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2025-79222ＮＯＤ１の活性を阻害する又は発現を阻害する阻害剤を含む組成物及びこれらの阻害剤のスクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025079222
(43)【公開日】2025-05-21
(54)【発明の名称】ＮＯＤ１の活性を阻害する又は発現を阻害する阻害剤を含む組成物及びこれらの阻害剤のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20250514BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20250514BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250514BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20250514BHJP
A61P 17/10 20060101ALI20250514BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20250514BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20250514BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20250514BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20250514BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20250514BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20250514BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20250514BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61K45/06
A61K48/00
A61P17/00
A61P17/10
A61P29/00
A61P31/00
A61P37/04
A61P43/00 121
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N33/50 P
G01N33/68
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023191782
(22)【出願日】2023-11-09
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｖｏｌｕｍｅ ３６ ウェブ公開、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－ａｎｄ－ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｖｏｌ／３６／ｓｕｐｐｌ／Ｃ、論文タイトル「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｂｏｃｙｔｅｓ」、２０２３年１０月２７日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 公益社団法人 日本生化学会、「第９６回日本生化学会大会要旨閲覧システム」、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｊｂｓ２０２３／ｔｏｐ？ｌａｎｇ＝ｊａ、２０２３年１０月１７日
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】599098518
【氏名又は名称】株式会社ディーエイチシー
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】北嶋 夏子
(72)【発明者】
【氏名】仲條 嵩久
(72)【発明者】
【氏名】片吉 健史
(72)【発明者】
【氏名】辻（内藤） 健太郎
【テーマコード（参考）】
2G045
4C084
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA36
4C084AA13
4C084AA17
4C084AA20
4C084MA02
4C084MA63
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZA901
4C084ZA902
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZC751
4C084ZC752
(57)【要約】
【課題】本発明は皮膚の健全性を維持しつつ、ＮＯＤ１の阻害剤を有効成分として含む皮膚炎症、特に尋常性ざ瘡の新たな予防又は治療する組成物を提供する。また、本発明は皮膚炎症を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法も併せて提供する。
【解決手段】本発明のスクリーニング方法は、例えば（ａ）ヒト皮脂腺細胞を被験物質で処理する工程、（ｂ）ＮＯＤ１の機能（即ち、活性又は発現）を阻害するか検定する工程、及び（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の機能を阻害した被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程、を含む。
【選択図】図４
【解決手段】本発明のスクリーニング方法は、例えば（ａ）ヒト皮脂腺細胞を被験物質で処理する工程、（ｂ）ＮＯＤ１の機能（即ち、活性又は発現）を阻害するか検定する工程、及び（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の機能を阻害した被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程、を含む。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮＯＤ１に対する阻害物質を有効成分として含有する、組成物。
【請求項2】
前記ＮＯＤ１に対する阻害物質が、ＮＯＤ１活性阻害物質及び／又はＮＯＤ１発現阻害物質を含む、請求項１に記載される組成物。
【請求項3】
前記ＮＯＤ１に対する阻害物質は、ＮＯＤ１活性阻害物質とするＮＯＤ１阻害剤、及び／又はＮＯＤ１発現阻害物質とするＮＯＤ１の発現を特異的に阻害可能なアンチセンス核酸若しくは小分子量干渉ＲＮＡを含む、請求項１に記載される組成物。
【請求項4】
さらにＴＬＲ２に対する阻害物質を有効成分として含有する、請求項１に記載される組成物。
【請求項5】
前記組成物は、皮膚炎症を予防する効果又は皮膚炎症を治療する効果がある医薬組成物である、請求項１乃至請求項４のうちいずれか一項に記載される組成物。
【請求項6】
前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物は、外用医薬品又は外用医薬部外品である、請求項５に記載の組成物。
【請求項8】
前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物は、皮膚炎症を予防する効果又は皮膚炎症を治療する効果がある化粧料組成物である、請求項１乃至請求項４のうちいずれか一項に記載される組成物。
【請求項10】
前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
以下の工程を含む、皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法。
（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；
（ｂ）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程
（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；
（ｂ）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程
【請求項12】
以下の工程を含む、皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法。
（ａ）ヒト皮脂腺細胞を被験物質で処理する工程；
（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞の発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程
（ａ）ヒト皮脂腺細胞を被験物質で処理する工程；
（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞の発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程
【請求項13】
以下の工程を含む、皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法。
（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；
（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；
（ｂ１）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）と（ｂ１）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質、及び炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程
（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；
（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；
（ｂ１）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）と（ｂ１）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質、及び炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程
【請求項14】
前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、請求項１１乃至請求項１３のうちいずれか一項に記載される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質１（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－１、ＮＯＤ１）の活性を阻害する又は発現を阻害する阻害剤を含む組成物及び該阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ（以下Ｃ．ａｃｎｅｓ）は皮膚常在細菌叢を構成しているグラム陽性嫌気性桿菌である。Ｃ．ａｃｎｅｓは、尋常性ざ瘡（ニキビ）等の発症因子、あるいはその増悪因子として知られている。
【0003】
従来の日本における尋常性ざ瘡（ニキビ）の治療は、抗菌薬療法が中心となっている。２００８年に抗炎症作用を有し、レチノイド様作用を示すことで角化異常を是正するアダパレン（ａｄａｐａｌｅｎ）が、２０１５年に強い殺菌作用を有する過酸化ベンゾイル（ｂｅｎｚｏｙｌ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）が導入されたことで、従来の抗菌薬治療に加え、それら薬剤の単独または併用による治療という選択の幅が幾分か広がったが、依然として選択肢が少ない現況にある（非特許文献１）。
【0004】
近年、抗菌薬単独の長期使用は薬剤耐性Ｃ．ａｃｎｅｓの出現を生み出すことが懸念されている（非特許文献１）。また、殺菌作用のある抗菌薬の長期使用は皮膚常在菌で構成されるヒト皮膚細菌叢を変化させてしまう懸念が指摘されている（非特許文献２）。そのため、抗菌薬の長期連用を回避するために新たな治療ターゲットの特定と治療法の確立が急務となっている。
【0005】
ヒト皮脂腺細胞は皮脂腺に常駐する主要な細胞であり、パターン認識受容体（Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＰＲＲｓ）という細菌感染に対するセンサーを持っている。尋常性ざ瘡（ニキビ）では、皮脂腺内でＣ．ａｃｎｅｓ（以下アクネ菌）が増殖し、ヒト皮脂腺細胞のＰＲＲｓを介して炎症を引き起こすことが症状悪化の要因として挙げられていた。
【0006】
上述細菌感染に対するセンサーとして機能するＰＲＲｓは何種類かあり、その一種類はシグナル伝達タイプのＰＲＲｓである。シグナル伝達タイプのＰＲＲｓは主に膜結合型のＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＬＲ）及び、Ｃ型レクチン受容体（Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＬＲ）、細胞質型のＮＯＤ様受容体（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｄｏｍａｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＮＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＩＧ－Ｉ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＲＬＲ）及びＡＩＭ２様受容体（ＡＩＭ２－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＬＲ）に分類されると知られている。そのうち、ＮＯＤはほとんどの細菌細胞壁の表面に存在するペプチドグリカンの一部の断片の構造を認識し先天免疫反応の重要な役割を果たすことで知られている。そして、ＮＯＤはＮ－末端にＣＡＲＤドメインが一個存在するＮＯＤ１およびＣＡＲＤドメインが二個存在するＮＯＤ２タンパク質に分けることができる。
ｄｏｍａｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＮＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＩＧ－Ｉ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＲＬＲ）及びＡＩＭ２様受容体（ＡＩＭ２－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＬＲ）に分類されると知られている。そのうち、ＮＯＤはほとんどの細菌細胞壁の表面に存在するペプチドグリカンの一部の断片の構造を認識し先天免疫反応の重要な役割を果たすことで知られている。そして、ＮＯＤはＮ－末端にＣＡＲＤドメインが一個存在するＮＯＤ１およびＣＡＲＤドメインが二個存在するＮＯＤ２タンパク質に分けることができる。
【0007】
これまでに、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）（非特許文献３）、ＮＯＤ様受容体Ｐ３（ＮＬＲＰ３）（非特許文献４）がヒト皮脂腺細胞に発現しているＰＲＲｓとして特定されており、尋常性ざ瘡（ニキビ）の治療ターゲットとしてこれらのＰＲＲｓに対する阻害
剤が有効であるとされていた。例えば、ＰＲＲｓのＴＬＲ２の阻害剤などが開発されてきた（特許文献１）。
剤が有効であるとされていた。例えば、ＰＲＲｓのＴＬＲ２の阻害剤などが開発されてきた（特許文献１）。
【0008】
ＮＬＲファミリーであるＮＯＤ１とＮＯＤ２も細胞質内の細菌の持つ成分を認識することで、細菌の侵入を感知するセンサーとして自然免疫において重要な役割を果たしていると考えられている。
そのうち、ＮＯＤ１はグラム陰性菌に加えアクネ菌など一部のグラム陽性菌を感知するが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（以下Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）などの多くの皮膚常在菌は感知しない。また、皮膚常在菌は皮膚のＰＲＲｓを介して抗菌ペプチドを恒常的に産生しており、皮膚の健全性を維持していることが知られている（非特許文献５）。しかしながら、ヒト皮脂腺細胞においてＮＯＤ１が発現しているかについては不明であった。
そのうち、ＮＯＤ１はグラム陰性菌に加えアクネ菌など一部のグラム陽性菌を感知するが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（以下Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）などの多くの皮膚常在菌は感知しない。また、皮膚常在菌は皮膚のＰＲＲｓを介して抗菌ペプチドを恒常的に産生しており、皮膚の健全性を維持していることが知られている（非特許文献５）。しかしながら、ヒト皮脂腺細胞においてＮＯＤ１が発現しているかについては不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】特開２０１０－９９０１５
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】生物試料分析 Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ３，１５２－１５６（２０１９）
【非特許文献2】Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ Ｖｏｌｕｍｅ １３, ６２５（２０２１）
【非特許文献3】Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １３９，１２３-１３１（２０１５）
【非特許文献4】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １３４， ２７４７－２７５６（２０１４）
【非特許文献5】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １３１， １９７４－１９８０（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本願発明者らは、新たにＮＯＤ１がヒト皮脂腺細胞のＰＲＲｓとして発現していることを見出した。ヒト皮脂腺細胞のＮＯＤ１は他のＰＲＲｓと同様に炎症を引き起こすほか、ＴＬＲ２と相加的に炎症を引き起こすことが明らかとなった。ＮＯＤ１はグラム陰性菌に加えアクネ菌など一部のグラム陽性菌を認識するが、多くの皮膚常在菌は感知しないこと、即ち、ＮＯＤ１の阻害剤は増殖したアクネ菌による過剰炎症は抑制する一方で、皮膚常在菌の恒常的な役割は阻害しない点から、ＮＯＤ１の阻害剤は尋常性ざ瘡（ニキビ）の新たな予防または治療剤として提供できると思われる。
そこで本発明の課題は、新たな治療ターゲットとしてＮＯＤ１を発見したことにより、ＮＯＤ１活性を阻害する又はその遺伝子/タンパク質の発現を阻害する阻害剤を含む組成物及びこれらの阻害剤のスクリーニング方法を提供することにある。
そこで本発明の課題は、新たな治療ターゲットとしてＮＯＤ１を発見したことにより、ＮＯＤ１活性を阻害する又はその遺伝子/タンパク質の発現を阻害する阻害剤を含む組成物及びこれらの阻害剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは鋭意検討した結果、新たにＮＯＤ１がヒト皮脂腺細胞のＰＲＲｓとして発現し、ＮＯＤ１活性を阻害する及び／又はその遺伝子/タンパク質の発現を阻害する阻害剤を含む組成物及びこれらの阻害剤のスクリーニング方法を見出し、以下の発明を完成させた。
すなわち本発明は以下を包含する。
１ ＮＯＤ１に対する阻害物質を有効成分として含有する、組成物に関する。
２.前記ＮＯＤ１に対する阻害物質が、ＮＯＤ１活性阻害物質及び／又はＮＯＤ１発現阻害物質を含む、前記１に記載される組成物に関する。
３.前記ＮＯＤ１に対する阻害物質は、ＮＯＤ１活性阻害物質とするＮＯＤ１阻害剤、及
び／又はＮＯＤ１発現阻害物質とするＮＯＤ１の発現を特異的に阻害可能なアンチセンス核酸若しくは小分子量干渉ＲＮＡを含む、前記１に記載される組成物に関する。
４.さらにＴＬＲ２に対する阻害物質を有効成分として含有する、前記１に記載される組成物に関する。
５.前記組成物は、皮膚炎症を予防する効果又は皮膚炎症を治療する効果がある医薬組成物である、前記１乃至前記４のうちいずれか一項に記載される組成物に関する。
６.前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、前記５に記載の組成物に関する。
７.前記組成物は、外用医薬品又は外用医薬部外品である、前記５に記載の組成物に関する。
８.前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、前記７に記載の組成物に関する。
９.前記組成物は、皮膚炎症を予防する効果又は皮膚炎症を治療する効果がある化粧料組成物である、前記１乃至前記４のうちいずれか一項に記載される組成物に関する。
１０.前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、前記９に記載の組成物に関する。
１１.以下の工程を含む、皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法に関する。（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；（ｂ）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；及び、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
１２.以下の工程を含む、皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法に関する。（ａ）ヒト皮脂腺細胞を被験物質で処理する工程；（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞の発現量と比較する工程；及び、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
１３.以下の工程を含む、皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法に関する。（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；（ｂ１）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；及び、（ｃ）上記（ｂ）と（ｂ１）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質、及び炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
１４.前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、前記１１乃至前記１３のうちいずれか一項に記載される方法に関する。
すなわち本発明は以下を包含する。
１ ＮＯＤ１に対する阻害物質を有効成分として含有する、組成物に関する。
２.前記ＮＯＤ１に対する阻害物質が、ＮＯＤ１活性阻害物質及び／又はＮＯＤ１発現阻害物質を含む、前記１に記載される組成物に関する。
３.前記ＮＯＤ１に対する阻害物質は、ＮＯＤ１活性阻害物質とするＮＯＤ１阻害剤、及
び／又はＮＯＤ１発現阻害物質とするＮＯＤ１の発現を特異的に阻害可能なアンチセンス核酸若しくは小分子量干渉ＲＮＡを含む、前記１に記載される組成物に関する。
４.さらにＴＬＲ２に対する阻害物質を有効成分として含有する、前記１に記載される組成物に関する。
５.前記組成物は、皮膚炎症を予防する効果又は皮膚炎症を治療する効果がある医薬組成物である、前記１乃至前記４のうちいずれか一項に記載される組成物に関する。
６.前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、前記５に記載の組成物に関する。
７.前記組成物は、外用医薬品又は外用医薬部外品である、前記５に記載の組成物に関する。
８.前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、前記７に記載の組成物に関する。
９.前記組成物は、皮膚炎症を予防する効果又は皮膚炎症を治療する効果がある化粧料組成物である、前記１乃至前記４のうちいずれか一項に記載される組成物に関する。
１０.前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、前記９に記載の組成物に関する。
１１.以下の工程を含む、皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法に関する。（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；（ｂ）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；及び、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
１２.以下の工程を含む、皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法に関する。（ａ）ヒト皮脂腺細胞を被験物質で処理する工程；（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞の発現量と比較する工程；及び、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
１３.以下の工程を含む、皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法に関する。（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；（ｂ１）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；及び、（ｃ）上記（ｂ）と（ｂ１）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質、及び炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
１４.前記皮膚炎症は尋常性ざ瘡である、前記１１乃至前記１３のうちいずれか一項に記載される方法に関する。
【発明の効果】
【0013】
本発明は皮膚の健全性を維持しつつ、アクネ菌による皮膚炎症、特に尋常性ざ瘡の新たな予防又は治療する組成物を提供できる。また、本発明は皮膚炎症を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法も併せて提供する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】図１は、ヒト皮脂腺細胞におけるＮＯＤ１及びＮＯＤ２の発現を示す。図１のＡはＮＯＤ１、ＮＯＤ２とＧＡＰＤＨ遺伝子発現を検出した電気泳動写真である。図１のＢはＮＯＤ１、ＮＯＤ２とＮＬＲＰ３遺伝子の絶対発現量を示すグラフである。
【図2】図２は、ヒト皮脂腺細胞におけるＮＯＤ１又はＮＯＤ２の刺激による炎症惹起を示す。図２のＡは定量リガンド（Ｔｒｉ－ＤＡＰ及びＭＤＰ）の異なる時間の刺激による炎症性サイトカインＩＬ－８（遺伝子名、ＣＸＣＬ８）の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図２のＢは異なる濃度のリガンド（Ｔｒｉ－ＤＡＰ及びＭＤＰ）で４時間刺激による炎症性サイトカインＩＬ－８の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図２のＣは異なる濃度のリガンド（Ｔｒｉ－ＤＡＰ及びＭＤＰ）で２４時間刺激による炎症性サイトカインＩＬ－８のタンパク質発現量の変化を表すグラフである。図２のＤは定量リガンド（Ｔｒｉ－ＤＡＰ）の異なる時間の刺激によるｐ６５、ｐ３８、ＪＮＫ及びＥＲＫタンパク質のリン酸化変化を表すウエスタンブロッティング写真（［１］）及びｐ６５、ｐ３８、ＪＮＫ及びＥＲＫタンパク質のリン酸化比率を表すグラフ（［２］）である。
【図3】図３は、リガンドＴｒｉ－ＤＡＰ及びＬＴＡの組み合わせ処理有無による、ヒト皮脂腺細胞における炎症性サイトカインＩＬ－８の遺伝子発現量レベル及びタンパク質発現量レベルの炎症惹起を表すグラフである。図３のＡは炎症性サイトカインＩＬ－８の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図３のＢは炎症性サイトカインＩＬ－８のタンパク質発現量の変化を表すグラフである。
【図4】図４は、ヒト皮脂腺細胞をＮＯＤ１阻害剤ＭＬ１３０で処理有無の場合に、リガンドの刺激による遺伝子発現量レベル及びタンパク質発現量レベルの炎症惹起抑制を表すグラフである。図４のＡはＮＯＤ１阻害剤ＭＬ１３０の処理有無の場合に、リガンドの刺激による炎症性サイトカインＩＬ－８の遺伝子発現量の変化を表すグラフである。図４のＢはＮＯＤ１阻害剤ＭＬ１３０の処理有無の場合に、リガンドの刺激による炎症性サイトカインＩＬ－８のタンパク質発現量の変化を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、ＮＯＤ１の阻害剤を有効成分として含む皮膚炎症の新たな予防又は治療する組成物、及び皮膚炎症を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法について、具体的に説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【0016】
［ＮＯＤ１及びＮＯＤ２］
ＮＬＲファミリーであるＮＯＤ１とＮＯＤ２は細胞質内の細菌の持つ成分を認識している。具体的に、ＮＯＤ２はほとんどの細菌ペプチドグリカンに存在するＭＤＰを認識する。それに対して、ＮＯＤ１はグラム陰性菌とアクネ菌など一部のグラム陽性菌のペプチドグリカンに存在するｉＥ－ＤＡＰを認識するが、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどの多くの皮膚常在菌は感知しない。ＮＯＤ１やＮＯＤ２はＲＩＰＫ２（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｓｅｒｉｎｅ－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ２，受容体相互作用蛋白質キナーゼ２）を介してＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫ伝達経路の活性化を誘導することで様々なサイトカイン（例えば、ＩＬ－８等）や抗菌ペプチドの発現を誘導し、自然免疫の活性化に働く。
また、ＮＯＤ２は、造血細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞）と非造血細胞（例えば、パネート細胞、幹細胞、杯細胞、腸細胞）を含む様々
な細胞型において発現されている。それに対して、ＮＯＤ１は胃、大腸、口腔の上皮細胞、膵臓、肺、腎臓、脾臓のマクロファージ、樹状細胞等の細胞型において、発現されているが、ヒト皮脂腺細胞ではＮＯＤ１の発現がまだ証明されていない。
ＮＬＲファミリーであるＮＯＤ１とＮＯＤ２は細胞質内の細菌の持つ成分を認識している。具体的に、ＮＯＤ２はほとんどの細菌ペプチドグリカンに存在するＭＤＰを認識する。それに対して、ＮＯＤ１はグラム陰性菌とアクネ菌など一部のグラム陽性菌のペプチドグリカンに存在するｉＥ－ＤＡＰを認識するが、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどの多くの皮膚常在菌は感知しない。ＮＯＤ１やＮＯＤ２はＲＩＰＫ２（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｓｅｒｉｎｅ－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ２，受容体相互作用蛋白質キナーゼ２）を介してＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫ伝達経路の活性化を誘導することで様々なサイトカイン（例えば、ＩＬ－８等）や抗菌ペプチドの発現を誘導し、自然免疫の活性化に働く。
また、ＮＯＤ２は、造血細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞）と非造血細胞（例えば、パネート細胞、幹細胞、杯細胞、腸細胞）を含む様々
な細胞型において発現されている。それに対して、ＮＯＤ１は胃、大腸、口腔の上皮細胞、膵臓、肺、腎臓、脾臓のマクロファージ、樹状細胞等の細胞型において、発現されているが、ヒト皮脂腺細胞ではＮＯＤ１の発現がまだ証明されていない。
【0017】
本発明の発明者らは、新たにＮＯＤ１がヒト皮脂腺細胞のＰＲＲｓとして発現していることを見出した。
【0018】
発明者らは、異なる３つのロットのヒト皮脂腺細胞とポジティブコントロールとしてのＴＨＰ－１細胞のＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡを作成した。得られたｃＤＮＡについてＤＮＡポリメラーゼと各合成プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の後、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２とＧＡＰＤＨ遺伝子発現を検出した（図１のＡを参照）。さらに絶対定量を行い、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２とＮＬＲＰ３遺伝子の絶対発現量を確認した（図１のＢを参照）。図１のＢにおいて、ＮＯＤ１遺伝子の絶対発現量は、ＮＯＤ２とＮＬＲＰ３遺伝子より多いと分かる。
【0019】
さらに、発明者らはＮＯＤ１への刺激により炎症惹起を確認した。図２のＡにより、定量のＮＯＤ１リガンド（Ｔｒｉ－ＤＡＰ）又はＮＯＤ２リガンド（ＭＤＰ）でヒト皮脂腺細胞を異なる時間で刺激し、その後ＲＮＡ抽出方法、ｃＤＮＡ合成方法、リアルタイム定量ＰＣＲに従って、炎症性サイトカインＩＬ－８の遺伝子発現を確認した結果、ＮＯＤ1刺激のみ４時間をピークとする発現の上昇が見られた。図２のＢとＣにより、異なる濃度のリガンド（Ｔｒｉ－ＤＡＰ又はＭＤＰ）で４時間ヒト皮脂腺細胞を刺激した結果、ＮＯＤ1刺激のみ炎症性サイトカインＩＬ－８の遺伝子発現の上昇が確認され、刺激から２４時間後において遺伝子と同様にＮＯＤ1刺激のみ炎症性サイトカインＩＬ－８のタンパク質発現量の上昇も確認された。図２のＤは定量リガンド（Ｔｒｉ－ＤＡＰ）の異なる時間の刺激によるヒト皮脂腺細胞におけるｐ６５、ｐ３８、ＪＮＫ及びＥＲＫタンパク質のリン酸化変化を表すウエスタンブロッティング写真（［１］）及びｐ６５、ｐ３８、ＪＮＫ及びＥＲＫタンパク質のリン酸化比率を表すグラフ（［２］）である。
【0020】
以上、図１及び図２で示された結果から、ヒト皮脂腺細胞においてもＮＯＤ１が存在する。さらにヒト皮脂腺細胞がリガンドに刺激されることにより、ｐ６５、ｐ３８タンパク質のリン酸化比率が上がり、炎症惹起刺激に応じて産生されるＩＬ－８が確認されることで、ＮＯＤ１がヒト皮脂腺細胞においてＰＲＲｓとして機能することが明らかである。
【0021】
［ＮＯＤ１に対する阻害物質］
本発明の組成物における有効成分である、「ＮＯＤ１に対する阻害物質」には、ＮＯＤ１タンパク質の活性を阻害する物質（以下、ＮＯＤ１活性阻害物質ともいう）及び／又はＮＯＤ１の発現を阻害する物質（以下、ＮＯＤ１発現阻害物質ともいう）が含まれる。なお、本明細書において用語「阻害」とは、阻害対象（例えば、活性又は発現）を完全に或いは部分的に抑制又は減少させることを意味する。
前記のように、ＮＯＤ１の刺激により炎症が引き起こされるため、ＮＯＤ１に対する阻害物質が炎症を抑える効果があると想定できる。
本発明の組成物における有効成分である、「ＮＯＤ１に対する阻害物質」には、ＮＯＤ１タンパク質の活性を阻害する物質（以下、ＮＯＤ１活性阻害物質ともいう）及び／又はＮＯＤ１の発現を阻害する物質（以下、ＮＯＤ１発現阻害物質ともいう）が含まれる。なお、本明細書において用語「阻害」とは、阻害対象（例えば、活性又は発現）を完全に或いは部分的に抑制又は減少させることを意味する。
前記のように、ＮＯＤ１の刺激により炎症が引き起こされるため、ＮＯＤ１に対する阻害物質が炎症を抑える効果があると想定できる。
【0022】
（ＮＯＤ１活性阻害物質）
本発明の組成物で用いることのできるＮＯＤ１活性阻害物質としては、例えば、アクネ菌など細菌と拮抗し、ＮＯＤ１と細菌との結合を阻害することでＮＯＤ１活性を阻害する物質、ＮＯＤ１に対する特異的抗体などが挙げられる。具体的にＭＬ１３０、ＣＩＤ－１０８８４３９のような２－アミノベンジミダゾイル誘導体を挙げることができ、ＭＬ１３０がより好ましい。また、ＮＯＤ１とＮＯＤ２の二重阻害剤、例えば、エチル－１－（４－トルエンスルフォニル）－１Ｈ－インドール－２－カルボキシレートおよびエチル－１－（４－メチルベンジル）－１Ｈ－インドール－２－カルボキシレートなどもＮＯＤ１活
性阻害物質として用いることができる。ＮＯＤ１活性阻害物質は、後述するスクリーニング方法を用いて、選択、同定又は確認することができる。
本発明の組成物で用いることのできるＮＯＤ１活性阻害物質としては、例えば、アクネ菌など細菌と拮抗し、ＮＯＤ１と細菌との結合を阻害することでＮＯＤ１活性を阻害する物質、ＮＯＤ１に対する特異的抗体などが挙げられる。具体的にＭＬ１３０、ＣＩＤ－１０８８４３９のような２－アミノベンジミダゾイル誘導体を挙げることができ、ＭＬ１３０がより好ましい。また、ＮＯＤ１とＮＯＤ２の二重阻害剤、例えば、エチル－１－（４－トルエンスルフォニル）－１Ｈ－インドール－２－カルボキシレートおよびエチル－１－（４－メチルベンジル）－１Ｈ－インドール－２－カルボキシレートなどもＮＯＤ１活
性阻害物質として用いることができる。ＮＯＤ１活性阻害物質は、後述するスクリーニング方法を用いて、選択、同定又は確認することができる。
【0023】
（ＮＯＤ１発現阻害物質）
本発明の組成物で用いることのできるＮＯＤ１発現阻害物質としては、例えば、ＮＯＤ１の発現を特異的に阻害可能なアンチセンス核酸若しくは小分子量干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ＮＯＤ１ ｍＲＮＡを特異的に切断可能なリボザイム、これらを哺乳動物細胞内において発現可能な発現ベクターなどを挙げることができる。また、ＮＯＤ１発現阻害物質の例として、シクロスポリンＡなどの免疫抑制剤などを挙げることができる。ＮＯＤ１発現阻害物質は、後述するスクリーニング方法を用いて、選択、同定又は確認することができる。
本発明の組成物で用いることのできるＮＯＤ１発現阻害物質としては、例えば、ＮＯＤ１の発現を特異的に阻害可能なアンチセンス核酸若しくは小分子量干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ＮＯＤ１ ｍＲＮＡを特異的に切断可能なリボザイム、これらを哺乳動物細胞内において発現可能な発現ベクターなどを挙げることができる。また、ＮＯＤ１発現阻害物質の例として、シクロスポリンＡなどの免疫抑制剤などを挙げることができる。ＮＯＤ１発現阻害物質は、後述するスクリーニング方法を用いて、選択、同定又は確認することができる。
【0024】
上記アンチセンス核酸としては、ＮＯＤ１の転写産物（ｍＲＮＡ又は初期転写産物）と特異的にハイブリダイズして、ＮＯＤ１の翻訳を阻害し得る核酸をいう。核酸としては、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、或いはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであっても良い。
【0025】
アンチセンス核酸の長さとしては、ＮＯＤ１の転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はないが、合成の容易さや抗原性の観点などから、下限としては通常１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のものが挙げられ、上限としては通常１００塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２４塩基以下のものが挙げられる。従って、アンチセンス核酸としては、例えば１０塩基以上１００塩基以下、好ましくは１５塩基以上３０塩基以下、より好ましくは１５塩基以上２４塩基以下のオリゴヌクレオチドが使用され得る。
【0026】
また、アンチセンス核酸の標的配列についても、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることによりＮＯＤ１の翻訳が阻害される配列であれば特に制限はなく、ｍＲＮＡの全配列であっても部分配列（通常１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上；且つ通常１００塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２４塩基以下）であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、アンチセンス核酸としてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列はＮＯＤ１のｍＲＮＡの５’末端からコード領域のＣ末端までに位置することが望ましい。
【0027】
上記アンチセンス核酸の合成は自体公知の方法で行えば良く、例えば、所望の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて合成すれば良い。
【0028】
上記ｓｉＲＮＡは、ＮＯＤ１の転写産物（ｍＲＮＡ又は初期転写産物）のコード領域内の部分配列（通常１８塩基以上、好ましくは２１塩基以上、且つ通常３０塩基以下、好ましくは２７塩基以下、より好ましくは２３塩基以下；初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡであり、当該転写産物を特異的に認識して切断することによりＮＯＤ１の発現を阻害し得るものであれば特に制限されない。ｓｉＲＮＡの長さは、通常２１～２３塩基である。当業者は、ヒトＮＯＤ１のｍＲＮＡ配列をもとに、ヒトＮＯＤ１の発現を阻害するために使用され得るｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を決定することができる。
ｓｉＲＮＡの合成は自体公知の方法で行えば良く、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、それらをアニーリングさせることにより合成することができる。
ｓｉＲＮＡの合成は自体公知の方法で行えば良く、例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、それらをアニーリングさせることにより合成することができる。
【0029】
また、上記発現ベクターとしては、当該技術分野で使用される任意のものを使用することができ、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９
４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが挙げられる。
４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが挙げられる。
【0030】
［皮膚炎症］
本明細書において、用語「皮膚炎症」には、これらに限定されないが、なかでも、尋常性ざ瘡（ニキビ）、酒さ、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、薬疹、乾癬、脂漏性皮膚炎、結合組織疾患（例えば、狼瘡および強皮症）、水疱形成疾患（例えば、水疱性類天疱瘡および天疱瘡）といったその他の自己免疫障害、色素性疾患（例えば、炎症後色素沈着過度、肝斑および白斑）、蕁麻疹または蕁麻疹性丘疹、体部白癬または手指もしくは足指爪の真菌感染症といった皮膚感染症を伴う炎症が含まれる。炎症は、これらの疾患の大部分にとって重要なステップである。
本発明が提供するＮＯＤ１に対する阻害物質を有効成分として含有する組成物は、特に尋常性ざ瘡、即ちニキビの予防や治療に効果的である。
本明細書において、用語「皮膚炎症」には、これらに限定されないが、なかでも、尋常性ざ瘡（ニキビ）、酒さ、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、薬疹、乾癬、脂漏性皮膚炎、結合組織疾患（例えば、狼瘡および強皮症）、水疱形成疾患（例えば、水疱性類天疱瘡および天疱瘡）といったその他の自己免疫障害、色素性疾患（例えば、炎症後色素沈着過度、肝斑および白斑）、蕁麻疹または蕁麻疹性丘疹、体部白癬または手指もしくは足指爪の真菌感染症といった皮膚感染症を伴う炎症が含まれる。炎症は、これらの疾患の大部分にとって重要なステップである。
本発明が提供するＮＯＤ１に対する阻害物質を有効成分として含有する組成物は、特に尋常性ざ瘡、即ちニキビの予防や治療に効果的である。
【0031】
［ＮＯＤ１の阻害剤を有効成分として含む組成物］
本発明のＮＯＤ１の阻害剤を有効成分として含む組成物は、具体的に医薬組成物及び化粧料組成物の形態で提供することができる。
本発明のＮＯＤ１の阻害剤を有効成分として含む組成物は、具体的に医薬組成物及び化粧料組成物の形態で提供することができる。
【0032】
（医薬組成物）
本発明の組成物は医薬組成物の場合に、ＮＯＤ１の阻害剤をそのままあるいは薬理学的に許容し得る担体を配合し、経口的または非経口的に投与することができる。薬理学的に許容し得る担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
本発明の組成物は医薬組成物の場合に、ＮＯＤ１の阻害剤をそのままあるいは薬理学的に許容し得る担体を配合し、経口的または非経口的に投与することができる。薬理学的に許容し得る担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【0033】
本発明の医薬組成物は、経口投与する場合の剤形としては、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられ、また、非経口投与する場合の剤形としては、例えば、塗布剤、注射剤、注入剤、点滴剤などが挙げられる。また、適当な基剤（例、酪酸の重合体、グリコール酸の重合体、酪酸－グリコール酸の共重合体、酪酸の重合体とグリコール酸の重合体との混合物、ポリグリセロール脂肪酸エステルなど）と組み合わせて徐放性製剤とすることも有効である。
【0034】
本発明の医薬組成物中のＮＯＤ１に対する阻害物質の含有量は、製剤の形態に応じて相違するが、通常製剤全体に対して２ないし８５重量％、好ましくは５ないし７０重量％である。
【0035】
ＮＯＤ１に対する阻害物質を上記の剤形に製する方法としては、当該分野で一般的に用いられている公知の製造方法を適用することができる。また、上記の剤形に製する場合には、必要に応じて、その剤形に製する際に製剤分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤などの担体、甘味剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤などの各種製剤添加物などを適宜、適量含有させて製造することができる。
【0036】
例えば、ＮＯＤ１に対する阻害物質を錠剤に製する場合には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤などを含有させて製造することができ、丸剤および顆粒剤に製する場合には、賦形剤、結合剤、崩壊剤などを含有させて製造することができる。また、散剤およびカプセル剤に製する場合には賦形剤などを、シロップ剤に製する場合には甘味剤などを、乳剤ま
たは懸濁剤に製する場合には懸濁化剤、界面活性剤、乳化剤などを含有させて製造することができる。
たは懸濁剤に製する場合には懸濁化剤、界面活性剤、乳化剤などを含有させて製造することができる。
【0037】
賦形剤の例としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、でんぷん、ショ糖、微結晶セルロース、カンゾウ末、マンニトール、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムなどが挙げられる。
結合剤の例としては、５ないし１０重量％デンプンのり液、１０ないし２０重量％アラビアゴム液またはゼラチン液、１ないし５重量％トラガント液、カルボキシメチルセルロース液、アルギン酸ナトリウム液、グリセリンなどが挙げられる。
崩壊剤の例としては、でんぷん、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、精製タルクなどが挙げられる。
甘味剤の例としては、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン、単シロップなどが挙げられる。
界面活性剤の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル４０などが挙げられる。
懸濁化剤の例としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ベントナイトなどが挙げられる。
乳化剤の例としては、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ポリソルベート８０などが挙げられる。
結合剤の例としては、５ないし１０重量％デンプンのり液、１０ないし２０重量％アラビアゴム液またはゼラチン液、１ないし５重量％トラガント液、カルボキシメチルセルロース液、アルギン酸ナトリウム液、グリセリンなどが挙げられる。
崩壊剤の例としては、でんぷん、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、精製タルクなどが挙げられる。
甘味剤の例としては、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン、単シロップなどが挙げられる。
界面活性剤の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル４０などが挙げられる。
懸濁化剤の例としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ベントナイトなどが挙げられる。
乳化剤の例としては、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ポリソルベート８０などが挙げられる。
【0038】
更に、ＮＯＤ１に対する阻害物質を上記の剤形に製造する場合には、所望により、製剤分野において通常用いられる着色剤、保存剤、芳香剤、矯味剤、安定剤、粘稠剤などを適量添加することができる。
【0039】
ＮＯＤ１に対する阻害物質を含有する本発明の医薬組成物は、安定かつ低毒性で安全に使用することができる。その１日の投与量は患者の状態や体重、ＮＯＤ１に対する阻害物質の種類、投与経路などによって異なるが、当業者はこれらの要素を考慮して適切な量を決定することができる。また、投与は、１日１回の投与であっても、或いは２ないし３回に分けての投与であってもよい。
【0040】
ＮＯＤ１に対する阻害物質を非経口的に投与する場合は、通常、液剤（例、注射剤）の形で投与する。その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形にして、通常体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ～約１００ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。注射剤としては、静脈注射剤のほか、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などが含まれ、また持続性製剤としては、イオントフォレシス経皮剤などが含まれる。かかる注射剤は、自体公知の方法、すなわち、ＮＯＤ１に対する阻害物質を無菌の水性液もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０）などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤（例、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなど）などと併用してもよい。また、緩衝剤（例、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例、ベンジルアルコール、フェノールなど）などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、アンプルに充填される。
【0041】
本発明の医薬組成物からなる剤は、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎などのような皮膚
炎を予防及び治療する効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。ＮＯＤ１に対する阻害物質と他の薬剤を併用する場合、ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤の投与形態は特に限定されず、投与時に、ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例、本発明の医薬組成物からなる剤→併用薬剤の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）などが挙げられる。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせなどにより適宜選択することができる。例えば、投与対象がヒトである場合、ＮＯＤ１に対する阻害物質１重量部に対し、併用薬剤を０．０１乃至１００重量部用いればよい。
炎を予防及び治療する効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。ＮＯＤ１に対する阻害物質と他の薬剤を併用する場合、ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤の投与形態は特に限定されず、投与時に、ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例、本発明の医薬組成物からなる剤→併用薬剤の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）などが挙げられる。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、ＮＯＤ１に対する阻害物質と併用薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせなどにより適宜選択することができる。例えば、投与対象がヒトである場合、ＮＯＤ１に対する阻害物質１重量部に対し、併用薬剤を０．０１乃至１００重量部用いればよい。
【0042】
該医薬組成物は、尋常性ざ瘡、即ちニキビの予防や治療に利用されるため、外用医薬品、外用医薬部外品の外用組成物として、非常に有効であると想定できる。
【0043】
（化粧料組成物）
また、本発明の組成物は、化粧料組成物でもある。本発明の化粧料組成物は、本発明のＮＯＤ１に対する阻害物質と一緒に化粧料組成物の製造分野で一般的に使用される1つ以上の賦形剤及び添加剤を含めて当分野の公知の方法により容易に製造されることができる。
また、本発明の組成物は、化粧料組成物でもある。本発明の化粧料組成物は、本発明のＮＯＤ１に対する阻害物質と一緒に化粧料組成物の製造分野で一般的に使用される1つ以上の賦形剤及び添加剤を含めて当分野の公知の方法により容易に製造されることができる。
【0044】
本発明の化粧料組成物は、ＮＯＤ１に対する阻害物質を有効成分として含有し、皮膚学的に許容可能な賦形剤と一緒に基礎化粧料組成物（化粧水、乳液、クリーム、美容液、クレンジングフォーム及びクレンジングウォーターのような洗顔剤、パック、ボディオイル）、色調化粧料組成物（ファンデーション、口紅、マスカラ、メイクアップベース）、頭髪製品組成物（シャンプー、リンス、ヘアコンディショナー、ヘアゲル）及び石鹸などの形態で製造することができる。前記化粧料組成物における賦形剤としてはこれに限定されないが、例えば、皮膚軟化剤、皮膚浸透増強剤、着色剤、芳香剤、乳化剤、濃化剤及び溶媒を含むことができる。また、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤及び保湿剤などをさらに含むことができ、物性改善を目的として増粘剤、無機塩類、合成高分子物質などを含むことができる。
【0045】
前記化粧料組成物における賦形剤としては、これに限定されないが、例えば、皮膚軟化剤、皮膚浸透増強剤、着色剤、芳香剤、乳化剤、濃化剤及び溶媒を含むことができる。また、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤及び保湿剤などをさらに含むことができ、物性改善を目的として増粘剤、無機塩類、合成高分子物質などを含むことができる。例えば、本発明の化粧料組成物でクリームを製造する場合には、一般的な水中油滴型（Ｏ／Ｗ）のクリームベースにＮＯＤ１に対する阻害物質を添加して製造することができる。ここで香料、キレート剤、色素、酸化防止剤、防腐剤などと物性改善を目的としたタンパク質、ミネラル、ビタミンなどの合成又は天然素材を追加して添加することができる。
【0046】
本発明の化粧料組成物に含有されるＮＯＤ１に対する阻害物質の含有量は、これに限定されないが、全体組成物の総重量に対して、０．０００５～１０重量％であることが好ましく、０．００１～５重量％であることがより好ましい。前記含量が０．００１重量％未満では、目的とする皮膚炎症の予防又は治療効果を期待することができず、１０重量％を
超えると安全性又は全ての剤形状製造に困難がありうる。
超えると安全性又は全ての剤形状製造に困難がありうる。
【0047】
また、本発明の化粧料組成物は、ＮＯＤ１に対する阻害物質と共に皮膚炎症の緩和や皮膚保護に効果があると知られている他の成分と一緒に混合して製造することができる。
【0048】
また、前記のように、尋常性ざ瘡（ニキビ）の治療ターゲットとしてこれらのＴＬＲ２に対する阻害剤が有効であると知られているため、本発明のＮＯＤ１の阻害剤を有効成分として含む組成物には、さらにＴＬＲ２の阻害剤を含んでもよい。
【0049】
［皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法］
本発明は皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法は主に下記の工程を含む。
（ａ）ヒト皮脂腺細胞を被験物質で処理する工程；
（ｂ）ＮＯＤ１の機能（即ち、活性又は発現）を阻害するか検定する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の機能を阻害した被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
当該スクリーニング方法において、用語「皮膚炎症」は、前記ＮＯＤ１の阻害剤を有効成分として含む組成物の説明において記述したものと同義である。
以下、本発明のスクリーニング方法を詳述する。
本発明は皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法は主に下記の工程を含む。
（ａ）ヒト皮脂腺細胞を被験物質で処理する工程；
（ｂ）ＮＯＤ１の機能（即ち、活性又は発現）を阻害するか検定する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の機能を阻害した被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
当該スクリーニング方法において、用語「皮膚炎症」は、前記ＮＯＤ１の阻害剤を有効成分として含む組成物の説明において記述したものと同義である。
以下、本発明のスクリーニング方法を詳述する。
【0050】
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。被験物質は、標識されていても未標識であってもよく、また、標識体と未標識体を所定の割合で含む混合物も被験物質として使用できる。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。
【0051】
（ＮＯＤ１活性阻害物質のスクリーニング方法－スクリーニング方法Ａ）
ＮＯＤ１の活性を阻害する物質（ＮＯＤ１活性阻害物質）のスクリーニング方法について説明する。
ＮＯＤ１の活性を阻害する物質（ＮＯＤ１活性阻害物質）のスクリーニング方法について説明する。
【0052】
ＮＯＤ１活性阻害物質のスクリーニング方法Ａは、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；
（ｂ）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、炎症性サイトカインの遺伝子のｍＲＮＡ発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；
（ｂ）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、炎症性サイトカインの遺伝子のｍＲＮＡ発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
【0053】
スクリーニング方法Ａの工程（ａ）では、まず、被験物質でヒト皮脂腺細胞を処理する。その後、ＮＯＤ１活性化剤を該被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる。ＮＯＤ１活性化剤は、例えばＮＯＤ１リガンド等が挙げられる。Ｔｒｉ－ＤＡＰ等は代表的なＮＯＤ１リガンドである。
【0054】
被験物質がＮＯＤ１活性阻害物質である場合に、その添加により、ＮＦ－κＢおよびＭ
ＡＰＫ伝達経路の活性化が阻害される。そこで、ＮＦ－κＢおよびＭＡＰＫ伝達経路の活性化に誘導されるさまざまな炎症性サイトカインの発現も阻害される。
スクリーニング方法Ａの工程（ｂ）では、まず、これらの炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量が測定される。遺伝子の発現量及びタンパク質発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考え、公知の方法により行われる。
例えば、炎症性サイトカインＩＬ－８遺伝子の発現量は、ＩＬ－８遺伝子の産物、例えば、転写産物（ｍＲＮＡ）又は翻訳産物（タンパク質）を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ＲＴ－ＰＣＲ、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９－４３９（１９８０））、蛍光抗体法などが使用できる。
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
ＡＰＫ伝達経路の活性化が阻害される。そこで、ＮＦ－κＢおよびＭＡＰＫ伝達経路の活性化に誘導されるさまざまな炎症性サイトカインの発現も阻害される。
スクリーニング方法Ａの工程（ｂ）では、まず、これらの炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量が測定される。遺伝子の発現量及びタンパク質発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考え、公知の方法により行われる。
例えば、炎症性サイトカインＩＬ－８遺伝子の発現量は、ＩＬ－８遺伝子の産物、例えば、転写産物（ｍＲＮＡ）又は翻訳産物（タンパク質）を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ＲＴ－ＰＣＲ、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９－４３９（１９８０））、蛍光抗体法などが使用できる。
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【0055】
スクリーニング方法Ａの工程（ｃ）では、炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択される。
【0056】
（ＮＯＤ１発現阻害物質のスクリーニング方法－スクリーニング方法Ｂ、Ｃ）
ＮＯＤ１の発現を阻害する物質（ＮＯＤ１発現阻害物質）のスクリーニング方法について説明する。
ＮＯＤ１の発現を阻害する物質（ＮＯＤ１発現阻害物質）のスクリーニング方法について説明する。
【0057】
ＮＯＤ１発現阻害物質のスクリーニング方法Ｂは、以下の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）ヒト皮脂腺細胞を被験物質で処理する工程；
（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞の発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
（ａ）ヒト皮脂腺細胞を被験物質で処理する工程；
（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞の発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程。
【0058】
スクリーニング方法Ｂの工程（ａ）では、まず、被験物質でヒト皮脂腺細胞を処理する。
【0059】
被験物質がＮＯＤ１発現阻害物質である場合に、その添加により、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量が影響される。
スクリーニング方法Ｂの工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させたヒト皮脂腺細胞におけるＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。具体的な測定方法は、スクリーニング方法Ａの工程（ｂ）と同様である。
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/
又タンパク質の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
スクリーニング方法Ｂの工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させたヒト皮脂腺細胞におけるＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。具体的な測定方法は、スクリーニング方法Ａの工程（ｂ）と同様である。
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/
又タンパク質の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【0060】
スクリーニング方法Ｂの工程（ｃ）では、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択される。
【0061】
ＮＯＤ１発現阻害物質のスクリーニング方法Ｃは、以下の工程（ａ）、（ｂ）、（ｂ１）及び（ｃ）を含む：
（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；
（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；
（ｂ１）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）と（ｂ１）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質、及び炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程
（ａ）ＮＯＤ１活性化剤を、被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる工程；
（ｂ）ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；
（ｂ１）炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量を定量し、これらの発現量を、ＮＯＤ１活性化剤を被験物質で処理しなかったヒト皮脂腺細胞に接触させた場合の発現量と比較する工程；及び、
（ｃ）上記（ｂ）と（ｂ１）の比較結果に基づいて、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質、及び炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択する工程
【0062】
スクリーニング方法Ｃの工程（ａ）では、まず、被験物質でヒト皮脂腺細胞を処理する。その後、ＮＯＤ１活性化剤を該被験物質で処理したヒト皮脂腺細胞に接触させる。ＮＯＤ１活性化剤はスクリーニング方法Ａと同様でもよい。
【0063】
被験物質がＮＯＤ１発現阻害物質である場合に、その添加により、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量が影響される。
スクリーニング方法Ｃの工程（ｂ）では、先ず、工程（ａ）を経たヒト皮脂腺細胞におけるＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。具体的な測定方法は、スクリーニング方法Ａの工程（ｂ）と同様である。
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
スクリーニング方法Ｃの工程（ｂ）では、先ず、工程（ａ）を経たヒト皮脂腺細胞におけるＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。具体的な測定方法は、スクリーニング方法Ａの工程（ｂ）と同様である。
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＮＯＤ１遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【0064】
ＮＯＤ１発現が阻害されるとともに、通常、シグナル伝達経路におけるＮＯＤ１下流のシグナル伝達も影響され、ＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫ伝達経路の活性化及びＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫ伝達経路の活性化に誘導されるさまざまな炎症性サイトカインの発現も阻害されると考えられる。
スクリーニング方法Ｃの工程（ｂ１）は、スクリーニング方法Ａの工程（ｂ）と同様である。即ち、スクリーニング方法Ｃの工程（ｂ）に、さらにスクリーニング方法Ａの工程
（ｂ）を加え、最終的に両方の結果を踏まえて、被験物質が皮膚炎症の予防又は治療のための物質として使用できるかどうかを判断することができる。ただし、スクリーニング方法Ｃの工程（ｂ）及び工程（ｂ１）は前後の順序が関係なく、スクリーニング時に同時に実施してもよい。
スクリーニング方法Ｃの工程（ｂ１）は、スクリーニング方法Ａの工程（ｂ）と同様である。即ち、スクリーニング方法Ｃの工程（ｂ）に、さらにスクリーニング方法Ａの工程
（ｂ）を加え、最終的に両方の結果を踏まえて、被験物質が皮膚炎症の予防又は治療のための物質として使用できるかどうかを判断することができる。ただし、スクリーニング方法Ｃの工程（ｂ）及び工程（ｂ１）は前後の順序が関係なく、スクリーニング時に同時に実施してもよい。
【0065】
具体的に、スクリーニング方法Ｃの工程（ｂ１）では、まず、炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量が測定される。遺伝子の発現量及びタンパク質発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考え、公知の方法により行われる。
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
次いで、被験物質を接触させた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量は、被験物質を接触させた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量及び/又タンパク質の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【0066】
スクリーニング方法Ｃの工程（ｃ）では、ＮＯＤ１の遺伝子発現量及び/又はＮＯＤ１のタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質、及び炎症性サイトカインの遺伝子発現量及び/又は炎症性サイトカインのタンパク質発現量の低下をもたらす被験物質を前記の皮膚炎症を予防又は治療し得る物質として選択される。
【実施例0067】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【0068】
（ヒト皮脂腺細胞の培養）
ヒト皮脂腺細胞は６ウェルプレートに１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル、１２ウェルプレートに５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地はＤＭＥＭ／Ｆ－１２に添加剤を加えたものを使用した。該添加剤はＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（２ｍＭ）、２－（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル）エタンスルホン酸（１０ｍＭ）、ヒト上皮成長因子（５０ｎｇ／ｍＬ）及び１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる。
ヒト皮脂腺細胞は６ウェルプレートに１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル、１２ウェルプレートに５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地はＤＭＥＭ／Ｆ－１２に添加剤を加えたものを使用した。該添加剤はＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（２ｍＭ）、２－（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル）エタンスルホン酸（１０ｍＭ）、ヒト上皮成長因子（５０ｎｇ／ｍＬ）及び１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる。
【0069】
（実施例１ ＮＯＤ１タンパク質活性の阻害）
５μＭのＮＯＤ１阻害剤ＭＬ１３０でヒト皮脂腺細胞を３０分間処理した後、１０μｇ／ｍＬのＴｒｉ－ＤＡＰで刺激を行った。Ｔｒｉ－ＤＡＰ刺激４時間後のサンプルについて、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡとＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）
ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を行い、ｃＤＮＡを作成した。双方の操作はメーカー推奨の方法に従って行った。ＩＬ－８遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用して、得られたｃＤＮＡを用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイで測定した。操作はメーカー推奨の方法に従って行った。リアルタイム定量ＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用して、５０℃で２分間のＵＮＧ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎステップ、９５℃で１０分間の酵素活性化ステ
ップの後に、９５℃で１５秒間の熱変性ステップ、６０℃で１分間のアニーリング／伸長ステップを含むサイクルを５０回繰り返した。図４のＡから、炎症性サイトカインＩＬ－８の遺伝子発現誘導を確認した。
５μＭのＮＯＤ１阻害剤ＭＬ１３０でヒト皮脂腺細胞を３０分間処理した後、１０μｇ／ｍＬのＴｒｉ－ＤＡＰで刺激を行った。Ｔｒｉ－ＤＡＰ刺激４時間後のサンプルについて、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡとＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）
ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を行い、ｃＤＮＡを作成した。双方の操作はメーカー推奨の方法に従って行った。ＩＬ－８遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用して、得られたｃＤＮＡを用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイで測定した。操作はメーカー推奨の方法に従って行った。リアルタイム定量ＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用して、５０℃で２分間のＵＮＧ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎステップ、９５℃で１０分間の酵素活性化ステ
ップの後に、９５℃で１５秒間の熱変性ステップ、６０℃で１分間のアニーリング／伸長ステップを含むサイクルを５０回繰り返した。図４のＡから、炎症性サイトカインＩＬ－８の遺伝子発現誘導を確認した。
【0070】
Ｔｒｉ－ＤＡＰ刺激２４時間後の細胞培養上清について、培養上清中のＩＬ－８量は、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－８ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ製）を用いてＥＬＩＳＡ法により定量した。操作はメーカー推奨の方法に従って行った。図４のＢから、炎症性サイトカインＩＬ－８のタンパク質発現誘導を確認した。
以上、ＭＬ１３０は、ＮＯＤ１活性化剤（Ｔｒｉ－ＤＡＰ）によって誘導される炎症性サイトカインＩＬ－８のｍＲＮＡ発現とタンパク質分泌の両方を有意に抑制した。
以上、ＭＬ１３０は、ＮＯＤ１活性化剤（Ｔｒｉ－ＤＡＰ）によって誘導される炎症性サイトカインＩＬ－８のｍＲＮＡ発現とタンパク質分泌の両方を有意に抑制した。
【0071】
５μＭのＮＯＤ１阻害剤ＭＬ１３０でヒト皮脂腺細胞を３０分間処理した後、１０μｇ／ｍＬのＴｒｉ－ＤＡＰで１時間刺激を行った。その後、ヒト皮脂腺細胞を溶解バッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２０ ｍＭ、ｐＨ ７．５）、ＮａＣｌ（１５０ ｍＭ）、エデテートカルシウム二ナトリウム（１０ｍＭ 、ｐＨ８．０）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００）で溶解し、サンプルバッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５０ ｍＭ、ｐＨ６．８）、２０％ ２－メルカプトエタノール、８％ドデシル硫酸ナトリウム、２０％スクロース、ブロモフェノールブルー（４０μｇ／μＬ））で調整した。調整したサンプルを１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、セミドライブロッティング装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を使用して、タンパク質をポリフッ化ビニリデンメンブレンに１００ｍＶで１時間転写した。メンブレンをブロッキング溶液（０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）を用いた５％スキムミルク溶液）で１時間ブロッキングした。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、メンブレンを４℃で一晩各抗体に当てた。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、メンブレンを室温で２時間 ＨＲＰ標識二次抗体に当てた。ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅウエスタンブロッティング検出試薬（Ｃｙｔｉｖａ製）またはＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ ＬＤ（和光製）をメーカー推奨の方法に従って使用し、ウエスタンブロッド解析法によって、ｐ６５とｐ３８タンパク質のリン酸化を確認した（図５のＡとＢ）。即ち、ＭＬ１３０は、Ｔｒｉ－ＤＡＰによって誘導される炎症性の細胞シグナリングであるｐ６５およびｐ３８のリン酸化を阻害した。
【0072】
以上、ＭＬ１３０の使用により、ＮＯＤ１タンパク質に対する活性を阻害する方法はアクネ菌などによる炎症を抑制する手段として有効であることが示された。
【0073】
（実施例２ ＮＯＤ１遺伝子発現及びタンパク質発現の阻害）
１９．２ｎＭのＮＯＤ１遺伝子のｓｉＲＮＡ（以後、ｓｉＮＯＤ１とも称する）（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いてヒト皮脂腺細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入から４８時間後のサンプルについて、前記のＲＮＡ抽出方法、ｃＤＮＡ合成方法、リアルタイム定量ＰＣＲに従って、ＮＯＤ１遺伝子発現量を約５０％減少したことを確認した。さらに遺伝子導入から４８時間後の細胞溶解液について、前記のウエスタンブロッティング法に従って、ＮＯＤ１のタンパク質発現量も３０％減少したことを確認した。
さらに、ＮＯＤ１発現が阻害されるとともに、シグナル伝達経路におけるＮＯＤ１下流のシグナル伝達も影響されると想定し、前記のＲＮＡ抽出方法、ｃＤＮＡ合成方法、リアルタイム定量ＰＣＲに従ってＴｒｉ－ＤＡＰ刺激４時間後における炎症性サイトカインＩＬ－８の遺伝子発現誘導も確認した（図６のＡ）。Ｔｒｉ－ＤＡＰ刺激２４時間後の細胞培養上清について、前記のＥＬＩＳＡ法に従って、炎症性サイトカインＩＬ－８のタンパク質発現誘導を確認した（図６のＢ）。
その結果、ｓｉＮＯＤ１の使用により、ＮＯＤ１活性化剤（Ｔｒｉ－ＤＡＰ）によって誘導される炎症性サイトカインＩＬ－８のｍＲＮＡ発現およびタンパク質分泌を完全に無
効にした。
以上、ｓｉＮＯＤ１の使用により、ＮＯＤ１遺伝子発現及びタンパク質の発現を阻害する方法はアクネ菌などによる炎症を抑制する手段として有効であることが示された。
１９．２ｎＭのＮＯＤ１遺伝子のｓｉＲＮＡ（以後、ｓｉＮＯＤ１とも称する）（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いてヒト皮脂腺細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入から４８時間後のサンプルについて、前記のＲＮＡ抽出方法、ｃＤＮＡ合成方法、リアルタイム定量ＰＣＲに従って、ＮＯＤ１遺伝子発現量を約５０％減少したことを確認した。さらに遺伝子導入から４８時間後の細胞溶解液について、前記のウエスタンブロッティング法に従って、ＮＯＤ１のタンパク質発現量も３０％減少したことを確認した。
さらに、ＮＯＤ１発現が阻害されるとともに、シグナル伝達経路におけるＮＯＤ１下流のシグナル伝達も影響されると想定し、前記のＲＮＡ抽出方法、ｃＤＮＡ合成方法、リアルタイム定量ＰＣＲに従ってＴｒｉ－ＤＡＰ刺激４時間後における炎症性サイトカインＩＬ－８の遺伝子発現誘導も確認した（図６のＡ）。Ｔｒｉ－ＤＡＰ刺激２４時間後の細胞培養上清について、前記のＥＬＩＳＡ法に従って、炎症性サイトカインＩＬ－８のタンパク質発現誘導を確認した（図６のＢ）。
その結果、ｓｉＮＯＤ１の使用により、ＮＯＤ１活性化剤（Ｔｒｉ－ＤＡＰ）によって誘導される炎症性サイトカインＩＬ－８のｍＲＮＡ発現およびタンパク質分泌を完全に無
効にした。
以上、ｓｉＮＯＤ１の使用により、ＮＯＤ１遺伝子発現及びタンパク質の発現を阻害する方法はアクネ菌などによる炎症を抑制する手段として有効であることが示された。
【0074】
＜化粧料の処方例＞
化粧水及び化粧用クリームを、下記表１及び表２の処方例より作製することができる。
化粧水及び化粧用クリームを、下記表１及び表２の処方例より作製することができる。
【表1】
【0075】
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0076】
本発明の皮膚炎症を予防又は治療する物質のスクリーニング方法により、直接的にまた間接的にＮＯＤ１の機能を阻害する物質を選択することができる。そこで、アクネ菌などによる皮膚炎症特に尋常性ざ瘡の皮膚炎症を抑制する手段が得られ、尋常性ざ瘡の皮膚炎症を予防又は治療する効果が期待できると考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
