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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025090995
(43)【公開日】2025-06-18
(54)【発明の名称】運動性精子選別デバイス、及び運動性精子の選別方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20250611BHJP
C12Q 1/24 20060101ALI20250611BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12Q1/24
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023205929
(22)【出願日】2023-12-06
(71)【出願人】
【識別番号】595009763
【氏名又は名称】株式会社協同インターナショナル
(71)【出願人】
【識別番号】317006683
【氏名又は名称】地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所
(71)【出願人】
【識別番号】504182255
【氏名又は名称】国立大学法人横浜国立大学
(71)【出願人】
【識別番号】000201641
【氏名又は名称】全国農業協同組合連合会
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】三田 正弘
(72)【発明者】
【氏名】安井 学
(72)【発明者】
【氏名】百武 徹
(72)【発明者】
【氏名】大日方 塁
(72)【発明者】
【氏名】塚原 隼人
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA09
4B029BB11
4B029CC01
4B029DF09
4B029DG08
4B029GB05
4B029HA05
4B063QA20
4B063QQ08
(57)【要約】
【課題】 本発明は、運動性精子を容易かつ効率的に選別でき、運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えることができる、運動性精子選別デバイス、及び運動性精子の選別方法を提供する。
【解決手段】 精子を含む精子含有液を収容する供給槽４、液状の媒体を収容する回収槽５、及び供給槽４と、回収槽５とを互いに連通する複数の流路６を備え、複数の流路６内に、回収槽５から供給槽４へ向かう媒体の流れを生じさせることによって、精子に含まれる運動性精子を、供給槽４から回収槽５へ複数の流路６を介して遡上させて、運動性精子を選別する、運動性精子選別デバイスである。
【選択図】図２
【解決手段】 精子を含む精子含有液を収容する供給槽４、液状の媒体を収容する回収槽５、及び供給槽４と、回収槽５とを互いに連通する複数の流路６を備え、複数の流路６内に、回収槽５から供給槽４へ向かう媒体の流れを生じさせることによって、精子に含まれる運動性精子を、供給槽４から回収槽５へ複数の流路６を介して遡上させて、運動性精子を選別する、運動性精子選別デバイスである。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
精子を含む精子含有液を収容する供給槽、
液状の媒体を収容する回収槽、及び
前記供給槽と、前記回収槽とを互いに連通する複数の流路を備え、
複数の前記流路内に、前記回収槽から前記供給槽へ向かう前記媒体の流れを生じさせることによって、前記精子に含まれる運動性精子を、前記供給槽から前記回収槽へ複数の前記流路を介して遡上させて、前記運動性精子を選別する、運動性精子選別デバイス。
液状の媒体を収容する回収槽、及び
前記供給槽と、前記回収槽とを互いに連通する複数の流路を備え、
複数の前記流路内に、前記回収槽から前記供給槽へ向かう前記媒体の流れを生じさせることによって、前記精子に含まれる運動性精子を、前記供給槽から前記回収槽へ複数の前記流路を介して遡上させて、前記運動性精子を選別する、運動性精子選別デバイス。
【請求項2】
前記回収槽に収容された前記媒体の液面を、前記供給槽に収容された前記精子含有液の液面より高くすることによって、複数の前記流路内に、前記回収槽から前記供給槽へ向かう前記媒体の流れを生じさせる、請求項１に記載の運動性精子選別デバイス。
【請求項3】
前記供給槽及び前記回収槽は、互いに平行に対向する面を有し、
複数の前記流路が、前記対向する面に接続しており、前記対向する面に直交する方向に延出する直線状の形状を有する、請求項１に記載の運動性精子選別デバイス。
複数の前記流路が、前記対向する面に接続しており、前記対向する面に直交する方向に延出する直線状の形状を有する、請求項１に記載の運動性精子選別デバイス。
【請求項4】
複数の前記流路は、前記対向する面と平行な断面が矩形である、請求項３に記載の運動性精子選別デバイス。
【請求項5】
基板、及びチップを備え、
前記チップは、上面と、下面とを有し、
前記チップに、前記上面と前記下面とを貫通する、前記供給槽用の穴、及び前記回収槽用の穴が形成され、前記チップの前記下面側に、前記供給槽用の穴と、前記回収槽用の穴とを連通する、複数の前記流路用の複数の溝が形成されており、
前記基板と、前記チップの前記下面とが接着されることによって、前記供給槽、前記回収槽、及び複数の前記流路が形成される、請求項１に記載の運動性精子選別デバイス。
前記チップは、上面と、下面とを有し、
前記チップに、前記上面と前記下面とを貫通する、前記供給槽用の穴、及び前記回収槽用の穴が形成され、前記チップの前記下面側に、前記供給槽用の穴と、前記回収槽用の穴とを連通する、複数の前記流路用の複数の溝が形成されており、
前記基板と、前記チップの前記下面とが接着されることによって、前記供給槽、前記回収槽、及び複数の前記流路が形成される、請求項１に記載の運動性精子選別デバイス。
【請求項6】
請求項１に記載の運動性精子選別デバイスを用意する工程、
前記回収槽に前記媒体を注入し、前記供給槽に前記精子含有液を注入し、複数の前記流路内に、前記回収槽から前記供給槽へ向かう前記媒体の流れを生じさせる工程を含む、運動性精子の選別方法。
前記回収槽に前記媒体を注入し、前記供給槽に前記精子含有液を注入し、複数の前記流路内に、前記回収槽から前記供給槽へ向かう前記媒体の流れを生じさせる工程を含む、運動性精子の選別方法。
【請求項7】
前記媒体の液面が前記精子含有液の液面より高くなるように、前記供給槽に前記精子含有液を注入する、請求項６に記載の運動性精子の選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、運動性精子選別デバイス、及び運動性精子の選別方法に関する。
【背景技術】
【0002】
体外受精において、受精卵を効率的に作成するためには、運動性の良好な精子（以下、運動性精子と称する）を用いることが望まれる。運動性精子を選別する方法として、遠心を行うパーコール法等の方法が存在する。しかしながら、このような方法は、遠心によって精子のＤＮＡが損傷する虞がある。また、操作に熟練した技術者が必要であり、精子の回収に時間がかかるという問題がある。従って、運動性精子を容易に選別することができ、運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えることができる方法が求められている。また、運動性精子を効率よく選別できる方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０１９／０３０８１９２号 明細書
【特許文献2】国際公開第２０２２／１４０６４８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、運動性精子を容易かつ効率的に選別でき、運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えることができる、運動性精子選別デバイスを提供する。また、本発明は、運動性精子を容易かつ効率的に選別でき、運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えることができる、運動性精子の選別方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の実施形態に係る運動性精子選別デバイスは、精子を含む精子含有液を収容する供給槽、液状の媒体を収容する回収槽、及び供給槽と、回収槽とを互いに連通する複数の流路を備え、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせることによって、精子に含まれる運動性精子を、供給槽から回収槽へ複数の流路を介して遡上させて、運動性精子を選別する。
【0006】
また、本発明の実施形態に係る運動性精子の選別方法は、精子を含む精子含有液を収容する供給槽、液状の媒体を収容する回収槽、及び供給槽と、回収槽とを互いに連通する複数の流路を備え、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせることによって、精子に含まれる運動性精子を、供給槽から回収槽へ複数の流路を介して遡上させて、運動性精子を選別する運動性精子選別デバイスを用意する工程、並びに回収槽に媒体を注入し、供給槽に精子含有液を注入し、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせる工程を含む。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、運動性精子を容易かつ効率的に選別でき、運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えることができる、運動性精子選別デバイスを提供できる。また、本発明は、運動性精子を容易かつ効率的に選別でき、運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えることができる、運動性精子の選別方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】図１は、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを示す斜視図であり、（ａ）は、運動性精子選別デバイスの全体を示す斜視図であり、（ｂ）は、複数の流路のうちのひとつを抜き出して示す斜視図である。
【図5】図５（ａ）～（ｃ）は、実施例１において、運動性精子選別デバイスの複数の流路を上から観察したときの顕微鏡写真であり、（ａ）は、運動性精子が流路内を遡上している状態を示す顕微鏡写真であり、（ｂ）は、（ａ）の状態から約１．４秒後の状態を示す顕微鏡写真であり、（ｃ）は、（ａ）の状態から約２．８秒後の状態を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本実施形態について、図面を参照しながら説明する。なお、開示はあくまで一例に過ぎず、当業者において、発明の主旨を保っての適宜変更について容易に想到し得るものについては、当然に本発明の範囲に含有されるものである。また、図面は、説明をより明確にするため、実際の態様に比べて、各部の幅、厚さ、形状等について模式的に表される場合があるが、あくまで一例であって、本発明の解釈を限定するものではない。また、本明細書と各図において、既出の図に関して前述したものと同一、又は、類似した機能を発揮する構成要素には同一の参照符号を付し、重複する詳細な説明を適宜省略することがある。
【0010】
＜第１の実施形態＞
第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスは、精子を含む精子含有液を収容する供給槽、液状の媒体を収容する回収槽、及び供給槽と、回収槽とを互いに連通する複数の流路を備え、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせることによって、精子に含まれる運動性精子を、供給槽から回収槽へ複数の流路を介して遡上させて、運動性精子を選別する。
第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスは、精子を含む精子含有液を収容する供給槽、液状の媒体を収容する回収槽、及び供給槽と、回収槽とを互いに連通する複数の流路を備え、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせることによって、精子に含まれる運動性精子を、供給槽から回収槽へ複数の流路を介して遡上させて、運動性精子を選別する。
【0011】
本明細書において、運動性精子とは、精子運動解析装置（ＳＭＡＳ）を用いて計測した曲線速度、直線性、頭部振幅、及び頭部振動数が高い精子である。第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスは、このような運動性精子を容易かつ効率的に選別でき、運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えることができる。
【0012】
以下、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスについて、図１～３を参照しながら説明する。
【0013】
図１～３に示すように、運動性精子選別デバイス１は、基板２、及びチップ３を備える。図示するように、互いに直交するＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸を記載する。Ｘ軸に沿った方向をＸ方向と称し、Ｙ軸に沿った方向をＹ方向と称し、Ｚ軸に沿った方向をＺ方向と称する。Ｘ方向は、運動性精子選別デバイス１の幅方向に相当する。Ｙ方向は、運動性精子選別デバイス１の奥行方向に相当する。Ｚ方向は、運動性精子選別デバイス１の厚さ方向に相当する。Ｘ軸、及びＹ軸によって規定されるＸ－Ｙ平面を見ることを平面視と称する。
【0014】
基板２は、上面２ａと、下面２ｂとを有する。図１（ａ）に示すように、基板２は、上面２ａ及び下面２ｂが平坦であり、かつ上面２ａ及び下面２ｂが平行な板状の形状を有する。基板２の形状は、板状に限定されず、例えば、立方体、直方体、及び円柱状等の形状であってもよい。基板２の材料は、特に限定されないが、ガラスであることが好ましい。
【0015】
チップ３は、上面３ａと、下面３ｂとを有する。図１（ａ）に示すように、チップ３は、概略直方体状の形状を有する。チップ３の形状は、概略直方体に限定されず、例えば、概略立方体及び円柱状等の形状であってもよい。また、チップ３は、上面３ａと下面３ｂとを貫通する、供給槽４用の穴７、及び回収槽５用の穴８が形成されている。また、チップ３の下面３ｂ側に、供給槽４用の穴７と、回収槽５用の穴８とを連通する、複数の流路６用の複数の溝９が形成されている。チップ３の材料は、特に限定されないが、樹脂であることが好ましく、ポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳと称する）であることがより好ましい。
【0016】
図１（ａ）に示すように、基板２の上面２ａと、チップ３の下面３ｂとが接着されることによって、供給槽４、回収槽５、及び供給槽４と、回収槽５とを互いに連通する複数の流路６が形成されている。
【0017】
図１（ａ）に示すように、供給槽４の一つの側面ＬＳ４と、回収槽５の一つの側面ＬＳ５が、Ｙ方向に互いに平行であり、Ｘ方向に互いに対向している。また、図１（ａ）に示すように、複数の流路６は、対向する面ＬＳ４及びＬＳ５に接続している。また、図１（ａ）及び（ｂ）に示すように、複数の流路６は、対向する面ＬＳ４及びＬＳ５に直交する方向（Ｘ方向）に延出する直線状の形状を有する。より詳細には、複数の流路６は、対向する面ＬＳ４及びＬＳ５と平行な方向（Ｙ方向）の断面が矩形である、直方体の形状を有している。供給槽４、回収槽５、及び複数の流路６をこのように構成することによって、複数の流路６の長さＬ３がすべて同じ長さとなる。これにより、後述する運動性精子の選別方法において、各流路６を遡上する運動性精子の量、及び運動性精子の運動性の高さを揃えることができる。また、複数の流路６は、対向する面ＬＳ４及びＬＳ５と平行する方向（Ｙ方向）の断面が矩形であることにより、図１（ｂ）に図示する幅Ｗ３、高さＨ３、及び長さＬ３を有する。これにより、後述する複数の流路６内の媒体１１の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭを容易に設計することができる。
【0018】
図１及び２に示すように、供給槽４及び回収槽５は、直方体状の形状を有している。供給槽４及び回収槽５の形状は、直方体に限定されず、立方体及び円柱状等であってもよい。供給槽４及び回収槽５の底面の面積は、例えば、２０ｍｍ２以上６４ｍｍ２以下である。
【0019】
図１及び２に示すように、供給槽４及び回収槽５が直方体の形状を有する場合、図１（ａ）に示す供給槽４の幅Ｗ１、奥行Ｄ１、並びに回収槽５の幅Ｗ２、奥行Ｄ２の値が、前記底面の面積の範囲を満たす組み合わせであることが好ましい。例えば、幅Ｗ１及びＷ２がそれぞれ１．６ｍｍ以上７．０ｍｍ以下であり、奥行Ｄ１及びＤ２がそれぞれ４．０ｍｍ以上４０ｍｍ以下である。
【0020】
図１及び図２に示すように、運動性精子選別デバイス１は、供給槽４と回収槽５とを互いに連通する流路６を複数備える。好ましくは、運動性精子選別デバイス１は、当該流路６を、供給槽４の側面ＬＳ４の横方向の長さ１ｍｍ当たりに対して、１０本／１ｍｍ以上５０本／１ｍｍ以下の密度で備える。運動性精子選別デバイス１が流路６を複数備えることによって、運動性精子が流路６を介して遡上する際に、運動性精子が接触する面が多くなるため、運動性精子の走触性を誘発し易くなる。従って、運動性精子の走触性を利用して、より多くの運動性精子を回収槽５へ移動させることができ、運動性精子を効率的に選別できる。なお、図１～３では、流路６を６本備える運動性精子選別デバイス１を模式的に示しているが、流路の数は６本に限定されない。
【0021】
流路６の幅Ｗ３は、１０μｍ以上の範囲で、可能な限り小さい方が好ましい。これにより、運動性精子が流路６の内側面ＬＳ６１及びＬＳ６２により接触し易くなるため、運動性精子の走触性をより誘発することができ、運動性精子をより効率的に選別できる。幅Ｗ３が１０μｍ未満であると、運動性精子が流路６を遡上することが困難となる虞がある。また、流路６の幅Ｗ３に対する高さＨ３（Ｈ３／Ｗ３）を、０．１＜Ｈ３／Ｗ３＜１０とすることが好ましい。Ｈ３／Ｗ３が０．１以下であると、チップ３がＰＤＭＳで形成されている場合に、流路６の上面がたわんで流路６の下面（即ち、基板２の上面２ａ）に接触し、流路６の少なくとも一部を塞ぐ虞がある。また、Ｈ３／Ｗ３が１０以上であると、チップ３がＰＤＭＳで形成されている場合に、流路６の側面がたわんで内側面ＬＳ６１とＬＳ６２とが接触し、流路６の少なくとも一部を塞ぐ虞がある。
【0022】
図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、供給槽４、回収槽５、及び複数の流路６の底面は、同一平面上に位置することが好ましい。これにより、後述する複数の流路６内の媒体の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭを制御することが容易となる。
【0023】
第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイス１は、複数の流路６内に、回収槽５から供給槽４へ向かう媒体の流れＦ（ｕＭ）を生じさせることによって、精子に含まれる運動性精子を、供給槽４から回収槽５へ複数の流路６を介して遡上させて、運動性精子を選別する。これにより、運動性精子を容易かつ効率的に選別でき、運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えることができる。媒体の流れ（ｕＭ）を生じさせる方法は、特に限定されない。例えば、回収槽５に収容された媒体の液面を、供給槽４に収容された精子含有液の液面より高くすることによって、媒体の流れ（ｕＭ）を生じさせてもよい。これにより、媒体の液面を精子含有液の液面より高くするという容易な操作によって、媒体の流れ（ｕＭ）を生じさせることができる。また、回収槽５内の圧力を供給槽４内の圧力よりも高くすることによって、媒体の流れ（ｕＭ）を生じさせてもよい。
【0024】
（第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスの製造方法）
次に、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスの製造方法について説明する。ここでは、図１～３に示す運動性精子選別デバイス１について、製造方法を説明する。第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイス１の製造方法は、基板２を用意する工程、供給槽４用の穴７、回収槽５用の穴８、及び複数の流路６用の複数の溝９が形成されたチップ３を用意する工程、並びに基板２の上面２ａと、チップ３の下面３ｂとを接着する接着工程を含む。
次に、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスの製造方法について説明する。ここでは、図１～３に示す運動性精子選別デバイス１について、製造方法を説明する。第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイス１の製造方法は、基板２を用意する工程、供給槽４用の穴７、回収槽５用の穴８、及び複数の流路６用の複数の溝９が形成されたチップ３を用意する工程、並びに基板２の上面２ａと、チップ３の下面３ｂとを接着する接着工程を含む。
【0025】
チップ３を用意する工程は、公知の方法によって行うことができる。例えば、穴７、穴８及び溝９が形成される前のチップ３に対して、切削、及びフォトリソグラフィ等によって、穴７、穴８及び溝９を形成し、チップ３を作製してもよい。また、穴７、穴８及び溝９の形状を設けた型を、金属、フォトレジスト及びシリコン等によって作製し、当該型を用いて射出成型等の成型を行うことによってチップ３を作製してもよい。また、ニッケル等を用いた電気鋳造によってチップ３を作製してもよい。
【0026】
接着工程において、基板２の上面２ａと、チップ３の下面３ｂとの接着は、プラズマ処理等によって行うことが好ましい。接着剤を用いた接着は、後述する運動性精子を選別方法において、接着剤に含まれる成分が媒体に溶け出し、精子の運動性に悪影響を与える虞があるため、好ましくない。
【0027】
以上説明した方法によって、図１～３に示す運動性精子選別デバイス１を製造することができる。このような製造方法によれば、チップ３の下面３ｂに複数の溝を加工することによって、容易に複数の流路６を形成することができる。
【0028】
（第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを用いた運動性精子の選別方法）
次に、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを用いた、運動性精子の選別方法について説明する。
次に、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを用いた、運動性精子の選別方法について説明する。
【0029】
運動性精子の選別方法は、精子を含む精子含有液を収容する供給槽、液状の媒体を収容する回収槽、及び供給槽と、回収槽とを互いに連通する複数の流路を備え、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせることによって、精子に含まれる運動性精子を、供給槽から回収槽へ複数の流路を介して遡上させて、運動性精子を選別する、運動性精子選別デバイス（即ち、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイス）を用意する工程（Ｓ１）、並びに回収槽に媒体を注入し、供給槽に精子含有液を注入し、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせる工程（Ｓ２）を含む。また、運動性精子の選別方法は、回収槽内に移動した運動性精子を回収する工程（Ｓ３）を更に含んでもよい。
【0030】
以下、図１～３に示す運動性精子選別デバイス１を用いた運動性精子の選別方法を説明する。
【0031】
まず、運動性精子選別デバイス１を用意する工程（Ｓ１）において、運動性精子選別デバイス１を水平な面に設置する。運動性精子選別デバイス１は、第１の実施形態で説明したものを用いることができる。
【0032】
次いで、媒体の流れを生じさせる工程（Ｓ２）において、回収槽５に媒体を注入し、供給槽４に精子含有液を注入し、複数の流路６内に、回収槽５から供給槽４へ向かう媒体の流れＦ（ｕＭ）を生じさせる。
【0033】
媒体は、複数の流路６内に回収槽５から供給槽４へ向かう媒体の流れＦ（ｕＭ）を生じさせた際に、精子に含まれる運動性精子を回収槽５へ遡上させることができる液状の物質であれば特に限定されない。媒体の密度は、水と同程度であることが好ましい。媒体の粘度は、例えば、１×１０-３Ｐａ・ｓ以上１×１０２Ｐａ・ｓ以下である。また、媒体の粘度は、水と同程度であることが好ましい。このような媒体として、ＩＦＰ９６３Ｂ（株式会社機能性ペプチド研究所社製）等の媒精液、体外受精用培養液、緩衝液、生理食塩水、及びその他の培養液等からなる群から選択される１つ、又は２つ以上の混合物に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のアルブミンを溶解したものが好ましい。２つ以上の混合物を用いる場合、それらの組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に選択できる。
【0034】
回収槽５に媒体を注入する方法は、特に限定されず、例えば、マイクロピペット及びシリンジ等を用いて回収槽５に媒体を注入することによって行ってもよい。
【0035】
精子含有液は、精子を含む液体であれば特に限定されないが、精液及び精液懸濁液等であることが好ましい。精液懸濁液は、精子凍結保存液、培養液、緩衝液及び生理食塩水等からなる群から選択される少なくとも１つ、又は２つ以上の混合物に対して精液を懸濁させたものである。２つ以上の混合物を用いる場合、それらの組み合わせ及び比率は、目的に応じて任意に選択できる。精子は、あらゆる動物の精子であってよいが、ウシ、ブタ及びヒト等の哺乳類動物の精子であることが好ましい。精子は、上述したような動物から採取したままの状態であってもよく、採取した後凍結保存し、その後解凍した状態のものであってもよい。
【0036】
供給槽４に精子含有液を注入する方法は、特に限定されず、例えば、マイクロピペット及びシリンジ等を用いて供給槽４に精子含有液を注入することによって行ってもよい。
【0037】
媒体の流れを生じさせる工程（Ｓ２）において、複数の流路６内に、回収槽５から供給槽４へ向かう媒体の流れＦ（ｕＭ）を生じさせる。運動性精子は、運動性精子が有する走流性及び走触性によって、流れＦ（ｕＭ）に逆らって供給槽４から回収槽５へ複数の流路６を介して遡上し、回収槽５に移動する。一方、運動性の低い精子は、流れＦ（ｕＭ）に逆らって遡上し難いため、供給槽４内に残留する。このように、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイス１は、運動性精子と、運動性の低い精子とを、運動性精子の走流性及び走触性を利用して選別することができる。また、遠心等の精子のＤＮＡに損傷を生じさせる虞がある方法を用いることなく運動性精子を選別できるため、運動性精子のＤＮＡが損傷することを抑えることができる。
【0038】
複数の流路６内に生じさせる、回収槽５から供給槽４へ向かう媒体の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭを、１０μｍ／ｓ以上１００μｍ／ｓ以下とすることが好ましく、２０μｍ／ｓ以上５０μｍ／ｓ以下とすることがより好ましい。媒体の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭが１０μｍ／ｓ以上１００μｍ／ｓ以下の範囲であると、運動性精子は、流れＦ（ｕＭ）に逆らって遡上し、回収槽５に移動することができる。一方、運動性の低い精子は、流れＦ（ｕＭ）に逆らって遡上することが難しくなる。従って、運動性精子と、運動性の低い精子とを精度よく選別することができる。また、平均流速ｕＭが２０μｍ／ｓ以上であると、運動性の低い精子が流れＦ（ｕＭ）に逆らって遡上することがさらに難しくなるため、運動性精子と、運動性の低い精子とをより精度よく選別することができる。平均流速ｕＭが１０μｍ／ｓ未満であると、媒体の流れＦ（ｕＭ）が安定しなかったり、媒体が逆流したりする虞がある。平均流速ｕＭが１００μｍ／ｓを超えると、運動性精子が流れＦ（ｕＭ）に逆らって遡上して、回収槽５に移動することが難しくなる虞がある。
【0039】
媒体の流れを生じさせる方法は、特に限定されない。例えば、回収槽５に収容された媒体の液面を、供給槽４に収容された精子含有液の液面より高くすることによって、媒体の流れＦ（ｕＭ）を生じさせてもよい。また、シリンジポンプ等を用いて、回収槽５内の圧力を供給槽４内の圧力よりも高くすることによって、媒体の流れＦ（ｕＭ）を生じさせてもよい。
【0040】
以下、回収槽５に収容された媒体の液面を、供給槽４に収容された精子含有液の液面より高くすることによって、媒体の流れＦ（ｕＭ）を生じさせる方法を、図４（ａ）～（ｅ）を参照して説明する。
【0041】
まず、図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、回収槽５に媒体１１を注入し、媒体１１を回収槽５から供給槽４へ複数の流路６を介して流入させる。
【0042】
媒体１１を回収槽５から供給槽４へ複数の流路６を介して流入させることができ、かつ後の工程において、媒体１１の液面ＦＬ１１を精子含有液１０の液面ＦＬ１０より高くするために十分な量の媒体１１を、回収槽５に注入する。回収槽５に十分な量の媒体１１を注入することによって、媒体１１が回収槽５から供給槽４へ複数の流路６を介して流入する。
【0043】
回収槽５に媒体１１を注入した後、媒体１１が回収槽５から供給槽４へ流入したことを確認することが好ましい。媒体１１が回収槽５から供給槽４へ流入したことは、例えば、図４（ｂ）に示すように、供給槽４に媒体１１が流入した状態を、供給槽４の開口部から目視等で確認すること等によって行うことができる。これにより、複数の流路６が回収槽５と供給槽４とを互いに連通していることを確認することができる。
【0044】
次いで、図４（ｃ）に示すように、媒体１１の液面ＦＬ１１が精子含有液１０の液面ＦＬ１０より高くなるように、供給槽４に精子含有液１０を注入する。媒体１１の液面の高さＦＬ１１と、精子含有液１０の液面の高さＦＬ１０との差ΔＦＬ（即ち、ΔＦＬ＝ＦＬ１１－ＦＬ１０）（以下、「液面差ΔＦＬ」と称する）は、後述する式（１）において、媒体の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭが１０μｍ／ｓ以上１００μｍ／ｓ以下の範囲となる任意の値とすることができる。しかしながら、液面差ΔＦＬが小さすぎると、衝撃等で媒体１１が逆流する虞がある。また、液面差ΔＦＬが大きすぎると、媒体の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭを前記範囲とするために、流路６の長さＬ３を長くする必要が生じる。液面差ΔＦＬは、例えば、０．７ｍｍ以上１０ｍｍ以下とすることができる。
【0045】
媒体１１の液面ＦＬ１１が精子含有液１０の液面ＦＬ１０より高くなるように、供給槽４に精子含有液１０を注入することによって、回収槽５内の媒体１１の液圧Ｐ１１が、供給槽４内の精子含有液１０の液圧Ｐ１０より大きくなる。従って、供給槽４に精子含有液１０を注入した後においても、図４（ｃ）～（ｅ）に示すように、媒体１１が回収槽５から供給槽４へ複数の流路６を介して流入する。このとき、複数の流路６内には、回収槽５から供給槽４へ向かう方向に平均流速ｕＭの媒体１１の流れＦ（ｕＭ）が生じる。図４（ｄ）及び（ｅ）に示すように、運動性精子１２ａは、運動性精子１２ａが有する走流性及び走触性によって、流れＦ（ｕＭ）に逆らって供給槽４から回収槽５へ複数の流路６を介して遡上し、回収槽５に移動する。一方、運動性の低い精子１２ｂは、流れＦ（ｕＭ）に逆らって遡上し難いため、供給槽４内に残留する。
【0046】
以下、複数の流路６内の媒体１１の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭと、流路６の形状と、液面差ΔＦＬとの関係について説明する。流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭは、図１（ｂ）に示す流路６の幅Ｗ３、高さＨ３、及び長さＬ３、並びに液面差ΔＦＬを用いて、次の式で表すことができる。なお、下記式において、ｇは重力加速度、ρは媒体１１の密度、μは媒体１１の粘度を示す。
【0047】
【数1】
【0048】
液面差ΔＦＬ、並びに流路６の幅Ｗ３、高さＨ３及び長さＬ３は、上記式において、平均流速ｕＭが１０μｍ／ｓ以上１００μｍ／ｓ以下の範囲となる任意の値とすることができる。例えば、媒体１１の密度ρ及び粘度μが水と同程度である場合、液面差ΔＦＬを０．７ｍｍ以上１０ｍｍ以下、流路６の幅Ｗ３を１０μｍ以上６０μｍ以下、高さＨ３を１０μｍ以上６０μｍ以下、長さＬ３を１ｍｍ以上８０ｍｍ以下とすることができる。
【0049】
供給槽４に精子含有液１０を注入してから、運動性精子１２ａを回収槽５内に移動させるまでの時間は、特に限定されないが、例えば、１５分以上６０分以下である。
【0050】
以上説明したようにして、媒体の流れを生じさせる工程（Ｓ２）を行ってもよい。これにより、媒体１１の液面ＦＬ１１を精子含有液１０の液面ＦＬ１０より高くするという容易な操作によって、媒体の流れを生じさせることができる。
【0051】
媒体の流れを生じさせる工程（Ｓ２）以降の工程において、運動性精子選別デバイス１内の精子含有液及び媒体を、精子が運動するために適切な温度に保つことが好ましい。適切な温度は、用いる精子の動物の種類によって異なり、例えば、ヒトの場合は３２℃以上３７℃以下、ウシの場合は３７℃以上３９℃以下である。精子含有液及び媒体を適切な温度に保つ方法は、特に限定されないが、運動性精子選別デバイス１をインキュベータに入れ、当該インキュベータによって温度を管理することによって行ってもよい。
【0052】
媒体の流れを生じさせる工程（Ｓ２）の後、回収槽５内に移動した運動性精子を回収する工程（Ｓ３）を行ってもよい。運動性精子を回収する方法は特に限定されないが、運動性精子を、回収槽５内に残存する媒体と共に、マイクロピペットやシリンジ等で回収することによって行ってもよい。
【0053】
回収した運動性精子を、例えば、媒体と共にマイクロチューブ等の中で保存してもよく、当該マイクロチューブ等を凍結して保存してもよい。回収及び保存した運動性精子は、体外受精に用いることができる。第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを用いて選別した運動性精子は、遠心を行うパーコール法等の従来の選別方法によって選別された精子と比較して、ＤＮＡの損傷が抑えられる。従って、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを用いて選別した運動性精子を体外受精に用いることで、体外受精の卵割率、胚盤胞率及び凍結可能胚率を高めることができる。
【0054】
以下、第１の実施形態の効果について説明する。
第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスは、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせることによって、精子に含まれる運動性精子を、供給槽から回収槽へ複数の流路を介して遡上させて、運動性精子を選別する。このように、当該運動性精子選別デバイスは、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせるという容易な操作によって、運動性精子を選別することができる。また、遠心等の運動性精子のＤＮＡに損傷を生じさせる虞がある方法を用いることなく、運動性精子の走流性及び走触性を利用することによって運動性精子を選別するため、運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えることができる。
また、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスは、供給槽と、回収槽とを互いに連通する流路を複数備える。これにより、運動性精子が流路を介して遡上する際に、運動性精子が接触する面が多くなるため、運動性精子の走触性を誘発し易くなる。従って、運動性精子の走触性を利用して、より多くの運動性精子を回収槽へ移動させることができるため、運動性精子を効率的に選別できる。
第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスは、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせることによって、精子に含まれる運動性精子を、供給槽から回収槽へ複数の流路を介して遡上させて、運動性精子を選別する。このように、当該運動性精子選別デバイスは、複数の流路内に、回収槽から供給槽へ向かう媒体の流れを生じさせるという容易な操作によって、運動性精子を選別することができる。また、遠心等の運動性精子のＤＮＡに損傷を生じさせる虞がある方法を用いることなく、運動性精子の走流性及び走触性を利用することによって運動性精子を選別するため、運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えることができる。
また、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスは、供給槽と、回収槽とを互いに連通する流路を複数備える。これにより、運動性精子が流路を介して遡上する際に、運動性精子が接触する面が多くなるため、運動性精子の走触性を誘発し易くなる。従って、運動性精子の走触性を利用して、より多くの運動性精子を回収槽へ移動させることができるため、運動性精子を効率的に選別できる。
【0055】
（実施例）
以下、実施例を例示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
以下、実施例を例示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0056】
＜実施例１＞
（運動性精子選別デバイスの用意）
図１～３に示す運動性精子選別デバイス１と同様のものを用意した。供給槽４及び回収槽５は、略同一形状の直方体であり、図１（ａ）に示す幅Ｗ１及びＷ２が３．５ｍｍであり、奥行きＤ１及びＤ２が８．２ｍｍであり、高さＨ１及びＨ２が５ｍｍであった。また、複数の流路６は、図１（ａ）及び（ｂ）に示すように、Ｙ方向の断面が矩形の直方体であり、幅Ｗ３が５０μｍであり、高さＨ３が１０μｍであり、長さＬ３が５ｍｍであった。また、運動性精子選別デバイス１は、当該流路６をＹ方向に並列して８０本備えていた。当該運動性精子選別デバイス１を、水平な面に設置した。
（運動性精子選別デバイスの用意）
図１～３に示す運動性精子選別デバイス１と同様のものを用意した。供給槽４及び回収槽５は、略同一形状の直方体であり、図１（ａ）に示す幅Ｗ１及びＷ２が３．５ｍｍであり、奥行きＤ１及びＤ２が８．２ｍｍであり、高さＨ１及びＨ２が５ｍｍであった。また、複数の流路６は、図１（ａ）及び（ｂ）に示すように、Ｙ方向の断面が矩形の直方体であり、幅Ｗ３が５０μｍであり、高さＨ３が１０μｍであり、長さＬ３が５ｍｍであった。また、運動性精子選別デバイス１は、当該流路６をＹ方向に並列して８０本備えていた。当該運動性精子選別デバイス１を、水平な面に設置した。
【0057】
（精子含有液及び媒体の用意）
ウシの凍結精液ストロー（種雄牛名：黒毛和牛「勝美桜」、家畜改良事業団盛岡種雄牛センター）中のウシの凍結精液を、３８．５℃の湯浴で融解し、精子含有液であるウシの精液を用意した。また、媒精用基本液ＩＦＰ９６３Ｂ（株式会社機能性ペプチド研究所製）（以下、ＢＯ液と称する）に、ウシ血清アルブミン（アルブミン、ウシ血清由来（ＢＳＡ）、ｐＨ７．０、ニュージーランド産、富士フイルム和光純薬株式会社製）（以下、ＢＳＡと称する）を溶解し、ＢＳＡの濃度が０．２質量％のＢＯ液（以下、０．２質量％ＢＳＡ添加ＢＯ液と称する）を調製し、媒体とした。
ウシの凍結精液ストロー（種雄牛名：黒毛和牛「勝美桜」、家畜改良事業団盛岡種雄牛センター）中のウシの凍結精液を、３８．５℃の湯浴で融解し、精子含有液であるウシの精液を用意した。また、媒精用基本液ＩＦＰ９６３Ｂ（株式会社機能性ペプチド研究所製）（以下、ＢＯ液と称する）に、ウシ血清アルブミン（アルブミン、ウシ血清由来（ＢＳＡ）、ｐＨ７．０、ニュージーランド産、富士フイルム和光純薬株式会社製）（以下、ＢＳＡと称する）を溶解し、ＢＳＡの濃度が０．２質量％のＢＯ液（以下、０．２質量％ＢＳＡ添加ＢＯ液と称する）を調製し、媒体とした。
【0058】
（運動性精子の選別）
調製した媒体１００μＬを、マイクロピペットを用いて、回収槽５に注入した。媒体が複数の流路を介して回収槽５から供給槽４へ流入したことを、供給槽４の開口部から目視によって確認した。次いで、精液８０μＬを供給槽４に注入した。このとき、媒体の液面が精子の液面よりも高く、媒体の液面の高さと、精液の液面の高さとの差ΔＦＬが０．７ｍｍ以上１０ｍｍ以下であった。また、精液を供給槽４に注入した後の、複数の流路６内の媒体の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭは、１４．８μｍ／ｓであった。次いで、運動性精子選別デバイス１をＣＯ２インキュベータ（ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶ－ＰＪ、ＰＨＣ株式会社製）に入れ、媒体及び精液の温度を３８．５度に保ち、３０分間安置した。この間、複数の流路６を上から顕微鏡で観察して、複数の流路６を介して供給槽４から回収槽５へ遡上する運動性精子の様子を観察した。その際の顕微鏡写真を、図５（ａ）～（ｃ）に示す。図５（ａ）は、運動性精子が流路６を遡上している状態を示す顕微鏡写真である。図５（ｂ）は、図５（ａ）の状態から約１．４秒後の状態を示す顕微鏡写真であり、図５（ｃ）は、図５（ａ）の状態から約２．８秒後の状態を示す顕微鏡写真である。なお、図５（ａ）～（ｃ）において、複数の流路６のうちのひとつを符号６で示し、その内側面を符号ＬＳ６１及びＬＳ６２で示し、運動性精子のうちのひとつを符号１２ａで示している。図５（ａ）～（ｃ）に示す顕微鏡写真から明らかなように、複数の運動性精子が、その走流性によって、複数の流路６内の媒体の流れＦ（ｕＭ）に逆らって遡上していることがわかる。また、運動性精子が、流路６の内側面ＬＳ６１及びＬＳ６２に沿って多数存在し、当該内側面ＬＳ６１及びＬＳ６２に沿って移動していることから、運動性精子は、その走触性によっても、複数の流路６内を遡上していることがわかる。
調製した媒体１００μＬを、マイクロピペットを用いて、回収槽５に注入した。媒体が複数の流路を介して回収槽５から供給槽４へ流入したことを、供給槽４の開口部から目視によって確認した。次いで、精液８０μＬを供給槽４に注入した。このとき、媒体の液面が精子の液面よりも高く、媒体の液面の高さと、精液の液面の高さとの差ΔＦＬが０．７ｍｍ以上１０ｍｍ以下であった。また、精液を供給槽４に注入した後の、複数の流路６内の媒体の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭは、１４．８μｍ／ｓであった。次いで、運動性精子選別デバイス１をＣＯ２インキュベータ（ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶ－ＰＪ、ＰＨＣ株式会社製）に入れ、媒体及び精液の温度を３８．５度に保ち、３０分間安置した。この間、複数の流路６を上から顕微鏡で観察して、複数の流路６を介して供給槽４から回収槽５へ遡上する運動性精子の様子を観察した。その際の顕微鏡写真を、図５（ａ）～（ｃ）に示す。図５（ａ）は、運動性精子が流路６を遡上している状態を示す顕微鏡写真である。図５（ｂ）は、図５（ａ）の状態から約１．４秒後の状態を示す顕微鏡写真であり、図５（ｃ）は、図５（ａ）の状態から約２．８秒後の状態を示す顕微鏡写真である。なお、図５（ａ）～（ｃ）において、複数の流路６のうちのひとつを符号６で示し、その内側面を符号ＬＳ６１及びＬＳ６２で示し、運動性精子のうちのひとつを符号１２ａで示している。図５（ａ）～（ｃ）に示す顕微鏡写真から明らかなように、複数の運動性精子が、その走流性によって、複数の流路６内の媒体の流れＦ（ｕＭ）に逆らって遡上していることがわかる。また、運動性精子が、流路６の内側面ＬＳ６１及びＬＳ６２に沿って多数存在し、当該内側面ＬＳ６１及びＬＳ６２に沿って移動していることから、運動性精子は、その走触性によっても、複数の流路６内を遡上していることがわかる。
【0059】
３０分間安置した後、回収槽５から、回収槽５に移動した運動性精子、及び回収槽５に残存する媒体の混合物を、マイクロピペットを用いて吸引し、マイクロチューブに入れて回収した。また、供給槽４から、供給槽４に残存する精液、及び回収槽５から供給槽４に流入した媒体の混合物を、マイクロピペットを用いて吸引し、マイクロチューブに入れて回収した。その後、精子運動解析装置（ＳＭＡＳ、株式会社ディテクト製）を用いて、回収槽５、及び供給槽４から回収した各混合物中に含まれる精子について、精子の曲線速度、直線性、頭部振幅、及び頭部振動数をそれぞれ測定し、精子の運動性を評価した。その結果を図６に示す。図６において、エラーバーは標準誤差を示し、符号「＊」は、ｐ値が０．０５未満であること（ｐ＜０．０５）を示し、符号「ｎ．ｓ．」は、統計的に有意でないことを示す。
【0060】
図６（ａ）に示すように、回収槽５に移動した運動性精子は、供給槽４に残存する精子よりも高い曲線速度を有していた。また、図６（ｂ）に示すように、回収槽５に移動した運動性精子は、供給槽４に残存する精子よりも高い直線性を有していた。また、図６（ｃ）に示すように、回収槽５に移動した運動性精子は、有意ではないものの、供給槽４に残存する精子よりも高い頭部振幅を有していた。また、図６（ｄ）に示すように、回収槽５に移動した運動性精子は、供給槽４に残存する精子よりも、高い頭部振動数を有していた。このように、回収槽５に移動した運動性精子は、供給槽４に残存する精子よりも高い運動性を有していることが分かった。従って、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを用いることによって、運動性の高い運動性精子を容易かつ効率的に選別できた。
【0061】
（実施例２）
運動性精子選別デバイス１の流路６の数が１２０本であった以外、実施例１と同様の方法によって、回収槽５から、回収槽５に移動した運動性精子、及び回収槽５に残存する媒体の混合物を回収した。当該混合物の精子濃度は５０万個／ｍＬであった。
運動性精子選別デバイス１の流路６の数が１２０本であった以外、実施例１と同様の方法によって、回収槽５から、回収槽５に移動した運動性精子、及び回収槽５に残存する媒体の混合物を回収した。当該混合物の精子濃度は５０万個／ｍＬであった。
【0062】
（実施例３）
運動性精子選別デバイス１の流路の長さが３ｍｍであり、流路の数が１２０本であり、複数の流路内の媒体の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭが２４．８μｍ／ｓであった以外、実施例１と同様の方法によって、回収槽５から、回収槽５に移動した運動性精子、及び回収槽５に残存する媒体の混合物を回収した。当該混合物の精子濃度は５０万個／ｍＬであった。
運動性精子選別デバイス１の流路の長さが３ｍｍであり、流路の数が１２０本であり、複数の流路内の媒体の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭが２４．８μｍ／ｓであった以外、実施例１と同様の方法によって、回収槽５から、回収槽５に移動した運動性精子、及び回収槽５に残存する媒体の混合物を回収した。当該混合物の精子濃度は５０万個／ｍＬであった。
【0063】
（比較例１）
まず、２ｍｌの９０％パーコール液を遠心管に入れ、その後、２ｍＬの４５％パーコール液を遠心管に積層した。ウシの凍結精液ストロー（種雄牛名：黒毛和牛「勝美桜」、家畜改良事業団盛岡種雄牛センター）中のウシの凍結精液を、３８．５℃の温湯で融解し、当該精液を遠心管内の４５％パーコール液の表面に積層した。遠心管を、１０００ｒｐｍの速度で、３０分間遠心分離し、運動性精子と運動性の低い精子を分離した。遠心管から上清を除去し、１ｍＬの媒精液（ＩＶＦ１００、株式会社機能性ペプチド研究所社製）を加え、ピペッティングすることによって混和し、精子浮遊液を調製した。当該精子浮遊液の精子濃度をＳＭＡＳを用いてカウント後、さらに媒精液（ＩＶＦ１００）を加え、当該精子浮遊液の精子濃度を２５０万個／ｍＬに調整した。
まず、２ｍｌの９０％パーコール液を遠心管に入れ、その後、２ｍＬの４５％パーコール液を遠心管に積層した。ウシの凍結精液ストロー（種雄牛名：黒毛和牛「勝美桜」、家畜改良事業団盛岡種雄牛センター）中のウシの凍結精液を、３８．５℃の温湯で融解し、当該精液を遠心管内の４５％パーコール液の表面に積層した。遠心管を、１０００ｒｐｍの速度で、３０分間遠心分離し、運動性精子と運動性の低い精子を分離した。遠心管から上清を除去し、１ｍＬの媒精液（ＩＶＦ１００、株式会社機能性ペプチド研究所社製）を加え、ピペッティングすることによって混和し、精子浮遊液を調製した。当該精子浮遊液の精子濃度をＳＭＡＳを用いてカウント後、さらに媒精液（ＩＶＦ１００）を加え、当該精子浮遊液の精子濃度を２５０万個／ｍＬに調整した。
【0064】
＜体外受精＞
（卵子の準備）
ウシの卵巣の卵胞内から、卵丘細胞卵子複合体を卵胞液と共にシリンジを用いて吸引採取した。顕微鏡を用いて、採取した卵丘細胞卵子複合体のうち、卵丘細胞が３層以上卵子に付着しているものを選別した。選別した卵丘細胞卵子複合体を、シャーレ内の成熟培地（血清を５％添加したＭｅｄｉｕｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ社製））へ導入し、３８．５℃、５％ＣＯ２ ｉｎ ａｉｒのインキュベータ内で、２０～２４時間成熟培養した。
（卵子の準備）
ウシの卵巣の卵胞内から、卵丘細胞卵子複合体を卵胞液と共にシリンジを用いて吸引採取した。顕微鏡を用いて、採取した卵丘細胞卵子複合体のうち、卵丘細胞が３層以上卵子に付着しているものを選別した。選別した卵丘細胞卵子複合体を、シャーレ内の成熟培地（血清を５％添加したＭｅｄｉｕｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ社製））へ導入し、３８．５℃、５％ＣＯ２ ｉｎ ａｉｒのインキュベータ内で、２０～２４時間成熟培養した。
【0065】
（媒精及び発生培養）
成熟培養した卵子を媒精培地に移動し、実施例２で回収した運動性精子及び媒体の混合物をマイクロピペットを用いて添加し、３８．５℃、５％ＣＯ２ ｉｎ ａｉｒのインキュベータ内で、６～１６時間培養することによって媒精した。媒清後の胚を、血清を５％添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。次いで、洗浄した胚を、発生培地（ＢＯ－ＩＶＣ（ＩＶＦ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））に導入し、１９２時間発生培養した。実施例３で回収した運動性精子及び媒体の混合物、及び比較例１で回収した精子浮遊液についても、同様の媒精及び発生培養処理を行った。
成熟培養した卵子を媒精培地に移動し、実施例２で回収した運動性精子及び媒体の混合物をマイクロピペットを用いて添加し、３８．５℃、５％ＣＯ２ ｉｎ ａｉｒのインキュベータ内で、６～１６時間培養することによって媒精した。媒清後の胚を、血清を５％添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。次いで、洗浄した胚を、発生培地（ＢＯ－ＩＶＣ（ＩＶＦ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））に導入し、１９２時間発生培養した。実施例３で回収した運動性精子及び媒体の混合物、及び比較例１で回収した精子浮遊液についても、同様の媒精及び発生培養処理を行った。
【0066】
＜卵割率、胚盤胞率、凍結可能胚率の測定＞
発生培養開始後、４８時間経過した胚を、顕微鏡を用いて観察し、卵割した胚の数を数えて卵割数及び卵割率（＝卵割数／供試胚数×１００）を得た。また、発生培養開始後、１９２時間経過した胚を、顕微鏡を用いて観察し、発生した胚盤胞を数えて胚盤胞数、及び胚盤胞率（＝胚盤胞数／供試胚×１００）を得た。また、発生培養開始後、１６８時間経過した胚を、顕微鏡を用いて観察し、国際胚技術学会(ＩＥＴＳ)の分類においてＣｏｄｅ ２以上の胚を凍結可能胚とし、当該凍結可能胚の数を数えて凍結可能胚数、及び凍結可能胚率（＝凍結可能胚数／供試胚×１００）を得た。その結果を表１に示す。
発生培養開始後、４８時間経過した胚を、顕微鏡を用いて観察し、卵割した胚の数を数えて卵割数及び卵割率（＝卵割数／供試胚数×１００）を得た。また、発生培養開始後、１９２時間経過した胚を、顕微鏡を用いて観察し、発生した胚盤胞を数えて胚盤胞数、及び胚盤胞率（＝胚盤胞数／供試胚×１００）を得た。また、発生培養開始後、１６８時間経過した胚を、顕微鏡を用いて観察し、国際胚技術学会(ＩＥＴＳ)の分類においてＣｏｄｅ ２以上の胚を凍結可能胚とし、当該凍結可能胚の数を数えて凍結可能胚数、及び凍結可能胚率（＝凍結可能胚数／供試胚×１００）を得た。その結果を表１に示す。
【0067】
【表1】
【0068】
表１に示すように、実施例２及び３は、比較例１よりも卵割率が高かった。また、実施例２及び３は、比較例１よりも胚盤胞率が高かった。また、実施例２及び３は、比較例１よりも凍結可能胚率が高かった。このように、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを用いて選別された運動性精子（実施例２及び３）は、遠心を行う従来法（パーコール法）によって得られた運動性精子（比較例１）よりも、体外受精の卵割率、胚盤胞率及び凍結可能胚率が高いことが分かった。従って、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを用いることによって、遠心を行う従来法よりも運動性精子のＤＮＡの損傷を抑えつつ、運動性精子を選別することができた。
【0069】
また、表１に示すように、複数の流路内の媒体の流れＦ（ｕＭ）の平均流速ｕＭが２０μｍ／ｓ以上５０μｍ／ｓ以下の範囲内であった実施例３は、平均流速ｕＭが２０μｍ／ｓ未満であった実施例２と比較して、凍結可能胚率がより高い結果となった。従って、平均流速ｕＭを２０μｍ／ｓ以上５０μｍ／ｓ以下の範囲内とすることにより、運動性の低い精子が回収槽まで遡上することをより抑え、運動性精子をより高い精度で選別することができた。
【0070】
上述した実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【0071】
（第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスの変形例）
以下、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイス１の変形例について、図７Ａ及び図７Ｂを参照しながら説明する。なお、図７Ａ（ａ）及び（ｂ）、並びに図７Ｂ（ｃ）及び（ｄ）では、運動性精子選別デバイス１の供給槽４、回収槽５及び複数の流路６のみを抜き出してそれぞれ図示している。流路６は、省略して１本のみを示しているが、複数本設けられている。上述の第１の実施形態と同様の構成についての説明は、上述の説明を援用して省略する。
以下、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイス１の変形例について、図７Ａ及び図７Ｂを参照しながら説明する。なお、図７Ａ（ａ）及び（ｂ）、並びに図７Ｂ（ｃ）及び（ｄ）では、運動性精子選別デバイス１の供給槽４、回収槽５及び複数の流路６のみを抜き出してそれぞれ図示している。流路６は、省略して１本のみを示しているが、複数本設けられている。上述の第１の実施形態と同様の構成についての説明は、上述の説明を援用して省略する。
【0072】
（第１の変形例）
図７Ａ（ａ）に示すように、２つの供給槽４の間に回収槽５を配置して、供給槽４と回収槽５とを複数の流路６でそれぞれ互いに連通して、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを構成してもよい。
図７Ａ（ａ）に示すように、２つの供給槽４の間に回収槽５を配置して、供給槽４と回収槽５とを複数の流路６でそれぞれ互いに連通して、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを構成してもよい。
【0073】
（第２の変形例）
図７Ａ（ｂ）に示すように、２つの供給槽４をＸ方向の両端に配置し、２つの供給槽４をＹ方向の両端に配置し、４つの供給槽４の中央に回収槽５を配置して、各供給槽４と、回収槽５とを、複数の流路６でそれぞれ互いに連通して、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを構成してもよい。
図７Ａ（ｂ）に示すように、２つの供給槽４をＸ方向の両端に配置し、２つの供給槽４をＹ方向の両端に配置し、４つの供給槽４の中央に回収槽５を配置して、各供給槽４と、回収槽５とを、複数の流路６でそれぞれ互いに連通して、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを構成してもよい。
【0074】
（第３の変形例）
図７Ｂ（ｃ）に示すように、複数の供給槽４及び複数の回収槽５を、Ｘ方向及びＹ方向に交互に並べて配置し、Ｘ方向及びＹ方向に隣り合う供給槽４と回収槽５とを、複数の流路６でそれぞれ互いに連通して、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを構成してもよい。
図７Ｂ（ｃ）に示すように、複数の供給槽４及び複数の回収槽５を、Ｘ方向及びＹ方向に交互に並べて配置し、Ｘ方向及びＹ方向に隣り合う供給槽４と回収槽５とを、複数の流路６でそれぞれ互いに連通して、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを構成してもよい。
【0075】
（第４の変形例）
図７Ｂ（ｄ）に示すように、中空円柱状の供給槽４の中央に、円柱状の回収槽５を配置し、供給槽４の側面ＬＳ４と、回収槽５の側面ＬＳ５とを、複数の流路６によって互いに連通することによって、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを構成してもよい。第４の変形例において、供給槽４の側面ＬＳ４、及び回収槽５の側面ＬＳ５は、互いに平行に対向している。また、複数の流路６が、回収槽５を中心として放射状に配置され、各流路６が、側面ＬＳ４、及び側面ＬＳ５と直交する方向に延出する直線状の形状を有している。
図７Ｂ（ｄ）に示すように、中空円柱状の供給槽４の中央に、円柱状の回収槽５を配置し、供給槽４の側面ＬＳ４と、回収槽５の側面ＬＳ５とを、複数の流路６によって互いに連通することによって、第１の実施形態に係る運動性精子選別デバイスを構成してもよい。第４の変形例において、供給槽４の側面ＬＳ４、及び回収槽５の側面ＬＳ５は、互いに平行に対向している。また、複数の流路６が、回収槽５を中心として放射状に配置され、各流路６が、側面ＬＳ４、及び側面ＬＳ５と直交する方向に延出する直線状の形状を有している。
【符号の説明】
【0076】
１…運動性精子選別デバイス、２…基板、３…チップ、４…供給槽、５…回収槽、６…流路、７…供給槽用の穴、８…回収槽用の穴、９…流路用の溝、１０…精子含有液、１１…媒体、１２…精子。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】