお、球形の三次元培養物を用いる場合における、三次元培養物の最大径の下限値は、特に限定されないが、１００μｍ以上としてもよく、３００μｍ以上としてもよい。
【0127】
一実施形態では、膜上に配置する三次元培養物は、間葉系細胞が未分化であるか、又は間葉系細胞を有する層の厚さが一定以下であることが好ましい。間葉系細胞を有する層の厚さは、好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは１８０μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、より好ましくは１３０μｍ以下、より好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは９０μｍ以下、より好ましくは８０μｍ以下、より好ましくは７０μｍ以下、より好ましくは６０μｍ以下、さらに好ましくは５０μｍ以下、特に好ましくは４０μｍ以下である。
かかる形態とすることで、該三次元培養物を膜上で培養するのみで、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。さらに、三次元皮膚組織における毛包の形成を促進することができる。
一実施形態では、上記の間葉系細胞は、頭部神経堤細胞（ｃｒａｎｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｃｅｌｌ；ＣＮＣＣ）であってもよい。
かかる形態とすることで、該三次元培養物を膜上で培養するのみで、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。さらに、三次元皮膚組織における毛包の形成を促進することができる。
一実施形態では、上記の間葉系細胞は、頭部神経堤細胞（ｃｒａｎｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｃｅｌｌ；ＣＮＣＣ）であってもよい。
【0128】
膜上に配置する三次元培養物の数は特に限定されず、例えば培養容器で隔てられた１空間（例えば、マルチウェルプレートの場合には１ウェル）につき、第１誘導工程Ｓ２１を経て得た三次元培養物を１個配置してもよいし、複数配置してもよい。複数の三次元培養物を配置する場合には、１空間（１ウェル）当たり、２個以上配置してもよく、５個以上配置してもよく、１０個以上の三次元培養物を配置してもよい。
【0129】
三次元培養工程Ｓ２４で使用する培養容器に備えられた膜は、培養液を透過可能な膜であり、多孔膜を好ましく用いることができる。このような膜を備えた培養容器としては、細胞培養用プレート（例えば、２４ウェルプレート）に、多孔膜を備えたトランズウェルインサートやセルカルチャーインサートを設置したものが好ましく挙げられる。また、培養容器自体に多孔膜が備えられた形態であってもよい。
【0130】
培養容器に設けられる多孔膜は、膜の孔径が、好ましくは０．１～８μｍ、より好ましくは０．４～５μｍ、さらに好ましくは０．４～３μｍである。
【0131】
本発明で使用する膜の厚さは、特に限定されず、例えば１０～１０００μｍとすることができる。当該膜の厚さは、後述する細胞外マトリックス成分等によるコーティングの厚さによっても調節することができる。
【0132】
培養容器に設けられる膜の素材は特に限定されないが、親水性ポリテトラフルオロエチレン（Ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ，ＰＴＦＥ）、セルロース混合エステル、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート等を適宜採用できる。
【0133】
また、培養容器に備えられる膜は、細胞外マトリックス成分からなる、微細孔を有する膜であってもよい。当該細胞外マトリックス成分からなる膜は、細胞外マトリックス成分が網目構造を形成する。膜を構成する細胞外マトリックス成分は、好ましくはコラーゲンであり、より好ましくはコラーゲンＩであり、さらに好ましくはコラーゲンＩから得たアテロコラーゲンである。このような培養容器としては、ＦｉｂＣｏｌｌ（登録商標）高透過性アテロコラーゲンインサート２４ｗｅｌｌ用（株式会社高研）を細胞培養用プレートに設置したものが好ましく例示できる。
【0134】
培養容器に設けられる膜は、該膜上を細胞外マトリックス成分でコーティングされることが好ましい。使用する細胞外マトリックス成分は、コラーゲンであることが好ましく、コラーゲンＩであることがより好ましい。
細胞外マトリックス成分でコーティングした膜上で培養することで、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。また、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
細胞外マトリックス成分でコーティングした膜上で培養することで、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。また、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された構造を有する三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
【0135】
細胞外マトリックス成分としてコラーゲンを用いる場合、該コラーゲンはゲル化されていることが好ましい。
【0136】
培養容器に設けられる膜は、該膜上にフィーダー細胞が敷設されていてもよい。フィーダー細胞としては、脂肪由来間葉系幹細胞を用いることが好ましい。
【0137】
また、三次元培養工程Ｓ２４では、膜の下方に培地を充填し、該膜上で三次元培養物を培養することが好ましい。すなわち、膜の下方に充填された培地と三次元培養物を、該膜を介して接触させ、該膜を通過して培地を三次元培養物に供給することが好ましい。かかる形態とすることにより、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進することができる。
【0138】
また、三次元培養物は膜上に載置されている状態が保たれていればよい。すなわち、三次元培養物は膜上に接着していてもよいし、膜に完全には接着せず、ピペッティングや振盪により膜から浮遊する状態であってもよい。
なお、膜上にフィーダー細胞を敷設する場合、三次元培養物は膜上のフィーダー細胞に載置されている状態が保たれていればよい。
なお、膜上にフィーダー細胞を敷設する場合、三次元培養物は膜上のフィーダー細胞に載置されている状態が保たれていればよい。
【0139】
三次元培養工程Ｓ２４において、膜の上方は、上皮系細胞の分化を誘導する培養環境とすることが好ましい。好ましい実施形態では、三次元培養工程Ｓ２４では、三次元培養物について、気液界面培養、及び／又は二層液間培養を実施する。好ましくは、三次元培養工程Ｓ２４では、気液界面培養を実施する。
かかる形態とすることで、真皮層及び表皮層の層構造を備える三次元皮膚組織を効率よく得ることができる。
かかる形態とすることで、真皮層及び表皮層の層構造を備える三次元皮膚組織を効率よく得ることができる。
【0140】
図２は、気液界面培養の様子を模式的に示す図であり、図３は、二層液間培養を模式的に示す図である。図２及び３では、浮遊培養工程により得た三次元培養物Ｃを、細胞培養プレート１０のセルに設置されたセルカルチャーインサート１１上に配置した状態（ａ）と、培養を継続し、真皮層Ｌ１及び表皮層Ｌ２が形成された状態（ｂ）を示す。
【0141】
気液界面培養では、膜Ｍを隔てて下方に培養液を添加し、上方には培地を添加しない状態で培養を行う（図２）。具体的には、浮遊培養により得た三次元培養物Ｃを膜Ｍ上に配置した後、膜Ｍ上の培地を除去し、該三次元培養物の上部を気相に暴露させ、下部を培養液に接触させた状態で、培養する。
これにより、三次元培養物Ｃの上部にて表皮層Ｌ２を構成する細胞の分化が促進され、真皮層Ｌ１及び表皮層Ｌ２の層構造を備える三次元皮膚組織を効率よく得ることができる。
これにより、三次元培養物Ｃの上部にて表皮層Ｌ２を構成する細胞の分化が促進され、真皮層Ｌ１及び表皮層Ｌ２の層構造を備える三次元皮膚組織を効率よく得ることができる。
【0142】
使用する培養液は、三次元培養物Ｃの成熟に適した培地であれば特に限定されないが、上記第３誘導工程Ｓ２３で使用した成熟培地が好ましく例示できる。成熟培地には、細胞外マトリックス成分を添加してもよい。添加する細胞外マトリックス成分の好ましい形態は、上記第３誘導工程Ｓ２３で使用する培地と同様であり、具体的にはマトリゲルを使用できる。
【0143】
二層液間培養は、膜Ｍを隔てて上方と下方に異なる培養液を充填し、培養を行う方法である（図３）。二層液間培養では、膜Ｍの上方に上皮細胞用培地を充填し、三次元培養物Ｃの上部を上皮細胞用培地と接触させて培養する。
これにより、三次元培養物Ｃの上部にて表皮層Ｌ２を構成する細胞の分化が促進され、真皮層Ｌ１及び表皮層Ｌ２の層構造を備える三次元皮膚組織を効率よく得ることができる。
これにより、三次元培養物Ｃの上部にて表皮層Ｌ２を構成する細胞の分化が促進され、真皮層Ｌ１及び表皮層Ｌ２の層構造を備える三次元皮膚組織を効率よく得ることができる。
【0144】
使用する上皮細胞用培地は特に限定されず、例えば、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＫＳＦＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＥｐｉＬｉｆｅＴＭ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、角化細胞増殖培地（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ）、約５～２０％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられるが、それらに限定されない。また、適宜上皮細胞の培養において適切な成分（カルシウム、成長因子等）を添加してもよい。
【0145】
膜Ｍの下方には、成熟培地を充填することが好ましい。成熟培地の好ましい実施形態は、上記の気液界面培養と同様である。
【0146】
本発明において、三次元培養工程Ｓ２４において成熟培地を用いて培養する工程は、成熟ステップＳ２４２ともいう。成熟ステップＳ２４２では、細胞外マトリックス成分を含有する培地で培養を開始し、その後、細胞外マトリックス成分を含有しない培地で培養を行う実施形態としてもよい。
【0147】
ここで、好ましい形態では、成熟ステップＳ２４２において、成熟培地に細胞外マトリックス成分を添加した成熟培地で培養する工程と、細胞外マトリックス成分を添加しない成熟培地で培養する工程を何れも含む。
かかる実施形態の場合、細胞外マトリックス成分を含有する培地で成熟ステップＳ２４２を開始し、その１～４日後に、細胞外マトリックス成分を含有しない培地で既存の培地の全部又は一部を置換し、その後、１～４日ごとに、細胞外マトリックス成分を含有しない培地で既存の培地の全部又は一部を置換しながら、培養を継続する。
かかる実施形態の場合、細胞外マトリックス成分を含有する培地で成熟ステップＳ２４２を開始し、その１～４日後に、細胞外マトリックス成分を含有しない培地で既存の培地の全部又は一部を置換し、その後、１～４日ごとに、細胞外マトリックス成分を含有しない培地で既存の培地の全部又は一部を置換しながら、培養を継続する。
【0148】
なお、第３の実施形態（図１（ｃ））の成熟ステップＳ２４２においては、細胞外マトリックス成分を添加しない成熟培地で培養する工程を含み、細胞外マトリックス成分を添加した成熟培地で培養する工程を含まない形態とすることができる。
【0149】
また、三次元培養工程Ｓ２４は、第１分化培地での分化誘導後、第２分化培地での分化誘導の途中で開始されることが好ましい。また、三次元培養工程Ｓ２４は、第１分化培地での分化誘導後に開始され、第２分化培地での分化誘導工程を含む形態であってもよい。
かかる形態において、例えば、第１の実施形態（図１（ａ））において、第２誘導工程Ｓ２２の実施期間が６～１０日に満たず、三次元培養工程Ｓ２４開始時に使用する三次元培養物が未熟である場合や、第４の実施形態（図１（ｄ））において第２誘導工程Ｓ２２を実施しない場合、三次元培養工程Ｓ２４開始時の培養では、上記成熟培地での培養前に第２誘導工程Ｓ２２で使用した第２分化培地を用いて培養する工程（誘導ステップＳ２４１）を実施することが好ましい。
かかる場合には、誘導ステップＳ２４１の気液界面培養や二層液間培養において膜の下方に充填する培地を、第２分化培地とすることが好ましい。
かかる形態において、例えば、第１の実施形態（図１（ａ））において、第２誘導工程Ｓ２２の実施期間が６～１０日に満たず、三次元培養工程Ｓ２４開始時に使用する三次元培養物が未熟である場合や、第４の実施形態（図１（ｄ））において第２誘導工程Ｓ２２を実施しない場合、三次元培養工程Ｓ２４開始時の培養では、上記成熟培地での培養前に第２誘導工程Ｓ２２で使用した第２分化培地を用いて培養する工程（誘導ステップＳ２４１）を実施することが好ましい。
かかる場合には、誘導ステップＳ２４１の気液界面培養や二層液間培養において膜の下方に充填する培地を、第２分化培地とすることが好ましい。
【0150】
三次元培養工程Ｓ２４において誘導ステップＳ２４１を実施する場合、誘導ステップＳ２４１の実施期間は、培養物の分化状態に応じて適宜変更することができる。
本発明では、第２誘導工程Ｓ２２及び誘導ステップＳ２４１における第２分化培地を用いた培養の培養期間の合計が、好ましくは２日以上、より好ましくは５日以上、さらに好ましくは７日以上となることが好ましい。また、第２誘導工程Ｓ２２及び誘導ステップＳ２４１における第２分化培地を用いた培養の培養期間の合計は、例えば１４日以下、好ましくは１３日以下、より好ましくは１０日以下、さらに好ましくは９日以下とすることができる。具体的には、第２誘導工程Ｓ２２及び誘導ステップＳ２４１における第２分化培地を用いた培養の培養期間の合計は、例えば２～１４日、好ましくは５～１３日、より好ましくは５～１０日、さらに好ましくは７～１０日、さらに好ましくは７～９日とすることができる。
本発明では、第２誘導工程Ｓ２２及び誘導ステップＳ２４１における第２分化培地を用いた培養の培養期間の合計が、好ましくは２日以上、より好ましくは５日以上、さらに好ましくは７日以上となることが好ましい。また、第２誘導工程Ｓ２２及び誘導ステップＳ２４１における第２分化培地を用いた培養の培養期間の合計は、例えば１４日以下、好ましくは１３日以下、より好ましくは１０日以下、さらに好ましくは９日以下とすることができる。具体的には、第２誘導工程Ｓ２２及び誘導ステップＳ２４１における第２分化培地を用いた培養の培養期間の合計は、例えば２～１４日、好ましくは５～１３日、より好ましくは５～１０日、さらに好ましくは７～１０日、さらに好ましくは７～９日とすることができる。
【0151】
また、別の実施形態では、三次元培養工程Ｓ２４は、第２分化培地での分化誘導後、開始されてもよい。かかる実施形態は、例えば第２の実施形態（図１（ｂ））において、三次元培養工程Ｓ２４は、第２誘導工程Ｓ２２後に開始され、第２分化培地での培養工程を含まない形態とすることができる。
【0152】
さらに、三次元培養工程Ｓ２４は、第２分化培地での分化誘導後、成熟培地での培養の途中で開始されてもよい。かかる場合、三次元培養工程Ｓ２４は、細胞外マトリックス成分を添加した成熟培地での培養が完了後、開始される形態が好ましい。
【0153】
三次元培養工程Ｓ２４では、三次元培養物を気液界面培養、二層液間培養の何れか一方の培養法のみで培養してもよいし、２つの培養法を任意の順で行ってもよい。
【0154】
三次元培養工程Ｓ２４の実施期間は、好ましくは８日以上、より好ましくは１０日以上、さらに好ましくは１４日以上、さらに好ましくは２０日以上である。
また、毛包を有する三次元皮膚組織を得る場合には、三次元培養工程Ｓ２４の実施期間は、好ましくは９０日以上、より好ましくは１００日以上、さらに好ましくは１０５日以上である。
また、毛包を有する三次元皮膚組織を得る場合には、三次元培養工程Ｓ２４の実施期間は、好ましくは９０日以上、より好ましくは１００日以上、さらに好ましくは１０５日以上である。
【0155】
三次元培養工程Ｓ２４の実施期間の上限は、特に限定されないが、２００日以下とすることができ、１５０日以下とすることができ、１００日以下とすることができ、８０日以下とすることができる。
三次元培養工程Ｓ２４の実施期間は、例えば８～２００日間とすることができ、１０～１５０日間とすることができ、１４～１００日間とすることができ、２０～８０日間とすることができる。
三次元培養工程Ｓ２４の実施期間は、例えば８～２００日間とすることができ、１０～１５０日間とすることができ、１４～１００日間とすることができ、２０～８０日間とすることができる。
【0156】
三次元培養工程Ｓ２４の期間を上記範囲内とすることで、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進させることができる。
【0157】
三次元培養工程Ｓ２４では、非特許文献６と異なり、誘導を開始後に三次元培養物が高次に分化した皮膚組織構造を備える前に、切開せずに該三次元培養物を膜上で培養する。そのため、三次元皮膚組織の作製手順を簡素化でき、さらに所望の三次元皮膚組織を得るまでの培養期間を短縮することができる。
そして、かかる三次元培養工程Ｓ２４を有する本発明は、培養物を切開することなく簡素な方法で得られることから、大量培養等の工業的な生産に好適に応用できる。
そして、かかる三次元培養工程Ｓ２４を有する本発明は、培養物を切開することなく簡素な方法で得られることから、大量培養等の工業的な生産に好適に応用できる。
【0158】
また、皮膚組織形成工程Ｓ２では、上述の通り、第２誘導工程Ｓ２２及び／又は誘導ステップＳ２４１において、第２分化培地を用いて培養を行う。
一実施形態では、第２誘導工程Ｓ２２及び誘導ステップＳ２４１における第２分化培地による培養は、以下の形態とすることができる。
一実施形態では、第２誘導工程Ｓ２２及び誘導ステップＳ２４１における第２分化培地による培養は、以下の形態とすることができる。
【0159】
例えば、第２分化培地による培養を２日以上行う実施形態では、第２分化培地による培養開始日の２～３日後に、既存の分化培地に対して、好ましくは０．３～１倍量、より好ましくは０．４～０．８倍量、さらに好ましくは０．５～０．７倍量の、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト及びＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストを含まない新鮮な培地を追加してもよい。
その後、１～３日の間隔を空けて、既存の分化培地の好ましくは３０～７０％、より好ましくは４０～６０％を前記新鮮な培地に置換して、第２分化培地による培養を継続する。
その後、１～３日の間隔を空けて、既存の分化培地の好ましくは３０～７０％、より好ましくは４０～６０％を前記新鮮な培地に置換して、第２分化培地による培養を継続する。
【0160】
また、第２分化培地による培養では、ＢＭＰシグナル伝達のアンタゴニストを、好ましくは１～１０００ｎＭ、より好ましくは５～５００ｎＭ、さらに好ましくは１０～２５０ｎＭの濃度で含む培地で三次元培養物を培養する。
段階的に濃度を変更させながら第２分化培地による培養を実施する場合には、上記濃度範囲内で濃度の変更を行うことができる。
段階的に濃度を変更させながら第２分化培地による培養を実施する場合には、上記濃度範囲内で濃度の変更を行うことができる。
【0161】
また、第２分化培地による培養では、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニストを、好ましくは０．５～２５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２～１５０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５～７５ｎｇ／ｍｌの濃度で含む培地で三次元培養物を培養する。
段階的に濃度を変更させながら第２分化培地による培養を実施する場合には、上記濃度範囲内で濃度の変更を行うことができる。
段階的に濃度を変更させながら第２分化培地による培養を実施する場合には、上記濃度範囲内で濃度の変更を行うことができる。
【0162】
ＦＧＦシグナル伝達のアゴニストは、第１誘導工程Ｓ２１での培地中の濃度に比して、第２誘導工程Ｓ２２及び／又は誘導ステップＳ２４１における第２分化培地による培養での培地中の濃度が高くなるように調整することが好ましい。具体的には、第２誘導工程Ｓ２２及び／又は誘導ステップＳ２４１における第２分化培地による培養での培地中のＦＧＦシグナル伝達のアゴニストの濃度は、第１誘導工程Ｓ２１での培地中の濃度に対して、好ましくは１．１～２０倍、より好ましくは２～１５倍である。
段階的にＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト濃度を変更させながら第２誘導工程Ｓ２２及び／又は誘導ステップＳ２４１を実施する場合には、少なくとも第２誘導工程Ｓ２２の開始時点において上記条件を満たすように調整すればよい。
段階的にＦＧＦシグナル伝達のアゴニスト濃度を変更させながら第２誘導工程Ｓ２２及び／又は誘導ステップＳ２４１を実施する場合には、少なくとも第２誘導工程Ｓ２２の開始時点において上記条件を満たすように調整すればよい。
【0163】
このように、第２誘導工程Ｓ２２及び／又は誘導ステップＳ２４１において、第２分化培地の濃度を段階的に調節することで、真皮層と表皮層が積層した層状の三次元皮膚組織の形成を促進させることができる。
【0164】
また、三次元培養工程Ｓ２４における誘導ステップＳ２４１では、第１分化培地による培養後、第１分化培地へ第２分化培地を添加することで、第２分化培地による培養を開始してもよい。すなわち、誘導ステップＳ２４１で使用する培地は、第１分化培地に含まれる因子と第２分化培地に含まれる因子の何れも含んでいてもよい。かかる形態の好ましい実施の形態は、上述した第２誘導工程Ｓ２２における、「第１誘導工程Ｓ２１において浮遊培養を実施している第１分化培地に、さらに第２分化培地を添加することで、第２誘導工程Ｓ２２を開始する形態」と同様である。
【0165】
また、本発明において、三次元培養工程Ｓ２４では、幹細胞のスフェロイドを培養して得た三次元培養物をＷｎｔシグナル伝達のアゴニストを含む培地で培養してもよいが、Ｗｎｔシグナル伝達のアゴニストを含まない培地で培養することもできる。
非特許文献６に記載の方法では、Ｗｎｔシグナル伝達のアゴニストを添加した培地で培養することで、得られる球状の皮膚オルガノイドの大きさをより大きくし、該皮膚オルガノイドを切開しやすくさせている。一方、本発明は、幹細胞のスフェロイドを培養して得た三次元培養物を、切開せずに膜上に配置するものである。そのため、本発明では、非特許文献６に示すようにＷｎｔシグナル伝達のアゴニストを含む培地で培養する工程を含まずとも、所望の層状の三次元皮膚組織を膜上に形成させることができる。
上記Ｗｎｔシグナル伝達のアゴニストとしては、ＧＳＫ３β阻害剤、具体的にはＣＨＩＲ９９０２が挙げられる。
非特許文献６に記載の方法では、Ｗｎｔシグナル伝達のアゴニストを添加した培地で培養することで、得られる球状の皮膚オルガノイドの大きさをより大きくし、該皮膚オルガノイドを切開しやすくさせている。一方、本発明は、幹細胞のスフェロイドを培養して得た三次元培養物を、切開せずに膜上に配置するものである。そのため、本発明では、非特許文献６に示すようにＷｎｔシグナル伝達のアゴニストを含む培地で培養する工程を含まずとも、所望の層状の三次元皮膚組織を膜上に形成させることができる。
上記Ｗｎｔシグナル伝達のアゴニストとしては、ＧＳＫ３β阻害剤、具体的にはＣＨＩＲ９９０２が挙げられる。
【0166】
＜三次元皮膚組織＞
本発明によれば、表皮層と真皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を作製することできる。本発明は、上述の作製方法により作製される三次元皮膚組織自体にもある。上述の作製方法により作製し得る、本発明の三次元皮膚組織の好ましい実施形態について、以下説明する。
本発明によれば、表皮層と真皮層が積層した層状の三次元皮膚組織を作製することできる。本発明は、上述の作製方法により作製される三次元皮膚組織自体にもある。上述の作製方法により作製し得る、本発明の三次元皮膚組織の好ましい実施形態について、以下説明する。
【0167】
好ましい実施の形態では、本発明の三次元皮膚組織は、表皮層が真皮層と直接接触する。かかる実施形態の三次元皮膚組織は、生体の皮膚構造に近い構造を有するため、臨床又は試験ツールとしての応用により好適である。
【0168】
また、好ましい実施の形態では、本発明の三次元皮膚組織は、真皮層の上方に表皮層が積層した構造を有する。
このように正常な多層構造を有する三次元皮膚組織は、臨床への応用、また試験ツールとしての応用に好適である。
このように正常な多層構造を有する三次元皮膚組織は、臨床への応用、また試験ツールとしての応用に好適である。
【0169】
さらに、本発明の三次元皮膚組織は、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ少なくとも表皮層が外界に開放された形態であることが好ましい。
かかる形態の三次元皮膚組織は、膜の上部に表皮層が形成され、表皮層が外界に露出した構造となる。そのため、得られた三次元皮膚組織をそのまま生体材料や試験ツールとして利用することができる。
かかる形態の三次元皮膚組織は、真皮層が表皮層を取り囲むことで表皮層が真皮層に内包された球状の形態と区別される。
かかる形態の三次元皮膚組織は、膜の上部に表皮層が形成され、表皮層が外界に露出した構造となる。そのため、得られた三次元皮膚組織をそのまま生体材料や試験ツールとして利用することができる。
かかる形態の三次元皮膚組織は、真皮層が表皮層を取り囲むことで表皮層が真皮層に内包された球状の形態と区別される。
【0170】
また、本発明の三次元皮膚組織の表皮層は、表皮ケラチノサイトを含むことができる。また、本発明の三次元皮膚組織の真皮層は、皮膚線維芽細胞を含むことができる。
【0171】
好ましい実施の形態では、本発明の三次元皮膚組織は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ）、皮膚鞘細胞（ｄｅｒｍａｌ ｓｈｅａｔｈ ｃｅｌｌｓ）及び毛包表皮幹細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）からなる群から選択される１種又は２種以上の細胞を含んでいてもよい。
【0172】
好ましい実施の形態では、本発明の三次元皮膚組織は、毛包を有する。すなわち、好ましい実施の形態では、三次元皮膚組織は、毛包オルガノイドである。毛包は、真皮層に毛乳頭細胞を有する毛球部を形成していることが好ましい。
【0173】
＜応用＞
本発明の三次元皮膚組織は、移植用皮膚組成物として臨床応用が可能である。
すなわち、本発明は上述の三次元皮膚組織を含む、移植用皮膚組成物にもある。
本発明の三次元皮膚組織は、移植用皮膚組成物として臨床応用が可能である。
すなわち、本発明は上述の三次元皮膚組織を含む、移植用皮膚組成物にもある。
【0174】
また、本発明の三次元皮膚組織は、試験ツールとしての応用が可能である。
具体的には、本発明の三次元皮膚組織に被験物質を適用し、その解剖学的、分子生物学的な反応を観察することで、医薬品や化粧品の有効成分をスクリーニングすることができる。三次元皮膚組織への被験物質の適用方法としては、塗布や注入などが挙げられる。
すなわち、本発明は上述の三次元皮膚組織に被験物質を適用することを特徴とする、医薬品又は化粧品の有効成分のスクリーニング方法にもある。
具体的には、本発明の三次元皮膚組織に被験物質を適用し、その解剖学的、分子生物学的な反応を観察することで、医薬品や化粧品の有効成分をスクリーニングすることができる。三次元皮膚組織への被験物質の適用方法としては、塗布や注入などが挙げられる。
すなわち、本発明は上述の三次元皮膚組織に被験物質を適用することを特徴とする、医薬品又は化粧品の有効成分のスクリーニング方法にもある。
【実施例0175】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されない。
【0176】
１．試験例１
＜細胞株の培養＞
試験に使用する幹細胞として、タカラバイオ株式会社から購入したＣｅｌｌａｒｔｉｓ ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（パサージュ２１－４７）を用意した。
＜細胞株の培養＞
試験に使用する幹細胞として、タカラバイオ株式会社から購入したＣｅｌｌａｒｔｉｓ ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（パサージュ２１－４７）を用意した。
【0177】
細胞株は、実験前にマイコプラズマの検査を行い、陰性であることを確認した。細胞は、ビトロネクチン組換えヒトタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を０．５μｇ／ｃｍ２の濃度で塗布した６ウェルプレート上で培養した。
【0178】
幹細胞は、１００μｇ／ｍｌ Ｎｏｒｍｏｃｉｎを添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ８ＴＭ Ｆｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地（以下、Ｅ８培地という）で維持した。培地は、細胞のコンフルエントの程度に応じ、１日おき、または毎日補充した。細胞は約８０％コンフルエントで継代した（通常４～５日ごと）。
【0179】
細胞の継代における細胞剥離には、ＣＴＳＴＭ ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（以下、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
【0180】
また継代の際には、１０μＭ Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、アポトーシス阻害剤；Ｓｅｍｇｅｎｔ）を含むＥ８培地を用い、継代から２４時間後に、Ｙ２７６３２を含まない新鮮なＥ８培地で培地を再補充した。
【0181】
＜スフェロイド形成工程＞
ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて幹細胞を培養皿から剥離した。剥離後、１０μＭ Ｙ２７６３２を含むＥ８培地（以下、Ｅ８－１０Ｙという）中に単細胞の懸濁液として回収した。死細胞と生細胞を区別するためにＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：１（Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ：細胞懸濁液）の割合で使用し、生細胞の数を計測した。
ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて幹細胞を培養皿から剥離した。剥離後、１０μＭ Ｙ２７６３２を含むＥ８培地（以下、Ｅ８－１０Ｙという）中に単細胞の懸濁液として回収した。死細胞と生細胞を区別するためにＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：１（Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ：細胞懸濁液）の割合で使用し、生細胞の数を計測した。
【0182】
実験に必要な適切な数の生細胞を、２０μＭ Ｙ２７６３２を含むＥ８培地（以下、Ｅ８－２０Ｙ）に移した。Ｅ８－２０Ｙ細胞懸濁液を９６ウェルＵ字底プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に分注した。この際、１００μｌ／ウェル、かつ、３５００個／ウェルとなるように細胞を分配した。
【0183】
細胞を分注したプレートを１１０ｇで６分間遠心分離することにより、細胞の凝集を促進した。２４時間培養後、新しい１００μｌのＥ８培地を各ウェルに加え、Ｙ２７６３２を希釈し、細胞の増殖と凝集体の成長を促進した。
【0184】
＜皮膚組織形成工程＞
皮膚組織形成工程において、三次元培養工程の開始時期、培養形態等の条件を検討した（実施例１～９）。
皮膚組織形成工程において、三次元培養工程の開始時期、培養形態等の条件を検討した（実施例１～９）。
【0185】
［実施例１］
（第１誘導工程）
スフェロイド形成工程で得た幹細胞のスフェロイドの分化誘導を開始した。なお、以下、分化誘導の開始日（皮膚組織形成工程（第１誘導工程）の開始日）を「０日目」として説明する。
（第１誘導工程）
スフェロイド形成工程で得た幹細胞のスフェロイドの分化誘導を開始した。なお、以下、分化誘導の開始日（皮膚組織形成工程（第１誘導工程）の開始日）を「０日目」として説明する。
【0186】
０日目、分化を開始するために、すべてのスフェロイドを個別に回収し、１ウェル当たり１００μｌの分化培地が充填されている新しい９６ウェルＵ字底プレートに移し、スフェロイドを浮遊培養することで非神経外胚葉形成を開始させた。
分化培地は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６ＴＭ（以下、「Ｅ６培地」という）をベースとするものであり、２％のＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（以下、ＦＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および５．０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含む。
分化培地は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６ＴＭ（以下、「Ｅ６培地」という）をベースとするものであり、２％のＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（以下、ＦＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および５．０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含む。
【0187】
（第２誘導工程）
３日目に、頭部神経堤様細胞（ＣＮＣ細胞）の形成を誘導するために、１μＭのＬＤＮ－１９３１８９（ＢＭＰ阻害剤、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）と２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含むＥ６培地を１ウェルあたり２５μｌの量で添加し、最終的に１ウェルあたり１２５μｌの量とした。
３日目に、頭部神経堤様細胞（ＣＮＣ細胞）の形成を誘導するために、１μＭのＬＤＮ－１９３１８９（ＢＭＰ阻害剤、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）と２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含むＥ６培地を１ウェルあたり２５μｌの量で添加し、最終的に１ウェルあたり１２５μｌの量とした。
【0188】
（三次元培養工程）
６日目に、９６ウェルＵ字底プレートへ１ウェルあたり７５μlの新鮮なＥ６培地を添加し、これにより得られた培地２００μｌを２４ｗｅｌｌプレートに移した。また、同様の組成となるように、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＳＢ４３１５４２、ＦＧＦ、ＢＭＰ４及びＬＤＮ－１９３１８９を添加した新たなＥ６培地を２００μｌ作製し、２４ｗｅｌｌプレートへ添加し、１ウェル当たりの培地量を４００μｌとした（４００μｌの培地は、１％のＭａｔｒｉｇｅｌ、５μＭのＳＢ４３１５４２、２．５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１２５ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９と３３．２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含む）。さらにカルチャーインサート（ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ、径１２ｍｍ；メンブレン孔径３μｍ、ポリカーボネート製のもの、以下、「ＣＩ」という）を設置した。ＣＩは、膜上をコラーゲンでコーティングしたものを用いた。
６日目に、９６ウェルＵ字底プレートへ１ウェルあたり７５μlの新鮮なＥ６培地を添加し、これにより得られた培地２００μｌを２４ｗｅｌｌプレートに移した。また、同様の組成となるように、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＳＢ４３１５４２、ＦＧＦ、ＢＭＰ４及びＬＤＮ－１９３１８９を添加した新たなＥ６培地を２００μｌ作製し、２４ｗｅｌｌプレートへ添加し、１ウェル当たりの培地量を４００μｌとした（４００μｌの培地は、１％のＭａｔｒｉｇｅｌ、５μＭのＳＢ４３１５４２、２．５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１２５ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９と３３．２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含む）。さらにカルチャーインサート（ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ、径１２ｍｍ；メンブレン孔径３μｍ、ポリカーボネート製のもの、以下、「ＣＩ」という）を設置した。ＣＩは、膜上をコラーゲンでコーティングしたものを用いた。
【0189】
コラーゲンコーティングしたＣＩは、ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬとなるように希釈されたＣｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ｒａｔ ｔａｉｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、コラーゲンの０．０２３倍の１Ｎ ＮａＯＨを加えてゲル化したコラーゲン溶液を、５０μＬずつＣＩ上に載せ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３０分静置することで得た。
【0190】
次いで、ＣＩ上に、第２誘導工程で得られた培養物を１個ずつ置き、ＣＩ上の培地を除いた。以後、ＣＩ上方には培地を加えず、ＣＩの多孔膜を介して培養物の下部が培地と触れている状態で、気液界面培養を行った。
【0191】
８日目と１０日目に培地の半分を交換した（２００μｌの使用済み培地を取り除き、２００μｌの新鮮なＥ６培地を加えた）。
【0192】
１２日目、使用済み培地の全量を取り除き、１％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含む成熟培地４００μｌを各ウェルに添加し、気液界面培養を継続した。
【0193】
成熟培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：１の混合培地をベースとし、１×ＧｌｕｔａＭａｘＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），０．５×Ｂ－２７ ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）そして０．５×Ｎ－２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をサプリメントとして含み、０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１００μｇ／ｍｌのｎｏｒｍｏｃｉｎを含むものである。
【0194】
１５日目に、使用済み培地の半分を、１％マトリゲルを含む新鮮な成熟培地で交換した（２００μｌの使用済み培地を除去し、２００μｌの新鮮培地を添加した）。
１８日目からは３日ごとにマトリゲルを含まない新鮮な成熟培地で培地の半分を交換して気液界面培養を継続した。
１８日目からは３日ごとにマトリゲルを含まない新鮮な成熟培地で培地の半分を交換して気液界面培養を継続した。
【0195】
［実施例２］
三次元培養工程において、気液界面培養ではなく二層液間培養を行った点以外は、上記実施例１と同様の手順で行った。
三次元培養工程において、気液界面培養ではなく二層液間培養を行った点以外は、上記実施例１と同様の手順で行った。
【0196】
二層液間培養では、ＣＩ上の培地を除いた後、該ＣＩ内にＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＫＳＦＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。すなわち、ＣＩの膜を介して上方にＫＳＦＭ、下方にＥ６培地（実施例１の気液界面培養で使用したものと同一の組成のもの）が充填された状態で、培養を行った。
【0197】
８日目と１０日目に培地交換を行った。ＣＩ下方については、半量の２００μｌの使用済み培地を取り除き、２００μｌの新鮮なＥ６培地を加えた。ＣＩ上方については、使用済み培地を全量取り除き、２００μｌのＫＳＦＭを各ＣＩ上部に添加した。
【0198】
１２日目、使用済み培地の全量を取り除き、各ウェルについて、ＣＩ下部に１％マトリゲルを含む成熟培地を４００μｌ、ＣＩ上部にＫＳＦＭを２００μｌ添加し、二層液間培養を継続した。
【0199】
１５日目に、使用済み培地の交換を行った。ＣＩ下方については、半量の２００μｌの使用済み培地を除去し、１％マトリゲルを含む新鮮な成熟培地を２００μｌの新鮮培地を添加した。ＣＩ上方については、使用済み培地を全量取り除き、２００μｌのＫＳＦＭを各ＣＩ上部に添加した。
【0200】
１８日目からは３日ごとに培地交換を行った。培地交換では、ＣＩ下方についてマトリゲルを含まない新鮮な成熟培地で培地の半分を交換し、ＣＩ上方について使用済み培地の全量交換を行い、二層液間培養を継続した。
【0201】
［実施例３］
三次元培養工程において、ＣＩ上での三次元培養工程の開始時期を、誘導開始６日目から１２日目に変更した以外は、実施例２と同様の手順で実施した。以下、変更点について説明する。
三次元培養工程において、ＣＩ上での三次元培養工程の開始時期を、誘導開始６日目から１２日目に変更した以外は、実施例２と同様の手順で実施した。以下、変更点について説明する。
【0202】
（第２誘導工程）
６日目前までの工程は、実施例１及び２と同様である。
６日目、７５μｌの新鮮なＥ６培地を加え、最終容量を２００μｌにした。
８日目と１０日目に培地の半分を交換した（１００μｌの使用済み培地を取り除き、１００μｌの新鮮なＥ６培地を加えた）。
６日目前までの工程は、実施例１及び２と同様である。
６日目、７５μｌの新鮮なＥ６培地を加え、最終容量を２００μｌにした。
８日目と１０日目に培地の半分を交換した（１００μｌの使用済み培地を取り除き、１００μｌの新鮮なＥ６培地を加えた）。
【0203】
（三次元培養工程）
１２日目、使用済み培地の全量を取り除き、各ウェルについて、ＣＩ下方に１％マトリゲルを含む成熟培地を４００μｌ、ＣＩ上方にＫＳＦＭを２００μｌ添加し、二層液間培養を行った。
二層液間培養の手順は、１２日目以降の実施例２の手順と同様である。
１２日目、使用済み培地の全量を取り除き、各ウェルについて、ＣＩ下方に１％マトリゲルを含む成熟培地を４００μｌ、ＣＩ上方にＫＳＦＭを２００μｌ添加し、二層液間培養を行った。
二層液間培養の手順は、１２日目以降の実施例２の手順と同様である。
【0204】
［実施例４］
三次元培養工程において、ＣＩ上での三次元培養工程の開始時期を、誘導開始１２日目から１８日目に変更して実施した。１２日目開始前までの手順は、実施例３と同様である。以下、変更点について説明する。
三次元培養工程において、ＣＩ上での三次元培養工程の開始時期を、誘導開始１２日目から１８日目に変更して実施した。１２日目開始前までの手順は、実施例３と同様である。以下、変更点について説明する。
【0205】
（第３誘導工程）
１２日目、自己組織化を誘導するため、すべての培養物を、２４ウェル低粘着プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の個々のウェルに５００μｌずつ充填された１％マトリゲルを含む成熟培地に移した。
１２日目、自己組織化を誘導するため、すべての培養物を、２４ウェル低粘着プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の個々のウェルに５００μｌずつ充填された１％マトリゲルを含む成熟培地に移した。
【0206】
成熟培地中のオルガノイドを浮遊培養において、培地循環を一定に保つため、２４ウェルプレートは、５％ＣＯ２ ３７℃のインキュベーター内で、６５ｒｐｍで振とうするオービタルシェイカーに載置した。
【0207】
１５日目に、使用済み培地の半分を、１％マトリゲルを含む新鮮な成熟培地で交換した（２５０μｌの使用済み培地を除去し、２５０μｌの新鮮培地を添加した）。
【0208】
（三次元培養工程）
１８日目に、マトリゲルを含まない新鮮な成熟培地で培地の半分を交換した後、交換後の培地を２４ｗｅｌｌプレートに１ウェル当たり４００μｌ添加し、コラーゲンコーティングをしたＣＩを設置した。次いで、ＣＩ上に、第３誘導工程で得られた培養物を１ウェル当たり１個ずつ置き、実施例１と同様に気液界面培養を行った。
１８日目に、マトリゲルを含まない新鮮な成熟培地で培地の半分を交換した後、交換後の培地を２４ｗｅｌｌプレートに１ウェル当たり４００μｌ添加し、コラーゲンコーティングをしたＣＩを設置した。次いで、ＣＩ上に、第３誘導工程で得られた培養物を１ウェル当たり１個ずつ置き、実施例１と同様に気液界面培養を行った。
【0209】
［実施例５］
三次元培養工程において、気液界面培養ではなく二層液間培養を行った点以外は、上記実施例４と同様の手順で行った。
三次元培養工程において、気液界面培養ではなく二層液間培養を行った点以外は、上記実施例４と同様の手順で行った。
【0210】
具体的には、１８日目に、マトリゲルを含まない新鮮な成熟培地で培地の半分を交換した後、各ウェルについて、交換後の培地をＣＩの下方に４００μｌ添加した。ＣＩ上に培養物を１ウェル当たり１個ずつ配置後、ＣＩの上方にＫＳＦＭを２００μｌ添加し、二層液間培養を行った。その後、３日ごとに培地交換を行った。培地交換の方法は、実施例２の手順と同様である。
【0211】
［実施例６～９］
実施例１～３について、コラーゲンコーティングを行わないＣＩを使用する点のみを変更した形態を、実施例６～８とした。また、実施例３における三次元培養工程において、コラーゲンコーティングを行わないＣＩを用いて気液界面培養を行う実施例９も実施した。表１に、実施例１～９の培養条件の一覧を記載する。「三次元培養工程開始のタイミング」は、分化誘導の開始日からの日数（分化誘導開始日を０日とする）で記載した。
実施例１～３について、コラーゲンコーティングを行わないＣＩを使用する点のみを変更した形態を、実施例６～８とした。また、実施例３における三次元培養工程において、コラーゲンコーティングを行わないＣＩを用いて気液界面培養を行う実施例９も実施した。表１に、実施例１～９の培養条件の一覧を記載する。「三次元培養工程開始のタイミング」は、分化誘導の開始日からの日数（分化誘導開始日を０日とする）で記載した。
【0212】
【表1】
【0213】
＜免疫染色＞
実施例１～９の皮膚組織について、誘導開始から２７日目に、以下のマーカー（一次抗体）について免疫組織染色を行った。
・Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（上皮細胞の細胞間接着因子マーカー）
・ＰＤＧＦＲα（間葉系細胞のマーカー）
実施例１～９の皮膚組織について、誘導開始から２７日目に、以下のマーカー（一次抗体）について免疫組織染色を行った。
・Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（上皮細胞の細胞間接着因子マーカー）
・ＰＤＧＦＲα（間葉系細胞のマーカー）
【0214】
免疫染色は、以下の手順で実施した。
得られた皮膚組織を用いて常法により、皮膚組織の上方領域と下方領域を含むように、ＣＩの上下方向と平行に凍結切片を切り出し、該切片をＰＢＳ－Ｔで洗浄した。その後、１０％ Ｇоａｔ Ｓｅｒｕｍを添加してブロッキングを行った後、一次抗体（上記参照）を４℃で反応させた。反応後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８ ＡｎｔｉｍｏｕｓｅおよびＡｌｅｘａ６４７ Ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ）を室温で反応させた。反応後の皮膚組織をＰＢＳで洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でプレパラートに封入した。
得られた皮膚組織について、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用い、皮膚組織の染色画像を撮像した。
得られた皮膚組織を用いて常法により、皮膚組織の上方領域と下方領域を含むように、ＣＩの上下方向と平行に凍結切片を切り出し、該切片をＰＢＳ－Ｔで洗浄した。その後、１０％ Ｇоａｔ Ｓｅｒｕｍを添加してブロッキングを行った後、一次抗体（上記参照）を４℃で反応させた。反応後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８ ＡｎｔｉｍｏｕｓｅおよびＡｌｅｘａ６４７ Ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ）を室温で反応させた。反応後の皮膚組織をＰＢＳで洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でプレパラートに封入した。
得られた皮膚組織について、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用い、皮膚組織の染色画像を撮像した。
【0215】
＜結果＞
実施例１～９の三次元培養物は、真皮層と表皮層が積層している様子が観察された。すなわち、ＣＩ等の多孔膜上で未発達な三次元培養物を切開せずに培養することで、真皮層と表皮層が積層した層状の立体皮膚組織を得ることができた。
実施例１～９の三次元培養物は、真皮層と表皮層が積層している様子が観察された。すなわち、ＣＩ等の多孔膜上で未発達な三次元培養物を切開せずに培養することで、真皮層と表皮層が積層した層状の立体皮膚組織を得ることができた。
【0216】
また、図４に示す通り、実施例１において、ＰＤＧＦＲαが発現する真皮層の上に、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎが発現する表皮層が積層している様子が観察された。また、実施例１にて得られた皮膚組織は、組織の内部に表皮層が取り込まれた形態ではなく、真皮層の上方に表皮層が平らに積層していた。
【0217】
２．試験例２
試験例１と同様に＜細胞株の培養＞及び＜スフェロイド形成工程＞を実施後、下記の手順で実施例１０～１２を実施した。
試験例１と同様に＜細胞株の培養＞及び＜スフェロイド形成工程＞を実施後、下記の手順で実施例１０～１２を実施した。
【0218】
［実施例１０］
実施例１の通り、誘導開始日に第１誘導工程を行った後、誘導開始日から３日目に第２誘導工程を実施した。
次いで、誘導開始から４日目に、第２誘導工程で得られた培養物を１ウェルあたり１０個ずつ、ＣＩ上に静置した。実施例１０では、ＣＩとしてＦｉｂＣｏｌｌ（登録商標）高透過性アテロコラーゲンインサート２４ｗｅｌｌ用（株式会社高研）を用い、ＣＩのコラーゲンコーティングを実施しなかった。
以後の培養は、実施例１と同様の手順で実施し、実施例１０の三次元皮膚組織を得た。
実施例１の通り、誘導開始日に第１誘導工程を行った後、誘導開始日から３日目に第２誘導工程を実施した。
次いで、誘導開始から４日目に、第２誘導工程で得られた培養物を１ウェルあたり１０個ずつ、ＣＩ上に静置した。実施例１０では、ＣＩとしてＦｉｂＣｏｌｌ（登録商標）高透過性アテロコラーゲンインサート２４ｗｅｌｌ用（株式会社高研）を用い、ＣＩのコラーゲンコーティングを実施しなかった。
以後の培養は、実施例１と同様の手順で実施し、実施例１０の三次元皮膚組織を得た。
【0219】
［実施例１１］
実施例１１では、ＣＩとして実施例１０と同様のアテロコラーゲンインサートを用い、且つ、第２誘導工程で得られた培養物を１ウェルあたり１０個ずつ置いた。ＣＩの種類及び静置した培養物の数以外は、実施例１と同様の手順で実施例１１の三次元皮膚組織を得た。
実施例１１では、ＣＩとして実施例１０と同様のアテロコラーゲンインサートを用い、且つ、第２誘導工程で得られた培養物を１ウェルあたり１０個ずつ置いた。ＣＩの種類及び静置した培養物の数以外は、実施例１と同様の手順で実施例１１の三次元皮膚組織を得た。
【0220】
［実施例１２］
実施例９と同様の手順で培養を行い、実施例１２の三次元皮膚組織を得た。
実施例９と同様の手順で培養を行い、実施例１２の三次元皮膚組織を得た。
【0221】
＜免疫染色＞
実施例１０～１２の皮膚組織について、以下の一次抗体及び二次抗体を用いて免疫組織染色を行った。実施例１０及び１１は誘導開始から１１６日目に、実施例１２は誘導開始から１１７日目に、免疫組織染色を実施した。免疫染色は、上記試験例１と同様の手順で実施した。
実施例１０～１２の皮膚組織について、以下の一次抗体及び二次抗体を用いて免疫組織染色を行った。実施例１０及び１１は誘導開始から１１６日目に、実施例１２は誘導開始から１１７日目に、免疫組織染色を実施した。免疫染色は、上記試験例１と同様の手順で実施した。
【0222】
・上皮細胞の細胞間接着因子マーカー（実施例１０～１１）
一次抗体：Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、二次抗体：Ａｌｅｘａ４８８ Ａｎｔｉｍｏｕｓｅ
・間葉系細胞のマーカー（実施例１０～１２）
一次抗体：ＰＤＧＦＲα、二次抗体：Ａｌｅｘａ６４７ Ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ
・毛乳頭細胞のマーカー
一次抗体：ＳＯＸ２（実施例１０～１２）、二次抗体：Ａｌｅｘａ５５５ Ａｎｔｉｒａｔ（実施例１０～１１）、Ａｌｅｘａ４８８ Ａｎｔｉｍｏｕｓｅ（実施例１２）
一次抗体：Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、二次抗体：Ａｌｅｘａ４８８ Ａｎｔｉｍｏｕｓｅ
・間葉系細胞のマーカー（実施例１０～１２）
一次抗体：ＰＤＧＦＲα、二次抗体：Ａｌｅｘａ６４７ Ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ
・毛乳頭細胞のマーカー
一次抗体：ＳＯＸ２（実施例１０～１２）、二次抗体：Ａｌｅｘａ５５５ Ａｎｔｉｒａｔ（実施例１０～１１）、Ａｌｅｘａ４８８ Ａｎｔｉｍｏｕｓｅ（実施例１２）
【0223】
図５に示す通り、実施例１０～１２の三次元皮膚組織は、破線で示される膜の上方に、ＰＤＧＦＲαが発現する真皮層、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎが発現する表皮層が順に積層していた。また、当該三次元皮膚組織は、＊の位置に毛包が形成されていることが確認された。
この結果から、誘導開始から１２日目まで程度の未熟な状態でＣＩ上における培養を開始することにより、表皮層が外界に開放されるように表皮層が真皮層の上方に積層し、さらに毛包を有する、層状の三次元皮膚組織が形成されることが明らかとなった。
この結果から、誘導開始から１２日目まで程度の未熟な状態でＣＩ上における培養を開始することにより、表皮層が外界に開放されるように表皮層が真皮層の上方に積層し、さらに毛包を有する、層状の三次元皮膚組織が形成されることが明らかとなった。
【0224】
３．試験例３
上記＜スフェロイド形成工程＞で得られたスフェロイドを分化誘導した経過を、免疫組織染色により確認した。具体的には、誘導開始日から３日目、５日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目、１５日目、１８日目の培養物について、下記の抗体を用いて免疫組織染色を行った。培養物の培養は、上記の実施例４及び５と同様の手順で実施し、誘導開始から１８日目の時点では、ＣＩへ移行を行わず、染色を実施した。免疫組織染色の手順は、試験例１と同様である。
上記＜スフェロイド形成工程＞で得られたスフェロイドを分化誘導した経過を、免疫組織染色により確認した。具体的には、誘導開始日から３日目、５日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目、１５日目、１８日目の培養物について、下記の抗体を用いて免疫組織染色を行った。培養物の培養は、上記の実施例４及び５と同様の手順で実施し、誘導開始から１８日目の時点では、ＣＩへ移行を行わず、染色を実施した。免疫組織染色の手順は、試験例１と同様である。
【0225】
・上皮細胞の細胞間接着因子マーカー
一次抗体：Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、二次抗体：Ａｌｅｘａ４８８ Ａｎｔｉｍｏｕｓｅ
・間葉系細胞のマーカー
一次抗体：ＰＤＧＦＲα、二次抗体：Ａｌｅｘａ６４７ Ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ
一次抗体：Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、二次抗体：Ａｌｅｘａ４８８ Ａｎｔｉｍｏｕｓｅ
・間葉系細胞のマーカー
一次抗体：ＰＤＧＦＲα、二次抗体：Ａｌｅｘａ６４７ Ａｎｔｉｒａｂｂｉｔ
【0226】
図６は、誘導日数ごとの、各マーカーの免疫組織染色の結果を示す。誘導開始から３日目には、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎの蛍光が確認された。そして、誘導開始から１０日目にかけて、培養物が成長するとともに、凝集体の外殻が明瞭になる様子が観察された。
誘導開始から１２日目には、上皮系細胞を含む層の外側にＰＤＧＦＲαの蛍光が確認され、該上皮系細胞を含む層を囲むように間葉系細胞を含む層が形成されていた。
誘導開始から１５日目には、間葉系細胞を含む層の厚みが増していた。誘導開始から１８日目には、間葉系細胞を含む層が、誘導開始から１５日目と比べてさらに厚くなっていた。なお、誘導開始から１８日目の時点では、毛包の形成は確認されなかった。
誘導開始から１２日目には、上皮系細胞を含む層の外側にＰＤＧＦＲαの蛍光が確認され、該上皮系細胞を含む層を囲むように間葉系細胞を含む層が形成されていた。
誘導開始から１５日目には、間葉系細胞を含む層の厚みが増していた。誘導開始から１８日目には、間葉系細胞を含む層が、誘導開始から１５日目と比べてさらに厚くなっていた。なお、誘導開始から１８日目の時点では、毛包の形成は確認されなかった。
【0227】
試験例１～３の結果を踏まえると、真皮層の上方に表皮層が積層し、かつ表皮層が外界に開放された三次元皮膚組織であって、特に毛包を有する皮膚組織を得るためには、誘導開始から日数が経過しておらず、分化が進んでいない未熟な段階で、三次元培養物をＣＩ上に移行し培養することが重要であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【0228】
本発明は、臨床用又はスクリーニングツールとして有用な皮膚組織の作製技術に応用することができる。
【符号の説明】
【0229】
１０ 細胞培養プレート
１１ セルカルチャーインサート
Ｍ 膜
Ｃ 三次元培養物
Ｌ１ 真皮層
Ｌ２ 表皮層
１１ セルカルチャーインサート
Ｍ 膜
Ｃ 三次元培養物
Ｌ１ 真皮層
Ｌ２ 表皮層
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
