特開 2025-9047 腱板断裂性肩関節症モデル動物及び腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025009047

(43)【公開日】2025-01-20

(54)【発明の名称】腱板断裂性肩関節症モデル動物及び腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/027 20240101AFI20250109BHJP

【ＦＩ】

A01K67/027

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023111774

(22)【出願日】2023-07-06

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅ２．ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ．ｃｏ．ｊｐ／４０ｊｓｂｍｒ／ｓｙｏｒｏｋｕ／、掲載日：令和４年７月１１日 集会名：第４０回日本骨代謝学会学術集会、開催日：令和４年７月２３日 アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅ２．ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｏａｋｉｓｏ２０２２／ａｐｐｌｉ／、掲載日：令和４年１０月４日 集会名：第３７回日本整形外科学会基礎学術集会、開催日：令和４年１０月１３日 刊行物名：１３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＢＭＰ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ＢＯＯＫ ＯＦ ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ、発行者名：１３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＢＭＰ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｃｒｏａｔｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｓ、掲載日：令和４年１０月８日 集会名：１３ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＢＭＰ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、開催日：令和４年１０月８日 アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｒｓ．ｏｒｇ／ａｂｓｔｒａｃｔ－ｓｅａｒｃｈ／、掲載日：令和５年１月２６日 集会名：ＯＲＳ ２０２３ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、開催日：令和５年２月１２日 刊行物名：第３５回日本軟骨代謝学会プログラム・抄録集、発行者名：第３５回日本軟骨代謝学会 事務局、頒布日：令和５年２月１７日 集会名：第３５回日本軟骨代謝学会、開催日：令和５年３月４日 刊行物名：第８回日本骨免疫学会Ｐｒｏｇｒａｍ＆Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、発行日（頒布日）：令和５年６月２５日 集会名：第８回日本骨免疫学会、開催日：令和５年６月２５日

(71)【出願人】

【識別番号】504258527

【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100168114

【弁理士】

【氏名又は名称】山中 生太

(74)【代理人】

【識別番号】100162259

【弁理士】

【氏名又は名称】末富 孝典

(74)【代理人】

【識別番号】100146916

【弁理士】

【氏名又は名称】廣石 雅紀

(72)【発明者】

【氏名】谷口 昇

(72)【発明者】

【氏名】前田 真吾

(72)【発明者】

【氏名】伊集院 俊郎

(57)【要約】

【課題】腱板断裂性肩関節症の病態をより忠実に再現することができる腱板断裂性肩関節症モデル動物及び腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法を提供する。
【解決手段】腱板断裂性肩関節症モデル動物は、同じ側の肩甲上腕関節における棘上筋の筋腱、棘下筋の筋腱、上方関節包及び上腕二頭筋長頭腱が切離されているげっ歯類動物である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

同じ側の肩甲上腕関節における棘上筋の筋腱、棘下筋の筋腱、上方関節包及び上腕二頭筋長頭腱が切離されたげっ歯類動物である、
腱板断裂性肩関節症モデル動物。

【請求項2】

前記げっ歯類動物は、
ラットである、
請求項１に記載の腱板断裂性肩関節症モデル動物。

【請求項3】

前記ラットの週齢が１２週齢以降である、
請求項２に記載の腱板断裂性肩関節症モデル動物。

【請求項4】

軟骨下骨が陥没する又は陥没している、
請求項１から３のいずれか一項に記載の腱板断裂性肩関節症モデル動物。

【請求項5】

げっ歯類動物の同じ側の肩甲上腕関節における棘上筋の筋腱及び棘下筋の筋腱を切離し、
前記肩甲上腕関節における上方関節包を切離し、
前記肩甲上腕関節における上腕二頭筋長頭腱を切離する、
腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腱板断裂性肩関節症モデル動物及び腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

肩腱板断裂は、耐え難い肩関節痛の主な原因である。８０歳以上の高齢者の６割以上が肩腱板断裂に罹患している。肩腱板断裂の症例の一部は、肩関節（肩甲上腕関節）の著明な変形、上腕骨の関節軟骨下骨陥没、上腕骨頭の骨量減少等を特徴とする、腱板断裂性肩関節症（ｃｕｆｆ ｔｅａｒ ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ；以下単に“ＣＴＡ”ともいう）に移行する。ＣＴＡは激烈な肩関節痛をもたらすとともに、肩関節の可動域制限によって日常生活動作を著しく制限する。ＣＴＡによって、自立生活が送れなくなる等、生活の質が低下する。ＣＴＡは高齢者の健康寿命を短縮させる。また、肩関節腱板断裂及びＣＴＡは、若年者においても職業活動及びスポーツ活動に大きな障害をもたらす。ＣＴＡについては、患者の身体的負担及び経済的負担はもとより、医療経済的な社会負担も大きい。

【0003】

ＣＴＡの治療法はリバース型人工肩関節置換術に限定されている。そのため、肩腱板断裂後にＣＴＡの発症を予防する、あるいは軽度のＣＴＡの増悪を抑制する治療法の開発のために、ＣＴＡの病態解明が期待される。肩腱板断裂を伴わない一次性の変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；以下単に“ＯＡ”ともいう）は、関節軟骨変性と骨棘形成を特徴とする変形である。ＯＡはレントゲン学的にも組織学的にもＣＴＡと明確に区別され、この両者の分子病態は異なることが予想される。したがって、ＣＴＡの病態解明には、既存の膝関節ＯＡモデル等では代替できず、ＣＴＡの特徴を正確に再現する動物モデルが必要である。

【0004】

非特許文献１では、棘上筋及び棘下筋の筋腱を切離したＣＴＡモデルラットが報告されている。非特許文献２では、棘上筋、棘下筋及び小円筋の筋腱を切離したＣＴＡモデルマウスが報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｅｒｉｋ Ｊ Ｋｒａｍｅｒ，外６名，「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｒｏｔａｔｏｒ ｃｕｆｆ ｔｅａｒ ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ」，Ｊ Ｓｈｏｕｌｄｅｒ Ｅｌｂｏｗ Ｓｕｒｇ，２０１３年，２２（１２）：１７０２－１７０９

【非特許文献2】Ａｌｉｓｓａ Ｚｉｎｇｍａｎ，外８名，「Ｓｈｏｕｌｄｅｒ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｏ ｒｏｔａｔｏｒ ｃｕｆｆ ｔｅａｒ：Ａ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ」，Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，２０１７年，３５（３）：５０６－５１４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

非特許文献１で報告されたＣＴＡモデルラットでは、術後にＣＴＡの病態が現れるのに１２週（ヒトの生涯換算で８年）を要するうえ、非特許文献１には上腕骨の関節軟骨下骨陥没及び上腕骨頭の骨量減少について言及されていない。当該ＣＴＡモデルラットを再現したところ、ヒトの腱板では自然修復は起こらないのに対し、ＣＴＡモデルラットでは瘢痕組織によって自然修復されてしまう。非特許文献２で報告されたＣＴＡモデルマウスでは、術後にＣＴＡの病態が現れるのに４５週（ヒトの生涯換算で３６年）を要するため、加齢による変化を否定できないうえ、非特許文献２には上腕骨の関節軟骨下骨の陥没について言及されていない。さらに、ヒト腱板断裂では、小円筋の断裂は稀であるため、当該ＣＴＡモデルマウスはＣＴＡの病態を正確に反映していない。非特許文献１で報告されたＣＴＡモデルラット及び非特許文献２で報告されたＣＴＡモデルマウスはいずれもＣＴＡの表現型に係る変化が小さく、ＣＴＡの臨床を反映しているとは言い難い。

【0007】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、腱板断裂性肩関節症の病態をより忠実に再現することができる腱板断裂性肩関節症モデル動物及び腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

（腱板断裂性肩関節症モデル動物）
本明細書に記載された腱板断裂性肩関節症モデル動物は、
同じ側の肩甲上腕関節における棘上筋の筋腱、棘下筋の筋腱、上方関節包及び上腕二頭筋長頭腱が切離されたげっ歯類動物である。

【0009】

前記げっ歯類動物は、
ラットであることとしてもよい。

【0010】

前記ラットの週齢が１２週齢以降であることとしてもよい。

【0011】

上記本明細書に記載された腱板断裂性肩関節症モデル動物は、
軟骨下骨が陥没する又は陥没していることとしてもよい。

【0012】

（腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法）
本明細書に記載された腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法は、
げっ歯類動物の同じ側の肩甲上腕関節における棘上筋の筋腱及び棘下筋の筋腱を切離し、
前記肩甲上腕関節における上方関節包を切離し、
前記肩甲上腕関節における上腕二頭筋長頭腱を切離する。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、腱板断裂性肩関節症の病態をより忠実に再現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明の実施の形態に係る腱板断裂性肩関節症モデル動物において切離される箇所の一例を模式的に示す図である。

【図2】実施例における改良腱板断裂関節症モデル作製のための外科的処置をＡ～Ｄの順番の時系列で撮影した画像を示す図である。

【図3】従来の腱板切離モデルにおいて肩甲上腕関節軟骨変性を評価した結果を示す図である。Ａはヘマトキシリン－エオシン染色した肩甲上腕関節及び周辺組織の切片の画像を示す。Ｂはアルシアンブルー染色した肩甲上腕関節及び周辺組織の切片の画像を示す。ＣはＯＡの程度の指標であるスコアを示す。

【図4】実施例における４週後の改良腱板断裂関節症モデルの上腕骨頭の画像を示す図である。

【図5】実施例における改良腱板断裂関節症モデルのアルシアンブルー染色した肩甲上腕関節及び周辺組織の切片の画像を示す図である。

【図6】実施例における改良腱板断裂関節症モデルにおけるＯＡの程度の指標であるスコアを示す図である。

【図7】実施例における４週後の改良腱板断裂関節症モデルのサフラニンＯ染色した肩甲上腕関節及び周辺組織の切片の画像を示す図である。

【図8】免疫組織化学染色で得られた実施例における改良腱板断裂関節症モデルの４週後の上腕骨頭関節軟骨の切片の画像を示す図である。

【図9】実施例における改良腱板断裂関節症モデルの骨の組織形態計測の結果を示す図である。Ａはトルイジンブルー染色した４週後の上腕骨頭軟骨下骨の切片を示す。Ｂは４週後の軟骨下骨における骨量を示す。Ｃは単位面積あたりの破骨細胞数を示す。Ｄは石灰化速度を示す。Ｅは骨形成速度を示す。

【図10】実施例における免疫組織化学染色された４週後の改良腱板断裂関節症モデルの上腕骨頭軟骨下骨の切片の画像を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。

【0016】

本実施の形態に係る腱板断裂性肩関節症モデル動物は、同じ側の肩甲上腕関節における棘上筋の筋腱、棘下筋の筋腱、上方関節包及び上腕二頭筋長頭腱が切離されたげっ歯類動物である。げっ歯類動物としては、例えば、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、モルモット（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）が挙げられる。ヒトとの腱板周囲の解剖学的類似性が高いことから、げっ歯類動物は、好ましくはラットである。以下では、げっ歯類動物としてラットを用いた腱板断裂性肩関節症モデル動物について説明する。

【0017】

ラットの週齢は特に限定されないが、１０週齢以降又は１１週齢以降、好ましくは１２週齢以降である。ラットの雌雄は特に限定されない。腱板断裂性肩関節症モデル動物において切離される箇所を図１に示す。腱板は、棘上筋、棘下筋、小円筋、肩甲下筋から構成されている。棘上筋は肩甲骨の棘上窩と肩甲棘の上面から起始し、上腕骨の大結節に停止している。棘下筋は肩甲骨の棘下窩と肩甲棘下面から起始し、上腕骨の大結節に停止している。上方関節包（関節包靭帯複合体ともいう）は、関節窩を囲むように肩甲骨の頚部及び関節唇とその外周から起始し、大結節及び小結節に付着している。上腕二頭筋長頭腱は、肩甲骨関節上結節から起始し、関節包内及び上腕骨結節間溝を通り、その大部分は橈骨粗面に付着している。腱板断裂性肩関節症モデル動物は、同じ側の腱板を構成する棘上筋及び棘下筋の筋腱、上方関節包、並びに上腕二頭筋長頭腱がそれぞれ切離されている。

【0018】

ここで、本実施の形態に係る腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法について説明する。腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法は、第１ステップ～第４ステップを含む。図２は、ラットの右側の肩甲上腕関節における腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法の実施例を示す。好ましくは、腱板断裂性肩関節症モデル動物の製造方法は、麻酔下のラットに対して行われる。第１ステップの前に、棘上筋の筋腱及び棘下筋の筋腱を露出させるために、図２Ａに示すように、三角筋をＴ型に切開する。

【0019】

第１ステップでは、図２Ｂ及び図２Ｃに示すように、肩甲上腕関節における棘上筋（以下単に“ＳＳＰ”ともいう）の筋腱及び棘下筋（以下単に“ＩＳＰ”ともいう）の筋腱を切離する。好ましくは、ＳＳＰ及びＩＳＰは、それぞれ上腕骨頭での付着部分で切離される。切離は、メス、ハサミ等を用いて公知の方法で行うことができる。第２ステップでは、図２Ｄの破線に示された、当該肩甲上腕関節における上関節上腕靱帯（以下単に“ＳＧＨＬ”ともいう）を含む上方関節包（以下単に“ｃａｐｓｕｌｅ”ともいう）を切離する。第３ステップでは、当該肩甲上腕関節における上腕二頭筋長頭腱（以下単に“ＬＨＢ”ともいう）を切離する。

【0020】

本実施の形態に係る腱板断裂性肩関節症モデル動物は、下記実施例に示すように、術後２週程で、顕著なＯＡの変化を示す。術後４週では、さらに顕著にＯＡの病態を呈し、軟骨下骨が陥没する。陥没した軟骨下骨を覆う部位には、線維性パンヌスが現れる。また、当該腱板断裂性肩関節症モデル動物では、骨代謝バランスが骨吸収に傾き、ＣＴＡ患者で報告されている上腕骨頭の骨量の低下が認められる。さらに当該腱板断裂性肩関節症モデル動物では、ヒトのＯＡと同様に、炎症性サイトカイン及び異化酵素（軟骨基質消化酵素）の発現が増大する。

【0021】

本実施の形態に係る腱板断裂性肩関節症モデル動物は、その病態生理がヒトのＣＴＡに類似しており、腱板断裂性肩関節症の病態をより忠実に再現することができる。ヒトＣＴＡの自然経過については不明な点が多いところ、当該腱板断裂性肩関節症モデル動物によって、組織学的変化、特に軟骨下骨の変化の経時的観察が可能となる。また、当該腱板断裂性肩関節症モデル動物は、原因遺伝子、原因タンパク質、疾患増悪因子等の解明に加え、新規治療薬の研究開発、並びに既存薬剤の治療効果及び副作用の研究に寄与する。さらに、当該腱板断裂性肩関節症モデル動物を用いることで、骨、軟骨、靱帯、腱、筋、滑膜等の再生医療、治療装具、手術法、手術器具、トレーニング法、リハビリテーション手技、サポーター、テーピング法などの開発が可能となる。

【0022】

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【実施例0023】

雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（以下単に“ＳＤ”ともいう）ラット（日本エスエルシー社製）を、ケージあたり２匹を収容し、飼料及び水を自由摂取させて、室温が２３±１℃に制御された部屋で１２時間の明暗サイクル下で飼育した。本実施例では、１２週齢のラット５２匹（３６７±１１ｇ）を使用した。すべての外科処置は、酸素と混合した２％イソフルランを用いた全身麻酔下で行い、感染を予防するためにペニシリン（２００００Ｕ／ｋｇ）をラットの皮下に投与した。鎮痛のために、ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下、１２時間毎）を術後にラットに投与した。

【0024】

摂食及び飲水が困難であること、自傷、姿勢異常及び跛行による生活の質の顕著な低下を人道的エンドポイントと定義した。しかし、有害事象はなく、摂食が良好で、体重減少も見られなかったため、除外した個体はなかった。

【0025】

腱板切離（Ｒｏｔａｔｏｒ ｃｕｆｆ ｔｅｎｏｔｏｍｙ；以下単に“ＲＣＴ”ともいう）モデルを次のように作製した。ＳＤラット（各時点でｎ＝７）の右肩で肩甲上腕関節を覆う皮膚を切開し、腱板を処置できるように上腕骨頭において三角筋を長手方向に切開した。上腕二頭筋は処置せずそのままにした。ＳＳＰ及びＩＳＰの腱を上腕骨頭における付着部分で切離した。疑似手術（以下単に“Ｓｈａｍ”とする）として、左肩の皮膚及び三角筋を切開した。ラットを手術直後（０日目）、術後１週間及び術後４週間で殺処分とした。

【0026】

改良腱板断裂関節症（以下単に“ｍＣＴＡ”ともいう）モデルを次のように作製した。ＳＤラット（各時点での組織学的分析ごとにｎ＝７、ただし４週目は、肉眼による検査及び骨の組織形態計測を実施するためにサンプルを追加しｎ＝１７とした）の右肩で三角筋（ｄｅｌｔｏｉｄ）をＴ型に切開し（図２Ａ）、ＳＳＰの筋腱及びＩＳＰの筋腱を上腕骨頭での付着部分で切離した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。続いてＳＧＨＬを含むｃａｐｓｕｌｅを切離し（図２Ｄの破線）、ＬＨＢを切離した（図２Ｄ）。Ｓｈａｍとして、左肩の皮膚及び三角筋を切開した。ラットを術後１週間及び術後２週間、４週間及び８週間で殺処分とした。

【0027】

殺処分したラットから肩甲上腕関節及び周辺組織を採取し、室温にて２４時間、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。続いて、それらを４℃で５日間、Ｋ－ＣＸ ＡＴ溶液（ファルマ社製）で脱灰し、パラフィン包埋した切片を作製した。組織学的評価のために、関節軟骨を上位（ｓｕｐｅｒｉｏｒ）、中位（ｍｉｄｄｌｅ）、下位（ｉｎｆｅｒｉｏｒ）の３つの領域に区分けした。サフラニンＯ染色によって各領域の２０箇所において関節軟骨の厚みを測定し、平均値を算出した。Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｈｏｕｌｄｅｒ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｓｃｏｒｅ（ＭＳＡＳ；上記非特許文献２参照）を用いてＯＡの変化を評価するためにアルシアンブルー（ｐＨ１．０）染色を行った。異なる実施者それぞれが各測定を２回行った。

【0028】

骨の組織形態計測では、カルセイン（８ｍｇ／ｋｇ）を殺処分の５日前と１日前のそれぞれラットの腹腔内に注射した。メタクリル酸グリシジル樹脂包埋切片をトルイジンブルーで染色した。クレハ分析センターにおいてＨｉｓｔｏｍｅｔｒｙ ＲＴ Ｃａｍｅｒａ（システムサプライ社製）を用いて上腕骨の骨幹端を解析した。ＢＺ－Ｘ７１０／ＢＺ－Ｘ７００マイクロスコープシステム（キーエンス社製）を用いて上腕骨頭軟骨下骨を分析した。

【0029】

免疫組織化学分析では、抗原回復のため、切片をＬ．Ａ．Ｂ．ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とともにインキュベートした。３％過酸化水素を含むリン酸緩衝生理食塩水で内因性のペルオキシダーゼを不活化し、ＣＡＳ－Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でブロッキングした。一次抗体には、ウサギポリクローナル抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α抗体（１：２００、ｂｓ－２０８１Ｒ、Ｂｉｏｓｓ社製）、ウサギポリクローナル抗インターロイキン（ＩＬ）－１β（１：２００、ｂｓ－０８１２Ｒ、Ｂｉｏｓｓ社製）、ウサギポリクローナル抗ＩＬ－６（１：２００、ｂｓ－０７８２Ｒ、Ｂｉｏｓｓ社製）、ウサギポリクローナル抗マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）－３（１：２００、１７８７３－１－ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）、ウサギポリクローナル抗ＭＭＰ－１３（１：２００、ａｂ３９０１２、Ａｂｃａｍ社製）、ウサギポリクローナル抗ＡＤＡＭＴＳ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ）－５（１：２００、ｂｓ－３５７３Ｒ、Ｂｉｏｓｓ社製）、ウサギポリクローナル抗ＣＤ３４（１：２００、ｂｓ－０６４６Ｒ、Ｂｉｏｓｓ社製）、マウスモノクローナル抗ビメンチン（１：１０００、６０３３０－１－Ｉｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）、マウスモノクローナル抗レプチン受容体（１：２００、ＭＡ５－３２６８５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ウサギポリクローナル抗血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）α（１：２００、ｂｓ－０２３１Ｒ、Ｂｉｏｓｓ社製）、マウスモノクローナル抗ＲＵＮＸ２（１：２００、Ｄ１３０－３、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）及びマウスモノクローナル抗ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ－ｋａｐｐａ Ｂ ｌｉｇａｎｄ）（１：１００、ａｂ４５０３９、Ａｂｃａｍ社製）を使用した。

【0030】

正常ウサギＩｇＧ（ｓｃ－２０２７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及び正常マウスＩｇＧ（ｓｃ－２０２５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を一次抗体の陰性対照として使用した。抗マウスペルオキシダーゼ結合二次抗体及び抗ウサギペルオキシダーゼ結合二次抗体の混合物であるＨｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ Ｒａｔ ＭＡＸ ＰＯ（ＭＵＬＴＩ）（４１４１９１、ニチレイバイオサイエンス社製）を一次抗体のシグナル検出に使用した。シグナルはジアミノベンジジン溶液（４１５１７１、ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて可視化した。マイヤーヘマトキシリン溶液を用いて対比染色を行った。ＢＺ－Ｘ７１０／ＢＺ－Ｘ７００マイクロスコープシステムを用いて切片の画像を撮像した。シグナル陽性細胞の個数を総細胞数で除して陽性染色率を定量した。３つの独立した領域の平均スコアを統計解析に用いた。

【0031】

（結果）
まず、ＲＣＴモデルの上腕骨頭関節軟骨変性を評価した。ヘマトキシリン－エオシン染色による組織学的評価では、図３Ａに示すようにＳＳＰ及びＩＳＰの切離された腱が術後１週間で炎症細胞が浸潤した肉芽組織によって再結合し、４週間以内で瘢痕組織によってさらに修復されていた。ＲＣＴモデルの肩のＯＡの変化をＭＳＡＳで評価したところ、図３Ｂ及び図３Ｃに示すように、上腕骨頭軟骨の上位領域でアルシアンブルーによる染色度がわずかに低下し、ＭＳＡＳが少し増加した一方で、中位領域及び下位領域の軟骨には影響がなかった（ウイルコクソンの順位和検定）。この結果は、ラットが腱板の腱の自己修復力を有し、肩関節の不安定化と、上腕骨頭と肩峰との間の直接の衝突を防ぐことを示す。

【0032】

ｍＣＴＡモデルの４週後の上腕骨頭を図４に示す。なお、図４の“ＳＳＣ”は肩甲下筋を示す。軟骨の光沢面が全体的になくなり、特に上位領域において色褪せ、ザラつきが生じていた。ｍＣＴＡモデルにおける肩のＯＡの特徴をアルシアンブルー染色で評価したところ、図５に示すように、切離された腱板の腱が２週以内に瘢痕組織によって修復された。４週後には、軟骨下骨が陥没し、その後陥没が拡がった。ｍＣＴＡモデルでは、上腕骨頭の関節部分の丸み、軟骨細胞の細胞充実度、軟骨下骨の形態及びアルシアンブルーの可染性が低下していたが、４週から線維性パンヌスが出現し、損傷した軟骨下骨を覆っていた。ｍＣＴＡモデルにおける上位領域のＯＡの変化の程度をＭＳＡＳで評価した結果を図６に示す。図６では“Ｓ”はＳｈａｍを示し、“Ｃ”はｍＣＴＡモデルを示す。ＭＳＡＳの評価では、ＳｈａｍとｍＣＴＡモデルとの間ではウイルコクソンの順位和検定を行い、異なる時点での各群間では、クラスカル・ワリス検定及びスチール・ドワス検定を行った。図６に示すように、時間依存的にＯＡの変化が顕著になった。図７は、Ｓｈａｍ及びｍＣＴＡモデルのサフラニンＯ染色した４週後の切片の画像を示す。ｍＣＴＡモデルでは、陥没した軟骨下骨を覆う旺盛な線維性パンヌスを認めた。

【0033】

４週後のｍＣＴＡモデルの上腕骨頭関節軟骨切片（上位領域）におけるＯＡ関連炎症性サイトカイン及び異化酵素に関する免疫組織化学染色の結果を図８に示す。ｍＣＴＡモデルでは、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－１３及びＡＤＡＭＴＳ－５の発現が顕著に増加していた。このため、ｍＣＴＡモデルの軟骨変性の病態生理学はＯＡに類似していた。

【0034】

非脱灰硬組織切片をトルイジンブルー染色した上腕骨頭の切片を図９Ａに示す。４週後のｍＣＴＡモデルの軟骨下骨での骨量（ＢＶ（骨量）／ＴＶ（総骨量））、単位面積あたりの破骨細胞数（Ｏｃ．Ｎ（破骨細胞数）／ＢＳ（骨表面積））、石灰化速度（ＭＡＲ）及び骨形成速度（ＢＦＲ／ＢＳ）をそれぞれ図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ及び図９Ｅに示す（ウイルコクソンの順位和検定）。ＣＴＡ患者の上腕骨頭の骨量が減るという病態がｍＣＴＡモデルにおいて４週で再現された。ｍＣＴＡモデルでは、骨吸収が亢進し、骨形成には変化がなかったことから骨代謝バランスが骨吸収に傾斜していた。

【0035】

図１０は、４週後のｍＣＴＡモデルの上腕骨頭における陥没した軟骨下骨近傍にあるパンヌス細胞における骨髄由来間葉系幹細胞マーカー（ＣＤ３４、ビメンチン、レプチン受容体及びＰＤＧＦＲα）及び幼若骨芽細胞マーカー（ＲＵＮＸ２及びＲＡＮＫＬ）の免疫組織化学染色の結果を示す図である。いずれの骨髄由来間葉系幹細胞マーカーも陽性であったため、パンヌス細胞の起源が間葉系幹細胞であることが示唆された。また、パンヌス細胞が、骨芽細胞の分化の主な制御因子であるＲＵＮＸ２及び破骨細胞形成を促進するＲＡＮＫＬを発現していることが示された。

【0036】

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

【産業上の利用可能性】

【0037】

本発明は、腱板断裂性肩関節症の分子病態研究、治療薬、再生医療、治療器具等の開発に有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】